TW202117021A

TW202117021A - 基因體序列之偵測與用於其之探針分子

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Publication number: TW202117021A
Application number: TW109124256A
Authority: TW
Inventors: 侯格克拉普; 索妮雅班納
Original assignee: 英商安全保護生技系統公司
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2020-07-17
Publication date: 2021-05-01
Also published as: AU2020317617A1; BR112021026672A2; CN114269944A; WO2021013736A1; JP2022540716A; MX2022000628A; IL289760A; ZA202200284B; US20220267833A1; KR20220035482A; CA3147364A1; EP3999658A1

Abstract

利用虛擬探針鑑認可存在於樣本中之同源基因體序列之方法、用於區分同源基因體序列之陣列、用於區分同源基因體序列之系統、以及適用於本發明之方法、陣列、及系統中之探針分子。

Description

基因體序列之偵測與用於其之探針分子

無相關申請案之交叉參考

本申請案主張2019年7月17日申請之美國臨時申請案第62/876,413號及2020年4月3日申請之第63/004,664號之優先權，該等申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。序列表

本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且其全文以引用之方式併入本文中。將2020年7月14日產生之該ASCII複本命名為SGB-006WO_ST25且大小為1,581個位元組。

傳染性病原之鑑認在確定個體之恰當診斷及治療過程中往往為至關重要的。傳染原之錯誤鑑認可導致治療過程之不適當或無效。對定序技術之改良有助於確定多種致病細菌之基因體之部分或完整序列。密切相關之細菌物種通常包含具有極高程度序列一致性的基因體序列。密切相關之物種之間的區分需要偵測兩個或更多個同源基因體序列之間的差異之靈敏及精確的方法。在一些情況下，使用單一寡核苷酸探針分子區分同源基因體序列可為不切實際的（若非不可能）。

因此，需要用於區分密切相關之微生物物種的新穎方法。

本發明提供鑑認可存在於樣本中之基因體序列及/或區分同源基因體序列之方法。所述方法利用探針分子之組合，所述探針分子獨自不能但共同能區分來自密切相關之微生物物種的同源基因體序列，且亦可鑑認可能存在於樣本中之基因體序列。為方便起見，如此探針分子之組合在本文中稱為「虛擬探針（virtual probe）」。

虛擬探針可包含複數種（例如兩種、三種或更多種）個別探針分子。在不定序之情況下，一基因體DNA（或自所述基因體DNA擴增之PCR產物）與個別探針分子之雜交可能不足以區別所述基因體DNA與一可存在於相同樣本中之基因上相關的物種之同源基因體DNA，尤其當使用靶向相關物種中之保守序列之通用引子來擴增所述基因體DNA時。然而，當所述基因體DNA或對應PCR擴增子用包含二或多種探針分子之虛擬探針探測時，與所述虛擬探針的雜交之模式之差異可區別來自兩個相關物種之基因體DNA或自其擴增之同源擴增子。

因此，藉助於包含複數種探針分子（例如具有可區分信號之探針分子），本發明之虛擬探針可組合區分一基因體序列與一同源基因體序列（或自其製備之擴增子）且鑑認存在於生物樣本中之微生物物種。舉例而言，根據本發明之方法，二或三種寡核苷酸探針分子之組合可組合形成虛擬探針，所述虛擬探針區分來自相關物種（諸如和緩鏈球菌（S. mitis ）及肺炎鏈球菌（S. pneumoniae ））之擴增子。因此，當樣本用作模板DNA之來源（例如在PCR反應中）時，任何所得PCR產物與所述虛擬探針之雜交可確定兩個物種中之哪個存在於樣本中。

在認識到使用來自細菌16S rRNA基因之序列設計的物種特異性寡核苷酸探針分子在不同物種中展示交叉反應性之後，開發出使用本文所揭示之虛擬探針鑑認同源基因體序列之方法。由於基因體之此區域之序列之間的低變化性，無法設計物種特異性探針分子。然而，發現不同物種仍可藉由分析來自與虛擬探針的雜交之信號來區分，所述虛擬探針組合多種寡核苷酸探針分子，所述寡核苷酸探針分子本身獨自不能區分不同物種。

在一個方面，本發明提供確定第一生物體（或對應第一基因體）及/或第二生物體（或對應第二基因體）是否存在於樣本中之方法。

如此方法可包含用針對所述第一生物體及所述第二生物體之虛擬探針探測所述樣本，以確定對應於所述第一基因體或第二基因體之一或多種目標核酸之存在或不存在。所述目標核酸可為（例如）基因體片段或在DNA擴增反應（諸如PCR）中產生之擴增子。所述虛擬探針包含二或多種探針分子，其中之各者能夠與所述對應於第一基因體之目標核酸之一或多者及/或所述對應於第二基因體之一或多種同源目標核酸之特異性雜交。由於所述探針分子與所述對應於第一及第二基因體之目標核酸不一致地雜交，因此所述虛擬探針可區分所述對應於第一基因體之目標核酸與所述對應於第二基因體之目標核酸。

例示性方法包含以下步驟：（a）使用一或多對能夠與所述第一及第二基因體（若存在於所述樣本中）雜交且自其等引發聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增之PCR引子對所述樣本進行PCR擴增反應。各組引子產生較佳對所述樣本中可能存在之各生物體而言獨特的擴增子組。因此，擴增在所述第一基因體存在於所述樣本中之情況下產生第一擴增子組且在所述第二基因體存在於所述樣本中之情況下產生不同的第二擴增子組。若僅使用單對PCR引子，則各擴增子組僅含有單一擴增子，且當使用複數種PCR引子對時，擴增子組可含有二或多種擴增子（例如複數種單一擴增子）。（b）在步驟（a）之後，用虛擬探針探測任何所得PCR擴增產物以確定所述第一擴增子組及第二擴增子組之存在或不存在。由於所述虛擬探針包含二或多種能夠以不同方式與所述第一擴增子組及第二擴增子組特異性雜交的探針分子（例如二或多種寡核苷酸探針分子），因此所述虛擬探針可區分所述第一擴增子組與所述第二擴增子組。各虛擬探針內之探針分子可藉助於具有不同標記（例如螢光標記，例如用不同螢光標記來標記之分子信標）或置於陣列上之分開的位置處來區分。

因此，所述PCR反應之PCR擴增產物與所述虛擬探針之雜交可區分所述第一與第二基因體，由此鑑認所述樣本中所述第一及/或第二生物體之存在。如本文所用，對於所述樣本中之生物體之存在的提及並不意謂所述樣本具有活生物體，僅僅意謂來自所述生物體之足夠的基因體DNA存在於待偵測或充當用於擴增反應（諸如PCR反應）之模板的樣本中。同樣，對於樣本中基因體之存在的提及並不意謂所述樣本具有完整的基因體，僅僅意謂來自所述基因體之足夠的DNA存在於待偵測或充當用於擴增反應（諸如PCR反應）之模板的樣本中。

舉例而言，當單一組引子用於PCR擴增反應中時，所述第一擴增子組及所述第二擴增子組可各自包含一種擴增子（分別稱為「第一擴增子（first amplicon）」及「第二擴增子（second amplicon）」）。可替代地，例如當超過一組引子用於PCR擴增反應中時，所述第一擴增子組及/或所述第二擴增子組可包含超過一種擴增子（所述第一擴增子組中之各擴增子稱為「第一擴增子」且所述第二擴增子組中之各擴增子稱為「第二擴增子」）。用於區分來自同源基因體序列之同源擴增子之其他例示性方法描述於章節6.2及編號實施方式1至86、130至132及135中，見下文。

本發明進一步提供用於區分同源基因體序列之陣列、用於區分同源基因體序列之系統、以及適用於（例如）本發明之方法、陣列、及系統中之寡核苷酸探針分子。

在一個方面，本發明提供用於區分來自第一基因體之第一基因體序列與來自第二基因體之第二同源基因體序列之可定址陣列。舉例而言，可在本文所描述之方法中使用本發明之可定址陣列。本發明之可定址陣列可包含一群位置可定址之寡核苷酸探針分子，所述寡核苷酸探針分子各自位於所述陣列上之分開的位置處，其中所述群之寡核苷酸探針分子中之各探針分子包含與所述第一基因體序列或第二基因體序列中之15至40個連續核苷酸90%至100%互補的核苷酸序列。所述可定址陣列可進一步可選地包含一或多種對照探針分子。

本發明之例示性可定址陣列描述於章節6.3及編號實施方式87至129及153至155中，見下文。

在另一個方面，本發明提供用於區分第一基因體序列與第二同源基因體序列（若存在於樣本中）之系統。例示性系統可包含：（a）光學讀取器，其用於產生本發明之陣列的各探針分子位置之信號數據；以及（b）至少一個處理器，其：（i）經設置以自所述光學讀取器接收信號數據；（ii）經設置以分析一或多種虛擬探針（例如具有如本文中所描述之特徵的虛擬探針）之信號數據；及（iii）具有用於輸出分析結果之至儲存或顯示裝置或網路之介面。

例示性系統描述於章節6.4及編號實施方式133至134中，見下文。

在另一個方面，本發明提供適用於虛擬探針之例示性寡核苷酸探針分子及包含二或多種如此寡核苷酸探針分子的套組。本發明之寡核苷酸探針分子可包括於本發明之可定址陣列上及/或用於本發明之方法中。例示性寡核苷酸探針分子及虛擬探針描述於章節6.2.4及編號實施方式136至152中，見下文。例示性套組描述於章節6.5及編號實施方式156至167中，見下文。

6.1. 定義

擴增子 ：擴增子為由PCR擴增反應產生之核酸分子。

不對稱引子對 ：由延伸引子及未延伸引子組成之引子對。

對應：關於具有序列一致性或互補之不同長度之兩個核酸股，術語「對應（corresponding）」係指於兩股中皆存在之序列重疊或互補的區域，如上下文規定。

直接重複 ：在延伸引子之「B」區之上下文中，「直接重複（Direct Repeat）」意謂與「A」區之一部分直接互補的核苷酸序列（亦即，具有相同5'至3'方向的互補序列）。

延伸引子 :含有以下者之PCR引子：（a）位於其3'端處之與目標股1中之對應區具有至少75%序列一致性或與目標股2中之對應區具有至少75%序列互補性的「A」區；（b）位於其5'端處之包含與「A」區之至少一部分互補之序列的「B」區；以及（c）位於「A」區與「B」區之間的可選的「C」區。

同源基因體序列 ：同源基因體序列為在具有共用祖先但核苷酸序列不完全一致之不同物種或菌株中找到之基因體序列。例示性同源基因體序列包括16S rRNA基因、23S rRNA基因、及16S-23S內部轉錄間隔區（internal transcribed spacer；ITS）序列。

反向重複 ：在延伸引子之「B」區之上下文中，「反向重複（Inverted Repeat）」意謂與「A」區之一部分反向互補的核苷酸序列（亦即，具有相反5'至3'方向的互補序列）。

解鏈溫度 （ T_m ）：DNA雙螺旋中之一半會解離變為單股之溫度。由去氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotide；DNA）構成之直鏈引子之T_m 已通常藉由以下者計算：「百分比GC（percent GC）」法（PCR實驗方法，方法及應用之指南（PCR PROTOCOLS, a Guide to Methods and Applications）,Innis等人編,學術出版社（Academic Press）（聖地亞哥，加利福尼亞州（美國）1990）或「2 (A+T)加4 (G+C)」法（Wallace等人,1979,Nucleic Acids Res. 6（11）:3543-3557）或「最近鄰（Nearest Neighbor）」法（Santa Lucia,1998,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1460-1465；及Allawi及Santa Lucia,1997,Biochem. 36:10581-10594）。出於申請專利範圍之目的，根據「最近鄰」法計算DNA之T_m ，且非天然存在之鹼基（例如2-去氧肌苷）視為腺嘌呤。

PCR 產物股 1 ：PCR產物股1係指由目標核酸與不對稱引子對產生且與所述不對稱引子對之未延伸引子互補的雙股PCR產物中的股。

PCR 產物股 2 ：PCR產物股1係指由目標核酸與不對稱引子對產生且與所述不對稱引子對之延伸引子互補的雙股PCR產物中的股。

PCR 試劑：除非上下文另外規定，否則術語「PCR試劑（PCR Reagent）」係指除模板核酸、熱穩定聚合酶及引子以外的PCR反應之組分。PCR試劑典型地包括dNTP（且除未經標記之dNTP以外，亦可包括經標記（例如經螢光標記）之dNTP）、緩衝劑、及含有二價陽離子之鹽（例如MgCl₂ ）。

引子：在其3'末端具有自由羥基的具有至少12個核苷酸之DNA寡核苷酸。引子可包括天然存在及非天然存在之核苷酸（例如含有通用鹼基之核苷酸，諸如3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或2-去氧肌苷，2-去氧肌苷為較佳的）。除非上下文另外規定，否則術語「引子（primer）」亦指在將混合鹼基包括於引子設計及構築中以使得其等與目標核酸分子中之變體序列雜交時產生的引子分子之混合物。目標序列變體可為物種間或物種內變體。混合鹼基之標準命名展示於表1中：

表 1 混合鹼基命名
R	A、G
Y	C、T
M	A、C
K	G、T
S	C、G
W	A、T
H	A、C、T
B	C、G、T
V	A、C、G
D	A、G、T
N	A、C、G、T

較佳地，各引子在與目標核酸互補之區域中含有不超過三個混合鹼基。在一些實施方式中，引子在與目標核酸互補之區域中含有零個、一個、兩個或三個混合鹼基。

引子對 ：能夠與以下者雜交且自其引發DNA聚合反應的正向及反向引子對（其中之各者可為具有序列變化以針對目標序列中之可能變化的引子之混合物）：少於5,000個鹼基對之區域內之相同核酸分子之不同股。在某些實施方式中，引子對能夠與以下者雜交且自其引發DNA聚合反應：少於2,500個鹼基對或少於1,500個鹼基對之區域內之相同核酸分子之不同股。

樣本：如本文所用，術語「樣本（sample）」係指含有或懷疑含有所關注之核酸（例如基因體、基因體片段、對應於基因體之區域之擴增子或另一目標核酸）之任何樣本。樣本可經歷一或多種處理且仍被視為「樣本」。舉例而言，經歷PCR擴增反應之樣本在PCR擴增反應之後仍為「樣本」。

單一擴增子 ：如本文所用，術語「單一擴增子（single amplicon）」係指藉由PCR擴增反應自單一生物體使用單一引子對產生之核酸分子或核酸分子之群。典型地，「單一擴增子」係指具有獨特序列之PCR產物，但亦可指具有一群（例如一組）獨特序列的PCR產物，例如當生物體對於所擴增之序列為異型合子時。

特異性 ：如本文所用，關於探針分子與擴增子之結合的術語「特異性（specific）」意謂探針分子對其目標擴增子具有相較於對其他非同源擴增子者大的親和力，典型地具有大得多的親和力，但並不要求探針分子對其目標具有絕對特異性。因此，探針分子可（例如）能夠與包含第一基因體序列之擴增子及包含第二同源基因體序列之擴增子雜交，所述第二同源基因體序列與所述第一基因體序列具有一或多個核苷酸不同。

目標股 1 ：目標股1係指不對稱引子對中之未延伸引子與之互補的雙股目標核酸中之股。

目標股 2 ：目標股2係指不對稱引子對中之延伸引子中的「A」區與之互補的雙股目標核酸中之股。

未延伸引子 ：基本上由與目標股2中之對應區具有至少75%序列一致性或與目標股1中之對應區具有至少75%序列互補性的核苷酸序列組成的PCR引子。提及未延伸引子之術語「基本上由…組成（consisting essentially of）」意謂核苷酸序列在與目標序列（至少75%）互補之區域之5’處可含有不超過3個額外核苷酸。6.2. 使用虛擬探針區分同源基因體序列之方法

本發明提供區分來自第一生物體之第一基因體序列與來自第二生物體之第二同源基因體序列之方法。所述方法允許使用虛擬探針鑑認樣本中所存在之生物體。用於基因體序列之虛擬探針通常包含二或多種探針分子，所述探針分子可（例如）藉助於其等在可定址陣列上之分開的位置或藉由差異性標記（例如以不同螢光部分）來區分。為方便起見，來自虛擬探針內之個別探針分子之讀出在本文中有時稱為「信號（signal）」。為了清楚起見，探針分子無需經標記來產生「信號」。舉例而言，與經螢光標記擴增子之雜交之不存在可構成「信號」。

用於基因體序列之各虛擬探針含有能夠與對應於所述基因體序列之目標核酸（例如擴增子）特異性雜交之（構成所述虛擬探針之複數種探針分子中之）至少一種探針分子。在一些情況下，所述虛擬探針中之二或多種探針分子能夠與對應於所述基因體序列之目標核酸（例如擴增子）雜交。虛擬探針中之探針分子與來自相關基因體序列之不同目標核酸（例如擴增子）之雜交模式充分不同，以便區分來自相關基因體序列之目標核酸，例如區分來自第一基因體之第一擴增子組與來自具有同源基因體序列之第二基因體之第二擴增子組。所述方法可用於（例如）確定細菌之特定物種或菌株是否存在於經探測之擴增子直接自其擴增（例如其中所述樣本被直接用於PCR中）或間接自其擴增（例如經由中間純化或富集步驟，諸如章節6.2.1中所描述之珠磨（bead beating）方法）的樣本中。本文所揭示之各種實施方式描述用虛擬探針探測DNA擴增反應（諸如PCR反應）之產物；然而，應理解，探測可使用能夠偵測非擴增基因體DNA之方法替代地進行。用於偵測非擴增基因體DNA之例示性方法描述於非擴增基因體 DNA 之偵測 （Detection of Non-Amplified Genomic DNA）2012,Spoto及Corradini（編）doi.org/10.1007/978-94-007-1226-3中，其內容以全文引用之方式併入。如此方法包括光學偵測方法（參見例如非擴增基因體 DNA 之偵測 中之Li及Fan,2012,「非擴增基因體DNA之光學偵測（Optical Detection of Non-amplified Genomic DNA）」,第153-183頁）、電化學偵測方法（參見例如非擴增基因體 DNA 之偵測 中之Marin及Merkoçi,2012,「使用基於奈米材料之感測器之DNA電化學偵測（Electrochemical Detection of DNA Using Nanomaterials Based Sensors）」,第185-201頁）、壓電感測方法（參見例如非擴增基因體 DNA 之偵測 中之Minunni,2012,「用於DNA靈敏偵測之壓電感測（Piezoelectric Sensing for Sensitive Detection of DNA）」,第203-233頁）、基於表面電漿子共振之方法（參見例如非擴增基因體 DNA 之偵測 中之D'Agata及Spoto,2012,「基於表面電漿子共振之方法」,第235-261頁）、以及平行光學及電化學方法（參見例如非擴增基因體 DNA 之偵測 中之Knoll等人,2012,「平行光學及電化學DNA偵測」,第263-278頁）。因此，在一些實施方式中，在不存在DNA擴增步驟下（例如其中所述樣本含有或疑似含有為基因體片段的目標核酸）進行樣本探測。

