CN104769114A

CN104769114A - Rhg1介导的对大豆胞囊线虫的抗性

Info

Publication number: CN104769114A
Application number: CN201380037226.2A
Authority: CN
Inventors: A·F·本特; M·赫德森; B·迪尔斯; S·梅利托; D·E·库克; T·休斯; A·贝利斯; J·王; T·G·李; X·郭
Original assignee: University of Illinois; Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: University of Illinois; Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 2012-05-11
Filing date: 2013-05-13
Publication date: 2015-07-08
Also published as: US20130305410A1; WO2013170258A2; US20180112230A1; CA2894841A1; US20220064664A1; US10808260B2; CA2894841C; WO2013170258A3; BR112014029020A2; US10995342B2

Abstract

在本文提供增加植物特别是大豆对线虫特别是大豆胞囊线虫抗性的方法。所述方法包括在植物细胞以及特别是植物根细胞中增加Glyma18g02580、Glyma18g02590和/或Glyma18g02610的表达以增加植物和植物细胞对线虫的抗性。所述方法包括使用组成型启动子或通过增加多核苷酸的拷贝数来增加表达。本发明还提供表达这些多肽的构建体、转基因细胞、转基因植物和产生其的方法。本发明还提供筛选植物细胞对线虫抗性或易感性的方法。

Description

RHG1介导的对大豆胞囊线虫的抗性

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年5月11日提交的美国临时专利申请61/646,017、2012年7月27日提交的美国临时专利申请61/676,854、以及2013年3月15日提交的美国实用新型申请13/843,447的优先权，以上专利以其整体引用并入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明是在由USDA/NIFA授予的资助号06-CRHF-0-6055和10-CRHF-0-6055的政府支持下完成。政府对本发明具有一定的权利。

序列表

本申请附有附序列表，其以整体并入本文。序列表以text文件与本申请一起在2013年5月13日提交。

背景技术

大豆胞囊线虫(SCN)目前是在大多数年份对美国大豆产量造成经济损坏最严重的疾病。估算表明，每年在美国SCN导致超过7亿美元的大豆产量减少。在其它国家，如巴西，阿根廷和中国，SCN也严重影响大豆产量。已经鉴定出具有增加的SCN抗性的大豆品种，但抗性是定量的并且其功效取决于线虫基因型，因此使用具有更强抗性的品种仍可能导致由SCN造成的大豆产量损失。

对SCN抗性的遗传基础已经被部分定义至遗传基因座水平，大豆基因座Rhg1的合适来源对SCN抗性有实质性贡献。在本工作之前，控制Rhg1介导的SCN抗性的特异基因和基因产物尚未得到成功记录。

发明内容

在本文中提供增加植物对线虫抗性，特别是增加大豆对SCN抗性的方法。鉴定了来自rhg1-b基因座的若干基因产物，并证明了在大豆中所述基因产物与SCN抗性的关系。这些基因和基因产物也可以增加其他植物的抗性，包括但不限于，糖甜菜、土豆、玉米、豌豆、或菜豆(bean)对于线虫，特别是胞囊线虫的抗性。

在一个方面中，本发明提供通过增加多核苷酸的表达、或改变多核苷酸的表达模式或增加多核苷酸的拷贝数增加植物对线虫(合适地胞囊形成线虫、合适地SCN)抗性的方法，所述多核苷酸在所述植物的细胞中编码Glyma18g02580多肽、Glyma18g02590多肽、Glyma18g02610多肽、与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:3具有90％或更多同一性的多肽、或任何前述多肽的同源物或功能变体。本发明还涉及所述多肽的组合的用途。编码这些多肽序列的多核苷酸可源自Williams 82、PI88788或Peking(PI548402)大豆品种或所述多核苷酸的其它来源。提供所述多肽序列，并注意到在不同品种中序列之间的多态性。在植物细胞中增加的多核苷酸表达增加了植物对线虫的抗性。合适地，在植物根细胞中增加表达。合适地，增加所述多核苷酸中的至少两个的表达。合适地，增加多核苷酸中的全部三个的表达。

在另一个方面，本发明提供通过改变(增加或减少)植物根细胞中多肽的表达增加植物对线虫(合适地胞囊形成线虫、合适地SCN)抗性的方法，所述多肽与Glyma18g02580的SEQ ID NO:1、Glyma18g02590的SEQ ID NO:2、5或6或Glyma18g02610的SEQ ID NO:3的至少一部分相同或相似，所述改变是相对于在植物根细胞中其表达被用作对照的多肽(如，Glyma11g35820)表达来进行。合适地，增加所述多肽中的至少两个的表达。合适地，增加所述多肽中的全部三个表达。可选择地或此外，也可增加编码Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580多肽的多核苷酸表达。

在另一个方面，本发明提供通过鉴定在植物根细胞中显示改变的(增加或减少)多肽表达的植物鉴定显示有用水平的对线虫(合适地胞囊形成线虫，合适地SCN)抗性的植物的方法，所述多肽与Glyma18g02580的SEQ ID NO:1、Glyma18g02590的SEQ ID NO:2、5或6或Glyma18g02610的SEQ ID NO:3的至少一部分相同或相似，所述改变是相对于在植物根细胞中其表达被用作对照的多肽(例如，Glyma11g35820)表达而言。合适地，所述多肽中的至少两个的表达水平比对SCN更加易感的植物中的水平高。合适地，所述多肽中的全部三个的表达水平更高。可选择地或此外，编码Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580多肽的多核苷酸表达也可在更高水平。

