CN109112196A - 一种用于快速检测泰国型α-地中海贫血的PCR扩增引物组、扩增试剂及试剂盒 - Google Patents

一种用于快速检测泰国型α-地中海贫血的PCR扩增引物组、扩增试剂及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN109112196A
CN109112196A CN201710484621.5A CN201710484621A CN109112196A CN 109112196 A CN109112196 A CN 109112196A CN 201710484621 A CN201710484621 A CN 201710484621A CN 109112196 A CN109112196 A CN 109112196A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
pcr amplification
seq
blood
thalassemia
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710484621.5A
Other languages
English (en)
Inventor
陈治中
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201710484621.5A priority Critical patent/CN109112196A/zh
Publication of CN109112196A publication Critical patent/CN109112196A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明“一种用于快速检测泰国型α‑地中海贫血的PCR扩增引物组、扩增试剂及试剂盒”，属于分子诊断技术。采用本发明的检测试剂盒进行‑‑THAI缺失型地中海贫血检测只需要约2h，且本发明的检测试剂盒的检测结果与经核酸提取DNA的普通常规Gap‑PCR法检测结果一致，而核酸提取DNA的普通常规Gap‑PCR法检测则需要4h以上，而且花费成本较高，操作繁琐，DNA易相互污染和降解，而，Direct PCR法检测‑‑THAI缺失型地中海贫血方面具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于‑‑THAI缺失型地中海贫血的检测。

Description

一种用于快速检测泰国型α-地中海贫血的PCR扩增引物组、扩 增试剂及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子诊断技术，特别是一种单管直接PCR检测泰国型α-地中海贫血的试剂盒。
背景技术
地中海贫血(Thalassemia，简称地贫)是全球最常见的单基因遗传病之一，是由于珠蛋白基因发生缺陷；致使珠蛋白链合成减少或缺失,使形成血红蛋白的α链/β链比例失衡,而导致的一组严重威胁人类健康的致残与致死的遗传溶血蛋白病。保守估计全世界地中海贫血基因携带者近2亿人,受累个体主要源于地中海地区、中东、外高加索、中亚、印度次大陆、东南亚和东亚和我国南方地区,其中包括我国南方广西、广东、海南等省份。
根据成人主要珠蛋白链(α2β2)所涉及的类型，该病主要被分为α-地贫和β-地贫。α-地贫属于常染色体隐性遗传病,其分子基础是位于16号染色体末端16p13.3位点上的人α-珠蛋白基因簇的先天性遗传缺陷而导致α-珠蛋白链合成减少或缺失为特征的遗传性溶血性贫血。根据a-珠蛋白基因突变受累的原因，α-地贫被分为缺失型和非缺失型两种类型。缺失型是α-地贫的主要原因；少数α-地贫是由于基因点突变(非缺失型)而造成。如果缺失型α-地贫是由于缺失一条染色体上两个功能性α-基因的其中一个，则a珠蛋白链的合成部分受抑制，例如亚洲人群中最常见的-α4.2/αα与-α3.7/αα；如果两个功能性α基因全部缺失，例如东南亚人群中最常见的--SEA以及--THAI，则a珠蛋白链的合成部分更受抑制。研究资料表明95％以上的α-地贫是由于α-珠蛋白基因大片断缺失(缺失型)所致,其缺失数目是α-地中海贫血临床表现及分型的依据。
