CN109136353A

CN109136353A - 一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的方法

Info

Publication number: CN109136353A
Application number: CN201810954236.7A
Authority: CN
Inventors: 戴宗; 郑旭玲; 李裕; 陈俊; 邹小勇
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2018-08-21
Filing date: 2018-08-21
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2038-08-21
Also published as: CN109136353B

Abstract

本发明公开了一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的方法，该方法通过设计特定的能够检测目标microRNA的模板T1和T2，将模板T1和T2、DNA聚合酶、切刻内切酶、dNTP混合，并于35～50℃条件下反应，检测扩增曲线，根据扩增曲线和标准曲线判定样品中是否含有目标microRNA，本发明方法能够进一步计算出样品中目标microRNA的具体含量。本发明方法扩增效率高，灵敏度高，缩短了分析时间；该方法对目标microRNA的序列依赖性小，通用性强；检测线性范围宽，特异性好；扩增体系简单，可发展成为试剂盒并向市场推广。

Description

一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的方法

技术领域

本发明属于核酸定量检测领域，具体涉及一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA(以下简称miRNA)的方法。

背景技术

miRNA是一类内源性的非编码小分子RNA，长约18-24个核苷酸，它对基因表达具有调控作用，在生物体内积极参与细胞生长分化及凋亡活动。大量的研究结果表明，miRNA的表达水平与癌症或者某些疾病之间密切相关。因此，对miRNA的定量检测不仅有助于深入理解其作用机制，而且对疾病的诊断与治疗以及相关基因药物的开发等具有重要意义。但由于miRNA的序列短小，具有高度的序列相似性，同源miRNA之间仅相差1-2个碱基且在实际样品中含量非常低，精确地定量检测miRNA是一个比较大的挑战。

鉴别和定量miRNA的常用方法有Northern印迹技术、Microarray方法和反转录定量PCR(Reverse Transcription-Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)方法。Northern印迹技术是基于杂交手段检测miRNA的标准方法，该方法需要大量的样品及分离富集步骤，操作繁琐、耗时长，且无法灵敏地辨别序列差别细微的miRNAs。Microarray方法可进行高通量的miRNA分析，同时对多种miRNAs进行检测，具有独特的优势，但方法的特异性较差、灵敏度较低，并且微阵列芯片的制作和检测价格昂贵。RT-qPCR是检测miRNA的很灵敏的方法，需要的样本量少，但由于miRNA序列短，需反转录后才能扩增，同时该方法需要精确的控制各个扩增步骤的温度。

为了更好地满足临床即时检测miRNA的要求，不需要热循环和变温过程的恒温扩增检测技术逐渐发展起来。滚环扩增(RCA)、环介导等温扩增(LAMP)、指数扩增(EXPAR)等都是具有代表性的恒温扩增检测技术。其中，滚环扩增和环介导等温扩增技术在检测miRNA时具有良好的特异性，但这些技术所需时间长，约为1.5h。由D.J.Galas等在2003年建立起来的恒温指数扩增反应(Isothermal Exponential Amplification Reaction)将检测时间缩短至30min，有希望成为实现即时检测(Point-of-care testing，POCT)的技术。但现有恒温指数扩增反应存在明显的序列依赖性问题，针对不同目标分子miRNA设计的扩增模板会表现出不同的扩增效率。2012年，Niemz团队通过计算机设计恒温指数扩增反应的模板，就发现在相同的热力学条件下，不同的模板展现出不同的扩增性能，恒温指数扩增反应的扩增效率在一定程度上依赖模板序列。因此，对恒温指数扩增进行改进，开发一种更快速灵敏且序列依赖性低的扩增技术具有重要意义。