確定來自第一生物體之第一基因體或來自第二生物體之第二基因體之存在（若任一者存在於樣本中）的方法可包含使用能夠與所述第一基因體及所述第二基因體雜交且自其等引發PCR擴增的PCR引子對所述樣本進行PCR擴增反應（例如如章節6.2.3中所描述）之步驟。自所述第一基因體（若存在於所述樣本中）之擴增產生第一擴增子組。自所述第二基因體（若存在於所述樣本中）之擴增產生第二擴增子組。所述PCR擴增之產物可用虛擬探針探測以確定所述第一擴增子組及第二擴增子組之存在或不存在。所述探測可在所述PCR擴增反應期間（例如當使用即時PCR時，例如如章節6.2.3.5中所描述）或在所述PCR擴增反應之後（例如藉由使用包含寡核苷酸探針分子之陣列，例如如章節6.3中所描述）進行。當在所述PCR反應之後進行所述探測（例如在陣列上）時，其適用於在所述PCR之混合物中包括經螢光標記之核苷酸以標記所得之PCR擴增子。所述可定址陣列上之螢光標記之一或多個位置及在一些情況下其強度可構成信號，所述信號用於構成所述虛擬探針之探針分子。

若確定所述第一擴增子組存在，則可得出以下結論：所述樣本含有所述第一基因體。同樣，若確定所述第二擴增子組存在，則可得出以下結論：所述樣本含有所述第二基因體。虛擬探針可用於區分由相關微生物製備之第一擴增子組與第二擴增子組，所述相關微生物例如為凝固酶陰性及凝固酶陽性葡萄球菌屬物種（例如如章節6.2.5.1中所描述）、格氏鏈球菌（S. gordonii ）及咽峽炎鏈球菌（S. anginosus ）（例如如章節6.2.5.2中所描述）或和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌（例如如章節6.2.5.3中所描述）。

樣本可為（例如）生物樣本、環境樣本、或食品。在一些實施方式中，所述樣本被一或多種微生物感染或處於被感染一或多種微生物感染之風險下。例示性樣本描述於章節6.2.1中。

涵蓋使用本發明之方法來區分任何同源基因體序列（及對應於所述同源基因體序列之擴增子）。當確定樣本中是否可能存在細菌物種或相關細菌物種時，可使用能夠區分對應於編碼rRNA（例如16S rRNA或23S rRNA）之基因體序列或rRNA基因之間的基因間間隔域（例如16S rRNA - 23S rRNA基因間間隔區）的目標核酸（例如擴增子）的虛擬探針。可藉由本發明之方法區分之例示性同源基因體序列之特徵描述於章節6.2.2中。

用於根據本發明之方法使用虛擬探針探測之擴增子可藉由使用能夠與第一生物體之基因體及第二生物體之基因體雜交且自其等引發PCR擴增的PCR引子對樣本進行PCR擴增反應來產生，所述樣本含有或疑似含有或處於含有所述第一生物體及/或所述第二生物體之風險下。所述PCR擴增反應可用單一組引子進行（當所述第一生物體及第二生物體存在於所述樣本中時，其應分別產生第一擴增子及第二擴增子）。可替代地，當所述第一及第二生物體分別存在於所述樣本中時，所述PCR擴增反應可用超過一組引子進行，以產生對應於所述第一基因體之多種擴增子及對應於所述第二基因體之多種擴增子。可用於本發明之方法中之例示性PCR擴增反應描述於章節6.2.3中。除PCR以外之核酸擴增技術（例如等溫擴增技術）（諸如環介導之等溫擴增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）、基於核酸序列之擴增（nucleic acid sequence based amplification，NASBA）、股置換擴增（strand displacement amplification，SDA）、及滾環式擴增（rolling circle amplification，RCA））亦可用以製備擴增子（參見例如Fakruddin等人,2013,J Pharm Bioallied Sci.5（4）: 245-252。因此，應理解，本文中描述為適用於PCR擴增產物之實施方式同樣適用於使用替代性擴增方法產生之擴增產物。

可用於虛擬探針中之探針分子之例示性特徵及虛擬探針之例示性特徵分別描述於章節6.2.4及6.2.5中。

在一些實施方式中，PCR擴增產物之探測包含以下步驟：使所述PCR擴增產物與陣列（例如如章節6.3中所描述）接觸、自所述陣列洗滌未結合之核酸分子、以及量測所述陣列上各探針分子位置處之標記（例如螢光標記）的信號強度。

在其他實施方式中，所述PCR擴增產物之探測包含量測來自用於即時PCR反應中之寡核苷酸探針分子的信號。

可用以執行本發明之方法的系統描述於章節6.4中。

可用於本發明之方法中之套組描述於章節6.5中。6.2.1. 樣本

用於本發明之方法中之樣本可為含有基因體DNA的任何類型或形式之樣品，所述基因體DNA處於適用於PCR擴增之狀況下或可製備成處於適用於PCR擴增之狀況下。在某些實施方式中，所述樣本處於被一或多種微生物（例如一或多種物種的微生物）感染之風險下。在其他實施方式中，所述樣本疑似具有一或多種微生物（例如一或多種物種的微生物）之感染。所述樣本可為（例如）生物樣本、環境樣本或食品。

樣本之實例包括各種流體樣本。在一些情況下，所述樣本可為來自個體之體液樣本。所述樣本可包括自個體收集之組織。所述樣本可包括個體之體液、分泌物、及/或組織。所述樣本可為生物樣本。所述生物樣本可為體液、分泌物、及/或組織樣本。生物樣本之實例包括（但不限於）血液、血清、唾液、尿液、胃液及消化液、淚液、糞便、精液、陰道液、來源於腫瘤組織之間質液、眼液、汗液、黏液、耳垢、油、腺體分泌物、呼出氣體、脊髓液、毛髮、指甲、皮膚細胞、血漿、鼻拭子或鼻咽洗滌液、脊髓液、腦脊髓液、組織、咽喉拭子、傷口拭子、生檢、胎盤液、羊水、臍帶血、增強液、腔液、痰、膿或其他傷口滲出液、藉由傷口清創術或切除取樣之感染組織、腦脊髓液、灌洗物、白細胞生成標本、腹膜透析液、乳汁、及/或其他排泄物。

個體可提供樣本，及/或樣本可自個體收集。所述個體可為人類或非人類動物。所述樣本可自活的或死的個體收集。所述動物可為哺乳動物，諸如家畜（例如乳牛、豬、綿羊）、運動動物（例如馬）、或寵物（例如狗或貓）。所述個體可為患者、臨床個體、或臨床前個體。個體可經歷診斷、治療、及/或疾病管理或生活方式或預防性照護。所述個體可在或可不在健康照護專業人員之照護下。

在一些實施方式中，所述樣本可為環境樣本。環境樣本之實例包括空氣樣本、水樣本（例如地下水、地表水、或廢水）、土壤樣本、及植物樣本。

其他樣本包括食品、飲料、製造材料、紡織物、化學品、及治療。

在一些實施方式中，所述樣本為含有或疑似含有諸如以下者中之一或多者的病原體之樣本：結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis ）、副結核鳥分枝桿菌亞種（Mycobacterium avium subsp paratuberculosis ）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）（包括二甲氧苯青黴素靈敏性及二甲氧苯青黴素抗性金黃色葡萄球菌（methicillin resistantStaphylococcus aureus ，MRSA））、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis ）、路鄧葡萄球菌（Staphylococcus lugdunensis ）、嗜麥芽葡萄球菌（Staphylococcus maltophilia ）、釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes ）、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae ）、流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）、副流感嗜血桿菌（Haemophilus parainfuluezae ）、黏膜炎莫拉氏菌（Moraxella catarrhalis ）、克雷伯氏肺炎桿菌、產酸克雷伯氏菌、大腸桿菌、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa ）、不動桿菌屬物種（Acinetobacter sp.）、百日咳博德氏桿菌（Bordetella pertussis ）、奈瑟氏腦膜炎菌（Neisseria meningitidis ）、炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis ）、諾卡菌屬物種（Nocardia sp.）、放線菌屬物種（Actinomyces sp.）、肺炎黴漿菌（Mycoplasma pneumoniae ）、肺炎衣原體（Chlamydia pneumonia ）、軍團菌屬物種（Legionella species ）、傑氏肺囊蟲（Pneumocystis jiroveci ）、A型流感病毒（influenza A virus）、巨細胞病毒、鼻病毒、屎腸球菌（Enterococcus faecium ）、鮑氏不動桿菌（Acinetobacter baumannii ）、無枝菌酸棒狀桿菌（Corynebacterium amycolatum ）、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes ）、糞腸球菌CI 4413（Enterococcus faecalis CI 4413）、陰溝腸桿菌、黏質沙雷菌（Serratia marcescens ）、馬鏈球菌（Streptococcus equi ）、白色念珠菌（Candida albicans ）、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis ）、黃色微球菌（Micrococcus luteus ）、嗜麥芽寡養單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia ）（黃桿菌（Xanthomonas ））以及沙門氏菌屬物種（Salmonella sp.）。在一些實施方式中，所述樣本為含有或疑似含有腸桿菌科群細菌（諸如產氣腸桿菌、阿氏腸桿菌或霍氏腸桿菌）之樣本。

樣本可在進行PCR擴增之前經預處理。因此，在本發明之方法中經受PCR擴增之樣本可為（例如）自此章節中或在本發明中其他地方所描述之樣本之類型中之任一者處理、萃取或分離的樣本（例如自尿液、痰、傷口拭子、血液、或腹膜透析液處理、萃取或分離之樣本）。

可使用之預處理步驟之實例包括如本文所論述或否則如所屬技術領域中已知之過濾、蒸餾、萃取、濃縮、離心、干擾性組分之不活化、試劑之添加、及類似者。

自生物樣本移除非所要細胞類型及粒狀物質以在PCR之前最大化基因體自所關注細胞類型之回收可為尤其有利的。

若意欲偵測生物樣本中之細菌，則以下者可為所欲的：經由過濾器預處理生物樣本以使得粒子及非細菌細胞被保留在過濾器上，而細菌細胞（若所欲，包括其孢子）穿過。如本文所用之「過濾器（filter）」為允許粒子及分子基於大小的差異性通過的膜或裝置。典型地，此藉由在所述過濾器中具有特定標稱尺寸之孔來完成。舉例而言，特別可用於細菌偵測應用之過濾器具有足夠大以允許細菌通過但足夠小以防止存在於所關注之樣本中之真核細胞通過的孔。一般而言，細菌細胞之直徑在0.2 µm至2 µm（微米（micrometer/micron））範圍內，大多數真菌細胞之直徑在1 µm至10 µm範圍內，血小板之直徑為約3 µm且大部分有核哺乳動物細胞之直徑典型地為10 µm至200 µm。因此，若意欲偵測細菌，小於2 µm或小於1 µm之過濾器孔徑尤其適用於自生物樣本移除非細菌細胞。

除過濾步驟以外或作為過濾步驟之替代，生物樣本可經受離心以自樣本移除細胞及碎屑。使真核沈澱但不使細菌細胞沈澱之離心參數為所屬技術領域中已知的。若所欲，隨後可過濾上清液。

可使用所屬技術領域中已知的用於製備包含基因體DNA以用於PCR之樣本的各種方法中之任一者製備樣本以用於PCR擴增（例如按照在上文所描述之預處理步驟中之一或多者）。在一些實施方式中，可使用市售之DNA萃取試劑、套組、及/或儀器，例如QIAamp DNA微型套組（Qiagen）、MagMAX™ DNA多樣本套組（ThermoFisher Scientific）、Maxwell® RSC儀器（Promega）等。

在一些實施方式中，藉由包含珠磨之方法（bead-beating）（例如如美國專利第10,036,054號中所描述，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中）製備用於PCR之樣本。血液可在收集於市售血液收集管中之後直接進行珠磨，例如藉由將珠磨珠添加至收集管中且對收集管進行攪拌。可用於收集血液樣本之市售收集管之實例包括含有EDTA之淡紫色蓋子管、含有檸檬酸鈉之淺藍色蓋子管、含有草酸鉀之灰色蓋子管、或含有肝素之綠色蓋子管。6.2.2. 同源基因體序列

本發明之方法可用於鑑認及/或區分第一及第二同源基因體序列（及目標核酸，諸如對應於所述第一及第二同源基因體序列之擴增子）。同源基因體序列為在具有共用祖先但核苷酸序列不完全一致之物種或菌株中找到之基因體序列。因此，舉例而言，同源基因體序列於密切相關之物種或菌株中找到。

所述第一基因體序列及所述第二基因體序列通常為來自第一微生物及第二微生物（例如細菌、病毒、或真菌）之基因體序列。所述第一及/或第二微生物可為（例如）人類病原體及/或動物病原體。所述微生物可來自相同目、相同科、相同屬、相同群、或甚至相同種。在較佳實施方式中，所述第一及第二微生物為細菌。

定序技術之進展已導致多個公共資料庫儲存庫（諸如國立生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information；NCBI）、歐洲分子生物學實驗室（European Molecular Biology Laboratory；EMBL）及日本DNA資料庫（DNA Databank of Japan；DDBJ））中可得之完整細菌基因體序列之數目實質上增加，且此類資料庫可用以鑑認同源基因體序列。

密切相關之微生物中之同源基因體序列往往於編碼rRNA之基因及編碼rRNA之基因之間的基因間間隔區中找到。使用16S核糖體RNA（16S ribosomal RNA；16S rRNA）之基因進行細菌物種之序列比較已有很長的歷史。16S核糖體RNA基因編碼細菌核糖體之30S小型次單元（負責蛋白產生之蛋白質/RNA複合物）之16S RNA組分。此基因包含一些高度保守序列區域，其間穿插九個高度變異區（V1-V9）。此等高度變異區中之序列變化為密切相關之物種之間的可觀測差異之大多數。由於此等基因中所觀測到之序列演化的慢速率，16S rRNA序列已用於構築多個細菌物種之種系發生樹（phylogenic tree）。由自GenBank獲得之數個葡萄球菌屬物種之16S rRNA基因製備的例示性種系發生樹展示於圖1中。

細菌基因體含有第二核糖體rRNA基因，23S rRNA基因。16S rRNA及23S rRNA基因藉由稱為16S-23S內部轉錄間隔區（ITS）或16S-23S基因間間隔區的間隔區彼此隔開。16S-23S rRNA ITS區包含高度變異區，該等高度變異區包含可用於區分及鑑認特定細菌物種之物種及物種間特異性序列（K. Okamura等人,2012）。由16s rRNA及16s-23s rRNA基因體序列之多重排比產生之草綠色鏈球菌群的例示性種系發生樹展示於圖2中。

在本發明之方法之一些實施方式中，所述第一基因體序列及所述第二基因體序列各自包含編碼rRNA之基因的核苷酸序列。在其他實施方式中，所述第一基因體序列及所述第二基因體序列各自包含在rRNA基因之間的基因間間隔區之核苷酸序列。

在所述微生物為細菌之實施方式中，所述第一基因體序列及所述第二基因體序列可各自包含（例如）16S rRNA基因或23S rRNA基因之核苷酸序列。在一些實施方式中，所述第一基因體序列及所述第二基因體序列各自包含16S rRNA基因之核苷酸序列。在其他實施方式中，所述第一基因體序列及所述第二基因體序列各自包含23S rRNA基因之核苷酸序列。在其他實施方式中，所述基因體序列包含於16S-23S基因間間隔區中找到之核苷酸序列。

在某些特定實施方式中，所述第一基因體序列及/或所述第二同源基因體序列為來自病原體（例如細菌、病毒或真菌）之基因體序列，所述病原體可於人類血液、尿液或腹膜液中找到。此類病原體之實例包括（但不限於）結核分枝桿菌、副結核鳥分枝桿菌亞種、金黃色葡萄球菌（包括二甲氧苯青黴素靈敏性及二甲氧苯青黴素抗性金黃色葡萄球菌（MRSA））、表皮葡萄球菌、路鄧葡萄球菌、嗜麥芽葡萄球菌、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、黏膜炎莫拉氏菌、克雷伯氏肺炎桿菌、產酸克雷伯氏菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、不動桿菌屬物種、百日咳博德氏桿菌、奈瑟氏腦膜炎菌、炭疽芽孢桿菌、諾卡菌屬物種、放線菌屬物種、肺炎黴漿菌、肺炎衣原體、軍團菌屬物種、傑氏肺囊蟲、A型流感病毒、巨細胞病毒、鼻病毒、屎腸球菌、鮑氏不動桿菌、無枝菌酸棒狀桿菌、產氣腸桿菌、糞腸球菌CI 4413、陰溝腸桿菌、黏質沙雷菌、馬鏈球菌、白色念珠菌、奇異變形桿菌、黃色微球菌、嗜麥芽寡養單胞菌（黃桿菌）、以及沙門氏菌屬物種。6.2.3. PCR 擴增

在本發明之方法之一些實施方式中，使用能夠與可存在於樣本中之基因體雜交且自其引發PCR擴增之PCR引子對樣本進行PCR擴增。所述PCR擴增之反應可為「對稱（symmetric）」PCR反應，亦即，所述反應藉由利用正向引子及反向引子製得模板DNA之雙股複本，所述正向引子及反向引子經設計以具有彼此相等或彼此在數℃內之「解鏈溫度（melting temperature）」或「T_m 」。用於引子設計之常用電腦軟體程式警告使用者避開高T_m 差異，且具有自動T_m 匹配特徵。亦可使用可製得單股DNA擴增子之「不對稱（asymmetric）」PCR反應。亦可使用即時PCR反應。在PCR擴增反應之上下文中，藉由所述反應擴增之基因體序列可稱為「目標（target）」核酸、「模板（template）」核酸、或類似者。

PCR擴增反應可使用單一引子組或多個引子組（例如當所述PCR擴增為多重PCR時）。多重PCR可用於（例如）產生對應於第一基因體序列（例如16S rRNA基因）之擴增子及/或對應於第二基因體序列（例如23S rRNA基因）之不同擴增子。作為多重PCR之替代方案，可混合藉由用不同引子組進行之分開的PCR擴增反應產生之擴增子以用於後續分析。有利地，可使用單一引子組以製備對應於在多個菌株或物種（例如2、3、4、或超過4個物種，其等可為（例如）相同屬之成員）之基因體中找到之同源基因體序列的擴增子。

