CN102492691A - 增强子Hr3在促进hycu-ep32蛋白增量表达中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及家蚕的转基因技术，具体为增强子Hr3在提高hycu-ep32蛋白表达量中的应用；所述增量表达载体以转座载体pBac[3×P3-EGFPafm]为基础载体，依次连接有增强子Hr3、39kP启动子、hycu-ep32基因和终止信号序列；本发明转基因增量表达外源抗病毒蛋白制备抗BmNPV家蚕品种，首次通过在滞育家蚕品种中转基因增量表达外源抗性蛋白提高家蚕的抗性；其在发育的各个时期均能表达Hycu-EP32蛋白，克服正常家蚕不表达Hycu-EP32的缺陷，有利于家蚕在各个时期都能利用Hycu-EP32蛋白来抑制病毒的增殖；该蛋白的表达量随着病毒量的增加而增加，所以能最大程度减少表达外源蛋白对家蚕正常生理活动和经济性状的影响，同时还能显著提高家蚕的抗性。

Description

增强子Hr3在促进hycu-ep32蛋白增量表达中的应用

技术领域

本发明涉及基因领域，特别涉及家蚕的转基因技术。

背景技术

转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰。转基因技术是现代生物学研究中的一项重要的技术，在功能基因研究、生物素材创新、现代遗传育种等方面发挥着重要的作用。

家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目昆虫，蚕丝业每年为蚕农创收 100 多亿元，蚕丝业为世界经济、文化、社会发展作出了重要贡献。但是，当家蚕遭遇病毒侵害，通常会造成蚕业的巨大损失。据统计，我国养蚕业最为发达的几个主产区，每年因病毒性疾病所造成的损失，约占总蚕病损失的 70-80%。其中家蚕核型多角体病毒病又是三大病毒病中最常见﹑危害最严重的一类蚕病,该病传染性极强，难以控制。

引起核型多角体病毒病的病原为家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus,BmNPV), BmNPV属于杆状病毒科，真杆状病毒亚科,核型多角体病毒属,病毒粒子呈杆状，全基因组大小为128413bp；病毒结构主要由外层的囊膜和内层的核衣壳组成，在不同感染时期分别以出芽型病毒粒子(budded virus,BV)和包埋型病毒粒子(occluded virus,OV)两种形态存在，而多角体是在感染细胞的核或质中产生的包含和保护病毒粒子的一种蛋白质结晶，很稳定。多角体病毒对不良环境﹑消毒药剂等有较强的抵抗性，在环境中可以长期存活，但极易溶于碱性溶液；当家蚕食下多角体病毒，在中肠强碱性消化液(pH9.2～9.4)作用下多角体被溶解，释放的病毒粒子OV借囊膜与中肠上皮细胞微绒毛膜的融合作用脱去囊膜，核衣壳进入中肠细胞开始原发感染(Primary infection)，在细胞内复制核衣壳并通过“出芽”方式产生BV进入血体腔，继而感染其他组织细胞。最终，蚕体多以体壁破裂，流出病毒多角体浓汁而死。病毒多角体浓汁中含有大量的病毒粒子，污染蚕座环境，使得周围健康蚕感染病毒。可见，家蚕核型多角体病毒病是蚕业生产中的一个重要的危害原，一旦产生，极易爆发。

由于家蚕核型多角体病毒病在蚕业生产中危害重大，蚕业界一直希望能够培育出对此病毒具有较高抗性的蚕品种。但是，由于目前病毒致病分子机制研究较少，加之抗性品种培育手段多采用传统的遗传筛选的办法，周期长而且定向性差，所以收效甚微。

转基因技术在生物素材创新、现代遗传育种等方面发挥着重要的作用，自2000年日本科学家报道首次成功培育转基因家蚕以来，国内外已陆续报道转基因家蚕成功的消息。目前已经有报道外国学者尝试通过转基因干涉病毒基因的方法来提高家蚕的抗性，他们利用的是家蚕多化性品系的非滞育卵，主要是因为多化性家蚕品种所产的卵为生种卵，其不需要任何的人工处理便能够在适当的温湿度下连续发育直至孵化，这个特点极大地方便了转基因实验中的操作控制。但是，通过转基因干涉利用多化性家蚕品种制备的抗病毒品系具有以下两个方面明显的缺陷：①生产用种普遍为二化性滞育种，用多化性家蚕品种制备的抗病毒品系不利于生产推广，同时与滞育性的家蚕品种相比较，多化性家蚕品种不具有滞育期，对其继代维持只能依靠连续的饲养繁殖，这样需要耗费大量的人力物力对获得的转基因家蚕品系进行维持和继代，同时也大大增加了获得的转基因家蚕品种资源丢失的风险。②转基因干涉品系只能在mRNA水平发挥作用，不能在病毒DNA复制和蛋白合成水平发挥作用。因此，利用家蚕滞育品种，制备一种能在病毒DNA复制和蛋白合成水平抑制病毒增殖的转基因品系是一个有效可取的方法。

先前的研究结果显示，当家蚕核型多角体病毒（BmNPV）和美国白蛾核型多角体病毒（HycuNPV）共转染BmN-4细胞，BmNPV在BmN-4细胞中的增殖将受到抑制，HycuNPV编码的hycu-ep32基因与BmNPV的增殖被抑制有关。家蚕自身抗性的有限导致宿主对抗性蛋白的大量需求。然而，遗憾的是，家蚕自身体内并不存在Hycu-EP32 蛋白。BmNPV的同源重复区(homologous regions，hr3)具有复制起始位点的功能，可以对启动子行使增强子功能。在细胞水平，Hr3增强子能使启动子的活性增强几倍，而Hr3+BmNPV的IE1蛋白能使启动子的活性增强上千倍。BmNPV的39kP启动子具有明显的BmNPV诱导启动活性，能使家蚕在受到BmNPV侵染的时候启动下游基因的表达。