目前已鉴定的α-地贫缺失类型至少有36种，其中中国人占8种。在我国最常见的三种α-地贫缺失基因型为--SEA/αα(东南亚型)、-α4.2/αα(左缺失型)与-α3.7/αα(右缺失型),累计占α-地贫的85％以上，而资料表明在广西地区--THAI占约0.63％。自从Boonsa等报道了(--THAI)以来，陆续有病例被检出。泰国型α-地贫基因缺失片段比东南亚基因缺失地贫 (--SEA)片段还要长，--THAI自身或--SEA自身或与-α3.7或-α4.2相互共同遗传可引起致死性的 HbBart's胎儿或严重影响生命质量的HbH病。东南亚型(--SEA)的纯合子(--SEA/--SEA)与泰国型(--THAI/--THAI)或者东南亚复合泰国型(--SEA/--THAI)，由于其4个α珠蛋白基因均缺失或缺陷，以致完全无α链生成，是α-地贫中最为严重的一种，即重型α地贫。患者在胎儿期即发生大量γ链合成γ4(Hb Bart′s)，Hb Bart′s对氧的亲合力极高，造成组织缺氧而引起胎儿水肿综合征，胎儿常于30～40周时流产、死胎或娩出后半小时内死亡。因而泰国型缺失在临床上可以形成中重型α地中海贫血，即泰国型缺失的HbH病和泰国型缺失的巴氏水肿胎。由于泰国型的血液学特征与东南亚缺失型α地贫一致，均表现出小细胞低色素，MCV降低和MCH降低等，因而可能造成误诊和漏诊，继而造成泰国型缺失的HbH病和泰国型缺失的巴氏水肿胎儿的出生。目前该病尚无理想的治疗方法，因此，泰国缺失型α地中海贫血的检测急需一种简单、能快速准确基因分型的技术手段，开展泰国型α-地贫(--THAI)检测对遗传咨询及产前诊断具有重要意义。
目前已报道传统的筛查方法α-地贫如血常规参数检测分析、红细胞渗透脆性试验、血红蛋白电泳试验等特异性不高，较易产生假阴性。Southern Blot杂交技术是α-地中海贫血的分子诊断金标准,准确性高,但操作繁琐、标本用量大、费时费力、检测通量小而不适合常规检测；其他变性高效液相色谱(DHPLC)、TaqMan探针技术、DNA直接测序和DNA微阵列技术等。但这些方法检测过程繁琐、检测所用时间长、使用试剂或者仪器昂贵和特殊的标记引物等，因而不利于临床广泛的推广应用。
现有的泰国缺失型α地中海贫血检测相关的技术主要基于Gap-PCR结合电泳或者杂交的方法、荧光定量PCR的方法检测，这些方法、专利及产品均需要提取外周血、绒毛和/或羊水中DNA，才能进行以后的实验操作，而DNA的质量是PCR成功的一个非常关键的因素，并且提取与纯化DNA过程极易污染或者降解，使得实验易出现假阴性或者假阳性，导致误检或者漏检。
目前市场上缺失型地贫检测方法多采用Gap-PCR结合电泳方法检测泰国缺失型α地中海贫血，必须提取与纯化DNA，才能继续后续实验，标本提取时间约1～2h，PCR扩增时间检测长达3～4h。电泳时间约50～60min或者杂交3h，整个流程时间7h。操作繁琐，耗时长，易污染和降解。尚不能满足临床简洁快速的需要。
另外，普通常规缺失型地贫检测方法所需样本量多，对于边远地带采集的标本运输需冷链设备，需三级包装系统，标本储存空间大；生物安全风险系数高。而滤纸片是血液标本采集和运输的极好载体。全血滴在滤纸片上制成滤纸片干血斑(Dried blood spots,DBS),有很好的生物稳定性和安全性,便于储存和运输。随着我国产前筛查、新生儿筛查力度的不断增强，特别是当筛查范围扩大到一些地域偏远、医疗条件相对落后的地区时，应用滤纸干血斑(DBS) 对于患者标本采集、保存和运输及流行病学调查则更为有利。而这在地贫方面应用甚少。特别是用全血、羊水和DBS直接检测地贫技术的专利尚无，市场上尚无此类产品。
发明内容
根据上述领域存在的空白和需求，本发明提供一种快速检测泰国型α-地中海贫血的试剂盒，采用该试剂盒可以实现单管单次闭管反应完成泰国型α-地中海贫血等位基因的检测，具有简便、快捷，高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性，技术方案如下：
一种用于快速检测泰国型α-地中海贫血的PCR扩增引物组，其特征在于：包含如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的上下游引物THAIF/THAIR，用于扩增α-珠蛋白基因簇中--THAI等位基因，PCR扩增特征片段为478bp。
所述PCR扩增引物组可直接以待测样品和/或自待测样品提取的DNA为模板进行扩增；
所述待测样品选自新鲜采集的抗凝外周血、-20℃－-80℃保存未反复冻融的陈旧性抗凝外周血、培养羊水细胞、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、唾液、DBS样本和/或类似DBS处理的样本、多个细胞或单个细胞、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞，即囊胚细胞。
优选地，还包含SEQ ID NO.1所示的引物；
