CN1737145A - 莲多酚氧化酶的基因序列及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种莲多酚氧化酶的基因序列及用途，莲幼叶cDNA中ppo基因的7个克隆序列，长度在978bp－1057bp，编码326－352个氨基酸，而且7个核苷酸序列及其相对应的7个氨基酸序列之间都有明显的差异。与GenBank中其它物种的PPO进行比较，其核苷酸序列相似性至少达到79％，氨基酸序列相似性至少达到61％。该基因的成功克隆，通过反义抑制或超量表达等生物工程方法选择性调节特定的莲器官、组织中ppo表达，抑制了莲藕的酶促褐变，增加了莲的抗虫抗病性。

Description

莲多酚氧化酶的基因序列及用途

技术领域：

本发明涉及莲幼叶cDNA中多酚氧化酶(Polyphenol oxidese，PPO)的基因序列，更具体涉及一种莲多酚氧化酶的7个核苷酸序列及其相对应的7个氨基酸序列，本发明还涉及一种用途。

背景技术：

莲是一种重要的水生经济作物，不仅可以食用，而且也是重要的观赏花卉和中草药，对它的研究已经引起人们的广泛重视。就莲遗传学研究来看，传统的研究主要是从形态方面进行的研究，近期的研究主要是运用分子生物学的方法对其进行分子方面的研究。

多酚氧化酶(Polyphenol oxidase PPO，EC.1.10.3.1)是一类普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，由核基因编码能与铜相结合的金属蛋白酶。早在1895年就被发现，直至1937年才分离得到。随着研究的深入，将其分为单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase，EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxides，EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase，EC.1.10.3.1)。现在所说的多酚氧化酶一般是指儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。

PPO通常先以无活性的前体形式存在。前体一般由N-端导肽(transitpeptide)、中间高度保守的Cu结合区、C-疏水区3部分组成。中间高度保守的Cu结合区是该酶的主要功能位点，其它部分则对酶的构象、高级结构的形成和维持起作用。

N-端导肽是叶绿体蛋白的典型特征，它能指导PPO蛋白质前体进入类囊体膜，保守性很低。Cu结合区富含His残基，每个Cu与3个His残基以配位键相连，形成了有特定三维结构(Type3 coppers bridged)的活性部位。疏水性的C-端只在前体中存在，常由几个β-链形成反向平行的β折叠，这可能与PPO三维结构的形成以及其酶活性有关，并且能与Cu结合。

大多数植物的PPO具有2个铜结合区域(CuA和CuB)。其中CuA的保守性(92％-94％)要大于CuB(60％-82％)。也有人提出了第3个富含His区域，认为CuA与PPO的水溶性有关，CuB是底物的连接位置，CuC则与分子氧相连，CuA-CuB彼此相互影响，CuB-CuC在空间相连，从而使酶整体具有活性。

一直以来人们都认为ppo基因是无内含子的，但应注意到以前都是对双子叶植物ppo基因的研究，而现已在单子叶植物香蕉果肉中找到一个含85bp内含子的ppo基因。对这个内含子序列的研究表明，它富含AT(85％)，并有保守的5′供体(donor)和3′受体(acceptor)的剪切位点，即符合GT/AG原则。

PPO由多个基因编码，表现出多基因家族性，少则2-3个，多则6-7个基因。但有的植物，如葡萄藤中只1个ppo基因。ppo的表达比较复杂，植物种类、部位、细胞类型、生长发育阶段的不同，ppo基因表达的种类及表达的量都是不同的。一般正在发育生长的幼小组织和器官，ppo mRNA含量都较高。ppo基因5′，3′的非编码区的保守性较低，尤其是5′启动子区，可能正是这些启动子的不同才引起ppo基因种类、时空表达模式差异。

许多生物、非生物因素都可诱导ppo的表达或是增加mRNA的稳定性，但是这种诱导也是依据植物种类、部位、细胞类型、发育生长阶段的不同有种类、时空、诱导程度的差异性。ppo的表达除在转录水平上调控，也在其它如翻译和翻译后水平上调控。