在棉花、玉米和水稻等物种中已经有利用转基因增量表达抗性基因来培育抗性品种的相关报道。到目前为止，利用滞育性家蚕品种增量表达外源抗病毒蛋白的方法和转基因品系在国内外还未见报道。因此，探索利用家蚕滞育品种，转基因增量表达外源抗病毒基因，抑制病毒在家蚕细胞中的增殖来提高家蚕的抗性是培育抗性品种的必然选择，也是加速科技成果实用化的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供增强子Hr3的新应用，该应用为提高家蚕核型多角体病毒抗性提供了新的思路。本发明的目的之二在于提供一种增量表达载体，其能显著提高hycu-ep32蛋白的表达量；本发明的目的之三在于提供所述增量表达载体的制备方法，该方法操作简单，适用于大规模运用，其稳定性佳；本发明的目的之四在于提供所述增量表达载体的应用，该应用降低了家蚕感染核型多角体病毒的风险。

本发明增强子Hr3在促进hycu-ep32蛋白增量表达中的应用，利用转基因增量表达外源抗病毒蛋白来制备抗BmNPV家蚕品种的方法，依次通过以下步骤实现：

(1)利用转座载体pBac[3×P3-EGFP afm]构建包含病毒39kP启动子、hycu-ep32基因全长序列和终止信号序列SV40片段的增量表达载体pBac[39kP-hycu-ep32-SV40-3×P3-EGFP afm] (pb-EKG)以及包含增强子Hr3、39kP启动子、hycu-ep32基因全长序列和终止信号序列SV40片段的增量表达载体pBac[Hr3-39kP- hycu-ep32-SV40-3×P3-EGFP afm] (pb-HEKG)；

(2)将家蚕932品种通过15℃低温催青解除滞育，将产下的非滞育蚕卵收集好，在蚕卵产后2h-4h用显微注射仪内将3-4nl、总浓度为400ng/ul的混合质粒（增量表达载体和辅助质粒按1:1混合）注射进蚕卵蚕卵，然后用无毒胶水将注射孔封住。

(3)将完成注射的蚕卵在35%的甲醛蒸汽中消毒4min后,置于25℃、相对湿度为80%的环境中进行催青直到孵化，将孵化的蚁蚕置于标准条件中饲养，将当代（G0）的蚕蛾进行自交或者回交，将滞育性的G1代蚕卵即时浸酸解除滞育，胚胎发育第六天在荧光显微镜下面筛选转基因阳性个体，将获得的转基因个体单蛾区正常饲养，继代扩大群体数量。

(4)通过RT-PCR检测转基因系统中hycu-ep32的表达量，确定hycu-ep32确实在所获得的转基因系统中表达。

(5)将转基因系统EKG、HEKG和正常932在3龄起蚕，用半致死剂量的BmNPV病毒通过经口感染，设置不添食的转基因和正常932对照，连续10天统计死亡率。结果显示转基因系统HEKG对BmNPV病毒的抗性明显提高。

(6)通过荧光定量PCR检测hycu-ep32在攻毒后的表达量变化情况，确定在HEKG系统中，hycu-ep32的表达量在攻毒后大大增加。

(7)在攻毒后24h，EKG、HEKG和正常932各取10头蚕提取总DNA，通过荧光定量PCR检测BmNPV病毒的拷贝数，证明HEKG中的病毒含量确实远低于正常932。

(8) 调查EKG、HEKG和正常932的经济性状，各系统雌雄各随机抽取15颗茧，分别称取每颗茧的全茧量和茧壳量，计算茧层率，确定转基因系统的经济性状没有受到影响。

本发明的技术方案为：

增强子Hr3在提高hycu-ep32蛋白表达量中的应用，所述增强子Hr3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，增强子Hr3在介导39kP启动子提高hycu-ep32蛋白表达量中的应用，所述39kP启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

增量表达载体，所述增量表达载体以转座载体pBac[3×P3-EGFP afm]为基础载体，依次连接有增强子Hr3、39kP启动子、hycu-ep32基因和终止信号序列。

优选的，所述hycu-ep32基因为hycu-ep32基因全长序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

优选的，所述终止信号序列为SV40，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

所述的增量表达载体的制备方法，具体包括以下步骤：

A） 39kP-1180载体的构建

将如SEQ ID NO:2所示的39kP启动子用Sal Ⅰ 和BamH Ⅰ进行双酶切，得39kP启动子酶切片段，同时用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ酶切pSLfa1180fa载体，得pSLfa1180fa载体酶切片段，连接39kP酶切片段和pSLfa1180fa载体酶切片段，得39kP-1180载体；

B ）39kP-hycu-ep32-1180载体的构建

将核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的hycu-ep32基因分别用 BamH Ⅰ和 Not Ⅰ进行双酶切，得hycu-ep32酶切片段，同时用BamH Ⅰ和Not Ⅰ酶切39kP-1180载体，得pSLfa1180fa-39kP载体酶切片段，连接hycu-ep32酶切片段和pSLfa1180fa-39kP载体酶切片段，得39kP-hycu-ep32-1180载体；

C ) 39kP-hycu-ep32-SV40-1180载体的构建

Not Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切含有如SEQ ID NO:4所示的终止信号的1180载体，得到终止信号酶切片段，同时用Not Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切步骤B所得39kP-hycu-ep32-1180载体，得到39kP-hycu-ep32-1180酶切片段，将终止信号酶切片段和39kP-hycu-ep32-1180酶切片段进行连接，得39kP-hycu-ep32-SV40-1180；

D) Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-1180

将如SEQ ID NO:1所示 增强子Hr3用Nco Ⅰ进行单酶切，得增强子Hr3酶切片段，同时将步骤C所得的39kP-hycu-ep32-SV40-1180用Nco Ⅰ进行单酶切，得39kP-hycu-ep32-SV40-1180酶切片段，将所述增强子Hr3酶切片段和39kP-hycu-ep32-SV40-1180酶切片段进行连接，得Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-1180；

E) pBac[Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-3×P3-EGFP afm]的构建

用限制性内切酶Asc Ⅰ酶切步骤D所得Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-1180载体，得Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40片段；同时用内切酶Asc Ⅰ单酶切piggyBac[3×p3 EGFP afm]，得piggyBac[3×p3 EGFP afm]线性片段，将Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40片段和piggyBac[3×p3 EGFP afm]连接，得增量表达载体，命名为pBac[Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-3×P3-EGFP afm]。

优选的，步骤A)中，如SEQ ID NO:2所示的39kP启动子的获得方式如下：设计特异引物，39kP的上游引物为: 5'acgcgtcgaccttgacccgaagcgaaat3', 39kP的下游引物为： R:5' cgcggatcctgttgctccggcatgttt 3'；以BmNPV基因组为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、55℃退火40秒、72℃延伸20秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。

优选的，步骤B)中，如SEQ ID NO:3所示的hycu-ep32的获得方式如下： hycu-ep32基因序列设计特异引物，上游引物为： 5' cgggatccatgaagaaccaacaacag 3'，下游引物为： 5' atagtttagcggccgcttaatttattaacatatcaaag 3'；以HycuNPV基因组为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、44℃退火40秒、72℃延伸50秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。

所述的增量表达载体在制备家蚕核型多角体病毒抗性增效剂中的应用。

本发明增强子Hr3在促进hycu-ep32蛋白增量表达中的应用，利用转基因增量表达外源抗病毒蛋白提高家蚕对BmNPV抗性的方法，首次通过在滞育家蚕品种中转基因增量表达外源抗性蛋白来显著提高家蚕的抗性。与其他方法相比，本发明具有以下优势：①使家蚕在发育的各个时期均能表达Hycu-EP32蛋白，克服正常家蚕不表达Hycu-EP32的缺陷，有利于家蚕在各个时期都能利用Hycu-EP32蛋白来抑制病毒的增殖；②巧妙的利用诱导型启动子39kP和增强子Hr3的组合，使转基因家蚕在正常情况下基本不表达Hycu-EP32蛋白，当BmNPV侵染家蚕的时候才表达该蛋白，而且利用病毒增殖产生的IE1蛋白激活Hr3增强子来大量表达该蛋白，使该蛋白的表达量随着病毒量的增加而增加，所以能最大程度减少表达外源蛋白对家蚕正常生理活动和经济性状的影响，同时还能显著提高家蚕的抗性；③滞育性转基因系统不需要连续饲养，保存和管理方便，而且品种资源丢失的风险低；④和传统育种手段相比，本发明通过转基因制备抗性品种不但效果好而且周期短。

附图说明

图1为增量表达hycu-ep32的转基因载体pb-EKG、pb-HEKG的结构示意图。

图2为RT-PCR检测hycu-ep32在EKG、HEKG-A、HEKG-B和正常932中的表达量的琼脂糖凝胶电泳图;ep32代表hycu-ep32，sw22934代表内参基因；PCR检测同一个模板，ep32扩增28个循环，sw22934扩增25个循环。

图3为EKG、HEKG-A、HEKG-B、正常932品种和不攻毒对照的死亡率统计结果;各系统在3龄起蚕以半致死剂量（3×10⁵多角体/头）单头经口添食BmNPV病毒。

图4为EKG、HEKG-B和正常932品种添食病毒后0h和48h， hycu-ep32在各系统中表达量的定量PCR检测结果。

图5为攻毒后48h，EKG、HEKG-B和正常932各系统体内BmNPV病毒含量的定量PCR检测结果。

图6为EKG、HEKG-A、HEKG-B和正常932各系统雌雄全茧量统计结果。

图7为EKG、HEKG-A、HEKG-B和正常932各系统雌雄茧层率统计结果。

具体实施方式

就分子生物学领域中，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

本发明通过构建病毒39kP诱导型启动子以及39kP启动子+Hr3增强子分别介导hycu-ep32基因的增量表达载体；结合蚕卵低温催青解除滞育方法，利用家蚕胚胎显微注射技术，制备了3个家蚕实用品种转基因系统；通过RT-PCR检测证明外源hycu-ep32基因在3个转基因系统中成功表达，而正常家蚕品种中没有该基因；通过经口添食病毒的抗性检测方法，结果发现和正常932系统相比，EKG系统（使用39kP启动子）没有降低死亡率，而HEKG系统（使用39kP启动子+Hr3增强子）则降低了30%左右的死亡率，抗性效果明显；通过定量定PCR检测发现，在正常情况下，hycu-ep32基因在HEKG系统中的表达量是EKG系统中的11.9，在攻毒后48h，hycu-ep32在HEKG系统中的表达为EKG系统中的48.5倍，HEKG系统中hycu-ep32的表达量能够随着病毒的增殖而增加，而EKG系统中hycu-ep32的表达量基本不受病毒的诱导；通过定量定量PCR检测发现，在食下病毒量一致的情况下，在攻毒后48h，BmNPV病毒的拷贝数在EKG和正常932中没有明显区别，而在HEKG-B中的含量仅为正常932中的30%左右；经济性状调查结果显示，EKG、HEKG和正常932各个系统的全茧量没有区别，茧层率也没有区别，说明表达外源hycu-ep32基因没有影响家蚕的经济性状。本发明通过使用39kP启动子+Hr3增强子，成功表达外源hycu-ep32，并且使hycu-ep32的表达量随着病毒含量的增加而增加，在显著提高家蚕抗性的同时没有影响其经济性状。

