CN113416770A - 一种染色体结构变异断点的定位方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测技术领域,特别是涉及一种染色体结构变异断点的定位方法,所述方法包括如下步骤:1)利用光学图谱平台获得待测染色体结构变异信息,所述染色体结构变异信息包括染色体结构变异类型、断点区域、断点区域上下游染色体片段的正常来源染色体;2)根据所述染色体结构变异类型,分别以正常来源染色体的DNA为模板设计用于扩增所述断点区域的扩增引物对以及验证引物;3)利用步骤2)获得的扩增引物对PCR扩增待测染色体后进行测序,从而定位染色体结构变异断点。本发明的染色体结构变异断点的定位方法可将断点精确至bp级别,成本低、周期短、准确度高、效率高,且易于推广,是染色体结构变异断点精确定位的有效方法。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,特别是涉及一种染色体结构变异断点的定位方法及装置。
背景技术
染色体结构变异是指染色体发生了结构上的改变,包括较长片段的插入或者缺失、串联重复、倒位、易位、拷贝数变异。据统计,每个人类基因组都有超过2万个结构变异,可能导致的疾病已经超过1000种,特别是对原因未明的癌症和遗传病寻找新的致病机制有重要意义。
染色体发生结构变异会在基因序列上产生断裂点,对断裂点所在染色体的位置的精确定位可以直接确定结构变异是否对某一基因产生影响,从而与临床表型结合,辅助临床上疾病的诊断。因此意义重大。目前结构变异的检测方法主要有核型分析、荧光原位杂交、二代测序、光学图谱等技术,这些技术均无法直接给出可靠的断裂点所在染色体的精确定位。核型分析只能检测Mb级别的部分结构变异;荧光原位杂交分辨率稍高,但仍只达到kb级别,并且需要针对特定结构变异断点设计探针。二代测序由于测序读长短的限制,检测结构变异需要依赖于复杂的生信算法,且无法准确检出高GC、低复杂度的区域发生的结构变异,对测序深度也有较高的要求,并且容易产生假阳性和假阴性。光学图谱技术是目前比较好的用于结构变异检测的平台,其通过针对特异序列的荧光标记可以检测绝大部分结构变异类型(不包括罗伯逊易位),但是受限于标记的不均一和检测分辨率,虽然检测分辨率达到500bp,仍无法获得精确的断裂点信息,特别是当遇到低复杂度的区域,检测到的断裂点位置可能会和实际断裂点位置产生较大的误差,而且平台本身不能得到核酸序列。因此需要一种检测方法可以在现有的技术平台上实现对染色体发生结构变异后所产生的断裂点做出精确定位,将结构变异断点检测精度提高至单个碱基级别,直接确定断裂点是否影响其所在位置上的基因的完整性或基因的调控区域等,从而将结构变异与临床表型结合,提高基因检测的阳性率和临床上疾病的确诊率,有效辅助疾病诊断。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种染色体结构变异断点的定位方法及装置,用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明提供一种染色体结构变异断点的定位方法,所述方法包括如下步骤:
1)利用光学图谱平台获得待测染色体的染色体结构变异信息,所述染色体结构变异信息包括染色体结构变异类型、断点区域、断点区域上下游染色体的正常来源染色体;
2)根据所述染色体结构变异类型,分别以正常来源染色体的DNA为模板设计用于扩增所述断点区域的扩增引物对以及验证引物;
3)利用步骤2)获得的扩增引物对PCR扩增待测染色体后进行测序,从而定位染色体结构变异断点。
本发明还提供一种染色体结构变异断点定位装置,所述染色体结构变异断点定位装置包括:
染色体结构变异信息获取模块,用于获取光学图谱平台检测出的待测染色体的染色体结构变异信息,所述染色体结构变异信息包括染色体结构变异类型、断点区域、断点区域上下游染色体片段的正常来源染色体;
扩增引物对以及验证引物设计模块,用于根据所述染色体结构变异类型,分别以正常来源染色体的DNA为模板设计用于扩增所述断点区域的扩增引物对以及验证引物;
断点扩增和建库模块,用于根据扩增引物对PCR扩增待测染色体,并利用扩增产物构建测序文库;
断点定位模块,用于根据断点扩增和建库模块的测序数据定位染色体结构变异断点。
本发明还提供了一种存储介质,所述存储介质上存储有计算机程序,所述计算机程序被计算机执行时实现所述染色体结构变异断点的定位方法。
本发明还提供了一种服务终端,所述服务终端包括处理器和存储器;所述存储器用于存储计算机程序,所述处理器用于执行所述存储器存储的计算机程序,以使所述服务终端执行时实现所述染色体结构变异断点的定位方法。