在另一个方面，本发明提供一种构建体，所述构建体包含与多核苷酸可操作连接的启动子，所述多核苷酸编码含有SEQ ID NO:1的Glyma18g02580多肽，含有SEQ ID NO:2、5或6的Glyma18g02590多肽、含有SEQ ID NO:3的Glyma18g02610多肽的至少部分，或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的多肽，或任何前述多肽的同源物或功能部分、或其组合。所述构建体可用于生成转基因植物或种子。

在又一个方面，本发明提供一种包含外源或非固有多核苷酸的转基因植物，所述多核苷酸编码含有SEQ ID NO:1的Glyma18g02580多肽，含有SEQ ID NO:2、5或6的Glyma18g02590多肽、含有SEQ ID NO:4的Glyma18g02600多肽、含有SEQ ID NO:3的Glyma18g02610多肽的至少部分、或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的多肽、任何前述多肽的同源物或功能部分或其组合、或者如本文所述的来自PI88788或Peking来源的多肽。所述转基因植物对线虫、合适地胞囊形成线虫、合适地SCN具有增加的抗性。合适地，所述转基因植物包含至少一个多核苷酸，其编码至少两个或至少三个编码Glyma18g02580、Glyma18g02590和Glyma18g02610多肽的多核苷酸。

在另一个方面，本发明提供一种包含编码能够增强对线虫(合适地胞囊形成线虫，合适地SCN)抗性的多肽的多核苷酸的转基因细胞。所述多肽包括与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或与源自PI88788(例如，SEQ ID NO:5)或Peking来源(例如，SEQ ID NO:6)的相似序列具有至少90％同一性的多肽的至少部分、或其组合。合适的，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3具有至少90％同一性的多肽中的至少两个或三个。

在另一个方面，本发明提供一种通过引入外源多核苷酸来生成转基因植物的方法，所述外源多核苷酸编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的Glyma18g02580多肽、与SEQ ID NO:2、5或6具有至少90％同一性的Glyma18g02590多肽、或者与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的Glyma18g02610多肽的至少部分、或其同源物或组合。所述转基因植物在植物根细胞中具有增加的Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580表达。所述转基因植物与对照植物相比具有对线虫(合适地胞囊形成线虫，合适地SCN)增加的抗性。合适地，所述转基因植物具有编码Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580多肽的多核苷酸中的至少两个或全部三个的增加的表达。

在另一个方面，本发明提供鉴定分子的方法，所述分子与Rhg1基因座、Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580RNA转录本、或者Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580多肽相互作用。所述方法包括检测能够结合Rhg1基因座、Glyma18g02610、Glyma18g02590或Glyma18g02580RNA转录本、或者Glyma18g02610、Glyma18g02590或Glyma18g02580多肽的分子。

在另一个方面，本发明提供鉴定植物对胞囊线虫抗性或易感性表型的方法。所述方法包括检测在第一植物细胞中与胞囊线虫抗性或易感性相关的遗传标志物，以及将第一植物细胞中的遗传标志物与已知抗性或易感性表型的第二植物细胞中的遗传标志物或与对照植物细胞中的遗传标志物进行比较。所述遗传标志物可以是序列变异、甲基化差异、mRNA表达差异、小RNA产生或其它本文所鉴定的差异。合适地，所述遗传标志物与Rhg-1基因座表征相关，例如本文所报告的那些。合适地，所述遗传标志物是Glyma18g02600、Glyma18g02610、Glyma18g02590或Glyma18g02580的至少一个的基因组拷贝数。合适地，所述植物是大豆以及所述线虫是SCN。

在另一个方面，本发明提供增加植物对线虫抗性的方法，所述方法包括在细胞中表达多核苷酸，所述多核苷酸编码Glyma18g02610多肽、Glyma18g02590多肽、或Glyma18g02580多肽、与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:3具有90％或更多同一性的多肽、或任何前述多肽的同源物或功能变体或组合。合适地，所述多核苷酸编码Glyma18g02610、Glyma18g02590或Glyma18g02580多肽中的至少两个或全部三个。然后，所述多肽或编码所述多肽的细胞可以应用到所述植物、植物种子、或种子可被种植的土壤。所述应用增加了所述植物对线虫的抗性。

附图说明

图1是SCN生命周期的图形描述。

图2是使用人工microRNA序列靶向目的基因的一个基因沉默策略的图形描述。

图3显示在rhg1-b有三个基因有助于SCN抗性。图3A是显示代表性的SCN感染的根；使用酸性品红染色根微管束和线虫。在SCN-抗性的根中更少的线虫从J2进展到J3、J4、成年雄性或充满卵的成年雌性(胞囊)阶段。图3B是图：其表明相对于Williams 82(SCN-易感型)和未沉默的Fayette(SCN-抗性)对照，具有指定基因沉默的大豆品种Fayette的转基因根中发育超越J2阶段的SCN。平均值±平均值的标准误。*：Fayette(沉默的)显著不同于Fayette(未沉默的)基于ANOVAP<0.05。EV：使用空载体转化的。