实施例 1 ：构建转基因增量表达载体 pBac[39kP-hycu-ep32-SV40-3 × P3-EGFP afm] 和 pBac[Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-3 × P3-EGFP afm]

(1)根据已经报道的BmNPV 39kP启动子序列（如SEQ ID NO:2所示）设计特异引物，引物序列如下：39kP F: 5'acgcgtcgaccttgacccgaagcgaaat3', 39kP R:5' cgcggatcctgttgctccggcatgttt 3'，设计的引物委托生工生物工程（上海）有限公司进行合成。以BmNPV基因组为模板，以设计的39kP F和39kP R为上下游引物进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、55℃退火40秒、72℃延伸20秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物（如SEQ ID NO:2所示）用Sal Ⅰ 和BamH Ⅰ进行双酶切，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得39kP酶切片段，同时用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ酶切pSLfa1180fa载体， 琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pSLfa1180fa载体酶切片段，连接39kP酶切片段和pSLfa1180fa载体酶切片段，连接反应在T4 DNA 连接酶作用下，16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，在含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定片段大小，得含有39kP的pSLfa1180fa载体（简称39kP-1180）。

(2)根据hycu-ep32基因序列设计特异引物，引物序列如下：hycu-ep32 F: 5' cgggatccatgaagaaccaacaacag 3'，hycu-ep32 R: 5' atagtttagcggccgcttaatttattaacatatcaaag 3'，设计的引物委托生工生物工程（上海）有限公司进行合成。以HycuNPV基因组为模板，以设计的hycu-ep32 F、hycu-ep32R为上下游引物进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、44℃退火40秒、72℃延伸50秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物（如SEQ ID NO:3所示）分别用 BamH Ⅰ和 Not Ⅰ进行双酶切，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得hycu-ep32酶切片段，同时用BamH Ⅰ和Not Ⅰ酶切39kP-1180载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pSLfa1180fa-39kP载体酶切片段，连接hycu-ep32酶切片段和pSLfa1180fa-39kP载体酶切片段，转化后筛选阳性克隆，得含有hycu-ep32基因和39kP启动子的pSLfa1180fa载体（简称39kP-hycu-ep32-1180）。

(3)用Not Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切已经含有SV40终止信号（如SEQ ID NO:4所示）的1180载体得到SV40酶切片段，同时用Not Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切39kP-hycu-ep32-1180载体得到39kP-hycu-ep32-1180酶切片段，将SV40酶切片段和39kP-hycu-ep32-1180酶切片段进行连接转化，筛选阳性克隆得到含有39kP启动子、hycu-ep32基因和SV40终止信号的pSLfa1180fa载体（简称39kP-hycu-ep32-SV40-1180）。

(4)将增强子Hr3序列（如SEQ ID NO:1所示）用Nco Ⅰ进行单酶切，回收得到Hr3酶切片段，同时将39kP-hycu-ep32-SV40-1180用Nco Ⅰ进行单酶切回收得到39kP-hycu-ep32-SV40-1180酶切片段，将Hr3酶切片段和39kP-hycu-ep32-SV40-1180酶切片段进行连接转化，筛选阳性克隆，得到Hr3增强子、39kP启动子、hycu-ep32基因和SV40终止信号的pSLfa1180fa载体（简称Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-1180）。

(5) 用限制性内切酶Asc Ⅰ分别酶切39kP-hycu-ep32-SV40-1180和Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-1180载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得39kP-hycu-ep32-SV40和Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40片段；同时用内切酶Asc Ⅰ单酶切piggyBac[3×p3 EGFP afm]，的piggyBac[3×p3 EGFP afm]线性片段，然后对获得piggyBac[3×p3 EGFP afm]线性片段5’端去磷酸化，连接39kP-hycu-ep32-SV40和piggyBac[3×p3 EGFP afm]，转化后筛选阳性克隆，得到重组载体pBac[39kP-hycu-ep32-SV40-3×P3-EGFP afm] (pb-EKG)；将Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40片段和piggyBac[3×p3 EGFP afm]连接转化，筛选阳性克隆，得到重组载体pBac[Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-3×P3-EGFP afm] (pb-HEKG) ，如图1所示。

实施例 2 ：转基因显微注射和阳性个体的筛选

（1）将家蚕932品种蚕卵浸酸（所用盐酸比重为1.073，温度为46℃，时间为5分钟）解除滞育以后，放于15℃和80%湿度的黑暗环境中催青30天左右直至孵化，将蚁蚕收好置于标准环境中饲养（温度：25℃，湿度：80%），化蛾以后将雌雄蚕蛾交配4小时，拆对后产下的蚕卵为非滞育蚕卵，用于下一步的显微注射；

（2）将产下的蚕卵在干净的载玻片上排列整齐，在蚕卵产后2小时用Eppendorf显微注射仪将pb-EKG重组载体和辅助质粒A3H，一起注射进91粒932蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25℃、相对湿度80%的环境中催青10天左右孵化，将孵化的25头G0代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾，G0代蚕蛾通过自交或回交共获得6蛾圈G1代蚕卵，用 Olympus^®电动宏观荧光显微镜观察G1胚胎筛选并获得1个阳性蛾圈，即1个39kP启动子介导的外源Hycu-EP32蛋白表达的转基因家蚕，简称EKG转基因系统，转化效率为16.67%；将含有pb-HEKG重组载体和辅助质粒A3H，一起注射进183粒932蚕卵中，共孵化47头G0代蚁蚕，获得13蛾圈G1代蚕卵，筛选得到8个阳性蛾圈，即8个Hr3+39kP启动子介导的外源Hycu-EP32蛋白表达的转基因家蚕，简称HEKG转基因系统，转化效率为61.54%。