如上所述,本发明的一种染色体结构变异断点的定位方法及装置,具有以下有益效果:利用光学图谱平台获得变异信息,根据不同的变异类型,在断点区域设计相适应的PCR引物对,利用优化的长片段扩增体系,扩增出长达20-40kb的光学图谱无法识别区域,将PCR产物进行二代测序能获得断点的精确位置。本发明所采用的方法只需通过PCR和二代测序即可将断点精确至bp级别,具有成本低,周期短、准确度高、效率高等优点,且测序平台普及度高,易于推广,是染色体结构变异断点精确定位的有效方法。
附图说明
图1显示为本发明的染色体结构变异断点的定位方法流程图,左图为详细的步骤图,右图为精简的流程图。
图2显示为光学图谱平台的染色体结构变异信息示例图。
图3显示为染色体发生的不同易位情况,以及相应易位情况下引物的设计方法。
图4显示为染色体发生的不同缺失情况,以及相应易位情况下引物的设计方法。
图5显示为光学图谱平台得到的2号染色体和20号染色体发生相互易位的一个样本结果。
图6显示为图5显示的两种易位情况的引物对的设计区域。
图7显示为使用分析软件IGV验证本发明的方法获得的2号染色体上的断点1是否正确的结果。
图8显示为使用分析软件IGV验证本发明的方法获得的20号染色体上的断点1是否正确的结果。
图9显示为使用分析软件IGV验证本发明的方法获得的2号染色体上的断点2是否正确的结果。
图10显示为使用分析软件IGV验证本发明的方法获得的20号染色体上的断点2是否正确的结果。
图11显示为一代测序验证本发明的方法获得的断点1是否正确的结果。
图12显示为一代测序验证本发明的方法获得的断点2是否正确的结果。
图13显示为本发明的染色体结构变异断点定位装置的结构示意图。
图14显示为本发明的服务终端的示意图。
具体实施方式
发生结构变异后形成的染色体称为异常染色体(或者称为mapping片段),异常染色体的序列称为异常序列。待测的异常染色体称为待测染色体。
异常染色体发生结构变异前的染色体称为正常来源染色体(或者称为比对染色体),正常来源染色体的序列称为正常参考序列。
断点指的是染色体上发生断裂的位置。
荧光标记断点为光学图谱平台中荧光标记的离断点最近的点。
断点区域是指待测染色体上断点所在的光学图谱平台无法识别区域。
上游荧光标记断点即光学图谱平台中给出的断点区域的上游端点。下游荧光标记断点即光学图谱平台中给出的断点区域的下游端点。
本发明首先提供一种染色体结构变异断点的定位方法,如图1右图所示,所述方法包括如下步骤:
1)利用光学图谱平台获得染色体结构变异信息,所述染色体结构变异信息包括染色体结构变异类型、断点区域、断点区域上下游染色体的正常来源染色体;
2)根据步骤1)获得的染色体结构变异信息,分别以正常来源染色体的DNA为模板设计用于扩增所述断点所在的光学图谱平台无法识别区域(简称为断点区域)的扩增引物对以及验证引物;
3)利用步骤2)获得的扩增引物对PCR扩增后进行测序,从而定位染色体结构变异断点。
所述染色体结构变异选自插入、缺失、倒位、易位或拷贝数变异。片段的缺失一般是指在50bp以上的缺失。本申请中的染色体易位选自单向易位或相互易位。
图2为光学图谱平台提供的某一染色体结构易位的信息的示例。中间的片段为光学图谱平台根据荧光标记拼接成的异常染色体(待测染色体)的异常序列。图中的每一条竖线为一个荧光标记的点,根据荧光标记比对异常染色体与上下两条正常来源染色体的正常参考序列,将异常染色体上的点分别对应到上下两条不同正常来源染色体的片段上的点。片段上会标记染色体的坐标位置用于指示结构变异所发生的位置,同时也提示染色体的方向,坐标的方向会根据实际情况向左或向右,即向染色体的上游或下游。中间的深色区域即为断点所在的光学图谱平台无法识别的区域(即断点区域),该区域的长度在不同情况下会有差异,平台会提供该区域的长度信息,从几kb到几十kb都有可能,这也是光学图谱平台无法精确定位断点的原因。
步骤2)中当染色体结构变异类型为染色体易位时,或当染色体结构变异类型为插入,且插入片段的正常来源染色体与被插入的染色体为不同染色体时,以待测染色体对应的两条正常来源染色体的DNA为模板设计扩增引物对。当染色体结构变异类型为插入,且插入片段的正常来源染色体与被插入的染色体为同一条染色体、缺失或倒位时,以存在插入、缺失或倒位的异常染色体对应的正常来源染色体的DNA为模板设计扩增引物对。本发明所指的插入均为单片段的插入,单片段的插入包括两种情况:a)插入片段的正常来源染色体与被插入的染色体为不同染色体;b)插入片段的正常来源染色体与被插入的染色体为同一条染色体。
