CN114317613B - 利用基因组编辑技术构建鳞翅目昆虫雌性不育品系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用基因组编辑技术构建鳞翅目昆虫雌性不育品系的方法。该方法包括：1)构建Esp基因敲除核酸构建物，其包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第一Esp基因靶点和polyA；U6启动子，第二Esp基因靶点和polyA；2)将所述构建物和可表达Piggybac转座酶的PHA3PIG质粒共转鳞翅目新鲜昆虫卵，得G0代，自交得G1代；和，3)将所述G1代与表达Cas9蛋白的转基因鳞翅目昆虫交配得G2代，即得。本发明利用基于piggyBac转座子的CRISPR/Cas9技术成功构建了在不影响正常交配行为的前提下雌性不育的鳞翅目昆虫，在鳞翅目害虫通过雌性不育技术进行防治方面具有重要的价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及利用基因组编辑技术构建鳞翅目昆虫雌性不育品系的方法。
背景技术
家蚕是以桑叶为食料、吐丝结茧的经济昆虫，也是鳞翅目的模式昆虫。家蚕除了具有模式生物的基本要素外，还有自身的特殊优势，例如基础研究历史悠久、多重测序数据和已实现人为控制等。利用家蚕作为昆虫害虫防治特别是鳞翅目害虫的遗传防治的研究对象，将在农林业害虫遗传防治方面产生重大的影响，而且还将在鳞翅目其他昆虫中推广应用。现阶段害虫的生物学防治不育技术大多是使用辐射及四环素诱导，而这两种不育技术耗时耗力并不能有稳定的遗传效应品系。因此，研究一种稳定遗传以及下一代雌性有效不育的品系迫在眉睫。
昆虫不育技术的原理是将突变后的不育昆虫规模性的释放到田间并与野生型异性昆虫交配，使其无法正常产生后代，以期达到降低甚至根除靶标害虫的目标。昆虫不育技术已被认为是一种环境友好型的害虫生物防治新方法，其不仅可以实现控制害虫种群数量的目的，而且对其它物种和环境没有影响。在过去的六十年中，研究者们主要开发了三种不同类型的昆虫不育技术，包括：基于辐射的昆虫不育技术(radiationbased steriletechnology，rSIT)、微生物介导的昆虫不育技术(microbe-mediated steriletechnology，mSIT)和基于遗传操作的昆虫不育技术(genetic-based inheritablesterile technology，gSIT)。现在被广泛应用的不育技术是gSIT，其原理是通过将外源或内源基因插入宿主基因组或将内源基因定点敲除，使昆虫性别特异性致死或不育，并成功实现种群数量控制。
昆虫不育技术有效实施的重要因素是改造后的个体在自然界有较强竞争能力和具有多代效应。转基因不育昆虫通过携带不育性状，并能正常释放信息素吸引野生型异性进行交配，后代中的单一性别突变体可以与野生型异性交配产生后代，而另一性别突变体可以与野生型异性交配但不产生后代，不育性状可以继续在后代中广泛传播，并在一定时间内最终导致种群数量减少。在昆虫交配生殖过程中，雌性卵黄发生的相关基因是雌性生殖成功必不可少的。卵黄发生基因能够影响卵黄蛋白的沉积，进而影响雌性的生殖力、生育力及后代存活率等。
发明内容
本发明的目的是鳞翅目昆虫遗传不育技术中缺乏雌性不育的鳞翅目昆虫品系的不足，提供利用基因组编辑技术构建鳞翅目昆虫雌性不育品系的方法。
为此，本发明提供一种制备雌性不育的鳞翅目昆虫的方法，其包括以下步骤：
1)构建Esp基因敲除核酸构建物，其包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：第一sgRNA表达元件和第二sgRNA表达元件；所述的第一sgRNA表达元件包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第一Esp基因靶点和polyA；所述的第二sgRNA表达元件包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第二Esp基因靶点和polyA；
2)将步骤1)所述的Esp基因敲除核酸构建物和可表达Piggybac转座酶的PHA3PIG质粒共转鳞翅目新鲜昆虫卵，孵化，化蛾，得G0代，使G0代自交，获得G1代；和
3)将步骤2)所述的G1代与表达Cas9蛋白的转基因鳞翅目昆虫交配，获得的G2代，即得雌性高度不育的鳞翅目昆虫。
优选的，所述的第一Esp基因靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的第二Esp基因靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选的，所述的Esp基因敲除核酸构建物还包括第一筛选标记基因表达盒。
优选的，所述的第一筛选标记基因是红色荧光蛋白基因。
优选的，所述的表达Cas9蛋白的转基因鳞翅目昆虫含有Cas9基因表达盒，所述的Cas9基因表达盒包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：Nos启动子，Cas9蛋白编码序列和SV40终止子。
优选的，所述的表达Cas9蛋白的转基因鳞翅目昆虫还包括第二筛选标记基因表达盒。优选的，所述的第二筛选标记基因是绿色荧光蛋白。
优选的，所述的共转是将所述Esp基因敲除核酸构建物和可表达Piggybac转座酶的PHA3PIG质粒混合后所得的混合液显微注射新鲜昆虫卵。
优选的，所述的鳞翅目昆虫是家蚕。
本发明还提供一种Esp基因敲除核酸构建物，其包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：第一sgRNA表达元件和第二sgRNA表达元件；所述的第一sgRNA表达元件包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第一Esp基因靶点和polyA；所述的第二sgRNA表达元件包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第二Esp基因靶点和polyA。
本发明还提供一种防治鳞翅目害虫的方法，包括以下步骤：将如上所述的方法制备而得的雌性不育的鳞翅目昆虫野外放生，通过与野生鳞翅目昆虫交配，使后代减少，降低种群数量。
本发明利用基于piggyBac转座子的CRISPR/Cas9技术敲除家蚕Esp基因，提供了稳定有效的雌性不育遗传品系，解决了传统的通过辐射及四环素诱导不育昆虫的方法不能稳定有效遗传给后代的问题。首次敲除家蚕Esp基因，成功实现了通过雌性突变体的释放，其后代中雌性突变体不育，从而实现昆虫的可控性。本发明将家蚕胚胎显微注射技术，荧光检测与分子生物操作相结合，敲除家蚕Esp基因而获得雌性不育稳定遗传品系。可以推广至害虫的生物学防治，促进环境友好型防治的发展。
附图说明
图1家蚕Esp基因结构图和质粒构建模式图。A：家蚕Esp基因结构及敲除靶点，红色为PAM序列。B：Esp基因转基因质粒构建模式图。
图2家蚕Esp基因敲除导致雌性不育。A：野生型雌、雄虫交配(WT♀×WT♂)产的卵可发育，野生型雌虫与突变的雄虫交配(WT♀×ΔEsp♂)产的卵可发育，野生型雄虫与突变的雌虫交配(ΔEsp♀×WT♂)产的卵不发育，突变的雌、雄虫交配(ΔEsp♀×ΔEsp♂)产的卵不发育。B：成虫交配后，其后代数量的量化图，与野生型和突变体雌性相比，突变体雌性的后代数差异极显著。
具体实施方式
本发明人经过广泛研究和反复试验，通过对基因突变位点的选择以及转基因质粒的构建将家蚕胚胎显微注射技术、荧光检测与分子生物操作相结合，构建了一个BmEsp基因突变家蚕品系，发现Esp基因突变后，雌雄突变体的正常交配行为均不受影响，雄性突变体作为亲本的蚕卵孵化率正常，然而雌性突变体作为亲本的蚕卵孵化率却接近0，可见BmEsp基因突变体家蚕雌性高度不育，可以用于鳞翅目昆虫的遗传控制，防治鳞翅目害虫，从而完成了本发明。
鳞翅目
鳞翅目包括蛾、蝶两类昆虫。属于有翅亚纲、全变态类。全世界已知约20万种，中国已知约8000余种。该目为昆虫纲中仅次于鞘翅目的第2个大目。包括麦蛾科；粉蝶科，如麦蛾、棉红铃虫、马铃薯块茎蛾和甘薯麦蛾等；卷蛾科，如棉褐带卷蛾、大豆食心虫等；螟蛾科，如梨大食心虫、玉米螟等；尺蛾科，如大造桥虫等；粉蝶科，如菜粉蝶等；夜蛾科，如粉蚊夜蛾、棉铃虫等；毒蛾科，如舞毒蛾等；凤蝶科，如玉带风蝶、金风蝶等；舟蛾科，如舟形毛虫等；灯蛾科，如黄腹灯蛾、红腹灯蛾、美国白蛾等；天蛾科，如葡萄天蛾等；蚕蛾科，如家蚕等；天蚕蛾科，如樗蚕等；弄蝶科，如稻苞虫等。鳞翅目昆虫的分布范围极广，以热带种类最为丰富。绝大多数种类的幼虫为害各类栽培植物，体形较大者常食尽叶片或钻蛀枝干。体形较小者往往卷叶、缀叶、结鞘、吐丝结网或钻入植物组织取食为害。成虫多以花蜜等作为补充营养，或口器退化不再取食，一般不造成直接危害。
综上所述，鳞翅目昆虫周大多数是害虫，也有少数，例如家蚕是有经济价值的昆虫。因此，对鳞翅目昆虫的大规模雌性不育技术进行研究，对于害虫的防治以及有经济价值的转基因产物将产生极大的现实意义。
因此，在优选的实施方式中，本发明的鳞翅目昆虫是家蚕。
目前鳞翅目昆虫转基因技术常用转座子的方式进行。piggyBac转座子是一种来源于鳞翅目昆虫的转座子，最初是通过杆状病毒(Baculovirus)侵染粉蚊夜蛾(Trichoplusiani)TN-368细胞株系，从Galleria mellonella(GmMNPV)和Autographa californica(AcMNPV)核多角体病毒内首次分离得到的，在粉红色螟蛉虫(Pectinophora gassypiella)胚胎、家蚕(Bombyx mori)卵细胞的切除测试等都证明了piggyBac转座子切除的准确性。在黄色伤寒蚊(Aedes aegypti)、粉蚊夜蛾和家蚕卵细胞内等的实验也显示了piggyBac能够进行顺利转座，而且切除和转座的频率都较高。在家蚕中的研究始于1997年，发现piggyBac转座子对家蚕的转座作用，研究人员随后利用piggyBac转座子对家蚕进行了研究。piggyBac转座子的深入研究将为害虫的遗传防治奠定理论基础。
目前普遍使用的基因组编辑技术的原理是通过人为的在基因组特定位点产生DNA双链断裂(Double-strand break，DSB)，从而诱发细胞中的DNA修复系统发生非同源末端连接(Nonhomologous end joining，NHEJ)和同源重组修复(Homologous recombination，HR)。通过上述修复途径，认为产生的DNA双键断裂处就会实现基因突变、特异突变引入和定点修饰。基因组编辑分为三类，其中CRISPR/Cas9技术成本较低，靶点剪切效率较高。
Esp(又称egg-specific protein)是一种卵黄蛋白编码基因，具有极强的保守性，在鳞翅目昆虫中普遍存在，在生殖发育中发挥重要作用。Esp在基因家族中属于糖脂蛋白基因家族，是胚胎发生、早期胚胎生长分化的能量来源和结构物质，最先被胚胎消耗和利用。本发明的Esp基因是鳞翅目昆虫的Esp基因，优选家蚕的。家蚕的BmEsp基因是研究鳞翅目昆虫的生殖，以及通过不育技术防治鳞翅目害虫的合适材料。
本发明优选Esp基因靶点序列，在CRISPR/Cas9技术中作为靶点序列敲除Esp基因，从而得到雌性不育突变体的功能。根据CRISPR/Cas9系统的靶标位点特点，本发明优选的两个靶点分别位于家蚕Esp基因(GenBank：NM_001126246.1)的第十和第十一外显子。更优选的，分别命名是TS1(GGTGCTTGCTGACGTGAGAGCGG)和TS2(GGGTATCAACGTTTACAACCAGG)。
因此，本发明包括与本发明的优选Esp基因靶点序列1或2(SEQ ID NO:1或2)具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的核酸，所述核酸也具有在CRISPR/Cas9技术中作为靶点序列敲除Esp基因，从而得到不育突变体的功能。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。
鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员不难理解，尽管本发明的实例中提供了来源于家蚕的Esp基因的靶点序列，但是来源于鳞翅目的其它昆虫，例如草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、小菜蛾，与本发明启动子具有一定同源性(保守性)的Esp基因靶点序列，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它昆虫中分离得到该Esp基因靶点序列并验证其功能。
(1)BmEsp基因敲除载体：
本发明所使用的BmEsp敲除质粒PXL-BacII-IE1-DsRed2-U6-BmEspsgRNA1-U6-BmEspsgRNA2是基于广泛应用于昆虫转基因研究的PiggyBac转座子(Piggybac转座子见Fraser et al.,Insect Moecular Biology,1996))加以改造完成的。如下：
首先在PiggyBac转座子载体中导入了由IE1启动子(Kojima et al,VirusResearch,2008)驱动的红色荧光蛋白DsRed，构建成为PXL-BacII-IE1-DsRed2转基因载体。成功转入此载体后，转基因阳性个体从胚胎后期可以全身表达红色荧光，便于筛选。随后在PXL-BacII-IE1-DsRed2质粒中逐次插入两个插入U6序列-polyA序列(U6为启动子序列，polyA序列为mRNA 3’末端的多聚腺苷酸序列)，其中U6序列为SEQ ID NO:3所示，polyA序列为：“TTTTTT”。至此，将PiggyBac转座子载体改造成为质粒PXL-BacII-IE1-DsRed2-U6-U6。
接着，由家蚕全基因组模板使用靶点鉴定引物F1、R1、F2和R2，通过PCR方法获得靶点片段。测序并确定靶点序列。合成长引物sgRNA-F1、sgRNA-R1、sgRNA-F2、sgRNA-R2、sgRNA-KnpI-F、sgRNA-HindIII-R、sgRNA-Overlap-F和sgRNA-Overlap-R。其中sgRNA-KnpI-F和sgRNA-R1、sgRNA-F1和sgRNA-Overlap-R两对引物分别以PXL-BacII-IE1-DsRed2-U6-U6质粒为模板，通过PCR获得产物，然后产物以2:1的体积比为模板，以sgRNA-KnpI-F和sgRNA-Overlap-R为引物，通过PCR获得带限制性内切酶KnpI同源臂的BmEspsgRNA-1片段。同理，以sgRNA-Overlap-F和sgRNA-R2、sgRNA-F2和sgRNA-HindIII-R为第一轮PCR引物，得产物后，以sgRNA-Overlap-F和sgRNA-HindIII-R为第二轮引物，通过PCR获得带限制性内切酶HindIII同源臂的BmEspsgRNA-2片段。
最后，用限制性内切酶KnpI和HindIII酶切PXL-BacII-IE1-DsRed2-U6-U6质粒。将上述酶切产物与带KnpI同源臂的BmEspRNA-1片段和带HindIII同源臂的BmEspRNA-2片段混合后通过同源重组的方法分别插入U6启动子下游，进行测序，确认插入正确后，得到PXL-BacII-IE1-DsRed2-U6-BmEspsgRNA1-U6-BmEspsgRNA2质粒。测序正确后，使用Qiagen公司的Plasmid Midi kit试剂盒纯化备用。这样就获得了BmEsp敲除质粒PXL-BacII-IE1-DsRed2-U6-BmEspsgRNA1-U6-BmEspsgRNA2(质粒模式图见图1)。
(2)转基因家蚕Esp敲除品系
本发明中使用可表达Piggybac转座酶的PHA3PIG质粒(参见Tamura et al.,Nature Biotechnology,2000)辅助产生piggyBac转座子，通过显微注射方法将Esp敲除质粒PXL-BacII-IE1-DsRed2-U6-BmEspsgRNA1-U6-BmEspsgRNA2和PHA3PIG质粒混合后注射入家蚕新鲜卵中，具体方法参照Kanda﹠Tamura(1991)。注射后用无毒胶封口以防污染，随后在25℃的无菌环境中孵化，并饲养蚁蚕，将当代(G0代)蚕蛾自交，获得的G1代蚕卵在荧光显微镜下筛选出红色荧光个体。
家蚕Nos-Cas9是家蚕转基因激活品系。该品系转基因家蚕全身表达EGFG绿色荧光，并在性腺中表达Cas9蛋白，是未来获得双荧光家蚕的亲本家蚕。根据文献(Xu,J.,Chen,S.,Zeng,B.,James,A.A.,Tan,A.and Huang,Y.(2017)Bombyx mori P-element SomaticInhibitor(BmPSI)Is a Key Auxiliary Factor for Silkworm Male SexDetermination.PLoS Genet,13,e1006576.)构建。首先在PiggyBac转座子载体中导入了由IE1启动子(Kojima et al,VirusResearch,2008)驱动的绿色荧光蛋白EGFP，构建成为PXL-BacII-IE1-EGFP转基因载体。随后分别克隆家蚕Nos基因的启动子、Cas9基因和SV40终止子序列。通过同源重组方法一次插入PXL-BacII-IE1-EGFP转基因载体，从而得到PXL-BacII-IE1-EGFP-Nos-Cas9-SV40转基因质粒。最后通过显微注射野生型家蚕，得到转基因家蚕品系Nos-Cas9。Nos启动子序列参见专利“家蚕生殖腺特异表达的启动子及其捕获方法”(专利申请号201610360601.2，陈容梅等，2016)。Cas9基因的序列如SEQ ID NO:4所示。SV40终止子序列如SEQ ID NO:5所示。注射后用无毒胶封口以防污染，随后在25℃的无菌环境中孵化，并饲养蚁蚕，将当代(G0代)自交后，获得的G1代蚁蚕在荧光显微镜下筛选出绿色荧光个体。
随后将筛选得到的G1代红色荧光个体和Nos-Cas9 G1代绿色荧光个体饲养并交配，获得的G2代蚁蚕在荧光显微镜下筛选双荧光(即发红光又发绿光)蚁蚕，所得双荧光家蚕抽提基因组鉴定靶点突变情况，待其生长至成虫，进行交配生殖现象观察，并统计产卵情况。
(3)BmEsp突变体家蚕的检测
本发明通过验证双荧光家蚕BmEsp基因突变以及统计其产卵情况，发现BmEsp基因突变对雌性家蚕孵化率具有实质性影响。基因突变情况的鉴定：在蚁蚕期挑取若干双荧光家蚕抽提基因组，通过PCR方法克隆靶点片段并测序。获得转基因个体可以通过观察红色和绿色荧光挑选出同时带有红色和绿色荧光蛋白表达的蚕卵即可。通过蛹期区分出不同性别，在成虫时确定是否雌性不育。双荧光家蚕所产卵的情况可通过将大量单性别双荧光家蚕与野生型家蚕在环境温度25℃下交配5小时后拆对，随后在相同环境中产卵36小时，统计产卵量。
本发明的优点在于：首次利用基于piggyBac转座子的CRISPR/Cas9技术成功构建了在不影响正常交配行为的前提下雌性高度不育的家蚕品系。所得到的转基因BmEsp突变体家蚕品系，无论雌雄突变体在相同环境中与野生型交配均不存在任何障碍，雄性突变体作为亲本的蚕卵孵化率正常，然而雌性突变体作为亲本的蚕卵孵化率却接近0。另外，本发明使突变体的获得非常容易。本发明在鳞翅目害虫通过雌性不育技术进行防治方面具有重要的价值。
实施例1载体的构建
1.通过PCR方法克隆获得BmEsp敲除质粒PXL-BacII-IE1-DsRed2-U6-BmEspsgRNA1-U6-BmEspsgRNA2。具体步骤：
I.sgRNA-KnpI-F和sgRNA-R1、sgRNA-F1和sgRNA-Overlap-R两对引物分别以PXL-BacII-IE1-DsRed2-U6-U6质粒为模板，通过PCR获得产物，然后产物以2:1的体积比为模板，以sgRNA-KnpI-F和sgRNA-Overlap-R为引物，通过PCR获得带限制性内切酶KnpI同源臂的BmEspsgRNA-1片段。同理，以sgRNA-Overlap-F和sgRNA-R2、sgRNA-F2和sgRNA-HindIII-R为第一轮PCR引物，得产物后，以sgRNA-Overlap-F和sgRNA-HindIII-R为第二轮引物，通过PCR获得带限制性内切酶HindIII同源臂的BmEspsgRNA-2片段。
最后，用限制性内切酶KnpI和HindIII酶切PXL-BacII-IE1-DsRed2-U6-U6质粒。将上述酶切产物与带KnpI同源臂的BmEspRNA-1片段和带HindIII同源臂的BmEspRNA-2片段混合后通过同源重组的方法分别插入U6启动子下游，进行测序，确认插入正确后，得到PXL-BacII-IE1-DsRed2-U6-BmEspsgRNA1-U6-BmEspsgRNA2质粒。测序正确后，使用Qiagen公司的Plasmid Midi kit试剂盒纯化备用。这样就获得了BmEsp敲除质粒PXL-BacII-IE1-DsRed2-U6-BmEspsgRNA1-U6-BmEspsgRNA2。其中PCP使用KOD PLUS Taq酶(宝生物工程公司)按如下体系配置PCR反应体系。
| 名称 | 用量(μl) |
| 10×Buffer | 5 |
| 2mM dNTPs | 5 |
| 25mM MgSO4 | 2 |
| KOD-Plus | 0.5 |
| 引物Primer-F | 1(10mM) |
| 引物Primer-R | 1(10mM) |
| 模板 | 2 |
| 加双蒸水至 | 50 |
PCR程序设置为:
PCR产物使用Gel Extraction Kit D2500试剂盒纯化后备用。
II.酶切PXL-BacII-IE1-DsRed2-Real-U6-U6质粒。酶切体系如下：
| 名称 | 用量 |
| KnpI内切酶(NEB公司) | 3μl |
| HindIII内切酶(NEB公司) | 3μl |
| PXL-BacII-IE1-DsRed2-U6-U6质粒 | 3μg |
| 去离子水 | ～50μl |
酶切程序：37℃，过夜(>8h)。
酶切产物使用Qiagen公司的Plasmid Midi kit试剂盒纯化。
III.使用One Step Cloning Kit将BmEspsgRNA-1和BmEspsgRNA-2片段分别插入至PXL-BacII-IE1-DsRed2-U6-U6的U6启动子的下游。反应体系如下：
反应程序：37℃，30min；冰浴5min。
IV.转化III中获得的重组质粒，涂板，隔天做菌落PCR。反应体系与I步骤相同。阳性单克隆送测序。使用引物为：sgRNA-F3421和sgRNA-R3667。
V.测序结果证明BmEspsgRNA-1和BmEspsgRNA-2片段插入正确。使用Qiagen公司的Plasmid Midi kit试剂盒纯化该质粒。从而获得Esp敲除质粒PXL-BacII-IE1-DsRed2-U6-BmEspsgRNA1-U6-BmEspsgRNA2，供随后注射。
实施例2转基因家蚕的获得
将实施例1制备的Esp敲除质粒PXL-BacII-IE1-DsRed2-U6-BmEspsgRNA1-U6-BmEspsgRNA2和可表达Piggybac转座酶的质粒PHA3PIG等量混合后注射到家蚕初产卵中。注射方法为按照Kanda﹠Tamura(1991)所述的方法进行显微注射。注射后用无毒胶封口以防污染，随后在25℃的无菌环境中孵化，并饲养蚁蚕，化蛾后，将当代(G0代)蚕蛾自交，获得的G1代蚁蚕，在荧光显微镜下筛选出具有红色荧光的转基因家蚕个体(即为BmEsp突变中间品系)。
随后，将筛选得到的红色荧光转基因家蚕和绿色荧光转基因家蚕Nos-Cas9饲养并交配，获得的G2代蚁蚕，在荧光显微镜下筛选双荧光(即发红光又发绿光)蚁蚕(即为BmEsp突变品系)，所得双荧光家蚕抽提基因组鉴定靶点突变情况，并观察统计产卵及孵化率情况(参见图2)。
实施例3转基因家蚕的检测
基因突变情况的鉴定：蚁蚕期挑取10头双荧光家蚕(即上文所述的BmEsp突变品系)抽提其基因组，使用引物F1和R1、F2和R2，通过PCR方法克隆靶点片段并测序。测序结果表明，双荧光家蚕体内的BmEsp基因中，“靶点1”和“靶点2”序列均发生突变。
双荧光家蚕所产卵的情况：将30头单性别双荧光家蚕(即上文所述的BmEsp突变品系)与野生型家蚕在环境温度25℃下交配5小时后拆对，随后在相同环境中产卵36小时，统计产卵量及孵化率，参见图2。可见，BmEsp产生突变(即双荧光)的雄家蚕与正常雌家蚕所产的卵孵化率正常；BmEsp产生突变(即双荧光)的雌家蚕与正常雄家蚕所产的卵孵化率接近0，且突变体雌雄家蚕交配所产的卵孵化率接近0。综上所述，BmEsp产生突变(即双荧光)的雌性家蚕不育(图2)。
在(即上文所述的BmEsp突变品系)成虫时，野生型雌、雄虫交配(WT♀×WT♂)产的卵可发育；野生型雌虫与突变的雄虫交配(WT♀×ΔEsp♂)产的卵可发育；野生型雄虫与突变的雌虫交配(ΔEsp♀×WT♂)产的卵不发育；突变的雌、雄虫交配(ΔEsp♀×ΔEsp♂)产的卵不发育。此结果表明(即上文所述的BmEsp突变品系)雌性突变体不育，而且通过雄性突变体可育将此系统稳定遗传给后代，后代中的雌性突变体可不育，进而达到数量可控性。
实施例4BmEsp突变体相较于BmOsp突变体的优点
在(即上文所述的BmEsp突变品系)成虫时，将30头单性别双荧光家蚕BmEsp突变体和对照BmOsp突变体(是BmOsp基因敲除的家蚕突变体，具体参见发明名称为：“一种制备雌性不育的鳞翅目昆虫的方法及其核酸构建物”，申请号为：201910850906.5的发明专利申请)分别与野生型家蚕在环境温度25℃下交配5小时后拆对，随后在相同环境中产卵36小时，统计每个处理组的平均产卵量。结果见表1，从中可见：
在BmEsp突变体中，野生型雌、雄虫交配(WT♀×WT♂)的平均产卵量为358个，野生型雌虫与突变的雄虫交配(WT♀×ΔEsp♂)的平均产卵量为344个；野生型雄虫与突变的雌虫交配(ΔEsp♀×WT♂)的平均产卵量为332个；突变的雌、雄虫交配(ΔEsp♀×ΔEsp♂)的平均产卵量为289个。
在BmOsp突变体中，野生型雌、雄虫交配(WT♀×WT♂)的平均产卵量为367个，野生型雌虫与突变的雄虫交配(WT♀×ΔOsp♂)的平均产卵量为350个；野生型雄虫与突变的雌虫交配(ΔOsp♀×WT♂)的平均产卵量为156个；突变的雌、雄虫交配(ΔOsp♀×ΔOsp♂)的平均产卵量为106个。
此结果表明，BmEsp基因突变导致的雌性不育相较于BmOsp基因突变导致的雌性不育，优势在于BmEsp基因突变不影响产卵指标。相较于BmOsp基因突变，其对家蚕影响更小，但也同样达到雌性不育的目的。
表1.BmEsp突变体与BmOsp突变体产卵量比较
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
/>
/>
/>
序列表
<110> 浙江省农业科学院
中国科学院分子植物科学卓越创新中心
华东师范大学
<120> 利用基因组编辑技术构建鳞翅目昆虫雌性不育品系的方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtgcttgct gacgtgagag cgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggtatcaac gtttacaacc agg 23
<210> 3
<211> 467
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggttatgta gtacacattg ttgtaaatca ctgaattgtt ttagatgatt ttaacaatta 60
gtacttatta atattaaata agtacatacc ttgagaattt aaaaatcgtc aactataagc 120
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<210> 4
<211> 4140
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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tataacgagc tcaccaaggt caaatacgtc acagaaggga tgagaaagcc agcattcctg 1620
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attaaagaca aggacttcct ggacaatgag gagaacgagg acattcttga ggacattgtc 1860
ctcaccctta cgttgtttga agatagggag atgattgaag aacgcttgaa aacttacgct 1920
catctcttcg acgacaaagt catgaaacag ctcaagaggc gccgatatac aggatggggg 1980
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gattttctta agtccgatgg atttgccaac cggaacttca tgcagttgat ccatgatgac 2100
tctctcacct ttaaggagga catccagaaa gcacaagttt ctggccaggg ggacagtctt 2160
cacgagcaca tcgctaatct tgcaggtagc ccagctatca aaaagggaat actgcagacc 2220
gttaaggtcg tggatgaact cgtcaaagta atgggaaggc ataagcccga gaatatcgtt 2280
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atgaagagga ttgaagaggg tataaaagaa ctggggtccc aaatccttaa ggaacaccca 2400
gttgaaaaca cccagcttca gaatgagaag ctctacctgt actacctgca gaacggcagg 2460
gacatgtacg tggatcagga actggacatc aatcggctct ccgactacga cgtggatcat 2520
atcgtgcccc agtcttttct caaagatgat tctattgata ataaagtgtt gacaagatcc 2580
gataaaaata gagggaagag tgataacgtc ccctcagaag aagttgtcaa gaaaatgaaa 2640
aattattggc ggcagctgct gaacgccaaa ctgatcacac aacggaagtt cgataatctg 2700
actaaggctg aacgaggtgg cctgtctgag ttggataaag ccggcttcat caaaaggcag 2760
cttgttgaga cacgccagat caccaagcac gtggcccaaa ttctcgattc acgcatgaac 2820
accaagtacg atgaaaatga caaactgatt cgagaggtga aagttattac tctgaagtct 2880
aagctggtct cagatttcag aaaggacttt cagttttata aggtgagaga gatcaacaat 2940
taccaccatg cgcatgatgc ctacctgaat gcagtggtag gcactgcact tatcaaaaaa 3000
tatcccaagc ttgaatctga atttgtttac ggagactata aagtgtacga tgttaggaaa 3060
atgatcgcaa agtctgagca ggaaataggc aaggccaccg ctaagtactt cttttacagc 3120
aatattatga attttttcaa gaccgagatt acactggcca atggagagat tcggaagcga 3180
ccacttatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtgt gggacaaggg tagggatttc 3240
gcgacagtcc ggaaggtcct gtccatgccg caggtgaaca tcgttaaaaa gaccgaagta 3300
cagaccggag gcttctccaa ggaaagtatc ctcccgaaaa ggaacagcga caagctgatc 3360
gcacgcaaaa aagattggga ccccaagaaa tacggcggat tcgattctcc tacagtcgct 3420
tacagtgtac tggttgtggc caaagtggag aaagggaagt ctaaaaaact caaaagcgtc 3480
aaggaactgc tgggcatcac aatcatggag cgatcaagct tcgaaaaaaa ccccatcgac 3540
tttctcgagg cgaaaggata taaagaggtc aaaaaagacc tcatcattaa gcttcccaag 3600
tactctctct ttgagcttga aaacggccgg aaacgaatgc tcgctagtgc gggcgagctg 3660
cagaaaggta acgagctggc actgccctct aaatacgtta atttcttgta tctggccagc 3720
cactatgaaa agctcaaagg gtctcccgaa gataatgagc agaagcagct gttcgtggaa 3780
caacacaaac actaccttga tgagatcatc gagcaaataa gcgaattctc caaaagagtg 3840
atcctcgccg acgctaacct cgataaggtg ctttctgctt acaataagca cagggataag 3900
cccatcaggg agcaggcaga aaacattatc cacttgttta ctctgaccaa cttgggcgcg 3960
cctgcagcct tcaagtactt cgacaccacc atagacagaa agcggtacac ctctacaaag 4020
gaggtcctgg acgccacact gattcatcag tcaattacgg ggctctatga aacaagaatc 4080
gacctctctc agctcggtgg agacagcagg gctgacccca agaagaagag gaaggtgtga 4140
<210> 5
<211> 231
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gactctagat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc 60
tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt 120
ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 180
catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta t 231
Claims (9)
1.利用基因组编辑技术构建鳞翅目昆虫雌性不育品系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建Esp基因敲除核酸构建物，其包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：第一sgRNA表达元件和第二sgRNA表达元件；所述的第一sgRNA表达元件包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第一Esp基因靶点和polyA；所述的第二sgRNA表达元件包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第二Esp基因靶点和polyA；
2)将步骤1)所述的Esp基因敲除核酸构建物和可表达Piggybac转座酶的PHA3PIG质粒共转鳞翅目新鲜昆虫卵，孵化，化蛾，得G0代，使G0代自交，获得G1代；和
3)将步骤2)所述的G1代与表达Cas9蛋白的转基因鳞翅目昆虫交配，获得的G2代，即得雌性不育的鳞翅目昆虫。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述的第一Esp基因靶点的核苷酸序列如SEQID NO:1所示，所述的第二Esp基因靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述的Esp基因敲除核酸构建物还包括第一筛选标记基因表达盒。
4.如权利要求3所述方法，其特征在于，所述的第一筛选标记基因是红色荧光蛋白基因。
5.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述的表达Cas9蛋白的转基因鳞翅目昆虫含有Cas9基因表达盒，所述的Cas9基因表达盒包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：Nos启动子，Cas9蛋白编码序列和SV40终止子。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述的表达Cas9蛋白的转基因鳞翅目昆虫还包括第二筛选标记基因表达盒。
7.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述的共转是将所述Esp基因敲除核酸构建物和可表达Piggybac转座酶的PHA3PIG质粒混合后所得的混合液显微注射新鲜昆虫卵。
8.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述的鳞翅目昆虫是家蚕。
9.一种防治鳞翅目害虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：将如权利要求1所述的方法制备而得的雌性不育的鳞翅目昆虫野外放生，通过与野生鳞翅目昆虫交配，使后代减少，降低种群数量。
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