发明内容

为了避免常规恒温指数扩增方法序列依赖性强的问题，同时提高扩增效率，缩短分析时间，实现快速分析的目的，本发明设计了一种高阶恒温指数扩增技术。高阶恒温指数扩增技术的扩增效率主要由模板决定，受目标microRNA序列的影响小，突破了目前恒温指数扩增方法对序列依赖强的局限性，可应用于检测多种短链核酸，同时具有扩增速度快、灵敏度高、特异性强等优点。

本发明的目的在于提供一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA模板和方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的模板，所述模板由模板T1和T2组成，模板T1和T2均为DNA序列；

模板T1和T2的5′端序列相同，均含有两段完全相同的序列x，两段序列x之间含有切刻内切酶识别的特异位点，记为x-特异位点-x；

模板T2的3′端序列能够与目标microRNA的5′端序列反向互补；

模板T1的3′端序列能够与模板T2的中间序列反向互补，所述T2的中间序列位于上述T2的3′端序列和T2的5′端序列之间；

模板T1的中间序列能够与目标microRNA的3′端序列反向互补，所述T1的中间序列位于上述T1的3′端序列和T1的5′端序列之间；

当T1、T2和目标microRNA三者共同存在时，三者之间序列两两部分反向互补，共同杂交形成T型结构；且在DNA聚合酶作用下，目标microRNA的3′端能够以T1模板进行扩增，扩增出的与T1 5′端序列反向互补的序列，记为x′-特异位点-x′；同时T1的3′端能够以T2模板进行扩增，扩增出的与T2 5′端序列反向互补的序列，记为x′-特异位点-x′；

上述x′-特异位点-x′与x-特异位点-x为反向互补序列，二者结合形成的双链能够被切刻内切酶切割，切刻内切酶切割的位点位于x′-特异位点-x′链中。

优选的，所述模板T2的3′端序列能够与目标microRNA的5′端序列反向互补，该段目标microRNA的5′端序列长度占目标microRNA总长度的8/21～12/21。

优选的，所述模板T1的中间序列与目标microRNA的3′端序列反向互补，该段目标microRNA的3′端序列长度占目标microRNA总长度的8/21～12/21。

优选的，所述序列x的长度为14～25nt。

优选的，所述模板T1的3′端序列能够与模板T2的中间序列反向互补，该段反向互补的序列长度为8～12bp。

优选的，所述切刻内切酶选自Nt.BstNBI、Nt.BsmAI、Nt.AlwI中的一种。

优选的，当待测目标microRNA为let-7b时，所述的模板为TCC ACC GTT TAC TTCTAA TGA CTC TCC ACC GTT TAC TTC TAA CCA CAA CCC CAA AAA和TCC ACC GTT TAC TTCTAA TGA CTC TTC CAC CGT TTA CTT CTT TTT TGG GAC CAA CCT ACT ACC TCA TT；

当待测目标microRNA为miR-374a时，所述的模板为TCC ACC GTT TAC TTC TAATGA CTC TCC ACC GTT TAC TTC TAA TTA CAA CCC CAAAAA和TCC ACC GTT TAC TTC TAATGACTC TTC CAC CGT TTA CTT CTT TTT TGG GAC ATA CAA TCT GAT AAG TT；

当待测目标microRNA为miR-762时，所述的模板为TCC ACC GTT TAC TTC TAA TGACTC TCC ACC GTT TAC TTC TGC TCG GCA CCC CAA AAA和TCC ACC GTT TAC TTC TAA TGACTC TTC CAC CGT TTA CTT CTT TTT TGG GAC CCC GGC CCC AGC CCC TT。

一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的方法，包括以下步骤：将待测样品、上述任一项所述的能够检测目标microRNA的模板T1和T2、DNA聚合酶、切刻内切酶、dNTP混合，将整个反应体系于35～50℃条件下反应，检测扩增曲线，根据扩增曲线和标准曲线判定样品中是否含有目标microRNA；并能够进一步计算出样品中目标microRNA的具体含量。