步骤2)中当染色体结构变异类型为染色体易位时,扩增引物对包括:以待测染色体上的断点区域上游染色体片段(即mapping片段上断点区域左端的染色体片段)对应的上游正常来源染色体为模板,获得可扩增上游正常来源染色体中对应断点区域片段的第一引物对,以所述第一引物对中近断点区域上游端点(上游荧光标记断点)的引物为第一扩增引物,另一引物为第一验证引物;以待测染色体上断点区域下游染色体对应的下游正常来源染色体为模板,获得可扩增下游正常来源染色体中对应断点区域片段的第二引物对,以所述第二引物对中近断点区域下游端点(下游荧光标记断点)的引物为第二扩增引物,另一引物为第二验证引物;其中,第一扩增引物与第二扩增引物组合成所述扩增引物对。
如图3所示,相互易位分为不同情况:易位情况1、易位情况2、易位情况3、易位情况4具体解释如何设计扩增引物对以及验证引物。图3中,正常来源染色体中实线部分即为组成异常染色体的片段。正常来源染色体上的箭头代表了染色体片段中的DNA 5’端到3’端的方向,即染色体的坐标位置递增的方向,将染色体坐标数值较小的一端即图中左端称为染色体的上游,将染色体坐标数值较大的一端即图中右端称为染色体的下游。异常染色体(mapping片段)上黑色区域为断点区域,为图示方便,无论断点区域多长,图上均以相同的黑色区域的长度代表;断点区域所在的片段为mapping片段(或称异常染色体),由于染色体在发生易位后,来自不同正常来源染色体的片段发生重组,它们的片段方向可能是一致的或者不一致的,为了表示方便,所以将mapping片段视为一个整体来定义mapping片段的方向,图中将mapping片段左端定义为上游,右端定义为下游。以上描述中,所述的染色的方向是由光学图谱平台给出的。根据如图3所示的不同相互易位情况具体解释如何设计扩增引物对以及验证引物:
在发生易位情况1的实施方式中,即步骤1)获得的染色体结构变异信息为:异常染色体上断点区域上下游染色体的片段(即断点区域两端的片段)的方向与两条正常来源染色体A和B的方向均一致。断点区域上游染色体片段对应的上游正常来源染色体为正常来源染色体B,以正常来源染色体B为模板,获得可扩增正常来源染色体B中对应断点区域片段的第一引物对B-F1和B-R1;第一引物对B-F1和B-R1中,B-F1为近断点区域上游端点的引物,所以其为第一扩增引物,另一引物B-R1为第一验证引物。断点区域下游染色体片段对应的下游正常来源染色体片段为正常来源染色体A,以正常来源染色体A为模板,获得可扩增正常来源染色体A中对应断点区域片段的第二引物对A-F1和A-R1,第二引物对A-F1和A-R1中,A-R1为近断点区域下游端点的引物,所以其为第二扩增引物,另一引物A-F1为第二验证引物。所以,第一扩增引物B-F1与第二扩增引物A-R1组合成所述扩增引物对。
在发生易位情况2的实施方式中,即步骤1)获得的染色体结构变异信息为:两条正常来源染色体A和B方向一致,异常染色体上断点区域上下游染色体的片段相一致,且和两条正常来源染色体A和B的方向均相反。断点区域上游染色体片段对应的上游正常来源染色体为正常来源染色体A,以正常来源染色体A为模板,获得可扩增正常来源染色体A中对应断点区域片段的第一引物对A-F1和A-R1;第一引物对A-F1和A-R1中,A-F1为近断点区域上游端点的引物,所以其为第一扩增引物,另一引物A-R1为第一验证引物。断点区域下游染色体片段对应的下游正常来源染色体为正常来源染色体B,以正常来源染色体B为模板,获得可扩增正常来源染色体B中对应断点区域片段的第二引物对B-F1和B-R1,第二引物对B-F1和B-R1中,B-R1为近断点区域下游端点的引物,所以其为第二扩增引物,另一引物B-F1为第二验证引物。所以,第一扩增引物A-F1与第二扩增引物B-R1组合成所述扩增引物对。
在发生易位情况3的实施方式中,即步骤1)获得的染色体结构变异信息为:两条正常来源染色体A和B方向相向,异常染色体上断点区域上下游染色体的片段也相向。断点区域上游染色体片段对应的上游正常来源染色体为正常来源染色体A,以正常来源染色体A为模板,获得可扩增正常来源染色体A中对应断点区域片段的第一引物对A-F1和A-R1;第一引物对A-F1和A-R1中,A-F1为近断点区域上游端点的引物,所以其为第一扩增引物,另一引物A-R1为第一验证引物。断点区域下游染色体片段对应的下游正常来源染色体为正常来源染色体B,以正常来源染色体B为模板,获得可扩增正常来源染色体B中对应断点区域片段的第二引物对B-F1和B-R1,第二引物对B-F1和B-R1中,B-F1为近断点区域下游端点的引物,所以其为第二扩增引物,另一引物B-R1为第二验证引物。所以,第一扩增引物A-F1与第二扩增引物B-F1组合成所述扩增引物对。
