CN109207588A - 高通量检测地中海贫血基因的5个突变位点的方法及其专用成套试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高通量检测地中海贫血基因的5个突变位点的方法及其专用成套试剂。成套试剂包括成套探针和成套引物。成套探针由序列11至序列19所示的11个探针组成。成套引物由序列1至序列10所示的10个引物组成。采用本发明提供的方法,可以快速实现对地中海贫血基因的5个突变位点突变类型的鉴定,并且特异性好、通量高、操作简单,准确率达到100%。本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于医学领域,具体涉及高通量检测地中海贫血基因的5个突变位点的方法及其专用成套试剂。
背景技术
地中海贫血(简称地贫)是常染色体隐性遗传病,主要是由珠蛋白基因发生点突变或缺失导致相应的珠蛋白合成量减少或完全缺失,从而引发的溶血性贫血的遗传性疾病,临床上以α、β地贫最常见。重型α地贫一般是死胎或胎儿水肿出生后即夭折,重型β地贫需要终生输血维持生命或进行造血干细胞移植,这会对患者造成极大的精神负担,对家庭和社会也造成极大的经济负担,而目前对重型地贫没有有效的治疗方法,因此对婚前检查、孕前检查及产检人群进行地贫诊断,降低及杜绝重型地贫患儿的出生就显的尤为重要。
目前诊断地贫的方法主要有筛查法和基因检测法。筛查法主要是血红蛋白分析和血液学检查,但这种方法不能对地贫进行确诊,属于初步筛查方法,轻型携带者易漏检,可能造成重症地贫患儿的出生。基因检测法包括southern印迹杂交、PCR-RFLP、反向杂交(RDB)技术、MOEA、荧光-PCR等,但这些方法一般很难实现大片段缺失的突变与点突变同时检出。同时现有的基因检测法一般耗时较长且操作复杂。因此,亟需一种能直观、快速、准确、高通量的检测地中海贫血基因突变类型的方法。
生物芯片因具有高通量、高度并行性、高灵敏度等优点而得到了广泛的研究和应用。基因芯片的基本原理是DNA的碱基配对和互补原理,将核酸片段作为识别分子,按预先设置的排列固定于特定的固相支持载体的表面形成微点阵,利用杂交技术,将标记的样品分子与微点阵上的核酸探针杂交,以实现多到数万个分子之间的杂交反应,通过特殊的检测系统来高通量、大规模的分析检测样品中多个基因的表达状况或者特定基因分子的存在。
地贫在全世界的分布极广,在中国南方、中东、印度、东南亚(尤其在泰国和马来西亚)都发现了相当多的地贫患者和携带者。泰国属于地贫高发的地区,而目前市场上并没有针对泰国地贫位点的高通量检测方法。
发明内容
本发明的目的是检测地中海贫血基因的突变位点的突变类型。
本发明首先保护用于检测地中海贫血基因的突变位点的成套试剂,可包括成套探针;所述成套探针可包括探针Tag1、探针Tag2、探针Tag3、探针Tag4、探针Tag5和探针Tag6;各个探针均为单链DNA分子;
所述探针Tag1可为如下a1)或a2)或a3)或a4)所示的DNA分子:
a1)具有序列表的序列11自5’末端起第16至35位所示的核苷酸的DNA分子;
a2)由连接臂和特异序列组成的DNA分子;所述特异序列的核苷酸序列如序列表的序列11自5’末端起第16至35位所示;
a3)核苷酸序列如序列表的序列11自5’末端起第16至35位所示的DNA分子;
a4)核苷酸序列如序列表的序列11所示的DNA分子;
所述探针Tag2可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子:
b1)具有序列表的序列12自5’末端起第16至34位所示的核苷酸的DNA分子;
b2)由连接臂和特异序列组成的DNA分子;所述特异序列的核苷酸序列如序列表的序列12自5’末端起第16至34位所示;
b3)核苷酸序列如序列表的序列12自5’末端起第16至34位所示的DNA分子;
b4)核苷酸序列如序列表的序列12所示的DNA分子;
所述探针Tag3可为如下c1)或c2)或c3)或c4)所示的DNA分子:
c1)具有序列表的序列13自5’末端起第16至35位所示的核苷酸的DNA分子;
c2)由连接臂和特异序列组成的DNA分子;所述特异序列的核苷酸序列如序列表的序列13自5’末端起第16至35位所示;
c3)核苷酸序列如序列表的序列13自5’末端起第16至35位所示的DNA分子;
c4)核苷酸序列如序列表的序列13所示的DNA分子;
所述探针Tag4可为如下d1)或d2)或d3)或d4)所示的DNA分子:
d1)具有序列表的序列14自5’末端起第16至35位所示的核苷酸的DNA分子;
d2)由连接臂和特异序列组成的DNA分子;所述特异序列的核苷酸序列如序列表的序列14自5’末端起第16至35位所示;
d3)核苷酸序列如序列表的序列14自5’末端起第16至35位所示的DNA分子;
d4)核苷酸序列如序列表的序列14所示的DNA分子;
所述探针Tag5可为如下e1)或e2)或e3)或e4)所示的DNA分子:
e1)具有序列表的序列15自5’末端起第16至35位所示的核苷酸的DNA分子;
e2)由连接臂和特异序列组成的DNA分子;所述特异序列的核苷酸序列如序列表的序列15自5’末端起第16至35位所示;
e3)核苷酸序列如序列表的序列15自5’末端起第16至35位所示的DNA分子;
e4)核苷酸序列如序列表的序列15所示的DNA分子;
所述探针Tag6可为如下f1)或f2)或f3)或f4)所示的DNA分子:
f1)具有序列表的序列16自5’末端起第16至35位所示的核苷酸的DNA分子;
f2)由连接臂和特异序列组成的DNA分子;所述特异序列的核苷酸序列如序列表的序列16自5’末端起第16至35位所示;
f3)核苷酸序列如序列表的序列16自5’末端起第16至35位所示的DNA分子;
f4)核苷酸序列如序列表的序列16所示的DNA分子。
所述成套探针具体可由所述探针Tag1、所述探针Tag2、所述探针Tag3、所述探针Tag4、所述探针Tag5和所述探针Tag6组成。
所述成套探针还可包括质控探针;所述质控探针为定位点探针和/或阳性探针和/或阴性探针;
所述定位点探针的核苷酸序列可如序列表的序列17所示;
所述阳性探针可为如下k1)或k2)或k3)或k4)所示的DNA分子:
k1)具有序列表的序列18自5’末端起第16至35位所示的核苷酸的DNA分子;
k2)由连接臂和特异序列组成的DNA分子;所述特异序列的核苷酸序列如序列表的序列18自5’末端起第16至35位所示;
k3)核苷酸序列如序列表的序列18自5’末端起第16至35位所示的DNA分子;