优选的，所述反应体系中DNA聚合酶浓度0.04～0.10U/μL、切刻内切酶浓度0.20～0.50U/μL、模板T2浓度0.005～0.200μM。

最优选的，所述反应体系中DNA聚合酶浓度0.06U/μL、切刻内切酶浓度0.40U/μL、模板T2浓度0.075μM。

优选的，所述反应体系中模板T1的浓度为0.08～0.12μM。

优选的，所述反应体系中还含有DNA聚合酶缓冲液、荧光染料、切刻内切酶缓冲液。

优选的，所述标准曲线以目标microRNA浓度为横坐标，以扩增曲线的POI值为纵坐标。

本发明的有益效果是：

本发明方法通过对广泛应用的指数扩增方法进行改进，设计两个指数扩增模板，与目标microRNA三者之间序列两两部分互补，共同杂交形成T型结构；然后再利用此改进的模板进行指数扩增检测待测目标物的浓度。本发明具有以下优点：

1)扩增效率高，灵敏度高，缩短了分析时间；

2)该方法对目标miRNA的序列依赖性小，通用性强；

3)检测线性范围宽，特异性好；

4)扩增体系简单，可发展成为试剂盒并向市场推广。

附图说明

图1本发明低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的原理图，图中Target:目标miRNA，extension：扩增，polymerase:DNA聚合酶，nicking：切割，nicking enzyme：切刻内切酶，release：释放。

图2不同组别的扩增曲线图；

图3本发明改进型恒温指数扩增与传统恒温指数扩增曲线对比图；

图4本发明方法对let-7家族各成员的扩增曲线图；

图5let-7b与let-7家族其他miRNA混合时的扩增曲线图；

图6不同浓度miR-374a和let-7b POI柱状图；

图7不同浓度miR-762和let-7b POI柱状图；

图8检测不同浓度let-7b的荧光扩增曲线；

图9检测miRNA的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的模板

如图1所示，根据目标miRNA设计两个部分互补的扩增模板T1和T2；模板T1和T2的5′端序列相同，均含有两段完全相同的序列x(长度为14～25nt)，两段序列x之间含有切刻内切酶识别的特异位点，记为x-特异位点-x；

模板T2的3′端序列能够与目标microRNA的5′端序列(该5′端序列长度占目标microRNA总长度的8/21～12/21)反向互补；

模板T1的3′端序列能够与模板T2的中间序列反向互补(长度为8～12bp)，所述T2的中间序列位于上述T2的3′端序列和T2的5′端序列之间；

模板T1的中间序列能够与目标microRNA的3′端序列(该3′端序列长度占目标microRNA总长度的8/21～12/21)反向互补，所述T1的中间序列位于上述T1的3′端序列和T1的5′端序列之间；

当T1、T2和目标microRNA三者共同存在时，三者之间序列两两部分反向互补，共同杂交形成T型结构；且在DNA聚合酶作用下沿T1、T2同时进行双向扩增，即目标microRNA的3′端能够以T1模板进行扩增，扩增出与T1 5′端序列反向互补的序列，记为x′-特异位点-x′；同时T1的3′端能够以T2模板进行扩增，扩增出与T2 5′端序列反向互补的序列，记为x′-特异位点-x′；

x′-特异位点-x′片段与x-特异位点-x片段为反向互补序列，x′-特异位点-x′片段中含有切刻内切酶识别的特异位点，能够被切刻内切酶(选自Nt.BstNBI、Nt.BsmAI、Nt.AlwI中的一种)切割；经内切酶作用，产生与x序列互补的短链核酸x'，x'可以继续与游离的扩增模板T1和T2中的x序列继续杂交进行扩增，可见高阶恒温指数扩增反应的扩增效率接近2×2ⁿ，从而提高灵敏度，降低序列依赖性。

