CN105087484A - 一种单染色分离方法、单染色体高通量测序文库的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种单染色体分离方法、单染色体高通量测序文库的构建方法及应用。本发明提供了的技术方案，先通过计算机模拟实验，获得最佳的稀释参数，然后通过稀释法对单个细胞中的染色体进行分离，获得单染色体，再进行高通量测序以及生物信息学分析，从而判断出变异基因是来源于同源染色体中的父方还是母方。相比将同源染色体作为一个混合样品进行测序，本发明采用稀释法分离获得单染色体，可用于单倍型测序，对科研以及临床均有重要应用价值。

Description

一种单染色分离方法、单染色体高通量测序文库的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及高通量测序领域，具体涉及一种单染色分离方法、单染色体高通量测序文库的构建方法及应用。

背景技术

人类基因组分析工作已经从确定所有人的“平均”参考序列(referencesequence)快速进入个体基因组测序时代。目前单细胞已经成为科学家们关注的重点，但是对于单个染色体的研究还是一个很空白的领域。人体内的每一个细胞里都含有两套基因组，其中一套来自父亲，另外一套来自母亲，这就叫做单体型现象，而每一个单倍体基因组(haploidgenome)中的变异都会对基因的表达、蛋白质的功能，以及疾病造成非常大的影响。

目前对于单细胞测序都是较为困难的，从单细胞里分离到单个的染色体，并在皮克范围内进行微量的建库，这都是目前行业的难点及关注点。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种单染色分离方法、单染色体高通量测序文库的构建方法及应用。

第一方面，本发明提供了一种单染色分离方法，包括如下步骤：

S01)模拟实验

采用随机数产生方法建模，获得验证实验总共所需要的稀释容器的最佳数目，包括如下步骤：

a)待分析物种染色体数记为X，并分别编号为S_n，n＝1～X，n和X为自然数；

b)在1-Z个数中随机产生X个数；将X个数分别对应为染色体编号，每个S_n各对应X个数中的一个数值；将Z个数均等分布在N个稀释容器中，其中Z、X为自然数，Z不小于X；重复步骤b)T次；

c)计算步骤b)T次模拟实验中，每次模拟实验后各稀释容器中对应的数字，记录为对应染色体的种类和数量；

d)将所有模拟实验步骤c)所得的数据进行统计学分析，获得如下PHC、及P1～P3四个参数：1)处于同一个稀释容器中的同源染色体的数量，记为PHC；2)将所有同源染色体完全分开的实验的频率，记为P1；3)只含有1条染色体的稀释容器的频率，记为P2；4)完全不含染色体的稀释容器的频率，记为P3；综合四个参数评估出总共所需要的稀释容器的最佳数目Q，其中，Q为不大于N的自然数。

S02)进行验证实验

获得待分析物种分裂中期至中后期的单细胞，取全部染色体，采用梯度稀释法将全部染色体稀释到Q个稀释容器中，获得至少有1个为仅含有单染色体的稀释容器。

优选地，所述步骤S01)中的步骤a)中，待分析物种为人，X为46。

优选地，所述步骤S01)中的步骤b)中，所述的将Z个数均等分布在N个稀释容器中的步骤包括：将Z个数从大到小排列，每隔Z/N个数取一次数值对应一个稀释容器。比如，Z为10，N为5，则每隔2个数取1次数值对应一个稀释容器：即，数字1和2分布到第1个稀释容器中，数字3和4分布到第2个稀释容器中，数字5和6分布到第3个稀释容器中，依次类推。

优选地，所述步骤S01)中的步骤b)之前还包括：确定Z和T值。

进一步优选地，确定Z和T值的步骤包括：

统计步骤b)中如下PHC、P1～P3四个参数：1)处于同一个稀释容器中的同源染色体的数量，记为PHC；2)将所有同源染色体完全分开的实验的频率，记为P1；3)只含有1条染色体的稀释容器的频率，记为P2；4)完全不含染色体的稀释容器的频率，记为P3；取各参数均趋于稳定时最小的Z’和T’值，即为合理的Z和T值。