图4是一组图，其表明线虫发育受沉默水平影响。图4A和4C表明在Williams82和转化了空载体(EV)的Fayette根中、或转化了沉默构建体(2580RNAi或ami2590)的Fayette中线虫发育依赖于沉默水平。具有减少的靶转录本丰度的转基因根(+)显示的线虫发育类似Williams 82(SCN-易感)，而具有未沉默转录本水平的转基因根(-)具有类似Fayette(SCN-抗性)的线虫发育。图4B和4D分别表明由qPCR测量的来自(A)或(C)的根中的靶基因的转录本丰度。SKP16转录本作为参考，并归一化到Fayette-EV。图4B和4D的结果被用来将根放入“良好沉默”(+)或“不良沉默”(-)分类中，如在图4A和4C中所示。图4A和4B是Glyma18g02580。图4C和4D是Glyma18g02610。条形代表平均值±平均值的标准误。

图5表明提高编码基因表达的31.2kb重复存在于Rhg1基因座的SCN-抗性单倍型中。图5A是Williams 82的Rhg1基因座(上)，和来自rhg1-b单倍型的5个福斯质粒插入的示意图。大豆参考基因组的DNA序列显示两个指定位置。数字和区块图标指大豆基因(如，Glyma18g02540)。福斯质粒#3、4和5携带跨重复接合处的rhg1-b基因组段。图5B显示了来自四种不同来源的SCN抗性的Rhg1重复接合处序列(与在(图5A)中的参考基因组序列相比)。图5C显示对应于图5A中以绿色显示的参考基因组区的全基因组鸟枪测序读数数目的图，所述读数数目比18号染色体上rhg1-b相邻的基因组区、或11和2号染色体的Rhg1-同源基因座大10倍。图5D是显示在31kb重复区编码的基因转录本丰度的图，其在来自SCN-抗性大豆品种的根中比SCN-易感品种大得多。显示对于qPCR的平均值±平均值标准误；Glyma18g02600的结果在检测限中。

图6显示在广泛使用的大豆品系中Rhg1拷贝数变化的Fiber-FISH检测。图6A是示意图，显示分离自单个PI88788(rhg1-b)基因组DNA福斯质粒克隆的两个相邻探针，其插入物跨越重复接合区产生25.2kb探针(绿色标记)和相邻的9.7kb的探针(红色标记)。用于绿色标记和红色标记的Fiber-FISH探针的DNA以相应的Williams 82序列区示出。用于绿色探针的来自rhg1-b单倍型的25.2kb的片段是跨越重复接合区的单一连续DNA片段。图6B显示每种基因型的四个Fiber-FISH影像(四种DNA纤维)和探针图的组合物。在单基因组DNA纤维上红色和绿色杂交的交替模式表明分别在SCN-抗性Fayette(源自PI88788的rhg1-b)和Peking(PI548402)的Rhg1基因座上的31kb区块的10个和3个直接重复拷贝，以及在SCN-易感Williams 82中的每个Rhg1单倍型的一个拷贝。白条＝10μm，其对应于使用3.21kb/μm转换率的约32kb。

图7显示多个SCN-抗性品种包含指示Rhg1基因座中重复的DNA接合处，并表现出完全在此重复内编码的基因的升高表达。图7A是在图7B中所用的PCR引物的示意图(也参见图5)。图7B是凝胶照片，显示使用在图7A所示的向外定向寡核苷酸引物的PCR的结果，其匹配在一些大豆品种中重复的Rhg1基因座的31kb段外边缘的序列。R表示SCN-抗性，S表示SCN-易感大豆品种。对于引物81和82参见表4。图7C显示来自11个SCN-抗性品种的DNA序列，并揭示对于指示共有起源的重复接合处相同的序列。红条表示重复接合处(也参见图5)。图7D显示对于在Rhg1编码的基因(归一化到SKP16)的转录本丰度的图，揭示了完全在来自PI88788或Peking来源的Rhg1重复中编码的基因表达相对于在SCN-易感性品种中相同基因表达升高。条形代表平均值±平均值标准误。Glyma18g02600表示在SKP16的0.01％(CT>35个循环)之下。图7E是使用从Fayette和Forrest(SCN抗性)和Williams 82(SCN易感性)整株植物的根部收集的RNA对于Glyma18g02570进行的RNA印迹分析。*表示对应Glyma18g02570的预期转录本尺寸(1.2kb)的条带。在1.8kb的带对应于非特异核糖体结合。栽培品种Fayette和Forrest(包含31kb DNA段的重复)显示与Williams 82(包含31KB DNA段的单一拷贝)相同的条带模式；在Fayette和Forrest中没有检测到对于Glyma18g02570替代的转录本作为重复DNA的结果。来自携带rhg1-b的植物的RACE PCR证实Glyma18g02580、-2590和-2610的全长转录本(具有在参考基因组中注释的转录本末端)。

图8是显示在Rhg1重复之内和之外的基因进行qPCR的图。从生长在皿(pot)中出现5天后的3个个体植物根中收集RNA。深灰色条是基于gDNA qPCR和cDNA测序估计的高拷贝数的品系。浅灰色条是含有低拷贝数的品系，对于完全抗性也需要Rhg4。

图9包含实施例凝胶照片和概括许多实验的表格，其表明抗性和易感性栽培品种在复制区域的基因中和与之相邻处具有不同的DNA甲基化，尤其是在启动子区。在McrBC实验中，甲基化的基因组DNA是通过McrBC切割，这减少了PCR产物的丰度，而在HpaII的实验中甲基化的基因组DNA不被HpaII切割，然而非甲基化DNA被切割导致PCR产物丰度降低。

图10是Western印迹的照片，其表明在转基因根中引入多核苷酸所产生的表位标记版本的Glyma18g02610蛋白质，在Williams 82和Fayette转基因根中均表达，且产物尺寸类似。

