CN110863041A - 一种与地中海贫血相关的突变基因及其检测试剂和应用 - Google Patents

一种与地中海贫血相关的突变基因及其检测试剂和应用 Download PDF

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CN110863041A CN201810981119.XA CN201810981119A CN110863041A CN 110863041 A CN110863041 A CN 110863041A CN 201810981119 A CN201810981119 A CN 201810981119A CN 110863041 A CN110863041 A CN 110863041A
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张通达
丁利杰
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Abstract

本申请公开了一种与地中海贫血相关的突变基因及其检测试剂和应用。本申请与地中海贫血相关的突变基因,相对于野生型基因发生了chr11:5245532‑5249021缺失突变。本申请与地中海贫血相关的突变基因,是一种罕见的新型β地贫基因突变型别。本申请的突变基因不仅填充了地中海贫血突变基因数据库,对地中海贫血的研究具有重要意义;而且地贫型别的补充完善,是减少误诊或漏诊,从而达到精准防控地贫的关键所在。

Description

一种与地中海贫血相关的突变基因及其检测试剂和应用
技术领域
本申请涉及地中海贫血基因检测领域,特别是涉及一种与地中海贫血相关的突变基因及其检测试剂和应用。
背景技术
地中海贫血(Thalassemia)简称“地贫”,是由于珠蛋白基因发生缺陷,致使珠蛋白链合成减少或缺如,从而导致的一组遗传性溶血性疾病。地贫是世界上发病率最高、危害性最大的单基因遗传病之一,广泛分布于地中海国家及其他曾经高发疟疾的地区。据估计全球约有3.5亿人携带地贫基因,每年约有30 万-50万地贫儿出生。在我国,地贫主要分布在长江以南的广东、广西、海南、云南、贵州、四川、福建、江西、湖南等地区,其中两广、云贵以及海南是高发区。据2016年《中国地中海贫血蓝皮书》数据显示,我国南方地区地贫基因缺陷携带率为2.5%-20%,地贫基因携带者达3000万人,其中重型和中间型地贫患者约30万人。重型地贫患儿在出生后三到六个月内发病,需终生输血和除铁治疗。患儿平均每20天输血一次,并长期服用去铁剂,每年治疗费在10万元左右。造血干细胞移植是目前治疗重型地中海贫血患儿的唯一手段,平均移植费用需要40万元/例,给家庭和社会带来了沉重的经济负担。
地中海贫血以β-地贫和α-地贫较为常见,其中β地贫在中国南方地区的发生率为1.0%,在香港地区的发病率为3.0%,在中国台湾地区的发病率为2.0%。到目前为止,全世界有大于200种β-地中海贫血的致病突变被报道,大多数是由于 HBB基因重要功能区域的点突变造成的,小部分为基因的缺失,其临床症状从无明显症状到严重贫血均有发生。近年来,随着大范围人群地贫防控和筛查的进行,现有的地贫基因检测技术由于其检测种类的局限,很多地贫基因突变患者的型别不在检测范围内,导致不能准确检出甚至不能检出,从而出现较高的漏诊和误诊率。因此,地贫新型别的鉴定和补充是建立健全地贫基因检测技术和检测范围的关键所在,也是减少地贫漏诊和误诊率,做到地贫精准防控的重要基础。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的与地中海贫血相关的突变基因及其检测试剂和应用。
本申请采用了以下技术方案:
本申请的一方面公开了一种与地中海贫血相关的突变基因,该突变基因为野生型基因发生chr11:5245532-5249021缺失突变而成,即正常人类基因第11 号染色体发生了chr11:5245532-5249021缺失突变。
需要说明的是,本申请的突变基因是新发现的与地中海贫血密切相关的基因,该突变基因的发现,一方面,进一步补充了地中海贫血突变基因数据库,对地中海贫血的研究具有重要意义;另一方面,通过本申请的突变基因可以进一步研发相关的检测技术,为完善地中海贫血检测技术,降低地中海贫血漏诊和误诊率奠定了基础。
本申请的再一方面公开了本申请的突变基因在制备用于地中海贫血检测的试剂或装置中的应用。
可以理解,本申请的突变基因是一种新的地中海贫血基因突变,在本申请突变基因的基础上,能够设计出检测该突变基因的引物、探针等,用于地中海贫血的检测或筛查,因此,本申请的突变基因能够用于制备地中海贫血检测的试剂或装置。