可選擇PCR擴增條件（無論對稱或不對稱、單重或多重），例如使得所述DNA擴增之產物之長度為100至1000個核苷酸。在一些實施方式中，選擇所述PCR反應以使得所述DNA擴增產物之長度為300至800個核苷酸。在其他實施方式中，選擇所述PCR條件以使得所述DNA擴增產物之長度為400至600個核苷酸。

在一些實施方式中，用於本發明之方法中之PCR擴增反應將產生可量測信號的標記併入至藉由所述反應產生之任何擴增子。所述標記可為（例如）螢光標記、電化學標記、或化學發光標記。螢光標記可藉由在PCR期間併入經螢光標記之核苷酸及/或藉由使用經標記之用於PCR的引子來達成。電化學標記可藉由在PCR期間併入經氧化還原-活性標記之核苷酸及/或藉由使用經氧化還原-活性標記之用於PCR的引子來達成（參見例如Hocek and Fojta,2011,Chem. Soc. Rev.,40:5802-5814；Fojta,2016,核酸之氧化還原標記以用於核苷酸序列及DNA損壞之電化學分析。於：Nikolelis D.,Nikoleli GP.（編）用於安全性及生物恐怖主義應用之生物感測器、用於安全性應用之先進科學及技術，Springer,Cham中）。化學發光標記可例如藉由使用經生物素標記之用於PCR的引子，結合鏈黴抗生物素蛋白－鹼性磷酸酶結合物，隨後與化學發光1,2-二氧雜環丁烷受質一起培養來達成。

適合之螢光部分之實例包括FITC、EDANS、德克薩斯紅（Texas red）、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、BODIPY FL/C3、BODIPY R6G、BODIPY FL、Alexa 532、BODIPY FL/C6、BODIPY TMR、5-FAM、BODIPY 493/503、BODIPY 564、BODIPY 581、Cy3、Cy5、R110、TAMRA、德克薩斯紅及x-玫瑰紅。

螢光部分可附接至dNTP，特別是含有胞嘧啶作為鹼基者（胞苷酸、胞嘧啶核苷5'-磷酸、胞嘧啶核苷5'-二磷酸、胞嘧啶核苷5'-三磷酸、或其聚合物、或含有胞苷酸之聚合物）。

dNTP標記之位置可位於鹼基（胺基）、磷酸基（OH基團）或去氧核糖部分（2'-OH基團或3'-OH基團）處。較佳位置係於鹼基處。

類似於其他核苷酸，經螢光標記之dNTP可在隨機位置（典型為dC位置）處併入PCR擴增子之兩股中且藉由DNA聚合酶延伸。

螢光dNTP可以高度濃縮形式購得且可在不調整各未經標記之dNTP之濃度下添加至PCR反應混合物中。對於大多數PCR擴增，dNTP與螢光dNTP之典型比率在100:1與1000:1之間。因此，經螢光標記之dNTP可以未經標記之dNTP之（莫耳）量之0.1%至1%包括於PCR試劑中。

經螢光標記之PCR產物之偵測可經由與探針分子（例如與微陣列結合之探針分子）雜交來達成。適合的微陣列系統利用三維交聯聚合物網路，如美國專利第9,738,926號中所描述，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。6.2.3.1. 引子

用於PCR反應中之引子經設計以識別一或多個給定核酸模板之序列（例如一或多個目標基因體序列）並與之雜交。引子及目標核酸模板之序列中之錯配可導致PCR反應之效率降低及/或所欲序列以外之序列的擴增。成功引子設計之參數為所屬技術領域中所熟知的（參見例如Dieffenbach等人,1993）且包括引子長度、解鏈溫度、GC含量、及類似者。PCR引子不需要與給定目標核酸模板共有100%序列一致性，且與目標序列具有至少75%，例如80%、例如85%、例如90%、例如95%、例如96%、例如97%、例如98%、例如99%、或99.5%一致性之PCR引子可起與目標序列雜交及使得目標序列擴增之作用。

本發明提供適合於製備具有高特異性及良好擴增效率之獨特引子系統之其他參數。引子長度典型地為18至24個鹼基，但引子可為更長，例如長度為25至50個鹼基、例如長度為25至45個鹼基、例如長度為30至45個鹼基、例如長度為35至45個鹼基、例如長度為40至45個鹼基長度、或例如長度為40至50個鹼基。用於PCR擴增之引子通常成對設計，其中一個引子稱為「正向（forward）」引子且一個引子稱為「反向（reverse）」引子。本發明之正向引子可設計成在3'端具有G及/或C殘基以便提供「GC-夾（GC-clamp）」。G與C核苷酸對展現比A-T核苷酸對更強的氫鍵；因而，引子之3'端處之GC-夾可有助於增加序列特異性、增加雜交可能性、且增加PCR反應之總效率。

可設計一組引子以擴增兩個基因體區域，例如一組引子可包括對16S rRNA基因具有特異性之一種引子對及對16S-23S rRNA ITS區具有特異性之第二引子對（參見圖3）。如此引子組可用於（例如）在單一PCR反應中產生多種擴增子。

PCR引子對可經設計以擴增跨越多個物種保守之序列（例如）以擴增多種細菌物種之16S rRNA基因。因此，有可能使用單一PCR引子對產生對應於同源基因體序列之擴增子，其在對含有或疑似含有多種可能生物體中之一者之樣本進行PCR時係有利的。用於經設計以擴增保守序列之引子的參數可包括鑑認跨越各種物種之保守區，可選地證實為校正保守區之任何序列差異（例如若所公佈之序列是否正確不確定），及選擇跨越該等序列至少75%，例如80%、例如85%、例如90%、例如95%、例如96%、例如97%、例如98%、例如99%或甚至100%保守的序列。展現小於100%序列一致性之引子可僅含有一或多個不同於給定模板之單一核苷酸鹼基，亦即製劑中之所有引子含有彼此相同的序列。可替代地，引子可經製備以在序列中之特定位置處含有替代核苷酸殘基。舉例而言，用於擴增數個物種之16S區的反向引子可包含寡核苷酸池，其中某百分比（例如50%）在引子中之某位置處含有第一核苷酸且其中某百分比（例如50%）在該位置處含有第二核苷酸。

在一些實施方式中，用於本發明之方法中之引子用可偵測之標記（例如螢光標記）來標記。舉例而言，在一些實施方式中，至少一種引子經5'螢光標記。在其他實施方式中，超過一種引子經5'螢光標記。適用於標記引子之螢光標記為所屬技術領域中已知的，且包括Cy5、FAM、JOE、ROX及TAMRA。6.2.3.2. 對稱 PCR 擴增

可用於本發明之方法中之典型三步驟PCR實驗方法（參見PCR實驗方法，方法及應用指南，Innis等人編,學術出版社（聖地亞哥,加利福尼亞州（美國）1990,第1章）可包括93℃-95℃持續超過5秒之變性或股解鏈、55℃-65℃持續10-60秒之引子黏合及在聚合酶有高活性之溫度下持續15-120秒之引子延伸，例如對於Taq DNA聚合酶為72℃。典型兩步驟PCR實驗方法之不同之處可在於對於引子黏合與對於引子延伸具有相同之溫度，例如60℃或72℃。對於三步驟PCR或兩步驟PCR，擴增涉及使反應混合物循環通過前述系列之步驟多次，典型地25-40次。在反應過程期間，反應中之個別步驟之時間及溫度可在循環間保持不變，或其可在反應過程中之一或多個點處改變以提高效率或增強選擇性。

除了所述對之引子及目標核酸以外，PCR反應混合物典型地含有以下者中之各者：四種去氧核糖核苷酸5'三磷酸（dNTP），典型地處於等莫耳濃度、熱穩定聚合酶、二價陽離子（典型地為Mg²⁺ ）及緩衝劑。如此反應之體積典型地為20-100 µl。可在相同反應中擴增多個目標序列。特定PCR擴增之循環次數視包含以下者的數個因素而定：a）起始物質之量；b）反應效率；及c）產物偵測或後續分析之方法及靈敏度。用於典型循環擴增反應之循環條件、試劑濃度、引子設計、及適當設備為所屬技術領域中所熟知的（參見例如Ausubel,F. 分子生物學中之當前實驗方法（1988）第15章: 「聚合酶鏈反應」,J. Wiley （New York,N.Y.（USA））。6.2.3.3. 不對稱 PCR 擴增

例示性不對稱PCR方法描述於Gyllensten及Erlich,1988,Natl. Acad. Sci.（USA）85: 7652-7656（1988）以及Gyllensten及Erlich,1991,美國專利第5,066,584號中。傳統的不對稱PCR不同於對稱PCR，因為引子中之一者以限制量添加，典型地為另一引子之濃度的1/100至1/5。雙股擴增子在早期溫度循環期間累積，如在對稱PCR中一樣，但一個引子耗盡，典型地在15-25個PCR循環之後，視起始模板數目而定。在後續循環期間利用未耗盡引子發生一股之線性擴增。用於文獻中所報導之不對稱PCR反應中之引子通常為與已知用於對稱PCR者相同的引子。Poddar（Poddar,2000,Mol. Cell Probes 14: 25-32）藉由包括40個熱循環之端點分析比較了用於擴增腺病毒受質之對稱及不對稱PCR。其報導50:1之引子比率為最佳的且不對稱PCR分析具有更好的靈敏度，然而對於可能含有較低數目之目標分子的稀釋受質溶液而言靈敏度顯著下降。6.2.3.4 經改良之不對稱 PCR 擴增

經改良之不對稱PCR方法描述於美國專利第10,513,730號中，其內容以全文引用之方式併入本文中。經改良之不對稱PCR方法包括指數階段及線性階段兩者。在指數階段期間，目標核酸之兩股均擴增。在線性階段期間，僅擴增股中之一者，導致目標核酸之單股過量。

該經改良之不對稱PCR方法經由使用不同長度及解鏈溫度之引子對實現單股之過量，其中較長引子稱為「延伸引子（Extended Primer）」且較短引子稱為「未延伸引子（Unextended Primer）」。延伸引子之解鏈溫度高於未延伸引子，且可用於使用PCR循環選擇性擴增目標核酸之單股，該等PCR循環中黏合步驟係在大於未延伸引子之解鏈溫度但低於延伸引子之解鏈溫度的溫度下進行。選擇性擴增產生富含目標股之PCR產物混合物，其可在後續偵測分析中探測。

除與目標核酸互補之序列以外，延伸引子含有5'延伸，所述延伸含有與相同引子之目標結合部分互補之序列。無意受限於理論，咸信使用5'延伸允許延伸引子分子之分子內或分子間雜交且防止此等較長引子與存在於PCR反應中之DNA分子在PCR反應開始時之任意或非特異性結合。此隨即防止非特異性DNA擴增且防止PCR產物中之「雜訊（noise）」，其在擴增生物樣本中少量存在之目標時可能成問題。

初始PCR反應混合物包括 ● 核酸樣本； ● 不對稱引子對； ● 熱穩定DNA聚合酶；以及 ● PCR試劑。

PCR反應中之延伸引子及未延伸引子之初始濃度可各自在200 nM至8 µM範圍內。延伸引子及未延伸引子可以等莫耳量包括於初始PCR反應中，例如各自在約200 nM與1 µM之間的濃度範圍內，例如各自在500 nM之濃度下。可替代地，延伸引子及未延伸引子可以非等莫耳量包括於初始PCR反應中。在某些實施方式中，延伸引子之初始濃度較佳地超過未延伸引子之濃度，例如超過約2倍至30倍莫耳濃度。因此，在某些方面，延伸引子之濃度在約1 µM與8 µM範圍內，且未延伸引子之濃度在約50 nM與200 nM範圍內。

不對稱引子對可經設計以擴增來自任何來源之核酸，且對於診斷應用而言，不對稱引子對可經設計以擴增來自病原體（諸如在章節6.2.1中所鑑認者）的DNA。

不對稱引子對可經設計以便能夠同時擴增許多物種中所存在之同源核酸序列，例如細菌中之高度保守16S核糖體序列。熱穩定 DNA 聚合酶 ：可用於本發明之不對稱PCR反應中之熱穩定聚合酶包括（但不限於）：Vent（Tli/嗜熱高溫球菌（Thermoccus Literalis ））、Vent exo-、Deep Vent、Deep Vent exo-、Taq（水生棲熱菌（Thermus aquaticus ））、Hot Start Taq、Hot Start Ex Taq、Hot Start LA Taq、DreamTaq™、TopTaq、RedTaq、Taqurate、NovaTaq™、SuperTaq™、Stoffel Fragment、Discoverase™ dHPLC、9° Nm、Phusion®、LongAmp Taq、LongAmp Hot Start Taq、OneTaq、Phusion® Hot Start Flex、Crimson Taq、Hemo KlenTaq、KlenTaq、Phire Hot Start II、DyNAzyme I、DyNAzyme II、M-MulV Reverse Transcript、PyroPhage®、Tth（嗜熱棲熱菌（Thermos termophilus）HB-8）、Tfl、Amlitherm™、芽孢桿菌DNA、DisplaceAce™、Pfu（激烈熱球菌（Pyrococcus furiosus ））、Pfu Turbot、Pfunds、ReproFast、PyroBest™、VeraSeq、Mako、Manta、Pwo（火球菌屬（pyrococcus ），沃氏（woesei ））、ExactRun、KOD（於超熱球菌（thermococcus kodakkaraensis ））、Pfx、ReproHot、Sac（嗜酸熱硫化葉菌（Sulfolobus acidocaldarius ））、Sso（硫磺礦硫化葉菌（Sulfolobus solfataricus ））、Tru（紅棲熱菌（Thermus ruber ）、Pfx50™（速生熱球菌（Thermococcus zilligi ））、AccuPrime™ GC-Rich（馬呂斯火葉菌（Pyrolobus fumarius ））、火球菌屬物種GB-D、Tfi（絲狀棲熱菌（Thermus filiformis ））、Tfi exo-、ThermalAce™、Tac（嗜酸熱原體（Thermoplasma acidophilum ））、（Mth（嗜熱甲烷桿菌（M. thermoautotrophicum ））、Pab（深海熱球菌（Pyrococcus abyssi ））、Pho（超嗜熱球菌（Pyrococcus horikosihi ）、B103（小短尾噬菌體亞科（Picovirinae Bacteriophage ）B103）、Bst（嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus ））、Bst Large Fragment、Bst 2.0、Bst 2.0 WarmStart、Bsu、Therminator™、Therminator™II、Therminator™III以及Therminator™T。在一較佳實施方式中，DNA聚合酶為Taq聚合酶，諸如Taq、Hot Start Taq、Hot Start Ex Taq、Hot Start LA Taq、DreamTaq™、TopTaq、RedTaq、Taqurate、NovaTaq™或SuperTaq™。

用於經改良之不對稱方法中之不對稱循環之說明性組展示於表2中。

表2
階段	步驟	溫度	時間	循環數目
*初始變性*	初始變性	90℃-100℃，較佳95℃	0-5分鐘，較佳2分鐘	0-1
指數階段	變形	90℃-100℃，較佳95℃	15-25秒，較佳20秒	20-40，較佳30-37（例如為35）
黏合	58℃	12-18秒，較佳15秒
延伸	72℃	30-50秒，較佳40秒
*線性階段*	變性	90℃-100℃，較佳95℃	15-25秒，較佳20秒	15-25，較佳為20
同時黏合及延伸	72℃	40-60秒，較佳50秒
*延長延伸*	延長延伸	72℃	0-5分鐘，較佳2分鐘	0-1

表2中所展示之循環數目之範圍可用於任何不對稱引子對，且最佳循環數目將視初始PCR混合物中之目標DNA之複本數而定：初始複本數越大，在指數階段中需要越少循環數目以產生足夠量之PCR產物來充當線性階段之模板。循環數目之最佳化對於所屬技術領域中具有通常知識者而言係例行工作的。

表2中所展示之溫度尤其適用於其中延伸引子之T_m 大於72℃（例如75℃-80℃）且未延伸引子之T_m 大於58℃但小於72℃（例如60℃-62℃），並且當熱穩定DNA聚合酶在72℃下具有活性時。

循環時間，特定言之延伸時間可根據引子之解鏈溫度及PCR產物之長度而變化，其中較長PCR產物需要較長延伸時間。經驗法則為延伸步驟應為每1,000個擴增子之鹼基至少60秒。延伸步驟可在線性階段延伸以提供額外黏合時間。6.2.3.4.1. 延伸引子

延伸引子之「A」區與目標股1中之對應區具有至少75%序列一致性。在某些實施方式中，引子之「A」區與目標股1中之對應區具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%一致性。在又其他實施方式中，引子之「A」區與目標股1之對應區具有100%序列一致性。

另一方面，在各種實施方式中，延伸引子之「A」區與目標股2中之對應區之互補序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或100%序列一致性。典型地，引子序列與目標序列之間之任何錯配之位置越向5’，其在PCR反應期間越可能被容忍。所屬技術領域中具有通常知識者可容易地設計與目標股具有小於100%序列一致性但仍可有效擴增目標DNA之引子序列。

與「A」區之至少一部分互補的「B」區中之序列可為直接重複或反向重複。在「B」區含有「A」區之一部分之直接重複的情況下，不同延伸引子分子可彼此分子間雜交，如圖5B中所示。在「B」區含有「A」區之一部分之反向重複的情況下，延伸引子分子可在分子內雜交，如圖5C中所示，或彼此分子間雜交，如圖5A中所示。

「B」區中之序列與其互補之「A」區之一部分較佳位於或接近於（例如距離1、2或3個核苷酸內）「A」區之5'端，亦即位於或接近於「A」區鄰接「B」區（或當存在「C」區時之「C」區）處。

延伸引子之「B」區之長度較佳為6至12個核苷酸，亦即長度較佳為6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。在特定實施方式中，延伸引子之「B」區之長度為8至10個核苷酸，亦即長度為8、9或10個核苷酸。

當「C」區存在於延伸引子中時，所述區之長度較佳為1至6個核苷酸，亦即長度較佳為1、2、3、4、5或6個核苷酸。

延伸引子之T_m 較佳（但非必須）在約68℃與約80℃之間。在特定實施方式中，未延伸引子之T_m 在約72℃與約78℃之間，例如約72℃、約73℃、約74℃、約75℃、約76℃、約77℃或約78℃。

