CN113388672A - 检测pkd1变异单精子的引物组合物、产品及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测PKD1变异单精子的引物组合物、产品及方法，所述引物组合物包括可特异扩增PKD1基因及其上下游2Mb范围内SNP所在区域引物，本发明可以对变异精子进行遗传标记，从而区分男方高致病性风险单倍型。

Description

检测PKD1变异单精子的引物组合物、产品及方法
【技术领域】
本发明涉及胚胎移植检测技术领域，尤其涉及一种检测PKD1变异单精子的引物组合物、产品及方法。
【背景技术】
单基因或孟德尔疾病主要归因于单一的遗传变异。已知的单基因疾病大约有10000种，虽然个别单基因疾病是罕见的，但所有单基因疾病在出生时的全球总患病率约为1％，它们几乎占儿童死亡率的20％。因此生育单基因病儿童风险增加的夫妇可通过生殖选择来减轻这种风险。产前诊断可以确定正在发展中的妊娠的遗传状况，然而，得知怀孕受到影响的患者往往面临终止妊娠的艰难决定。因此，这些患者可以选择植入前基因检测(PGT)。单基因病的PGT(PGT-M) 包括对体外受精(IVF)产生的胚胎进行活检，通常适用于已知致病变异的单基因疾病。
PGT-M最大的挑战之一是模板DNA含量低，需要敏感的DNA扩增技术。活检单个(极体(PB)或卵裂球)或少数细胞(5-10个滋养层(TE)细胞)，通过多重PCR或全基因组扩增(WGA)反应，待下游应用。目前，人们开发了多种全基因组扩增方法，都无法避免等位基因丢失(ADO)现象的发生。等位基因丢失(ADO)是单细胞聚合酶链反应(PCR)因扩增偏差而产生的固有缺陷，对诊断的准确性有很大的威胁。为了避免ADO的误诊，基于单倍型的连锁分析方法广泛应用于PGT-M。
单倍型，即位于同一染色体上的等位基因序列，是遗传变异的基本单位。单倍型的推断在许多分析中起着重要的作用。夫妇的单倍型是通过夫妇-孩子三人组，或男方父母-男方、女方父母-女方构建的。对于一个核心家系来说，每个单倍型都有其区分其它单倍型的遗传标记。在行PGT-M前的临床检查过程中，通过目标基因附近的遗传标记，可以对来自夫妇和相关家庭成员的DNA 样本进行分型。在有家族致病性变异的家族成员中常见的单倍型被称为高致病性风险单倍型(或突变型)，而没有家族致病性变体的单倍型称为野生型或低风险单倍型。
高致病性风险单倍型的区分依赖于核心家系成员样本的获得。但是，在实际应用中，本发明很难搜集到完整的家系成员样本；男方携带的高致病性风险单倍型源自男方染色体的新发变异，而非遗传自男方父母的情况增加了检测的困难；与此同时，行PGT-M的夫妇年龄趋大，女子卵子不足的情况也是需要考虑的问题。
因此，有必要研究一种检测PKD1变异单精子的引物组合物、产品及方法来应对现有技术的不足，以解决或减轻上述一个或多个问题。
【发明内容】
有鉴于此，本发明提供了一种检测PKD1变异单精子的引物组合物、产品及方法，可以对变异精子进行遗传标记，从而区分男方高致病性风险单倍型。
一方面，本发明提供一种检测PKD1变异单精子的引物组合物，所述引物组合物包括可特异扩增PKD1基因及其上下游2Mb范围内SNP所在区域引物。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述 PKD1基因为人类可特异扩增PKD1基因。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述可特异扩增PKD1基因的上下游序列为1-216的全部引物对。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述可特异扩增PKD1基因上下游2Mb范围内SNP所在区域引物的上下游序列为1-216 的全部引物对。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述引物组合物包括SEQID NO：1-216的全部引物对。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述全部引物对在目标染色体上序列唯一；位置特异的寡核苷酸具有相同的退火温度。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种胚胎植入前的检测产品，所述检测产品由上述的引物组合物制备而成。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述检测产品为检测试剂盒。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述检测试剂盒包括：
用于文库构建的反应试剂，包括：特异性结合引物、通用PCR引物、多重PCR 聚合酶、DNA连接酶、末端修复酶、dNTPs和反应缓冲液；