本申请的再一方面公开了一种用于地中海贫血检测的试剂,该试剂包括能够通过PCR扩增检测本申请的基因突变的引物对。
优选的,本申请的试剂中引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列,下游引物为Seq ID No.2所示序列,
Seq ID No.1:5’-ACATCCTCCAGGTTCATCAATT-3’
Seq ID No.2:5’-GCAGATTAGTCCAGGCAGAA-3’。
优选的,本申请的试剂中还包括PCR扩增的反应混合液。
需要说明的是,在本申请突变基因的基础上,本领域技术人员可以根据引物设计原则设计出相应的PCR扩增引物,Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列仅仅是本申请一种实现方式中采用的,能够用于本申请突变基因检测的引物。另外,为了使用方便,在本申请用于地中海贫血检测的试剂中还可以包括PCR 扩增的反应混合液,该反应混合液可以是常规的PCR反应缓冲液或mix,在此不做具体限定。
本申请的再一方面公开了一种用于地中海贫血检测的试剂,该试剂包括能够通过核酸杂交检测本申请的基因突变的DNA探针。
需要说明的是,在本申请突变基因的基础上,本领域技术人员可以根据杂交探针设计原则设计出特异性检测本申请突变基因的DNA探针,具体的探针序列可以根据使用需求而定,在此不做具体限定。
本申请的再一方面公开了一种用于地中海贫血检测的试剂,该试剂包括用于检测本申请的基因突变的基因芯片。
优选的,基因芯片上固定有能够通过核酸杂交检测本申请的基因突变的 DNA探针。
需要说明的是,本申请的突变基因涉及3490bp的碱基缺失,针对这一大段 DNA片段的缺失,本领域技术人员完全可以设计出若干条特异性的杂交探针,并设计相应的基因芯片进行检测,具体的杂交探针序列根据使用需求而定,在此不做具体限定。
本申请的再一方面公开了一种用于地中海贫血检测的试剂盒,该试剂盒中含有本申请用于地中海贫血检测的试剂。
需要说明的是,为了使用方面可以将本申请的各试剂制成试剂盒,用于地中海贫血的检测或筛查,可以理解,试剂盒中还可以包含各试剂相对应的反应缓冲液等,在此不做具体限定。
本申请的有益效果在于:
本申请与地中海贫血相关的突变基因,是一种罕见的新型的β地贫基因突变型别。本申请的突变基因不仅填充了地中海贫血突变基因数据库,对地中海贫血的研究具有重要意义;而且地贫型别的补充完善,是减少误诊或漏诊,从而达到精准防控地贫的关键所在。
附图说明
图1是本申请实施例中地贫分析样本1的缺失区域结果;
图2是本申请实施例中样本1的Sanger测序图;
图3是本申请实施例中样本2的Sanger测序图;
图4是本申请实施例中样本1的sanger测序的blast比对结果。
具体实施方式
本申请通过对一个地贫家系进行地贫基因测序检测,通过生物信息学分析发现一种新的潜在地贫缺失型别,再通过qPCR和sanger测序进行验证缺失区域,结合患者临床表型确认这种新的地贫缺失型,即本申请的突变基因。目前已报道过的中国人大片段缺失型β-地贫主要有五种,包括Cantonese(广州型)、 Yunnanese(云南型)、Chinese(中国型)、S.E.Asian(东南亚型)和Taiwanese (中国台湾型)。本申请的突变基因不属于这五种缺失型中的任何一种,是一种新的β地贫缺失型,该型别的发现补充完善了国内地贫型别种类,为地贫基因检测新技术的开发和完善奠定重要基础,同时对地贫患者临床诊断提供更多的支持和参考,对中国南方地区地贫精准防控具有重要意义。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明,不应理解为对本申请的限制。
实施例
一、样本采集
本例收集到1个地中海贫血家系样本3例,包括父亲、母亲及其女儿。三者均有临床和生化指标的异常,即地贫血液学筛查指标MCV、MCH、HBA、 HBA2和HBF均有一个或多个指标异常。基于已有的市购地贫基因检测试剂盒,该父亲地贫基因检出型别为Codons 14/15(+G)杂合,其女儿地贫基因检出型别为Codons 14/15(+G)纯合,是地贫重症患者,需要定期输血治疗;而该母亲在常规地贫基因检测试剂盒和华大康孕301型地贫基因检测技术下均未检出地贫型别。由于其女儿是重症地贫患者,其母亲在现有地贫基因检测产品下未检出地贫,不符合孟德尔遗传规律,加上该母亲的血液学指标有明显异常,提示该母亲样本可能是一种新的地贫基因突变型别可能性较大。并且,女儿检出的基因型别为纯合,根据孟德尔遗传定律,女儿纯合基因型的两个等位基因应该是一个来自父亲、一个来自母亲,也就是说,父亲和母亲的基因型别都应该是杂合,或者母亲也应该是相应的地贫型别或携带者;但是,母亲却没有检出地贫型别,这明显不符合孟德尔遗传规律,极大可能是由于技术局限,母亲方携带的地贫型别未能检出。所以,本例将这个家系的母亲(下称样本1)和女儿(下称样本2),这2个样本作为研究样本,每个样本采集外周血样品3mL,加入EDTA 抗凝,-80摄氏度保存备用。