k4)核苷酸序列如序列表的序列18所示的DNA分子;
所述阴性探针可为如下m1)或m2)或m3)或m4)所示的DNA分子:
m1)具有序列表的序列19自5’末端起第16至38位所示的核苷酸的DNA分子;
m2)由连接臂和特异序列组成的DNA分子;所述特异序列的核苷酸序列如序列表的序列19自5’末端起第16至38位所示;
m3)核苷酸序列如序列表的序列19自5’末端起第16至38位所示的DNA分子;
m4)核苷酸序列如序列表的序列19所示的DNA分子。
所述a2)和/或所述b2)和/或所述c2)和/或所述d2)和/或所述e2)和/或所述f2)和/或所述k2)和/或所述m2)中,所述连接臂由若干个T组成。
所述a2)和/或所述b2)和/或所述c2)和/或所述d2)和/或所述e2)和/或所述f2)和/或所述k2)和/或所述m2)中,所述连接臂具体可由15个T组成。
所述成套探针具体可由所述探针Tag1、所述探针Tag2、所述探针Tag3、所述探针Tag4、所述探针Tag5、所述探针Tag6、所述定位点探针、所述阳性探针和所述阴性探针组成。
上述任一所述成套试剂还可包括成套引物。
所述成套引物可包括引物CD19W、引物CD19M、引物beta-R、引物CD41M、引物118kbdeletion-F、引物118kb deletion-R、引物αPSM-F、引物αPSM-R、引物3.4kbdeletion-F和引物3.4kb deletion-R;
所述引物CD19W的核苷酸序列如序列表中序列1所示;
所述引物CD19M的核苷酸序列如序列表中序列2所示;
所述引物beta-R的核苷酸序列如序列表中序列3所示;
所述引物CD41M的核苷酸序列如序列表中序列4所示;
所述引物118kb deletion-F的核苷酸序列如序列表中序列5所示;
所述引物118kb deletion-R的核苷酸序列如序列表中序列6所示;
所述引物αPSM-F的核苷酸序列如序列表中序列7所示;
所述引物αPSM-R的核苷酸序列如序列表中序列8所示;
所述引物3.4kb deletion-F的核苷酸序列如序列表中序列9所示;
所述引物3.4kb deletion-R的核苷酸序列如序列表中序列10所示。
所述成套引物具体可由所述引物CD19W、所述引物CD19M、所述引物beta-R、所述引物CD41M、所述引物118kb deletion-F、所述引物118kb deletion-R、所述引物αPSM-F、所述引物αPSM-R、所述引物3.4kb deletion-F和所述引物3.4kb deletion-R组成。
所述引物beta-R、所述引物3.4kb deletion-F、所述引物118kb deletion-R和所述引物αPSM-R的5’末端可进行生物素标记(目的为与磁珠结合,便于PCR扩增产物的分离)。
所述引物CD19W、所述引物CD19M、所述引物CD41M、所述引物3.4kb deletion-R、所述引物118kb deletion-F和所述引物αPSM-F均含有Tag标签(目的为和探针结合)。所述引物CD19W、所述引物CD41M、所述引物3.4kb deletion-R、所述引物118kbdeletion-F和所述引物αPSM-F中的Tag标签均为相应引物序列自5’末端起第1至20位所示。所述引物CD19M中的Tag标签均为相应引物序列自5’末端起第1至19位所示。
本发明还保护用于检测地中海贫血基因的突变位点的核酸芯片。
所述核酸芯片的基片上可分别固定有所述探针Tag1、所述探针Tag2、所述探针Tag3、所述探针Tag4、所述探针Tag5和所述探针Tag6。
所述核酸芯片的基片上还可分别固定有所述定位点探针和/或所述阳性探针和/或所述阴性探针。
在本发明的一个实施例中,所述核酸芯片的基片上分别固定有所述探针Tag1、所述探针Tag2、所述探针Tag3、所述探针Tag4、所述探针Tag5、所述探针Tag6、所述定位点探针、所述阳性探针和所述阴性探针。
本发明还保护用于检测地中海贫血基因的突变位点的试剂盒,可包括Q1)或Q2):
Q1)上述任一所述成套试剂;
Q2)上述任一所述核酸芯片和/或上述任一所述成套引物。
如下A1)或A2)或A3)或A4)的应用也属于本发明的保护范围:
A1)上述任一所述成套试剂在制备用于检测地中海贫血基因的突变位点的试剂盒中的应用;
A2)上述任一所述核酸芯片和/或上述任一所述成套引物在制备用于检测地中海贫血基因的突变位点的试剂盒中的应用;
A3)上述任一所述成套探针在制备用于检测地中海贫血基因的突变位点的核酸芯片中的应用;
A4)上述任一所述成套试剂、上述任一所述核酸芯片、上述任一所述成套引物、上述任一所述试剂盒在检测地中海贫血基因的突变位点中的应用。
上文中,所述地中海贫血基因的突变位点可为CD19位点、CD41位点、3.4kbdeletion位点、118kb deletion位点或αPS位点。
本发明还保护检测待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型的方法。
本发明要保护的检测待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型的方法,具体可为方法一,可包括如下步骤:以待测者的基因组DNA为模板,采用上述任一所述成套引物进行PCR扩增,获得PCR扩增产物,将PCR扩增产物与上述任一所述核酸芯片进行杂交,然后进行如下判断:
D1)如果所述PCR扩增产物可以与所述核酸芯片中的探针Tag1和探针Tag2杂交,则待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型为CD19杂合突变;
D2)如果所述PCR扩增产物可以与所述核酸芯片中的探针Tag2杂交且不能与探针Tag1杂交,则待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型为CD19纯合突变;
D3)如果所述PCR扩增产物可以与所述核酸芯片中的探针Tag3杂交,则待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型为CD41突变;
D4)如果所述PCR扩增产物可以与所述核酸芯片中的探针Tag4杂交且可以与核酸芯片中的Tag1或探针Tag2杂交,则待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型为118kbdeletion杂合突变;
