CN105671031A - 基于乳液pcr的大片段单分子簇扩增技术 - Google Patents

基于乳液pcr的大片段单分子簇扩增技术 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于乳液PCR的大片段单分子簇扩增方法，所述方法包括：将携带有生物素标记的PCR引物与磁珠进行结合孵育，使引物吸附于磁珠表面形成引物簇，利用所述引物簇进行乳液PCR反应。本发明利用长片段核酸扩增酶，结合乳液PCR技术，制备单分子大片段簇，扩增的大片段长度可达到4-6Kbp，可以作为基因组文库构建新技术。

Description

基于乳液PCR的大片段单分子簇扩增技术
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体的，涉及一种基于乳液PCR的大片段单分子簇扩增技术。
背景技术
PCR技术是通过酶促反应体外合成DNA片段的方法，能够迅速获得所需片段，具有操作简便、灵敏度高、特异性强等特点。PCR技术已经被应用于多个领域，如基因表达分析、核酸序列分析以及当前的疾病诊断等。在PCR技术基础上衍生出各种分支技术，乳液PCR技术就是其中之一，乳液PCR主要是通过将PCR反应所有成分注入快速旋转的油相表面，从而在一个反应体系中形成数目庞大的微反应器，使得每个微反应器中有少量的模板，从而减少模板间、引物间的相互干扰，最大化试剂的利用率，提高PCR反应的特异性。其应用领域也是相当广泛，包括可以辅助形成高通量测序过程中的单分子簇、使多重PCR中每种PCR产物相对均衡等。虽然该技术的优势明显、应用广泛，但由于其仅适用于较短的扩增长度，所以限制了其在更多方面的应用。虽然目前用于长片段扩增的DNA聚合酶已经很多，扩增的最长片段达到几十Kbp，但是实际扩增过程中的情况却是常常难以获得理想的扩增效果，得到的扩增条带也经常有非特异带甚至弥散带，所以不能满足大片段扩增的需求。
因此有必要对乳液PCR技术进行优化，增加乳液PCR技术的扩增长度，扩展乳液PCR的应用范围，从而为进一步拓展乳液PCR技术的应用领域提供有效手段。
发明内容
本发明的目的在于解决现有的乳液PCR技术所存在的难以扩增获得特异性长片段的缺陷，发明一种新的大片段单分子簇扩增方法。
为此，本发明提供了一种基于乳液PCR技术的大片段单分子簇扩增方法，所述方法包括：将携带有生物素标记的PCR引物与磁珠进行结合孵育，使引物吸附于磁珠表面形成引物簇，利用所述引物簇进行乳液PCR反应。
本发明中对于PCR引物进行生物素标记的方法没有特别的限制，可以利用本领域常规的标记方法进行。
可选的，所述磁珠为T1磁珠或M270磁珠。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述PCR引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
可选的，结合孵育的体系为：
可选的，所述结合孵育的条件为将所述携带有生物素标记的PCR引物与磁珠在20-25℃孵育5-20min。清洗磁珠4-5次，清洗的方法为用1×BeadsWashBuffer清洗两次，ddH2O洗2-3次。
在本发明所提供的方法中，乳液PCR反应体系由预先各自配制好的水相和油相混合制成。在所述乳液PCR反应体系中，包括引物簇以及游离引物，所述游离引物不带有生物素标记，游离引物的核苷酸序列与引物簇中磁珠上所吸附的PCR引物相同。游离引物的作用为增加微反应体系中单分子模板的数量，模板数量的增多会增大模板与磁珠上引物的碰撞几率，使得扩增反应更容易发生。
可选的，乳液PCR反应体系的水相包括：
在本发明所提供的方法中，所述游离PCR引物为未经过生物素标记的PCR引物。
本发明所提供的方法还包括预先对基因组DNA进行破碎获得5-8Kbp的大片段，利用所述大片段进行文库构建获得大片段文库作为模板DNA。
本发明中，对于文库构建的方式没特别的限制，可以按照本领域常规的方法进行构建。
在本发明的一种优选的实施方式中，可以按照以下步骤构建大片段文库：将超声破碎后的大片段用AMPurebeads进行纯化，试剂盒进行大片段文库构建，经过末端修复加A尾后，加接头，接头序列优选如SEQIDNO.1-2所示。用0.6％琼脂糖凝胶电泳分离核酸片段，切取4Kbp、5Kbp或6Kbp附近的片段，用试剂盒回收目的片段获得大片段文库。
可选的，乳液PCR反应的条件包括：94℃预变性1min；98℃变性10sec，68℃退火延伸4min，15-25个循环；72℃延伸5min；可根据实际需求选择具体循环数。