其中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3分别作为上、下游引物APF/APR用于扩增α-珠蛋白基因簇中正常人基因，PCR扩增特征片段为317bp。
优选地，引物组中三条引物混合在一起，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3 的摩尔浓度比例为2:3:5。
本发明还提供一种用于快速检测泰国型α-地中海贫血的PCR扩增试剂，其特征在于，用于一个反应的所述PCR扩增试剂中，含有：
其中所述引物THAIF如SEQ ID NO.2所示，所述引物THAIR如SEQ ID NO.3所示，所述引物APF如SEQ ID NO.1所示，
所述PCR扩增试剂适合直接加入蒸馏水和待测样品和/或自待测样品提取的DNA达到20 份体积进行扩增；
所述待测样品选自新鲜采集的抗凝外周血、-20℃－-80℃保存未反复冻融的陈旧性抗凝外周血、培养羊水细胞、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、唾液、DBS样本和/或类似DBS处理的样本、多个细胞或单个细胞、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞，即囊胚细胞。
优选地，其中三条引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的摩尔浓度比例为 2:3:5。
优选地，用于一个反应的所述PCR扩增试剂中，含有：
还发明还提供一种用于快速检测泰国型α-地中海贫血的试剂盒，包含任一所述的引物组以PCR扩增所需的常规试剂；所述常规试剂包括缓冲液、DNA扩增酶、MgCl2和dNTP。
一种快速检测泰国型α-地中海贫血的方法，其特征在于，采用任一所述的引物组或任一所述的PCR扩增试剂对待测样品进行PCR扩增；包括如下步骤：
(1)准备待测样品，
(2)准备PCR扩增体系，
(3)运行PCR程序并检测扩增产物；
只得到一条带317bp条带时，结果初步判断为正常型；
得到478bp和317bp两条带时结果初步判断为携带--THAI等位基因；
仅得到一条478bp条带时，结果初步判断为--THAI等位基因纯合子；
所述待测样品选自新鲜采集的抗凝外周血、-20℃－-80℃保存未反复冻融的陈旧性抗凝外周血、培养羊水细胞、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、唾液、DBS样本和/或类似DBS处理的样本、多个细胞或单个细胞、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞，即囊胚细胞。
优选地，所述PCR程序95℃预变性3～5分钟，然后94℃15～30秒，62-66℃退火25～35秒，28～38个循环。
本发明所述的快速检测泰国型α-地中海贫血的试剂盒，包括扩增引物，经过大量实践调整本发明的引物序列，优选的引物组合序列如下：一对可以扩增α-珠蛋白基因簇中--THAI等位基因的特征序列的引物THAIF和THAIR。PCR扩增的产物片段约为478bp。
THAIF：SEQ ID NO.2；
THAIR：SEQ ID NO.3。
为了对泰国型α-地贫(--THAI)进行基因分型评估，在该PCR体系中，引入内对照扩增α- 珠蛋白基因簇中正常人基因(NG_000006.1)序列的引物。PCR扩增的产物片段约为317bp。
APF：SEQ ID NO.1。
APR：SEQ ID NO.3。
本发明所述的快速检测--THAI缺失型地中海贫血等位基因的试剂盒还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如缓冲液、酶液、MgCl2和dNTP等。具体地，酶液为Taq聚合酶体系，包括可用于直接PCR法的热启动酶体系等；所述缓冲液为可用于血液直接PCR缓冲液；当酶液选择采用宝生物工程(大连)有限公司所生产的MightyAmpTM DNA Polymerase时，缓冲液则优选为与MightyAmpTM DNA Polymerase配套的缓冲液。
优选的，上述泰国型α-地中海贫血的基因检测试剂盒中，用于多重直接PCR的反应液按每人份含量由以下组份组成配方(引物工作浓度10μmol/L，MightyAmp DNAPolymerase 为1.25U/μL)：
表1 PCR反应液配方与反应条件
本发明所述试剂盒适用于琼脂糖凝胶电泳法。
本发明所述试剂盒基于Direct PCR的快速检测--THAI缺失型地中海贫血等位基因，采用该试剂盒快速检测--THAI缺失型地中海贫血等位基因的方法包括以下步骤：