T值即：步骤S01)中，共需要重复步骤b)(随机分管过程)多少次比较合理，T优选为20000。Z值即：步骤S01)的步骤b)中，X被稀释多少倍(将X稀释在Z个数中)比较合理。

优选地，所述步骤S01)中的步骤b)中，Z为2ⁿ(n＝6～16)，优选为1024。

优选地，所述步骤S01)中的步骤b)中，N为4-256中任一自然数(N优选为4的倍数)。

优选地，所述步骤S01)中的步骤d)中，综合四个参数，得出总共所需要的稀释容器的最佳数目Q(优选为24)的标准为：P2尽可能大；且取P1和P3尽可能小。

优选地，所述步骤S02)中，梯度稀释法对染色体进行稀释的步骤包括：

1)将Q或者R进行因式分解，得Y＝y*2ⁿ，其中，Y＝R或Q，n为自然数，R＝Q±2k，k、R为自然数；

2)取1个稀释容器，在稀释容器中先后加入细胞裂解液和1个单细胞，孵育，得细胞悬液，总体积为V₁；

3)将步骤2)所得细胞悬液等体积分配在y个稀释容器中，并在每个稀释容器中补足超纯水至体积为V₁，并混匀；

4)将步骤3)中每个稀释容器中溶液的一半分别置于新的稀释容器中，得y*2个稀释容器，并在每个稀释容器补足超纯水至体积为V₁，并混匀；

5)重复步骤4)共n次，最后获得Y个含有细胞悬液的稀释容器；在Y稀释容器中，至少有1个为仅含有单染色体的稀释容器。

进一步优选地，所述步骤S02)中的步骤1)中，y不能被2整除。

进一步优选地，所述步骤S02)中的步骤1)中，k为0～10的自然数。

更进一步优选地，所述步骤S02)中的步骤1)中，k为4～8的自然数。

进一步优选地，所述步骤S02)中的步骤1)中，所述Y＝8、16、24和32中的至少1种。

第二方面，本发明提供了一种单染色体高通量测序文库的构建方法，包括如下步骤：

将第一方面所得的单染色体进行扩增，得到单染色体高通量测序文库。

优选地，进一步对单染色体高通量测序文库进行高通量测序，并对测序结果进行生物信息学分析，获得各稀释容器中的单染色体的种类和数量，以及所有单染色体的序列信息。

进一步优选地，所述“对测序结果进行生物信息学分析”之前，还包括如下模拟实验来确认后续生物信息学分析结果的可靠性：1.选取参考基因组(如hg19)；选定碎片长度L(L＝50bp～150bp，优选为50bp)；2.把1号染色体每Lbp(选为50bp)，取出来作为一个read，制作成fastq文件，再用bowtie2，对比到hg19基因组上；统计其所有reads在各染色体上的分布；3.对其他所有染色体重复步骤2；4.对各染色体切割的结果显示：是否不低于95％的reads都对比到原染色体上。

第三方面，本发明提供了一种采用稀释法对染色体进行分离获得单个的染色体的方法，包括如下步骤：

1)将Q或者R进行因式分解，得Y＝y*2ⁿ，其中，Y＝R或Q，n为自然数，R＝Q±2k，k、R为自然数；

2)取1个稀释容器，在稀释容器中先后加入细胞裂解液和1个单细胞，孵育，得细胞悬液，总体积为V₁；

3)将步骤2)所得细胞悬液等体积分配在y个稀释容器中，并在每个稀释容器中补足超纯水至体积为V₁，并混匀；

4)将步骤3)中每个稀释容器中溶液的一半分别置于新的稀释容器中，得y*2个稀释容器，并在每个稀释容器补足超纯水至体积为V₁，并混匀；

5)重复步骤4)共n次，最后获得Y个含有细胞悬液的稀释容器；在Y稀释容器中，至少有1个为仅含有单染色体的稀释容器。

优选地，所述步骤1)中，y不能被2整除。

优选地，所述步骤1)中，k为0～10的自然数。

优选地，所述步骤1)中，k为4～8的自然数。

优选地，所述步骤1)中，所述Y＝8、16、24和32中的至少1种。

第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的单染色分离方法、如第二方面所述的单染色体高通量测序文库的构建方法或如第三方面所述的采用稀释法对染色体进行分离获得单个的染色体的方法在单倍型测序中的应用。