二、实验方法
1.样品制备
分别取样本1和样本2的外周血200μL,利用OMEGA Blood DNA Midi Kit 全血DNA提取试剂盒抽提基因组DNA,具体如下:
(1)取200μL全血样本,加入150μL OB Protease,2.1mL Buffer BL和20μL RNaseA,最大速度漩涡1分钟,彻底混匀。
(2)65摄氏度水浴15-20分钟,并在水浴过程中漩涡5次。
(3)加入2.2mL无水乙醇,最大速度漩涡30秒,彻底混匀。
(4)将3.5mL裂解液移入带过滤柱的15mL离心管,4000转离心5分钟,取出过滤柱,倒掉过滤液体,放回过滤柱。
(5)将第3步剩余裂解液加入带过滤柱的15mL离心管,4000转离心5分钟,取出过滤柱,倒掉过滤液体,放回过滤柱。
(6)加入3mL HB Buffer,洗涤过滤柱,4000转离心5分钟,取出过滤柱,倒掉过滤液体,放回过滤柱。
(7)加入3mL DNA Wash Buffer,4000转离心5分钟,取出过滤柱,倒掉过滤液体,放回过滤柱。
(8)再次加入3mL DNA Wash Buffer,4000转离心5分钟,取出过滤柱,倒掉过滤液体,放回过滤柱。4000转离心15分钟,甩干过滤柱。
(9)将过滤柱移至新的15mL离心管,加入500μL 70摄氏度的Elution Buffer,室温静置5分钟,4000转离心5分钟,收集含有DNA的过滤液。
(11)再次将过滤柱移至新15mL离心管,加入500μL 70摄氏度的Elution Buffer,室温静置5分钟,4000转离心5分钟,收集含有DNA的过滤液。
提取所得样本基因组DNA,利用Qubit Fluorometer3.0、NanoDrop及凝胶电泳法测量DNA的浓度、纯度和完整性。结果显示,所得的两个样本DNA的 OD260/OD280位于1.8-2.0之间,电泳条带清晰,完整性较好,总量不低于1μg,样品存-20℃备用。
2.地贫基因和相关基因测序
对收集的家系中样本1的基因组DNA,采用BGISeq500高通量测序技术平台对地贫基因和地贫相关基因进行测序和数据分析,本例主要测序检测并分析了地贫α珠蛋白和β珠蛋白基因簇的蛋白编码基因HBA1、HBA2、HBB、HBG1、 HBG2、HBE1、HBZ及其基因间区和上下游序列,以及KLF1、BCL11A、HBS1L、 MYB等地贫相关的关键调控基因。具体步骤如下:
(1)文库构建
取制备好的基因组DNA 100ng,进行打断、末端修复、加A尾、连接接头后再经过PCR扩增纯化,形成初步二代测序文库,用于高通量测序。其中,高通量测序参照BGISeq500标准的Make DNB和测序的protocol进行,测序平台为BGISeq500,测序策略为PE50,样本的平均测序深度为200×。具体如下:
1)打断、末端修复,加A尾:
利用NEB Fragmentase将样本基因组DNA随机打断成150-200bp左右的片段,末端修复、加A尾,反应体系30μL,包括:基因组DNA 100ng、3μL 10×NEB fragmentase bufferv2、NEB fragmentase 2μL、200mM的MgCl2 1.5μL、25mM的 dNTP 0.12μL、100mM的dATP 0.15μL、10U/μL的DNA Polymerase I 0.5μL、 10U/μL的rTaq 1.5μL,补充H2O至30μL。
将反应样品置入PCR仪中反应,反应条件为4℃5min、37℃20min、65℃ 15min、4℃hold。
2)接头连接
a.“打断、末端修复,加A尾”反应结束后,在30μL反应产物中加入5μL 5μM的Ad153_2B adapter,再加水25μL,混匀。
b.配制20μL反应体系包括:H2O 1.2μL、100mM的ATP 0.8μL、10×PNK buffer 5μL、12μL的50%PEG8000、600U/μL的T4DNA ligase 1μL。
c.将步骤b配制的20μL反应体系加入步骤a的样品中,混匀。
将步骤c的混合反应液置入PCR仪中反应,反应条件为:23℃60min、4℃ hold。
3)纯化:
a.将“2)接头连接”的产物置于1.5mL离心管中,加入20μL TE,再加入 50μLaxygen beads结合10min,磁力架吸附1min.