用于纯化PCR的反应产物的试剂，包括产物纯化磁珠及缓冲液；
阴性质控品和阳性质控品。
如上所述的方面和任一可能的实现方式，进一步提供一种胚胎植入前的检测方法，通过所述的检测产品实现，所述检测方法包括以下步骤：
S1：查找PKD1基因及其上下游2M内的SNP位点，针对PKD1基因全部CDS 区域及上下游2M内的SNP位点进行引物设计，引物组合物包括SEQID NO：1～216 的全部引物对；
S2：提取男方、女方基因组DNA，获得单精子并进行全基因组扩增；
S3：采用高通量测序技术，对男方、女方及男方单精子的PKD1基因CDS区域及上下游2M内的SNP位点进行测序；
S4：在单精子中同男方相同的变异位点进行高通量测序及一代测序；
S5：单倍型的构建：分别用AA、BB、AB代表野生型纯合、变异型纯和和杂合三种类型，选取女方或男方基因型为AA或BB且男方或女方基因型为AB的位点进行分析，得出男方染色体在该区域的另一种单倍型。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)对无法构成夫妇-孩子三人组，或男方父母-男方三人组的家系进行男方高致病性风险染色体的区分；
2)男方的变异有时来自精子的形成或胚胎的发育过程，这就导致即使可以获得男方父母-男方三人的样本，由于无法在双亲血液中检测该变异而无法区分男方高致病性风险染色体，此时，利用单精子的单倍型分析，可有效的找到变异染色体；
3)精子样本比卵子样本更易获得，在行PGT-M技术时，可以避免因胚胎不足而无法检测的情况发生；
4)单精子单倍型的特性结合高通量测序技术，可对大片段缺失变异的染色体进行确定。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
【具体实施方式】
为了更好的理解本发明的技术方案，下面对本发明实施例进行详细描述。
应当明确，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本发明提供一种检测PKD1变异单精子的引物组合物，所述引物组合物包括可特异扩增PKD1基因及其上下游2Mb范围内SNP所在区域引物。所述PKD1基因为人类可特异扩增PKD1基因。所述可特异扩增PKD1基因的上下游序列为1-216 的全部引物对。所述可特异扩增PKD1基因上下游2Mb范围内SNP所在区域引物的上下游序列为1-216的全部引物对。所述引物组合物包括SEQID NO：1-216的全部引物对。所述全部引物对在目标染色体上序列唯一；位置特异的寡核苷酸具有相同的退火温度。
本发明还提供一种胚胎植入前的检测产品，所述检测产品由上述的引物组合物制备而成。所述检测产品为检测试剂盒。所述检测试剂盒包括：
用于文库构建的反应试剂，包括：特异性结合引物、通用PCR引物、多重PCR 聚合酶、DNA连接酶、末端修复酶、dNTPs和反应缓冲液；
用于纯化PCR的反应产物的试剂，包括产物纯化磁珠及缓冲液；
阴性质控品和阳性质控品。
本发明还提供一种胚胎植入前的检测方法，通过所述的检测产品实现，所述检测方法包括以下步骤：
S1：查找PKD1基因及其上下游2M内的SNP位点，针对PKD1基因全部CDS 区域及上下游2M内的SNP位点进行引物设计，引物组合物包括SEQID NO：1～216 的全部引物对；
S2：提取男方、女方基因组DNA，获得单精子并进行全基因组扩增；
S3：采用高通量测序技术，对男方、女方及男方单精子的PKD1基因CDS区域及上下游2M内的SNP位点进行测序；
S4：在单精子中同男方相同的变异位点进行高通量测序及一代测序；
S5：单倍型的构建：分别用AA、BB、AB代表野生型纯合、变异型纯和和杂合三种类型，选取女方或男方基因型为AA或BB且男方或女方基因型为AB的位点进行分析，得出男方染色体在该区域的另一种单倍型。
实施例1：
1、引物组合物
该引物共216对(如表一所示)，可特异扩增PKD1基因及其上下游2Mb 范围内紧密连锁的单核苷酸多态性(SNP)位点所在区域。该引物的特点为：在目标染色体上序列唯一；位置特异的寡核苷酸具有相同的退火温度。
表一：PKD1变异单精子的检测引物
Figure BDA0003042634670000061
Figure BDA0003042634670000071
Figure BDA0003042634670000081
Figure BDA0003042634670000091
Figure BDA0003042634670000101
Figure BDA0003042634670000111
Figure BDA0003042634670000121
Figure BDA0003042634670000131
Figure BDA0003042634670000141
Figure BDA0003042634670000151