图11A是显示对于在易感性和抗性根中在Rhg1基因座中的基因进行定量PCR基因表达分析的图，其表明这些基因中的一些不仅在抗性栽培品种中更高表达(如在图11中所示)，而且也在接种SCN后显示出一些上调。

图11B是显示在茉莉酸甲酯或水处理之后进行定量PCR基因表达分析的图，其揭示了Glyma18g02610在响应升高水平的茉莉酸甲酯时表达更高。

图12是一组照片，显示在Fayette毛状根中的启动子GUS表达的组织化学染色：有线虫接种(B、D、F和H)或无(A、C、E和G)线虫接种。A和B显示Glyma18g02580。C和D显示Glyma18g02590。E和F显示Glyma18g02610。G和H显示Glyma14g06080。

图13提供来自所示品种的Glyma18g2590的核苷酸序列和氨基酸序列。

图14是计算机生成的Glyma18g2590三维结构的示意图，显示品种之间在结构中的多态性。

图15是图，其显示通过多基因的同时过表达而不是来自31kb rhg1-b重复的单独基因的过表达所赋予的升高的SCN抗性。报道了过表达指定的单个基因，或过表达31kb重复内编码的全部基因(Glyma18g02580、-2590、-2600和-2610)的转基因大豆根(品种Williams 82)相对于Williams 82(SCN-易感)和Fayette(SCN-抗性)对照，SCN发育超过J2阶段。对于转化有空载体的根(EV)或转化有基因过表达构建体的根(OX)的平均值±平均值标准误。*：Williams 82-OX显著不同于Williams 82–Ev，基于ANOVA p<0.05。

图16是一组图，其显示在Williams 82中表达固有Fayette Glyma18g02590等位基因并不改变SCN发育。图16A是图，其表明在表达空载体(EV)的Williams82的转基因根中或者在Fayette Glyma18g02590启动子序列(2590_FayP::2590_Fay)的控制下表达Glyma18g02590的Fayette(rhg1-b型)等位基因的Williams 82的转基因根中显示相似的线虫发育。使用二者任一的构建体转化的Williams 82与Fayette-EV相比允许更大比例的线虫发育超越J2阶段。图16B是图，其显示通过qPCR测量的在来自图16A的根中对于Glyma18g02590的转录本丰度。SKP16转录本用作参考；数据归一化到Williams 82-EV。在图16A和16B中的条表示平均值±平均值的标准误。

图17是显示qPCR的图，其揭示使用图15的多基因同时过表达的构建体转化的根中预期基因的转录本丰度，PR-1表达不显著升高。转基因根或者携带多基因构建体(OX)或携带空载体(EV)。在第二个独立试验中使用不同转基因事件得到类似结果，除了在第二个实验中在Williams 82-EV、Fayette-EV和Williams-OX根之间PR-1丰度更加相似(接近1.0)。条形代表平均值±平均值标准误。对于Williams-EV和Fayette-EV的Glyma18g02600数据不太可靠，因为其qPCR的信号在准确qPCR检测(CT>33)的界线上。

图18是一组图，其显示Glyma18g2580、Glyma18g2590和Glyma18g2610组合的过表达可赋予易感性Williams 82品种以抗性。

具体实施方式

在本文提供鉴定植物对胞囊线虫(如大豆胞囊线虫(SCN))抗性或易感性的方法、评估植物对线虫(如SCN)的抗性或易感性水平的方法、增加植物或植物细胞对胞囊线虫抗性的方法以及产生转基因植物材料，包括转基因细胞和植物的方法。此外，包括编码本文所述的Rhg1多肽的多核苷酸或其同源物或变体的构建体在本文中作为SEQ ID NO:1-6提供。在本文中提供对胞囊线虫特别是SCN具有增强抗性的转基因植物或转基因植物细胞，其携带源自编码SEQ ID NO:1-6的多肽的多核苷酸的编码非固有或外源rhg1的转基因。本发明还公开携带所述多肽的非转基因植物或繁殖的或除此之外，经工程化的以表达升高水平的多肽或编码所述多肽的多核苷酸。

SCN由线虫大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)导致。线虫的生活周期在图1中显示。一旦田地被感染了这种线虫，目前不存在从该田地消除SCN的经济上可行的手段。当前SCN管理往往侧重于轮作以及种植大豆的SCN-抗性品种以控制大豆胞囊线虫种群存在多年，以及使用SCN抗性和/或SCN耐受的大豆以便得到当年作物可接受的产量。从业者根据大豆胞囊线虫种群克服植物SCN抗性的已知来源的能力采用“Race”和“Hg型”术语来描述大豆胞囊线虫种群。存在若干Race和Hg类型，对一种类型线虫有抗性的大豆对另一类型的线虫可能几乎无法或无法提供防护。此外，大豆胞囊线虫是异形杂交的生物体，对于其来说地方种群是遗传异质性(可以引入新的线虫基因型)，因此地方种群可以进行在Race和Hg类型上的转换，因而以前有效的植物SCN抗性可能失去效力。因此，需要识别哪个大豆对哪种大豆胞囊线虫线虫种群有抗性的能力，以及需要遗传工程化大豆植物的能力，使其对多于一种类型的线虫种群具有增加的抗性。

对SCN具有增加抗性的大豆是可获得的并且已被用于杂交育种实验，以产生对SCN具有更强抗性的大豆。大豆rhg1的Peking基因座是先前发现，被安置到18号染色体的区域(原名连锁群G)，在那个基因座上编码携带富含亮氨酸的重复和蛋白激酶结构域(LRR-激酶)的产物的基因被推断解释了对SCN增加的抗性。在携带源自大豆PI88788的rhg1-b基因座的植物中，SCN仍穿入并开始被饲养(feeding)，但并不持续是高百分比的合胞体而是经历线虫发育的全顺序(通过J3和J4阶段从蜕皮到成年、性受精及雌性过渡到胚胎填充和在环境中持久的胞囊)(Li,Chen et al.2004),(Colgrove和Niblack 2008)。所述部分SCN-抗性的分子基础并不清楚。虽然，对每年在美国造成数亿美元经济损失的病原体SCN研究了50年，在本申请的优先权申请之前仍没有克隆大豆SCN抗性基因的确定的公开报告。

在携带Rhg1的PI88788源的植物中完成了所述rhg1基因座(也被称为Rhg1基因座或被其它更受限制的命名如rhg1-b)的进一步精细遗传作图，并且鉴定了与抗性基因型相关的新标志物。参见Kim,M.,D.L.Hyten,A.F.Bent和B.W.Diers,2010.Fine mapping of the SCN resistance locus rhg1-b from PI 88788.Plant Genome3:81-89，以其全文引用并入本文中。选择PI88788是因为它是目前作为SCN抗性销售的许多杂交育种系的抗性来源。这些标志物与对SCN的抗性或易感性紧密相关，并且可用于鉴定或预测大豆育种品系是否可能显示SCN抗性或SCN敏感表型。来自PI88788的rhg1-b基因座的精细作图表明非常接近rhg1-b基因座的LRR激酶基因对SCN抗性表型没有作出显著贡献。Melito等人2010年的研究也没有发现任何证据支持rhg1-b-近端Glyma18g02680LRR激酶在SCN抗性中的作用，该研究使用表达全长转录本或部分沉默转录本表达的构建体的转基因根。Kim等人表明，与PI88788及其衍生物的SCN抗性/易感性表型相关联的rhg1-b遗传组件位于由末端BARCSOYSSR_18_0090和BARCSOYSSR_18_0094限定的染色体间隔内。最近的精细结构遗传作图定义了rhg1-b的间隔(interval)，其对应于携带SCN-易感性Williams 82大豆测序基因组中11个预测基因的67kb间隔(Kim，Hyten等人，2010)。参见图5。

在这里，我们报告了rhg1-b遗传间隔中的多个基因的鉴定和功能测试。在Rhg1基因座内，编码Rhg1基因座内四个鉴定出的基因的染色体片段的多个拷贝(迄今为止调查的品种中10、7或3拷贝)存在于SCN-抗性大豆品种中，而仅有一个拷贝的该段存在于测试的SCN-易感性品种中，所述SCN-易感性品种缺乏源自抗性品种如PI88788、PI437654或Peking的Rhg1等位基因。参见图5和6。使用miRNA沉默多拷贝基因区块内三个基因中的任何一个导致在转基因大豆根中对SCN易感性的增加。在来自之前的SCN-易感性大豆品种的转基因根中，来自多拷贝基因区块的rhg1-b基因中的三个或四个的同时过表达导致增加的SCN抗性。在受测试的SCN-抗性的大豆品种中，该区块内的基因以显著更高的水平表达。当～2kb的这些Glyma18g02590或Glyma18g02610启动子DNA序列在Fayette中整合到不是rhg1-b的基因座时，在Fayette中的反式作用因子也不足以驱动携带这些序列的转基因DNA序列的升高的表达。在Rhg1基因座中的多个位点上的DNA甲基化在SCN-抗性和SCN-易感性品系之间是多态性的，这可能导致与SCN抗性相关的基因表达的差异。此基因座的拷贝数也与Glyma18g2580、Glyma18g2590和Glyma18g2610多肽和mRNAs的表达水平以及对SCN抗性的水平相关。因此，基于增加所述DNA重复区域的拷贝数的定量基因给药(gene dosing)可以是介导多肽表达增加和对SCN抗性增加的关键因素。这些发现的许多部分报告于Cook,D.E.,Lee,T.G.,Guo,X.,Melito,S.,Wang,K.,Bayless,A.,Wang,J.,Hughes,T.J.,Willis,D.K.,Clemente,T.,Diers,B.W.,Hudson,M.E.和Bent,A.F 2012Copy Number Variation of Multiple Genesat Rhg1Mediates Nematode Resistance in Soybean.Science 338:1206-1209和相关在线支持材料(补充材料)见于www.sciencemag.org/content/suppl/2012/10/10/science.1228746.DC1.html，其以全文引用并入本文。

通过将所述植物中的遗传标志物与已知抗性或易感性表型的第二植物中相同的遗传标志物或可选择标志物进行比较可以有价值地准确性预测植物的抗性或易感性。因此，在本文提供筛选对胞囊线虫抗性或易感性的第一植物或植物细胞的方法。所述方法包括在第一植物细胞中检测与胞囊线虫的胞囊线虫抗性或易感性相关的遗传标志物或可选择标志物，并使用所述标志物来预测第一植物或植物细胞对线虫的抗性或易感性。预测并不意味着100％保证植物对胞囊线虫抗性或易感性表型。所述预测步骤可以包括将在第一植物或植物细胞中的标志物与在已知抗性或易感性表型的第二植物或植物细胞中的标志物进行比较。所述第二细胞的标志物表型或基因型预测在第一细胞中的胞囊线虫抗性表型。所述预测可用以选择抗性大豆或抗性植物细胞以便用来生产抗性植物品系。所述植物包括但不限于：糖甜菜、土豆、玉米、豌豆或菜豆。

植物包括植物的任何部分，包括但不限于整体植物、植物的部分如根、叶、茎、种子、荚果、花、细胞、组织或植物种质或其任何后代的部分。种质是指来自源自品系、栽培品种、品种或培养物的个体、或个体组或克隆的遗传材料。植物是指整个植物或其部分，包括但不限于，植物细胞、植物原生质体、植物组织培养细胞或愈伤组织。例如，大豆植物是指整个大豆植物或其部分，包括但不限于：大豆植物细胞、大豆植物原生质、大豆植物组织培养细胞或愈伤组织。植物细胞是指收获自或源自植物或植物组织培养细胞或愈伤组织的任何部分的细胞。

所述rhg1基因座是鉴定为对SCN抗性重要区域的染色体区域。基因座是一个或多个性状决定簇、基因、多态核酸或标志物所定位的染色体区。定量性状基因座(QTL)指的是多态遗传基因座，其中所构成的基因控制定量测量的性状，并包含至少两个等位基因，其有区别地影响在至少一个遗传背景中表型或基因型的表达，其中基因座负责部分而不是全部在评估整体表型性状中观察到的改变。遗传标志物是可用于鉴定一个遗传连锁基因座如QTL的核苷酸序列或氨基酸序列。遗传标志物的实例包括但不限于基于易感性和抗性植物之间基于单核苷酸多态性(SNP)、简单序列重复(SSR或微卫星)、限制性内切酶识别位点的改变、特定基因或靶序列或其它序列的基因组拷贝数的差异。

可使用各种分析方法，包括RFLP、AFLP、序列分析，杂交如等位基因特异性杂交分析，差别PCR或其它方法，例如本领域技术人员已知的那些来检测遗传或可选择的标志物。在实施例表3中提供抗性和易感性大豆之间在Rhg1多基因拷贝区中的单核苷酸多态性的列表。在另一个实施方案中，所述标志物是在抗性品系复制区域中发现的基因或DNA序列中的至少一个的基因组拷贝数或基因组拷贝数的估计值。在又一个实施方案中，标志物是携带如图5和6所示的Glyma18g02610和Glyma18g02570复制区域之间边界的基因组DNA段。选择方法还可包括分析性状、表型多态性或不是由DNA或RNA序列差异所限定的可选择标志物，如在DNA序列甲基化中的差异、或多肽的表达水平或在基因表达水平上的差异。如实施例中所示，与易感性植物相比在抗性植物中大豆SCN抗性Rhg1基因座，特别Glyma18g02610、Glyma18g02590和Glyma18g02580的启动子区域是高度甲基化的。在这些基因内和与之相邻的甲基化差异，例如在基因的启动子和上游区域的甲基化差异，可用于区分抗性和易感性品系。此外，与易感性植物相比抗性植物具有更高的Glyma18g02610、Glyma18g02590和Glyma18g02580mRNA水平。参见图5。因而，检测任何这些基因的基因表达水平的方法，例如通过监测mRNA的丰度，可用在本文所述的方法中。在另一个实施方案中，标志物可以是Glyma18g02610、Glyma18g02590和Glyma18g02580中至少一个的蛋白表达水平。任何这些差异可用作筛选来测试植物或植物细胞是否可能对线虫具有抗性或易感性。

以上描述的标志物与增加的对胞囊线虫抗性或者增加的对胞囊线虫易感性的表型相关联。检测方法可以包括扩增标志物或其部分以产生扩增产物。所述产物的存在可指示标志物或者可测序扩增的产物。也可以通过对限制性内切酶的差别敏感性评估扩增产物。可使用等位基因特异性杂交分析、定量PCR、Northern印迹分析、Western印迹分析或其它方法来检测标志物。如本文所述的检测或评估性状的遗传或表型标志物的方法是本领域技术人员可获得的，在实施例中提供许多这样的方法，并且可以预料，将来可以开发新方法以检测本文所述的Rhg1多态性。例如，标志物可用于检测在繁殖选择过程中多拷贝Rhg1区域的存在或不存在。

关联基因座描述这样的情况：其中遗传标志物和性状是染色体上紧密关联的以使得遗传标志物和性状不独立地分离以及在减数分裂过程中不高频地发生在遗传标志物和性状之间的重组。所述遗传标志物和性状可以独立分离，但一般不分离。例如，性状的遗传标志物可以仅从性状5％的时间中独立分离；合适地，只有5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更少的时间。与产生性状的基因座更紧密关联的遗传标志物将作为更好的标志物，因为它们更少地与独立分离于性状，因为遗传标志物更紧密地与性状关联。直接检测引起目的性状变化的多态性核苷酸位点的遗传标志物因为其在标志物辅助的植物育种中的准确性而特别有用。因此，本文提供的筛选方法，其可以用在传统育种、重组生物学或转基因育种过程或其任何杂种以选择或者筛选抗性品种。

在本文所述方法中，通过将第一大豆中的遗传标志物与已知具有抗性表型的第二大豆的遗传标志物进行比较来鉴别第一大豆的SCN抗性或易感性表型。第二大豆可以是已知的具有对SCN的抗性。因此，与第二大豆具有相同遗传标志物的第一大豆很可能具有对SCN抗性。抗性大豆是本领域已知的，包括但不限于：PI88788、Peking、Hartwig、Fayette、Forrest、LD02-5320、LD02-5025、和LD01-7323或携带以下基因座的品系，所述基因座对如在表2中提供的那些栽培品种作出贡献或源自这些栽培品种。具体地，所述方法允许鉴定对Race 3SCN和其它线虫种群具有增强抗性的大豆植物，类似PI88788。或者，第二大豆可以是已知对SCN易感的。因此，与第二大豆具有相同遗传标志物的第一大豆很可能是对SCN易感的。易感性的大豆是本领域已知的，包括但不限于，‘Williams 82’,Essex,Thorne,Sturdy,LG03-1672以及LG00-3372或携带以下基因座的品系，所述基因座对如在表2中提供的那些栽培之一品种作出贡献或源自这些栽培品种之一。具体地，所述方法允许鉴定类似于‘Williams 82’的对SCN具有易感性的大豆植物。虽然对SCN抗性被广泛观察到为定量的性状，如在前面段落中所使用的术语易感性和抗性指定性的性状，这样鉴定为抗性大豆表示该大豆和与之相比较的易感性大豆品系相比是抗性更强的。同样地，鉴定为易感性大豆的大豆表示该大豆和与之相比较的抗性大豆品系相比是敏感性更强的。

可以以各种方式测量对SCN的抗性(或易感性)，其中一些是本领域技术人员已知的。在实施例中，大豆根进行了实验接种SCN，相比于易感性和/或抗性的对照植物对所述根中线虫到成熟(蜕皮并继续进展超过J2发育阶段)的能力进行了评价。在实施例中还描述SCN温室试验，并且其提供了植物中胞囊数量的指示并报告为雌虫指数。对线虫增加的抗性也可以表现为相对于具体线虫种群或基因型在抗性功效上的改变。另外但不排它，生长在SCN感染田地中的SCN-易感性大豆与可比较的SCN-抗性大豆相比将有显著减少的作物产量。即使所有上述权值不改变，任何这些权值的改善具有有用性。

如实施例中所示，在染色体18的串联重复段中发现的一组三个基因被鉴定出来，其沉默导致在抗性品种中对SCN易感性增加。在约31kb的长的染色体段中发现这三个基因与第四基因、第五基因的一部分和其它DNA序列，所述染色体段以10拷贝存在于大豆品种中，所述大豆品种携带rhg1-b等位基因或Rhg1的单倍型，在商业上广泛用于大豆SCN疾病的控制。在到目前为止测试的所有SCN抗性品种中，发现以至少三个拷贝的Rhg1染色体段。各种抗性品种携带三、七或十拷贝，且Rhg1的更高拷贝数版本表达更高水平的所述三个基因的转录本。Rhg1的更高拷贝数版本也赋予其自身更强SCN抗性(表少为相对具有较低的Rhg1重复拷贝数的Rhg1单倍型，更少依赖同时存在其它SCN抗性QTL的期望等位基因，如Rhg4以有效赋予SCN抗性)。在实施例中，在易感性品种中过表达这三个基因使得根对SCN更具有抗性。描述了通过选择携带遗传标志物的植物来增加植物对胞囊线虫抗性的方法，所述遗传标志物与在Rhg1基因座中存在的Glyma18g02610、Glyma18g02590、和/或Glyma18g02580等位基因相关联。如实施例中所示，在其它大豆(Glycine max)植物品系和其它大豆属物种中可发生从单核苷酸多态性到基因重排(即基因复制)范围的遗传多态性以及在甲基化上的差异，其可改变与Rhg1基因座关联的一个或多个基因的表达或生物影响，以及仔细选择在Rhg1基因座的特定基因的期望等位基因可期望允许选择具有对SCN增加抗性的植物。

还提供通过在所述植物的细胞中增加多核苷酸的表达或改变多核苷酸的表达模式或增加多核苷酸的拷贝数来增加植物对胞囊线虫(包括但不限于SCN)抗性的方法，所述多核苷酸编码Glyma18g02610(SEQ ID NO：3)、Glyma18g02590(SEQID NOS：2、5和6)和/或Glyma18g02580(SEQ ID NO：1)多肽或其功能性片段或变体。所述多肽可以是与所提供的序列80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。我们已测序来自抗性和易感性品种两者中的这些基因，发现编码区内的几个多态性和导致氨基酸改变的几个改变。如实施例中所示，Glyma18g2590多肽确实具有在抗性和易感性品种之间的一些显著多态性，其似乎是功能上与SCN抗性相关。

合适地，在植物的根中增加由Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580编码的多肽的表达。合适地，在植物的根细胞中增加由Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580编码的多肽的表达。合适地，所述该植物是大豆植物或其部分。所述多核苷酸也可以转移到其它非大豆植物，或者在那些植物中可过表达这些多肽的同源物、或编码来自其它植物的多肽的多核苷酸、或编码与由Glyma18g02610、Glyma18g02590、和/或Glyma18g02580所编码多肽相类似的产物的合成基因。其它的植物包括但不限于：糖甜菜、马铃薯、玉米、豌豆和菜豆。基因的过表达可以增加来自其它物种的植物对线虫特别是胞囊线虫的抗性，例如大豆胞囊线虫大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)、糖甜菜胞囊线虫Heterodera schacthii、马铃薯胞囊线虫马铃薯白线虫(Globodera pallida)和在马铃薯中引起类似疾病的相关线虫，如马铃薯金线虫(Globoderarostochiensis)、玉米胞囊线虫Heterodera zeae和豌豆胞囊线虫Heteroderagoettingiana。