PPO具有单酚酶活性(monophenolase activity)和O-双酚酶活性(O-diphenolaseactivity)。它能催化单酚羟基化为O-二酚，O-二羟基酚氧化为相应的O-醌。在植物中，许多的O-二酚如绿原酸和(-)表儿茶酚被PPO氧化成相应的醌，然后醌能自我聚合，或者通过共价修饰并结合细胞内的亲核物质，或者形成半醌。醌的多聚化以及它与其它物质的结合产生黑色或褐色的色素沉淀，最终导致水果、蔬菜等经济作物营养丢失和经济损失。所以植物PPO是许多果蔬等农产品酶促褐变的主要原因，同时它与啤酒、红茶品质密切相关。

植物对病原菌的防御系统大致可分为3道防线。最后一道防线SAR(SystemicAcquired Response)是通过诱导一些防御相关蛋白(如PPO)的形成或活性增加来获得的。现已发现PPO在水稻(Oryza sativa)、烟草(Nicotiana tabacum)、棉苗、苹果对各种病菌及昆虫的抗性中起重要作用。

醌类物质能介入光合作用中的默勒反应，PPO可能作为一种金属氧化还原酶，调节胞质中的氧化还原水平，与氧结合并传递分子氧，以调节叶绿体中有害的光氧化反应速度，参与其中电子传递，起能量转换作用。

Nakayama等人在金鱼草(Antirrhinum majus)等的抽提物中发现了一种新的酶—金鱼草素合成酶(Aureusidin synthase)，它以查耳酮(chalcone)为特异性底物，催化类黄酮Aurone的形成，而后者是花中黄色形成的主要原因。通过对金鱼草素合成酶及其cDNA的研究发现，它与PPO有很高的相似性(39％-51％)，属于PPO家族。所以推测PPO参与了自然界中花色的形成。

PPO还在植物的生长发育(如根的形成)、乙烯的产生以及促进伤口的愈合中起某些作用。

莲在中国有较大面积的种植，产量大，每年都有大量出口国外，但由于莲为水生蔬菜，采收后在空气中暴露时间过长容易失水干缩、腐烂或发生褐变(表皮容易变为淡紫色，进而又变成铁锈色)，影响其感官及品质，为中国的经济带来了一定的损失，生产中常运用多种物理或化学方法来降低莲中PPO含量或抑制PPO活性，当前大多数是用低温保鲜剂法，从一定程度上解决了莲的褐变问题。

发明内容：

本发明的目的在于提供了一种莲多酚氧化酶的基因序列，该基因的获得与应用，促进了莲的新品种改良与培育，抑制了莲藕的酶促褐变，增加了莲的抗病虫性。

本发明还涉及一种莲多酚氧化酶的基因序列在抑制莲藕酶促褐变的基因工程育种中的应用。

本发明还涉及一种莲多酚氧化酶的基因序列在增加莲抗病虫基因工程育种中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

本发明中所指的转化是指农杆菌导入法，土壤农杆菌是植物基因工程中对双子叶植物进行转化最常用的一种细菌，它可以侵染植物伤口并将自身基因组的一部分插入到植物染色体中。这种方法是本领域的技术人员公知的技术。土壤农杆菌可以从商业途径(如Promega公司)中得到。具体的是把克隆到的莲多酚氧化酶基因，正向插入到可以进行植物转化的中间载体中，例如含有花椰菜叶病毒CAMV35S启动子的真核表达载体(从Promega公司购买)，且将这一中间载体转移给土壤农杆菌，用转化后的土壤农杆菌侵染带有伤口的莲叶片，通过这一过程，外源插入的多酚氧化酶基因就进入了莲染色体，通过选择性筛选出带有外源基因的细胞在无菌条件下培养长成愈伤组织，并进一步分化出芽和根，成为转基因植物。

本发明提出的方法有如下步骤：

一.莲多酚氧化酶(ppo)基因的克隆

1.总RNA提取

用一种新的CTAB-LiCl法(专利申请号200410060812.1)提取总RNA，于-70℃保存。

2. cDNA第一链的合成

取3μl RNA，用MMLV-RTase于42℃反应2小时后，于-15℃--20℃保存。

3. ppo基因的扩增

以合成的cDNA第一链为模板，设计简并引物进行PCR扩增。

4. PCR产物的回收和克隆

目的条带回收并转化培养后，挑选白色菌落。

5.克隆的鉴定和测序

提取质粒DNA作模板进行PCR，鉴定阳性克隆，并送公司测序。

6.序列的分析

利用在线软件及数据库资源[如GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中的BLASTN和BLASTX程序]，调整一定的参数，对序列进行分析。

