CN112369376B - 一种抗浓核病家蚕的选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗浓核病家蚕的选育方法，F1代：确定Bmnsd‑Z靶点并构建含sgRNA质粒pXL[IE1‑DsRed‑U6‑sgRNA]，导入家蚕体内；F2代：将带有质粒F1代自交，筛选红色荧光个体，获得F2代阳性个体；F3代：F2代与表达Cas9蛋白品系家蚕杂交得到双荧光后代，通过对浓核病抗病能力以及基因组鉴定进行初筛选，确定F3代阳性个体；F4代：F3代自交筛选无荧光个体并再次进行基因组和抗病能力的鉴定，确定具有抗浓核病能力无荧光的目标品系；F5代：F4代中选出的目标品系与Js品种进行杂交，将抗性基因导入受体品种中培育。培育得到对浓核病具有抗性且可以用于生产的家蚕。
Description
技术领域
本发明涉及家蚕抗病品系品种选育，特别涉及一种抗浓核病家蚕的选育方法。
背景技术
家蚕是一种具有代表性的鳞翅目昆虫，被广泛用作研究生物学模型。在传统的丝绸纺织业中，家蚕拥有产丝优质，生命周期短，易繁殖等特点。蚕桑目前仍是许多农村地区的支柱产业之一，但由于蚕病严重威胁蚕业生产，每年都会造成的占蚕业总产量的20％经济损失，其中包括细菌、真菌、和病毒病，浓核病便是其中之一。
浓核病是近年来影响蚕桑生产的主要病害之一，家蚕经口感染浓核病后潜伏期通常在7天左右，主要病症是染病蚕体肌肉松弛，发育较为缓慢且体型瘦小，饷食后几乎不生长，蚕体差异大小显著。主要表现为空头，染病重的家蚕不食用桑叶，爬向蚕座四周，头胸部向后倾倒，消化道内几乎没有桑叶碎片，只有半透明的消化液，直至死亡。
多年研究表明，不同的家蚕品系对浓核病的抗病能力差异显著，关于家蚕抗浓核病能力的研究主要集中在抗病基因以及抗病机制分子水平的研究上-用存活率的高低或者生长发育大小来评价，适合大量基础性研究，不涉及家蚕的茧丝产量以及经济性状的问题。但是在实际生产中，家蚕茧丝量的多少才是至关重要的。茧丝是蚕桑行业产量和质量效益的主要决定因素，因此培育具有抗性且茧丝性状良好的品种对于稳定生产具有重要作用。另外，传统常规性育种方法可以有效的抵制病毒对家蚕的伤害，但由于传统方法成效缓慢，培育周期较长，工作量极大限制了其育种的效率，基因编辑技术则是目前更为快速的抗病技术。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供一种抗浓核病家蚕的选育方法。该方法通过基因编辑的技术改变家蚕体内抗病机制，明确各代性状筛选标准，以选育出在综合性状方面既具有高抗病力又经济性状良好的家蚕品种。具体是利用CRISPR/Cas9技术敲除靶标基因获得基因突变体，从而培育出新的抗病突变品系。
技术方案：本发明提供一种抗浓核病家蚕的选育方法，包括如下步骤：
(1)F1代：确定Bmnsd-Z靶点并且构建质粒pXL[IE1-DsRed-U6-Bmnsd-Z-sgRNA]，图谱见图2，利用基因编辑技术通过显微注射技术将构建好的质粒导入家蚕体内得到注射品系；
(2)F2代：将带有sgRNA的红色荧光F1代进行自交，筛选红色荧光个体，获得F2代阳性个体；
(3)F3代：F2代与转基因Cas9品系杂交得到的家蚕通过荧光筛选以及基因组的鉴定进行对浓核病抗病能力的初筛选，得到抗病初品系；
(4)F4代：将F3代中对浓核病具有抵抗能力的家蚕进行自交，筛选没有荧光的个体并再次进行基因组以及抗病能力的鉴定，确定具有抗浓核病能力无荧光的目标品系；
(5)F5代：对F4代中选出的目标品系与家蚕品种进行杂交，将抗性基因导入受体品种中，育成对浓核病具有高抵抗性的家蚕新品系并组配成新品种。