1)样本采集，抗凝外周血、-20℃－-80℃保存未反复冻融的陈旧性抗凝外周血、培养羊水细胞、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、唾液、DBS样本、多个和/或单个细胞、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞，即囊胚细胞等标本直接作为模板，也可以采用上述标本经核酸提取的DNA作为模板。
2)配制PCR反应配方及体系，具体为：
将引物THAIF、THAIR、APF和APR；以及PCR缓冲液、酶液、MgCl2、dNTP、水和外周血配制成反应体系；
3)样本检测：分别将以抗凝外周血直接为模板配制的反应体系进行PCR扩增，得到扩增产物。
4)电泳检测鉴定PCR产物：取PCR扩增中的产物4.0～5.0μL；点样于2～2.5％琼脂糖凝胶外加0.005％核酸染料；在5V/cm电压下电泳约30～35分钟，取出于凝胶成像系统里观察结果并拍照保存。
5)数据分析及结果判定：根据PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析判读结果，仅有只得到一条带 317bp条带时，结果为正常野生型；得到478bp和317bp两条带时结果为携带--THAI等位基因；仅有只得到一条带478bp条带时，结果为--THAI等位基因纯合子或者--THAI等位基因纯合子待排除。
上述方法的步骤1)中，采用新鲜采集的抗凝外周血或者(-20℃或者-80℃保存未反复冻融的陈旧性抗凝外周血)或者培养羊水细胞或者DBS样本为模板。检测绒毛、羊水或脐带血时须避免母体血污染，采用其他相关鉴定实验排除。
上述方法的步骤1)中的滤纸片干血斑样品采集与制备保存：①、使用Whatman 903滤纸片(或者普通滤纸片)。在滤纸片上标记受检者编号和收集日期。②、末梢血和抗凝血均可用于滤纸片干血斑样品制作。如果从末梢血制备滤纸片干血斑，采集部位为足弓、耳垂或手指。用70％乙醇或酒精棉消毒采血部位，用消过毒的针头小心刺破皮肤。弃去第一滴末梢血。将第二滴血点在滤纸片中央的圆圈内，大约每孔需要50～80μl全血，保证滴满圆圈。每个样品应点满一张滤纸片的每个孔。如从抗凝血制备滤纸片干血斑，移液器吸取50～80μl抗凝血血样，对准滤纸片印圈的中心处，将血样滴在滤纸上。应滴满一张滤纸片的每个孔。③、血液滤纸片于室温下自然干燥至少4小时(在潮湿气候下至少24小时)，不要加热血片或将他们堆叠在一起，干燥过程中不要与其它界面接触。在滤纸片血斑充分干燥后，将滤纸片放入密封袋中，避免滤纸之间标本的相互污染。④、完整包装的DBS样品可在室温下避光储存 2周。未及时检测的DBS样品存放冰箱在-20℃或以下待检。
上述方法的步骤2)中，反应体系中各组分的浓度优选为：外周血模板：1～4μl(待检测 DNA：1～4ng/μL)；各引物：0.05～1μmol/L，MgCl2浓度为1.5～5mM/L，dNTP的浓度为100～500μM/L，DNA聚合酶的浓度为1～4U/反应。反应体系的终体积优选为20～40μL。
上述方法的步骤3)中，PCR扩增条件为：95℃预变性3～5分钟，然后94℃15～30秒，62-66℃退火25～35秒，28～38个循环，所有循环结束后进行琼脂糖凝胶电泳分析。
与现有技术相比，本发明的特点在于：
1、本发明所述试剂盒可以实现单管单次闭管反应完成--THAI缺失型地中海贫血等位基因的检测，进行--THAI缺失型地中海贫血检测(含电泳时间)只需要约2h，具有快捷简洁、高度的稳定性、灵敏性和准确性，特异性。
2、待测样品不需要提取DNA,可自己加入到PCR体系中扩增。
3、本发明所述试剂盒基于Direct PCR法的快速检测缺失型--THAI地中海贫血等位基因的试剂盒，无需开管操作，极大限度地降低实验室PCR产物污染的可能；另一方面，直接采用琼脂糖凝胶电泳法，该方法是目前使用PCR分子诊断技术中最廉价的实验体系构建方法，成本更低，不需要昂贵的仪器和探针设计，各级实验室和医院都易开展，更易于推广。
附图说明
图1本发明实施例1中琼脂糖凝胶电泳结果；
其中M：DL500DNA Marker(Takara Code No.3590A)
1：正常野生型(全血)；
2：--THAI杂合子(全血)；
3：阴性对照。
图2本发明实施例2中琼脂糖凝胶电泳结果；
M：DL500DNA Marker(Takara Code No.3590A)
1：--THAI杂合子(DBS)；
2：正常野生型(DBS)；
3：阴性对照。
图3本发明实施例3中琼脂糖凝胶电泳结果；