位於區域「A」與「B」之間的可選的區域「C」可充當「A」區與「B」區之間的間隔子，以使得延伸引子形成髮夾環（hairpin loop）及/或將限制性核酸內切酶序列（較佳為6-剪切酶序列）引入PCR產物中。限制性核酸內切酶序列可全部在「C」區內，或可由「C」區之全部或一部分連同分別來自「B」區及「A」區之側接5'及/或3'序列形成。為了最小化與目標核酸雜交之干擾，「C」區較佳不與目標股1或目標股2互補。

延伸引子之T_m 較佳比未延伸引子之T_m 大至少約6℃。較佳地，延伸引子具有比未延伸引子之T_m 大約15℃至30℃之T_m 。

延伸引子之「A」區之T_m 較佳比與目標（排除任何5'延伸）（至少75%）互補之未延伸引子之部分之T_m 高或低不超過約3℃，亦即與目標雜交之正向引子中之區域之T_m 較佳比與目標雜交之反向引子中之區域之T_m 高或低不超過約3℃，且反之亦然。

延伸引子之「A」區之長度較佳為至少12個核苷酸，且較佳在12至30個核苷酸範圍內且更佳在14至25個核苷酸範圍內。在某些實施方式中，延伸引子之「A」區之長度為14、15、16、17、18、19或20個核苷酸。6.2.3.4.2. 未延伸引子

未延伸引子之核苷酸序列與目標股2中之對應區具有至少75%序列一致性。在某些實施方式中，未延伸引子之核苷酸序列與目標股2中之對應區具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性。在又其他實施方式中，未延伸引子之核苷酸序列與目標股2之相應區具有100%序列一致性。

另一方面，在各種實施方式中，未延伸引子之核苷酸序列與目標股2中之對應1區之互補序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或100%序列一致性。典型地，引子序列與目標序列之間之任何錯配之位置越向5，其在PCR反應期間越可能被容忍。所屬技術領域中具有通常知識者可容易地設計與目標股具有小於100%序列一致性但仍可有效擴增目標DNA之引子序列。

未延伸引子可進一步具有1、2或3個核苷酸之5'尾。

未延伸引子之T_m 較佳（但非必須）在約50℃與約62℃之間。在特定實施方式中，未延伸引子之T_m 在約59℃與約62℃之間，例如約59℃、約60℃、約61℃或約62℃。

未延伸引子之T_m 較佳比延伸引子之T_m 低至少約6℃。較佳地，未延伸引子具有比延伸引子之T_m 低約15℃至30℃之T_m 。

與目標（排除任何5'延伸）（至少75%）互補之未延伸引子之區域之T_m 較佳比延伸引子之「A」區之T_m 高或低不超過約3℃，亦即與目標雜交之正向引子中之區域之T_m 較佳比與目標雜交之反向引子中之區域之T_m 高或低不超過約3℃，且反之亦然。

未延伸引子之長度較佳為至少12個核苷酸，且較佳在12至30個核苷酸範圍內且更佳在14-25個核苷酸範圍內。在某些實施方式中，未延伸引子之長度為14、15、16、17、18、19或20個核苷酸。6.2.3.4.3. 通用引子

在一些不對稱PCR方法中，例如如美國專利第8,735,067 B2號中所描述，除正向及反向引子對以外，亦使用第三「通用（generic）」引子，其具有與添加至引子中之一者之5'寡核苷酸尾類似之序列。意欲使通用引子參與初始PCR循環之後的擴增反應以「平衡（balance）」多重擴增反應中之不同目標之擴增效率。

無意受限於理論，咸信如美國專利第8,735,067號中所描述地包括通用引子（其在經改良之不對稱PCR方法之情形中會具有基本上由延伸引子之「B」區之序列組成之序列（如此通用引子在本文中稱為「通用引子（Generic Primer）」））會降低使用本文中所描述之不對稱引子對之擴增效率。因此，本文中所描述之經改良之不對稱DNA擴增方法較佳在缺乏通用引子之情況下進行。

在相關實施方式中，本文中所描述之經改良之不對稱DNA擴增方法每目標區域可利用單一不對稱引子對，亦即不包括任何其他引子，認識到個別引子可為引子分子與由在引子中之某些位置處包括混合鹼基而產生之密切相關的序列之混合物。為清楚且避免疑問起見，此實施方式並不排除在多重擴增反應中使用複數種不對稱引子對，其限制條件為單一不對稱引子對用於各擴增子。6.2.3.5. 即時 PCR 擴增

用於本發明之方法中之PCR擴增反應可為即時PCR擴增反應。

即時PCR係指一組不斷成長之技術，其中可隨著反應進發展量測經擴增之DNA產物之累積，典型地每個PCR循環量測一次。監測產物隨時間推移之累聚允許確定反應之效率、以及估算DNA模板分子之初始濃度。關於即時PCR之一般細節參見即時 PCR ：基礎指南（Real-Time PCR: An Essential Guide）,K. Edwards等人編,Horizon Bioscience,Norwich,U.K.（2004）。

現存在數種不同的指示經擴增之DNA之存在的即時偵測化學。其等大多數視由於PCR過程而改變特性之螢光指示物而定。此等偵測化學中之一係DNA結合染料（諸如SYBR®綠），其一旦與雙股DNA結合則增加螢光效率。其他即時偵測化學利用螢光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer；FRET）（一種現象，染料之螢光效率由於該現象而強烈依賴於與另一光吸收部分或遮蔽子之接近程度）。此等染料及遮蔽子典型地附接至DNA序列特異性探針或引子。基於FRET之偵測化學之一係水解探針及構形探針。水解探針（諸如TaqMan®探針）使用聚合酶以自附接至寡核苷酸探針之遮蔽染料分子切裂報導染料分子。構形探針（諸如分子信標）利用附接至寡核苷酸之染料，其螢光發射在與目標DNA雜交之寡核苷酸之構形改變時改變（參見例如Tyagi S等人,1996,分子信標：在雜交時發螢光之探針（Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization）. Nat Biotechnol 14,303-308）。

即時PCR可為對稱或不對稱的，例如在章節6.2.3.3或6.2.3.4中所描述之對稱或不對稱PCR擴增反應之反應混合物中用水解探針分子進行。

存在可用於進行即時PCR之多種商業儀器。可購儀器之實例包括應用生物系統（Applied Biosystems）PRISM 7500、Bio-Rad iCylcer及羅氏診斷（Roche Diagnostics）LightCycler 2.0。6.2.4. 探針分子

本發明提供適用於在PCR反應中產生之擴增子之序列特異性偵測的探針分子，例如寡核苷酸探針分子。

成功寡核苷酸探針分子設計之參數為所屬技術領域中所熟知的且包括（但不限於）探針分子長度、交叉雜交率、解鏈溫度、GC-含量、自黏合及形成二級結構之能力。本發明提供寡核苷酸探針分子在微陣列（例如可定址陣列）中之用途，其中探針分子被錨定至基底（例如膜，例如玻璃基底、例如塑膠基底、例如聚合物-基質基底）且在允與寡核苷酸探針分子與具有類似於相同之序列（例如該等序列共有至少75%，例如80%、例如85%、例如90%、例如95%、例如96%、例如97%、例如98%、例如99%或甚至100%類似性或一致性）的擴增子雜交之條件下暴露至核酸。

在一些實施方式中，用於本發明之方法中之寡核苷酸探針分子包含核苷酸序列，該核苷酸序列與第一基因體序列及/或第二基因體序列中之15至40個連續核苷酸90%至100%互補（例如90%至95%或95%至100%）。

例示性寡核苷酸探針分子描述於實施例中，且包括包含SEQ ID NO: 1-7之核苷酸序列的探針分子。

在一些實施方式中，寡核苷酸探針分子存在於陣列上。各探針分子可位於陣列上之分開的位置處且可藉由其於陣列上之位置區分，以使得寡核苷酸探針分子為存在於陣列上之位置可定址之探針分子。

在一些實施方式中，寡核苷酸探針分子包含聚胸苷尾，例如包含至多10個核苷酸之聚胸苷尾、或例如包含至多15個核苷酸之聚胸苷尾、或例如包含至多20個核苷酸之聚胸苷尾。在一個實施方式中，聚胸苷尾包含10至20個核苷酸，例如15個核苷酸。當探針分子附接至陣列時，聚胸苷尾可是有用的，因為聚胸苷尾充當陣列基底與探針分子與一或多個目標序列部分或完全互補之區域之間的間隔子。

寡核苷酸探針分子可經標記或未經標記。在一些實施方式中，寡核苷酸探針分子經標記。在其他實施方式中，寡核苷酸探針分子未經標記。寡核苷酸探針分子可例如用螢光報導子標記，螢光報導子可為螢光染料，諸如章節6.2.3或6.2.3.1中所描述者。經標記之寡核苷酸探針分子可用於（例如）即時PCR反應中。用於即時PCR之經標記之寡核苷酸探針分子可在探針分子的一端包含螢光報導子且在探針分子的另一端包含遮蔽報導子之螢光的遮蔽部分。在PCR期間，探針分子可在黏合階段期間與其目標序列雜交，且一旦聚合酶在延伸階段期間達至探針分子，則其5'-3'-核酸外切酶降解探針，使螢光報導子與遮蔽子物理分離，引起可量測之螢光增加。

探針分子上之螢光標記及遮蔽部分之位置可為使得FRET可發生在此兩個部分之間。舉例而言，螢光標記可位於或接近於探針分子之5'端，且遮蔽部分位於或接近於探針之3'端。在一些實施方式中，螢光標籤與遮蔽子之間的分離距離為約14至約22個核苷酸，但可使用其他距離，諸如約6、約8、約10或約12個核苷酸。可使用之其他距離包括約14、約16、約18、約20或約22個核苷酸。

可用於即時PCR之寡核苷酸探針分子中之例示性螢光標記為FAM或6-FAM，且代表性遮蔽部分為MGB。報導子部分之其他非限制性實例包括螢光素、HEX、TET、TAM、ROX、Cy3、Alexa、及德克薩斯紅，而遮蔽子或受體螢光部分之非限制性實例包括TAMRA、BHQ（黑洞遮蔽子（black hole quencher））、LC紅640及諸如CY5之花青染料。如所屬技術領域中具有通常知識者會瞭解的，可使用報導子及遮蔽子/受體部分之任何配對，只要其等相容而使得發射可自供體向遮蔽子/受體發生即可。此外，適合的供體與遮蔽子/受體之配對在所屬技術領域中為已知的且提供於本文中。可藉由所屬技術領域中已知之任何手段來進行對選擇。定製即時PCR探針分子可購自例如ThermoFisher Scientific、Sigma-Aldrich及其他。6.2.5. 虛擬探針

為方便起見，此章節（及本發明之其他章節）提及可用虛擬探針探測之擴增子及擴增子組。然而，應理解，虛擬探針可同樣用於探測含有或疑似含有非擴增目標核酸（諸如基因體片段）之樣本。

第一擴增子組（含有對應於第一基因體中之區域的單一第一擴增子或對應於所述第一基因體中之不同區域的複數種第一擴增子）與第二擴增子組（含有對應於第二基因體中之區域的單一第二擴增子或對應於所述第二基因體中之不同區域的複數種第二擴增子）之間的核苷酸錯配之數目可相對較小，且個別寡核苷酸探針分子可能獨自不能區分所述第一擴增子組與第二擴增子組。本發明之發明人已出乎意料地發現，還是有可能藉由使用虛擬探針在如此情境下區分所述第一擴增子組與第二擴增子組。所述虛擬探針之探針分子獨自不能但共同能藉助於在所述第一及第二擴增子組用所述虛擬探針之探針分子探測時觀測到之不同雜交模式區分所述兩個擴增子組。

所述第一擴增子及所述第二擴增子之核苷酸序列在能夠被用於虛擬探針中之探針分子結合的所述擴增子之區域中應具有至少1個（例如1個，至少2個，2個，至少3個或3個）核苷酸錯配，以使得當構成所述虛擬探針的二或多種探針分子與所述第一擴增子組雜交時及當所述探針分子與所述第二擴增子組雜交時（例如在陣列上或即時PCR反應期間），存在對於所述探針分子之信號模式的差異，所述二或多種探針分子構成虛擬探針。所述信號模式之差異可用於鑑認及/或區分所述第一及第二擴增子組。當藉由使用虛擬探針確定所述第一擴增子組存在時，可得出以下結論：所述第一擴增子組自其產生之樣本含有對應於所述第一擴增子組之基因體（及可延伸至其基因體含於所述樣本中之生物體）。同樣，當藉由使用虛擬探針確定所述第二擴增子組存在時，可得出以下結論：所述第二擴增子組自其產生之樣本含有對應於所述第二擴增子組之基因體（及可延伸至其基因體含於所述樣本中之生物體）。

當與PCR擴增產物雜交時，虛擬探針之個別探針分子之信號（例如可藉由其於陣列上之位置區分或對應於不同螢光標記之信號）可例如藉由一或多個布林運算子、藉由一或多個關係運算子或藉由以一或多個布林運算子與一或多個關係運算子之任何組合形式來組合以區分第一擴增子與第二擴增子組。在一些實施方式中，所述信號藉由一或多個布林運算子組合。在其他實施方式中，所述信號藉由一或多個關係運算子組合。在又其他實施方式中，所述信號藉由一或多個布林運算子及一或多個關係運算子來組合。

在一些情況下，布林運算子「與（AND）」、「或（OR）」及「非（NOT）」可用於組合來自虛擬探針之個別探針分子之信號以區分第一擴增子組與第二擴增子組。作為一實例，用於兩種同源擴增子（在此實例中為「擴增子A（Amplicon A）」及「擴增子B（Amplicon B）」）之虛擬探針由兩種探針分子（在此實例中為「探針1（Probe 1）」及「探針2（Probe 2）」）組成。探針1及探針2兩者均能夠與擴增子A特異性雜交，而探針1但並非探針2能夠與擴增子B特異性雜交。當PCR擴增產物用所述虛擬探針探測且來自探針1與所述PCR擴增產物的雜交之信號及來自探針2與所述PCR擴增產物的雜交之信號均為陽性（其可使用布林運算子「與」表示為「探針1與探針2」）時，可確定擴增子A存在於所述PCR擴增產物中。當PCR擴增產物用所述虛擬探針探測且來自探針1與所述PCR擴增產物的雜交之信號為陽性而來自探針2與所述PCR產物的雜交之信號不為陽性（其可使用布林運算子「非」表示為「探針1非探針2」）時，可確定擴增子B存在於所述PCR擴增產物中。舉例而言，若雜交信號高於背景水平，則所述雜交信號可視為陽性。舉例而言，當未觀測到信號或所觀測到之信號不高於背景水平時，所述雜交信號可視為不為陽性。

在一些情況下，關係運算子「大於（greater than）」（「＞」）及「小於（less than）」（「＜」）可用於組合來自虛擬探針之個別探針分子之信號以區分第一擴增子組與第二擴增子組。作為一實例，用於兩個同源擴增子（在此實例中為「擴增子C（Amplicon C）」及「擴增子D（Amplicon D）」）之虛擬探針由兩種探針分子（在此實例中為「探針3（Probe 3）」及「探針4（Probe 4）」）組成。探針3及探針4兩者均能夠與擴增子C及擴增子D特異性雜交。當探針3及探針4與擴增子C雜交時，探針3之信號大於探針4之信號（其可使用「大於」關係運算子表示為「探針3＞探針4」。另一方面，當探針3及探針4與擴增子D雜交時，探針3之信號小於探針4之信號（其可使用「小於」關係運算子表示為「探針3＜探針4」）。因此，當PCR擴增產物用所述虛擬探針探測且探針3之信號大於探針4之信號時，可確定擴增子C存在於所述PCR擴增產物中，且當探針3之信號小於探針4之信號時，可確定擴增子D存在於所述PCR擴增產物中。

當組合雜交信號時，所述信號可為（例如）絕對信號、標準化信號或分率信號（例如用於虛擬探針中之探針分子之信號的值可使用預定函數縮放，例如如實施例3中所描述）。舉例而言，當探針分子之信號高於預定截止值時，其可視為陽性。舉例而言，截止值可設定為或高於對於給定探針分子所觀測到之背景信號（例如導因於非特異性雜交之背景信號）。因此，舉例而言，若觀測到探針分子之信號但所述信號不高於背景水準時，則所述信號可視為不為陽性。

在一個實施方式中，虛擬探針包含二或多種寡核苷酸探針分子（例如2種寡核苷酸探針分子）。在另一實施方式中，虛擬探針包含三或更多種寡核苷酸探針分子（例如3種寡核苷酸探針分子或4種寡核苷酸探針分子）。

在一些實施方式中，用於第一生物體及第二生物體之虛擬探針由兩種探針分子組成。在一個實施方式中，所述兩種探針分子包含能夠特異性雜交第一擴增子組（對應於所述第一生物體）中之第一擴增子及第二擴增子組（對應於所述第二生物體）中之第二擴增子的第一探針分子以及能夠與所述第二擴增子組中之擴增子但不能與所述第一擴增子組中之擴增子特異性雜交的第二探針分子。在如此實施方式中，當探測由所述樣本製備之PCR擴增產物時，若所述第一探針分子之信號為陽性且所述第二探針分子之信號不為陽性，則可確定所述第一生物體存在於樣本中。另一方面，當探測所述PCR擴增產物時，若所述第一探針分子之信號為陽性且所述第二探針分子之信號為陽性，則可確定所述第二生物體存在於所述樣本中。

在一些實施方式中，用於第一生物體及第二生物體之虛擬探針由三種探針分子組成。在一個實施方式中，所述三種探針分子包含能夠特異性雜交第一擴增子組（對應於所述第一生物體）中之第一擴增子及第二擴增子組（對應於所述第二生物體）中之第二擴增子的第一探針分子、能夠與所述第一擴增子組中之擴增子及所述第二擴增子組中之擴增子特異性雜交之第二探針分子（所述第二探針分子不同於所述第一探針）、以及能夠與所述第一擴增子組中之擴增子及所述第二擴增子組中之擴增子特異性雜交之第三探針分子（所述第三探針分子不同於所述第一及第二探針分子）。在此類實施方式中，當探測PCR擴增產物時，觀測到之所述三種探針分子之相對信號可用於確定用於製備所述PCR擴增產物之樣本是否含有所述第一生物體或所述第二生物體。

