CN114107350A - 一种acot7-nphp4融合基因及其应用和检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种ACOT7‑NPHP4融合基因及其应用和检测试剂盒，所述融合基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首先发现、鉴定了急性淋巴细胞白血病中存在新融合基因ACOT7‑NPHP4，评估认为ACOT7‑NPHP4可以作为急性淋巴细胞白血病的特异性分子标志物，进而开发了一款临床上可用于诊断、检测患者微小残留病(MRD)的试剂盒。试剂盒利用Taqman探针实时荧光PCR对急性淋巴细胞白血病患者体内ACOT7‑NPHP4融合基因进行绝对定量，其检测特异性好、灵敏度高、方法简便高效、成本低廉，能够满足临床上的诊疗需求。

Description

一种ACOT7-NPHP4融合基因及其应用和检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种急性淋巴细胞白血病融合基因及其应用和检测试剂盒。

背景技术

急性淋巴细胞白血病(ALL)是临床常见的血液恶性肿瘤，大多数ALL患者通过临床多药化疗诱导获得缓解，但半数还是会复发。而通过监测微小残留病灶(MRD)，即治疗后持续存在的白血病原始细胞数低于常规形态学检测的限度，越来越多地用于评估治疗效果，是联合化疗后最有效的评判标准，对改善患者预后至关重要。并且多项研究表明，MRD是儿童和成人ALL的独立预后因素。因此，几乎所有儿童ALL和大部分成人ALL的治疗方案均与监测MRD结合来评估治疗后的反应。

现如今，监测MRD的方法是利用白血病细胞特有的特征来将它们与正常细胞区分开来，筛选出肿瘤细胞的分子标志物，包括融合基因(例如通过聚合酶链反应(PCR)方法检测BCR/ABL1是筛选费城染色体阳性B-ALL(ph⁺-ALL)患者的首选方法)、T细胞受体(TCR)基因重排和异常白血病相关免疫表型(LAIP)等。但如今仍然有很大比例的ALL患者缺乏分子标志来监测MRD，从而为评估治疗疗效，预防复发和治疗预后带来较大困难。因此发现并监测与ALL相关的新融合基因对于病情诊断、治疗方案制定、疗效评价、预后评估及病变复发具有重要的临床意义。

ACOT7又称Acyl-CoA Thioesterase 7，编码酰基辅酶A硫酯酶，可将酰基辅酶A水解为游离脂肪酸和辅酶A(CoASH)，具有调节细胞内酰基辅酶A、游离脂肪酸和CoASH水平的能力，可能在大脑中发挥重要的生理功能。有文章已经表明ACOT7表达水平高的急性髓性白血病(AML)患者通常预后较差，即使已经接受了异基因干细胞移植治疗。而NPHP4即Nephrocystin4，其编码的蛋白质参与肾小管发育，其突变与肾病有关。上述两个基因在该ALL患者里形成了一种新融合基因ACOT7-NPHP4，并且是至今未见文献报道的分子标志物。

发明内容

本发明的第一个目的在于，提供一种急性淋巴细胞白血病融合基因ACOT7-NPHP4。

本发明的第二个目的在于，提供融合基因ACOT7-NPHP4在制备急性淋巴细胞白血病诊断和/或监测制剂或试剂盒中的应用。

本发明的第三个目的在于，提供一种急性淋巴细胞白血病诊断和/或监测试剂盒。

本发明第四个目的在于，提供一种非疾病诊断目的的检测ACOT7-NPHP4融合基因的方法。

为了实现上述第一个目的，本发明提供了一种ACOT7-NPHP4融合基因，所述融合基因序列如SEQ ID NO.1所示。

为了实现上述第二个目的，本发明提供了ACOT7-NPHP4融合基因在制备急性淋巴细胞白血病诊断和/或监测制剂或试剂盒中的应用。部分急性淋巴细胞白血病患者携带融合基因ACOT7-NPHP4，其可以作为患者特异性的分子标志物，并应用于临床诊断、定期监测患者的微小残留病变。

为了实现上述第三个目的，本发明提供了一种急性淋巴细胞白血病诊断和/或监测试剂盒，所述试剂盒含有检测ACOT7-NPHP4融合基因或检测其表达产物的试剂

作为一个优选方案，所述试剂盒包括上游引物、下游引物、Taqman探针、内参、PCR反应缓冲液、阳性对照和阴性对照；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