分析结果表明，一共7个核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7，长度为978bp-1057bp；而其相对应的7个氨基酸序列：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14，长度为326-352个氨基酸(见表1)。利用GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中的BLASTN和BLASTX程序，进行同源性分析，结果表明与其它物种有极高的同源性，核苷酸序列相似性为79％-93％，氨基酸序列的相似性为61％-83％(见表2)。

二.ppo基因在植株中的应用

1.土壤农杆菌转化

2.叶盘法进行莲组织的转化

3.转基因植物的检测

4. NTP II检测，Northern检测，基因组Southern检测。

本发明所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7，长度为978bp-1057bp；而其相对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14，长度为326-352个氨基酸。(见表1)利用GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中的BLASTN和BLASTX程序，进行同源性分析，结果表明与其它物种有极高的同源性，核苷酸序列相似性为79％-93％，氨基酸序列的相似性为61％-83％(见表2)。

本发明中的“基因”是指将编码构成的蛋白质或多肽的氨基酸的核苷酸序列。这些序列可以是DNA形式或者RNA形式，DNA形式包括cDNA，基因组DNA，或人工化学合成的DNA。DNA可以是单链的或者是双链的。

本发明中的“载体”是指将前面指出的基因转移到宿主细胞中的DNA。常用的载体包括质粒，噬菌体，病毒等都可以从商业途径(如Promega公司)获得。

本发明中的“转基因植物”是指含有导入的基因并能够稳定或瞬时地表达所导入的基因并产生具有特定的生物学性状的植物。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

通过克隆该基因家族及制备该基因的蛋白，将莲作为模式系统，用于研究：1)植物ppo基因的表达调控、酶促褐变的形成及抑制；2)植物抗虫抗病性机理，增加植物的抗逆性。植物基因工程育种方法相对传统的育种方法，不仅更方便快捷缩短育种时间，而且适用范围更广。莲是一种原产于我国的古老的宿根水生植物，不仅可以食用，而且也是重要的观赏花卉和中草药，具有较高的经济价值。在中国，莲藕种植面积和产量均较大，每年都有大量出口国外，但采收后在空气中暴露时间过长容易失水干缩、腐烂或发生褐变，影响感官及品质，从而造成经济损失。通过基因工程方法培育莲藕新品种，提高了莲藕的品质与产量，扩大了莲藕种植分布范围，促进了莲藕的产业化发展。

附图说明：

图1为用1.2％甲醛变性琼脂糖电泳检测抽提总RNA的结果。从图中可以看出，5s，18s和28s RNA条带明显、清晰、不拖尾，而且28s条带的亮度约为18s的两倍。表明该方法抽提的总RNA质量较好，无明显DNA等杂质污染，且为无降解的完整RNA。

图2为用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测以cDNA的第一链为模板，简并性引物进行PCR扩增的产物，用Alphalmager^TM 2200成像系统拍照所记录的实验结果。从图中可以看出，在1000bp左右有一条明亮的条带，表明在该基因在莲幼叶中大量转录。

图3为用Clustal w程序对SEQ ID NO：12与日本梨、苹果、杂交杨树、菠萝的PPO氨基酸序列进行配比，并引进缺口(gap)以优化配比。用星号标记相同的氨基酸，圆点标记氨基酸的保守替换，横线表示引进缺口(gaps)以优化配比。保守的组酸残基都已框出。下划线表示三个保守的Cu结合区，突变位点已用圆形表示。这六个序列在GenBank中的注册序列号分别为：苹果，PPO MALDO，P43309；PPO-Mado，BAA21676.1；日本梨，PPO-PyP，BAB64530.1；柰李，PPO-Prco，AAW65103.1；杂交杨树，PPO-PotD，AAU12257.1；菠萝，PPO-Anco，AAO16864.1；中国莲，B15：Nenu-PPO6。从图中可以看出，SEQ ID NO：12长度为352个氨基酸，其序列中保守的组氨酸His位点，3个保守的Cu结合区域(CuA、CuB、CuC)都是高度保守没有变化的。分析结果表明SEQ ID NO：12与这几个物种的氨基酸序列有较高的同源性。