（3）将获得的一个EKG阳性蛾圈和随机选择的两个HEKG阳性蛾圈（HEKG-A和HEKG-B）各自单蛾圈饲养，继代扩大。

实施例 3 ： RT-PCR 检测 hycu-ep 32 在 EKG 、 HEKG 和正常 932 中的表达量

（1）将实施例2制备的EKG、HEKG-A、HEKG-B和正常932进行正常饲养，在3龄起蚕、3龄眠蚕、4龄起蚕和4龄眠蚕各取5头幼虫提取总RNA（Total RNA (Mini) Kit ，Watson），用DNA酶消化处理后各自取4μg的RNA反转录成25μl 的cDNA，最后各自稀释到100μl用于下步检测。

（2）利用家蚕内参基因特异引物sw22934 F：5' ttcgtactggctcttctcgt 3'，sw22934 R：5' caaagttgatagcaattccct 3'，取上述的16个cDNA模板各1μl进行RT-PCR检测，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸10秒，共25个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，如图2所示，发现各个模板都扩增出目的条带，而且条带大小粗细程度比较均一，说明这16个cDNA模板是可用的。

（3）利用hycu-ep32的特异检测引物ep32 QRT F: 5' acatcagaatacccatcacg 3'，ep32 QRT R: 5' attgttcaatggtaactccc 3'，取上述的16个cDNA模板各1μl进行RT-PCR检测，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸10秒，共28个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，发现除了正常932的4个模板，在EKG、HEKG-A和HEKG-B的所有模板中都扩增出目的条带，如图2所示。这个结果证明正常家蚕体内确实不含有hycu-ep32基因，而hycu-ep32基因成功在我们所制备的转基因系统中表达。

实施例 4 ：转基因系统的抗性检测

(1)取转基因系统EKG、HEKG-A、HEKG-B和正常932品种，在3龄起蚕时期以半致死剂量（3×10⁵多角体/头）单头经口添食BmNPV病毒，4个系统各设置3个重复区，每个重复区100头蚕，同时每个系统设置3个不攻毒对照区，连续10天统计死亡率；

(2)抗性检测结果如图3所示，EKG、HEKG-A、HEKG-B和正常932的死亡率分别为55.47%、24.29%、24.50%、50.50%。转基因系统EKG的死亡率和正常932系统没有明显区别；转基因系统HEKG-A和HEKG-B的死亡率明显低于正常932系统，能降低26%左右的死亡率。

(3)根据抗性检测结果，我们发现增量表达外源Hycu-EP32蛋白确实能提高家蚕对BmNPV病毒的抗性，而且Hr3+39kP的启动子效率明显优于39kP的启动子效率。

实施例 5 ：定量 PCR 检测 hycu-ep 32 在攻毒后的的表达量变化情况

（1）在3龄起蚕（设为攻毒0h）和攻毒后48h，EKG、HEKG-B和正常932每个系统各取10头蚕，提取总RNA然后反转录成cDNA。以hycu-ep32基因的特异引物ep32 QRT进行定量PCR检测（试剂盒为SYBR Premix Ex Taq Kit，TaKaRa；定量PCR检测仪器为ABI StepOnePlus^TM Real-Time PCR System，Applied Biosystems；按照试剂盒和仪器使用说明书进行操作）；以家蚕看家基因BGIBMGA003186-TA作为内参，检测引物为sw22934。

（2）根据定量PCR的结果如图4所示，我们发现在正常情况下，hycu-ep32在HEKG-B中的表达量是EKG中的11.9倍；在攻毒后48h，hycu-ep32在EKG中的表达量为攻毒前的1.3倍，hycu-ep32在HEKG-B中的表达量为攻毒前的5.4倍；在攻毒后48h，hycu-ep32在HEKG-B中的表达量为EKG中的48.5倍。

（3）从以上的定量PCR结果，我们可以看出，39kP启动子被病毒诱导表达的能力很弱（1.3倍），导致EKG不能增强家蚕的抗性，这说明39kP启动子单独作为一个启动子使用基本不具备应用价值；但是，如果把Hr3增强子和39kP启动子联合一起使用(Hr3+39kP)，则可以明显提高启动子的活性，在正常情况下可以比较明显的提高启动子活性（增强11.9倍），更重要的是，Hr3+39kP在攻毒后的活性大大增加，达到了39kP的48.5倍。这些结果说明由于使用Hr3+39kP启动子，我们的HEKG系统在正常情况下可以表达适量的ep32，在攻毒后则随着病毒量的增加而增加ep32的表达量，这使HEKG系统的经济性状没有受到影响，同时还大大提高了抗性。

实施例 6 ：定量 PCR 检测攻毒后各系统中 BmNPV 病毒的含量

（1）在攻毒后48h，EKG、HEKG-B和正常932每个系统各取10头蚕提取总DNA。每个DNA模板各取20 ng，以BmNPV病毒gp41基因的特异引物进行定量PCR检测，引物为GP41 F: 5‘cgtagtagtagtaatcgccgc3’, GP41 R: 5‘agtcgagtcgcgtcgcttt3’， （试剂盒为SYBR Premix Ex Taq Kit，TaKaRa；定量PCR检测仪器为ABI StepOnePlus^TM Real-Time PCR System，Applied Biosystems；按照试剂盒和仪器使用说明书进行操作）；以家蚕看家基因BmGAPDH为内参，引物为 BmGAPDH F: 5‘ gctgcctccttgaccttttgc3 ’, BmGAPDH R: 5‘ cattccgcgtccctgttgctaat 3’。