进一步地，根据数据库，查找基因的CDS序列和基因组序列，比对各个基因CDS序列和基因组序列，分析出内含子与外显子部分，再根据CRISPR/Cas9靶点的设计5’-GGNN18NGG-3’，利用软件对Bmnsd-Z基因的ORF区域进行特异性靶点的设计；
以载体pXL[IE1-DsRed]为初始质粒，通过同源重组将特异性sgRNA表达框克隆至初始质粒获得目的质粒pXL[IE1-DsRed-U6-Bmnsd-Z-sgRNA]，pXL[IE1-DsRed-U6-Bmnsd-Z-sgRNA]质粒含有由IE1启动表达红色荧光报告基因DsRed蛋白基因，sgRNA由U6启动子启动表达。将目的质粒、辅助质粒helDer质粒混合起来。收集产下的家蚕受精卵，注入家蚕胚胎，恒温培养至成虫，为F1代。
进一步地，步骤(3)的中的初筛选标准为：含有红色、绿色荧光且基因组水平上基因实现了敲除，在自然条件下对0.1％浓度的BmDNV具有抗病能力的个体。
进一步地，步骤(4)的筛选标准为：基因组水平上基因实现了敲除的个体的无荧光个体，在自然条件下对0.1％浓度的BmDNV具有抗病能力的个体。
进一步地，步骤(5)家蚕新品系筛选标准为：在自然条件下对0.1％浓度的BmDNV具有抗病能力的个体，且具有茧丝性状。
进一步地，步骤(5)与Js品种进行杂交。
有益效果：本发明利用CRISPR/Cas9技术敲除靶标基因获得基因突变体，从而培育出新的抗病品系，同时利用分子标记辅助选择进行品种选育，分子辅助标记在杂交和回交中追踪特定基因的流向，选育出既具有高抗病力又经济性状良好的家蚕品种。
附图说明
图1为Bmnsd基因图谱(包括14个外显子)，其中，敏感品系NO.908中Bmnsd基因完整；抗性品系J150中该基因有一段序列的缺失；
图2为sgRNA设计靶点图，其中绿色基因序列为sgRNA序列(5’-GCTGTGACCTTACCAGGTGCCGG-3’)；红色基因序列为PAM序列(5’-CGG-3’)；
图3为构建CRISPR/Cas9系统质粒图谱；
图4为F3代中的荧光检测图，WT：野生型；Dual：检测到的双荧光个体；
图5为F3代中双荧光个体基因组检测，M：DL2000DNA Marker；1-6：F3代中的双荧光个体；7：野生型Nistari对照组；
图6为家蚕Bmnsd-Z敲除体后代中双荧光个体的基因突变情况，WT：野生型；1-3：双荧光个体的敲除情况；括号中代表了敲除片段的大小，绿色为sgRNA所在位置(5’-GCTGTGACCTTACCAGGTGCCGG-3’)，红色为PAM区域(5’-CGG-3’)；
图7为BmDNV侵染家蚕后感病情况，WT：野生型(感病品系)，nsd-Z(ko)：基因敲除品系(抗病品系)；
图8为对照组野生型与敲除体家蚕的生长表型统计；
图9为对照组野生型与敲除体家蚕的全茧量统计；
图10为F4代家蚕与F5代的生长表型(茧层率、全茧量)统计，F5代：Js*nsd；F4代：nsd，F5代全茧量与茧层率明显高于F4代敲除品系；
图11为质粒pXL[IE1-DsRed-U6-Bmnsd-Z-sgRNA]的图谱。
具体实施方式
家蚕对浓核病毒的抗性由家蚕基因控制，抗病家蚕的抗性是由单个基因Bmnsd-Z决定的，病毒抗性是由仅在中肠中表达的编码跨膜蛋白(一种氨基酸转运蛋白家族的成员)的基因的ORF中的6KB缺失引起的(图1)。
本实施例采用针对抗病基因Bmnsd-Z进行基因编辑技术从而达到品种选育的目的，利用CRISPR/Cas9技术敲除靶标基因获得突变体，从而培育出新的抗病突变品系。同时，利用分子标记在杂交和回交中追踪特定基因的流向，从而获得优良品种。
根据SilkDB(http：silkworm.Genomics.org.cn)数据库，查找基因的CDS序列和基因组序列，通过NCBI网站在线的Nucleotide Blast程序(http：blast.ncbi.nlm.nih.gov.Blast.Cgi)比对各个基因CDS序列和基因组序列，分析出内含子与外显子部分(图1)。再根据CRISPR/Cas9靶点的设计原5’-NN20NGG-3’，利用在线软件CRISPR direct(http：//crispr.dbcls.jp/)对Bmnsd-Z基因的ORF区域进行特异性靶点的设计(图2)。
构建载体：pXL[IE1-DsRed-U6-Bmnsd-Z-sgRNA]。以载体pXL[IE1-DsRed]为初始质粒，通过同源重组将特异性sgRNA表达框克隆至初始质粒获得目的载体pXL[IE1-DsRed-U6-Bmnsd-Z-sgRNA](图3)。pXL[IE1-DsRed-U6-Bmnsd-Z-sgRNA]质粒含有由IE1启动表达红色荧光报告基因DsRed蛋白基因，sgRNA由U6启动子启动表达。将pXL质粒(终浓度为400ng/μL)、辅助质粒helper(终浓度为400ng/μL)均匀混合起来。收集产下的家蚕受精卵，用超纯水冲洗干净，将其放在载玻片上胶水固定，然后将混合液通过Eppendorf显微注射仪注入家蚕胚胎。注射完成后用少量的速干胶封住注射孔，随后将注射之后的蚕卵放置在25℃培养箱中恒温培养，10-12天后孵化出蚁蚕，收集蚁蚕并统计孵化率。将蚁蚕饲养至成虫，此代称为F1代。
F2代：将带有sgRNA质粒的F1代进行自交，筛选红色荧光个体，获得F2代阳性个体。
显微注射之后得到F1代通过自交得到F2代，共计20个蛾圈，使用荧光显微镜对F2代幼虫筛选表达红色荧光蛋白的sgRNA个体，从20个蛾圈中筛选得到5个阳性蛾圈。获得的品系能够正常的生长发育，说明外源基因的插入没有对家蚕本身的生长发育产生不良影响。
F3代：F2代与转基因Cas9品系杂交得到的家蚕通过荧光晒选以及基因组的鉴定进行对浓核病抗病能力的初筛选。
将红色荧光的F2代和Cas9品系进行杂交，Cas9品系中表达pBac[IE1-EGFP-nos-Cas9](nos-Cas9)质粒。Nos-Cas9质粒含有由IE1启动表达绿色荧光报告基因EGFP基因，并且Cas9蛋白由nos启动表达。筛选双荧光个体，即带有红色荧光和绿色荧光的双阳性个体(图4)。
为了确定CRISPR/Cas9是否对Bmnsd-Z基因成功敲除，对突变体的敲除位点进行验证。本研究从F3代双荧光品系中随机选取6头进行靶点验证，对突变体家蚕基因组进行提取，在sgRNA的上下游300+bp设计特异性引物对其进行扩增，比较测序结果发现在靶点周围发生了几个-几百个碱基的缺失，最短有3bp的缺失，最多有319bp的缺失(图5、6)。这种基因组上外显子以及内含子上碱基大量的缺失导致该基因功能的丧失。这一结果显示CRISPR/Cas9可以诱导该基因碱基的突变并且具有高效的敲除效率，最终导致基因功能的缺失。双荧光个体且基因水平上Bmnsd-Z基因有缺失的即为F3代。在此基础上，对F3进行抗病能力验证，结果表明：突变品系对0.1％浓度的BmDNV具有抗性(图7)。
F4代：将F3代中对浓核病具有抵抗能力的家蚕进行自交，筛选无荧光个体并再次进行基因组以及抗病能力的鉴定，确定具有抗浓核病能力无荧光的目标个体。
为了确定Bmnsd-Z基因的敲除后，BmDNV侵染是否会影响家蚕经济性状，对其从5龄起蚕到熟蚕每天的体重进行调查。在相同且适宜的环境下，对敲除Bmnsd-Z基因的家蚕F4代进行0.1％的浓度的BmDNV浓核病病毒添毒和不添毒处理。观察两组家蚕的生长情况，发现家蚕均未发病且发育正常，能够正常吐丝并结茧。数据显示，与对照组相比实验组的生长发育状况并无明显差别，体重无区别。对两组家蚕的茧质性状进行了调查，数据表明全茧量与茧层量无显著性差异，说明该基因的敲除后，BmDNV的侵染对敲除体家蚕不会对其生长发育和生理代谢产生影响。图8、9为F4代的全茧量。
F5代：对F4代中选出的目标株系与具备优良经济性状-家蚕Js品种进行杂交，育成对浓核病具有高抵抗性的家蚕新品系并组配成优质、高产新品种。
Js品系是高茧重经济性状优良的家蚕品系，将抗病品种与其杂交，抗性基因导入受体品种中，进行基因组的鉴定挑选出优良品系。对新品系F5代Js*nsd进行茧质调查，结果表明新品系的全茧量和茧层率明显高于F4代(图10)。
综上所述，本发明利用基因编辑技术的选育方法，采用分子辅助标记育种的方法，对家蚕进行连续5代的选择育种，通过不同世代特定的选育法与选育性状的组合，以得到抗病与稳定高产协调统一，贴合实际农业生产需要，并且在综合性状方面均表现优良的基础上全育期抗浓核病力强、营养经济性状优良的家蚕新品种。
Claims (4)
1.一种抗浓核病家蚕的选育方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）F1代：确定Bmnsd-Z靶点并且构建质粒pXL-IE1- DsRed -U6-Bmnsd-Z- sgRNA，通过显微注射技术将构建好的质粒导入家蚕体内得到注射品系；
（2）F2代：将带有sgRNA质粒的F1代进行自交，筛选红色荧光个体，获得F2代阳性个体；
（3）F3代：F2代与表达Cas9蛋白家蚕品系杂交得到的家蚕，通过荧光筛选以及基因组的鉴定同时进行浓核病抗病能力的初筛选，确定抗病初品系F3代；
（4）F4代：将F3代中家蚕进行自交，筛选无荧光个体并再次进行基因组以及抗病能力的鉴定，确定具有抗浓核病能力无荧光的目标品系即F4代；
（5）F5代：对F4代中选出的目标品系与家蚕Js品种进行杂交，将抗性基因导入受体品种中，育成对浓核病具有高抵抗性且性状优良的家蚕新品系并组配成新品种；
步骤（1）的方法如下：根据数据库，查找基因的CDS序列和基因组序列，比对基因CDS序列和基因组序列，分析出内含子与外显子部分，再根据CRISPR/Cas9靶点的设计原则5’-NN20NGG-3’，利用软件对Bmnsd-Z基因的ORF区域进行特异性靶点的设计；
以载体pXL-IE1-DsRed为初始质粒，通过同源重组将特异性sgRNA表达框克隆至初始质粒获得目的质粒pXL-IE1-DsRed-U6-Bmnsd-Z-sgRNA，
质粒pXL-IE1-DsRed -U6-Bmnsd-Z-sgRNA含有由IE1启动表达红色荧光报告基因DsRed蛋白基因，sgRNA由U6启动子启动表达，将目的质粒、辅助质粒helper质粒混合起来显微注射至家蚕胚胎，恒温培养至成虫，为F1代。
2.据权利要求1所述的抗浓核病家蚕的选育方法，其特征在于：步骤（3）的中的初筛选标准为：含有红色、绿色荧光且基因组水平上基因实现了敲除，在自然条件下对0.1%浓度的BmDNV具有抗病能力的个体。
3.据权利要求1所述的抗浓核病家蚕的选育方法，其特征在于：步骤（4）的筛选标准为：基因组水平上基因实现了敲除的个体的无荧光个体，在自然条件下对0.1%浓度的BmDNV具有抗病能力的个体。
4.据权 利要求1所述的抗浓核病家蚕的选育方法，其特征在于：步骤（5）中与Js品种进行杂交，在自然条件下对0.1%浓度的BmDNV具有抗病能力的个体，且茧丝经济性状优良的个体。
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