有益效果：

本发明提供了的技术方案，先通过计算机模拟实验，获得最佳的稀释参数，然后通过稀释法对单个细胞中的染色体进行分离，获得单染色体，再进行测序以及生物信息学分析，从而可以判断出变异基因是来源于同源染色体中的父方还是母方。相比将同源染色体作为一个混合样品进行测序，本发明采用稀释法分离获得单染色体，可用于单倍型测序，对科研以及临床均有重要应用价值。值得注意的是，本发明提供的技术方案简单，且应用范围广，不仅可用于分离细胞中的同源染色体，还可用于分离细胞中其他任何单个染色体(比如，对于双倍体生物，本发明提供的方案可以用于分离同源染色体；对于单倍体生物，本发明提供的方案可以用于分离单个的染色体)，以获得单个染色体的序列信息。

附图说明

图1为本发明确定每次实验模拟多少次随机分管过程比较合理的分析结果；

图2为本发明确定容器中共有多少个球比较合理的分析结果；

图3为本发明实施例提供的第一模拟实验的分析结果；

图4为本发明第二模拟实验四号染色体切割的结果；

图5本发明实施例提供的采用稀释容器对染色体进行分离，获得单染色体的方法示意图；

图6为本发明实施例提供的琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图7为本发明实施例提供的生物信息学分析结果。

下面结合具体方案对本发明提供的技术方案做进一步阐述。

本发明提供了的技术方案，是通过稀释法对单个细胞中的染色体进行分离，获得单染色体；包括计算机模拟实验和验证实验(wetlab)。

本发明所述的“单个细胞”包括但不限于具有同源染色体的细胞，还可以是其他细胞种类(比如，减数分裂中仅具有单倍体的生殖细胞)。

本发明所述的“获得单染色体”，包括但不限于将同源染色体分离，获得单个的父方或母方染色体；还包括获得“单个的染色体”。

本发明所述的“单个的染色体”是指1条染色体，值得注意的是，含有2条姐妹染色单体的染色体包括在本发明所述的“单个的染色体”之内。

本发明采用Perl编程的软件通过一次计算机模拟实验(记为第一模拟实验)，获得总共所需要的稀释容器的最佳数目；软件编程的设计思路如下(为方便理解，下述具体步骤均给出具体数值，可以理解的是，本领域技术人员可以根据具体需要对各数值进行调整)：

一、由生物问题建立数学模型：

把每个染色体视作小球，把同样体积的水分子视作一个小球。先假设容器内一共有1024个小球(分别编号1-1024)。其中48个小球是染色体，其他的是水分子。那么染色体被分到不同的试管中的过程，就可以视为小球被分到不同的试管中的过程。

二、设计：

1.在1-1024中随机数产生48个数，48个数分别依次对应为1-48号染色体，1个数对应1条染色体编号。(1024减去这48个数后，余下的球是水分子；这一步过程就相当于是在试管中混匀染色体的过程)

2.把1024个球，按照编号顺序从小到大或从大到小均分到8个试管中(比如1-128分在第一个试管中，129-256分在第二个试管中，依次类推)。(因为第一步是随机产生的数，这里就可以按照顺序，不用再随机了。)

3.统计这一次模拟中：1)有多少对同源染色体(PHC)在一个试管里面；2)是否所有同源染色体都被分在不同试管；3)有多少试管只含有一条染色体；4)有多少试管不含染色体。

4.重复上面的模拟100次，统计：1)PHC的平均值；2)统计把同源染色体完全分开的实验的频率，记为P1；3)统计只含有一条染色体的试管出现的频率，记为P2；4)统计不含有任何染色体的试管出现的频率，记为P3。