由於虛擬探針可用於區分同源基因體序列，因此虛擬探針可用於區分密切相關之生物體，例如密切相關之微生物。舉例而言，虛擬探針可用於區分來自相同目、相同科、相同屬、相同群、或甚至相同種之微生物（例如相同種之不同菌株）。舉例而言，虛擬探針可用於區分乳酸桿菌屬（Lactobacillus ）與李氏菌屬（Listeria ）物種、區分棒狀桿菌屬（Corynebacterium ）與丙酸桿菌屬（Propionibactium ）物種、區分微球菌屬（Micrococcus ）與庫克菌屬（Kocuria ）物種、區分巴斯德氏菌屬（Pasturella ）與嗜血桿菌屬（Haemophillus ）物種、區分凝固酶陰性葡萄球菌屬物種與凝固酶陽性葡萄球菌屬物種、區分鏈球菌屬物種（例如咽峽炎鏈球菌、格氏鏈球菌、和緩鏈球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌（S. agalactiae ）、釀膿鏈球菌（S. pyogenes ）、解沒食子酸鏈球菌（S. gallolyticus ）、嬰兒鏈球菌（S. infantarius ）、前庭鏈球菌（S. vestibularis ）、唾液鏈球菌（S. salivarius ）、豬腸鏈球菌（S. hyointestinalis ）、星座鏈球菌（S. constellatus ）、中間鏈球菌（S. intermedius ）、口腔鏈球菌（S. oralis ）、血鏈球菌（S. sanguinis ）、副血鏈球菌（S. parasanguinis ））、區分葡萄球菌屬物種（例如路鄧葡萄球菌（S. lugdunensis ）、表皮葡萄球菌（S. epidermidis ））、區分腸球菌屬物種（例如糞腸球菌（E. fecalis ）、屎腸球菌（E. faecium ））、區分梭菌屬物種（例如產氣莢膜梭菌（C. perfringens ）、梭狀梭菌（C. clostridiiforme ）、無害梭菌（C. innocuum ））、區分芽孢桿菌屬物種（例如蠟樣芽孢桿菌（B. cereus ）、凝結芽孢桿菌（B. coagulans ））、區分假單胞菌屬物種（（例如綠膿桿菌（P. aeruginosa ）、惡臭假單胞菌（P. putida ）、施氏假單胞菌（P. stutzeri ）、螢光假單胞菌（P. fluorescens ）、門多薩假單胞菌（P. mendocina ））、及區分不動桿菌屬物種（例如鮑氏不動桿菌（A. baumannii ）、魯氏不動桿菌（A. lwoffii ）、阿氏不動桿菌（A. ursingii ）、溶血不動桿菌（A. haemolyticus ）、瓊氏不動桿菌（A. junii ））。

章節6.2.5.1至6.2.5.3及章節7中之實施例1-5描述用於鑑認及/或區分不同類型之密切相關的細菌的例示性虛擬探針。6.2.5.1. 用於凝固酶陰性葡萄球菌屬物種之虛擬探針

本發明提供虛擬探針，其可用以確定凝固酶陰性葡萄球種是否存在於樣本中，且可用以區分包含凝固酶陰性葡萄球菌屬物種之樣本與包含凝固酶陽性葡萄球菌屬物種之樣本。可用於凝固酶陰性葡萄球菌屬物種之虛擬探針中之第一例示性探針分子包含以下核苷酸序列或由其組成：CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）。可用於凝固酶陰性葡萄球菌屬物種之虛擬探針中之第二例示性探針分子包含以下核苷酸序列或由其組成：GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG（SEQ ID NO: 2）。SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之核苷酸序列經設計以探測16S RNA擴增子。因此，具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2之核苷酸序列之探針分子可用於探測由使用經設計以擴增凝固酶陰性葡萄球菌屬物種16S rRNA基因體序列之引子進行的PCR擴增反應產生之擴增子。所述探針分子可（例如）包括於陣列上或用於即時PCR反應中。

若當探測由樣本製備之PCR擴增產物，所述第一寡核苷酸探針（「探針1」）之信號為陽性且所述第二寡核苷酸探針（「探針2」）之信號不為陽性（其可使用「非」運算子表示為「探針1非探針2」）時，則可確定所述樣本含有凝固酶陰性葡萄球菌屬物種。用於凝固酶陰性葡萄球菌屬物種之例示性虛擬探針進一步描述於實施例1中。6.2.5.2. 用於格氏鏈球菌及咽峽炎鏈球菌之虛擬探針

本發明提供虛擬探針，其可用於確定格氏鏈球菌或咽峽炎鏈球菌是否存在於樣本中，且可用於區分包含格氏鏈球菌之樣本與包含咽峽炎鏈球菌之樣本。可用於格氏鏈球菌及咽峽炎鏈球菌之虛擬探針中之第一例示性探針分子包含以下核苷酸序列或由其組成：CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT（SEQ ID NO: 3）。可用於格氏鏈球菌及咽峽炎鏈球菌之虛擬探針中之第二例示性探針分子包含以下核苷酸序列或由其組成：TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA（SEQ ID NO: 4）。SEQ ID NO: 3及SEQ ID NO: 4之核苷酸序列經設計以探測16S RNA擴增子。因此，具有SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4之核苷酸序列之寡核苷酸探針分子可用於探測由使用經設計以擴增來自格氏鏈球菌及咽峽炎鏈球菌之16S rRNA基因體序列之引子進行的PCR擴增反應產生之擴增子。所述探針分子可（例如）包括於陣列上或用於即時PCR反應中。

若當探測由樣本製備之PCR擴增產物，所述第一探針（「探針1」）之信號為陽性且所述第二探針（「探針2」）之信號不為陽性（其可使用「非」運算子表示為「探針1非探針2」）時，則可確定所述樣本含有格氏鏈球菌。若當探測由樣本製備之PCR擴增產物，探針1之信號為陽性且探針2之信號亦為陽性（其可使用「與」運算子表示為「探針1與探針2」）時，則可確定所述樣本含有咽峽炎鏈球菌。用於格氏鏈球菌及咽峽炎鏈球菌之例示性虛擬探針進一步描述於實施例2中。6.2.5.3. 用於和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之虛擬探針

本發明提供虛擬探針，其可用於確定和緩鏈球菌或肺炎鏈球菌是否存在於樣本中，且可用於區分包含和緩鏈球菌之樣本與包含肺炎鏈球菌之樣本。可用於和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之虛擬探針中之第一例示性探針分子包含以下核苷酸序列或由其組成：AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）。可用於和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之虛擬探針中之第二例示性探針分子包含以下核苷酸序列或由其組成：GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA（SEQ ID NO: 6）。可用於和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之虛擬探針中之第三例示性探針分子包含以下核苷酸序列或由其組成：GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA（SEQ ID NO: 7）。SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 7之核苷酸序列經設計以探測16S RNA擴增子。因此，具有SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7之核苷酸序列之探針分子可用於探測由使用經設計以擴增和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之16S rRNA基因體序列之引子進行的PCR擴增反應產生之擴增子。所述探針分子可（例如）包括於陣列上或用於即時PCR反應中。

若當探測由樣本製備之PCR擴增產物，所述第二探針（「探針2」）及/或所述第三探針（「探針3」）小於所述第一探針（「探針1」）之按比例縮放之信號時，則可確定所述樣本含有和緩鏈球菌。用於確定樣本是否含有和緩鏈球菌之信號之間的關係可使用布林及關係運算子表示為「(探針2或探針3) ＜ (探針1)/n」，其中n為用於縮放探針1信號之預定值。若當探測由樣本製備之PCR擴增產物，探針2及/或探針3之信號大於探針1之按比例縮放之信號時，則可確定所述樣本含有肺炎鏈球菌。用於確定樣本是否含有肺炎鏈球菌之信號之間的關係可使用布林及關係運算子表示為「(探針2或探針3) ＞ (探針1)/n」。可（例如）藉由探測由已知含有和緩鏈球菌之樣本產生之PCR產物及探測來自已知含有肺炎鏈球菌之樣本的PCR產物來確定「n」之適合值。

可替代地，若當探測由樣本製備之PCR擴增產物，探針3之信號除以探針1之信號小於預定值「n」時，則可確定所述樣本含有和緩鏈球菌。若當探測由樣本製備之PCR擴增產物，探針3之信號除以探針1之信號大於「n」時，則可確定所述樣本含有肺炎鏈球菌。可（例如）藉由探測由已知含有和緩鏈球菌之樣本產生之PCR產物及探測來自已知含有肺炎鏈球菌之樣本的PCR產物來確定「n」之適合值。

用於和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之例示性虛擬探針進一步描述於實施例3中。6.3. 陣列

本發明提供可定址陣列，其包含一或多種各自可用於區分第一基因體序列與第二同源基因體序列之虛擬探針。

本發明之可定址陣列可用於本文所描述之方法中。本發明之可定址陣列可包含一群位置可定址之寡核苷酸探針分子，所述寡核苷酸探針分子各自位於所述陣列上之分開的位置處。在一些實施方式中，構成虛擬探針之所述群之寡核苷酸探針分子中的各探針分子（典型地為二或三種不同探針分子）包含與所述虛擬探針意欲區分的第一基因體序列或第二基因體序列中之15至40個連續核苷酸（例如15至20、15至30、20至40、20至30或30至40個連續核苷酸）90%至100%（例如90%至95%或95%至100%）互補的核苷酸序列。

所述可定址陣列可進一步可選地包含一或多種對照探針分子（例如用於評估DNA萃取及擴增步驟之效率的萃取及擴增對照及/或用於評估與所述陣列的DNA雜交之效率的雜交對照）。

在一些實施方式中，所述陣列之探針分子包含聚胸苷尾，例如包含至多10個核苷酸之聚胸苷尾、或例如包含至多15個核苷酸之聚胸苷尾、或例如包含至多20個核苷酸之聚胸苷尾。在一些實施方式中，所述聚胸苷尾為10聚體至20聚體，例如15聚體。

在一些實施方式中，所述可定址陣列包含12或更多種探針分子，例如12至100種探針分子、或例如12至50種探針分子、或例如25至75種探針分子、或例如50至100種探針分子。在一些實施方式中，所述可定址陣列包含12種探針分子。在其他實施方式中，所述可定址陣列包含14種探針分子。在再其他實施方式中，所述可定址陣列包含84種探針分子。

在一些實施方式中，所述可定址陣列包含用於至少2種虛擬探針（例如至少3個虛擬探針、或例如至少5個虛擬探針、或例如至少10個虛擬探針）之寡核苷酸探針，或例如可所述定址陣列包含用於至多10個或至多15個虛擬探針之寡核苷酸探針。

所述虛擬探針可重疊，使得探針分子可為兩個或更多個虛擬探針之組分。所述虛擬探針亦可為不重疊的。

在一些實施方式中，所述可定址陣列包含能夠區分至少5種不同類型之微生物（例如細菌）的虛擬探針。在其他實施方式中，所述可定址陣列包含能夠區分至少10種不同類型（例如至少20種不同類型、例如至少30種不同類型、例如至少40種不同類型、或例如至多50種不同類型）之微生物（例如細菌）的虛擬探針。

在一些實施方式中，所述可定址陣列含有至少5個虛擬探針，例如至少10個虛擬探針、例如至少15個虛擬探針、或例如至少20個虛擬探針，其中之各者能夠鑑認樣本中可能存在之不同類型之微生物，例如細菌，例如不同菌株或細菌物種。

在一些實施方式中，本發明之可定址陣列包含一或多種用於區別來自真細菌物種之基因體序列與並非真細菌物種之微生物之基因體序列的虛擬探針。在一些實施方式中，所述可定址陣列包含一或多種適用於區別來自革蘭氏陽性細菌之基因體序列與來自革蘭氏陰性細菌之基因體序列的虛擬探針。在一些實施方式中，所述可定址陣列包含一或多種適用於區別來自不同目之微生物之基因體序列的虛擬探針。在一些實施方式中，所述虛擬探針適用於區別來自不同科之微生物之基因體序列。在一些實施方式中，所述虛擬探針適用於區別來自不同屬、不同群、及/或不同種之微生物之基因體序列。

可用於製備本發明之陣列之適合的微陣列系統描述於美國專利第9,738,926號及美國專利申請案公開第2018/0362719 A1號中，其等之內容以全文引用之方式併入本文中。美國專利第9,738,926號及美國專利申請案公開第2018/0362719 A1號中所描述之微陣列系統利用三維交聯聚合物網路。因此，在一些實施方式中，本發明之陣列包含如美國專利第9,738,926號中所描述之陣列，其中所述陣列之探針分子包含一群如本文所描述之寡核苷酸探針分子。在其他實施方式中，本發明之陣列包含如美國專利申請案公開第2018/0362719 A1號中所描述之陣列，其中所述陣列之探針分子包含一群如本文所描述之寡核苷酸探針分子。

在本發明之一個方面，本發明提供使用本發明之陣列確定第一生物體或第二生物體是否存在於樣本中之方法。例示性方法包含以下步驟：使用能夠與第一生物體之基因體（「第一基因體（first genome）」）及第二生物體之基因體（「第二基因體（second genome）」）雜交且自其等引發PCR擴增的PCR引子對樣本進行PCR擴增反應，當所述第一基因體及所述第二基因體存在於所述樣本中時，分別產生第一擴增子組及第二擴增子組，且其中所述PCR擴增反應併入標記，所述標記在任何由所述反應產生之PCR擴增產物中產生可量測信號；使所述PCR擴增產物與本發明之陣列接觸，所述陣列具有一或多種包含二或多種寡核苷酸探針分子之虛擬探針，所述寡核苷酸探針分子中之各者能夠與所述第一擴增子組及/或所述第二擴增子組中之一或多種擴增子特異性雜交，且其中所述二或多種寡核苷酸探針分子與所述第一擴增子組中之擴增子及所述第二擴增子組中之擴增子不一致地雜交，使得所述探針分子與所述第一擴增子組及第二擴增子組中之擴增子之雜交可區分所述第一擴增子組與所述第二擴增子組；自所述陣列洗滌未結合之核酸分子；及量測所述陣列上之各探針分子位置處之標記之信號；以及若所述信號指示與所述探針分子雜交之PCR擴增產物係由所述PCR擴增反應產生，則如本文所描述地分析所述信號以確定所述第一擴增子組或所述第二擴增子組是否由所述PCR擴增反應產生；或若所述信號指示所述PCR擴增反應未產生與所述群之探針分子雜交之PCR擴增產物，則確定所述樣本不含有所述第一生物體或所述第二生物體，因此確定所述第一生物體或所述第二生物體是否存在於所述樣本中。6.4. 系統

本發明提供用於確定生物體是否存在於樣本中之系統。所述系統可包含（例如）：（i）光學讀取器，其用於產生具有寡核苷酸探針分子之陣列（例如本發明之陣列）的各探針分子位置之信號數據；以及（ii）至少一個處理器，其經設置以自所述光學讀取器接收信號數據且經設置以使用虛擬探針（例如具有如本文中所描述之特徵的虛擬探針）分析信號數據，且所述處理器具有用於輸出分析結果之至儲存或顯示裝置或網路之介面。

可用於本發明之系統中之光學讀取器包括市售微盤讀取器（例如GloMax® Discover（Promega）、ArrayPix^TM （Arrayit）、Varioskan^TM LUX（Thermo Scientific）、Infinite® 200 PRO（Tecan））。

所述系統可包括非暫態儲存媒體（例如硬碟、隨身碟、CD或DVD），其包括用於實施所述信號數據之分析的處理器可執行指令。

所述系統可包括通用或專用運算系統環境或設置。可與本發明之系統一起使用的熟知運算系統、環境及/或設置之實例包括（但不限於）個人電腦、伺服器電腦、智慧型電話、平板電腦、手持式或膝上型電腦裝置、多處理器系統、基於微處理器之系統、網路PC、小型電腦、大型電腦、包括以上系統或裝置中之任一者的分散式運算環境、及類似者。

本發明之系統可執行電腦可執行指令，諸如程式模組。一般而言，程式模組包括執行特定任務或實施特定抽象資料類型的常式、程式、物件、組件、資料結構、等等。一些實施方式亦可在分散式計算環境中實踐，其中藉由遠端處理裝置執行任務，所述遠端處理裝置經由通信網路連接。此等分散式系統可為稱為企業運算系統者，或在一些實施方式中，可為「雲端（cloud）」運算系統。在分散式運算環境中，程式模組可位於本地及/或遠端電腦儲存媒體（包括記憶體儲存裝置）中。

運算環境可包括一或多個輸入/輸出裝置。一些此類輸入/輸出裝置可提供使用者介面。使用者可經由輸入裝置（諸如鍵盤及指向裝置（諸如滑鼠））將命令及資訊鍵入至所述電腦中。然而，可使用其他形式之指向裝置，包括軌跡球、觸控板、或觸控式螢幕。

本發明之系統可包括一或多個輸出裝置，包括可形成使用者介面之一部分的輸出裝置，例如監視器。

本發明之系統可在網路化環境中使用與一或多個遠端電腦之邏輯連接來操作。所述遠端電腦可為個人電腦、伺服器、路由器、網路PC、對等裝置或其他公用網路節點。邏輯連接包括區域網路（local area network；LAN）及廣域網路（wide area network；WAN），但亦可包括其他網路。此類網路連接環境在辦公室（企業範圍的電腦網路、內部網路及網際網路）中為常見的。或者或另外，WAN可包括蜂巢式網路。

當用於LAN網路連接環境中時，本發明之系統可經由網路介面或適配器連接至所述LAN。當用於WAN網路連接環境中時，系統可包括數據機或用於經由所述WAN（諸如網際網路）建立通信之其他構件。

在網路化環境中，用於使用虛擬探針分析信號數據之程式模組可儲存於遠端記憶體儲存裝置（例如硬碟機或隨身碟）中。

本發明之系統可進一步包含能夠將PCR擴增反應之產物添加至所述陣列且能夠自所述陣列洗滌未結合之核酸分子的盤操作機器人。多種盤操作機器人為可商購的且此等機器人可用於本發明之系統中（例如Tecan MSP 9000、MSP 9250或MSP 9500、TecanCavro®Omni Flex、Tricontinent TriTon（XYZ）或Aurora VersaTM）。6.5. 套組

本發明提供適用於本發明之方法中之套組。

套組可包含（例如）適用於如本文所描述之即時PCR反應之一組二或多種經標記之探針分子（例如2至20種探針分子、2至10種探針分子、2至5種探針分子、5至10種探針分子、或10至20種探針分子）。舉例而言，套組可包含（1）其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之探針分子及其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之探針分子；（2）其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之探針分子及其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4之探針分子；或（3）其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 5之探針分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6之探針分子及其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 7之探針分子。在一些實施方式中，套組包含（1）及（2）之探針分子之組合。在其他實施方式中，套組包含（1）及（3）之探針分子之組合。在其他實施方式中，套組包含（2）及（3）之探針分子之組合。在又其他實施方式中，套組包含（1）、（2）及（3）之探針分子之組合。