b.75%乙醇洗两次,晾干。
c.加入25μL TE,静置10min,磁力架吸附1min,取上清22μL产物用于PCR 反应,PCR产物再用磁珠纯化。
(2)上机测序
将PCR扩增产物送深圳华大基因测序,测序要求对地贫基因HBA1、HBA2、 HBB、HBG1、HBG2、HBE1、HBZ及其基因间区和上下游序列,以及地贫相关基因KLF1、BCL11A、HBS1L、MYB进行重点检测和分析。具体采用 BGISeq500测序平台,PE50的测序技术标准流程,进行DNA测序。
(3)变异检测及注释
将测序产出数据依次进行初步统计分析,SNP、indel、CNV检测和注释,主要步骤如下:
①基本数据分析统计
将测序产出数据进行基本数据分析统计:测得的序列reads长度分析、统计 reads数量和数据的产量、reads序列与参考基因组序列的比对、统计目标区域比对到所要参考的基因组reads的覆盖度(Coverage)与测序深度(Depth)等。然后,根据以上基本数据的统计结果,得到样本基本信息,并判断数据是否符合要求。
②SNP和INDEL检测
将各样本的高质量的原始reads通过bwa比对软件比对到参考基因组(hg19) 上。然后,使用GATK检测SNP和Indel。
③CNV检测
通关华大开发的流程batCNV进行CNV检测。利用比对结果bam文件提取深度信息,并进行GC矫正及批次矫正,划分窗口,估计每个窗口的拷贝数目,连续5个窗口以上拷贝数目异常被判为异常拷贝数,连成一个CNV片段计算检验概率。
其中,基于测序结果,将样本1测序数据与地贫基因HBA1、HBA2、HBB 及相关序列区域进行比对分析,结果发现,地贫测序在样本1中检测到1个大片段杂合缺失,缺失位置定位在chr11:5245554-5249031,如图1所示,该缺失突变包含HBB整个基因及其两端的上下游序列,这样的缺失突变在之前的研究中未曾出现,也没有任何相关研究和报道。
3.qPCR和sanger验证
对样本1在地贫检出的目标缺失区域,利用qPCR和sanger技术对样本1 和样本2进行验证,具体操作如下:
(1)qPCR验证
在对样本1在地贫检出的目标缺失区域(即chr11:5245554-5249031)首尾断点附近及缺失区间内共设计6对引物,进行扩增,扩增突变所在区域的PCR 引物采用Primer6.0设计。以GAPDH基因为内参,采用相对定量方法运算公式:相对值=2-ΔΔCT,计算出目标序列相对内参的序列拷贝数相对值。拷贝数判断标准:相对值小于0.25,变异类型为纯合del;相对值大于0.25且小于0.75,变异类型为del,拷贝数为1;相对值大于0.75小于1.25,无拷贝数变异。本例设计的6对引物如表1所示。
表1 qPCR验证引物
Figure BDA0001778564280000071
Figure BDA0001778564280000081
利用qPCR对样本1和样本2进行缺失区域的验证,结果如表2所示。
表2 qPCR验证结果
Figure BDA0001778564280000082
表2的结果显示,对于样本1而言,缺失区域的两端断点外扩增产物,即引物对1和引物对6的扩增产物,两者的相对值均在0.75至1.25之间,该区段正常表达;而跨越断点以及在缺失区域内的扩增产物,即引物对2至5的扩增产物,其定量相对值均处于0.25~0.75之间,表示该区段存在杂合缺失。样本2 的结果与样本1一致,在该区段均存在杂合缺失。以上结果显示,qPCR验证结果与预期一致。
(2)Sanger验证
根据样本1在地贫检出的目标缺失区域(即chr11:5245554-5249031),在缺失首尾断点两端设计一对引物,跨越缺失区域,得到断点两端序列连接产物,进行sanger测序,从而验证缺失的区域。扩增的片段使用ABI3100(Applied Biosystems,Foster City,CA)遗传分析仪,采用ABI BigDye Terminator cycle sequencing kit v3.1(AppliedBiosystems,Foster City,CA)进行测序。具体的,本例参考人类基因组序列数据库GRCh37.1/hg19,采用Primer6.0设计用于Sanger 验证的特异性引物,其上游引物为Seq IDNo.1所示序列,下游引物为Seq ID No.2所示序列,
Seq ID No.1:5’-ACATCCTCCAGGTTCATCAATT-3’
Seq ID No.2:5’-GCAGATTAGTCCAGGCAGAA-3’。
