CN107058465A - 一种利用单倍体测序技术检测染色体平衡易位的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用单倍体测序技术检测染色体平衡易位的方法，所述方法包括以下步骤：(1)培养与收集待测样本中的淋巴细胞；(2)显微注射挑取单细胞并分离染色体以获得单倍体；(3)单倍体的扩增和文库的构建；(4)单倍体文库经二代测序得到测序数据，与基因组参考序列比对确定易位的染色体数目及染色体编号；深度测序将潜在的断裂点区域缩小至12kb；(5)利用测序数据的双端特征，与样本的全基因组测序数据进行对比，对12kb的断点区域进行分析，找出所有满足条件的reads，以此确定染色体平衡易位的断裂点；(6)PCR和Sanger测序验证。本发明提供的方法可广泛应用于产前诊断胎儿的染色体平衡易位、筛查先天性染色体异常疾病以及白血病等肿瘤诊断。

Description

一种利用单倍体测序技术检测染色体平衡易位的方法
技术领域
本发明涉及医学遗传学领域，尤其涉及一种利用单倍体测序技术检测染色体平衡易位的方法。
背景技术
目前常用的染色体平衡易位检测方法有两种：染色体核型分析和荧光原位杂交技术。
1.染色体核型分析
样本采集后按常规操作进行细胞培养、染色体制备、G显带，将待测细胞的染色体按照该生物固有的染色体形态特征和规定，进行配对、编号和分组。染色体核型分析通过观察染色体大小和染色体显带，可以确定是哪个染色体发生易位，但是，仅凭现有的核型分析报告无法精确判断发生易位断裂点的位置，例如，核型分析通过染色体大小和染色体显带，可以判断3号和5号染色体发生易位，却无法精确定位两者发生易位的断点基因。
2.荧光原位杂交技术，也称FISH(fluorescence in situ hybridization)技术
利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交的染色体的形态和分布。但是荧光原位杂交技术不能达到100％杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。FISH技术容易出现假阳性，而且，FISH可用的荧光信号种类少，不能满足大量靶点同时检测。FISH技术操作过程复杂繁琐，对实验的设定及环境有非常高的要求。
总之，以上常用的两种检测方法在精确定位染色体单碱基易位断点位置的方面存在精度不够、过程繁琐等缺陷。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用单倍体测序技术检测染色体平衡易位的方法，本发明通过显微注射技术获得单个的中期细胞，单细胞裂解后逐级稀释分离获得单染色体，测序数据经全基因组比对后可精确定位染色体发生易位的单碱基断点。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种利用单倍体测序技术检测染色体平衡易位的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)培养与收集待测样本中的淋巴细胞；
(2)显微注射挑取单细胞并分离染色体以获得单倍体；
(3)单倍体的扩增和文库的构建；
(4)单倍体文库经二代测序得到测序数据，与基因组参考序列比对确定易位的染色体数目及染色体编号；深度测序将潜在的断裂点区域缩小至12kb；
(5)利用测序数据的双端特征，与样本的全基因组测序数据进行对比，对12kb的断点区域进行分析，找出所有满足条件的reads，以此确定染色体平衡易位的断裂点；
(6)PCR扩增并采用Sanger法测序验证。
本发明提供的方法具有成本低、试验方法简单、耗时周期短以及设备成熟等优点，可广泛应用于产前诊断胎儿的染色体平衡易位、细胞遗传学检查如筛查先天性染色体异常疾病以及白血病等肿瘤诊断。
采用本发明提供的检测染色体平衡易位方法，从采样到生成结果报告仅需两周的时间，并且，该方法可以将断裂点确定到单碱基位置。
本发明通过将发生易位的染色体的测序数据进行基因组比对，可缩小断点区间至12kb；而且，本发明应用150bp的双端测序，300bp的区间即可确定断裂的碱基位置，具有试验方法简单、结果可靠等优点。
根据本发明，步骤(1)所述培养与收集待测样本中的淋巴细胞，包括以下操作：
a)采集人体的外周静脉血血液样本，无菌条件下向细胞培养液中滴加30-35滴血液样本；
b)混匀后于37℃，5％CO2条件下，培养69h；
c)无菌条件下加入秋水仙素至终浓度为0.2μg/mL，继续培养3-5h；