图4为以SEQ ID NO：6为例，分析其相对应的核苷酸序列，即EQ ID NO：12的特征。小方框表示保守的组氨酸残基，圆形表示突变位点，阴影部份表示3个保守的Cu结合区域：CuA，CuB，CuC。CuA，CuC也是设计引物区域。从图中可以看出，SEQ ID NO：6的长度为1057bp，SEQ ID NO：12的长度为352个氨基酸。分析结果表明，SEQ ID NO：12中保守的组氨酸His位点，3个保守的Cu结合区域(CuA、CuB、CuC)都是高度保守没有变化的。

具体实施方式：

一.莲多酚氧化酶(ppo)基因的克隆

1.总RNA提取

取莲的幼叶，用CTAB-LiCl法(专利申请号200410060812.1)提取总RNA，-70℃保存。

用此方法提取植物总RNA的紫外吸收值：A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.85-2.0之间，为典型的RNA吸收值，说明RNA纯度较好，无明显的蛋白质、DNA等杂质的污染。产率为0.1-0.2mg RNA/1g植物材料。RNA的甲醛变性琼脂糖电泳结果可看出，5s，18s和28s RNA条带明显，清晰，不拖尾，而且28s条带的亮度约为18s的两倍，且无明显DNA等杂质污染。说明用此方法抽提的植物RNA质量较好，为无降解的完整RNA。

2. cDNA第一链的合成

反转录体系为25μl，先将3μl RNA与3μl Oligo(dT)引物(2.5mM)于70℃变性5min，迅速放入0℃5min，再加入5×RT缓冲液，1.25μl dNTP(10mM)，1μl MMLV-RTase(200uμl^-1)，然后用RNase-Free H₂O加至25μl。反应条件为42℃，2h，于-20℃保存。

3. ppo基因的扩增

以合成的cDNA第一链为模板，设计简并引物进行PCR扩增，引物序列为：

P1：5’TGG CTB TTY TTY CCB TTY CAY 3’

P2：5’RWA RCT YCC NGC RWAYTC 3’

PCR反应体系为25μl，引物各25pmol，dNTP各2.5mmol，10×PCR反应缓冲液2.5μl，Taqase 0.2μl(5u μl^-1)；反应条件为94℃预变性3min；接着94℃变性40秒，50℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。

用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，用美国Alphalmager^TM 2200成像系统拍照所记录的实验结果，发现在1000bp左右有明亮清晰的条带。

4. PCR产物的回收和克隆

用DNA回收试剂盒将目的条带回收、纯化后，克隆到pGEM-T载体(购于Promega公司)上，转化Escherichia coli DH-5α(购于Promega公司)的感受态细胞，在固体LB选择培养基(氨卡青霉素/X-Gal/IPTG)上培养后，挑选白色菌落。

固体LB选择培养基置于37℃培养箱，经约16小时过夜培养后发现培养基上长出约100个单菌落，其中白色菌落约为60个，蓝色菌落约为40个。

5.克隆的鉴定和测序

用碱裂解法(参照《分子克隆》的操作方法)提取质粒，以质粒作模板进行PCR，鉴定阳性克隆，并将菌液送到上海博亚生物技术公司用3370DNA自动测序仪测序。

根据测序结果进行序列分析，一共测定了7个核苷酸序列，即SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7，长度为978bp-1057bp；而其相对应的7个氨基酸序列为SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14，长度为326-352个氨基酸，而且7个核苷酸序列及其7个氨基酸序列之间都有明显的差异(见表1)。利用BLASTN和BLASTX程序，在GenBank中进行同源搜索，结果表明其核苷酸序列与GenBank中其它物种的PPO有极高的同源性，相似性为79％-93％，氨基酸序列的相似性为61％-83％(见表2)。