D5)如果所述PCR扩增产物可以与所述核酸芯片中的探针Tag4杂交且不可以与核酸芯片中的Tag1或探针Tag2杂交,则待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型为118kbdeletion纯合突变;
D6)如果所述PCR扩增产物可以与所述核酸芯片中的探针Tag5杂交,则待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型为αPS突变;
D7)如果所述PCR扩增产物可以与所述核酸芯片中的探针Tag6杂交且可以与核酸芯片中的Tag1或探针Tag2杂交,则待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型为3.4kbdeletion杂合突变;
D8)如果所述PCR扩增产物可以与所述核酸芯片中的探针Tag6杂交且不可以与核酸芯片中的Tag1或探针Tag2杂交,则待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型为3.4kbdeletion纯合突变;
D9)如果不为D1)-D8)中的任一种,则待测者地中海贫血基因中CD19位点、CD41位点、3.4kb deletion位点、118kb deletion位点和αPS位点均未发生突变。
本发明要保护的检测待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型的方法,具体可为方法二,可包括如下步骤:
F1)以待测者的基因组DNA为模板,采用上述任一所述成套引物进行PCR扩增,获得PCR扩增产物,将PCR扩增产物与上述任一所述核酸芯片进行杂交,获得杂交信号;以标准DNA群中的各个基因组DNA为模板,采用上述任一所述成套引物进行PCR扩增,获得PCR扩增产物,将PCR扩增产物与上述任一所述核酸芯片进行杂交,获得杂交信号;
所述标准DNA群由地中海贫血基因发生CD19杂合突变的人基因组DNA、地中海贫血基因发生CD19纯合突变的人基因组DNA、地中海贫血基因发生CD41突变的人基因组DNA、地中海贫血基因发生118kb deletion杂合突变的人基因组DNA、地中海贫血基因发生118kbdeletion纯合突变的人基因组DNA、地中海贫血基因发生αPS突变的人基因组DNA、地中海贫血基因发生3.4kb deletion杂合突变的人基因组DNA和地中海贫血基因发生3.4kbdeletion纯合突变的人基因组DNA组成;
F2)如果“待测者的PCR扩增产物与某探针杂交后的杂交信号”与“标准DNA群中的某个基因组DNA与相应探针杂交后的杂交信号”均为阳性(即杂交信号值均为2500以上),待测者与该基因组DNA地中海贫血基因发生的突变类型相同。
上述任一所述杂交信号具体采用LuxScanTM 10K芯片扫描仪在532nm激发的波长下进行基因芯片扫描获得。杂交信号阳性判读原则具体见实施例2中步骤三。
上述方法中,所述“采用上述任一所述成套引物进行PCR扩增”可分为一个以上PCR反应体系进行。具体的,在发明的实施例中,分为两个PCR反应体系进行。第一个PCR反应体系中含有所述引物CD19W、所述引物CD19M、所述引物beta-R、所述引物CD41M、所述引物118kb deletion-F和所述引物118kb deletion-R。第二个PCR反应体系中含有所述引物αPSM-F、所述引物αPSM-R、所述引物3.4kb deletion-F和所述引物3.4kb deletion-R。各个引物在PCR扩增体系中的浓度可为0.1~2.0μM。
所述PCR反应体系中还含有DNA聚合酶、Mg2+、dNTP等常规PCR反应试剂。
上述方法中,所述“采用上述任一所述成套引物进行PCR扩增”的反应条件具体可为:95℃10min;95℃35s,50℃~60℃15s,72℃90s,35个循环;72℃5min;12℃保存。
上述方法中,作为模板的待测者的基因组DNA需满足如下条件:(1)浓度为5-50ng/μL;(2)OD260nm/OD280nm为1.6~2.0。
上述任一所述的方法中,所述地中海贫血基因的突变位点可为CD19位点、CD41位点、3.4kb deletion位点、118kb deletion位点或αPS位点。
上文中,所述待测者具体可为地中海贫血患者。
采用本发明提供的检测待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型的方法,可以快速实现对地中海贫血基因的5个突变位点(分别为CD19位点、CD41位点、3.4kb deletion位点、118kb deletion位点和αPS位点)突变类型的鉴定,并且特异性好、通量高(在一张芯片上同时完成5个位点的检测)、操作简单,准确率达到100%。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为采用基因芯片检测12例人血液的基因组DNA中地中海贫血基因的突变位点。
图2为特异性实验。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
光学级醛基基片、基因芯片点样液和基因芯片SmartArrayer136点样仪均为成都博奥晶芯生物科技有限公司的产品。磁珠为英潍捷基(上海)贸易有限公司的产品。
实施例1、用于检测地中海贫血基因的5个突变位点的引物和特异性探针的合成
研究表明,泰国人群中存在β地中海贫血基因的4个突变位点(分别为CD19位点(AAC-AGC)、CD41位点(-C)、3.4kb deletion位点和118kb deletion位点)和α地中海贫血基因的1个突变位点(为αPS位点(CD142:TAA-TAT)),共计5个。
一、用于检测地中海贫血基因的5个突变位点的引物的合成
1、根据β链珠蛋白基因(Genebank号为NT_009237)的核苷酸序列设计并合成CD19位点的野生型特异引物(命名为CD19W)、突变型特异引物(命名为CD19M)和通用引物(命名为beta-R)。
某人的β链珠蛋白基因中:如果同时“含有CD19W和beta-R的靶序列”和“CD19M和beta-R的靶序列”,则该人的CD19位点发生突变且突变类型为CD19杂合突变;如果仅含有CD19M和beta-R的靶序列,则该人的CD19位点发生突变且突变类型为CD19纯合突变;如果仅含有CD19W和beta-R的靶序列,则该人的CD19位点未发生突变。
2、根据β链珠蛋白基因的核苷酸序列设计并合成CD41位点的突变型特异引物(命名为CD41M)和通用引物(命名为beta-R,与步骤(1)中的通用引物完全一样)。