作为一个优选方案，所述Taqman探针的5’端标记有FAM基团，所述探针的3’端标记有TAMRA基团。当待测样品中不存在目标DNA分子时FAM的荧光被TAMRA淬灭，不发出荧光；当待测样品中存在目标DNA分子时，探针与目标DNA分子结合，随后靠Taq酶的5'→3’双链外切酶活性降解探针而释放荧光基团FAM，发出荧光。

作为一个优选方案，所述内参中包含内参上游引物，内参下游引物和内参探针；

所述内参上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述内参下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

内参基因ABL的探针5’端可以标记有FAM基团，探针的3’端可以标记有TAMRA基团，FAM基团为报告基团，TAMRA为淬灭基团。

PCR反应缓冲液为本领域常用缓冲液，一般包括cDNA第一链合成试剂TIANScriptⅡRT Kit(TIANGEN公司)和实时荧光PCR混合液(Pro Taq HS Premix Probe qPCR Kit，Acurrate Biology公司，AG11704)，其主要成分包含DNA聚合酶、Mg²⁺、dNTP、逆转录酶、DTT。

所述阳性对照包含有带有ACOT7-NPHP4融合基因的质粒标准品和带有ABL基因的质粒。所述阴性对照包含去离子水和10例健康骨髓供者的cDNA。

为了实现上述第四个目的，本发明提供了一种非疾病诊断目的的检测ACOT7-NPHP4融合基因的方法，包括以下步骤：

(1)提取人血液样本中的总RNA，将RNA反转为cDNA作为待测样品；

(2)配置PCR反应液，再分别加入待测样品，阳性对照和阴性对照；

(3)实时荧光PCR仪上检测，反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35s，反应40个循环，荧光信号于60℃时采集；

其中所述PCR反应液包括上游引物、下游引物、Taqman探针、内参、PCR反应缓冲液、阳性对照和阴性对照，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

检测实验结果成立的条件为：若无目的基因扩增信号曲线，内参、阳性对照以及阴性对照检测均正常时，结果为阴性；若有目的基因扩增信号曲线，内参、阳性对照以及阴性对照检测均正常时，结果为阳性。若内参、阳性对照以及阴性对照出现异常，则需查明原因，做出调整后重新检测。

本发明发现并验证了部分急性淋巴细胞白血病携带融合基因ACOT7-NPHP4，继之开发了一款实时荧光PCR和Taqman探针技术相结合的融合基因检测、定量试剂盒。实时荧光PCR其结果用Ct值表示，具有特异度好，灵敏度高，操作简单，结果更直观等优点，是目前微量融合基因检测的首选方法，因此本试剂盒采用Taqman探针实时荧光PCR检测ACOT7-NPHP4融合基因，对患者MRD进行监测。

本发明的优点在于，(1)应用生物信息学技术筛选鉴定到急性淋巴细胞白血病患者携带的融合基因ACOT7-NPHP4，证明其是至今未见报道的新融合基因，并可以作为患者的分子标志物应用于临床诊断、选择合适的治疗方案、定期监测患者MRD。

(2)本发明涉及的ACOT7-NPHP4融合基因检测试剂盒具有如下优势：①准确性高：同时使用探针和引物双重控制，特异性好、假阳性低。②特异性强：使用特异性探针识别融合基因序列。③全程监控：实时监测全程扩增信号。④安全简便：操作简单安全，自动化程度高而且防止污染。⑤快速：完成检测时间为120min。

(3)本发明采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针，检测受测者体内ACOT7-NPHP4融合基因和内参基因ABL的表达情况，能把低丰度的基因信号从复杂背景中分辨出来的，对于患者诊断、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发的监测中具有非常大的应用潜力。

附图说明

图1为ACOT7-NPHP4融合基因结构图及PCR，sanger验证。A：1p36.31区域的translocation导致ACOT7-NPHP4融合基因发生的图形化展示；B：融合基因在患者初发以及对照样本中的PCR验证；C：携带融合基因患者PCR验证产物的sanger测序结果图，确认了ACOT7外显子7与NPHP4外显子5的融合。