在发生易位情况4的实施方式中,即步骤1)获得的染色体结构变异信息为:两条正常来源染色体A和B方向相反,异常染色体上断点区域上下游染色体的片段也相反。断点区域上游染色体片段对应的上游正常来源染色体为正常来源染色体A,以正常来源染色体A为模板,获得可扩增正常来源染色体A中对应断点区域片段的第一引物对A-F1和A-R1;第一引物对A-F1和A-R1中,A-R1为近断点区域上游端点的引物,所以其为第一扩增引物,另一引物A-F1为第一验证引物。断点区域下游染色体片段对应的下游正常来源染色体为正常来源染色体B,以正常来源染色体B为模板,获得可扩增正常来源染色体B中对应断点区域片段的第二引物对B-F1和B-R1,第二引物对B-F1和B-R1中,B-R1为近断点区域下游端点的引物,所以其为第二扩增引物,另一引物B-F1为第二验证引物。所以,第一扩增引物A-R1与第二扩增引物B-R1组合成所述扩增引物对。
由于发生易位情况3和易位情况4后,异常染色体上断点区域两端的片段方向不同,所以这两种易位情况下对于组成扩增引物对的两条引物不能向普通引物对一样分别将两条引物命名为上游引物或下游引物,所以本申请中统一将扩增引物对中的各引物的名称命名为“第一扩增引物”、“第二扩增引物”。
简而言之,步骤2)中在染色体结构发生易位情况下设计引物对时,分别以两条正常来源染色体为模板各设计至少一对引物对,再从中选择两条引物作为扩增引物对。亦即,以两条正常来源染色体分别为模板至少共设计两对引物对,在这两对引物对中分别选择一条引物组成扩增引物对。设计未被选中的引物(即验证引物)的目的是为了在NICBI等数据库中blast验证扩增引物对的特异性。
步骤2)中在染色体结构变异类型为缺失时,具体的引物对设计方法为:扩增引物对包括:以断点区域上下游染色体的片段为模板,获得可扩增断点区域的多对引物对,以所述引物对中近断点区域的引物组成扩增引物对。
染色体结构缺失分为如图4所示的缺失情况1和缺失情况2,图4中的图例与图3中相同。不同的缺失情况设计扩增引物对的方法也不同,具体如下所述:
在发生缺失情况1的实施方式中,即步骤1)获得的染色体结构变异信息为:异常染色体上断点区域上下游染色体的片段的方向与正常来源染色体的方向一致。以断点区域上下游的染色体片段为模板,获得可扩增断点区域的F1、R1和F2、R2,其中近断点区域的引物F2、R1组成扩增引物对。
在发生缺失情况2的实施方式中,即步骤1)获得的染色体结构变异信息为:异常染色体上断点区域上下游染色体的片段与正常来源染色体的方向均相反。以断点区域上下游的染色体片段为模板,获得可扩增断点区域的F1、R1和F2、R2,其中近断点区域的引物F1、R2组成扩增引物对。
在一较佳实施方式中,步骤2)中在染色体结构发生缺失情况下设计引物对时,以正常来源染色体为模板设计至少两对引物对,再从中选择两条引物作为扩增引物对。设计未被选中的引物(即验证引物)的目的是为了在NCBI等数据库中blast验证扩增引物对的特异性。具体的,设计未被选中的引物(即验证引物)是为了服务于扩增引物对,因为不同扩增长度下引物设计条件也不同,染色体缺失后,染色体的长度发生变化,如果用扩增引物对进行blast,那么扩增引物对的blast结果会显示扩增长度远长于实际扩增长度。另外,由于考虑到扩增长度对引物设计影响的问题,光学图谱平台给出的两个坐标在染色体上相隔是比较远的,但是因为染色体发生了缺失,这两个坐标会靠得更近,所以需要按照中间mapping片段的长度去设计扩增引物对。
当染色体结构变异类型为倒位时,可视为染色体结构变异类型为缺失,例如2号染色体上坐标为200~300的片段发生倒位,倒位后染色体坐标即为100、101……199、300、299……201、200、301……400、401,此时即可认为坐标199至300之间发生了坐标200-299片段的缺失,同理,在坐标200至301之间发生了坐标201-300片段的缺失,然后再按照缺失的染色体结构变异断点的定位方法定位即可。
步骤2)中选择近荧光标记断点的引物的原因是PCR扩增的难度随着扩增长度的增加而增加,所以引物设计的位置应尽量靠近系统提示的断点区域。
当光学图谱平台提供的断点区域长度太长,导致很难实现长片段扩增的时候,可以在设计引物时将任一条引物的起始点提前到断点区域,从而人为的将断点区域缩短以达到缩短mapping片段长度的目的,从而产生两个较短的mapping片段,更改的幅度以实现PCR扩增的目的为准,用这种方法设计扩增引物对,若成功扩增则直接进行后续实验,若扩增不成功,则认为断点在另一条正常来源染色体上,再以另一条正常来源染色体的DNA为模板设计引物即可。
本申请中所述的“起始点”是指距荧光标记断点0~50个bp的点。
本申请中扩增引物对和验证引物的除遵循上述方法设计外,还应当满足以下条件:当扩增的长度≥10kb,设计的引物Tm值68-71℃;当扩增的长度<10kb,设计引物的Tm值64-66℃。