M：DL500DNA Marker(Takara Code No.3590A)
1：正常野生型(羊水)；
2：--THAI杂合子(羊水)；
3：阴性对照。
图4本发明实施例4中琼脂糖凝胶电泳结果；
M：DL500DNA Marker(Takara Code No.3590A)
1：阴性对照；
2：正常野生型(脐血)；
3：--THAI杂合子(提纯DNA)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不
限于以下实施例。
实施例1：采用本发明所述试剂盒在已知基因型全血样本中的检测结果
1、试剂盒的组成：
可以扩增α-珠蛋白基因簇中--THAI等位基因与正常基因(NG_000006.1)的特征序列的引物组
THAIF、THAIR、APF和APR：
表2 检测--THAI地贫特征序列的引物组
优选的，按下述表3配制PCR反应体系(引物工作浓度10μmol/L，MightyAmp DNAPolymerase为1.25U/μL)：
利用正交试验方法，通过大量的实验对比，通过大量实验对比，最终确定最优的PCR反应液配方及体系见表3：
PCR反应液18μl，外周血(绒毛、羊水或脐带血)等样本加样量2μl，反应总体积为20μl：
表3 PCR反应液配方体系及反应条件
2、实施方法：
PCR反应所用仪器：Bio-Rad热循环仪C1000或者T100或者杭州晶格基因扩增PCR仪。优选的，PCR反应程序见表1，所有循环结束后进行琼脂糖凝胶电泳分析。
样本采集，抗凝外周血或脐带血等标本。
样本检测：将用常规方法检测确定的已知基因型待检样本(全血)，根据上述反应体系和反应程序，于PCR仪上进行扩增检测，所有循环结束后进行琼脂糖凝胶电泳分析。
3、样本来源：所有样本均来源自经常规Gap-PCR技术确定基因型的抗凝外周血样本。
4、数据分析及结果判定：根据PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析判读结果，仅有只得到一条带317 bp条带时，结果为正常野生型；得到478bp和317bp两条带时结果为携带--THAI等位基因；仅有只得到一条带478bp条带时，结果为--THAI等位基因纯合子或者--THAI等位基因纯合子待排除。
可见，采用本发明所述试剂盒用于Direct PCR分析法进行--THAI缺失型地中海贫血等位基因检测，结果准确；而且野生型样本只能检测出正常条带，具有较高的特异性，结果直观。
实施例2：本发明所述试剂盒在DBS样本中的检测效果。
1、试剂盒的组成：
同实施例1。
优选的，按表3配制PCR反应体系：
利用正交试验方法，通过大量的实验对比，通过大量实验对比，最终确定最优的PCR反应液配方体系见表3：PCR反应液18μl，DBS样本1-3片(直径1-2mm)(补水2μl)，反应总体积为20μl。
2、实施方法：
同实施例1。
3、样本来源：
所有样本均来源自经常规Gap-PCR技术确定基因型的抗凝外周血样本，均经滤纸片干血斑样品采集与制备。采用双盲实验进行检测。用打孔器在样品区截取一个小圆片(直径：1-2mm)。 4、滤纸片干血斑样品采集与制备：①、使用Whatman903滤纸片(或者普通滤纸片)。在滤纸片上标记受检者编号和收集日期。②、末梢血和抗凝血均可用于滤纸片干血斑样品制作。如果从末梢血制备滤纸片干血斑，采集部位为足弓、耳垂或手指。用70％乙醇或酒精棉消毒采血部位，用消过毒的针头小心刺破皮肤。弃去第一滴末梢血。将第二滴血点在滤纸片中央的圆圈内，大约每孔需要50～80μl全血，保证滴满圆圈。每个样品应点满一张滤纸片的每个孔。如从抗凝血制备滤纸片干血斑，移液器吸取50～80μl抗凝血血样，对准滤纸片印圈的中心处，将血样滴在滤纸上。应滴满一张滤纸片的每个孔。③、血液滤纸片于室温下自然干燥至少2-4小时(在潮湿气候下至少24小时)，不要加热血片或将他们堆叠在一起，干燥过程中不要与其它界面接触。在滤纸片血斑充分干燥后，将滤纸片放入密封袋中，避免滤纸之间标本的相互污染。④、完整包装的DBS样品可在室温下避光储存2周。未及时检测的DBS 样品存放冰箱在-20℃或以下待检。
本实施例中的DBS样品还可以替换成：滤纸片干羊水样品、滤纸片干唾液样品、滤纸片干胚胎的遗传物质样品、滤纸片干基因组DNA样品，上述各滤纸片干体液/胚胎的遗传物质 /DNA样品制备方法同DBS样品的常规制备方式(如上所述)，并且，采用相同的引物组、相同的PCR方法能获得相同的实验结果，本文中不再一一赘述。
5、数据分析及结果判定：同实施例1。
实施例3：本发明所述试剂盒在羊水样本(或经培养的羊水样本)的检测效果。
1、试剂盒的组成：
同实施例1。
按表3配制PCR反应体系：