实施例2一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的方法

以检测let-7家族中let-7b为例，根据要检测的目标let-7b的序列，设计与之部分互补的模板T1和模板T2，具体序列如表1所示。

表1 let-7b及其模板T1和模板T2的序列

在冰上配制A和B反应液，A反应液分为A1、A2、A3、A4四种：

A1包含内切酶缓冲液、模板T1、模板T2、dNTP、目标let-7b；

A2包含内切酶缓冲液、模板T1、dNTP、目标let-7b；

A3包含内切酶缓冲液、模板T2、dNTP、目标let-7b；

A4包含内切酶缓冲液、模板T1、模板T2、dNTP。

B反应液包含DNA聚合酶缓冲溶液、Vent(exo-)DNA聚合酶、内切酶Nt.BstNBI、SYBRGreen I荧光染料。

将A1和B，A2和B，A3和B，A4和B分别混合后在45℃进行实时指数扩增反应(混合的体系中T1终浓度0.1μM，T2终浓度0.075μM，内切酶终浓度0.4U/μL，聚合酶的终浓度0.06U/μL)，用BIO-RAD CFX Connect^TM荧光定量PCR监控扩增曲线，

扩增曲线如图2所示，let-7b，T1和T2三者共同存在时的扩增效率最大，对比POI值(point of inflection values，实时荧光强度曲线的最大斜率对应的时间)，let-7b，T1和T2三者形成的T型结构使扩增时间缩短了30min以上，只需扩增10min即可获得检测结果，而其他组均需扩增40min以上才有结果。

实施例3一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的方法

在冰上配制本发明高阶恒温指数扩增技术(TEXPAR)的A和B反应液，A反应液包含内切酶缓冲液、模板T1、模板T2、dNTP、目标let-7b；B反应液包含聚合酶缓冲溶液、Vent(exo-)聚合酶、内切酶Nt.BstNBI、SYBR Green I荧光染料。将A和B混合(混合的体系中T1终浓度0.1μM，T2终浓度0.075μM，内切酶终浓度0.4U/μL，聚合酶的终浓度0.06U/μL)，然后在50℃进行实时指数扩增反应，用BIO-RAD CFX Connect^TM荧光定量PCR监控扩增曲线。

对比例1

以检测let-7家族中let-7b为例，根据要检测的目标let-7b的序列，设计传统恒温指数扩增模板T：5'-AAC CAC ACA ACC TAC TAC CTC AAA CAG ACT CAA ACC ACA CAA CCTACT ACC TCA A-3'(SEQ ID NO：4)。

同时配制传统恒温指数扩增技术(EXPAR)的反应液，把反应液配成C和D反应液，C反应液包含内切酶缓冲液、模板T(0.1μM)、dNTP、目标let-7b；D反应液包含聚合酶缓冲溶液、Vent(exo-)聚合酶、内切酶Nt.BstNBI、SYBR Green I荧光染料。将C和D混合，然后在50℃进行实时指数扩增反应，用BIO-RAD CFX Connect^TM荧光定量PCR监控扩增曲线。

对比实施例3和对比例1两种方法的POI值。POI值越小，说明扩增效率越高。

实施例3和对比例1的扩增曲线见图3，具体的POI值见表2，从中可以看出本发明改进型恒温指数扩增POI值为6.50，传统恒温指数扩增曲线POI值为61.5，说明本发明方法具有更好的扩增效率。

表2本发明高阶恒温指数扩增(EXPAR)与传统恒温指数扩增(TEXPAR)曲线的POI值

实施例4特异性检测

方法：

为了检测本发明方法的特异性，配制一系列与let-7b序列相差1个或者多个碱基的确定浓度的let-7a、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i溶液。let-7家族序列如表3所示。