三、具体实验方法及结论：

1.确定每次实验模拟多少次随机分管过程比较合理

a)保持1024个球和分成16管不变，改变实验设计中第4步，“重复1000次”的参数。从100次，变化到1000次，间隔为100次；从500次，变化到50000次，间隔为500次。

b)统计实验设计中4个参数的值，画图，看在多少次之后，四个值都稳定下来，即变化范围非常小。

c)结论是，在重复次数到20000次后，四个值的变化范围就很小了，结果见图1。所以后面两组实验中，重复次数都取20000次。

2.确定容器中共有多少个球比较合理

a)理论上，水分子体积是远大于染色体体积的，但是受计算机计算能力限制，没有必要设置类似于100万个球里面，48个球是染色体。所以要探究一下大概设置多少个之后，四个值就趋于平稳了。

b)保持20000次重复实验，分成16管不变，改变1024这个数值。每次取值为2ⁿ取做模拟，n从6做到16，即从64个球做到了65536个球。

c)统计实验设计中4个参数的值，画图，看在多少次之后，四个值都稳定下来。

d)结论是，在球数达到1024后，四个值的变化范围就很小了。结果见图2。

3.用上面确定的参数，改变试管数，确定最优试管数目

a)保持球数为1024，重复20000次实验不变，改变试管数。从4变到256，每次间隔为4。

b)统计实验设计中4个参数的值，画图，确定最优试管数。

c)结果见图3。可以看到，在达到24管时，含有同源染色体的试管数已经降到1以下，且再增加试管数是，对PHC和P1而言，带来的增益较小；P2在24管时，达到最大值；P3在24管时，具体值是14.7％，不是很高。故得结论理论最优值为24。

在本发明第一模拟实验的基础上，本发明进一步提供了如下验证实验：

本发明验证实验中，我们采用稀释方法对处于分裂期(有丝分裂中期或中后期；或减数分裂I中期～减II中后期)单细胞的染色体进行分离，获得至少一个仅具有单染色体(优选为仅有1条单染色体)的稀释容器，完成同源染色体的分离，获得单染色体；其中，稀释所用容器的数量为第一模拟实验所得最佳稀释容器数或包括最佳稀释容器数在内的几组较佳数值。

比如，若第一模拟实验所得的最佳稀释容器数记为Q个(优选为24)，其中，Q为不大于N的自然数；则验证实验中用来稀释染色体的容器数共Q个，或者为R中的至少一种，其中，R为Q±2k，k为0～10的自然数(优选地，k为4～8的自然数)。

在本发明一验证实验中，稀释所用容器的数量优选为8、16、24和32中的至少1种。

在本发明一验证实验中，所述分裂期单细胞优选为有丝分裂中期至中后期、或者减数分裂I中期至减II至中后期的细胞。这些时期中，细胞的染色体形态清晰，有利于观察和计数，便于分离。

在本发明一验证实验中，所述分裂期单细胞包括但不限于采用秋水仙素处理所制得；也可以采用本领域内其他常用的、与秋水仙素相同用途的试剂进行处理制得。

本发明一验证实验中，所述“稀释容器”包括但不限于PCR管或其他常规实验室EP管，体积规格包括但不限于100ul、0.5mL、1mL、2mL。

本发明一验证实验中，“采用稀释容器对染色体进行分离”的步骤包括：

1)将Q或者R进行因式分解，得Y＝y*2ⁿ，其中，Y＝R或Q，n为自然数，y不能被2整除；

2)取1个稀释容器，在稀释容器中先后加入细胞裂解液和1个单细胞，孵育，得细胞悬液，总体积为V₁；

3)将步骤1)所得细胞悬液等体积分配在y个稀释容器中，并在每个稀释容器中补足超纯水至体积为V₁，并混匀；

4)将步骤3)中每个稀释容器中溶液的一半分别置于新的稀释容器中，得y*2个稀释容器，并在每个稀释容器补足超纯水至体积为V₁，并混匀；

5)重复步骤4)共n次，最后获得Y个含有细胞悬液的稀释容器；在Y稀释容器中，至少有1个为仅含有单染色体的稀释容器。

本发明一验证实验中，进行稀释时，原装稀释容器不丢弃，而是进入下一轮稀释，这样不会造成染色体丢失。比如，对A容器中的细胞悬液(总体积为V₂)进行稀释，则取B₁容器，取A中细胞悬液的一半(0.5V₂)加入B₁中，然后分别在A和B₁中加入0.5V₂的细胞悬液，并将A标记为B₂。以此方法，对B₁和B₂进行后一轮稀释。