某人的β链珠蛋白基因中:如果含有CD41M和beta-R的靶序列,则该人的CD41位点发生突变(即CD41突变);如果不含有CD41M和beta-R的靶序列,则该人的CD41位点未发生突变。
3、根据β链珠蛋白基因的核苷酸序列,利用Gap-PCR原理设计并合成3.4kbdeletion位点的上游引物(命名为3.4kb deletion-F)和下游引物(命名为3.4kbdeletion-R)。
某人的β链珠蛋白基因中:如果含有3.4kb deletion-F和3.4kb deletion-R的约1392bp的靶序列且存在CD19位点,则该人的3.4kb deletion位点发生突变且突变类型为3.4kb deletion杂合突变;如果含有3.4kb deletion-F和3.4kb deletion-R的约1392bp的靶序列且不存在CD19位点,则该人的3.4kb deletion位点发生突变且突变类型为3.4kbdeletion纯合突变;如果不含有3.4kb deletion-F和3.4kb deletion-R的约1392bp的靶序列,则该人的3.4kb deletion位点未发生突变。
4、根据β链珠蛋白基因的核苷酸序列,利用Gap-PCR原理设计并合成118kbdeletion位点的上游引物(命名为118kb deletion-F)和下游引物(命名为118kbdeletion-R)。
某人的β链珠蛋白基因中:如果含有118kb deletion-F和118kb deletion-R的约1156bp的靶序列且存在CD19位点,则该人的118kb deletion位点发生突变且突变类型为118kb deletion杂合突变;如果含有118kb deletion-F和118kb deletion-R的约1156bp的靶序列且不存在CD19位点,则该人的118kb deletion位点发生突变且突变类型为118kbdeletion纯合突变;如果不含有118kb deletion-F和118kb deletion-R的约1156bp的靶序列,则该人的118kb deletion位点未发生突变。
5、根据α链珠蛋白基因(Genebank号为NG_000006)的核苷酸序列设计并合成αPS位点的突变型特异引物(命名为αPSM-F)和通用引物(命名为αPSM-R)。
某人的α链珠蛋白基因中:如果含有αPSM-F和αPSM-R的靶序列,则该人的αPS位点发生突变(即αPS突变);如果不含有αPSM-F和αPSM-R的靶序列,则该人的αPS位点未发生突变。
CD19W、CD19M、CD41M、3.4kb deletion-R、118kb deletion-F和αPSM-F均含有Tag标签(目的为和特异性探针结合,即和基因芯片结合)。beta-R、3.4kb deletion-F、118kbdeletion-R和αPSM-R的5’末端均进行生物素(biotin)标记(目的为与磁珠结合)。Tag标签和生物素标记可以使PCR扩增产物加上相应的标记,用于杂交分析和检测结果。
二、引物组1和引物组2的获得
将步骤一中合成的引物根据扩增的位点分为引物组1和引物组2两组。
引物组1扩增的位点为CD19位点、CD41位点和118kb deletion位点,各个引物的核苷酸序列见表1。
引物组2扩增的位点为αPS位点和3.4kb deletion位点,各个引物的核苷酸序列见表2。
表1
注:下划线均为Tag标签。
表2
注:下划线均为Tag标签。
三、特异性探针的合成
根据步骤一的引物序列、β链珠蛋白基因和α链珠蛋白基因设计鉴定各个位点的特异性探针、阳性探针、阴性探针和定位点探针,经过大量预实验,获得如表3所示的6个特异性探针和表4所示的定位点探针、阳性探针和阴性探针(定位点探针、阳性探针和阴性探针一起作为质控探针)的核苷酸序列。其中,定位点探针对未杂交的芯片进行扫描时能够直接发光,可以对探针与基片的偶联是否正常进行检测,另外,通过对定位点探针的排布,可以显示其它探针的整体排布情况,为后期杂交结果的判读提供参照点;阳性探针作为阳性对照,用于对PCR扩增标记过程和杂交过程是否成功进行监控;阴性探针是一条与步骤一的引物序列、β链珠蛋白基因和α链珠蛋白基因均无同源性的寡核苷酸,作用是监控杂交过程非特异性结合的情况,正常情况下不发出荧光。
人工合成所有探针。
表3.特异性探针
位点 | 探针名称 | 核苷酸序列(5'-3') | 序列表中的位置 |
CD19位点(未发生突变) | Tag1 | TTTTTTTTTTTTTTTGCCGAGTGTAAGCGTATCCG | 序列表中序列11 |
CD19位点(发生突变) | Tag2 | TTTTTTTTTTTTTTTGTGTAGCGGTTATGAGGCG | 序列表中序列12 |
CD41位点 | Tag3 | TTTTTTTTTTTTTTTCCACGAGCGAACTATTGCGG | 序列表中序列13 |
118kb deletion位点 | Tag4 | TTTTTTTTTTTTTTTCGCTCACGAATACACGACGC | 序列表中序列14 |
αPS位点 | Tag5 | TTTTTTTTTTTTTTTCACTTCGTAACCTCTCGCCG | 序列表中序列15 |
3.4kb deletion位点 | Tag6 | TTTTTTTTTTTTTTTGTTCGGCTCTAATGCGGACG | 序列表中序列16 |
注:表3中,所有探针自5’末端至3’末端由修饰序列和特异序列组成,修饰序列为15个T组成的连接臂。
表4.质控探针
探针类型 | 代码 | 探针序列(5’-3’) | 序列表中的位置 |
定位点探针 | QC | CCTCAACGGAAGCAAGTGA | 序列表中序列17 |
阳性探针 | PC | TTTTTTTTTTTTTTTATCACTTGCTTCCGTTGAGG | 序列表中序列18 |
阴性探针 | NC | TTTTTTTTTTTTTTTCCCGATGACGTTAGGGATAAAGC | 序列表中序列19 |
空白对照 | BC | 无 | 无 |
注:表4中,阳性探针和阴性探针自5’末端至3’末端由修饰序列和特异序列组成,修饰序列为15个T组成的连接臂。
实施例2、采用基因芯片高通量检测待测样品的地中海贫血基因的5个突变位点突变类型
以12例人血液的基因组DNA为待测样品。样本编号为DP-001至DP-012(表5中第1列)。
将12个待测样品进行测序,得到12个待测样品的地中海贫血基因的突变类型,结果具体见表5中第2列。
表5
样本编号 | 测序结果 | 检测结果 |