在其他實施方式中，套組可包含（例如）適用於如本文所描述之陣列中之一組二或多種探針分子（例如2至20種探針分子、2至10種探針分子、2至5種探針分子、5至10種探針分子、或10至20種探針分子）（例如未標記之探針分子）。舉例而言，套組可包含（1）其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之探針分子及其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之探針分子；（2）其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之探針分子及其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4之探針分子；或（3）其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 5之探針分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6之探針分子及其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 7之探針分子。在一些實施方式中，套組包含（1）及（2）之探針分子之組合。在其他實施方式中，套組包含（1）及（3）之探針分子之組合。在其他實施方式中，套組包含（2）及（3）之探針分子之組合。在又其他實施方式中，套組包含（1）、（2）及（3）之探針分子之組合。

在其他實施方式中，套組可包含如本文所描述之陣列。

如本文所描述之套組可進一步包含一或多種用於進行PCR反應之試劑（例如一或多種（例如兩種）用於擴增同源基因體序列之引子）及/或一或多種用於進行雜交反應之試劑（例如洗滌緩衝劑）。

如本文所描述之套組可進一步包含一或多種用於製備用於PCR擴增反應之樣本的試劑及/或一或多種用於製備用於PCR擴增反應之樣本的裝置，例如溶胞緩衝劑或珠磨系統。

如本文所描述之套組可進一步包含一或多個容器及/或對於使用所述套組之組件執行如本文所描述之方法中之步驟之一些或全部之說明書。7. 實施例 7.1. 實施例 1 ：用於凝固酶陰性葡萄球菌（ CNS ）之虛擬探針

金黃色葡萄球菌為凝固酶陽性物種且為身體之微生物相之正常成員。然而，金黃色葡萄球菌（S. aureus ）可變成伺機性病原體，引起皮膚感染、呼吸道感染、及食物中毒。因此，存在對可在臨床樣本中區分金黃色葡萄球菌及其他葡萄球菌屬物種之測試的臨床需求。存在少量其他凝固酶陽性葡萄球菌，但其等通常在疾病中無主要腳色，且因此對於大部分之分析目的而言可忽略。

製得寡核苷酸探針，「AllStaph-146abp」（具有核苷酸序列CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）），其可用於非特異性地鑑認葡萄球菌屬物種。換言之，AllStaph-146abp為屬探針分子且本身無法區分樣本中之金黃色葡萄球菌與凝固酶陰性物種。實施例中所使用之探針分子名稱中所存在之數字係指用於製備可用探針分子探測之擴增子之正向PCR引子與該探針之起始點之間的按核苷酸數目計之距離。第二寡核苷酸探針，「Sau-71p」（具有核苷酸序列GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG（SEQ ID NO: 2））為16S rRNA探針分子，其為來自金黃色葡萄球菌之擴增子提供陽性信號，但不為來自凝固酶陰性葡萄球菌之擴增子提供陽性信號。因此，在唯一臨床上相關之凝固酶陽性葡萄球菌屬物種為金黃色葡萄球菌之情況下，用於凝固酶陰性葡萄球菌屬物種之例示性虛擬探針可由AllStaph-146abp及Sau-71p組成。當以虛擬探針探測PCR擴增產物及AllStaph-146abp之信號為陽性且Sau-71p之信號不為陽性（其可表示為「AllStaph-146-abp非Sau-71p」）時，可確定PCR擴增產物自其製備之樣本含有凝固酶陰性葡萄球菌屬物種（參見圖10A）。在較多物種相關之情形下，虛擬探針可包括另外的探針分子。舉例而言，當可引起牛、馬、及豬中之皮膚疾病之豬葡萄球菌（S. hyicus ）相關時，當對豬葡萄球菌具有特異性之探針亦不為陽性（其可表示為「AllStaph-146abp非Sau71P非豬葡萄球菌」）時，樣本可確定含有凝固酶陰性葡萄球菌屬物種（參見圖10B）。7.2. 實施例 2 ：用於區別咽峽炎鏈球菌及格氏鏈球菌之虛擬探針

格氏鏈球菌為通常於人類口中找到之細菌。格氏鏈球菌在口中通常為無害的，但可在進入血流後引起急性細菌性心內膜炎。咽峽炎鏈球菌亦為人類微生物相之成員，且已知會於免疫功能不全個體引起感染。

已製得兩種寡核苷酸探針分子，其等可用於虛擬探針中以用於區分樣本中之咽峽炎鏈球菌及格氏鏈球菌。具有核苷酸序列CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT（SEQ ID NO: 3）之寡核苷酸探針分子「Stango 85p」為16S rRNA探針分子，其可在咽峽炎鏈球菌及格氏鏈球菌中之任一者存在於樣本中時產生陽性信號。另一方面，具有核苷酸序列TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA（SEQ ID NO: 4）之寡核苷酸探針分子「Sang 156p」為來自咽峽炎鏈球菌之擴增子提供陽性信號且不為來自格氏鏈球菌之擴增子提供陽性信號。用於格氏鏈球菌及咽峽炎鏈球菌之例示性虛擬探針由Stango85p及Sang156p構成。當用虛擬探針探測PCR擴增產物且Stango85p之信號為陽性並且San156p之信號不為陽性（其可表示為「Stango85p非Sang156p」）時，可確定用於製備PCR擴增產物之樣本含有格氏鏈球菌，而若Stango85p之信號為陽性且San156p之信號為陽性（其可表示為「Stango85p與Sang156p」），則可確定樣本含有咽峽炎鏈球菌。7.3. 實施例 3 ：用於區別和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之虛擬探針

和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌（兩者均可為病原性的）在其等之16S rRNA幾乎完全一致，由此使得難以使用對於16S rRNA之單一寡核苷酸探針分子區分兩個物種。

已製得三種寡核苷酸探針分子，其等可用於虛擬探針中以用於區分和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌。具有核苷酸序列AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）之第一探針「AllStrep-261p」為不能區分不同鏈球菌屬物種之屬探針分子。具有核苷酸序列GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA（SEQ ID NO: 6）的第二探針「Spneu-229p」雖然包含來自肺炎鏈球菌之基因體序列，但是其自身不能用於區分和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌。具有核苷酸序列GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA（SEQ ID NO: 7）之第三探針「Spneu-229bp」與Spneu-229p差異單一核苷酸，該單一核苷酸形成肺炎鏈球菌中之SNP。

當來自和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之16S rRNA擴增子與包含該三種探針分子之陣列結合時，觀測到該三種探針分子中之每一者的陽性信號（圖11A-11B）。因此，該三種探針分子獨自不能用於區分和緩鏈球菌與肺炎鏈球菌。然而，來自和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之擴增子可藉由在用該三種探針探測來自和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之16S rRNA擴增子時評估信號模式來區分。特定言之，探測由含有和緩鏈球菌之樣本產生之PCR擴增產物產生可表示為「(Spneu-229p或Spneu-229bp) ＜ (AllStrep-261p)/3」之信號模式，而探測由含有肺炎鏈球菌之樣本產生之PCR擴增產物產生可表示為「(Spneu-229p與Spneu-229bp) ＞ (AllStrep-261p)/3」之信號模式。

基於自來自含有和緩鏈球菌及肺炎鏈球菌之樣本之雜交數據的進一步分析，確定對於Spneu-229bp及AllStrep-261p探針之「(Spneu-229bp/AllStrep-261p) ≤0.39」之信號模式指示和緩鏈球菌之存在，而對於Spneu-229bp及AllStrep-261p探針之「(Spneu-229bp/AllStrep-261p) ＞0.39」之信號模式指示肺炎鏈球菌之存在。

因此，此實施例驗證所述虛擬探針概念。7.4. 實施例 4 ：用於偵測草綠色鏈球菌群之虛擬探針

草綠色鏈球菌群（viridians Streptococci group；VGS）為臨床上相關之革蘭氏陽性細菌之主要群中之一者，其具有被分為以下五個子群的超過24個物種：牛鏈球菌群、咽峽炎鏈球菌群、唾液鏈球菌群、和緩鏈球菌群及變形鏈球菌群。VGS群細菌可在免疫功能不全患者中引起肺炎及敗血症。

作為群之VGS物種呈現基因上異質，表明可使用單一探針偵測不同物種。多種探針經設計用於不同VGS群細菌，但一些物種展示與用於其他VGS子群之探針的交叉反應性（參見圖12，其展示肺炎鏈球菌與和緩鏈球菌探針Smit-79p之交叉反應性，且展示和緩鏈球菌及口腔鏈球菌與肺炎鏈球菌探針Spneu-229p及Spneu-229bp之交叉反應性）。鑒於此交叉反應性，設計可區分肺炎鏈球菌與和緩鏈球菌/口腔鏈球菌之和緩鏈球菌群細菌的虛擬探針：

和緩鏈球菌子群= (Spar-205p與AllStrep-261p)或(Smit-79p與AllStrep-261p與非Shyo-193p)或(Ssang-193p與AllStrep-261p與非Stmu-86p)或(Stango-85p與非Sang-156p與AllStrep-261p＞0.01)且若Smit-79p，則(Spneu-229bp / AllStrep-261p) / AllStrep-261p ≤ 3。7.5. 實施例 5 ：用於偵測來自腸桿菌科群之物種的虛擬探針

腸桿菌科為包括病原性及非病原性物種之革蘭氏陰性細菌之大型科。病原性科成員包括克雷伯氏菌屬物種、腸桿菌屬物種、艾氏菌屬（Escherichia）物種、檸檬酸桿菌屬物種、沙雷菌屬物種及沙門氏菌屬物種。

該科之成員之16s rRNA區域在物種間具有極小基因序列變異，使得難以設計能夠區分物種之16S探針。然而，考慮到16S序列之類似性，設計共同探針「Entb-132p」，其可將大部分科成員鑑認為腸桿菌科，除可鑑認探針「Entb-299p」之泛菌屬（Pan toea ）物種以外。

遵循來自腸桿菌科物種之物種於16S rRNA基因體區域的聚集模式設計兩組探針。來自腸桿菌屬及克雷伯氏菌屬之物種可藉由探針「Enklspss-95p」鑑認，且來自檸檬酸桿菌屬、沙門氏菌屬及艾氏菌屬之物種可藉由探針「SaEsCi-91p」鑑認。由於在設計能夠區分腸桿菌科物種之單一探針方面之困難，設計16S rRNA與ITS探針之組合（參見圖13及圖14）以用於腸桿菌科物種之層級鑑認及區別。

使用16s-23s ITS區使得有可能區別陰溝腸桿菌複合體之物種，該陰溝腸桿菌複合體包括陰溝腸桿菌、阿氏腸桿菌及霍氏腸桿菌。組合使用之三個探針：「Encl-1871p」、「Encl-1659p」及「ECC3-1729p」允許不同陰溝腸桿菌複合體物種之特異性鑑認（參見圖15）。陰溝腸桿菌= Encl-1659p非(Encl-1871p或ECC3-1729p) 阿氏腸桿菌= Encl01871p非(Encl-1659p或ECC3-1729p) 霍氏腸桿菌= (Encl-1871p與ECC3-1729p)非Encl-1659p8. 特定實施方式