按照以下配比配制样本的PCR反应体系,25μL反应体系包括:2×KAPA HiFiHotStart Readymix 12.5μL、20μM的Ad153 primer1 0.25μL、20μM的Ad153 primer2 0.25μL、基因组DNA 30ng,补充H2O至25μL。
PCR反应条件为:95℃3min,然后进入32个循环:98℃20s、62℃20s、 72℃20s,循环结束后,72℃10min,结束反应。
最后,将PCR产物进行sanger测序,测序所得结果在NCBI Nucleotide Blast 中进行比对验证。
其中,地贫测序在样本1中检测到的缺失区域,sanger验证结果如图2和图 3所示;图2是样本1的Sanger测序图,箭头位置处为缺失区间外首尾连接处;图3是样本2的Sanger测序图,箭头所指位置处为缺失区间外首尾连接处。对样本1和样本2的sanger验证结果显示,其缺失的精确位置为chr11: 5245532-5249021。将样本1的sanger测序结果进行Blast比对,结果如图4所示,图4的结果显示,其缺失区域的起始位置是chr11:5245532,终止断点位置是chr11:5249021。本例的地贫基因缺失位置和大小未见相关报道,也无检测此型别的试剂或相关产品。
根据以上研究结果分析认为,第一,样本1(即母亲)具有临床地贫生化筛查指标的异常,而没有检出地贫基因型别,说明样本1可能为一种新的地贫型别,因此无法被现有技术检出;第二,样本1的女儿,也就是样本2,是地贫重症患者,即一对等位基因均无功能才会致重症,而其父亲只是HBB基因单碱基插入突变HBB:c.45_46insG的携带者,说明样本2应该是遗传自其父亲的插入突变和其母亲的缺失型,才会导致重症,这也就说明样本1的缺失型别是会导致地贫的;所以认为样本1的chr11:5245532-5249021缺失型为新的地贫型别。本例的chr11:5245532-5249021缺失是地中海贫血的一种新的β地贫基因突变型别,该新的β地贫基因型别的鉴定,可以补充现有地贫基因检测试剂盒的检测内容,减少漏诊和误诊。也可以单独针对本例的突变基因,延伸一种罕见地贫型别的检测技术,快速检测受试者是否为本例的β地贫基因型别或携带者,进而预防中重型地贫患儿的出生。地贫是我国南方地区最高发的遗传病之一,本例的β地贫基因型别对地贫型别的补充和完善,也是减少误诊和漏诊,从而达到精准防控地贫的关键所在。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明,不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 一种与地中海贫血相关的突变基因及其检测试剂和应用
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aacgcagtat tcttagtgga ctag 24

Claims (9)

1.一种与地中海贫血相关的突变基因,其特征在于:相对于野生型基因发生了chr11:5245532-5249021缺失突变。
2.根据权利要求1所述的突变基因在制备用于地中海贫血检测的试剂或装置中的应用。
3.一种用于地中海贫血检测的试剂,其特征在于:包括能够通过PCR扩增检测权利要求1所述的基因突变的引物对。
4.根据权利要求3所述的试剂,其特征在于:所述引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列,下游引物为Seq ID No.2所示序列,
Seq ID No.1:5’-ACATCCTCCAGGTTCATCAATT-3’
Seq ID No.2:5’-GCAGATTAGTCCAGGCAGAA-3’。
5.根据权利要求3或4所述的试剂,其特征在于:还包括PCR扩增的反应混合液。
6.一种用于地中海贫血检测的试剂,其特征在于:包括能够通过核酸杂交检测权利要求1所述的基因突变的DNA探针。
7.一种用于地中海贫血检测的试剂,其特征在于:包括用于检测权利要求1所述的基因突变的基因芯片。
8.根据权利要求7所述的试剂,其特征在于:所述基因芯片上固定有能够通过核酸杂交检测权利要求1所述的基因突变的DNA探针。
9.一种用于地中海贫血检测的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒中含有权利要求3-8任一项所述的试剂。
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