（2）定量PCR的结果如图5所示，正常932体内的病毒含量被设置为100%，EKG和HEKG-B体内的病毒含量分别为110.89%和28.39%。从该图我们可以发现，在食下病毒量一致的情况下，在攻毒后48h，BmNPV病毒的拷贝数在EKG和正常932中没有明显区别，而在HEKG-B中的含量则远远低于正常932中的含量。

（3）BmNPV病毒拷贝数的检测结果说明，HEKG-B系统明显抑制了BmNPV病毒在其体内的复制增殖，这也解释了为什么HEKG-B的死亡率明显降低；EKG不能抑制病毒在其体内的增殖，所以不能降低死亡率。

实施例 7 ：调查转基因系统的经济性状

（1）EKG、HEKG-A、HEKG-B和正常932各系统雌雄各自随机抽取15颗茧，分别称取每颗茧的全茧量和茧壳量。

（2）统计的全茧量结果如图6所示：EKG、HEKG-A、HEKG-B和正常932的全茧量分别为1.007g、1.361g、1.353、1.197(雄)，和1.279g、1.749g、1.638g、1.497g(雌)。结果显示转基因系统和正常932之间没有明显区别

（3）计算出的茧层率结果如图7所示：EKG、HEKG-A、HEKG-B和正常932的茧层率分别为22.21%、23.94%、24.49%、23.18% (雄)，和19.50%、19.75%、21.20%、20.36%(雌)。结果也显示转基因系统和正常932之间没有明显区别。

（4）以上调查结果显示转基因增量表达hycu-ep32不会影响家蚕的经济性状。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110> 西南大学

