JP2005281592A - セルロース微細多孔質膜の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 平面性を向上させるとともに、核酸の得率を向上させるセルロース微細多孔質膜を製造する。
【解決手段】 セルロースエステル誘導体の微細多孔質膜を搬送しながらけん化と中和と水洗と乾燥との各処理を実施しけん化膜１２であるセルロース微細多孔質膜を製造する。用いる水はすべてヌクレアーゼフリー水である。乾燥装置１８にはドラム２５とベルト２６とが備えられており、けん化膜１２はこれらの間に挟み込まれながら搬送されて加熱される。搬送速度は０．０５〜５．０ｍ／分である。この乾燥はＩＳＯ１４６４４によるクラス７以上の清浄度のクリーンルーム内で実施される。これにより、得られるけん化膜１２は優れた平面性を有し、直径７ｍｍの円形に打ち抜いたときの平面性も良好で、核酸分離精製用のカートリッジを生産性よく製造することができるものとなった。
【選択図】 図１

Description

本発明は、セルロース微細多孔質膜の製造方法に関し、特に、核酸の分離精製のために用いることができるセルロース微細多孔質膜の製造方法に関するものである。

セルロースアセテート微細多孔質膜は、古くから製品化されており、ろ過用フィルタとして広く利用されている。その製造方法としては、様々な提案がなされている（例えば、特許文献１〜３）。また、セルロースアセテート微細多孔質膜をケン化処理することによりセルロース微細多孔質膜を製造する方法も提案されており（例えば、特許文献４参照。）、これは製品化されて耐溶剤性のフィルタとして利用されている。

ところで、周知のように、核酸は様々な分野で種々の形態で使用されている。例えば、組換え核酸技術の分野においては、核酸をプローブやゲノム核酸、プラスミド核酸の形状で用いることが要求されている。

核酸は、診断分野においても種々の方法で用いられており、例えば、核酸プローブは、ヒトの病原体の検出および診断のために広く用いられている。また、核酸は、遺伝障害の検出や、食品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は、遺伝地図の作製やクローニング、遺伝子組換えによる形質発現におよぶ種々の目的のために、所定の核酸に関する位置確認や同定、単離において日常的に用いられている。

しかし、多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手することができず、そして、その単離と精製との操作が、煩雑であり多くの時間を要する。この時間を要する煩雑な工程は、核酸の損失に結びつきやすいという問題がある。また、例えば、血清、尿およびバクテリアのカルチャーから得られた試料における核酸の精製においては、コンタミネーションが発生したり、疑陽性の結果を招くという問題も加わる。

上記問題を解決し、簡便かつ効率よく核酸を分離精製する方法の一つとして、セルロースのような、表面に水酸基を有する有機高分子により構成される多孔質膜に核酸を吸着ならびに脱着させる方法が、提案されている（例えば、特許文献５参照。）。

特公昭４３−１５６９８号公報 特公昭４６−４０２５号公報 特公昭５５−６４０６号 特公昭４５−４６３３号公報 特開２００３−１２８６９１号

しかしながら、核酸の分離、精製に用いるためのカートリッジ中に、従来法により製造されたセルロース微細多孔質膜を用いると、カートリッジの生産性が悪いという問題があった。これは、セルロース多孔質膜の平面性にばらつきがあるためである。したがって、カートリッジの生産性を向上させるために、セルロース微細多孔質膜の平面性の改善が望まれている。

平面性に優れた膜を得るためには、ケン化後のセルロース膜を乾燥する工程において枠張りが必要であり、この枠張りを用いると、膜が収縮により破れることがある。そのためセルロース微細多孔質膜の生産性には限界があった。また、パスロールを用いて膜を搬送しながら乾燥させる方法もあるが、膜が収縮してしまい良好な平面性の得られないという問題がある。

本発明の目的は、検体中の核酸を分離精製する際に、再現性よく核酸を回収することができる高品質なセルロース微細多孔質膜を高い生産性で製造する方法を提供することであって、さらに、平面性に優れ、カートリッジへの収容性に優れたセルロース微細多孔質膜を高い生産性で製造する方法を提供することである。