d)收集培养液中处于有丝分裂中期的淋巴细胞，并将其分散成细胞悬浮液，4℃保存备用。
本发明中，步骤a)所述细胞培养液为本领域公知的细胞培养液，例如RPMI1640等，在此不做特殊限定。
本发明中，步骤c)所述加入秋水仙素至终浓度为0.2μg/mL，其中的“终浓度”是指秋水仙素的终浓度；该秋水仙素的终浓度是指秋水仙素在整个细胞培养体系中的浓度。
本发明中，步骤d)所述分散成细胞悬浮液采用本领域公知的悬浮液进行操作，本领域技术人员可以根据实际需要采用相关的方法，在此不做特殊限定。
本发明中，所采集的人体的外周静脉血血液样本可低至1-2mL，因此，该检测方法具有样品用量少的特点。
本发明中，优选采用规格为2mL的注射器向细胞培养液中滴加血液样本，例如采用规格为2mL的注射器将30-35滴血液样本滴加到含有细胞培养基的细胞培养瓶中；对于细胞培养瓶的个数，例如可以是2瓶、3瓶等，在此不做特殊限定。
示例性地，本发明所述检测染色体平衡易位的方法中，步骤(1)具体采用如下操作：
采集人体的外周静脉血血液样本2mL，提供两个含有细胞培养液的细胞培养瓶，无菌条件下使用2mL注射器分别向细胞培养液中加30滴血液样本，轻轻摇匀后于37℃、5％CO2孵育69h，加入秋水仙碱后使秋水仙碱的最终浓度为0.2μg/mL，继续培养3h；将两瓶培养液合并后收集处于有丝分裂中期的淋巴细胞，将收集的淋巴细胞分散成细胞悬浮液，4℃保存备用。
本发明中，步骤(2)所述显微注射挑取单细胞并分离染色体以获得单倍体，包括以下操作：
a)配制如下组分的细胞裂解液：
b)显微镜下从细胞悬浮液中挑取一个中期细胞，放在步骤a)的细胞裂解液中，显微镜下观察细胞裂解释放染色体后，显微注射吸取全部染色体，并释放到含有纯水的离心管中；
c)将混匀的含染色体的纯水等倍稀释并均分至8个含有纯水的离心管中。
优选地，步骤b)和步骤c)所述离心管中均存有9μL纯水。
根据本发明，步骤a)所述细胞裂解液中的各组分，其浓度均是本领域公知的浓度单位。
示例性地，本发明所述检测染色体平衡易位的方法中，步骤(2)具体采用如下操作：
显微镜下从细胞悬浮液中挑取一个处于有丝分裂中期的细胞，放在提前准备好的细胞裂解液中，显微镜下观察细胞裂解释放染色体后，显微注射吸取全部染色体，并释放到存有9μL纯水的离心管中，轻柔吹打混匀后，将混匀的9μL含染色体的纯水等倍稀释并均分至8个离心管中，每管存有9μL含染色体的纯水。
根据本发明，在步骤(2)中所采用的细胞悬浮液为本领域公知的悬浮液，在此不做特殊限定。
本发明中，步骤(3)所述单倍体的扩增和文库的构建，包括以下操作：
对步骤(2)所得到的单倍体进行全基因组扩增，并进行纯化获得单染色体高通量测序文库。
根据本发明，步骤(3)所述全基因组扩增、纯化以及高通量测序文库的构建均采用本领域公知的技术进行，本发明不做特殊限定。
本发明中，所述纯化采用PCR产物纯化试剂盒(例如Qiagen PCR ProductionPurification Kit)进行，也可以采用本领域公知的其它纯化技术来进行，在此不做特殊限定。
本发明中，步骤(4)所述测序采用Miseq测序仪进行高通量测序，也可以采用本领域公知的其它测序技术进行。
本发明中，步骤(4)中将发生易位的两条染色体的深度测序数据进行比对分析，缩小断点区间至12kb。其中关于深度测序的方法，可采用本领域公知的技术来进行，在此不做特殊限定。
本发明中，步骤(5)利用测序数据的双端特征，与样本的全基因组测序数据进行对比，对12kb的断点区域进行分析，找出所有满足如下条件：read1前30bp在第三条染色体且read2后30bp在第五条染色体；或者read1前30bp在第五条染色体且read2后30bp在第三条染色体的reads，以此确定染色体平衡易位的断裂点。
根据本发明，所述“read”以及“read1”和“read2”均采用本领域公知的含义来理解。
优选地，步骤(5)中所述双端测序采用150bp的双端测序，每个reads的长度为300bp，从而确定染色体平衡易位的断裂点。
本发明中，步骤(6)所述PCR扩增和采用Sanger法测序验证，包括以下操作：
在重组染色体的断点位置两端设计4对引物对断点片段进行PCR扩增，富集的片段采用Sanger法测序验证。
根据本发明，步骤(6)中所述PCR扩增和Sanger法测序验证均采用本领域公知的方法来进行；至于所用到的引物也是本领域技术人员根据实际需要进行的设计。
本发明中，所述待测样本的细胞为淋巴细胞。
优选地，所述淋巴细胞来自染色体平衡易位病样本。
本发明中所述利用单倍体测序技术检测染色体平衡易位的方法，具体包括以下步骤：