本申请选择在发生易位结构变异的两条正常来源染色体上分别设计一对引物,两对引物对分别位于各自的正常来源染色体上,扩增长度约等于断点所在的光学图谱平台无法识别的区域的长度,最后再从两个引物对中各挑出其中一条作为扩增引物对的技术方案可以解决以下问题:由于染色体发生易位,两条引物分别来源于不同的正常来源染色体上,导致的无法直接使用NCBI等数据库进行blast来验证引物的特异性的问题。以及当发生缺失时,虽然两条引物来源于同一染色体上,但因片段缺失会导致扩增产物更短,若直接blast,只能得到缺失前的blast结果,长度会远远超过实际扩增长度,可能得不到blast结果,因此无法直接使用NCBI等数据库进行blast。
在一种实施方式中,在通过验证引物对的blast之后,再增加扩增引物对的blast。扩增引物对的blast可以保证没有意料之外的扩增产物。
在一种实施方式中,步骤3)中的测序为二代测序。所述二代测序的测序平台可以选自本领域熟知的测序平台,例如华大基因的MGISEQ-T7测序平台、illumina的MiSeq测序平台、NextSeq测序平台等。
在一种实施方式中,步骤3)中可以使用现有的分析软件分析测序数据,进而定位染色体结构变异断点。分析软件例如为DELLY。
本发明还提供一种染色体结构变异断点定位装置,如图13所示,包括:
染色体结构变异信息获取模块,用于获取光学图谱平台检测出的待测染色体的染色体结构变异信息,所述染色体结构变异信息包括染色体结构变异类型、断点区域、断点区域上下游染色体片段的正常来源染色体;
扩增引物对以及验证引物设计模块,用于根据所述染色体结构变异类型,分别以正常来源染色体的DNA为模板设计用于扩增所述断点区域的扩增引物对以及验证引物;
断点扩增和建库模块,用于根据扩增引物对PCR扩增待测染色体,并利用扩增产物构建测序文库;
断点定位模块,用于根据断点扩增和建库模块的测序数据定位染色体结构变异断点。
所述染色体结构变异选自插入、缺失、倒位、易位或拷贝数变异,所述易位选自单向易位或相互易位。
当染色体结构变异类型为染色体易位时,或当染色体结构变异类型为插入,且插入片段的正常来源染色体与被插入的染色体为不同染色体时,扩增引物对以及验证引物设计模块以待测染色体对应的两条正常来源染色体的DNA为模板设计扩增引物对;当染色体结构变异类型为插入,且插入片段的正常来源染色体与被插入的染色体为同一条染色体、缺失或倒位时,扩增引物对以及验证引物设计模块以发生缺失的染色体对应的正常来源染色体的DNA为模板设计扩增引物对。
具体的,当染色体结构变异类型为染色体易位时,扩增引物对以及验证引物设计模块按照下述方法设计扩增引物对以及验证引物:以断点区域上游染色体片段对应的上游正常来源染色体为模板,获得可扩增上游正常来源染色体中对应断点区域片段的第一引物对,以所述第一引物对中近断点区域上游端点的引物为第一扩增引物,另一引物为第一验证引物;以断点区域下游染色体片段对应的下游正常来源染色体为模板,获得可扩增下游正常来源染色体中对应断点区域片段的第二引物对,以所述第二引物对中近断点区域下游端点的引物为第二扩增引物,另一引物为第二验证引物;其中,第一扩增引物与第二扩增引物组合成所述扩增引物对。
当染色体结构变异类型为缺失时,扩增引物对以及验证引物设计模块按照下述方法设计扩增引物对:以断点区域上下游的染色体片段为模板,获得可扩增断点区域的多对引物对,以所述引物对中近断点区域的引物组成扩增引物对。
当染色体结构变异类型为插入,且插入片段的正常来源染色体与被插入的染色体为同一条染色体,或染色体结构变异类型为倒位时,扩增引物对以及验证引物设计模块将染色体结构变异类型视为缺失。
在一种实施方式中,断点定位模块中使用的测序数据为二代测序的数据。所述二代测序的测序平台可以选自本领域熟知的测序平台,例如华大基因的MGISEQ-T7测序平台、illumina的Miseq测序平台、Nextseq测序平台等。
在一种实施方式中,断点定位模块中定位染色体结构变异断点可以使用现有的分析软件或将现有的分析软件嵌入断点定位模块中。分析软件例如为DELLY。
本发明还提供了一种存储介质,所述存储介质上存储有计算机程序,所述计算机程序被计算机执行时实现所述染色体结构变异断点的定位方法。
进一步的,所述存储介质包括:ROM、RAM、磁碟、U盘、存储卡或者光盘等各种可以存储程序代码的介质。
如图14所示,本发明还提供了一种服务终端,所述服务终端包括处理器和存储器;所述存储器用于存储计算机程序,所述处理器用于执行所述存储器存储的计算机程序,以使所述服务终端执行时实现所述染色体结构变异断点的定位方法。
所述存储器用于存储计算机程序。优选地,所述存储器包括:ROM、RAM、磁碟、U盘、存储卡或者光盘等各种可以存储程序代码的介质。
所述处理器与所述存储器相连,用于执行所述存储器存储的计算机程序,以使所述服务终端执行上述的设计方法。