在冰上配制A和B反应液，A反应液包含内切酶缓冲液、模板T1、模板T2、dNTP、上述目标miRNA中的一种(即let-7a、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i中的一种)；B反应液包含聚合酶缓冲溶液、Vent(exo-)DNA聚合酶、内切酶Nt.BstNBI、SYBR GreenI荧光染料。将A和B混合后定容至10μL，各组分为0.5×Nt.BstNBI缓冲液(25mM tris-HCl,pH7.90,50mM NaCl,5mM MgCl₂,0.5mM EDTA)、模板T1(0.1μM)、模板T2(0.075μM)、dNTP(1000μM)、目标miRNA(100pmol)、1×ThermoPol聚合酶缓冲溶液(10mM KCl,10mM(NH₄)₂SO₄,20mM Tris-HCl pH 8.8,2mM MgSO₄,0.1％Triton X-100)、Vent(exo-)聚合酶(0.06U/μL)、Nt.BstNBI内切酶(0.4U/μL)、0.4×SYBR Green I荧光染料、DEPC水。然后在45℃进行指数扩增反应，在定量PCR仪上监控各组扩增曲线，求得各组POI值和各错配情况的POI值。

表3 let-7家族序列表

表4本发明方法对let-7家族各成员的扩增曲线POI值

结果：

各组扩增曲线如图4所示，具体POI值见表4，从中可以看出100pM let-7b的扩增曲线POI值为4.835，100pM let-7家族其他miRNA扩增曲线POI值约为10.96～13.25，与空白组接近，说明了本发明方法用于检测目标miRNA(如let-7b)时具有很强的特异性，与let-7b仅一个碱基之差的let-7c对let-7b的检测也不存在干扰。

实施例5抗干扰评价

方法：

配制一系列分别加入了干扰物let-7a、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i的let-7b溶液，在冰上配制A和B反应液，A反应液包含内切酶缓冲液、模板T1、模板T2、dNTP、各miRNA；B反应液包含聚合酶缓冲溶液、Vent(exo-)聚合酶、Nt.BstNBI内切酶、SYBR Green I荧光染料。将A和B两部分溶液混合，将A和B混合后定容至10μL，各组分为0.5×Nt.BstNBI缓冲液(25mM tris-HCl,pH 7.90,50mM NaCl,5mM MgCl₂,0.5mM EDTA)、模板T1(0.1μM)、模板T2(0.075μM)、dNTP(1000μM)、let-7b(10fmol)、let-7c～let-7i(10pM)、1×ThermoPol聚合酶缓冲溶液(10mM KCl,10mM(NH4)₂SO₄,20mM Tris-HCl pH 8.8,2mMMgSO₄,0.1％Triton X-100)、Vent(exo-)聚合酶(0.06U/μL)、内切酶(0.4U/μL)、0.4×SYBRGreen I荧光染料、DEPC水。然后在45℃进行指数扩增反应，立即在定量PCR仪上监控扩增曲线，求得POI值，根据此POI值以及标准曲线计算该改进型指数扩增方法的抗干扰性。

表5 let-7b与let-7家族其他miRNA混合时的扩增曲线POI值

结果：

各组扩增曲线如图5所示，具体POI值见表5，从中可以看出10fmol let-7b的扩增曲线POI值为7.997，与10pM的let-7家族其他miRNA分别混合后进行扩增，扩增曲线的POI值与7.997接近，说明了本发明方法可以用于检测含有干扰物let-7家族其他miRNA的let-7b溶液，具有较强的抗干扰性。说明本发明方法检测目标miRNA的抗干扰性强，特异性高。