2、实施方法：
同实施例1。
3、样本来源：
所有样本均来源自经常规Gap-PCR技术确定基因型的羊水样本。
4、数据分析及结果判定：同实施例1。
实施例4：采用双盲实验，本发明所述试剂盒在不同直接模板类型中的检测效果。
1、试剂盒的组成：
同实施例1。
按表3配制PCR反应体系：
2、实施方法：
采用双盲实验，其他同实施例1。
3、样本来源：
所有样本均来源自经第三方提供的常规Gap-PCR技术确定基因型(研究者不知道)不同类型样本。
4、数据分析及结果判定：同实施例1。
实施例5.本发明的产品性能验证
产品性能指标
1.测定准确性
收集10份阴性样本和15份地贫样本，选择低、中、高3个浓度，每个浓度重复3次，分别用3批产品来检测，分别计算阴性和阳性符合率。结果显示相应的基因型，研究结果与采用深圳益生堂生物企业有限公司和/或亚能生物技术(深圳)有限公司的地中海贫血基因诊断试剂盒(PCR法)试剂盒检测结果完全符合，产品阳性符合率和阴性符合率都达100％。
2.分析灵敏度
采用本发明试剂盒对--THAI缺失型地贫检测位点进行灵敏度分析，每个样本包含7个浓度梯度，确定各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为10ng/μL；
3.分析特异性
通过干扰筛查试验，临床正常剂量的EDTA、枸橼酸钠不是本品的干扰物质；溶血样本不会干扰本试剂盒检测结果；脂血样本中甘油三酯(14.1mmol/L)和黄疸样本(360.4mmol/L) 对本品检测无干扰。
用本产品检测8例本产品检测范围外的临床样本，包括2例α-地贫阴性样本、2例β-地中海贫血临床样本、2例缺铁性贫血临床样本、2例G-6-PD临床样本，均无交叉反应。
4重复性
采用本发明试剂盒不同批号产品，不同人(2人)操作，同一天做2次，共做2天，每个参考品每次试验重复3次检测。在不同实验条件下能多次重复稳定检测α-地贫基因型，结果显示一致。
采用本发明的检测试剂盒进行--THAI缺失型地中海贫血检测只需要约2h，且本发明的检测试剂盒的检测结果与经核酸提取DNA的普通常规Gap-PCR法检测结果一致，而核酸提取DNA 的普通常规Gap-PCR法检测则需要4h以上，而且花费成本较高，操作繁琐，DNA易相互污染和降解。因此，Direct PCR法检测--THAI缺失型地中海贫血方面具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于--THAI缺失型地中海贫血的检测。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
SEQ ID NO.1 5'TCCTTGGGGTAGCTCGAGTCAG 3'
SEQ ID NO.2 5'TGCCCTCAACCCCTGACAAT 3'
SEQ ID NO.3 5'CTTGGATCTGCACCTCTGGGTAG 3'。

Claims (9)

1.一种用于快速检测泰国型α-地中海贫血的PCR扩增引物组，其特征在于：包含如SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所示的上下游引物THAIF/THAIR，用于扩增α-珠蛋白基因簇中--THAI等位基因，PCR扩增特征片段为478bp；
所述PCR扩增引物组可直接以待测样品和/或自待测样品提取的DNA为模板进行扩增；
所述待测样品选自新鲜采集的抗凝外周血、-20℃－-80℃保存未反复冻融的陈旧性抗凝外周血、培养羊水细胞、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、唾液、DBS样本和/或类似DBS处理的样本、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞，即囊胚细胞。
2.根据权利要求1所述的PCR扩增引物组，其特征在于：还包含SEQ ID NO.1所示的引物；
其中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3分别作为上、下游引物APF/APR用于扩增α-珠蛋白基因簇中正常人基因，PCR扩增特征片段为317bp。
3.根据权利要求2所述的PCR扩增引物组，其特征在于：引物组中三条引物混合在一起，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的摩尔浓度比例为2:3:5。
4.一种用于快速检测泰国型α-地中海贫血的PCR扩增试剂，其特征在于，用于一个反应的所述PCR扩增试剂中，含有：