本发明验证实验中，步骤1)中所述的“将Q或者R进行因式分解”是指将Q或者R分解到不能再被2整除，比如当Q或R为8、16、24或32时，进行因式分解有8＝2*2*2、16＝2*2*2*2、24＝3*2*2*2、32＝2*2*2*2*2；进行稀释时，不能被2整除的最小数(即y，比如，在Q或R＝24中，y＝3)，即为进行第一次稀释后所得的稀释容器的数量。

本发明的验证实验中，染色体分离完成后，获得的仅含有单染色体的稀释容器进一步可用于构建单染色体高通量测序文库：通过采用常规的染色体扩增方法(比如WGA4、WGA3)分别扩增各稀释容器中单染色体，即可得到单染色体高通量测序文库；单染色体高通量测序文库经过测序、生物信息学分析，即可获得同源染色体中各单染色体的信息。由于父方与母方的同源染色体被分开，故本发明技术方案能获得每一个单倍体基因组(haploidgenome)中的变异信息。

目前，高通量测序的主要平台代表有罗氏公司(Roche)的454测序仪(RochGSFLXsequencer)、Illumina公司的Solexa基因组分析仪(IlluminaGenomeAnalyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABISOLiDsequencer)等，应当指出的是，本发明提供的技术方案适用于目前任一一种二代高通量测序平台。

本发明优选包括第二模拟实验。第二模拟实验的目的：理论上，一条染色体被打断之后，对比到基因组上，绝大部分片段(也就是后来测序的read)，还能对比到那条染色体上面去。第二模拟实验目的在于验证该理论，具体模拟方法：

1.选取参考基因组为hg19；选定碎片长度为50bp(因为测序仪输出的结果，能用的长度一般在50bp到150bp之间；且50bp的序列，在基因组上，基本只有一个特定的位置，极少数有多个位置)。

2.把1号染色体每50个bp，取出来作为一个read，制作成fastq文件，再用bowtie2(开源生物信息学软件)，对比到hg19基因组上；统计其所有reads在各染色体上的分布。

3.对其他所有染色体重复步骤2。

4.对四号染色体切割的结果见图4，其他所有染色体的结果均类似，即几乎所有(约95％)的reads都对比到原染色体上。

以上说明，测序之后，把某稀释管的测序结果align到全基因组上，统计各条染色体上reads的数目，来确定该稀释管中有哪几条染色体的方法是可行的。

本发明部分英文释义(若无释义，则为本领域技术人员常规理解，优选为高通量测序中的常规理解)：

Adapter(adapter)：接头序列(根据具体的高通量测序平台，使用相应的接头序列，比如，illumina有PCR扩增接头和测序接头，分别用于文库构建和测序的引物；具体接头序列参照罗氏、illumina或ABI的高通量测序文库构建说明书)

ligasebuffer：连接酶缓冲液ligase：连接酶

index：索引序列(测序公司用index来标记样品，以区分样品；具体索引序列参照罗氏、illumina或ABI的高通量测序文库构建说明书)

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

本发明实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品。

第一模拟实验

第一模拟实验所得分析结果如图3所示，图3包括(a)-(d)，由图3可知，第一模拟实验所得最佳稀释容器数为24(Q值)。因为：由图3-a可知，Q值＝24时，处于同一个稀释容器中的同源染色体的平均数量小于1；由图3-b可知，Q值＝24时，将所有同源染色体完全分开的实验的频率约为0.36；由图3-c可知，Q值＝24时，只含有1条染色体的稀释容器的频率达到峰值0.27；由图3-d可知，Q值＝24时，完全不含染色体的稀释容器的频率也不是特别高，仅达到0.14。

验证实验(wetlab)