优选的，为了获得更好的扩增效果，增加产物量、减少非特异性带和弥散带的产生，在扩增过程中，升温速度为1.0-1.5℃/s，降温速度为1.5-2.4℃/s。
特别优选的，升温速率为1.0℃/S，降温速率为1.5℃/S。
可选的，乳液PCR反应所使用的DNA聚合酶为KAPA、NEB或KOD。
可选的，为了获得更好的扩增效果，减少非特异性带和弥散带的产生，乳液PCR反应所使用的DNA聚合酶为KOD。
可选的，在每100ulPCR反应体系的水相中加入321.6ul油，涡旋震荡形成乳液PCR体系；涡旋混匀仪最大转速震荡5-7分钟，每50ul一管进行PCR反应。
可选的，利用超声破碎的方式对基因组DNA进行破碎，超声破碎的条件包括：在20-45k赫兹下超声破碎10-30s。
可选的，所述方法还包括利用与乳液PCR反应体系等体积的二丁醇或异丙醇进行破乳，破乳的条件为以1000-5000转/分钟的速度离心4-6分钟，回收磁珠。
本发明中，油相可以按照以下方式进行配制：使用lifescience公司的油相，按照Stabilizer1：Stabilizer2：Mineraloil＝75：4：920或9：2：189的比例进行油相配制。
本发明利用长片段核酸扩增酶，结合乳液PCR技术，制备单分子大片段簇，可以保证一个磁珠上携带多个同样的大分子，在用于基因组文库构建时能够确保同样index对应的大片段在打断后有overlap，确保大片段的有效组装，从而协助基因组组装。目前已成功达到4-6Kbp，并且二次PCR检测主带清晰，可以作为基因组文库构建新技术的储备技术。
附图说明
图1为本发明实施例1的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为1Kbmarker，1为二次PCR结果。
图2为本发明实施例2的琼脂糖凝胶电泳图，其中左边起第一条泳道为1Kbmarker，第二和三泳道分别为以0.25ug和0.5ug磁珠为模板的二次PCR结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
1、大片段核酸文库的制备
取1ug水稻基因组DNA，进行大片段核酸文库制备:
(1)水稻基因组DNA经10s超声破碎，获得5-8Kbp的大片段，用AMPureXPBeads(BECMAN，A63880)纯化；纯化后的样品加入VAHTSTurboEndPrepEnzymeMix和VAHTSTurboEndPrepReactionBuffer，混匀后20℃反应30min、65℃反应30min；
(2)反应结束后加入VAHTSTurboT4DNALigase、VAHTSTurboLigaseEnhancer、加入接头，混匀后20℃反应15min，磁珠纯化；
接头序列如SEQIDNO.1-2所示。
SEQIDNO.1：5'-TGAGTGCCTTCTGCGTCCAGTCT-3'；
SEQIDNO.2：5'-PO3-GACTGGACGCAGAAGGCACTCA-3'。
(3)纯化后的样品，经0.6％琼脂糖凝胶进行片段分离，切取5Kbp下边缘至6Kbp下边缘的胶块，回收DNA片段。
(4)检测大片段文库Qubit浓度为1.44ng/ul。
2、引物簇制备
(1)取M270磁珠，与含生物素标记的引物孵育，形成引物簇，体系如下：
20℃孵育15min，1×BeadsWashBuffer清洗两次，ddH2O洗2-3次。
3、乳液PCR体系形成
(1)油相配制：Stabilizer1、Stabilizer2和Mineraloil比例为75：4：920；
(2)水相反应体系制备
充分混匀后置于冰上；其中PCR引物如SEQIDNO.3所示：
5'-TGAGTGCCTTCTGCGTCCAGTCT-3'。
(3)乳液形成，每100ul水相PCR体系加入321.6ul油相，涡旋混匀仪最大转速震荡5分钟，每50ul一管进行PCR扩增。
4、乳液PCR扩增，扩增条件如下：
5、破乳回收磁珠，加入等体积的二丁醇，充分混匀，3000转/分钟离心5min，1×BeadsWashBuffer清洗两次，ddH2O洗2-3次。
6、二次PCR检测片段扩增情况
取0.5ug磁珠，按如下体系配制二次PCR体系：
琼脂糖凝聚电泳检测磁珠上大片段情况。结果显示，主条带清晰，说明第一轮乳液PCR已成功将大片段扩增在磁珠上，如图1所示。
实施例2
1、大片段核酸文库的制备
取1.5ug水稻基因组DNA，进行大片段核酸文库制备:
(1)水稻基因组DNA经10s超声破碎，获得5-8Kbp的大片段，AMPureXPBeads(BECMAN,A63880)纯化；纯化后的样品加入VAHTSTurboEndPrepEnzymeMix和VAHTSTurboEndPrepReactionBuffer，混匀后20℃反应30min、65℃反应30min；
(2)反应结束后加入VAHTSTurboT4DNALigase、VAHTSTurboLigaseEnhancer、加入接头，混匀后20℃反应15min，磁珠纯化；
接头序列如SEQIDNO.1-2所示。
SEQIDNO.1-2序列为：
5'-TGAGTGCCTTCTGCGTCCAGTCT-3'
5'-PO3-GACTGGACGCAGAAGGCACTCA-3'
(3)纯化后的样品，经0.6％琼脂糖凝胶进行片段分离，切取5Kbp下边缘至6Kbp下边缘的胶块，回收DNA片段。
(4)检测大片段文库Qubit浓度为0.488ng/ul。
2、引物簇制备
(1)取T1磁珠，
与含生物素标记的引物孵育，形成引物簇，体系如下：
20℃孵育15min，1×BeadsWashBuffer清洗两次，ddH2O洗2-3次。
3、乳液PCR体系形成
(1)油相配制；Stabilizer1、Stabilizer2和Mineraloil比例为75：4：920；
(2)水相反应体系制备
充分混匀后置于冰上；其中PCR引物序列如SEQIDNO.3所示。
(3)乳液形成，每100ul水相PCR体系加入321.6ul油相，涡旋混匀仪最大转速震荡5分钟，每50ul一管进行PCR扩增。根据计算，每个微滴内有0-1个模板分子。显微镜下观察，大部分情况为每个微滴内含1个引物簇，保证单分子簇的形成。
乳液PCR扩增，扩增条件如下：
4、破乳回收磁珠，加入等体积的二丁醇或异丙醇，充分混匀，3000转/分钟离心5min，1×BeadsWashBuffer清洗两次，ddH2O洗2-3次。
5、二次PCR检测片段扩增情况
取0.25ug和0.5ug磁珠，按如下体系分别配制二次PCR体系：
琼脂糖凝聚电泳检测磁珠上大片段情况。结果显示，主条带清晰，说明第一轮乳液PCR已成功将大片段扩增在磁珠上。
6、上述制备的大片段磁珠，经转座酶打断并连接接头、PCR扩增获取文库，经二代测序，结果显示，目的基因组的比对效率达到94.65％。说明制备的大片段单分子簇在制备过程中被污染的几率很小，而微滴内单引物簇和0-1个模板分子的设计保证单分子簇的成功制备，可以用于后续试验。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种基于乳液PCR的大片段单分子簇扩增方法，其特征在于，所述方法包括：将携带有生物素标记的PCR引物与磁珠进行结合孵育，使引物吸附于磁珠表面形成引物簇，利用所述引物簇进行乳液PCR反应。
2.根据权利要求1所述的大片段单分子簇扩增方法，其特征在于，所述结合孵育的条件为将所述携带有生物素标记的PCR引物与磁珠在20-25℃孵育5-20min。
3.根据权利要求1或2所述的大片段单分子簇扩增方法，其特征在于，乳液PCR反应体系的水相包括：
4.根据权利要求3所述的大片段单分子簇扩增方法，其特征在于，所述游离PCR引物为未经过生物素标记的PCR引物。
5.根据权利要求3所述的大片段单分子簇扩增方法，其特征在于，乳液PCR反应的条件包括：
94℃预变性1min；98℃变性10sec，68℃退火延伸4-6min，15-25个循环；72℃延伸5min。
6.根据权利要求5所述的大片段单分子簇扩增方法，其特征在于，在扩增过程中，升温速度为1.0-1.5℃/s，降温速度为1.5-2.4℃/s。
7.根据权利要求4-6中任意一项所述的大片段单分子簇扩增方法，其特征在于，所述方法包括对基因组DNA进行破碎获得5-8Kbp的大片段，利用所述大片段进行文库构建获得大片段文库，以大片段文库作为模板DNA。
8.根据权利要求7所述的大片段单分子簇扩增方法，其特征在于，乳液PCR反应所使用的DNA聚合酶为KAPA、NEB或KOD。
9.根据权利要求1、2、4-6和8中任意一项所述的大片段单分子簇扩增方法，其特征在于，PCR引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
10.根据权利要求9所述的大片段单分子簇扩增方法，其特征在于，所述磁珠为T1磁珠或M270磁珠。
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