本発明のセルロース微細多孔質膜の製造方法では、セルロースエステル誘導体からなる微細多孔質膜をけん化して前記セルロースエステル誘導体をセルロースとするけん化工程と、前記けん化した前記微細多孔質膜を中和する中和工程と、前記中和工程後に前記微細多孔質膜を洗浄する洗浄工程と、前記洗浄工程後に前記微細多孔質膜を加熱乾燥させる乾燥工程とを有し、前記乾燥が、ＩＳＯ １４６４４に規定されるクラス７またはそれ以上の清浄度を有するクリーンルーム内で行われるとともに、前記乾燥工程では接触式ドラム乾燥機を用いることを特徴として構成されている。

そして、前記接触式ドラム乾燥機が、回転駆動されるとともに表面温度制御可能なドラムと、このドラムの外周面の一部に巻きかけられて搬送されるベルトとを有し、前記洗浄工程を経た微細多孔質膜がドラムとベルトとの間を搬送されながら加熱されることが好ましい。

また、前記ドラムが、前記微細多孔質膜との接着を防止するための第１の被覆材を表面に備えることが好ましく、ベルトの表面の凹凸の差を弾性により吸収して前記ベルトの前記凹凸が前記微細多孔質膜につくことを防止するための第２の被覆材が、前記ベルトの表面に備えられることが好ましい。

また、前記搬送の速度を０．０５ｍ／分以上５．０ｍ／分以下とすることが好ましく、けん化と中和と洗浄とのすべての前記工程で用いる水がヌクレアーゼフリー水であることが好ましい。

本発明によると、検体中の核酸を分離精製する際に、再現性よく核酸を回収することができる高品質なセルロース微細多孔質膜を、高い生産性で製造することができる。このセルロース微細多孔質膜は、平面性に優れており、かつ、核酸分離精製用のカートリッジへの収容に適する。得られる核酸分離精製用カートリッジは、分離性能に優れて洗浄効率がよく、簡便に用いることができ、迅速で自動化適性に優れたものとなる。

以下に図を参照しながら、本発明について詳細に説明する。ただし、以下に説明する実施様態は一例であり、本発明はこの実施様態に限定されるものではない。

図１は、実施形態としてのセルロース微細多孔質膜の製造設備（以降、単に製造設備と称する。）の概略図である。この製造設備１０は、セルロースエステル微細多孔質膜（以降、セルロースエステル膜と称する。）１１を、シート状で、または、長尺の状態で、所定の処理によりけん化膜１２とする設備となっている。製造設備１０は、けん化装置１５と、中和装置１６と、水洗装置１７と、乾燥装置１８とを有している。また各装置１５〜１８の内部と各装置１５〜１８間においては、エステル膜１１またはけん化膜１２を搬送するための搬送ローラ２１と支持する支持ローラ（図示せず）が必要に応じて設けられている。

けん化装置１５内には、けん化槽（図示せず）が備えられており、このけん化槽には、セルロースエステル膜１１をけん化してけん化膜１２とするためのアルカリ性水溶液が備えられる。

中和装置１６には、中和処理槽（図示なし）が備えられており、けん化によって生成したけん化膜１２の表面あるいは内部に残留するアルカリ性水溶液を中和するための酸性溶液が、この中和処理槽内に備えられる。

水洗装置１７には、攪拌機（図示なし）を有する水洗器（図示なし）が備えられている。本実施形態において用いた水洗器には、吸水口と排水口とが備えられ、吸水口からは適宜洗浄用の水が水供給部２０から供給され、また排水口からは適宜使用済みの水が外部へ排水される。

そして、乾燥装置１８は、けん化膜１２を加熱する加熱手段としてのドラム２５を有する。また、乾燥装置１８はベルト２６を有しており、このベルト２６は、けん化膜１２を搬送し、かつ、ドラム２５との間にセルロース膜１２を挟み込むことによりけん化膜１２の加熱効率を高める。乾燥装置１８は、さらに、ベルト２６を搬送するための搬送ローラ２７を備える。ドラム２５には、これを回転駆動するためのモータ２５ａと、ドラム２５の表面温度を検知してこの検知結果に基づいて表面温度を制御するための温度コントローラ２５ｂとが備えられている。また、乾燥装置１８には、チャンバ３１が備えられており、このチャンバ３１には内部の空気をクリーンルーム５０の外部へ排出するための排気口３１ａが備えられている。なお、このチャンバ３１への空気の取り込みは、本実施形態においてはけん化膜１２の入口でなされる。