优选地,所述处理器可以是通用处理器,包括中央处理器(Central ProcessingUnit,简称CPU)、网络处理器(Network Processor,简称NP)等;还可以是数字信号处理器(Digital Signal Processor,简称DSP)、专用集成电路(Application SpecificIntegrated Circuit,简称ASIC)、现场可编程门阵列(Field Programmable Gate Array,简称FPGA)或者其他可编程逻辑器件、分立门或者晶体管逻辑器件、分立硬件组件。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例
1.光学图谱平台检测
已知一个样本的光学图谱平台检测结果显示2号染色体和20号染色体发生相互易位,结果如图5所示。图中断点1的两条正常来源染色体方向一致,mapping片段和正常来源染色体方向相反,属于易位情况2;断点2的两条正常来源染色体方向一致,mapping片段和正常来源染色体方向相同,属于易位情况1;
图中a、b、b、d表示为荧光标记的离断点最近的点(即荧光标记断点),它们在染色体上的坐标如下:
2.引物设计
根据易位情况2下的引物设计原则设计引物用于扩增断点1,根据易位情况1下的引物设计原则设计引物用于扩增断点2。
引物设计的位置如图6所示,设计的引物信息如下表:
断点1选择2-F1和20-R1作为扩增引物对,断点2选择20-F2和2-R2作为扩增引物对,引物合成公司为上海擎科生物科技有限公司。
3.PCR扩增和二代测序建库
3.1PCR扩增
扩增所用试剂:Takara公司LA Taq Hot Start Version,货号:RR042Q。
反应体系如下:
成分 | 体积 |
DNA | Xμl(100ng) |
10×buffer | 5μl |
LA | 0.5μl |
dNTP(2.5mM) | 8μl |
引物 | 1μl |
水 | xμl |
total | 50μl |
反应条件如下:
3.2扩增产物二代测序建库
建库所用试剂:翊圣生物科技(上海)有限公司Hieff NGS OnePot DNA LibraryPrep Kit for Illumina,货号:12203ES96。
PCR产物片段化/末端修复/dA尾添加反应体系如下:
成分 | 体积 |
PCR产物 | Xμl(100ng) |
Smearase Mix | 10μl |
水 | Up to 60μl |
反应程序如下:
温度 | 时间 |
4℃ | 1min |
30℃ | 10min |
72℃ | 20min |
4℃ | ∞ |
反应结束后继续进行连接反应,反应体系如下:
成分 | 体积 |
上一步反应产物 | 60μl |
Ligation Enhancer | 30μl |
Fast T4 DNA Ligase | 5μl |
DNA Adapter | 5μl |
Total | 100μl |
反应条件如下:
温度 | 时间 |
20℃ | 15min |
4℃ | ∞ |
反应结束后进行纯化,实验步骤如下:
(1)将纯化磁珠从冰箱取出,室温平衡30min,充分震荡混匀;
(2)吸取60μl磁珠至接头连接产物所在PCR管中,用移液器吹打混匀,室温孵育5min;(3)将PCR管置于磁力架上,静置直至溶液澄清,用移液器小心吸弃上清;
(4)保持PCR管在磁力架上,加入200μl新鲜配制的80%乙醇洗涤磁珠,用移液器吸弃上清;
(5)重复步骤(4)一次;
(6)保持PCR管在磁力架上,静置干燥磁珠至无酒精液体残留;
(7)加入100μl水重悬浮磁珠,用移液器吹打混匀;
(8)加入70μl磁珠至重悬浮后的磁珠液中,用移液器吹打混匀,室温孵育5min;
(9)将PCR管置于磁力架上,静置直至溶液澄清,用移液器小心吸取上清至新的离心管中;
(10)加入20μl磁珠,用移液器吹打混匀,室温孵育5min;
(11)将PCR管置于磁力架上,静置直至溶液澄清,用移液器小心吸弃上清;
(12)保持PCR管在磁力架上,加入200μl新鲜配制的80%乙醇洗涤磁珠,用移液器吸弃上清;
(13)重复步骤(12)一次;
(14)保持PCR管在磁力架上,静置干燥磁珠至无酒精液体残留;
(15)加入20μl水重悬浮磁珠,用移液器吹打混匀;
磁珠纯化后继续进行PCR扩增反应,反应体系如下:
成分 | 体积 |
磁珠纯化产物 | 20μl |
2×Super Canace II High-Fidelity Mix | 25μl |
Primer Mix | 5μl |
Total | 50μl |
反应条件如下:
反应结束后继续进行磁珠纯化,实验步骤如下:
(1)将纯化磁珠从冰箱取出,室温平衡30min,充分震荡混匀;
(2)吸取45μl磁珠至接头连接产物所在PCR管中,用移液器吹打混匀,室温孵育5min;
(3)将PCR管置于磁力架上,静置直至溶液澄清,用移液器小心吸弃上清;
(4)保持PCR管在磁力架上,加入200μl新鲜配制的80%乙醇洗涤磁珠,用移液器吸弃上清;
(5)重复步骤(4)一次;
(6)保持PCR管在磁力架上,静置干燥磁珠至无酒精液体残留;
(7)加入30μl水重悬浮磁珠,用移液器吹打混匀,室温孵育2min;
(8)将PCR管置于磁力架上,静置直至溶液澄清,用移液器吸取上清至新的离心管,获得最终文库。
4.二代测序获得精确断点
使用华大的MGISEQ-T7测序平台对文库进行测序,测序模式为PE100,每个样本的测序数据量为100Mb。
使用分析软件DELLY对测序数据进行分析,寻找同一条测序序列上比对到不同染色体上的情况,验证断点的精确位置,最终获得的断点信息如下:
使用分析软件IGV对测序数据进行分析,输入断点1的二号染色体的断点坐标,结果如图7所示,发现测序覆盖度发生明显变化,证明二代测序推测的断点正确;
使用分析软件IGV对测序数据进行分析,输入断点1的20号染色体的断点坐标,结果如图8所示,发现测序覆盖度发生明显变化,证明二代测序推测的断点正确;
使用分析软件IGV对测序数据进行分析,输入断点2的2号染色体的断点坐标,结果如图9所示,发现测序覆盖度发生明显变化,证明二代测序推测的断点正确;
使用分析软件IGV对测序数据进行分析,输入断点2的20号染色体的断点坐标,结果如图10所示,发现测序覆盖度发生明显变化,证明二代测序推测的断点正确;
5.一代测序验证检测结果
5.1引物设计
一代测序的引物设计原则和二代测序的引物设计原则相同,由于已经获得了断点的精确位置,所以无需考虑mapping片段上未确认区域的长度,只需扩增出适合一代测序的长度即可。引物设计结果如下:
5.2PCR扩增
使用南京诺维赞生物科技股份有限公司的2×Taq Plus Master Mix,货号:P211-01。反应体系如下:
成分 | 体积 |
DNA | Xμl(50ng) |
2×Taq Plus Master Mix | 10μl |
引物 | 1μl |
水 | Up to 20μl |
反应条件如下:
5.3一代测序
断点1的测序结果如图11所示。断点2的测序结果如图12所示。通过对比正常参考序列的坐标,获得断点的精确位置如下:
最后将所有数据汇总如下:
可以看到,一代测序和二代测序的结果一致,其中断点1的2号染色体断点所在位置存在G碱基重复,所以造成2bp的误差。
由此可见,光学图谱平台作为检测结构变异的专业平台,其检测精度仍存在较大误差,这个误差导致无法将断点精确定位到染色体上,从而影响最终的分析。本发明所采用的方法只需通过PCR和二代测序即可将断点精确至bp级别,具有成本低,效率高等优点,且测序平台普及度高,易于推广,是染色体结构变异断点精确定位的有效方法。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案,并不能理解为对本发明的限制。此外,本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化,在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述,但应当理解,本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上,各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (12)
1.一种染色体结构变异断点的定位方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
1)利用光学图谱平台获得待测染色体的染色体结构变异信息,所述染色体结构变异信息包括染色体结构变异类型、断点区域、断点区域上下游染色体片段的正常来源染色体;
2)根据所述染色体结构变异类型,分别以正常来源染色体的DNA为模板设计用于扩增所述断点区域的扩增引物对以及验证引物;
3)利用步骤2)获得的扩增引物对PCR扩增待测染色体后进行测序,从而定位染色体结构变异断点。
2.根据权利要求1所述的定位方法,其特征在于,所述染色体结构变异选自插入、缺失、倒位、易位或拷贝数变异,所述易位选自单向易位或相互易位。
3.根据权利要求1所述的定位方法,其特征在于,步骤2)中当染色体结构变异类型为染色体易位时,以待测染色体对应的两条正常来源染色体的DNA为模板设计扩增引物对;当染色体结构变异类型为插入、缺失或倒位时,以发生插入、缺失或倒位的染色体对应的正常来源染色体的DNA为模板设计扩增引物对。