二.叶盘法获得转基因莲及其检测

1.土壤农杆菌的转化

ppo基因克隆到植物中间载体pE3(购于Promega公司)的Bam HI和Xho I位点之间，将含有中间载体的DH-5α与带有pRK2013的大肠杆菌(购于Promega公司)以及土壤农杆菌LBA4404(购于Promega公司)共培养，筛选具有利福平抗性及壮观霉素抗性的农杆菌。

2.叶盘法转化莲组织

把莲无菌叶片切成1cm左右的叶盘，叶盘在农杆菌中浸泡5-10h，以保证农杆菌的感染。然后在加了滤纸的MS培养基上与土壤农杆菌共培养2d，然后转到含有生长素(BA 2mg/l，IAA 0.1mg/l)的培养基上，诱导愈伤组织，抗生素筛选(卡那霉素100mg/l，羧苄青霉素500mg/l)，两周继一代，待芽分化后，换成不加激素，但抗生素相同的MS培养基(参照《分子克隆》的操作方法)。

3.转基因植物的检测

a. NPT II检测

取50mg叶片加入50μl DNA抽提缓冲液(参照《分子克隆》的操作方法)，研磨后离心，取上清液20μl，加入20μl反应缓冲液，5μl ATP溶液，30℃保温30min后点样于whatmanP81离子交换滤纸上，然后用蛋白酶K溶液37℃洗4min，65℃洗45min，80℃洗4min，，最后室温下蒸馏水冲洗，待滤纸干后，压上X光片，放射自显影过夜。

b.基因组Southem检测

植物基因组DNA采用CTAB法(参照《分子克隆》的操作方法)提取，10μg基因组DNA经EcoRI酶切完全后，进行Southern杂交，为避免植物中ppo基因的干扰，并能证明目的基因是否导入植物基因组内，探针采用α-³²P-dATP随机标记的CaMV35S启动子DNA片段(参照《分子克隆》的操作方法)。

c. Northern检测

选择处于相似发育阶段的莲幼叶(2-3cm)，用新的CTAB-LiCl法提取总的RNA，取10μgRNA进行甲酰胺变性琼脂糖凝胶电泳，探针采用α-³²P-dATP随机标记的ppo基因片段。

通过以上过程得到莲的转基因新品系，调控莲中ppo基因表达，抑制莲藕的酶促褐变，增加莲的抗虫抗病性的。

                                表1

基因名称	核苷酸长度(bp)	氨基酸长度(aa)	核苷酸相似(％)	氨基酸相似(％)
					SEQ ID NO：1SEQ ID NO：2SEQ ID NO：3SEQ ID NO：4SEQ ID NO：5SEQ ID NO：6SEQ ID NO：7	104698397810049831057980	346327326334327352326	93828283838383	74817483657982

表1为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及相对应氨基酸SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14的长度及其相似率。表明其核苷酸长度为978bp-1057bp，编码326-352个氨基酸。

                                                               表2

物种Species	基因名称(检索号)Gene name(accesionnumbers)	得分Score	E值E value	氨基酸比较Coparison ofamino acid	一致率Identity(％)	相似性Positives(％)	间隙Gaps
								日本梨Pyrus pyrifolia苹果Malus×domestica杂交杨树Populusbalsamiferasubbp.trichocarpa×Poulusdelfoides菠萝Ananas comosus茶树Camellia sinensis奈李Prunus Salicinavar.cordata紫花苜蓿Medicago sativasubsp.sativa蚕豆I′icia faba	PPO(BAB645301)CAO(AAA69902.1)PPO(BAA216761)PPO(AAV12257.1)PPO(AAO16864.1)PPO(AAO16863.1)PPO(AAT75166.1)PPO(AAW65103.1)PPO(AAP33165.1)PPO VICFA(CAA77764.1)	385380379379379324361310310306	e-111e-110e-109e-104e-104e-101e-101e-102e-102e-100	176/296174/296175/296166/255164/254150/223150/253152/216142/271142/221	59585965646770526449	74747379798279657961	11/29611/29611/2963/2714/2543/2161/2164/2544/2546/269