其中所述引物THAIF如SEQ ID NO.2所示，所述引物THAIR如SEQ ID NO.3 所示，所述引物APF如SEQ ID NO.1所示，
所述PCR扩增试剂适合直接加入蒸馏水和待测样品和/或自待测样品提取的DNA达到20份体积进行扩增；
所述待测样品选自新鲜采集的抗凝外周血、-20℃－-80℃保存未反复冻融的陈旧性抗凝外周血、培养羊水细胞、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、唾液、DBS样本和/或类似DBS处理的样本、多个细胞或单个细胞、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞，即囊胚细胞。
5.根据权利要求4所述的PCR扩增试剂，其特征在于，其中三条引物SEQ ID NO.1、SEQID NO.2和SEQ ID NO.3的摩尔浓度比例为2:3:5。
6.根据权利要求5所述的PCR扩增试剂，其特征在于，用于一个反应的所述PCR扩增试剂中，含有：
7.一种用于快速检测泰国型α-地中海贫血的试剂盒，包含权利要求1-3任一所述的引物组以PCR扩增所需的常规试剂；所述常规试剂包括缓冲液、DNA扩增酶、MgCl2和dNTPs。
8.一种快速检测泰国型α-地中海贫血的方法，其特征在于，采用权利要求1－3任一所述的引物组或权利要求4-7任一所述的PCR扩增试剂对待测样品进行PCR扩增；包括如下步骤：
(1)准备待测样品，
(2)准备PCR扩增体系，
(3)运行PCR程序并检测扩增产物；
只得到一条带317bp条带时，结果初步判断为正常型；
得到478bp和317bp两条带时结果初步判断为携带--THAI等位基因；
仅得到一条478bp条带时，结果初步判断为--THAI等位基因纯合子；
所述待测样品选自新鲜采集的抗凝外周血、-20℃－-80℃保存未反复冻融的陈旧性抗凝外周血、培养羊水细胞、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、DBS样本和/或类似DBS处理的样本、多个细胞或单个细胞。
9.根据权利要求4-7任一所述的方法，其特征在于：所述PCR程序95℃预变性3～5分钟，然后94℃15～30秒，62-66℃退火25～35秒，28～38个循环。
CN201710484621.5A 2017-06-23 2017-06-23 一种用于快速检测泰国型α-地中海贫血的PCR扩增引物组、扩增试剂及试剂盒 Pending CN109112196A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710484621.5A CN109112196A (zh) 2017-06-23 2017-06-23 一种用于快速检测泰国型α-地中海贫血的PCR扩增引物组、扩增试剂及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710484621.5A CN109112196A (zh) 2017-06-23 2017-06-23 一种用于快速检测泰国型α-地中海贫血的PCR扩增引物组、扩增试剂及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109112196A true CN109112196A (zh) 2019-01-01

Family

ID=64733154

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710484621.5A Pending CN109112196A (zh) 2017-06-23 2017-06-23 一种用于快速检测泰国型α-地中海贫血的PCR扩增引物组、扩增试剂及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109112196A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013003583A2 (en) * 2011-06-29 2013-01-03 Duke University Somatic mutations in atrx in brain cancer
CN102943116A (zh) * 2012-12-04 2013-02-27 亚能生物技术（深圳）有限公司 泰国型α-地中海贫血的基因检测试剂盒