4.根据权利要求3所述的定位方法,其特征在于,步骤2)中当染色体结构变异类型为染色体易位时,或,当染色体结构变异类型为插入,且插入片段的正常来源染色体与被插入的染色体为不同染色体时:以断点区域上游染色体片段对应的上游正常来源染色体为模板,获得可扩增上游正常来源染色体中对应断点区域片段的第一引物对,以所述第一引物对中近断点区域上游端点的引物为第一扩增引物,另一引物为第一验证引物;以断点区域下游染色体片段对应的下游正常来源染色体为模板,获得可扩增下游正常来源染色体中对应断点区域片段的第二引物对,以所述第二引物对中近断点区域下游端点的引物为第二扩增引物,另一引物为第二验证引物;其中,第一扩增引物与第二扩增引物组合成所述扩增引物对。
5.根据权利要求3所述的定位方法,其特征在于,步骤2)中当染色体结构变异类型为以下中的一种或多种时:
a)当染色体结构变异类型为插入,且插入片段的正常来源染色体与被插入的染色体为同一条染色体时;
b)当染色体结构变异类型为缺失时;
c)当染色体结构变异类型为倒位时;
扩增引物对包括:以断点区域上下游的染色体片段为模板,获得可扩增断点区域的多对引物对,以所述引物对中近断点区域的引物组成扩增引物对。
6.一种染色体结构变异断点定位装置,其特征在于,所述染色体结构变异断点定位装置包括:
染色体结构变异信息获取模块,用于获取光学图谱平台检测出的待测染色体的染色体结构变异信息,所述染色体结构变异信息包括染色体结构变异类型、断点区域、断点区域上下游染色体片段的正常来源染色体;
扩增引物对以及验证引物设计模块,用于根据所述染色体结构变异类型,分别以正常来源染色体的DNA为模板设计用于扩增所述断点区域的扩增引物对以及验证引物;
断点扩增和建库模块,用于根据扩增引物对PCR扩增待测染色体,并利用扩增产物构建测序文库;
断点定位模块,用于根据断点扩增和建库模块的测序数据定位染色体结构变异断点。
7.根据权利要求6所述的染色体结构变异断点定位装置,其特征在于,所述染色体结构变异选自插入、缺失、倒位、易位或拷贝数变异,所述易位选自单向易位或相互易位。
8.根据权利要求6所述的染色体结构变异断点定位装置,其特征在于,所述扩增引物对以及验证引物设计模块中,当染色体结构变异类型为染色体易位时,以待测染色体对应的两条正常来源染色体的DNA为模板设计扩增引物对;当染色体结构变异类型为缺失时,以发生缺失的染色体对应的正常来源染色体的DNA为模板设计扩增引物对。
9.根据权利要求8所述的染色体结构变异断点定位装置,其特征在于,所述扩增引物对以及验证引物设计模块中,当染色体结构变异类型为染色体易位时,或,当染色体结构变异类型为插入,且插入片段的正常来源染色体与被插入的染色体为不同染色体时,按照下述方法设计扩增引物对以及验证引物:以断点区域上游染色体片段对应的上游正常来源染色体为模板,获得可扩增上游正常来源染色体中对应断点区域片段的第一引物对,以所述第一引物对中近断点区域上游端点的引物为第一扩增引物,另一引物为第一验证引物;以断点区域下游染色体片段对应的下游正常来源染色体为模板,获得可扩增下游正常来源染色体中对应断点区域片段的第二引物对,以所述第二引物对中近断点区域下游端点的引物为第二扩增引物,另一引物为第二验证引物;其中,第一扩增引物与第二扩增引物组合成所述扩增引物对。
10.根据权利要求8所述的染色体结构变异断点定位装置,其特征在于,所述扩增引物对以及验证引物设计模块中,当染色体结构变异类型为以下中的一种或多种时:
a)当染色体结构变异类型为插入,且插入片段的正常来源染色体与被插入的染色体为同一条染色体时;
b)当染色体结构变异类型为缺失时;
c)当染色体结构变异类型为倒位时;
按照下述方法设计扩增引物对:以断点区域上下游的染色体片段为模板,获得可扩增断点区域的多对引物对,以所述引物对中近断点区域的引物组成扩增引物对。
11.一种存储介质,所述存储介质上存储有计算机程序,其特征在于,所述计算机程序被计算机执行时实现权利要求1-5任一所述的染色体结构变异断点的定位方法。
12.一种服务终端,其特征在于,所述服务终端包括处理器和存储器;所述存储器用于存储计算机程序,所述处理器用于执行所述存储器存储的计算机程序,以使所述服务终端执行时实现权利要求1-5任一所述的染色体结构变异断点的定位方法。
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- 2021-05-28 CN CN202110593000.7A patent/CN113416770A/zh active Pending
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