CN111944881A - 一种新型快速实时荧光定量pcr方法 - Google Patents

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吴迪
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Abstract

本发明提供一种新型快速实时荧光定量PCR方法，包括优化设计上下游引物和优化设计MGB荧光探针以及修改RT‑PCR反应条件；本发明通过对上下游引物、荧光探针的优化设计，提高引物探针的Tm值，大幅提高了扩增过程中退火/延伸步骤温度，缩小了变性与退火/延伸过程的温度差，从而减少了升温、降温过程中所需的时间，以达到缩短核酸扩增反应时间的目的。本发明既可适用于普通荧光定量PCR仪，也可适用于任何基于RT‑PCR技术的核酸诊断设备，搭配最适反应温度的程序设置，均可实现缩短RT‑PCR反应时间的效果。该方法对基于RT‑PCR技术的疾病快速核酸诊断提供新思路，其成果具有一定的理论意义和较高的应用价值。

Description

一种新型快速实时荧光定量PCR方法
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，尤其是涉及核酸POCT领域的一种新型快速实时荧光定量PCR方法。
背景技术
实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR，RT-PCR)是一种在核酸扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。该技术通过在PCR反应体系中加入荧光标记的探针(如TaqMan)，利用实时积累的荧光信号监测整个扩增反应过程，通过已知浓度标准品扩增得出的标准曲线对未知模板进行定量分析，以此来评估RT-PCR扩增效果。传统的PCR反应过程中主要包括三个步骤，即变性、退火、延伸。变性是指DNA双链在体外95℃高温时变性解开成单链；退火是指在低温(通常是60℃左右)引物与变性解链的单链按碱基互补配对的原则结合，重新形成DNA双链结构；延伸是指将温度调至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。而在RT-PCR中，由于通常检测的目的片段长度一般较短，因此在反应过程中也经常采用两步法扩增，即95℃变性，60℃退火/延伸。
由于RT-PCR技术具有良好的扩增特异性，灵敏度高、取样少、定量准确等优势，因而被广泛应用于疾病核酸诊断当中。疾病的核酸诊断步骤通常包括样本采集、核酸提取、核酸扩增、扩增结果分析几个步骤，全流程通常用时最快需要2-3个小时。但随着快速诊断、POCT等概念的兴起，对疾病核酸精确、快速诊断的要求越来越高，传统RT-PCR技术检测速度相对较慢的缺陷逐渐显现出来。尽管目前有部分基于RT-PCR技术的POCT设备，通过缩小反应体系体积、提高RT-PCR扩增过程中升降温速度等方法，缩短了RT-PCR反应所需的时间，但这些优化方法对传统RT-PCR扩增反应速度的优化已达到瓶颈，难以进一步提高其反应速度。
发明内容
为了克服现有技术中传统RT-PCR扩增反应速度慢的问题，本发明提供一种新型快速实时荧光定量PCR方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种新型快速实时荧光定量PCR方法，包括优化设计上下游引物和优化设计MGB荧光探针以及新的RT-PCR反应条件。
所述优化设计上下游引物是在常规RT-PCR原有的上下游引物序列基础上，通过适当延长引物序列或在同一目的基因片段内选择新的位点，重新设计引物序列，提高上下游引物的Tm值；
所述优化设计MGB荧光探针是在原有RT-PCR荧光探针序列基础上适当加长或在同一目的基因片段上选择合适的位点重新设计序列，提高MGB荧光探针的Tm值；
所述新的RT-PCR反应条件是指提高反应退火温度和延伸温度。
所述新的RT-PCR反应条件中，实际最适的退火温度值取决于上下游引物和MGB荧光探针设计的Tm值综合考量，也可通过设置梯度扩增程序自行摸索。
所述的新型快速实时荧光定量PCR方法既适用于两步法PCR扩增(变性-退火/延伸)，也适用于三步法PCR扩增(变性-退火-延伸)。
作为优选，所述优化设计上下游引物具体包括：采用ABI Primer Express 3.0软件进行引物序列设计，设计上下游引物序列长度在20-40bp之间，设计Tm值在60-72℃，上下游引物的Tm值差值在1℃以内。
作为优选，所述优化设计MGB荧光探针具体包括：2)采用ABI Primer Express 3.0软件进行MGB荧光探针序列设计，设计MGB荧光探针的长度在20-30bp之间，设计Tm值在70-81℃。
作为优选，所述新的RT-PCR反应条件具体包括：将通常RT-PCR扩增反应中55-60℃退火，72℃延伸修改为60-72℃退火、延伸。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明方法能够减少升温、降温过程中所需的时间，提高了RT-PCR扩增反应速度；提高了退火/延伸温度，进一步降低了出现非特异性扩增的几率，进一步提高了RT-PCR反应的特异性。
(2)本发明适用于对各种常见的RT-PCR反应引物、探针序列进行优化设计.
(3)本发明既可适用于普通荧光定量PCR仪，也可适用于任何基于RT-PCR技术的核酸诊断设备，搭配最适反应温度的程序设置，均可实现缩短RT-PCR反应时间的效果。该方法的建立将对基于RT-PCR技术的疾病快速核酸诊断提供新思路，其成果具有一定的理论意义和应用价值，具有广阔的应用前景。
(4)本发明通过对上下游引物、荧光探针的优化设计，提高引物探针的Tm值，大幅提高了扩增过程中退火/延伸步骤温度，缩小了变性与退火/延伸过程的温度差，从而减少了升温、降温过程中所需的时间，以达到缩短核酸扩增反应时间的目的。该方法相比传统RT-PCR扩增方法，反应时间进一步缩短，并进一步降低了非特异性扩增几率。与基于恒温扩增技术的核酸诊断技术相比，在检测速度接近的前提下具有更高的检测精度。因此，该新型快速实时荧光定量PCR方法在病原快速核酸检测领域极具应用价值。
附图说明
图1是常规RT-PCR引物探针的扩增曲线图。
图2是本发明新型快速RT-PCR引物探针的扩增曲线图。
图3是常规RT-PCR引物探针扩增的标准曲线图。
图4是本发明新型快速RT-PCR引物探针扩增的标准曲线图。
图5是常规RT-PCR引物探针扩增的时间-温度变化曲线图。
图6是本发明新型快速RT-PCR引物探针扩增的时间-温度变化曲线图。
具体实施方式
以下优选的实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过下述优选实施例已对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
下文中将结合附图对本发明的实施例进行详细说明，需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
实施例1
如图1-6所示，基于新型快速实时荧光定量PCR方法缩短RT-PCR扩增时间的测试。
包括一段新型冠状病毒COVID-19的E基因序列，如SEQ ID No.1所示：
目的基因序列：
ATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTCTAA(SEQ ID No.1)
并采用ABI Primer Express 3.0软件对其进行上游引物、下游引物及荧光探针进行设计。其中，引物Tm值在55-60℃之间，荧光探针Tm值在68-70℃之间，设计后的上下游引物及荧光探针序列如SEQ ID No.2-4所示：
上游引物：ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCG(SEQ ID No.2)
下游引物：CGTTAACAATATTGCAGCAGTACGCACACA(SEQ ID No.3)
MGB荧光探针：5’CY3-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ13’(SEQ ID No.4)
本发明中同时针对SEQ ID No.2-4优化设计了上游引物、下游引物及MGB荧光探针，将引物Tm值提高至69-72℃之间，荧光探针Tm值在79-81℃之间，序列如SEQ ID No.5-7所示：
上游引物：CGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCG(SEQ ID No.5)
下游引物：CACGTTAACAATATTGCAGCAGTACGCACACA(SEQ ID No.6)
MGB荧光探针：5’CY3-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-MGB3’(SEQ ID No.7)
在检测中，利用上述两组上下游引物、荧光探针进行对比(即优化前与优化后进行对比，两者反应条件相同)。以人工合成的SEQ ID No.1基因作为模板，采用TAKARA PremixEx TaqTM试剂(RR390A)，以ABI-7500实时荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR扩增。其中，采用常规设计的引物探针反应条件为95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s；本发明中设计的MGB引物探针反应条件为95℃ 30s，95℃ 5s，70℃ 30s。反应体系如下：
试剂名称 用量
Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2X) 12.5μL
上游引物(10μmol/L) 0.5μL
下游引物(10μmol/L) 0.5μL
荧光探针 1μL
模板 2μL
ddH<sub>2</sub>O 8.5μL
总计 25μL
获得扩增曲线图如图1和图2所示、标准曲线图如图3和图4、扩增时间-温度变化曲线图如5和图6所示；图1和图2中的数字是基线的数值。本发明方法优化设计的上下游引物及MGB探针在保证扩增效率的基础上，扩增速度明显优于普通RT-PCR引物探针。
上述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (3)

1.一种新型快速实时荧光定量PCR方法，其特征是，包括优化设计上下游引物和优化设计MGB荧光探针以及新的RT-PCR反应条件；
所述优化设计上下游引物是在常规RT-PCR原有的上下游引物序列基础上，通过延长引物序列或在同一目的基因片段内选择新的位点，重新设计引物序列，提高上下游引物的Tm值；
所述优化设计MGB荧光探针是在原有RT-PCR荧光探针序列基础上延长探针序列或在同一目的基因片段上选择新的位点重新设计序列，并采用MGB作为3’端荧光淬灭基团提高MGB荧光探针的Tm值；所述MGB荧光探针的荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、JOE、CY3、VIC、TET、TAXAS RED、NED、ALEXA、TAMRA、CY5.5和CY5中的一种；
所述新的RT-PCR反应条件是将通常扩增反应中55-60℃退火，72℃延伸修改为60-72℃退火、延伸；
所述优化设计的上下游引物和MGB荧光探针适用于退火温度和延伸温度在60-72℃范围内的RT-PCR反应条件；
所述新的RT-PCR反应条件中，实际最适的退火温度值取决于上下游引物和MGB荧光探针的Tm值。
2.根据权利要求1所述的一种新型快速实时荧光定量PCR方法，其特征是，所述优化设计上下游引物具体包括：采用RT-PCR引物探针设计软件进行引物序列设计，设计上下游引物序列长度在20-40bp之间，设计Tm值从常规引物设计标准的58-60℃提高至60-72℃，上下游引物的Tm值差值在1℃以内。
3.根据权利要求1所述的一种新型快速实时荧光定量PCR方法，其特征是，所述优化设计MGB荧光探针具体包括：采用RT-PCR引物探针设计软件进行MGB荧光探针序列设计，设计MGB荧光探针的长度在20-30bp之间，设计Tm值从常规荧光探针设计标准的68-70℃提高至70-81℃。
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