Figure BDA0003042634670000161
Figure BDA0003042634670000171
Figure BDA0003042634670000181
Figure BDA0003042634670000191
Figure BDA0003042634670000201
2、检测产品
在一个特定的实施方案中，检测试剂盒包括：(1)用于文库构建的反应试剂，包括：特异性结合引物，通用引物，多重PCR聚合酶，DNA连接酶，末端修复酶， dNTPs，反应缓冲液；(2)用于纯化PCR反应产物的试剂。所述特异性结合引物即为本发明的上述引物组合物。优选地，用于PCR产物纯化的试剂包括产物纯化磁珠及缓冲液。上述试剂盒还可以包括阴性质控品和阳性质控品。
3、检测方法
(1)样本基因组DNA的获得：样本来自单精子和全血。单精子基因组DNA的获取是用全基因组扩增的方法，扩增产物用磁珠进行纯化。(2)多重PCR扩增、富集目标区域DNA：根据检测区域的不同，选择不同的引物对目标区域进行PCR 扩增，将DNA分子富集为大小集中的片段，片段大小在125-300bp之间。(3)纯化PCR产物，建库：按照试剂盒中标准建库流程进行建库。在这个过程中，对目标DNA分子两端加上测序接头，接头中含有标签序列。当待测的DNA分子来自多个受试样品时，每个样品被加上不同的标签序列，用于测序过程中样品的区分，从而实现多样本的同时测序。(4)测序：采用的方法为高通量测序。测序深度为 300×～1000×，如：测序深度为1000×，即每条特异PCR扩增产物被测序1000 次。(5)比对与统计：可通过任意一种序列比对程序将读段与参考基因组序列进行比对，得到读段在参考基因组上的位置，以备后续的SNP覆盖倍数和基因型的分析。(6)数据分析
4、分析方法
(1)单倍型的确定
获得男方、女方及男方精子三个样本在变异区域以及变异区域上游和下游4M 内的高通量测序结果，通常以野生型纯合、变异型纯和和杂合三种类型展示，分别用AA、BB、AB代表三种基因型进行如下说明。本发明选取女方基因型为AA或 BB且男方基因型为AB的位点进行分析。这些位点对应的精子基因型为A或B，1 个单精子在这些位点基因型的合集按照染色体绝对位置从小到大的顺序，构成了该区域男方的单倍型，由于人类是2倍体生物，在已知男方基因型的情况下，根据单精子单倍型，本发明可得出男方染色体在该区域的另一种单倍型。如果男方染色体在第一次减数分裂四分体联会时发生了重组，且断点恰好落在检测区域，那么男方染色体该区域的单倍型为4种，为了排除重组带来的结果判断错误的风险，检测的单精子数目至少为3个。
(2)高致病性风险单倍型的区分
单倍型确定后，为了区分高致病性风险单倍型，本发明根据变异类型的不同，选择不同的检测方法对单精子的变异位点进行检测。如果变异类型是点突变或小片段的插入或缺失，可选择高通量或sanger测序的方法；如果变异类型为大片段的缺失，只能选择高通量测序的方法。检出含有变异的单精子，结合单倍型的结果，就可以确定高致病性风险单倍型。
该分析方法的成功取决于单精子单细胞扩增的质量和送检单精子的数目。在单精子扩增成功率50％，脱扣率30％的情况下，送检10个单精子的成功率约为85％。
现有家系成员为男方和女方的家系，由于男方的变异为新发变异且无子代，符合本发明方法的使用条件。男方的变异基因为PKD1，变异位点信息是： NM_001009944.2，EX41:c.11423G>A,p.Trp3808*Het，女方无该基因的变异。
(1)查找PKD1基因(GRCH37/hg19,chr16:2138709-2185899)及上下游 2M内的SNP位点，针对PKD1基因全部CDS区域及上下游2M内的SNP位点进行引物设计，SNP数量及位点分布见表2；
(2)提取男方、女方基因组DNA，获得单精子并进行全基因组扩增；
(3)采用高通量测序技术，对男方、女方及男方单精子的PKD1基因CDS 区域及上下游2M内的SNP位点进行测序，获得该家系可用的SNP位点数目及分布见表3；
(4)高通量测序及一代测序在单精子中均检测到同男方相同的变异位点。检测信息见表4。
(5)单倍型的构建：分别用AA、BB、AB代表野生型纯合、变异型纯和和杂合三种类型。选取女方(男方)基因型为AA或BB且男方(女方)基因型为 AB的位点进行分析。这些位点对应的精子基因型为A或B，1个单精子在这些位点基因型的合集按照染色体绝对位置从小到大的顺序，构成了该区域男方的单倍型，由于人类是2倍体生物，在已知男方基因型的情况下，根据单精子单倍型，本发明可得出男方染色体在该区域的另一种单倍型。
表2：SNP位点分布
Figure BDA0003042634670000231
表3：目标基因SNP位点统计
Figure BDA0003042634670000232
表4：高通量测序结果
Figure BDA0003042634670000233