DP-001 | 3.4kb deletion纯合突变 | 3.4kb deletion纯合突变 |
DP-002 | CD19杂合突变 | CD19杂合突变 |
DP-003 | CD41突变 | CD41突变 |
DP-004 | 118kb deletion杂合突变 | 118kb deletion杂合突变 |
DP-005 | CD19杂合突变/CD41突变 | CD19杂合突变/CD41突变 |
DP-006 | αPS突变 | αPS突变 |
DP-007 | 3.4kb deletion纯合突变 | 3.4kb deletion纯合突变 |
DP-008 | 3.4kb deletion杂合突变 | 3.4kb deletion杂合突变 |
DP-009 | CD19纯合突变 | CD19纯合突变 |
DP-010 | 野生型 | 野生型 |
DP-011 | 野生型 | 野生型 |
DP-012 | 野生型 | 野生型 |
采用基因芯片高通量检测12个待测样品的地中海贫血基因的5个突变位点突变类型,具体步骤如下:
一、基因芯片的制备
1、探针点阵的设计
每张光学级醛基基片上分别有90个相同的探针点阵(10行9列),每个探针点阵中探针的具体排布如表6所示,表中每个格相当于一个点。每个探针设3个重复,探针在芯片上的实际距离为点间距300μm。
表6.探针排布
QC | QC | QC | BC | BC | BC | PC | PC | PC |
BC | BC | BC | PC | PC | PC | BC | BC | BC |
Tag3 | Tag3 | Tag3 | PC | PC | PC | NC | NC | NC |
BC | BC | BC | NC | NC | NC | NC | NC | NC |
BC | BC | BC | NC | NC | NC | Tag6 | Tag6 | Tag6 |
BC | BC | BC | BC | BC | BC | Tag4 | Tag4 | Tag4 |
Tag1 | Tag1 | Tag1 | BC | BC | BC | BC | BC | BC |
Tag2 | Tag2 | Tag2 | PC | PC | PC | Tag5 | Tag5 | Tag5 |
BC | BC | BC | PC | PC | PC | BC | BC | BC |
PC | PC | PC | NC | NC | NC | QC | QC | QC |
2、探针的准备
将探针(Tag1、Tag2、Tag3、Tag4、Tag5、Tag6、定位点探针、阳性探针或阴性探针)用ddH2O稀释成50μmol/L的探针母液。
3、点样
取4μL探针母液和4μL基因芯片点样液混合,得到探针点样液;然后利用基因芯片SmartArrayer136点样仪按步骤1设计的探针点阵排布顺序,将探针点样液点至光学级醛基基片上。
按照上述步骤,将4μL探针母液替换为4μL ddH2O,其它步骤均不变,作为空白对照(即表6中的BC)。
4、固定
完成步骤3后,取所述光学级醛基基片,置于湿盒中37℃恒温固定12h以上。
5、洗片
完成步骤4后,取所述光学级醛基基片,用清洗液(浓度为1.2mg/mL的SDS水溶液)洗涤1次,然后用封闭液(浓度为5.6mg/mL的硼氢化钠水溶液)洗涤1次,最后用ddH2O洗涤1次,1200rpm离心,抽真空后2-8℃避光贮藏,待用。
二、PCR扩增产物与基因芯片的杂交反应
1、分别以12例人血液的基因组DNA为模板(约25-250ng),采用实施例1制备的引物组1进行PCR扩增(各个引物在PCR扩增体系中的浓度均为0.1~2.0μM),得到PCR扩增产物1。分别以12例人血液的基因组DNA为模板,采用实施例1制备的引物组2进行PCR扩增(各个引物在PCR扩增体系中的浓度均为0.1~2.0μM),得到PCR扩增产物2。
反应条件:95℃10min;95℃35s,50℃~60℃15s,72℃90s,35个循环;72℃5min;12℃保存。
2、磁珠预处理
取8~15μL磁珠,加入30μL结合缓冲液(含0.6mM EDTA-2Na和1.2M NaCl的8.5mMTris-HCl(pH8.0)缓冲液),涡旋振荡混匀;然后置于磁力架吸附15s,弃液体;最后加入30μL结合缓冲液振荡混匀,得到磁珠溶液。
3、将PCR扩增产物1、PCR扩增产物2和磁珠溶液充分混合,然后置于磁力架吸附15s,弃液体。
4、完成步骤3后,加入100mM的NaOH水溶液,涡旋振荡混匀,然后置于磁力架吸附15s,弃液体。
5、完成步骤4后,加入20μL杂交缓冲液(含28%(w/v)去离子甲酰胺、7.5×SSC、2.5×Denhardt's和0.2%(w/v)SDS的水溶液),吹吸混匀,得到混合液。
6、完成步骤5后,取10-18μL混合液,加入步骤一制备的基因芯片中,45℃~60℃水浴30-90min。
三、芯片扫描与结果判读
用LuxScanTM 10K芯片扫描仪在532nm激发的波长下进行基因芯片扫描,保存扫描图片,通过数据分析可得到532nm激发光下的每个杂交信号点的信号值,并以此作为依据进行结果判读,杂交信号阳性结果判读原则如下:
(1)每个检测点信号值=F532(Mean)-B532(即在波长为532nm的激发光下,该点的荧光强度平均值减去背景强度值)。
(2)空白对照平均信号值=3个空白对照的检测点信号值的平均值。
(3)阴性对照平均信号值=3个阴性对照的检测点信号值的平均值。
(4)每个探针的每个检测点的信号值-空白对照平均信号值>10倍阴性对照平均信号值,且检测点信号值为2500以上,即判读该检测点为阳性。
(5)每个探针的3个重复检测点平均值为阳性即判读该条探针杂交结果为阳性。
(6)如定位点探针部分或全部为阴性,则表明探针与基片结合有问题,实验结果不准确。
(7)如阳性对照探针为阴性,则表明杂交环节存在问题,实验结果不准确。
(8)如阴性对照探针为阳性,则表明杂交过程中存在非特异性结合,可能是扩增或杂交过程中有污染,实验结果不准确。
DP-001的扫描结果见图1中A。结果表明,DP-001的地中海贫血基因发生突变且突变类型为3.4kb deletion纯合突变,与预期结果完全一致。
DP-002的扫描结果见图1中B。结果表明,DP-002的地中海贫血基因发生突变且突变类型为CD19杂合突变,与预期结果完全一致。
DP-003的扫描结果见图1中C。结果表明,DP-003的地中海贫血基因发生突变且突变类型为CD41突变,与预期结果完全一致。