また、乾燥装置１８は、図１に示すように、クリーンルーム５０の内部に設置されている。クリーンルーム５０は、吸気口５０ａと排気口５０ｂとを有している。そして、給気口５０ａには内部へ送り込まれる空気を清浄化するためのフィルタ５０ｃが接続されている。このクリーンルーム５０は、ＩＳＯ（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ）が規定する１４６４４規格において、ＩＳＯ７またはそれ以上の清浄度を示すクリーンルームとされている。これにより、得られるけん化膜１２への汚染物質の付着を防止することができるので、このけん化膜を核酸分離抽出用のフィルタとして用いると、核酸精製時のコンタミネーションを防止し、核酸をより高い得率で得ることができる。乾燥されたけん化膜１２は、巻き取り機３５に巻き取られられたり、あるいは集積手段（図示せず）によりシート状で集積される。

本発明においては、セルロースエステル膜１１の膜素材は上述の通りセルロースのエステル誘導体であり、このエステル誘導体としては、モノエステル、ジエステル、トリエステル、モノエステルとジエステルとの混合物、モノエステルとトリエステルとの混合物、ジエステルとトリエステルの混合物、モノエステルとジエステルとトリエステルとの混合物のいずれかであり、これらエステル化合物のアシル基の種類により、例えばセルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースブチレート、セルロースアセテートプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースプロピオネートブチレートの等を挙げることができる。

そして、本実施形態では上記の装置を用いて、以下の方法によりセルロース微細多孔質膜を製造した。まず、けん化装置１５ではセルロースエステル膜１１のけん化がなされる。つまり、セルロースエステル膜１１が、アルカリ性水溶液に浸漬することにより、セルローエステルがけん化して所定のけん化率を有するけん化膜１２となる。このとき、けん化率は、アルカリの濃度と浸漬時間により調整される。したがって、本発明により得られる膜はセルロース微細多孔質膜と称しているものの、これは膜及び膜の微細孔表面のセルロースエステルを所定のけん化率としたものを意味している。その結果、本発明によるセルロース微細多孔質膜とは、一部がセルロースとなり、けん化されていない部分についてはエステルのままであることもある。

セルロースエステル膜１１は、所定温度のアルカリ性水溶液に所定時間浸漬することによりけん化される。本実施形態においては、常温下で、０．1 〜１．０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を、攪拌しながら、セルロースエステル膜１１を１０〜１２０分間浸漬し、ここでの常温下とは１５〜３５℃の範囲を意味する。ただし、本発明はけん化条件に依存するものではない。したがって、アルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

けん化膜１２のけん化率は、周知の方法によって容易に測定することができる。例えば、滴定による酢化度測定方法や、ＮＭＲ、ＩＲ、ＸＰＳ等の市販の測定機器による構造解析等が挙げられる。このような市販の各種測定機器による方法においては、例えば、カルボニル基のピーク減少度によりけん化率は求められる。

本発明においては、セルロースエステルのけん化率は５％以上１００％以下であることが好ましい。これは、けん化率が５％以上１００％以下であると、核酸の分離精製のための吸着物として用いた時に、十分な吸着能を有するようになるからである。このけん化率を達成する為には、例えば、０．４ＮのＮａＯＨへの浸漬時間は１０分以上とすることが好ましい。