(1)培养与收集待测样本中的淋巴细胞：
采集人体的外周静脉血血液样本2mL，提供两个含有细胞培养基的细胞培养瓶，无菌条件下使用2mL注射器分别向细胞培养液中加30滴血液样本，轻轻摇匀后于37℃、5％CO2孵育69h，加入秋水仙碱后使其最终浓度为0.2μg/ml，继续培养3h。两瓶培养液合并后收集淋巴细胞，将收集的淋巴细胞分散成细胞悬浮液，4℃保存备用；
(2)显微注射挑取单细胞并分离染色体以获得单倍体：
显微镜下从细胞悬浮液中挑取一个中期细胞，放在提前准备好的轻缓细胞膜裂解液中，显微镜下观察细胞裂解释放染色体后，显微注射吸取全部染色体，并释放到存有9μL纯水的离心管中，轻柔吹打混匀后，将混匀的9μL含染色体的纯水等倍稀释并均分至8个离心管中，每管存有9μL含染色体的纯水；
(3)单倍体的扩增和文库的构建：
等倍稀释到8个离心管的染色体，进行全基因组扩增(whole genomeamplification，WGA)及文库构建。
(4)文库经二代测序得到原始测序数据：
原始数据预处理后，基因组比对确定每个离心管中的染色体数目及染色体编号，确定易位的染色体。通过深度测序进一步将断裂点从染色体范围到某个基因。
(5)确定染色体平衡易位的断裂点：
与样本的全基因组测序数据进行对比，利用测序数据的双端特征，对12kb的断点区域进行分析。由于易位后的重组染色体会分为两部分比对到不同的源染色体，所以，正反向比对重组染色体即可确定断裂点。
(6)PCR和Sanger测序验证：
在重组染色体的断点位置两端设计4对引物进行PCR扩增，富集的片段进行Sanger测序验证。
本发明的关键操作在于：易位点附近的片段一部分在3号染色体，另一部分在5号染色体。本发明中应用的是150bp的双端测序，那么，每个reads的长度即300bp。将选定的12kb的断点区间所有reads进行双向比对，有几对reads会显示：一端在3号染色体，另一端在5号染色体，因此，即可确定断裂的碱基位置。
与现有技术方案相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种使用单倍体测序技术来检测染色体平衡易位断裂点的方法，通过使用二代测序技术和生物信息学方法，将染色体易位断裂点定位到单个碱基的位置，该方法的实验成本低，方法简单，周期较短且所用实验设备较为成熟；
(2)本发明可应用于产前诊断胎儿的染色体平衡易位、细胞遗传学检查如筛查先天性染色体异常疾病以及白血病等肿瘤诊断中，具有重要的医学价值。
附图说明
图1是显微注射分离一个中期淋巴细胞的操作示意图；
图2是单染色体逐级稀释及扩增和文库构建流程图；
图3是单染色体测序确定易位染色体编号示意图；
图4是断裂点位置示意图；
图5是引物设计示意图。
下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：
实施例1淋巴细胞的培养与收集
采集人体的外周静脉血血液样本2mL，无菌条件下使用2mL注射器分别向两瓶淋巴细胞培养液中加35滴血液样本，轻轻摇匀后于37℃、5％CO2孵育69h，加入秋水仙碱后并使其最终浓度为0.2μg/ml，继续培养3h。合并两瓶培养液，收集淋巴细胞，将收集的淋巴细胞分散成细胞悬浮液，4℃保存备用。
细胞悬浮液配制组分如下：
实施例2单细胞挑取及单染色体分离
配制如下组分的细胞裂解液：
吸取10μL淋巴细胞悬浮液置于培养皿中，显微镜下观察，采用如图1所示的操作使用显微注射系统吸取一个中期细胞，放在提前准备好的轻缓细胞膜裂解液中，显微镜下观察到细胞裂解，染色体分散后，显微注射吸取全部染色体，并释放到存有9μL纯水的离心管中，轻柔吹打混匀后，将混匀的9μL含染色体的纯水等倍稀释并均分至8个离心管中，使每管存有9μL含染色体的纯水，关于单染色体的逐级稀释操作如图2所示。
实施例3染色体扩增及文库构建
存有9μL含染色体的纯水的8个离心管，采用WGA4和WGA3的全基因组扩增方法对染色体进行扩增。扩增后采用NEB商业化产品依次进行末端修复、加A、加接头、片段选择、加index构建文库，关于染色体的扩增和文库构建流程如图2所示。
实施例4确定发生易位的染色体数目及编号
文库构建完成后经二代测序得到原始测序数据，生物信息学分析每个离心管内含有的染色体数目及编号。采用一种如图3所示的可视化的环形图，来显示染色体在8个离心管的分布情况。通过基因比对，可以进一步缩小(染色体断裂点→局部位点→基因→潜在突破点)为12kbp区域。
实施例5结合单染色体测序和全基因组测序精确定位断点