本發明藉由以下特定實施方式例示。 1. 一種確定具有第一基因體之第一生物體或具有第二基因體之第二生物體是否存在於測試樣本或所述測試樣本自其製備之初始樣本中之方法，所述方法包含：（a）用虛擬探針探測所述測試樣本，所述虛擬探針包含二或多種探針分子，其中各探針分子能夠與對應於所述第一基因體之一或多種目標核酸及/或對應於所述第二基因體之一或多種同源目標核酸特異性雜交，且其中所述探針分子與所述對應於第一及第二基因體之目標核酸不一致地雜交，使得所述探針分子與所述對應於第一基因體之一或多種目標核酸及所述對應於第二基因體之一或多種目標核酸之雜交能夠區分所述對應於第一基因體之目標核酸與所述對應於第二基因體之目標核酸；以及（b）偵測及/或定量來自所述虛擬探針中之探針分子與所述測試樣本中若存在之核酸之雜交的信號，由此確定所述第一生物體或第二生物體是否存在於所述測試樣本或初始樣本中。 2. 如實施方式1之方法，其中所述對應於第一基因體之一或多種目標核酸為第一擴增子組且所述對應於第二基因體之一或多種目標核酸為第二擴增子組，並且其中所述虛擬探針中之各探針分子能夠與所述第一擴增子組及/或所述第二擴增子組中之一或多種擴增子特異性雜交，且其中所述探針分子與所述第一擴增子組中之擴增子及所述第二擴增子組中之擴增子不一致地雜交，使得所述探針分子與所述第一擴增子組及第二擴增子組中之擴增子之雜交可區分所述第一擴增子組與所述第二擴增子組。 3. 如實施方式2之方法，其進一步包含藉由使用如下PCR引子對所述初始樣本進行PCR擴增反應來製備所述測試樣本：能夠與所述第一基因體及所述第二基因體兩者雜交且自其等引發PCR擴增以在所述第一基因體及第二基因體存在於所述初始樣本中時分別產生所述第一擴增子組及第二擴增子組。 4. 如實施方式3之方法，其中所述PCR引子包含超過一種引子對且其中所述第一擴增子組包含複數種第一擴增子及/或所述第二擴增子組包含複數種第二擴增子。 5. 如實施方式2之方法，其進一步包含藉由以下者製備所述測試樣本：（a）使用能夠與所述第一基因體及所述第二基因體兩者雜交且自其等引發PCR擴增之第一組PCR引子對所述初始樣本進行第一PCR擴增反應；（b）使用不同於所述第一組PCR引子且能夠與所述第一基因體及所述第二基因體兩者雜交並且自其等引發PCR擴增的第二組PCR引子對所述初始樣本進行第二PCR擴增反應；以及（c）組合所述第一及第二PCR反應中產生之擴增子以在所述第一基因體及第二基因體存在於所述初始樣本中時分別產生包含複數種第一擴增子之第一擴增子組及包含複數種第二擴增子之第二擴增子組。 6. 如實施方式4或實施方式5之方法，其中所述複數種第一擴增子對應於所述第一基因體中之不同區域及/或所述複數種第二擴增子對應於所述第二基因體中之不同區域。 7. 如實施方式3之方法，其中所述PCR引子包含單一引子對，且所述第一擴增子組由單一第一擴增子組成且所述第二擴增子組由單一第二擴增子組成。 8. 如實施方式7之方法，其中所述第一擴增子之核苷酸序列與所述第二擴增子之核苷酸序列在所述擴增子能夠與所述虛擬探針中之至少一種探針分子雜交的區域中具有至少1個核苷酸錯配。 9. 如實施方式7之方法，其中所述第一擴增子之核苷酸序列與所述第二擴增子之核苷酸序列在所述擴增子能夠與所述虛擬探針中之至少一種探針分子雜交的區域中具有至少2個核苷酸錯配。 10. 如實施方式7之方法，其中所述第一擴增子之核苷酸序列與所述第二擴增子之核苷酸序列在所述擴增子能夠與所述虛擬探針中之至少一種探針分子雜交的區域中具有至少3個核苷酸錯配。 11. 如實施方式3至10中任一項之方法，其中所述PCR擴增反應將產生可量測信號的標記併入由所述反應產生之任何擴增子中。 12. 如實施方式3至11中任一項之方法，其中所述引子經標記。 13. 如實施方式12之方法，其中至少一種引子經5'螢光標記。 14. 如實施方式12之方法，其中超過一種引子經5'螢光標記。 15. 如實施方式3至14中任一項之方法，其中所述PCR反應包括經螢光標記之去氧核苷酸。 16. 如實施方式1至15中任一項之方法，其中各探針分子包含與所述第一第一基因體及/或第二基因體中之15至40個連續核苷酸90%至100%互補之核苷酸序列。 17. 如實施方式1至16中任一項之方法，其中所述虛擬探針包含兩種相對於彼此具有1個或更多個核苷酸錯配之探針分子。 18. 如實施方式17之方法，其中所述虛擬探針包含兩種相對於彼此具有1個核苷酸錯配之探針分子。 19. 如實施方式17之方法，其中所述虛擬探針包含相對於彼此具有2個核苷酸錯配之探針分子。 20. 如實施方式1至19中任一項之方法，其中所述虛擬探針之探針分子為存在於陣列上之位置可定址之探針分子，所述探針分子各自位於所述陣列上之分開的位置處。 21. 如實施方式20之方法，其中偵測及/或定量來自所述虛擬探針中之探針分子與所述PCR擴增之產物之雜交的信號包含偵測及/或定量位於所述虛擬探針中之探針分子之位置處之標記。 22. 如實施方式20或實施方式21之方法，其中步驟（b）包含：（i）使所述PCR擴增產物與所述陣列接觸；（ii）自所述陣列洗滌未結合之核酸分子；以及（iii）量測位於所述陣列上之各探針分子位置處之標記之信號強度。 23. 如實施方式20至22中任一項之方法，其中所述陣列包含一或多種對照探針分子。 24. 如實施方式20至23中任一項之方法，其中所述探針分子為寡核苷酸探針分子。 25. 如實施方式24之方法，其中所述探針分子中之一或多者具有聚胸苷尾。 26. 如實施方式24之方法，其中所述聚胸苷尾為10聚體至20聚體。 27. 如實施方式26之方法，其中所述聚胸苷尾為15聚體。 28. 如實施方式3至19中任一項之方法，所述PCR擴增反應為即時PCR擴增反應。 29. 如實施方式28之方法，其中：（a）各探針分子包含可區分之標記及遮蔽部分，所述遮蔽部分在所述標記及遮蔽部分均附接至所述探針時抑制所述標記之偵測；（b）所述標記在所述即時PCR擴增反應期間在所述探針分子被切裂後產生可量測之信號；以及（c）各標記可與其他標記彼此區分。 30. 如實施方式29之方法，其中所述標記為螢光標記。 31. 如實施方式2至30中任一項之方法，其中所述第一擴增子組及所述第二擴增子組各自包含對應於編碼rRNA之基因的核苷酸序列。 32. 如實施方式2至31中任一項之方法，其中所述第一擴增子組及所述第二擴增子組各自包含對應於rRNA基因之間的基因間間隔區的核苷酸序列。 33. 如實施方式1至32中任一項之方法，其中所述第一生物體及所述第二生物體為微生物。 34. 如實施方式33之方法，其中所述微生物為相同目之成員。 35. 如實施方式33之方法，其中所述微生物為相同科之成員。 36. 如實施方式35之方法，其中所述微生物為相同屬之成員。 37. 如實施方式36之方法，其中所述微生物為相同群之成員。 38. 如實施方式33至37中任一項之方法，其中所述微生物中之一或多者為人類病原體或動物病原體。 39. 如實施方式33至38中任一項之方法，其中所述微生物為細菌、病毒、或真菌。 40. 如實施方式33至39中任一項之方法，其中所述微生物為細菌。 41. 如實施方式40之方法，其中所述第一擴增子組及所述第二擴增子組各自包含對應於16S rRNA基因之核苷酸序列及/或對應於23S rRNA基因之核苷酸序列。 42. 如實施方式41之方法，其中所述第一擴增子組及所述第二擴增子組各自包含對應於16S rRNA基因之核苷酸序列。 43. 如實施方式41或實施方式42之方法，其中所述第一擴增子組及所述第二擴增子組各自包含對應於23S rRNA基因之核苷酸序列。 44. 如實施方式40至43中任一項之方法，其中所述第一擴增子組及所述第二擴增子組各自包含對應於16S-23S基因間間隔區之核苷酸序列。 45. 如實施方式1至44中任一項之方法，其中來自所述探針分子與目標核酸之雜交的信號可藉由以下者組合以區分所述第一基因體與所述第二基因體：（i）一或多個布林運算子、（ii）一或多個關係運算子或（iii）一或多個布林運算子及一或多個關係運算子。 46. 如實施方式45之方法，其進一步包含藉由以下者組合來自所述虛擬探針中之探針分子與所述目標核酸之雜交的信號以區分所述第一基因體及所述第二基因體：（i）一或多個布林運算子、（ii）一或多個關係運算子或（iii）一或多個布林運算子及一或多個關係運算子。 47. 如實施方式45或實施方式46之方法，其中各布林運算子獨立地選自「與」、「或」及「非」。 48. 如實施方式45至47中任一項之方法，其中各關係運算子獨立地選自「大於」（「＞」）及「小於」（「＜」）。 49. 如實施方式45至47中任一項之方法，其中所述信號可藉由一或多個布林運算子組合。 50. 如實施方式45至48中任一項之方法，其中所述信號可藉由一或多個關係運算子組合。 51. 如實施方式45至48中任一項之方法，其中所述信號可藉由一或多個布林運算子及一或多個關係運算子組合。 52. 如實施方式1至51中任一項之方法，其中所述虛擬探針包含兩種探針分子或由兩種探針分子組成。 53. 如實施方式52之方法，其中所述虛擬探針包含（i）能夠與第一目標核酸（例如當所述目標核酸為PCR產物時，所述第一擴增子組中之第一擴增子）及第二目標核酸（例如當所述目標核酸為PCR產物時，所述第二擴增子組中之第二擴增子）特異性雜交之第一探針分子、以及（ii）能夠與所述第二目標核酸特異性雜交但不與所述第一目標核酸特異性雜交之第二探針分子。 54. 如實施方式53之方法，其包含若所述第一探針分子之信號為陽性且所述第二探針分子之信號不為陽性則確定所述第一生物體存在於所述測試樣本或初始樣本中。 55. 如實施方式53或實施方式54之方法，其包含若所述第一探針分子之信號為陽性且所述第二探針分子之信號為陽性則確定所述第二生物體存在於所述測試樣本或初始樣本中。 56. 如實施方式53至55中任一項之方法，其中第一微生物為凝固酶陰性葡萄球菌屬物種且第二微生物為凝固酶陽性葡萄球菌屬物種。 57. 如實施方式56之方法，其中所述第二微生物為金黃色葡萄球菌。 58. 如實施方式56或實施方式57中任一項之方法，其中所述第一探針分子具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）之核苷酸序列。 59. 如實施方式56至實施方式58中任一項之方法，其中所述第二探針分子具有包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG（SEQ ID NO: 2）之核苷酸序列。 60. 如實施方式53至55中任一項之方法，其中所述第一微生物為格氏鏈球菌，且所述第二微生物為咽峽炎鏈球菌。 61. 如實施方式60之方法，其中所述第一探針分子具有包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT（SEQ ID NO: 3）之核苷酸序列。 62. 如實施方式60或實施方式61之方法，其中所述第二探針分子具有包含TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA（SEQ ID NO: 4）之核苷酸序列。 63. 如實施方式53至55中任一項之方法，其中所述第一微生物及所述第二微生物為腸桿菌科細菌。 64. 如實施方式63之方法，其中所述第一微生物及所述第二微生物係選自產氣腸桿菌、阿氏腸桿菌、及霍氏腸桿菌。 65. 如實施方式52之方法，其中所述虛擬探針包含（i）能夠與第一目標核酸（例如當所述目標核酸為PCR產物時，所述第一擴增子組中之第一擴增子）及第二目標核酸（例如當所述目標核酸為PCR產物時，所述第二擴增子組中之第二擴增子）特異性雜交之第一探針分子及（ii）能夠與所述第一目標核酸及所述第二目標核酸特異性雜交之第二探針分子。 66. 如實施方式65之方法，其包含若所述第一探針分子之信號除以所述第二探針分子之信號小於預定截止值則確定所述第一生物體存在於所述測試樣本或初始樣本中。 67. 如實施方式65或實施方式66之方法，其包含若所述第一探針分子之信號除以所述第二探針分子之信號大於預定截止值則確定所述第二生物體存在於所述測試樣本或初始樣本中。 68. 如實施方式65至67中任一項之方法，其中所述第一微生物為和緩鏈球菌，且所述第二微生物為肺炎鏈球菌。 69. 如實施方式65至68中任一項之方法，其中所述第一探針分子具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA（SEQ ID NO: 7）之核苷酸序列。 70. 如實施方式65至69中任一項之方法，其中所述第二探針分子具有包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）之核苷酸序列。 71. 如實施方式1至51中任一項之方法，其中所述虛擬探針包含三種探針分子或由三種探針分子組成。 72. 如實施方式71之方法，其中所述虛擬探針包含（i）能夠與第一目標核酸（例如當所述目標核酸為PCR產物時，所述第一擴增子組中之第一擴增子）及第二目標核酸（例如當所述目標核酸為PCR產物時，所述第二擴增子組中之第二擴增子）特異性雜交之第一探針分子；（ii）不同於所述第一探針分子且能夠與所述第一及第二目標核酸特異性雜交之第二探針分子；以及（iii）不同於所述第一及第二探針分子且能夠與所述第一及第二目標核酸特異性雜交之第三探針分子。 73. 如實施方式72之方法，其包含若出現以下情況則確定所述第一生物體存在於所述測試樣本或初始樣本中：（a）所述第一探針分子之信號為陽性或所述第二探針分子之信號為陽性，以及（b）所述第一探針分子之信號或所述第二探針分子之信號小於所述第三探針分子之信號或所述第三探針分子之信號之適當分數。 74. 如實施方式72或實施方式73之方法，其包含若出現以下情況則確定所述第二生物體存在於所述測試樣本或初始樣本中：（a）所述第一探針分子之信號及所述第二探針分子之信號為陽性，以及（b）所述第一探針分子之信號及所述第二探針分子之信號大於所述第三探針分子之信號或所述第三探針分子之信號之適當分數。 75. 如實施方式65至74中任一項之方法，其中所述第一微生物為和緩鏈球菌，且所述第二微生物為肺炎鏈球菌。 76. 如實施方式75之方法，其中所述第一探針分子具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA（SEQ ID NO: 6）之核苷酸序列。 77. 如實施方式75或實施方式76之方法，其中所述第二探針分子具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA（SEQ ID NO: 7）之核苷酸序列。 78. 如實施方式75至77中任一項之方法，其中所述第三探針分子具有包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）之核苷酸序列。 79. 如實施方式3至78中任一項之方法，其中選擇所述PCR之條件以使得所述PCR擴增產物之長度為300至800個核苷酸。 80. 如實施方式79之方法，其中選擇所述PCR條件以使得所述PCR擴增產物之長度為400至600個核苷酸。 81. 如實施方式33至80中任一項之方法，其中所述初始樣本或測試樣本處於被所述微生物中之一或多者感染之風險下。 82. 如實施方式33至81中任一項之方法，其中所述初始樣本或測試樣本疑似被所述微生物中之一或多者感染。 83. 如實施方式1至82中任一項之方法，其中所述初始樣本或測試樣本為生物樣本、環境樣本、或食品。 84. 如實施方式83之方法，其中所述初始樣本或測試樣本為選自以下者之生物樣本：血液、血清、唾液、尿液、胃液、消化液、淚液、糞便、精液、陰道液、間質液、源於腫瘤組織之體液、眼液、汗液、黏液、耳垢、油、腺體分泌物、呼出氣體、脊髓液、毛髮、指甲、皮膚細胞、血漿、自鼻拭子獲得之體液、自鼻咽洗滌液獲得之體液、腦脊髓液、組織樣本、自咽喉拭子獲得之體液或組織、自傷口拭子獲得之體液或組織、生檢組織、胎盤液、羊水、腹膜透析液、臍帶血、淋巴液、腔液、痰、膿、微生物相、胎糞、乳汁或自前述者中任一者處理、萃取或分離之樣本。 85. 如實施方式84之方法，其中所述生物樣本為：（a）尿液、痰或自尿液處理、萃取或分離之樣本；（b）痰或自痰處理、萃取或分離之樣本；（c）傷口拭子或自傷口拭子處理、萃取或分離之樣本；（d）血液或自血液處理、萃取或分離之樣本；或（e）腹膜透析液或自腹膜透析液處理、萃取或分離之樣本。 86. 實施方式83之方法，其中所述初始樣本或測試樣本為選自以下者之環境樣本：土壤、地下水、地表水、廢水或自前述者中任一者處理、萃取或分離之樣本。 87. 一種可定址陣列，其包含：（a）一或多個用於區分第一基因體序列與第二同源基因體序列之虛擬探針，各虛擬探針包含一群位置可定址之寡核苷酸探針分子，所述寡核苷酸探針分子各自位於所述陣列上之分開的位置處，其中所述一或多個虛擬探針中之各探針分子包含與所述第一基因體序列或第二基因體序列中之15至40個連續核苷酸90%至100%互補的核苷酸序列；以及（b）可選地，一或多種對照探針分子。 88. 如實施方式87之可定址陣列，其包含至少兩個虛擬探針。 89. 如實施方式87之可定址陣列，其包含至少三個虛擬探針。 90. 如實施方式87之可定址陣列，其包含至少四個虛擬探針。 91. 如實施方式87之可定址陣列，其包含至少五個虛擬探針。 92. 如實施方式87之可定址陣列，其包含至少十個虛擬探針。 93. 如實施方式87至91中任一項之可定址陣列，其包含至多十個虛擬探針。 94. 如實施方式87至92中任一項之可定址陣列，其包含至多十五個虛擬探針。 95. 如實施方式87至94中任一項之可定址陣列，其中各虛擬探針包含2-4種寡核苷酸探針分子。 96. 如實施方式95之可定址陣列，其中各虛擬探針包含2-3種寡核苷酸探針分子。 97. 如實施方式87至96中任一項之可定址陣列，其包含12個或更多種探針分子。 98. 如實施方式97之可定址陣列，其包含12至100種探針分子。 99. 如實施方式97之可定址陣列，其包含12至50種探針分子。 100. 如實施方式97之可定址陣列，其包含25至75種探針分子。 101. 如實施方式97之可定址陣列，其包含50至100種探針分子。 102. 如實施方式97之可定址陣列，其包含12種探針分子。 103. 如實施方式97之可定址陣列，其包含14種探針分子。 104. 如實施方式97之可定址陣列，其包含84種探針分子。 105. 如實施方式實施方式87至104中任一項之可定址陣列，其中所述第一基因體序列及所述第二基因體序列分別為來自第一微生物及第二微生物之基因體序列。 106. 如實施方式105之可定址陣列，其中所述微生物為相同目之成員。 107. 如實施方式105之可定址陣列，其中所述微生物為相同科之成員。 108. 如實施方式107之可定址陣列，其中所述微生物為相同屬之成員。 109. 如實施方式108之可定址陣列，其中所述微生物為相同群之成員。 110. 如實施方式87至109中任一項之可定址陣列，其中所述探針分子中之一或多者包含聚胸苷尾。 111. 如實施方式110之可定址陣列，其中所述聚胸苷尾為10聚體至20聚體。 112. 如實施方式111之可定址陣列，其中所述聚胸苷尾為15聚體。 113. 如實施方式87至112中任一項之可定址陣列，其中所述第一基因體序列及所述第二基因體序列各自包含對應於編碼rRNA之基因的核苷酸序列。 114. 如實施方式113之可定址陣列，其中所述編碼rRNA之基因為16S rRNA基因或23S rRNA基因。 115. 如實施方式87至112中任一項之可定址陣列，其中所述第一基因體序列及所述第二基因體序列各自包含對應於rRNA基因之間的基因間間隔區的核苷酸序列。 116. 如實施方式87至115中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含用於區別來自真細菌物種之基因體序列與並非真細菌物種之微生物之基因體序列的探針分子。 117. 如實施方式87至116中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含用於區別來自革蘭氏陽性細菌之基因體序列與來自革蘭氏陰性細菌之基因體序列的探針分子。 118. 如實施方式87至117中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含用於區別來自不同目之微生物的基因體序列之探針分子。 119. 如實施方式87至118中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含用於區別來自不同科之微生物的基因體序列之探針分子。 120. 如實施方式87至119中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含用於區別來自不同屬之微生物的基因體序列之探針分子。 121. 如實施方式87至120中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含用於區別來自不同群之微生物的基因體序列之探針分子。 122. 如實施方式87至121中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含用於區別來自不同物種之微生物的基因體序列之探針分子。 123. 如實施方式87至122中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含其核苷酸序列包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）之探針分子。 124. 如實施方式87至123中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含其核苷酸序列包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG（SEQ ID NO: 2）之探針分子。 125. 如實施方式87至124中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含其核苷酸序列包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT（SEQ ID NO: 3）之探針分子。 126. 如實施方式87至125中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含其核苷酸序列包含TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA（SEQ ID NO: 4）之探針分子。 127. 如實施方式87至126中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含其核苷酸序列包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）之探針分子。 128. 如實施方式87至127中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含其核苷酸序列包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA（SEQ ID NO: 6）之探針分子。 129. 如實施方式87至128中任一項之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含其核苷酸序列包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA（SEQ ID NO: 7）之探針分子。 130. 一種確定具有第一基因體之第一生物體或具有第二基因體之第二生物體是否存在於測試樣本或所述測試樣本自其衍生之初始樣本中之方法，所述方法包含：（a）用包含包含二或多種探針分子的虛擬探針的如實施方式87或129中任一項之陣列探測所述測試樣本，其中各探針分子能夠與對應於所述第一基因體之一或多種目標核酸及/或對應於所述第二基因體之一或多種同源目標核酸特異性雜交，且其中所述探針分子與所述對應於第一及第二基因體之目標核酸不一致地雜交，使得所述探針分子與所述對應於第一基因體之一或多種目標核酸及所述對應於第二基因體之一或多種目標核酸之雜交可區分所述對應於第一基因體之目標核酸與所述對應於第二基因體之目標核酸；及（b）自所述陣列洗滌未結合之核酸分子；（c）偵測及/或定量位於所述陣列上之各探針分子位置處之信號；以及（d）若所述信號指示：（i）與所述陣列之探針分子雜交之目標核酸存在於所述測試樣本中，則分析所述信號以確定對應於所述第一基因體之目標核酸或對應於所述第二基因體之目標核酸是否存在於所述樣本中，由此確定所述第一生物體或第二生物體是否存在於所述初始樣本或所述測試樣本中；或（ii）在步驟（a）中並未產生與所述虛擬探針之探針分子雜交之目標產物，則確定所述初始樣本或測試樣本不含有所述第一生物體或所述第二生物體，由此確定所述第一生物體或第二生物體是否存在於所述初始樣本或所述測試樣本中。 131. 如實施方式130之方法，其中所述對應於第一基因體之一或多種目標核酸為第一擴增子組且所述對應於第二基因體之一或多種目標核酸為第二擴增子組，並且其中所述虛擬探針中之各探針分子能夠與所述第一擴增子組及/或所述第二擴增子組中之一或多種擴增子特異性雜交，且其中所述探針分子與所述第一擴增子組中之擴增子及所述第二擴增子組中之擴增子不一致地雜交，使得所述探針分子與所述第一擴增子組及第二擴增子組中之擴增子之雜交可區分所述第一擴增子組與所述第二擴增子組。 132. 如實施方式131之方法，其進一步包含藉由使用如下PCR引子對所述初始樣本進行PCR擴增反應來製備所述測試樣本：能夠與所述第一基因體及所述第二基因體兩者雜交且自其等引發PCR擴增以在所述第一基因體及第二基因體存在於所述樣本中時分別產生所述第一擴增子組及第二擴增子組。 133. 一種系統，其用於確定生物體是否存在於樣本中，所述系統包含：（a）光學讀取器，其用於產生如實施方式87至129中任一項之陣列的各探針分子位置之信號數據；以及（b）至少一個處理器，其：（i）經設置以自所述光學讀取器接收信號數據；（ii）經設置以分析所述一或多個虛擬探針之信號數據；及（iii）具有用於輸出分析結果之至儲存或顯示裝置或網路之介面。 134. 如實施方式133之系統，其進一步包含能夠將PCR擴增反應之產物添加至所述陣列且能夠自所述陣列洗滌未結合之核酸分子的盤操作機器人。 135. 如實施方式1至86或130至132中任一項之方法，其係使用實施方式133或134之系統來執行。 136. 一種寡核苷酸探針分子，其核苷酸序列包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）。 137. 一種寡核苷酸探針分子，其核苷酸序列包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG（SEQ ID NO: 2）。 138. 一種寡核苷酸探針分子，其核苷酸序列包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT（SEQ ID NO: 3）。 139. 一種寡核苷酸探針分子，其核苷酸序列包含TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA（SEQ ID NO: 4）。 140. 一種寡核苷酸探針分子，其核苷酸序列包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）。 141. 一種寡核苷酸探針分子，其核苷酸序列包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA（SEQ ID NO: 6）。 142. 一種寡核苷酸探針分子，其核苷酸序列包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA（SEQ ID NO: 7）。 143. 如實施方式136至142中任一項之寡核苷酸探針分子，其包含聚胸苷尾。 144. 如實施方式143之寡核苷酸探針分子，其中所述聚胸苷尾為10聚體至20聚體。 145. 如實施方式144之寡核苷酸探針分子，其中所述聚胸苷尾為15聚體。 146. 如實施方式136至145中任一項之寡核苷酸探針分子，其包含標記。 147. 一種包含複數種寡核苷酸探針分子之虛擬探針，其中所述虛擬探針中之至少一種寡核苷酸探針分子具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）之核苷酸序列且所述虛擬探針中之另一寡核苷酸分子具有包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG（SEQ ID NO: 2）之核苷酸序列。 148. 一種包含複數種寡核苷酸探針分子之虛擬探針，其中所述虛擬探針中之至少一種寡核苷酸探針分子具有包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT（SEQ ID NO: 3）之核苷酸序列且所述虛擬探針中之另一寡核苷酸分子具有包含TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA（SEQ ID NO: 4）之核苷酸序列。 149. 一種包含複數種寡核苷酸探針分子之虛擬探針，其中所述虛擬探針中之至少一種寡核苷酸探針分子具有包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）之核苷酸序列、所述虛擬探針中之另一寡核苷酸分子具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA（SEQ ID NO: 6）之核苷酸序列且所述虛擬探針中之另一寡核苷酸分子具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA（SEQ ID NO: 7）之核苷酸序列。 150. 如實施方式147至149中任一項之虛擬探針，其中各寡核苷酸探針分子包含聚胸苷尾。 151. 如實施方式150之虛擬探針，其中所述聚胸苷尾為10聚體至20聚體。 152. 如實施方式151之虛擬探針，其中所述聚胸苷尾為15聚體。 153. 一種可定址陣列，其包含： (a)一群位置可定址之探針分子，所述探針分子各自位於所述陣列上之分開的位置處，其中所述群之探針分子包含如實施方式136至146中任一項之寡核苷酸探針分子。（b）可選地，一或多種對照探針分子。 154. 一種可定址陣列，其包含如實施方式147至152中任一項之虛擬探針，其中所述虛擬探針中之各探針分子位於所述陣列上之分開的位置處。 155. 如實施方式154之可定址陣列，其進一步包含一或多種對照探針分子。 156. 一種套組，其包含二或多種探針分子，所述探針分子係選自其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7之探針分子。 157. 如實施方式156之套組，所述套組包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之寡核苷酸探針分子及其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之寡核苷酸探針分子。 158. 如實施方式156之套組，所述套組包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之寡核苷酸探針分子及其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4之寡核苷酸探針分子。 159. 如實施方式156之套組，所述套組包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 5之寡核苷酸探針分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6之寡核苷酸探針分子及其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 7之寡核苷酸探針分子。 160. 如實施方式156之套組，所述套組包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之寡核苷酸探針分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之寡核苷酸探針分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之寡核苷酸探針分子及其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4之寡核苷酸探針分子。 161. 如實施方式156之套組，所述套組包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之寡核苷酸探針分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之寡核苷酸探針分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 5之寡核苷酸探針分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6之寡核苷酸探針分子及其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 7之寡核苷酸探針分子。 162. 如實施方式156之套組，所述套組包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之寡核苷酸探針分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4之寡核苷酸探針分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 5之寡核苷酸探針分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6之寡核苷酸探針分子及其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 7之寡核苷酸探針分子。 163. 如實施方式156之套組，所述套組包含其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1之寡核苷酸探針分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2之寡核苷酸探針分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3之寡核苷酸探針分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4之寡核苷酸探針分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 5之寡核苷酸探針分子、其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6之寡核苷酸探針分子，及其核苷酸序列包含SEQ ID NO: 7之寡核苷酸探針分子。 164. 如實施方式156至163中任一項之套組，其中所述探針分子經標記。 165. 如實施方式164之套組，其中所述探針分子經螢光標記標記。 166. 如實施方式156至163中任一項之套組，其中所述探針分子未經標記。 167. 如實施方式156至166中任一項之套組，其進一步包含一或多種能夠擴增第一基因體序列及第二同源基因體序列之PCR引子對。9. 文獻之引用

本申請案中所引用之所有出版品、專利、專利申請案及其他文獻均出於所有目的特此以全文引用之方式併入，引用之程度就如同個別地指示將各個別出版品、專利、專利申請案及其他文獻以引用之方式併入以用於所有目的一樣。在併入本文中之一或多個文獻之教示內容與本發明不一致之情況下，以本說明書之教示內容為準。

無

[ 圖 1]A-B 為根據自GenBank獲得之數個葡萄球菌屬（Staphylococcus ）物種之16S rRNA基因製得的系統樹圖（在圖1A與圖1B之間拆分）。該樹係使用CLC序列查看器軟件以自舉分析（bootstrap analysis）構築以展示數據之可信度。葡萄球菌屬群之各物種用兩個由Gen Bank寄存編號展示之序列表示。樹之各節點處的自舉值（以整數計）定義跨越重複數據的數據之可信度之百分比。數據之自舉值越高，其對於個別分類群之支持性越高。個別物種之水平線稱為分枝且表示該物種之基因改變量。分枝長度之單位以改變或取代之數目除以序列之長度展示。[ 圖 2]A-B 表示由16s rRNA及16s-23s rRNA基因體序列之多重排比產生之來自草綠色鏈球菌（Streptococcus viridians）群的物種之系統樹圖（在圖2A與圖2B之間拆分）。I-牛鏈球菌（Streptococcus bovis ）群、II-咽峽炎鏈球菌（Streptococcus anginosus ）群、III-唾液鏈球菌（Streptococcus salivarius ）群、IV-和緩鏈球菌（Streptococcus mitis ）群以及V-變形鏈球菌（Streptococcus mutans ）群。數字表示指示數據組之可信度之百分比的自舉值。視排比模式及其等之病原性重要性而定，將物種稱為三個群-I、II及III。[ 圖 3] 為16S rRNA及16S-23S rRNA ITS基因體序列、以及16S正向（16S Fw）、16S反向（16S Rv）、ITS正向（ITS Fw）及ITS反向（ITS Rv）引子之圖。[ 圖 4] 說明適用於章節6.2.3.4中所描述之不對稱PCR方法的引子對，該引子對包含未延伸引子（其可為用於對稱PCR方法中之傳統引子）以及由與目標核酸互補之「A」區、包括「A」區之至少一部分之直接重複或反向重複的「B」區、及可包括間隔序列及/或限制性核酸內切酶識別位點之部分或全部的可選的「C」區構成之延伸引子。[ 圖 5]A-C. 圖5A說明在「B」區含有「A」區之至少一部分之反向重複時發生的延伸引子之分子間雜交。圖5B說明在「B」區含有「A」區之至少一部分之直接重複時發生的延伸引子之分子間雜交。圖5C說明在「B」區含有「A」區之至少一部分之反向重複時發生的延伸引子之分子內雜交。較佳地，「A」區與「B」區之間的互補區位於或接近於「A」區之5'端。[ 圖 6] 說明章節6.2.3.4中所描述之不對稱PCR反應中的變性步驟。在變性步驟中，將PCR反應混合物（其典型地含有含有目標核酸或處於含有目標核酸之風險下的生物樣本、不對稱引子對、熱穩定DNA聚合酶、及PCR試劑）加熱至高於目標核酸之解鏈溫度，使得目標核酸（若存在）及不對稱引子對中之延伸引子變性，以形成單股。[ 圖 7] 說明章節6.2.3.4中所描述之不對稱PCR反應之指數階段的黏合步驟，其在低於未延伸引子之解鏈溫度發生。不對稱引子對中之未延伸引子及延伸引子兩者與其等各自的互補股雜交。圖7展示與目標DNA之黏合（亦稱為雜交或結合），如發生於PCR之初始循環中，但在後續循環中，黏合可能發生於引子與PCR產物中之互補序列之間。由於延伸引子中之「B」區及可選的「C」區，PCR產物將具有彼等序列或其等之互補物，如圖8B及圖9中所描繪。[ 圖 8]A-B ：圖8A及圖8B說明章節6.2.3.4中所描述之不對稱PCR反應之指數階段的延伸步驟，在此期間熱穩定DNA聚合酶使用互補DNA作為模板延伸引子DNA。延伸之區域以虛線描繪。圖8A中之模板為目標DNA之股，且圖8B中之模板為使用不對稱引子對及目標DNA產生之PCR產物之股[ 圖 9] 說明章節6.2.3.4中所描述之不對稱PCR反應之線性階段的同時黏合及延伸步驟，其在高於未延伸引子之解鏈溫度且低於延伸引子之解鏈溫度發生，使用PCR產物股2作為模板。此使得PCR產物股2不對稱擴增，導致PCR反應結束時，相對於PCR產物股1分子產生過量PCR產物股2分子。[ 圖 10]A-B 說明可如何將兩種（圖10A）或三種（圖10B）探針分子用於針對凝固酶陰性葡萄球菌（coagulase negativeStaphylococcus ；CNS）之虛擬探針中。來自PCR擴增產物與該兩種或三種探針分子之雜交的信號可使用布林運算子（Boolean operator）組合以確定CNS是否存在於樣本中。[ 圖 11]A-B 展示當與來自和緩鏈球菌（圖11A）及肺炎鏈球菌（圖11B）之16S rRNA擴增子結合時，各種寡核苷酸探針分子之信號。[ 圖 12] 展示當與來自肺炎鏈球菌、和緩鏈球菌、及口腔鏈球菌（Streptococcus oralis ）之PCR擴增子結合時，各種寡核苷酸探針分子之信號強度。[ 圖 13] 展示當與來自腸沙門氏菌（Salmonella enterica ）及大腸桿菌（Escherichia coli ）之PCR擴增子結合時，各種寡核苷酸探針分子之信號強度。[ 圖 14] 展示當與來自克雷伯氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae ）及產酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca ）之PCR擴增子結合時，各種寡核苷酸探針分子之信號強度。[ 圖 15] 展示當與來自陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae ）、阿氏腸桿菌（Enterobacter asburiae ）、及霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei ）之PCR擴增子結合時，各種寡核苷酸探針分子之信號強度。

Claims

一種確定具有第一基因體之第一生物體或具有第二基因體之第二生物體是否存在於測試樣本或所述測試樣本自其製備之初始樣本中之方法，所述方法包含：（a）用虛擬探針探測所述測試樣本，所述虛擬探針包含二或多種探針分子，其中各探針分子能夠與對應於所述第一基因體之一或多種目標核酸及/或對應於所述第二基因體之一或多種同源目標核酸特異性雜交，且其中所述探針分子與所述對應於第一及第二基因體之目標核酸不一致地雜交，使得所述探針分子與所述對應於第一基因體之一或多種目標核酸及所述對應於第二基因體之一或多種目標核酸之雜交能夠區分所述對應於第一基因體之目標核酸與所述對應於第二基因體之目標核酸；以及（b）偵測及/或定量來自所述虛擬探針中之探針分子與所述測試樣本中若存在之核酸之雜交的信號，由此確定所述第一生物體或第二生物體是否存在於所述測試樣本或初始樣本中。
如請求項1之方法，其中所述對應於第一基因體之一或多種目標核酸為第一擴增子組且所述對應於第二基因體之一或多種目標核酸為第二擴增子組，並且其中所述虛擬探針中之各探針分子能夠與所述第一擴增子組及/或所述第二擴增子組中之一或多種擴增子特異性雜交，且其中所述探針分子與所述第一擴增子組中之擴增子及所述第二擴增子組中之擴增子不一致地雜交，使得所述探針分子與所述第一擴增子組及第二擴增子組中之擴增子之雜交能夠區分所述第一擴增子組與所述第二擴增子組。
如請求項2之方法，其進一步包含藉由使用如下PCR引子對所述初始樣本進行PCR擴增反應來製備所述測試樣本：能夠與所述第一基因體及所述第二基因體兩者雜交且自其等引發PCR擴增以在所述第一基因體及第二基因體存在於所述初始樣本中時分別產生所述第一擴增子組及第二擴增子組。
如請求項3之方法，其中所述PCR引子包含超過一種引子對，且其中所述第一擴增子組包含複數種第一擴增子及/或所述第二擴增子組包含複數種第二擴增子。
如請求項4之方法，其中所述複數種第一擴增子對應於所述第一基因體中之不同區域及/或所述複數種第二擴增子對應於所述第二基因體中之不同區域。
如請求項3之方法，其中所述PCR引子包含單一引子對，且所述第一擴增子組由單一第一擴增子組成且所述第二擴增子組由單一第二擴增子組成。
如請求項1至6中任一項之方法，其中所述虛擬探針之探針分子為存在於陣列上之位置可定址之探針分子，所述探針分子各自位於所述陣列上之分開的位置處。
如請求項2至7中任一項之方法，其中所述第一擴增子組及所述第二擴增子組各自包含對應於編碼rRNA之基因的核苷酸序列。
如請求項2至7中任一項之方法，其中所述第一擴增子組及所述第二擴增子組各自包含對應於rRNA基因之間的基因間間隔區的核苷酸序列。
如請求項1至9中任一項之方法，其中所述第一生物體及所述第二生物體為微生物。
如請求項10之方法，其中所述微生物為相同目、科、屬、或群之成員。
如請求項10或請求項11之方法，其中所述微生物為細菌。
如請求項2之方法，其中所述第一生物體及第二生物體為細菌，且其中所述第一擴增子組及所述第二擴增子組各自包含對應於16S rRNA基因之核苷酸序列及/或對應於23S rRNA基因之核苷酸序列。
如請求項13之方法，其中所述第一擴增子組及所述第二擴增子組各自包含對應於16S rRNA基因之核苷酸序列。
如請求項13或請求項14之方法，其中所述第一擴增子組及所述第二擴增子組各自包含對應於23S rRNA基因之核苷酸序列。
如請求項13至15中任一項之方法，其中所述第一擴增子組及所述第二擴增子組各自包含對應於16S-23S基因間間隔區之核苷酸序列。
如請求項12至16中任一項之方法，其中：（a）所述第一微生物為凝固酶陰性葡萄球菌屬物種（coagulase negativeStaphylococcus sp. ）且所述第二微生物為凝固酶陽性葡萄球菌屬物種（coagulase positiveStaphylococcus sp ）；（b）所述第一微生物為格氏鏈球菌（Streptococcus gordonii ）且所述第二微生物為咽峽炎鏈球菌（Streptococcus anginosus ）；或（c）所述第一微生物為和緩鏈球菌（Streptococcus mitis ）且所述第二微生物為肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae ）。
一種可定址陣列，其包含：（a）一或多個用於區分第一基因體序列與第二同源基因體序列之虛擬探針，各虛擬探針包含一群位置可定址之寡核苷酸探針分子，所述寡核苷酸探針分子各自位於所述陣列上之分開的位置處，其中所述一或多個虛擬探針中之各探針分子包含與所述第一基因體序列或第二基因體序列中之15至40個連續核苷酸90%至100%互補的核苷酸序列；以及（b）可選地，一或多種對照探針分子。
如請求項18之可定址陣列，其中至少一個虛擬探針包含其核苷酸序列包含以下者的探針分子：CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）、GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG（SEQ ID NO: 2）、CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT（SEQ ID NO: 3）、TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA（SEQ ID NO: 4）、AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）、GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA（SEQ ID NO: 6）或GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA（SEQ ID NO: 7）。
一種確定具有第一基因體之第一生物體或具有第二基因體之第二生物體是否存在於測試樣本或所述測試樣本自其衍生之初始樣本中之方法，所述方法包含：（a）用如請求項18或請求項19之陣列探測所述測試樣本，所述陣列包含虛擬探針，所述虛擬探針包含二或多種探針分子，其中各探針分子能夠與對應於所述第一基因體之一或多種目標核酸及/或對應於所述第二基因體之一或多種同源目標核酸特異性雜交，且其中所述探針分子與所述對應於第一及第二基因體之目標核酸不一致地雜交，使得所述探針分子與所述對應於第一基因體之一或多種目標核酸及所述對應於第二基因體之一或多種目標核酸之雜交能夠區分所述對應於第一基因體之目標核酸與所述對應於第二基因體之目標核酸；及（b）自所述陣列洗滌未結合之核酸分子；（c）偵測及/或定量位於所述陣列上之各探針分子位置處之信號；以及（d）若所述信號指示：（i）與所述陣列之探針分子雜交之目標核酸存在於所述測試樣本中，則分析所述信號以確定對應於所述第一基因體之目標核酸或對應於所述第二基因體之目標核酸是否存在於所述樣本中，由此確定所述第一生物體或第二生物體是否存在於所述初始樣本或所述測試樣本中；或（ii）在步驟（a）中並未產生與所述虛擬探針之探針分子雜交之目標產物，則確定所述初始樣本或測試樣本不含有所述第一生物體或所述第二生物體，由此確定所述第一生物體或第二生物體是否存在於所述初始樣本或所述測試樣本中。
一種用於確定生物體是否存在於樣本中的系統，所述系統包含：（a）光學讀取器，其用於產生如請求項18或請求項19之陣列之各探針分子位置之信號數據；以及（b）至少一個處理器，其：（i）經設置以自所述光學讀取器接收信號數據；（ii）經設置以分析所述一或多個虛擬探針之信號數據；及（iii）具有用於輸出分析結果之至儲存或顯示裝置或網路之介面。
一種寡核苷酸探針分子，其核苷酸序列包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）、GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG（SEQ ID NO: 2）、CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT（SEQ ID NO: 3）、TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA（SEQ ID NO: 4）、AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）、GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA（SEQ ID NO: 6）或GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA（SEQ ID NO: 7）。
一種包含複數種寡核苷酸探針分子之虛擬探針，其中：（a）所述虛擬探針中之至少一種寡核苷酸探針分子具有包含CCAGTCTTATAGGTAGGTTAYCCACG（SEQ ID NO: 1）之核苷酸序列，且所述虛擬探針中之另一寡核苷酸分子具有包含GCTTCTCGTCCGTTCGCTCG（SEQ ID NO: 2）之核苷酸序列；（b）所述虛擬探針中之至少一種寡核苷酸探針分子具有包含CAGTCTATGGTGTAGCAAGCTACGGTAT（SEQ ID NO: 3）之核苷酸序列，且所述虛擬探針中之另一寡核苷酸分子具有包含TATCCCCCTCTAATAGGCAGGTTA（SEQ ID NO: 4）之核苷酸序列；或（c）所述虛擬探針中之至少一種寡核苷酸探針分子具有包含AGCTAATACAACGCAGGTCCATCT（SEQ ID NO: 5）之核苷酸序列、所述虛擬探針中之另一寡核苷酸分子具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGCAA（SEQ ID NO: 6）之核苷酸序列且所述虛擬探針中之另一寡核苷酸分子具有包含GATGCAAGTGCACCTTTTAAGTAA（SEQ ID NO: 7）之核苷酸序列。
一種包含一群位置可定址之探針分子之可定址陣列，所述探針分子各自位於所述陣列上之分開的位置處，其中所述群之探針分子包含如請求項22之寡核苷酸探針分子。
一種包含如請求項23之虛擬探針之可定址陣列，其中所述虛擬探針中之各探針分子位於所述陣列上之分開的位置處。