けん化された後のけん化膜１２は、けん化後できるだけすぐに、同環境下において、酸で中和されることが好ましい。中和工程において使用する酸の濃度や種類、中和時間については本発明では限定するものではなく、けん化工程によりけん化膜１２に付着したアルカリ性水溶液を中和するために十分であればよい。本実施形態では、一例として、０．1 〜１．０Ｎの塩酸水溶液に、１０〜６０分浸漬することにより中和がなされた。そして、本実施形態における中和方法は、酸性水溶液中にけん化膜１２を浸積させる方法を用いたが、この方法に限定されるものではなく、けん化膜１２に対して酸性水溶液を塗布したり吹き付けたりする等、公知の種々の方法を用いることができ、本発明は中和方法に依存するものではない。

次に、水洗装置１７において、けん化膜１２を十分に水洗する。本実施形態においては、水は連続的に供給と排出とがなされ、つまり水洗装置１７では流水での洗浄が実施されている。このような流水方式にすることにより、洗浄効率ならびに洗浄効果が向上する。また、水洗時間については、流水の場合には６０分以上であることが好ましく、滞留式の水洗では適宜水を交換しながら６０分よりも長くすることが好ましい。

洗浄において用いる水は蒸留ろ過水であり、この蒸留ろ過水はヌクレアーゼフリーであり、粒子直径が０．５μｍ以上の粒子が除去されたものである。ヌクレアーゼはＤＮＡ及びＲＮＡの分解酵素であるので、ヌクレアーゼフリー水を洗浄水とすることにより、核酸の分離精製による得率低下を防ぐことができる。

なお、本実施形態においては、この水洗工程の他、製造工程にて用いる水すべてについて、上記ヌクレアーゼフリー水としている。つまり、図示の煩雑性をさけるため図示は省略したが、けん化工程におけるアルカリ水溶液と中和工程における酸性溶液との両方に用いられる水はともに、水供給部２０から供給されるヌクレアーゼフリー水とされている。これにより、核酸の得率をより向上させることができる。

また、本発明においては、洗浄水に対して水溶性有機溶媒を混合してもよい。水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールとこの異性体との中から選ばれることが好ましく、また選ばれるものは複数であってもよい。

次に乾燥装置１８による乾燥工程について説明する。本発明において用いた加熱手段は上記の通り接触式のドラム２５とされている。ドラム２５には搬送ローラ２７により循環して連続搬送されるベルト２６が巻きかけられており、水洗装置１７を経たけん化膜１２は搬送ローラ２１等によりベルト２６にまで至る。そして、けん化膜１２はベルト２６によりドラム２５まで案内されて、表面が加熱されたドラム２５により加熱される。加熱時においては、けん化膜はドラム２５とベルト２６との間に挟まれながら搬送されている。そして加熱されたけん化膜はドラム２５から離れてからもベルト２６上でその昇温により乾燥が進み、チャンバ３１の外部に出る頃までには十分に乾燥される。

この挟み込み加熱によりけん化膜１２の加熱効率が向上するとともに、膜の破断等を防止することができる。これは、けん化膜１２の水分蒸発に伴って発生するけん化膜１２の収縮が抑制され、破断がこのような収縮に起因するものだからである。したがって、本発明によると、従来、側端部を保持する等の枠保持方式により保持搬送しながらけん化膜を乾燥する等により発生していた破断を防止することができる。

ドラム２５の温度は、けん化膜１２の厚みと、このけん化膜１２に含まれる水の量、搬送速度等に応じて決定され、また搬送速度は、けん化膜１２の強度等を考慮して決定されるが、ドラム２５の表面温度は概ね１００〜２００℃とし、搬送速度は、０．０５〜５．０ｍ／ｍｉｎとすることが好ましい。表面温度を１００℃未満とすると、加熱不十分のために乾燥が十分になされないことがあり、２００℃を越えると、けん化膜１２を劣化させることがある。また、搬送速度を０．０５ｍ／分未満とすると生産性の点で問題があり、また５．０ｍ／分とすると乾燥不良となることがある。

また、上記のように挟み込みにより加熱して乾燥させる方法によると、後述のような高い平面性を有するけん化膜１２を得ることができ、これがセルロース微細多孔質膜である。この平面性により、得られたけん化膜１２を所定のサイズに切断されて核酸分離精製用のカートリッジに良好に収容することができる。