DP-004的扫描结果见图1中D。结果表明,DP-004的地中海贫血基因发生突变且突变类型为118kb deletion杂合突变,与预期结果完全一致。
DP-005的扫描结果见图1中E。结果表明,DP-005的地中海贫血基因发生突变且突变类型为CD19杂合突变/CD41突变,与预期结果完全一致。
DP-006的扫描结果见图1中F。结果表明,DP-006的地中海贫血基因发生突变且突变类型为αPS突变,与预期结果完全一致。
DP-007的扫描结果见图1中G。结果表明,DP-007的地中海贫血基因发生突变且突变类型为3.4kb deletion纯合突变,与预期结果完全一致。
DP-008的扫描结果见图1中H。结果表明,DP-008的地中海贫血基因发生突变且突变类型为3.4kb deletion杂合突变,与预期结果完全一致。
DP-009的扫描结果见图1中I。结果表明,DP-009的地中海贫血基因发生突变且突变类型为CD19纯合突变,与预期结果完全一致。
DP-010的扫描结果见图1中J。结果表明,DP-010的地中海贫血基因未发生突变(即野生型),与预期结果完全一致。
DP-011的扫描结果见图1中K。结果表明,DP-011的地中海贫血基因未发生突变(即野生型),与预期结果完全一致。
DP-012的扫描结果见图1中L。结果表明,DP-012的地中海贫血基因未发生突变(即野生型),与预期结果完全一致。
上述结果表明,6个特异性探针可对CD19位点、CD41位点、3.4kb deletion位点、118kb deletion位点和αPS位点进行快速鉴定且检测覆盖率高,准确率高(达到100%),而且可以在一张芯片上同时完成多个待测样品的地中海贫血基因的5个突变位点的高通量定性检测。
实施例3、特异性
以2例人血液的基因组DNA为待测样品。样本编号分别为DP-013和DP-014。
将2个待测样品进行测序。测序结果表明,DP-013的地中海贫血基因的突变类型为β地中海贫血CD41/42杂合突变,DP-014的地中海贫血基因的突变类型为α地中海贫血αCS杂合突变。
采用基因芯片高通量检测DP-013和DP-014的地中海贫血基因的突变类型。DP-013的扫描结果见图2中M。DP-014的扫描结果见图2中N。
结果表明,本发明提供的6个特异性探针具有较高的特异性,仅可用于检测CD19位点、CD41位点、3.4kb deletion位点、118kb deletion位点和αPS位点。
<110> 北京博奥晶典生物技术有限公司
<120> 一种高通量检测地中海贫血基因的5个突变位点的方法及其专用成套试剂
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
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gccgagtgta agcgtatccg ccctgtggag caaggtgaa 39
<210> 2
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<212> DNA
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gtgtagcggt tatgaggcgg ccctgtgggg caaggttag 39
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cccattctaa actgtaccct gt 22
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ccacgagcga actattgcgg ctacccttgg acccagagga tt 42
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<212> DNA
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cgctcacgaa tacacgacgc aagcagagct actcagggca ttt 43
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tagatcccat ttgtcaagtt gt 22
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<212> DNA
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cacttcgtaa cctctcgccg tgctgacctc caaataccgt gat 43
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ctccattgtt ggcacattcc 20
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gttcggctct aatgcggacg ttggaaaaga gtaaacagtc aaatg 45
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tttttttttt tttttcactt cgtaacctct cgccg 35
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<213> 人工序列
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tttttttttt tttttatcac ttgcttccgt tgagg 35
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tttttttttt tttttcccga tgacgttagg gataaagc 38
Claims (10)
1.用于检测地中海贫血基因的突变位点的成套试剂,包括成套探针;
所述成套探针包括探针Tag1、探针Tag2、探针Tag3、探针Tag4、探针Tag5和探针Tag6;各个探针均为单链DNA分子;
所述探针Tag1为如下a1)或a2)或a3)或a4)所示的DNA分子:
a1)具有序列表的序列11自5’末端起第16至35位所示的核苷酸的DNA分子;
a2)由连接臂和特异序列组成的DNA分子;所述特异序列的核苷酸序列如序列表的序列11自5’末端起第16至35位所示;