图2为ACOT7-NPHP4融合基因的质粒标准品构建结果。A：融合基因标准品质粒pGEMT-easy-ACOT7-NPHP4图谱；B：标准品质粒sanger测序结果。

图3为使用本发明所述试剂盒检测ACOT7-NPHP4的结果图例。A：ACOT7-NPHP4标准曲线，阳性样本以及阴性对照；B：ACOT7-NPHP4阳性患者随治疗，ACOT7-NPHP4在mRNA水平的变化。

具体实施方式

以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。

实施例1.急性淋巴细胞白血病患者携带ACOT7-NPHP4新融合基因

(1)应用生物信息学技术筛选出急性淋巴细胞白血病患者的融合基因，以及文献中均未有过报道的ACOT7-NPHP4新融合基因。

(2)ACOT7-NPHP4新融合基因由ACOT7基因的第1-7外显子与NPHP4的第5-29外显子拼接形成，具体的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

(3)分别应用PCR、并对PCR产物进行sanger测序，我们确认该例急性淋巴细胞白血病患者携带ACOT7-NPHP4新融合基因，验证结果见图1。图1为ACOT7-NPHP4融合基因结构图及PCR，sanger验证。A：1p36.31区域的translocation导致ACOT7-NPHP4融合基因发生的图形化展示；B：融合基因在患者初发以及对照样本中的PCR验证；C：携带融合基因患者PCR验证产物的sanger测序结果图，确认了ACOT7外显子7与NPHP4外显子5的融合。

(4)选取合适的质粒，并将一段包含融合breakpoint的序列克隆到质粒中，从中挑选出阳性克隆进行PCR扩增和sanger测序，验证转入到质粒中序列的正确性，从而得到标准品。图2为ACOT7-NPHP4融合基因的质粒标准品构建结果。A：融合基因标准品质粒pGEM T-easy-ACOT7-NPHP4图谱；B：标准品质粒sanger测序结果。

(5)设计了检测内参/目的基因用引物、探针，采用实时荧光PCR技术，检测内参基因ABL、ACOT7-NPHP4融合基因的表达情况。试剂盒通过调整内参/目的基因的引物探针比例，以及PCR反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。

实施例2.试剂盒的制备

1、特异性的引物和探针的设计

根据基因序列(ABL1基因序列、ACOT7基因序列、NPHP4基因序列均来自于美国国家生物技术信息中心核酸数据库，ABL1基因Entrez Gene ID 25，基因参考序列NM_005157.5；ACOT7基因Entrez Gene ID 11332，基因参考序列NM_181864.3；NPHP4基因Entrez Gene ID261734，基因参考序列NM_015102.5)设计特异性探针和引物。

2、试剂盒组分配制

cDNA第一链合成试剂：TIANScriptⅡRT Kit(TIANGEN公司)，检测体系PCR反应液：Pro Taq HS Premix Probe qPCR Kit(Acurrate Biology，AG11704)，其主要成分包含DNA聚合酶、Mg²⁺、dNTP、逆转录酶、DTT。

引物和探针：包括检测ACOT7-NPHP4融合基因和内参ABL引物以及与引物相对应的探针，具体如下：

ACOT7-NPHP4-F:CCAACATCGTCACAGCTTC(SEQ ID NO.2)

ACOT7-NPHP4-R:GCTTCAGCGTGTACTGCA(SEQ ID NO.3)

ACOT7-NPHP4-Probe:FAM-AGAAAAGAAAACAGACACATGACCCTC

-TAMRA(SEQ ID NO.4)

ABL1-F:CTAAAGGTGAAAAGCTCCG(SEQ ID NO.5)

ABL1-R:GACTGTTGACTGGCGTGAT(SEQ ID NO.6)

ABL1-Probe:FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-TAMRA(SEQ ID NO.7)。

阳性对照品：包含有带有ACOT7-NPHP4融合基因的质粒标准品和带有ABL基因的质粒；阴性对照品：去离子水和10例健康骨髓供者的cDNA。

实施例3.本试剂盒检测ALL患者标本的操作流程

1、取送检的ALL患者抗凝血标本，抽提血液中的总RNA：在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀。室温静置10min；5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1ml TRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静置5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm 4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm 4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10-15min，加入20μlRNase-free水溶解沉淀。