实施例6序列依赖性检测

方法：

在冰上配制不同浓度(100pM、1pM、10fM)的let-7b待测溶液，并配制相同对应浓度的miR-374a、miR-762待测溶液，将反应液配成A和B两部分，A部分分为A1、A2、A3三种，A1包含内切酶缓冲液、模板T1、模板T2、dNTP、let-7b；A2包含内切酶缓冲液、模板T3、模板T4(见表6)、dNTP、miR-374a；A3包含内切酶缓冲液、模板T5、模板T6(见表6)、dNTP、miR-762。B部分包含聚合酶缓冲溶液、Vent(exo-)聚合酶、Nt.BstNBI内切酶、SYBR Green I荧光染料。将A1和B，A2和B，A3和B分别混合，各组分浓度为0.5×Nt.BstNBI内切酶缓冲液(25mM tris-HCl,pH 7.90,50mM NaCl,5mM MgCl,0.5mM EDTA)、模板T1(0.1μM)、模板T2(0.075μM)、模板T3(0.1μM)、模板T4(0.075μM)、模板T5(0.1μM)、模板T6(0.075μM)、dNTP(1000μM)、target、1×ThermoPol聚合酶缓冲溶液(10mM KCl,10mM(NH₄)₂SO₄,20mM Tris-HCl pH 8.8,2mM MgSO₄,0.1％Triton X-100)、Vent(exo-)聚合酶(0.06U/μL)、内切酶(0.40U/μL)、0.4×SYBRGreen I荧光染料、DEPC水。反应液充分混合后在45℃进行实时指数扩增反应，用BIO-RADCFX Connect^TM荧光定量PCR监控扩增曲线。

表6 miR-374a、miR-762、模板T3、T4、T5、T6的序列

结果：

在相同浓度条件下，本发明方法对let-7b、miR-762、miR-374a扩增曲线的POI值相近(见图6和图7)，无显著差异，说明本发明高阶恒温指数扩增检测miRNA的方法具有低序列依赖性，适用于多种miRNA的检测。

实施例7本发明检测方法的条件优化

方法：

a)反应温度的优化

为了探索温度对指数扩增的影响，在添加定量试剂的条件下，监控不同温度下目标miRNA(let-7b)以及空白的荧光定量PCR曲线，计算对应目标miRNA以及空白曲线的POI差值，选择POI差值最大的所对应的温度作为指数扩增实验的最佳温度。

b)聚合酶用量的优化

为了探索Vent(exo-)DNA聚合酶含量对指数扩增的影响，选择定量其他试剂在添加不同含量梯度聚合酶的条件下，监控对应含量聚合酶的目标miRNA(let-7b)以及空白的荧光定量PCR曲线，计算对应目标miRNA以及空白曲线的POI差值，在保证扩增效率较高的基础上选择最大ΔPOI所对应的聚合酶含量作为指数扩增实验的最佳聚合酶含量。

c)切刻内切酶用量的优化

为了探索切刻内切酶含量对指数扩增的影响，选择定量其他试剂在添加不同含量梯度聚合酶的条件下，监控对应含量聚合酶的目标miRNA(let-7b)以及空白的荧光定量PCR曲线，计算对应目标miRNA以及空白曲线的POI差值，在保证扩增效率较高的基础上选择最大ΔPOI所对应的切刻内切酶含量作为指数扩增实验的最佳聚合酶含量。

d)模板T2用量的优化

为了探索指数扩增模板T2的链对指数扩增的影响，选择最佳含量的模板的量。选择定量其他试剂在荧光定量PCR仪上面监控不同含量模板T2在定量目标miRNA(let-7b)及空白的扩增曲线，计算每个一定量模板T2在定量目标miRNA与相应空白扩增曲线的POI的差值，差值越大说明背景影响越小，在保证扩增效率较高的基础上选择最大ΔPOI所对应的T2模板量为最佳模板含量。

具体操作如下：

在冰上配制A和B反应液，A反应液包含内切酶缓冲液、模板T1、模板T2、dNTP、target(let-7b)；B反应液包含聚合酶缓冲溶液、Vent(exo-)聚合酶、Nt.BstNBI内切酶、SYBR Green I荧光染料。对温度进行优化时，将A和B混合，然后分别在A 35、B 40、C 45、D50℃进行实时指数扩增反应。