本发明实施例提供的一种采用稀释容器对染色体进行分离，获得单染色体高通量测序的方法。

实验一：孵育淋巴细胞

1)收集全血样品；

2)无菌条件下，采用2mL注射器将25滴全血样品滴加到含有细胞培养基的细胞培养瓶中，制备2瓶，分别进行后续步骤3-6；

3)轻轻混匀；

4)37℃，5％CO₂条件下，培养69小时；

5)无菌条件加入秋水仙素至终浓度为0.4ug/mL；

6)轻轻混匀，孵育3小时；

7)收集处于有丝分裂中期(M期)的淋巴细胞：

7-1)收集2瓶细胞培养瓶中的细胞培养液，混合，500g离心5分钟；

7-2)去上清，加入10mLKCl(75mM)溶液；

7-3)将细胞吹散(轻缓)，室温静置15分钟；

7-4)加入200uL乙酸至终浓度2％，混匀(轻缓)，冰上放置30分钟；

7-5)800g离心5分钟，去上清；

7-6)加入乙醇：乙酸(3:1)混合液，10mL，细胞吹散(轻缓)，800g离心5分钟；

7-7)用2mLKCl(75mM)溶液洗涤，800g离心5分钟；

7-8)根据细胞量，采用2.5-5mL的溶液将细胞分散，溶液组分(1mMEDTA，1％Trition-X100，0.2mg/mLRNaseA，75mMKCl)，然后放入4℃冰箱过夜。

实验二：获取单个淋巴细胞

1)制备如下组分的细胞裂解液：

0.03％Pepsin1％TritonX1002％乙酸75mMKCL

2)取准备实验一，步骤7-8所得的细胞悬浮液置于1个PCR管内；

3)吸取约5滴细胞悬浮液置于一个Petri板上；

4)采用显微操作注射仪吸取1个M期淋巴细胞，释放到板上的细胞裂解液中；当观察到细胞裂解，使用显微操作仪吸取已经裂解并分散的染色体转移至预先加入的9ul超纯水中，吹散在PCR管内(低吸附)。

实验三：稀释法分离染色体获得单染色体

图5为本发明提供的一种采用稀释容器对染色体进行分离，获得单染色体的方法示意图(以Q＝24为例)。

参照图5，采用稀释容器对染色体进行分离的步骤包括：

1)Q＝24，进行因式分解(Q＝y*2ⁿ)，得24＝3*2*2*2；

2)取实验二步骤5所得含染色体溶液的PCR管，所述PCR管中仅具有1个单细胞的全部染色体，总体积为9uL；

3)，将步骤2)所得的9ul含染色体纯水等倍稀释至预先放放置其他待稀释的9ul纯水低吸附PCR管中，中途不得更换枪头参照准备实验三步骤1-5的方法，取Q＝8、16、32，分别进行因式分解(Q＝y*2ⁿ)，分别得8＝2*2*2；16＝2*2*2*2、32＝2*2*2*2*2；对实验二步骤5所得含染色体溶液的PCR管进行不同稀释，分别获得8、16、32个含有细胞裂解液的PCR管，对各PCR管进行编号。

实验四：构建单染色体高通量测序文库

采用下述步骤对构建单染色体高通量测序文库，步骤包括：

1)取准备实验三步骤5)所得的含有单染色体的PCR管，分别作为待扩增样品，配置WGA4扩增体系进行后续扩增；

2)WGA4(Sigma,SingleCellWholeGenomeAmplificationKit)扩增；

3)磁珠(Beckman,AmpureXP)或柱纯化(Qiagen,QIAquickPCRPurificationKit)，WGA3(Sigma,WholeGenomeAmplification,WGAReamplificationKit)扩增

4)磁珠(Beckman,AmpureXP)或柱纯化(Qiagen,QIAquickPCRPurificationKit)，-20℃储存。

5)将步骤4)所得纯化后的DNA进行如下处理：Endpair

Total:50uL，在20℃下孵育30分钟。

6)用磁珠(Beckman,AmpureXP)或柱纯化(Qiagen,QIAquickPCRPurificationKit)，得40uL

纯化DNA产物，对所得纯化DNA加A：

Total:50uL，37℃下，孵育30分钟后，柱纯化，得27uL纯化DNA产物。

7)Adapter连接(采用(NewEnglandBiolabs)连接试剂盒)