2、参考TIANGEN公司的TIANScriptⅡRT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为cDNA。

3、试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，X＝23μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)，每人份23μl分装。

4、加样：加入检测体系PCR反应液中2μl cDNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。

5、检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35s，反应40个循环，荧光信号于60℃时采集。

6、结果判断：若无目的基因扩增信号曲线，内参、阳性对照以及阴性对照检测均正常时，结果为阴性；若有目的基因扩增信号曲线，内参、阳性对照以及阴性对照检测均正常时，结果为阳性。若内参、阳性对照以及阴性对照出现异常，则需查明原因，做出调整后重新检测。

7、ACOT7-NPHP4可以作为急性淋巴细胞白血病患者特异性的分子标志物：我们应用上述构建的检测试剂盒，对一例ACOT7-NPHP4阳性患者临床治疗的3个时间节点样本进行了MRD监测。图3为使用本发明所述试剂盒检测ACOT7-NPHP4的结果图例。A：ACOT7-NPHP4标准曲线，阳性样本以及阴性对照；B：ACOT7-NPHP4阳性患者随治疗，ACOT7-NPHP4在mRNA水平的变化。Sample1:初发；Sample2:化疗后18天；Sample3:化疗后35天。我们发现，该患者在初发(Sample1)时ACOT7-NPHP4表达水平高，但在临床给予诱导化疗后，该患者新融合基因表达水平逐渐下降(Sample2和Sample3)，但仍有一定的表达，与患者病情未明显缓解状态一致，说明ACOT7-NPHP4表达与疾病进展趋势一致，仍需实时监测警惕复发风险。上述结果表明，ACOT7-NPHP4可以作为患者新的分子标志物用来监测MRD，并且证明该试剂盒的准确可靠。

综上结果表明，本试剂盒可高通量、快速、准确地检测样本，同时具有良好的特异性和可重复性，可有效避免假阳性和假阴性结果。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连医科大学附属第二医院

上海交通大学医学院附属新华医院

<120> 一种ACOT7-NPHP4融合基因及其应用和检测试剂盒

<130> /

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4623

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgaagctgc ttgccagggc tctccggctc tgtgagtttg ggaggcaggc atcttccagg 60