図２は、ドラム２５とベルト２６とによるけん化膜１２の挟み込みの状態を示す断面図である。ドラム２５は、その外周面に第１の被覆材２５ｃを備えている。また、ベルト２６は、ベルト本体２６ｃにとしての布材に第２の被覆材２６ｂを備えている。本実施形態においては、ベルト本体２６ａとしてフェルト布等の弾性材を用いているがこれに限定されるものではない。ベルト本体２６ａとして、所定の硬さを有する弾性体を用いることにより、けん化膜１２の搬送が安定化するとともに、またドラム２５との挟み圧の制御がより最適化される。また、第２被覆材２６ｂとしては合成樹脂の細い糸により編まれた編み物が用いられており、この第２被覆材２６ｂがけん化膜１２に接する。また、本実施形態で用いたベルト本体２６ａには前端と後端とのつなぎ目があり、第２被覆材２６ｂを表面に備えることにより、このつなぎ目のけん化膜１２への接触によるけん化膜１２の表面へのキズ発生が抑制されたり、ドラム２５とけん化膜１２との接着が防止される他、第１被覆材２５ｃを用いることによってもドラム２５とけん化膜１２との接着が防止される。

上記のように製造されたけん化膜１２は以下の方法により平面性を評価された。図３は、けん化膜１２の平面性評価方法の説明図である。まず、得られたけん化膜１２を、直径７ｍｍの円形に打ち抜く。図３は、直径Ｄが７ｍｍとされたけん化膜１２の断面図である。そして、平面性の評価は、これを水平な台上においたとき、膜面の高低の差Ｈを測定することにより実施される。つまり高低差Ｈが大きいほど平面性が悪く、高低差Ｈが小さいほど平面性が良好であることを意味する。高低差Ｈの測定は、市販の非接触型の膜厚計、例えば、レーザー反射を利用した測定器を用いることが好ましい。そして、この平面性評価方法によると、高低差Ｈが１ｍｍよりも大きいと、核酸分離精製用のカートリッジへの収容性が好ましくなく、カートリッジの生産性に劣ることが確認された。しかし、平面性評価方法は、ここに記載する方法には限定されない。

そしてこの平面性測定法の結果では、上記の製造方法により得られたけん化膜１２は、高低差Ｈが０〜１ｍｍとなる。したがって、本発明により得られるけん化膜１２は、良好な平面性を有し、核酸分離精製用のカートリッジを良好な得率で製造することができることがわかる。

上記作製したけん化膜１２の孔径は、平均孔径が０．１〜１０．０μｍであり、かつ、厚みが５０〜５００μｍであることが好ましい。これにより、核酸分離精製用の核酸吸着剤としてより好適に用いることができる。

以下に本発明をより詳細に説明するために実施例を示す。なお、実施例４と５とは、実施例１〜３に対する比較実験として実施したものである。

セルロースエステルのドープを調製した。ドープ調製における溶解方法では、まず、ポリマー成分を最初にジメチルクロライドに溶解し、この溶液にメタノールを少量づつ添加した。そして、この溶液にさらにグリセリンと純水とを少量ずつ添加して未溶解物がほとんどない状態のドープを得た。そして、ドープを濾紙で濾過する。なおドープ調製における各成分の配合は以下である。
ジアセチルセルロース（酢化度５４．５％）・・・・・２．４２重量％
トリアセチルセルロース（酢化度６０．８％）・・・・３．４３重量％
グリセリン・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．１８重量％
ジメチルクロライド・・・・・・・・・・・・・・・・５４．２０重量％
メタノール・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３３．２２重量％
純水・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・６．３５重量％

次に、ギヤ−ポンプでドープを送液し、さらに、ろ過を行ってから、エンドレスバンド上に載せて搬送されるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム上にダイから流延した。この流延膜を２０〜４０℃の乾燥風により２０分間乾燥した。
エンドレスバンドから、フィルムをＰＥＴとともに剥ぎ取り、これを１５分間、８０〜１２０℃で熱風乾燥して巻き取り機で巻き取った。ＰＥＴ上には、セルロースアセテート微細多孔質膜が形成されている。