对聚合酶量进行优化时，将A和B混合，然后在45℃进行实时指数扩增反应，DNA聚合酶含量如下：A 0.04、B 0.06、C 0.08、D 0.10U/μL。

对切刻内切酶量进行优化时，将A和B混合，然后在45℃进行实时指数扩增反应，切刻内切酶含量为A 0.20、B 0.30、C 0.40、D 0.50U/μL。

对模板T2量进行优化时，将A和B混合，然后在45℃进行实时指数扩增反应，模板T2含量为A 0.005、B 0.075、C 0.100、D 0.200μM。

本实验用BIO-RAD CFX Connect^TM荧光定量PCR监控扩增曲线，计算各组对应目标miRNA以及空白曲线的POI差值。

结果：

检测结果发现在35～50℃、DNA聚合酶浓度0.04～0.10U/μL、切刻内切酶浓度0.20～0.50U/μL、模板T2浓度0.005～0.200μM的条件下均能实现本发明对目标miRNA的检测；但根据let-7b与空白的POI差值越大，说明背景值越小，因此选择最大ΔPOI所对应的温度、内切酶量、聚合酶含量和模板T2含量作为此指数扩增反应的最佳条件，据此，本发明发现最优的反应温度为45℃，模板T2的最佳浓度为0.075μM，切刻内切酶的最佳浓度为0.4U/μL，DNA聚合酶的最佳浓度为0.06U/μL。

实施例8标准曲线的制备

方法：在冰上配制一系列不同let-7b浓度的待测溶液；配制A和B两部分溶液，A部分包含Nt.BstNBI内切酶缓冲液、模板T1、模板T2、dNTP、let-7b；B部分包含聚合酶缓冲溶液、Vent(exo-)聚合酶、Nt.BstNBI内切酶、SYBR Green I荧光染料。将A和B混合后定容至10μL，各组分为0.5×Nt.BstNBI缓冲液(25mM tris-HCl,pH 7.90,50mM NaCl,5mM MgCl₂,0.5mM EDTA)、模板T1(0.1μM)、模板T2(0.075μM)、dNTP(1000μM)、let-7b(一系列不同浓度)、1×ThermoPol聚合酶缓冲溶液(10mM KCl,10mM(NH₄)₂SO₄,20mM Tris-HCl pH8.8,2mMMgSO₄,0.1％Triton X-100)、Vent(exo-)聚合酶(0.06U/μL)、内切酶(0.4U/μL)、0.4×SYBRGreen I荧光染料、DEPC水。然后在45℃进行指数扩增反应，在定量PCR仪上监控扩增曲线，求得POI值，得到let-7b浓度测定标准曲线。

结果：不同let-7b浓度下的扩增曲线图如图8所示，制定的标准曲线如图9所示，标准曲线方程为POI＝-1.45-0.656lgc_let-7b(M)，R²＝0.984，可见在100zM-10nM的miRNA浓度范围内具有很好的线性关系，对miRNA的最低检测限均可达100zM。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的方法

<130>

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

ugagguagua gguugugugg uu 22

<210> 2

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccaccgttt acttctaatg actctccacc gtttacttct aaccacaacc ccaaaaa 57

<210> 3

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccaccgttt acttctaatg actcttccac cgtttacttc ttttttggga ccaacctact 60

acctcatt 68

<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaccacacaa cctactacct caaacagact caaaccacac aacctactac ctcaa 55

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

ugagguagua gguuguauag uu 22

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

ugagguagua gguuguaugg uu 22

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

agagguagua gguugcauag u 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

ugagguagga gguuguauag u 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

ugagguagua gauguauagu u 21

<210> 10

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

ugagguagua guuguacagu 20

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

ugagguagua guugugcugu u 21

<210> 12

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

cuuaucagau uguauuguaa uu 22

<210> 13

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggggcugggg ccggggccga gc 22

<210> 14

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tccaccgttt acttctaatg actctccacc gtttacttct aattacaacc ccaaaaa 57