aggctggtgg ctggccaggg atgtgtgggg ccccggcgag ggtgctgcgc tcccgtccag 120

gtggttgggc ccagggctga tctcccaccc tgtggagcct gcattactgg aaggatcatg 180

cggccagatg atgccaacgt ggccggcaat gtccacgggg ggaccatcct gaagatgatc 240

gaggaggcag gcgccatcat cagcacccgg cattgcaaca gccagaacgg ggagcgctgt 300

gtggccgccc tggctcgtgt cgagcgcacc gacttcctgt ctcccatgtg catcggtgag 360

gtggcgcatg tcagcgcgga gatcacctac acctccaagc actctgtgga ggtgcaggtc 420

aacgtgatgt ccgaaaacat cctcacaggt gccaaaaagc tgaccaataa ggccaccctg 480

tggtatgtgc ccctgtcgct gaagaatgtg gacaaggtcc tcgaggtgcc tcctgttgtg 540

tattcccggc aggagcagga ggaggagggc cggaagcggt atgaagccca gaagctggag 600

cgcatggaga ccaagtggag gaacggggac atcgtccagc cagtcctcaa cccagagccg 660

aacactgtca gctacagcca gtccagcttg atccacctgg tggggccttc agactgcacc 720

ctgcacggct ttgtgcacgg aggtgtgacc atgaagctca tggatgaggt cgccgggatc 780

gtggctgcac gccactgcaa gaccaacatc gtcacagctt ccgtggacgc cattaatttt 840

catgacaaga tcagaaaaga aaacagacac atgaccctca ttgagaactg cagcctgcag 900

tacacgctga agccacaccc ggccctggag cctgcgttcc accttcttcc tgagaacctt 960

ctggtgtctg gtctgcagca gatacctggc ctgcttccag ctcatggaga atccggcgac 1020

gctctccgaa agcctcgcct ccagaagccc atcacggggc acttggatga cttattcttc 1080

accctgtacc cctccctgga gaagtttgag gaagagctgc tggagctcca cgtccaggac 1140

cacttccagg agggatgtgg cccactggac ggtggtgccc tggagatcct ggagcggcgc 1200

ctgcgtgtgg gcgtgcacaa tggtctgggc ttcgtgcaga ggccgcaggt cgttgtactg 1260

gtgcctgaga tggatgtggc cttgacgcgc tcagctagct tcagcaggaa agtggtctcc 1320

tcttccaaga ccagctccgg gagccaagct ctggttttga gaagccgcct ccgcctccca 1380

gagatggtcg gccaccctgc atttgcggtc atcttccagc tggagtacgt gttcagcagc 1440

cctgcaggag tggacggcaa tgcagcttcg gtcacctctc tgtccaacct ggcatgcatg 1500

cacatggtcc gctgggctgt ttggaacccc ttgctggaag ctgattctgg aagggtgacc 1560

ctgcctctgc agggtgggat ccagcccaac ccctcgcact gtctggtcta caaggtaccc 1620

tcagccagca tgagctctga agaggtgaag caggtggagt cgggtacact ccggttccag 1680

ttctcgctgg gctcagaaga acacctggat gcacccacgg agcctgtcag tggccccaaa 1740

gtggagcggc ggccttccag gaaaccaccc acgtcccctt cgagcccgcc agcgccagta 1800

cctcgagttc tcgctgcccc gcagaactca cctgtgggac cagggttgtc aatttcccag 1860

ctggcggcct ccccgcggtc cccgactcag cactgcttgg ccaggcctac ttcacagcta 1920

ccccatggct ctcaggcctc cccggcccag gcacaggagt tcccgttgga ggccggtatc 1980

tcccacctgg aagccgacct gagccagacc tccctggtcc tggaaacatc cattgccgaa 2040

cagttacagg agctgccgtt cacgcctttg catgccccta ttgttgtggg aacccagacc 2100

aggagctctg cagggcagcc ctcgagagcc tccatggtgc tcctgcagtc ctccggcttt 2160

cccgagattc tggatgccaa taaacagcca gccgaggctg tcagcgctac agaacctgtg 2220

acgtttaacc ctcagaagga agaatcagat tgtctacaaa gcaacgagat ggtgctacag 2280

tttcttgcct ttagcagagt ggcccaggac tgccgaggaa catcatggcc aaagactgtg 2340

tatttcacct tccagttcta ccgcttccca cccgcaacga cgccacgact gcagctggtc 2400

cagctggatg aggccggcca gcccagctct ggcgccctga cccacatcct cgtgcctgtg 2460

agcagagatg gcacctttga tgctgggtct cctggcttcc agctgaggta catggtgggc 2520

cctgggttcc tgaagccagg tgagcggcgc tgctttgccc gctacctggc cgtgcagacc 2580

ctgcagattg acgtctggga cggagactcc ctgctgctca tcggatctgc tgccgtccag 2640

atgaagcatc tcctccgcca aggccggccg gctgtgcagg cctcccacga gcttgaggtc 2700

gtggcaactg aatacgagca ggacaacatg gtggtgagtg gagacatgct ggggtttggc 2760

cgcgtcaagc ccatcggcgt ccactcggtg gtgaagggcc ggctgcacct gactttggcc 2820

aacgtgggtc acccgtgtga acagaaagtg agaggttgta gcacattgcc accgtccaga 2880

tctcgggtca tctcaaacga tggagccagc cgcttctctg gaggcagcct cctcacgact 2940

ggaagctcaa ggcgaaaaca cgtggtgcaa gcacagaagc tggcggacgt ggacagtgag 3000