得られた巻き取りロールを、スリッタ付きの巻き替え機（図示なし）により４３ｃｍ幅にスリットした。この４３ｃｍ幅のＰＥＴ付きセルロースアセテート膜を剥離バーにより、ＰＥＴ部とセルロースアセテート微細多孔質膜とに分けた。得られたセルロースアセテート微細多孔質膜は、保証孔径が５．０μｍのものであった。なお、上記の濃度を、メタノール、ジメチレンクロライド、純水などの配合比をかえることによりに調製すると０．０５〜８．０μｍの種々の保証孔径の膜が作成される。

セルロースアセテート微細多孔質膜に、メタノール１．５リットルとヌクレアーゼフリー水１３．５リットルとの混合液を吸収させてから、けん化装置１５にてけん化した。この保証孔径は５μｍ、多孔質膜の幅は４３ｃｍ、長さは１０ｍ、厚みは１４０μｍである。また、ヌクレアーゼフリー水は、０．４μｍ以下の保証孔径を有するろ過フィルタにて濾過して得られたものである。

けん化装置１５は、オートウォッシャ（型式；Ｋ−５００、ＨＡＮＳＡ製）であり、けん化には２０〜３０℃に調整された０．４ＮのＮａＯＨ水溶液を用いた。けん化は、前記水溶液を所定の攪拌機により攪拌しながら６０分実施した。

中和は、２０〜３０℃に調整された０．１Ｎの塩酸中にけん化膜１２を浸漬することにより実施した。

洗浄は、オートウォッシャ（型式；Ｍ−７００、ＨＡＮＳＡ製）を水洗装置１７として用い、また洗浄水はヌクレアーゼフリー水とした。このヌクレアーゼフリー水は、０．２〜０．０５μｍの保証孔径を有するろ過フィルタにて濾過して得られたものである。また、水洗装置には攪拌機が設けられており、洗浄水を攪拌しながら、かつ前記ヌクレアーゼフリー水の供給と使用済みの水の排水とを実施して流水させ、１２０分の洗浄を実施した。

けん化膜１２を、クリーン度１００００未満のクリーンブース内に設置された、接触式ドラム乾燥機を備える乾燥装置１８を用いて乾燥した。用いた接触式ドラム乾燥機は、ジャポー（株）のＪＰＯ ＡＵＴＯ ＤＲＹＥＲ ＴＹＰＥ ＭＲ−３Ｄである。ドラム２５の温度は１１０〜１２５℃に設定し、ドラム２５の回転によるけん化膜１２の搬送速度は０．２ｍ／分とした。ドラム２５とけん化膜１２との接着防止、及び、ベルト２６の縫い目によるしわ発生の防止のため、ドラム２５にはナイロンメッシュ材（ストッキング材料）を巻き、さらに、ベルト２６にも第２被覆材２５ａとしてのテトロン（商品名）（ＮＢ９０、ＮＢＣ工業製）を巻いた。ドラム２５の表面温度は温度コントローラ２５ｂに備えられた赤外線温度計にて測定している。

本実施例１で得られたけん化膜１２は、幅が３５ｃｍ、長さが９ｍ、厚みが８０μｍであり、けん化前に比べて収縮はしたが、良好な平面性を有し、7 ｍｍφの円で打ち抜いた時の高低差Ｈは０. ２ｍｍであった。また、保証孔径は２．５μｍとなった。

けん化工程で用いるアルカリ水溶液を０．４７Ｎの水酸化カリウムとした他は実施例１と同様に実施した。

本実施例２で得られたけん化膜１２は、幅が３５ｃｍ、長さが９ｍ、厚みが８０μｍであり、けん化前に比べて収縮はしたが、良好な平面性を有し、7 ｍｍφの円で打ち抜いた時の高低差Ｈは０. ２ｍｍであった。また、保証孔径は２．５μｍとなった。

セルロースアセテート膜１１を次の保証孔径を有するものに代えて、実施例１と同様の方法でけん化膜１２を製造した。用いたセルロースアセテート膜１１は、各保証孔径はそれぞれ５μｍ、３μｍ、１．２μｍ、０．６５μｍ、０．３μｍのものである。