<210> 15

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tccaccgttt acttctaatg actcttccac cgtttacttc ttttttggga catacaatct 60

gataagtt 68

<210> 16

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tccaccgttt acttctaatg actctccacc gtttacttct gctcggcacc ccaaaaa 57

<210> 17

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tccaccgttt acttctaatg actcttccac cgtttacttc ttttttggga ccccggcccc 60

agcccctt 68

Claims

1.一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的模板，其特征在于，所述模板由模板T1和T2组成，模板T1和T2均为DNA序列；

模板T2的3′端序列能够与目标microRNA的5′端序列反向互补；

当T1、T2和目标microRNA三者共同存在时，三者之间序列两两部分反向互补，共同杂交形成T型结构；且在DNA聚合酶作用下，目标microRNA的3′端能够以T1模板进行扩增，扩增出的与T1 5′端序列反向互补的序列，记为x′-特异位点-x′；同时T1的3′端能够以T2模板进行扩增，扩增出的与T2 5′端序列反向互补的序列，记为x′-特异位点-x′；上述x′-特异位点-x′与x-特异位点-x为反向互补序列，二者结合形成的双链能够被切刻内切酶切割，切刻内切酶切割的位点位于x′-特异位点-x′链中。

2.根据权利要求1所述的一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的模板，其特征在于，所述模板T2的3′端序列能够与目标microRNA的5′端序列反向互补，该段目标microRNA的5′端序列长度占目标microRNA总长度的8/21～12/21。

3.根据权利要求1所述的一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的模板，其特征在于，所述模板T1的中间序列与目标microRNA的3′端序列反向互补，该段目标microRNA的3′端序列长度占目标microRNA总长度的8/21～12/21。

4.根据权利要求1所述的一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的模板，其特征在于，所述序列x的长度为14～25nt。

5.根据权利要求1所述的一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的模板，其特征在于，所述模板T1的3′端序列能够与模板T2的中间序列反向互补，该段反向互补的序列长度为8～12bp。

6.根据权利要求1所述的一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的模板，其特征在于，所述切刻内切酶选自Nt.BstNBI、Nt.BsmAI、Nt.AlwI中的一种。

7.根据权利要求1所述的一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的模板，其特征在于，当待测目标microRNA为let-7b时，所述的模板为TCC ACC GTT TAC TTC TAA TGACTC TCC ACC GTT TAC TTC TAA CCA CAA CCC CAA AAA和TCC ACC GTT TAC TTC TAA TGACTC TTC CAC CGT TTA CTT CTT TTT TGG GAC CAA CCT ACT ACC TCA TT；

当待测目标microRNA为miR-374a时，所述的模板为TCC ACC GTT TAC TTC TAA TGACTC TCC ACC GTT TAC TTC TAA TTA CAA CCC CAA AAA和TCC ACC GTT TAC TTC TAA TGACTC TTC CAC CGT TTA CTT CTT TTT TGG GAC ATA CAA TCT GAT AAG TT；

当待测目标microRNA为miR-762时，所述的模板为TCC ACC GTT TAC TTC TAA TGA CTCTCC ACC GTT TAC TTC TGC TCG GCA CCC CAA AAA和TCC ACC GTT TAC TTC TAA TGA CTCTTC CAC CGT TTA CTT CTT TTT TGG GAC CCC GGC CCC AGC CCC TT。

8.一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：将待测样品、权利要求1～7任一项所述的能够检测目标microRNA的模板T1和T2、DNA聚合酶、切刻内切酶、dNTP混合，将整个反应体系于35～50℃条件下反应，检测扩增曲线，根据扩增曲线和标准曲线判定样品中是否含有目标microRNA；并能够进一步计算出样品中目标microRNA的具体含量。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反应体系中DNA聚合酶浓度0.04～0.10U/μL、切刻内切酶浓度0.20～0.50U/μL、模板T2浓度0.005～0.200μM。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反应体系中还含有DNA聚合酶缓冲液、荧光染料、切刻内切酶缓冲液。