a3)核苷酸序列如序列表的序列11自5’末端起第16至35位所示的DNA分子;
a4)核苷酸序列如序列表的序列11所示的DNA分子;
所述探针Tag2为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子:
b1)具有序列表的序列12自5’末端起第16至34位所示的核苷酸的DNA分子;
b2)由连接臂和特异序列组成的DNA分子;所述特异序列的核苷酸序列如序列表的序列12自5’末端起第16至34位所示;
b3)核苷酸序列如序列表的序列12自5’末端起第16至34位所示的DNA分子;
b4)核苷酸序列如序列表的序列12所示的DNA分子;
所述探针Tag3为如下c1)或c2)或c3)或c4)所示的DNA分子:
c1)具有序列表的序列13自5’末端起第16至35位所示的核苷酸的DNA分子;
c2)由连接臂和特异序列组成的DNA分子;所述特异序列的核苷酸序列如序列表的序列13自5’末端起第16至35位所示;
c3)核苷酸序列如序列表的序列13自5’末端起第16至35位所示的DNA分子;
c4)核苷酸序列如序列表的序列13所示的DNA分子;
所述探针Tag4为如下d1)或d2)或d3)或d4)所示的DNA分子:
d1)具有序列表的序列14自5’末端起第16至35位所示的核苷酸的DNA分子;
d2)由连接臂和特异序列组成的DNA分子;所述特异序列的核苷酸序列如序列表的序列14自5’末端起第16至35位所示;
d3)核苷酸序列如序列表的序列14自5’末端起第16至35位所示的DNA分子;
d4)核苷酸序列如序列表的序列14所示的DNA分子;
所述探针Tag5为如下e1)或e2)或e3)或e4)所示的DNA分子:
e1)具有序列表的序列15自5’末端起第16至35位所示的核苷酸的DNA分子;
e2)由连接臂和特异序列组成的DNA分子;所述特异序列的核苷酸序列如序列表的序列15自5’末端起第16至35位所示;
e3)核苷酸序列如序列表的序列15自5’末端起第16至35位所示的DNA分子;
e4)核苷酸序列如序列表的序列15所示的DNA分子;
所述探针Tag6为如下f1)或f2)或f3)或f4)所示的DNA分子:
f1)具有序列表的序列16自5’末端起第16至35位所示的核苷酸的DNA分子;
f2)由连接臂和特异序列组成的DNA分子;所述特异序列的核苷酸序列如序列表的序列16自5’末端起第16至35位所示;
f3)核苷酸序列如序列表的序列16自5’末端起第16至35位所示的DNA分子;
f4)核苷酸序列如序列表的序列16所示的DNA分子。
2.如权利要求1所述的成套试剂,其特征在于:所述成套探针还包括质控探针;所述质控探针为定位点探针和/或阳性探针和/或阴性探针;
所述定位点探针的核苷酸序列如序列表的序列17所示;
所述阳性探针为如下k1)或k2)或k3)或k4)所示的DNA分子:
k1)具有序列表的序列18自5’末端起第16至35位所示的核苷酸的DNA分子;
k2)由连接臂和特异序列组成的DNA分子;所述特异序列的核苷酸序列如序列表的序列18自5’末端起第16至35位所示;
k3)核苷酸序列如序列表的序列18自5’末端起第16至35位所示的DNA分子;
k4)核苷酸序列如序列表的序列18所示的DNA分子;
所述阴性探针为如下m1)或m2)或m3)或m4)所示的DNA分子:
m1)具有序列表的序列19自5’末端起第16至38位所示的核苷酸的DNA分子;
m2)由连接臂和特异序列组成的DNA分子;所述特异序列的核苷酸序列如序列表的序列19自5’末端起第16至38位所示;
m3)核苷酸序列如序列表的序列19自5’末端起第16至38位所示的DNA分子;
m4)核苷酸序列如序列表的序列19所示的DNA分子。
3.如权利要求1或2所述的成套试剂,其特征在于:所述成套试剂还包括成套引物;所述成套引物包括引物CD19W、引物CD19M、引物beta-R、引物CD41M、引物118kb deletion-F、引物118kb deletion-R、引物αPSM-F、引物αPSM-R、引物3.4kb deletion-F和引物3.4kbdeletion-R;
所述引物CD19W的核苷酸序列如序列表中序列1所示;
所述引物CD19M的核苷酸序列如序列表中序列2所示;
所述引物beta-R的核苷酸序列如序列表中序列3所示;
所述引物CD41M的核苷酸序列如序列表中序列4所示;
所述引物118kb deletion-F的核苷酸序列如序列表中序列5所示;
所述引物118kb deletion-R的核苷酸序列如序列表中序列6所示;
所述引物αPSM-F的核苷酸序列如序列表中序列7所示;
所述引物αPSM-R的核苷酸序列如序列表中序列8所示;
所述引物3.4kb deletion-F的核苷酸序列如序列表中序列9所示;
所述引物3.4kb deletion-R的核苷酸序列如序列表中序列10所示。
4.用于检测地中海贫血基因的突变位点的核酸芯片;
所述核酸芯片的基片上分别固定有权利要求1中所述探针Tag1、所述探针Tag2、所述探针Tag3、所述探针Tag4、所述探针Tag5和所述探针Tag6。
5.如权利要求4所述的核酸芯片,其特征在于:所述核酸芯片的基片上还分别固定有权利要求2中所述定位点探针和/或所述阳性探针和/或所述阴性探针。
6.用于检测地中海贫血基因的突变位点的试剂盒,包括Q1)或Q2):
Q1)权利要求1至3任一所述成套试剂;
Q2)权利要求4或5所述核酸芯片和/或权利要求3中所述成套引物。
7.A1)或A2)或A3)或A4):
A1)权利要求1至3任一所述成套试剂在制备用于检测地中海贫血基因的突变位点的试剂盒中的应用;
A2)权利要求4或5所述核酸芯片和/或权利要求3中所述成套引物在制备用于检测地中海贫血基因的突变位点的试剂盒中的应用;
A3)权利要求1或2中所述成套探针在制备用于检测地中海贫血基因的突变位点的核酸芯片中的应用;
A4)权利要求1至3任一所述成套试剂、权利要求4或5所述核酸芯片、权利要求3中所述成套引物、权利要求6所述试剂盒在检测地中海贫血基因的突变位点中的应用。
8.如权利要求1至3任一所述成套试剂、权利要求4或5所述核酸芯片、权利要求6所述试剂盒或权利要求7所述的应用,其特征在于:所述地中海贫血基因的突变位点为CD19位点、CD41位点、3.4kb deletion位点、118kb deletion位点或αPS位点。
9.检测待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型的方法,包括如下步骤:以待测者的基因组DNA为模板,采用权利要求3中所述成套引物进行PCR扩增,获得PCR扩增产物,将PCR扩增产物与权利要求4或5所述核酸芯片进行杂交,然后进行如下判断:
D1)如果所述PCR扩增产物可以与核酸芯片中的探针Tag1和探针Tag2杂交,则待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型为CD19杂合突变;
D2)如果所述PCR扩增产物可以与核酸芯片中的探针Tag2杂交且不能与探针Tag1杂交,则待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型为CD19纯合突变;
D3)如果所述PCR扩增产物可以与核酸芯片中的探针Tag3杂交,则待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型为CD41突变;
D4)如果所述PCR扩增产物可以与核酸芯片中的探针Tag4杂交且可以与核酸芯片中的Tag1或探针Tag2杂交,则待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型为118kb deletion杂合突变;
D5)如果所述PCR扩增产物可以与核酸芯片中的探针Tag4杂交且不可以与核酸芯片中的Tag1或探针Tag2杂交,则待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型为118kb deletion纯合突变;
D6)如果所述PCR扩增产物可以与核酸芯片中的探针Tag5杂交,则待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型为αPS突变;
D7)如果所述PCR扩增产物可以与核酸芯片中的探针Tag6杂交且可以与核酸芯片中的Tag1或探针Tag2杂交,则待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型为3.4kb deletion杂合突变;
D8)如果所述PCR扩增产物可以与核酸芯片中的探针Tag6杂交且不可以与核酸芯片中的Tag1或探针Tag2杂交,则待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型为3.4kb deletion纯合突变;
D9)如果不为D1)-D8)中的任一种,则待测者地中海贫血基因中CD19位点、CD41位点、3.4kb deletion位点、118kb deletion位点和αPS位点均未发生突变。
10.检测待测者地中海贫血基因突变位点的突变类型的方法,包括如下步骤:
F1)以待测者的基因组DNA为模板,采用权利要求3中所述成套引物进行PCR扩增,获得PCR扩增产物,将PCR扩增产物与权利要求4或5所述核酸芯片进行杂交,获得杂交信号;以标准DNA群中的各个基因组DNA为模板,采用权利要求3中所述成套引物进行PCR扩增,获得PCR扩增产物,将PCR扩增产物与权利要求4或5所述核酸芯片进行杂交,获得杂交信号;
所述标准DNA群由地中海贫血基因发生CD19杂合突变的人基因组DNA、地中海贫血基因发生CD19纯合突变的人基因组DNA、地中海贫血基因发生CD41突变的人基因组DNA、地中海贫血基因发生118kb deletion杂合突变的人基因组DNA、地中海贫血基因发生118kbdeletion纯合突变的人基因组DNA、地中海贫血基因发生αPS突变的人基因组DNA、地中海贫血基因发生3.4kb deletion杂合突变的人基因组DNA和地中海贫血基因发生3.4kbdeletion纯合突变的人基因组DNA组成;
F2)如果“待测者的PCR扩增产物与某探针杂交后的杂交信号”与“标准DNA群中的某个基因组DNA与相应探针杂交后的杂交信号”均为阳性,待测者与该基因组DNA地中海贫血基因发生的突变类型相同。
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Citations (3)
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---|---|---|---|---|
US20030186230A1 (en) * | 2001-07-23 | 2003-10-02 | Ye Bangce | Medium and low density gene chips |
CN102373265A (zh) * | 2010-08-06 | 2012-03-14 | 博奥生物有限公司 | 一种检测遗传性耳聋的试剂盒 |
CN104372100A (zh) * | 2014-11-28 | 2015-02-25 | 博奥生物集团有限公司 | 检测地中海贫血相关基因突变的试剂盒及其应用 |
-
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---|---|---|---|---|
US20030186230A1 (en) * | 2001-07-23 | 2003-10-02 | Ye Bangce | Medium and low density gene chips |
CN102373265A (zh) * | 2010-08-06 | 2012-03-14 | 博奥生物有限公司 | 一种检测遗传性耳聋的试剂盒 |
CN104372100A (zh) * | 2014-11-28 | 2015-02-25 | 博奥生物集团有限公司 | 检测地中海贫血相关基因突变的试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BOONCHAI BOONYAWAT等: "Molecular analysis of beta-globin gene mutations among Thai beta-thalassemia children: results from a single center study", 《THE APPLICATION OF CLINICAL GENETICS》 * |
TRITIPSOMBUT J: "single-tube multiplex gap-PCR for the detection of eight b-globin gene cluster deletions common in Southeast Asia", 《HEMOGLOBIN》 * |
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