本実施例３で得られたけん化膜１２はいずれも高低差Ｈが０．１〜１．０ｍｍの良好な平面性を有していた。そして、上記の各保証孔径を有するセルロースアセテート膜１１からは、順に、２．５μｍ、１．０μｍ、０．７μｍ、０．４μｍ、０．２μｍの各保証孔径を有するけん化膜１２が得られた。

乾燥工程については、長さ６０ｃｍ、幅３０ｃｍのシート状に切断されたけん化膜を、特公昭４５−４６３３号公報実施例のように枠張り式の乾燥方法を用いて、１００℃の空気乾燥機内でけん化膜を乾燥した。その他の条件については、実施例１と同様に実施した。

本実施例４により得られたけん化膜には、乾燥中に収縮による破れが発生することがあった。また、得られたけん化膜は長さが５０ｃｍであり、生産性が悪かった。

乾燥装置１８による乾燥工程の代わりに、ぬれた状態のけん化膜をパスローラに巻きかけて、このローラの表面を１００℃に制御した。その他の条件については、実施例１と同様に実施した。

本実施例５により得られたけん化膜には、収縮によるしわが発生し、またこのけん化膜は平面性が悪く、高低差Ｈが１. ５ｍｍであった。

［核酸精製カートリッジの作製］
核酸吸着性多孔膜を収容して核酸分離精製用に用いられるカートリッジ用容器をハイインパクトポリスチレンで作製した。このカートリッジ用容器の本体は内径が７ｍｍである。上記実施例１にて得られたけん化膜１２であるセルロースアセテート微細多孔質膜を、上記核酸分離精製用カートリッジ用容器の中に、核酸吸着性多孔膜として収容して、核酸分離精製カートリッジを得た。

［核酸可溶化試薬の溶液及び洗浄液の調製］
核酸可溶化試薬の溶液と洗浄液とを調製した。核酸可溶化試薬の溶液の処方は以下の通りであり、また、洗浄液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの３０％エタノール溶液１０ミリモルである。
・塩酸グアニジン（ライフテクノロジー社製） ３８２ｇ
・Ｔｒｉｓ（ライフテクノロジー社製） １２．１ｇ
・Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ＩＣＮ社製） １０ｇ
・蒸留水・・・・・・上記物質に加えて全量が１０００ミリリットルとなるように使用。

［核酸精製操作］
ヒト前骨髄性白血病細胞（ＨＬ６０）培養液を用意する。このとき、細胞数が１×１０６個となるように調製し、Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺フリーＰＢＳにより、この細胞を洗浄する。４℃で５分間、重力加速度３００Ｇの条件にてスイングローターでこれを遠心分離し、浮遊細胞をペレット状にした後、上清を除去して、タッピングによって細胞を再懸濁した。この中へ、上記処方により調製した核酸可溶化試薬の溶液３５０μリットルを加え、ボルテックスミキサーにより１分間攪拌した。その後、７０％のエタノール３５０μリットルを加えて、ボルテックスミキサーにより５秒間撹拌した。撹拌した後、これを、上記作製した核酸分離精製カートリッジの中へ一の開口から注入し、続いてこの開口に圧力差発生装置を結合して、核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、けん化膜１２に通過させて接触させた。そして核酸分離精製カ−トリッジの他の開口部より液を排出した。

続いて、核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に洗浄液を５００μリットル注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合して、核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液をけん化膜１２に通過させ、他の開口より排出させた。４０μリットルのＤＮａｓｅ溶液（商品名；ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）をけん化膜１２上にアプライして、室温で１５分間放置した。続いて、先と同様の洗浄を２回実施した。その後、上記核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に、回収液１００μリットルを注入し、核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液をけん化膜１２に通過させ、他の開口より排出してこの液を回収した。回収した液量と、２６０ｎｍの吸光度測定から得られたＲＮＡ溶液の濃度とから、核酸回収量を計算した。