配置的连接体系如下：

其中，Adapter信息如下：

MultiplexingAdapters:

5’-P-GATCGGAAGAGCACACGTCT-3’(SEQUNECNO.1)

5’–ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQUNECNO.2)

其中，“P”表示磷酸化；

用如上反应体系100uL在20°孵育30分钟。连接产物纯化

8)磁珠(Beckman,AmpureXP)或柱纯化(Qiagen,QIAquickPCRPurificationKit)文库加index及扩增(具体步骤参照illumina高通量测序文库构建说明书)PCR体系：

2×phusionMasterMix(NewEnglandBiolabs#M0531S)25ul

P11ul

Index1ul

连接产物23ul

用以上混合物进行以下PCR反应

9)扩增产物纯化

用QiagenPCRProductionPurificationKit进行纯化获得单染色体高通量测序文库；采用Miseq测序仪进行高通量测序。

10)对高通量测序结果进行生物信息学分析

采用Bowtie2对测序序列进行比对分析，以hg19为参考，获取sam文件；

对各个PCR管对应的sam文件进行分析，数出各管中各染色体出现的数量；

将各染色体出现的数值除以其长度，再乘以100,000,000，获得标准化数值；

将各管中各染色体出现数值的标准化数值采用柱状图表现出来；并分析获得各管中染色体的数量和类型。

为进一步说明本发明的有益效果，本发明还提供了Q＝32个PCR管的实验数据(Q＝8、16、24未显示)，包括：

本实施例中步骤2)WGA4扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果(如图6-a所示)，和步骤3)WGA3扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果(如图6-b所示)，以及步骤9)的纯化后获得单染色体高通量测序文库的琼脂糖凝胶电泳检测结果(如图6-c所示)。在图6中，a、b、c图分别包括上下两排，共32个样品孔，分别对应32个PCR管。

本实施例中步骤10)生物信息学分析结果的部分数据，如表1和图7所示：表1显示了每个PCR管的测序所得序列数(rawsequencingreadsnumber)以及比对比例(mappingrate)，从表1可以看出32个PCR管中各单染色体的情况。图7是统计结果，包括a-d，经过分析，编号为3以及4的PCR管中第8号染色体的出现频率最高(分别如图7-a和4-b所示)；在1号PCR管中，出现了多个峰值，表明1号管中有多个染色体(如图7-c所示)；在某些管中，看上去没有峰值，比如5号，很难说这样的管中存在哪一条染色体(如图7-d所示)。

表1.32个PCR管中各染色体以及序列信息

(TubeNo:PCR管编号；existingchromosome(s):含有的染色体)

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种单染色分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

S01)模拟实验

采用随机数产生方法建模，获得验证实验所需要的稀释容器的最佳数目，包括如下步骤：

a)待分析物种染色体数记为X，并分别编号为S_n，n＝1-X，n和X为自然数；

b)在1-Z个数中随机产生X个数；将X个数分别对应为染色体编号，每个S_n各对应X个数中的一个数值；将Z个数均等分布在N个稀释容器中，其中Z、X为自然数，Z不小于X；重复步骤b)T次；

c)计算步骤b)T次模拟实验中，每次模拟实验后各稀释容器中对应的数字，记录为对应染色体的种类和数量；

d)将所有模拟实验步骤c)所得的数据进行统计学分析，获得如下PHC、及P1～P3四个参数：1)处于同一个稀释容器中的同源染色体的数量，记为PHC；2)将所有同源染色体完全分开的实验的频率，记为P1；3)只含有1条染色体的稀释容器的频率，记为P2；4)完全不含染色体的稀释容器的频率，记为P3；综合四个参数评估出总共所需要的稀释容器的最佳数目Q，其中，Q为不大于N的自然数。