表2为利用BLASTN和BLASTX程序，搜索GenBank中Eukaryotic[ORGN]的[nr]数据库(其它参数都为默认值)。表明SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7都与GenBank中其它物种的PPO有极高的同源性，其核苷酸序列的相似性为79％-93％，而其相对应氨基酸序列的相似性更高达61％-83％。

                      SEQUENCE LISTING

<110>武汉大学

<120>莲多酚氧化酶的基因序列及其用途

<130>莲多酚氧化酶的基因序列及其用途

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1040

<212>DNA

<213>Nelumbo nucifera

<400>1

tggctttttt tccccttcca tcgctactat ctctacttct acgagaggat gttgggcaag      60

ttgatcgacg accccacatt tgcgttgcct tactggaact gggatgctcc cgccggcatg     120

aaaatgccaa ccatgtacgc caaccctaac tcccctctct acgacaaact ccgcgatgcc     180

aagcaccagc caccgacgat gatcgatctc aactacaatg tacaagacac cacgatgact     240

cctgagcaac tactgaagaa caatctcgcc accatgtacc ggcaagtggt gtccaatggc     300

tcgacggcgc agctcttcct tggatcgccg taccgtgccg gagaccaacc cgaccctggt     360

ttcgggtcgc ttgagaacgt tccacatgga ccggttcatc tatgggccgg tgatcgtacc     420

cagcctaata tagagaatat gggcaacttt tactcggctg cccgagaccc catcttctat     480

gcccaccact ccaacgtcga ccggatgtgg acaatatgga aaaagctggg aggaaggaga     540

aaggatttca aagaccccga ctggctgaac gcgggcttcc tgttgtacga cgagaacaag     600

cagctggtga gagttaaggt tcgggactgc ctggacgaga agaaactccg gtactcgtat     660

caggacgtgg agattccatg gatgaagacg aggcccacgc ctggtaaact catggcagct     720

gctcagaaac tgaagattac ggataggggg ttgaagaaga agaagccaac cgtcagtgag     780

ttccccaaga acttgatgcg ccattcaagg tagtgtgaag agccgagaaa tcgagagcag     840

aaagagagag acgagaggag atattgtaat agaccagtag agttggagag gtgaagaggc     900

cgaggaaatc gaggagcaag aaagagaagg aggacgaaga ggagatattg gtaatagacc     960

aagtagagtt ggagagggac acggtggtga agttcgacgt ctacatcaac gacgaggacg    1020

agccaagcccggataagagt                                                 1040

<210>2

<211>983

<212>DNA

<213>Nelumbo nucifera

<400>2

tggctttttt tcccttttca tcgctactat ctctacttct acgagaggat gttgggcaag     60

ttgatcgacg accccacatt tgcgttgcct tactggaact gggatgctcc cgccggcatg    120

aaaatgccaa ccatgtacgc caaccctaac tcccctctct acgacaaact ccgcgatgcc    180

aagcaccagc caccgacgat gatcgatctc aactacaatg tacaagacac cacgatgact    240

cctgagcaac tactgaagaa caatctcgcc accatgtact ggcaagtggt gtccaatggc    300

tcgacggcgc agctcttcct tggatcgccg taccgtgccg gagaccaacc cgaccctggt    360

ttcgggtcgc ttgagaacgt tccacatgga ccggttcatc tatgggccgg tgatcgtacc    420

cagcctaata tagagaatat gggcaacttt tactcggctg cccgagaccc catcttctat    480

gcccaccact ccaacgtcga ccggatgtgg acaatatgga aaaagctggg aggaaggaga    540

aaggatttca aagaccccga ctggctgaac gcgggcttcc tgttgtacga cgagaacaag    600

cagctggtga gagttaaggt tcgggactgc ctggacgaga agaaactccg gtactcgtat    660

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<210>3

<211>978

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<400>3

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Claims (4)

1.一种分离的基因序列，其具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7所示核苷酸序列至少79％同源性的序列。

2.一种分离的多肽，其具有与SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14所示氨基酸序列至少61％同源性的序列。

3.一种分离的莲多酚氧化酶基因序列在抑制莲藕酶促褐变的基因工程中的应用。

4.一种分离的莲多酚氧化酶基因序列在增加莲的抗病虫基因工程中的应用。

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