以上の操作をすべてＩＳＯ １４６４４における清浄度がクラス７であるクリーンルーム内で実施した。そして以上の操作を７回繰り返し実施した結果、核酸回収量（単位；μｇ）はそれぞれ、１１．８μｇ、１２．８μｇ、１２．７μｇ、１２．４μｇ、１２．３μｇ、１１．９μｇ、１１．８μｇとなり、これらの平均値（以下平均回収量Ａｖと称する）は１２．２μｇ、標準偏差（ＳＤ）は０．４μｇ、ＳＤ／ＡＶ（ＣＶ）は３．４μｇであった。この結果より、本発明により得られたセルロース微細多孔質膜は、再現性良く核酸を高得率で分離することができることがわかる。

けん化膜の乾燥工程はクリーンルーム内では実施しなかった。その他の条件は実施例１と同様に実施した。また、核酸分離精製カートリッジの製造工程においてもクリーンルームを利用しなかった他は実施例６と同様に実施した。

本実施例７の結果、核酸回収量（単位；μｇ）はそれぞれ、１１．６μｇ、９．２μｇ、９．６μｇ、１２．７μｇ、８．６μｇ、８．４μｇ、１０．５μｇとなり、平均回収量Ａｖは１０．１μｇ、標準偏差（ＳＤ）は１．６μｇ、ＳＤ／ＡＶ（ＣＶ）は１５．８μｇであった。

以上の実施例１〜７の結果より、本発明により得られたセルロース微細多孔質膜は、平面性に優れ、核酸分離精製カートリッジに好適に用いることができ、再現性良く核酸を高得率で分離することができることがわかる。

本発明を実施したセルロース微細多孔質膜の製造装置の概略図である。 ドラムとベルトとの断面図である。 けん化膜の平面性評価方法の説明図である。

符号の説明

１０ セルロース微細多孔質膜の製造装置
１１ セルロースエステル膜
１２ けん化膜
１５ けん化装置
１６ 中和装置
１７ 水洗装置
１８ 乾燥装置
２５ ドラム
２５ｂ 温度コントローラ
２５ｃ 第１被覆材
２６ ベルト
２６ａ ベルト本体
２６ｂ 第２被覆材
５０ クリーンルーム

Claims (6)

1. セルロースエステル誘導体からなる微細多孔質膜をけん化して、前記セルロースエステル誘導体をセルロースとするけん化工程と、
   前記けん化した前記微細多孔質膜を中和する中和工程と、
   前記中和工程後に前記微細多孔質膜を洗浄する洗浄工程と、
   前記洗浄工程後に前記微細多孔質膜を加熱乾燥させる乾燥工程と、
   を有し、
   前記乾燥が、ＩＳＯ １４６４４に規定されるクラス７またはそれ以上の清浄度を有するクリーンルーム内で行われるとともに、前記乾燥工程では、接触式ドラム乾燥機を用いることを特徴とするセルロース微細多孔質膜の製造方法。
2. 前記接触式ドラム乾燥機が、
   回転駆動され、かつ、表面温度制御可能なドラムと、
   前記ドラムの外周面の一部に巻きかけられて搬送されるベルトとを有し、
   前記洗浄工程を経た微細多孔質膜が前記ドラムと前記ベルトとの間を搬送されながら加熱されることを特徴とする請求項１記載のセルロース微細多孔質膜の製造方法。
3. 前記ドラムが、前記微細多孔質膜との接着を防止するための第１の被覆材を表面に備えることを特徴とする請求項２記載のセルロース微細多孔質膜の製造方法。
4. 前記ベルトの表面の凹凸の差を弾性により吸収することによって、前記凹凸が前記微細多孔質膜につくことを防止する第２の被覆材が、前記ベルトの表面に備えられることを特徴とする請求項２または３記載のセルロース微細多孔質膜の製造方法。
5. 前記搬送の速度を０．０５ｍ／分以上５．０ｍ／分以下とすることを特徴とする請求項１ないし４いずれかひとつ記載のセルロース微細多孔質膜の製造方法。
6. けん化と中和と洗浄とのすべての前記工程で用いる水がヌクレアーゼフリー水であることを特徴とする請求項１ないし５いずれかひとつ記載のセルロース系微細多孔質膜の製造方法。

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