CN105525016A (zh) * 2016-01-29 2016-04-27 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 与番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子标记aad及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013003583A2 (en) * 2011-06-29 2013-01-03 Duke University Somatic mutations in atrx in brain cancer
CN102943116A (zh) * 2012-12-04 2013-02-27 亚能生物技术（深圳）有限公司 泰国型α-地中海贫血的基因检测试剂盒
CN105525016A (zh) * 2016-01-29 2016-04-27 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 与番茄花青素缺乏性状紧密连锁的插入缺失分子标记aad及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105112569A (zh) 基于宏基因组学的病毒感染检测及鉴定方法
CN105755137B (zh) 一种α-地中海贫血基因检测试剂盒
CN102409100B (zh) 地中海贫血实时荧光定量pcr检测引物和试剂盒
CN106167833B (zh) 一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的rt-pcr引物和探针组合及试剂盒
Costa et al. Submicroscopic malaria parasite carriage: how reproducible are polymerase chain reaction-based methods?
CN104032038B (zh) 鳜鱼弹状病毒的检测试剂盒及检测方法
EP3436606B1 (en) Plasma derived cell-free mitochondrial deoxyribonucleic acid
CN107760802A (zh) 罗湖病毒特异性rt‑pcr检测试剂盒及检测方法
Jiang et al. Sap-direct RT-PCR for the rapid detection of coleus blumei viroids of the genus Coleviroid from natural host plants
CN108070636A (zh) 一种荧光pcr扩增样本的处理方法和试剂盒
CN109112208A (zh) 用于检测缺失型α-地中海贫血的引物组及试剂盒
CN107058465A (zh) 一种利用单倍体测序技术检测染色体平衡易位的方法
CN102943116B (zh) 泰国型α-地中海贫血的基因检测试剂盒
CN109112197A (zh) 一种直接同时检测α与β地中海贫血的芯片、扩增试剂及试剂盒
CN110885902B (zh) 用于检测猪蓝耳病毒并鉴别从中猪蓝耳病毒高致病经典变异株的冻干微芯片、试剂盒及方法
CN109112206A (zh) 用于基因分型检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法及试剂盒
CN109112196A (zh) 一种用于快速检测泰国型α-地中海贫血的PCR扩增引物组、扩增试剂及试剂盒
CN109112200A (zh) 一种用于检测α地中海贫血的基因芯片、扩增试剂及试剂盒
RU2620561C1 (ru) Способ диагностики псориаза
CN103305635B (zh) 一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法
CN109234414A (zh) 结核分枝杆菌的对氨基水杨酸耐药性诊断标志物及其应用
CN109112199A (zh) 一种用于检测α-地中海贫血的基因芯片、扩增试剂和试剂盒
CN108018355A (zh) 基于vdr基因多态性辅助诊断多发性骨髓瘤的检测试剂盒及其制备与用途
CN110734985B (zh) 一种鉴别棉蚜茧蜂与豆柄瘤蚜茧蜂的方法
CN109112202A (zh) 用于基因分型检测α0缺失型地中海贫血的引物组及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190101

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication