CN111394482A - 一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，首先提取乳品样本，提取乳品样本多的RNA；在0.5ml微量离心管中，加入步骤一中RNA1‑5μg，补充DEPCH2O使总体积达11ul，在管中加10μM Oligo(dt)12‑18ul,然后均匀摇晃进行离心；70℃加热10分钟后，立即将步骤2中的微量离心管插入冰浴中1分钟，本发明一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，mRNA作为检测的靶基因，可以通过PCR等方法检出，而mRNA在细菌死亡后能够快速降解，因此选择适当的mRNA作为靶点基因，便能够只检测到具有活性的细菌，避免死亡细菌造成的假阳性干扰；同时项目通过对PCR引物的改进设计，运用实时荧光RT‑PCR技术，可以实现对多种细菌的联合检测，更加节省时间和成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种乳品检测方法，特别涉及一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，属于乳品检测技术领域。
背景技术
近年来，随着PCR技术的发展，针对某一种或一类致病菌的PCR检验方法被建立起来，得到了广泛应用。在食品安全检测领域，基于DNA扩增的PCR检测病原菌方法，检测时间为两天左右，并且检测结果若为阳性不能说明检出的致病菌为死菌还是活菌，还需进一步送实验室按照国标方法进行细菌培养才能够发检验报告。目前奶制品厂使用的方法仍然是直接细菌培养方法，需要4-5天时间才能发报告，导致大量产品要在仓库放置几天才能够出厂销售，造成生产厂家的生产成本增加。
发明内容
本发明的目的在于提供一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法：
(1)首先提取乳品样本，提取乳品样本多的RNA；
(2)在0.5ml微量离心管中，加入步骤一中RNA1-5μg，补充DEPCH2O使总体积达11ul，在管中加10μM Oligo(dt)12-18ul,然后均匀摇晃进行离心；
(3)70℃加热10分钟后，立即将步骤2中的微量离心管插入冰浴中1分钟；
(4)取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2 ul；上游引物(10pM)2ul；下游引物(10pM)2ul；dNTP(2mM)4ul；10×PCRbuffer5ul；Taq酶(2u/ul)1ul，轻轻混匀，离心，42℃孵育2～5min；
(5)将管插入冰中，加入RNaseH1，37℃孵育20min，降解残留的RNA，-20℃保存备用；
(6)取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2ul；上游引物(10pM)ul；下游引物(10pM)2ul；dNTP(2mM)4ul；10×PCRbuffer5ul；Taq酶(2u/ul)1ul，加入适量的ddH2O，使总体积达50ul，轻轻混匀，离心；
(7)设定RT-PCR程序，在适当的温度参数下扩增28～32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在RT-PCR扩增目的基因时，加入一对内参的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照；
(8)在反应管中加有石蜡油，需用100ul氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油或者直接取5-10ul电泳检测。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的PCRbuffer使用之间加44mL无水乙醇。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的引物扩增的效率和种属特异性，扩增的片段不能太长，引物的Tm值要接近，适合PCR扩增条件的优化。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的Taq DNA聚合酶在反应体系中，加入2-4ul的酶量，能够达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的PCR试剂配制应使用最高质量的双蒸水，采用0.22um滤膜过滤除菌或高压灭菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，mRNA作为检测的靶基因，可以通过PCR等方法检出，而mRNA在细菌死亡后能够快速降解，因此选择适当的mRNA作为靶点基因，便能够只检测到具有活性的细菌，避免死亡细菌造成的假阳性干扰；同时项目通过对PCR引物的改进设计，运用实时荧光RT-PCR技术，可以实现对多种细菌的联合检测，更加节省时间和成本。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。
本发明提供了一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，其步骤如下：
(1)首先提取乳品样本，提取乳品样本多的RNA；
(2)在0.5ml微量离心管中，加入步骤一中RNA1-5μg，补充DEPCH2O使总体积达11ul，在管中加10μM Oligo(dt)12-18ul,然后均匀摇晃进行离心；
(3)70℃加热10分钟后，立即将步骤2中的微量离心管插入冰浴中1分钟；
(4)取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2ul；上游引物(10pM)2ul；下游引物(10pM)2ul；dNTP(2mM)4ul；10×PCRbuffer5ul；Taq酶(2u/ul)1ul，轻轻混匀，离心，42℃孵育2～5min；
(5)将管插入冰中，加入RNaseH1，37℃孵育20min，降解残留的RNA，-20℃保存备用；
(6)取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2ul；上游引物(10pM)ul；下游引物(10pM)2ul；dNTP(2mM)4ul；10×PCRbuffer5ul；Taq酶(2u/ul)1ul，加入适量的ddH2O，使总体积达50ul，轻轻混匀，离心；
(7)设定RT-PCR程序，在适当的温度参数下扩增28～32个循环，为了保证实验结果的可靠与准确，可在RT-PCR扩增目的基因时，加入一对内参的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照；
(8)在反应管中加有石蜡油，需用100ul氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油或者直接取5-10ul电泳检测。
其中，的PCRbuffer使用之间加44mL无水乙醇，的引物扩增的效率和种属特异性，扩增的片段不能太长，引物的Tm值要接近，适合PCR扩增条件的优化。
进一步地，的Taq DNA聚合酶在反应体系中，加入2-4ul的酶量，能够达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。
更进一步地，的PCR试剂配制应使用最高质量的双蒸水，采用0.22um滤膜过滤除菌或高压灭菌。
“包含”和“包括”当用于本说明书中时被认为是指存在所陈述的特征、整体、步骤或部分，但不排除存在或添加一种或多种其他特征、整体、步骤、部分或其组合。因此，除非上下文另外明确要求，在整个所述描述和权利要求书中，单词包含”和“包括”等应以包括性意义解释而不是排他或穷尽的意义；就是说，以“包括但不限于”的意义。
Claims (5)
1.一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，其步骤如下：
(1)首先提取乳品样本，提取乳品样本多的RNA；
(2)在0.5ml微量离心管中，加入步骤一中RNA1-5μg，补充DEPCH2O使总体积达11ul，在管中加10μM Oligo(dt)12-18ul,然后均匀摇晃进行离心；
(3)70℃加热10分钟后，立即将步骤2中的微量离心管插入冰浴中1分钟；
(4)取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2ul；上游引物(10pM)2ul；下游引物(10pM)2ul；dNTP(2mM)4ul；10×PCRbuffer5ul；Taq酶(2u/ul)1ul，轻轻混匀，离心，42℃孵育2～5min；
(5)将管插入冰中，加入RNaseH1，37℃孵育20min，降解残留的RNA，-20℃保存备用；
(6)取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2ul；上游引物(10pM)ul；下游引物(10pM)2ul；dNTP(2mM)4ul；10×PCRbuffer5ul；Taq酶(2u/ul)1ul，加入适量的ddH2O，使总体积达50ul，轻轻混匀，离心；
(7)设定RT-PCR程序，在适当的温度参数下扩增28～32个循环，为了保证实验结果的可靠与准确，可在RT-PCR扩增目的基因时，加入一对内参的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照；
(8)在反应管中加有石蜡油，需用100ul氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油或者直接取5-10ul电泳检测。
2.根据权利要求1所述的一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，其特征在于：所述的PCRbuffer使用之间加44mL无水乙醇。
3.根据权利要求1所述的一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，其特征在于：所述的引物扩增的效率和种属特异性，扩增的片段不能太长，引物的Tm值要接近，适合PCR扩增条件的优化。
4.根据权利要求1所述的一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，其特征在于：所述的Taq DNA聚合酶在反应体系中，加入2-4ul的酶量，能够达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。
5.根据权利要求1所述的一种乳品中阪崎肠杆菌的快速检测方法，其特征在于：所述的PCR试剂配制应使用最高质量的双蒸水，采用0.22um滤膜过滤除菌或高压灭菌。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111944881A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-11-17 | 浙江大学 | 一种新型快速实时荧光定量pcr方法 |
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2019
- 2019-12-14 CN CN201911287343.XA patent/CN111394482A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111944881A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-11-17 | 浙江大学 | 一种新型快速实时荧光定量pcr方法 |
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