ctggctgcca tgctactgac ccatgcccgg cagggcaagg ggccccagga cgtcagccgc 3060

gagtcggatg ccacccgcag gcgtaagctg gagcggatga ggtctgtgcg cctgcaggag 3120

gccgggggag acttgggccg gcgcgggacg agcgtgttgg cgcagcagag cgtccgcaca 3180

cagcacttgc gggacctaca ggtcatcgcc gcctaccggg aacgcacgaa ggccgagagc 3240

atcgccagcc tgctgagcct ggccatcacc acggagcaca cgctccacgc cacgctgggg 3300

gtcgccgagt tctttgagtt tgtgcttaag aacccccaca acacacagca cacggtgact 3360

gtggagatcg acaaccccga gctcagcgtc atcgtggaca gtcaggagtg gagggacttc 3420

aagggtgctg ctggcctgca cacaccggtg gaggaggaca tgttccacct gcgtggcagc 3480

ctggcccccc agctctacct gcgcccccac gagaccgccc acgtcccctt caagttccag 3540

agcttctctg cagggcagct ggccatggtg caggcctctc ctgggttgag caacgagaag 3600

ggcatggacg ccgtgtcacc ttggaagtcc agcgcagtgc ccactaaaca cgccaaggtc 3660

ttgttccgag cgagtggtgg caagcccatc gccgtgctct gcctgactgt ggagctgcag 3720

ccccacgtgg tggaccaggt cttccgcttc tatcacccgg agctctcctt cctgaagaag 3780

gccatccgcc tgccgccctg gcacacattt ccaggtgctc cggtgggaat gcttggtgag 3840

gaccccccag tccatgttcg ctgcagcgac ccgaacgtca tctgtgagac ccagaatgtg 3900

ggccccgggg aaccacggga catatttctg aaggtggcca gtggtccaag cccggagatc 3960

aaagacttct ttgtcatcat ttactcggat cgctggctgg cgacacccac acagacgtgg 4020

caggtctacc tccactccct gcagcgcgtg gatgtctcct gcgtcgcagg ccagctgacc 4080

cgcctgtccc ttgtccttcg ggggacacag acagtgagga aagtgagagc tttcacctct 4140

catccccagg agctgaagac agaccccaaa ggtgtcttcg tgctgccgcc tcgtggggtg 4200

caggacctgc atgttggcgt gaggcccctt agggccggca gccgctttgt ccatctcaac 4260

ctggtggacg tggattgcca ccagctggtg gcctcctggc tcgtgtgcct ctgctgccgc 4320

cagccgctca tctccaaggc ctttgagatc atgttggctg cgggcgaagg gaagggtgtc 4380

aacaagagga tcacctacac caacccctac ccctcccgga ggacattcca cctgcacagc 4440

gaccacccgg agctgctgcg gttcagagag gactccttcc aggtcggggg tggagagacc 4500

tacaccatcg gcttgcagtt tgcgcctagt cagagagtgg gtgaggagga gatcctgatc 4560

tacatcaatg accatgagga caaaaacgaa gaggcatttt gcgtgaaggt catctaccag 4620

tga 4623

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ccaacatcgt cacagcttc 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gcttcagcgt gtactgca 18

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

agaaaagaaa acagacacat gaccctc 27

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctaaaggtga aaagctccg 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gactgttgac tggcgtgat 19

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ccatttttgg tttgggcttc acaccatt 28

Claims (7)

1.一种ACOT7-NPHP4融合基因，其特征在于，所述融合基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述ACOT7-NPHP4融合基因在制备急性淋巴细胞白血病诊断和/或监测制剂或试剂盒中的应用。

3.一种急性淋巴细胞白血病诊断和/或监测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有检测权利要求1所述ACOT7-NPHP4融合基因或检测其表达产物的试剂。

4.根据权利要求3所述急性淋巴细胞白血病诊断和/或监测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上游引物、下游引物、Taqman探针、内参、PCR反应缓冲液、阳性对照和阴性对照；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求4所述急性淋巴细胞白血病诊断和/或监测试剂盒，其特征在于，所述Taqman探针的5’端标记有FAM基团，所述探针的3’端标记有TAMRA基团。

6.根据权利要求4所述急性淋巴细胞白血病诊断和/或监测试剂盒，其特征在于，所述内参中包含内参上游引物，内参下游引物和内参探针；

所述内参上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述内参下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

7.一种非疾病诊断目的的检测权利要求1所述ACOT7-NPHP4融合基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取人血液样本中的总RNA，将RNA反转为cDNA作为待测样品；

(2)配置PCR反应液，再分别加入待测样品，阳性对照和阴性对照；

(3)实时荧光PCR仪上检测，反应条件：95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，反应40个循环，荧光信号于60℃时采集；

其中所述PCR反应液包括上游引物、下游引物、Taqman探针、内参、PCR

反应缓冲液、阳性对照和阴性对照；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

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