<120> 增强子Hr3在促进hycu-ep32蛋白增量表达中的应用

<160> 6

<210> 1

<211> 959

<212> DNA

<213> 家蚕（Bombyx Batryticatus）

<220>

<223> 增强子Hr3

<400> 1

ccatggaaaa agaagccgtg cccagtcacg tgtacgccaa cctgaacacg caatccaacg 60

acggcgtcaa atacaatcgt tggttgcacg ctaaaaatga ccaatacatg gcgtgtcctg 120

aagaattgta cgataacaac gaatttaaat gtaacgtaga atcggataaa ttatattatt 180

tggataattt acaagaagat tccattgtat aaacatttta tgtcgaaaac aaatgacatc 240

agcttatgat tcatacttaa tcgtgcgtta caagtagaat tctactcgta aagcgagttt 300

aatttggaaa aacaaattag tcattattaa acatgttaac aatcgtgtat aaaatgacat 360

cagtttaatg atgacatcat ctcttgatta tgttttacac gtagaattct actcgtaaag 420

ccagttcagt tttgaaaaac aaatgacatc atctcttgat tatgttttac aagtagaatt 480

ctactcgtaa agccggttca gttttgaaaa acaaatgaca tcatctcttg actgtgtttt 540

acacgtagaa ttctactcgc aaagcaagtt tagttttgaa aaacaaatga catcattcag 600

ttttgaaaaa caaatgacat catctcttga ttgtgtttta cacgtagaat tctgctcgta 660

aagcgagttt ggttttgaaa aacaaatgac atcatttctt aaattcggtt ttgaaaaacg 720

aatgacatca tcttttgatt gtgttttaca cgtagaattc tactcgtaaa gcgagtttgg 780

ttttgaaaaa caaatgacat catctcttga ttatgtttta cacgtagaat tctactcgta 840

aagcgagtta gttttaaaaa acaaatgaca tcatcttaga ggtagacccg tcttggcgac 900

gggtctgctc atacgtcgtt ttgtatttgt cattgcctct tttcacgacg ctgccatgg 959

<210> 2

<211> 308

<212> DNA

<213> 家蚕（Bombyx Batryticatus）

<220>

<223> 39kP启动子

<400> 2

cttgacccga agcgaaatac aagcgctgtt cagggaaacc attaacacgc tcaagcacac 60

aatgaataca gaagacgtct gcgcgcacat gttggacatc gtgtcgtttg agcgtataaa 120

agaatatata agagctaatt taggccattt cacagtaatt accgacaaat gttctaagcg 180

taaggtgtgt cttcatcaca aacgaattgc caggctgttg ggcattaaaa aaatatatca 240

tcaagaatac aagcgggtcg tttcaaaggt ttacaaaaag caaacatggt aaacatgccg 300

gagcaaca 308

<210> 3

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hycu-ep32基因全长序列

<400> 3

atgaagaacc aacaacagtt atccgctcag caacaacgtg ctgccaattc ggcgcgccga 60

ttaactatca aaaaacaacg cgccgacatg gtgaaaaaac tgagcgacag catgtccgct 120

tggttagcaa cggctccaac tagaccatct tatccgttgg tgtttttaaa ctctatgcac 180

aacaccaccg ccggtgctaa tgtacaattt aaaccggtca ccgtgcaaac ggcgcacatc 240

agaataccca tcacggcaac tgtgcggttt accgtggcaa cgcactgccg ttgcatgcac 300

ggtaacattg attgtcacaa gtttgcctgt aatccaacgt gtaaagctga tttggaagcc 360

ggcaatacag acattaacaa cgcgttttac aaattgcaag aagatgctga gaaattggga 420

gttaccattg aacaattgca acaacaacaa gataaagaaa ttgaccaata ttttagtgct 480

gataataatt cgtgcaattt atccatattt aaaatcgaca acctgttcaa gcaaaaagaa 540

tacaatggtt ttaacgacag acggcggcga acggcttgcg cgttaaacaa tcaaaacatt 600

gatgtactca agtacaaaga agattttgac gacgacgaca cgcaaactaa tattagttta 660

aaaatgctgt cggtaacgtc aactggcaat tttaacattt tgtttcccga aacaaacaat 720

gcgtcttgga aaaaattggc cagcaacaac ttaattactg tgtatgacaa ccaacatgaa 780

acgcctgtta ttcaaacgtt taacaaatct gttgaaccat ttgtatgtgt ggccttgaag 840

caaatccgcc agattattat gtcgcaattg taccaacgcg ttgaaatcaa cgttaacaac 900

gccatggcca catttaactt tgatatgtta ataaattaa 939

<210> 4

<211> 235

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SV40终止信号

<400> 4

gactctagat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc 60

tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt 120

ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 180

catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tctta 235

<210> 5

<211> 1496

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 39kP-hycu-ep32-SV40载体

<400> 5

cttgacccga agcgaaatac aagcgctgtt cagggaaacc attaacacgc tcaagcacac 60

aatgaataca gaagacgtct gcgcgcacat gttggacatc gtgtcgtttg agcgtataaa 120

agaatatata agagctaatt taggccattt cacagtaatt accgacaaat gttctaagcg 180

taaggtgtgt cttcatcaca aacgaattgc caggctgttg ggcattaaaa aaatatatca 240

tcaagaatac aagcgggtcg tttcaaaggt ttacaaaaag caaacatggt aaacatgccg 300

gagcaacagg atccatgaag aaccaacaac agttatccgc tcagcaacaa cgtgctgcca 360

attcggcgcg ccgattaact atcaaaaaac aacgcgccga catggtgaaa aaactgagcg 420

acagcatgtc cgcttggtta gcaacggctc caactagacc atcttatccg ttggtgtttt 480

taaactctat gcacaacacc accgccggtg ctaatgtaca atttaaaccg gtcaccgtgc 540

aaacggcgca catcagaata cccatcacgg caactgtgcg gtttaccgtg gcaacgcact 600

gccgttgcat gcacggtaac attgattgtc acaagtttgc ctgtaatcca acgtgtaaag 660

ctgatttgga agccggcaat acagacatta acaacgcgtt ttacaaattg caagaagatg 720

ctgagaaatt gggagttacc attgaacaat tgcaacaaca acaagataaa gaaattgacc 780

aatattttag tgctgataat aattcgtgca atttatccat atttaaaatc gacaacctgt 840

tcaagcaaaa agaatacaat ggttttaacg acagacggcg gcgaacggct tgcgcgttaa 900

acaatcaaaa cattgatgta ctcaagtaca aagaagattt tgacgacgac gacacgcaaa 960

ctaatattag tttaaaaatg ctgtcggtaa cgtcaactgg caattttaac attttgtttc 1020

ccgaaacaaa caatgcgtct tggaaaaaat tggccagcaa caacttaatt actgtgtatg 1080

acaaccaaca tgaaacgcct gttattcaaa cgtttaacaa atctgttgaa ccatttgtat 1140

gtgtggcctt gaagcaaatc cgccagatta ttatgtcgca attgtaccaa cgcgttgaaa 1200

tcaacgttaa caacgccatg gccacattta actttgatat gttaataaat taagcggccg 1260

cgactctaga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac 1320

ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg 1380

tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa 1440

gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atctta 1496

<210> 6

<211> 2470

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40载体

<400> 6

ccatggaaaa agaagccgtg cccagtcacg tgtacgccaa cctgaacacg caatccaacg 60

acggcgtcaa atacaatcgt tggttgcacg ctaaaaatga ccaatacatg gcgtgtcctg 120

aagaattgta cgataacaac gaatttaaat gtaacgtaga atcggataaa ttatattatt 180

tggataattt acaagaagat tccattgtat aaacatttta tgtcgaaaac aaatgacatc 240

agcttatgat tcatacttaa tcgtgcgtta caagtagaat tctactcgta aagcgagttt 300

aatttggaaa aacaaattag tcattattaa acatgttaac aatcgtgtat aaaatgacat 360

cagtttaatg atgacatcat ctcttgatta tgttttacac gtagaattct actcgtaaag 420

ccagttcagt tttgaaaaac aaatgacatc atctcttgat tatgttttac aagtagaatt 480

ctactcgtaa agccggttca gttttgaaaa acaaatgaca tcatctcttg actgtgtttt 540

acacgtagaa ttctactcgc aaagcaagtt tagttttgaa aaacaaatga catcattcag 600

ttttgaaaaa caaatgacat catctcttga ttgtgtttta cacgtagaat tctgctcgta 660

aagcgagttt ggttttgaaa aacaaatgac atcatttctt aaattcggtt ttgaaaaacg 720

aatgacatca tcttttgatt gtgttttaca cgtagaattc tactcgtaaa gcgagtttgg 780

ttttgaaaaa caaatgacat catctcttga ttatgtttta cacgtagaat tctactcgta 840

aagcgagtta gttttaaaaa acaaatgaca tcatcttaga ggtagacccg tcttggcgac 900

gggtctgctc atacgtcgtt ttgtatttgt cattgcctct tttcacgacg ctgccatggc 960

catgggacgt cgaccttgac ccgaagcgaa atacaagcgc tgttcaggga aaccattaac 1020

acgctcaagc acacaatgaa tacagaagac gtctgcgcgc acatgttgga catcgtgtcg 1080

tttgagcgta taaaagaata tataagagct aatttaggcc atttcacagt aattaccgac 1140

aaatgttcta agcgtaaggt gtgtcttcat cacaaacgaa ttgccaggct gttgggcatt 1200

aaaaaaatat atcatcaaga atacaagcgg gtcgtttcaa aggtttacaa aaagcaaaca 1260

tggtaaacat gccggagcaa caggatccat gaagaaccaa caacagttat ccgctcagca 1320

acaacgtgct gccaattcgg cgcgccgatt aactatcaaa aaacaacgcg ccgacatggt 1380

gaaaaaactg agcgacagca tgtccgcttg gttagcaacg gctccaacta gaccatctta 1440

tccgttggtg tttttaaact ctatgcacaa caccaccgcc ggtgctaatg tacaatttaa 1500

accggtcacc gtgcaaacgg cgcacatcag aatacccatc acggcaactg tgcggtttac 1560

cgtggcaacg cactgccgtt gcatgcacgg taacattgat tgtcacaagt ttgcctgtaa 1620

tccaacgtgt aaagctgatt tggaagccgg caatacagac attaacaacg cgttttacaa 1680

attgcaagaa gatgctgaga aattgggagt taccattgaa caattgcaac aacaacaaga 1740

taaagaaatt gaccaatatt ttagtgctga taataattcg tgcaatttat ccatatttaa 1800

aatcgacaac ctgttcaagc aaaaagaata caatggtttt aacgacagac ggcggcgaac 1860

ggcttgcgcg ttaaacaatc aaaacattga tgtactcaag tacaaagaag attttgacga 1920

cgacgacacg caaactaata ttagtttaaa aatgctgtcg gtaacgtcaa ctggcaattt 1980

taacattttg tttcccgaaa caaacaatgc gtcttggaaa aaattggcca gcaacaactt 2040

aattactgtg tatgacaacc aacatgaaac gcctgttatt caaacgttta acaaatctgt 2100

tgaaccattt gtatgtgtgg ccttgaagca aatccgccag attattatgt cgcaattgta 2160

ccaacgcgtt gaaatcaacg ttaacaacgc catggccaca tttaactttg atatgttaat 2220

aaattaagcg gccgcgactc tagatcataa tcagccatac cacatttgta gaggttttac 2280

ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 2340

ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 2400

atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 2460

atgtatctta 2470

Claims (9)

1.增强子Hr3在提高hycu-ep32蛋白表达量中的应用，所述增强子Hr3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，增强子Hr3在介导39kP启动子提高hycu-ep32蛋白表达量中的应用，所述39kP启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.增量表达载体，其特征在于，所述增量表达载体以转座载体pBac[3×P3-EGFP afm]为基础载体，依次连接有增强子Hr3、39kP启动子、hycu-ep32基因和终止信号序列。

4.根据权利要求3所述的增量表达载体，其特征在于，所述hycu-ep32基因为hycu-ep32基因全长序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.根据权利要求3所述的增量表达载体，其特征在于，所述终止信号序列为SV40，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

6.权利要求3所述的增量表达载体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

A） 39kP-1180载体的构建

将如SEQ ID NO:2所示的39kP启动子用Sal Ⅰ 和BamH Ⅰ进行双酶切，得39kP启动子酶切片段，同时用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ酶切pSLfa1180fa载体，得pSLfa1180fa载体酶切片段，连接39kP酶切片段和pSLfa1180fa载体酶切片段，得39kP-1180载体；

B ）39kP-hycu-ep32-1180载体的构建

将核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的hycu-ep32基因分别用 BamH Ⅰ和 Not Ⅰ进行双酶切，得hycu-ep32酶切片段，同时用BamH Ⅰ和Not Ⅰ酶切39kP-1180载体，得pSLfa1180fa-39kP载体酶切片段，连接hycu-ep32酶切片段和pSLfa1180fa-39kP载体酶切片段，得39kP-hycu-ep32-1180载体；

C ) 39kP-hycu-ep32-SV40-1180载体的构建

Not Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切含有如SEQ ID NO:4所示的终止信号的1180载体，得到终止信号酶切片段，同时用Not Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切步骤B所得39kP-hycu-ep32-1180载体，得到39kP-hycu-ep32-1180酶切片段，将终止信号酶切片段和39kP-hycu-ep32-1180酶切片段进行连接，得39kP-hycu-ep32-SV40-1180,如SEQ ID NO:5所示；

D) Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-1180

将如SEQ ID NO:1所示 增强子Hr3用Nco Ⅰ进行单酶切，得增强子Hr3酶切片段，同时将步骤C所得的39kP-hycu-ep32-SV40-1180用Nco Ⅰ进行单酶切，得39kP-hycu-ep32-SV40-1180酶切片段，将所述增强子Hr3酶切片段和39kP-hycu-ep32-SV40-1180酶切片段进行连接，得Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-1180,其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

E) pBac[Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-3×P3-EGFP afm]的构建

用限制性内切酶Asc Ⅰ酶切步骤D所得Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-1180载体，得Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40片段；同时用内切酶Asc Ⅰ单酶切piggyBac[3×p3 EGFP afm]，得piggyBac[3×p3 EGFP afm]线性片段，将Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40片段和piggyBac[3×p3 EGFP afm]连接，得增量表达载体，命名为pBac[Hr3-39kP-hycu-ep32-SV40-3×P3-EGFP afm]。

7.根据权利要求6所述的增量表达载体的制备方法，其特征在于，步骤A)中，如SEQ ID NO:2所示的39kP启动子的获得方式如下：设计特异引物，39kP的上游引物为: 5'acgcgtcgaccttgacccgaagcgaaat3', 39kP的下游引物为： R:5' cgcggatcctgttgctccggcatgttt 3'；以BmNPV基因组为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、55℃退火40秒、72℃延伸20秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。

8.根据权利要求6所述的增量表达载体的制备方法，其特征在于，步骤B)中，如SEQ ID NO:3所示的hycu-ep32的获得方式如下： hycu-ep32基因序列设计特异引物，上游引物为： 5' cgggatccatgaagaaccaacaacag 3'，下游引物为： 5' atagtttagcggccgcttaatttattaacatatcaaag 3'；以HycuNPV基因组为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、44℃退火40秒、72℃延伸50秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。

9.权利要求3所述的增量表达载体在制备家蚕核型多角体病毒抗性增效剂中的应用。

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