利用测序数据的双端特征，与样本的全基因组测序数据进行对比，对12kb的断点区域进行分析，找出所有满足条件(read1前30bp在Chr.3且read2后30bp在Chr.5；或者read1前30bp在Chr.5且read2后30bp在Chr.3)的reads。以此确定染色体平衡易位的断点，断裂点位置如图4所示。
实施例6PCR和Sanger测序验证
选取重组染色体的断点两侧片段设计4对引物进行PCR扩增，引物设计如图5所示；以正常样品DNA为对照，凝胶电泳检测及Sanger测序验证。
经验证，使用单倍体测序技术来检测染色体平衡易位断裂点的方法，通过使用二代测序技术和生物信息学方法，可将染色体易位断裂点定位到单个碱基的位置，该方法的实验成本低，方法简单，周期较短且所用实验设备较为成熟。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (8)

1.一种利用单倍体测序技术检测染色体平衡易位的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)培养与收集待测样本中的淋巴细胞；
(2)显微注射挑取单细胞并分离染色体以获得单倍体；
(3)单倍体的扩增和文库的构建；
(4)单倍体文库经二代测序得到测序数据，与基因组参考序列比对确定易位的染色体数目及染色体编号；深度测序将潜在的断裂点区域缩小至12kb；
(5)利用测序数据的双端特征，与样本的全基因组测序数据进行对比，对12kb的断点区域进行分析，找出所有满足条件的测序读长，以此确定染色体平衡易位的断裂点；
(6)PCR扩增并采用Sanger法测序验证；
所述方法不以治疗和诊断为目的。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述培养与收集待测样本中的淋巴细胞，包括以下操作：
a)采集人体的外周静脉血血液样本，无菌条件下向细胞培养液中滴加30-35滴血液样本；
b)混匀后于37℃，5％CO2条件下，培养69h；
c)无菌条件下加入秋水仙素至终浓度为0.2μg/mL，继续培养3-5h；
d)收集处于有丝分裂中期的淋巴细胞，并将其分散成细胞悬浮液，4℃保存备用；
优选地，采用2mL规格的注射器向细胞培养液中滴加血液样本。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述显微注射挑取单细胞并分离染色体以获得单倍体，包括以下操作：
a)配制如下组分的细胞裂解液：
b)显微镜下从细胞悬浮液中挑取一个中期细胞，放在步骤a)的细胞裂解液中，显微镜下观察细胞裂解释放染色体后，显微注射吸取全部染色体，并释放到含有纯水的离心管中；
c)将混匀的含染色体的纯水等倍稀释并均分至8个含有纯水的离心管中；
优选地，步骤b)和步骤c)所述离心管中均存有9μL纯水。
4.如权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述单倍体的扩增和文库的构建，包括以下操作：
对步骤(2)所得到的单倍体进行全基因组扩增，并进行纯化获得单染色体高通量测序文库；
优选地，所述纯化采用PCR产物纯化试剂盒进行。
5.如权利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述测序采用Miseq测序仪进行高通量测序；
优选地，步骤(4)中将发生易位的两条染色体的测序数据进行基因组比对，确定发生易位的染色体数目及染色体编号。
6.如权利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述利用测序数据的双端特征，将单倍体测序数据与样本的全基因组测序数据进行对比；
优选地，对步骤(4)中所述12kb的断点区域进行分析，找出所有满足如下条件：读长序列1前30bp在3号染色体且读长序列2后30bp在5号染色体；或者read1前30bp在5号染色体且read2后30bp在3号染色体的读长，以此确定染色体平衡易位的断裂点。
7.如权利要求1-6之一所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述PCR扩增和采用Sanger法测序验证，包括以下操作：
在重组染色体的断点位置两端设计4对引物进行PCR扩增，富集的片段采用Sanger法测序验证。
8.如权利要求1-7之一所述的方法，其特征在于，所述待测样本的细胞为淋巴细胞；
优选地，所述淋巴细胞来自染色体平衡易位病样本。
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