Figure BDA0003042634670000241
表5、男方、女方、单精子单体型结果
其中，左边男方左边表示致病，右边表示正常，单精子均为致病，NO：1-2， 4-5，7，14，18-21，29，43-53，57-58，65-66，71，73-75，77，80-81，88-89， 91-93均为女方有效位点，NO：3，6，8-12，15-16，22-28，30-40，42，54-56， 29，61-64，67-70，72，78-79，87，90，94均为男方有效点。
Figure BDA0003042634670000242
Figure BDA0003042634670000251
Figure BDA0003042634670000261
Figure BDA0003042634670000271
Figure BDA0003042634670000281
以上对本申请实施例所提供的一种检测PKD1变异单精子的引物组合物、产品及方法，进行了详细介绍。以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
如在说明书及权利要求书当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求书并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求书当中所提及的“包含”、“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含/包括但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求书所界定者为准。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
应当理解，本文中使用的术语“和/或”仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求书的保护范围内。

Claims (10)

1.一种检测PKD1变异单精子的引物组合物、产品及方法引物组合物，其特征在于,所述引物组合物包括可特异扩增PKD1基因及其上下游2Mb范围内紧密连锁的单核苷酸多态性SNP位点所在区域。
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述PKD1基因为人类可特异扩增PKD1基因。
3.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述可特异扩增PKD1基因的上下游序列为1-216的全部引物对。
4.根据权利要求3所述的引物组合物，其特征在于，所述可特异扩增PKD1基因上下游2Mb范围内SNP所在区域引物的上下游序列为1-216的全部引物对。
5.根据权利要求4所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括SEQ ID NO：1-216的全部引物对。
6.根据权利要求5所述的引物组合物，其特征在于，所述全部引物对在目标染色体上序列唯一,位置特异的寡核苷酸具有相同的退火温度。
7.一种胚胎植入前的检测产品，其特征在于，所述检测产品由上述权利要求1-6之一所述的引物组合物制备而成。
8.根据权利要求7所述的检测产品，其特征在于，所述检测产品为检测试剂盒。
9.根据权利要求8所述的检测产品，其特征在于，所述检测试剂盒包括：
用于文库构建的反应试剂，包括：特异性结合引物、通用PCR引物、多重PCR聚合酶、DNA连接酶、末端修复酶、dNTPs和反应缓冲液；
用于纯化PCR的反应产物的试剂，包括产物纯化磁珠及缓冲液；
阴性质控品和阳性质控品。
10.一种胚胎植入前的检测方法，通过上述权利要求7-9之一所述的检测产品实现，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
S1：查找PKD1基因及其上下游2M内的SNP位点，针对PKD1基因全部CDS区域及上下游2M内的SNP位点进行引物设计，引物组合物包括SEQ ID NO：1～216的全部引物对；
S2：提取男方、女方基因组DNA，获得单精子并进行全基因组扩增；
S3：采用高通量测序技术，对男方、女方及男方单精子的PKD1基因CDS区域及上下游2M内的SNP位点进行测序；
S4：在单精子中同男方相同的变异位点进行高通量测序及一代测序；
S5：单倍型的构建：分别用AA、BB、AB代表野生型纯合、变异型纯和和杂合三种类型，选取女方或男方基因型为AA或BB且男方或女方基因型为AB的位点进行分析，得出男方染色体在该区域的另一种单倍型。
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