S02)进行验证实验

获得待分析物种分裂中期至中后期任一阶段的单细胞，取全部染色体，采用梯度稀释法将全部染色体稀释到Q个稀释容器中，获得至少有1个为仅含有单染色体的稀释容器。

2.如权利要求1所述的单染色分离方法，其特征在于，所述步骤S01)中的步骤b)之前还包括：确定Z和T值。

3.如权利要求1所述的单染色分离方法，其特征在于，所述步骤S01)中的步骤b)中，Z为2ⁿ，n＝6～16。

4.如权利要求1所述的单染色分离方法，其特征在于，所述步骤S01)中的步骤b)中，N为4-256中任一自然数。

5.如权利要求1所述的单染色分离方法，其特征在于，所述步骤S02)中，梯度稀释法对染色体进行稀释的步骤包括：

1)将Q或者R进行因式分解，得Y＝y*2ⁿ，其中，Y＝R或Q，n为自然数，R＝Q±2k，k、R为自然数；

2)取1个稀释容器，在稀释容器中先后加入细胞裂解液和1个单细胞，孵育，得细胞悬液，总体积为V₁；

3)将步骤2)所得细胞悬液等体积分配在y个稀释容器中，并在每个稀释容器中补足超纯水至体积为V₁，并混匀；

4)将步骤3)中每个稀释容器中溶液的一半分别置于新的稀释容器中，得y*2个稀释容器，并在每个稀释容器补足超纯水至体积为V₁，并混匀；

5)重复步骤4)共n次，最后获得Y个含有细胞悬液的稀释容器；在Y稀释容器中，至少有1个为仅含有单染色体的稀释容器。

6.如权利要求5所述的单染色分离方法，其特征在于，所述步骤S02)中的步骤1)中，所述Y＝8、16、24和32中的至少1种。

7.一种单染色体高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求1所得的单染色体进行扩增，得到单染色体高通量测序文库。

8.如权利要求7所述的单染色体高通量测序文库的构建方法，其特征在于，对单染色体高通量测序文库进行高通量测序，并对测序结果进行生物信息学分析，获得各稀释容器中的单染色体的种类和数量，以及所有单染色体的序列信息。

9.一种采用稀释法对染色体进行分离获得单个的染色体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将Q或者R进行因式分解，得Y＝y*2ⁿ，其中，Y＝R或Q，n为自然数，R＝Q±2k，k、R为自然数；

2)取1个稀释容器，在稀释容器中先后加入细胞裂解液和1个单细胞，孵育，得细胞悬液，总体积为V₁；

3)将步骤2)所得细胞悬液等体积分配在y个稀释容器中，并在每个稀释容器中补足超纯水至体积为V₁，并混匀；

4)将步骤3)中每个稀释容器中溶液的一半分别置于新的稀释容器中，得y*2个稀释容器，并在每个稀释容器补足超纯水至体积为V₁，并混匀；

5)重复步骤4)共n次，最后获得Y个含有细胞悬液的稀释容器；在Y稀释容器中，至少有1个为仅含有单染色体的稀释容器。

10.如权利要求1所述的单染色分离方法、如权利要求7所述的单染色体高通量测序文库的构建方法或如权利要求9所述的采用稀释法对染色体进行分离获得单个的染色体的方法在单倍型测序中的应用。

11.一种模拟单染色分离的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a)待分析物种染色体数记为X，并分别编号为S_n，n＝1-X，n和X为自然数；

b)在1-Z个数中随机产生X个数；将X个数分别对应为染色体编号，每个S_n各对应X个数中的一个数值；将Z个数均等分布在N个稀释容器中，其中Z、X为自然数，Z不小于X；重复步骤b)T次；

c)计算步骤b)T次模拟实验中，每次模拟实验后各稀释容器中对应的数字，记录为对应染色体的种类和数量；

d)将所有模拟实验步骤c)所得的数据进行统计学分析，获得如下PHC、及P1～P3四个参数：1)处于同一个稀释容器中的同源染色体的数量，记为PHC；2)将所有同源染色体完全分开的实验的频率，记为P1；3)只含有1条染色体的稀释容器的频率，记为P2；4)完全不含染色体的稀释容器的频率，记为P3；综合四个参数评估出总共所需要的稀释容器的最佳数目Q，其中，Q为不大于N的自然数。