可以通过在植物中、在植物细胞中、合适地根细胞中增加多核苷酸拷贝数，或者通过鉴定已经发生其的植物来增加所述多核苷酸的表达。然后这些植物可以在传统育种中使用。合适地，多核苷酸以三、七、甚至十拷贝存在。合适地，表达编码所述多肽或Glyma18g02610、Glyma18g02590和Glyma18g02580的多肽的多核苷酸中的至少两个或全部三个。可选地，可以使用重组DNA技术来增加表达，例如通过使用强启动子以驱动一个或多个多核苷酸的表达增加。

此外，可以通过将来自抗性品系Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580的上游序列克隆到易感性品系来实现增加的植物对胞囊线虫抗性的方法。对于这些方法，可以使用与在Glyma18g02610、Glyma18g02590或Glyma18g02580的蛋白质编码区侧翼的核苷酸序列具有至少60％、70％或80％同一性的核苷酸序列(或者与那些蛋白质编码区具有至少80％、85％、或90％同一性的序列)，所述侧翼区包括这些基因的mRNA的5'和3'非翻译区，并且还包括从这些基因的蛋白质编码区延伸到紧邻基因的蛋白编码区的任何其它基因组DNA序列。

可以在mRNA的表达水平、或在由Glyma18g02610、Glyma18g02590、和/或Glyma18g02580编码的多肽表达水平测量植物中在Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580表达中的增加。如实施例中所示，表达的水平可以相对于在对照植物中的表达水平增加。对照植物可以是SCN-易感性植物或SCN-抗性植物。例如，可以用表达载体转化易感性植物如'Williams82'，从而与未转化的植物或用不改变Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580表达的构建体转化的植物相比转化植物的根表达增加水平的Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580，导致增加对线虫的抗性。可选择地，所述对照可以是对线虫部分抗性的植物，Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580的增加表达可导致对线虫抗性增加。可选择地，所述植物可以是对线虫具有抗性的植物，Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580的增加表达可导致对线虫抗性进一步地增加。可选择地，所述植物可以是对某些线虫种群、种族、Hg型或株具有较强抗性并且对其它线虫种群、种族(races)、Hg型或株具有较弱抗性，Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580的表达增加可导致对这些线虫种群、种族、Hg型或株中的某些抗性增加。

在实施例中，表明减少Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580的表达增加SCN-抗性大豆对SCN成熟的易感性。此外，易感性“Williams82'大豆的根与抗性Fayette品系相比显示具有较低水平的Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580mRNA。因为低水平的Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580mRNA与线虫易感性相关，而增加的水平与抗性相关，Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580mRNA的直接降低通常与之前抗性组织的更大线虫易感性相关，所以在大豆中增加Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580的水平应在许多情况下增加大豆对线虫特别是SCN的抗性。在图15中，Glyma18g02600、Glyma18g02610、Glyma18g02590和Glyma18g02580的组合的表达增加证明增加易感品系对SCN的抗性。在图18中也证明三个基因Glyma18g02610、Glyma18g02590和Glyma18g02580的表达增加增加SCN易感性品种的抗性。少于这三个多核苷酸的表达增加或由所述多核苷酸编码的多肽的表达增加可对增强抗性有类似效果。

可以以各种方式增加Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580的表达，包括若干对于本领域技术人员明显地，以及可以包括转基因、非转基因和传统育种方法。例如，可以通过向植物细胞中引入构建体增加由Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580编码的多肽表达，所述构建体包括在植物中可操作地连接到编码多肽的多核苷酸的启动子。合适地，所述细胞是根细胞。可选择地，可以通过向植物细胞中引入转基因增加由Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580编码的多肽表达，所述转基因包括在植物中可操作地连接到编码多肽的多核苷酸的启动子。所述启动子可以是组成型或诱导型启动子，其能够诱导多核苷酸在植物、植物根或植物根细胞中的全部或部分中表达多核苷酸。在另一个实施方案中，Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580的表达可通过在植物或植物细胞中如植物根细胞中增加所述固有多肽的表达而增加。在另一个实施方案中，Glyma18g02610、Glyma18g02590，和/或Glyma18g02580的表达可通过在植物或植物细胞中，如线虫饲育部位、合胞体或与合胞体相邻的细胞中增加所述固有多肽的表达而增加。在另一个实施方案中，Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580的表达可以通过在植物或在植物细胞中，如线虫与植物细胞的接触部位增加固有多肽的表达而增加。在另一个实施方案中，可以通过增加Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580的拷贝数而增加表达。其它用于增加Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580表达的机制包括但不限于：增加转录激活因子的表达，减少转录阻抑物的表达，添加能够增强Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580表达的增强子区，增加mRNA的稳定性，改变相关基因附近的DNA甲基化、组蛋白乙酰化或其它表观遗传或染色质修饰，或增加蛋白质或多肽的稳定性。

除了传统地利用转基因技术引入额外拷贝或增加所述基因表达以及介导Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580的多肽在植物中增加表达之外，转基因或非转基因技术可以以其它方式使用以增加所述多肽的表达。例如，植物组织培养和再生、除Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580以外的植物基因的突变或改变的表达、或转基因技术可用于在Rhg1基因座上或更通常在植物基因组上产生不稳定性，其导致在Rhg1基因座拷贝数或基因表达行为上的改变。然后，可以通过去除诱发变异的突变或处理，例如通过进一步植物繁殖或传统的杂交育种，来稳定新的拷贝数或基因表达行为。在一个实施例中，虽然转基因植物用于在拷贝数上制造变化，由于所述基因座的拷贝数增加结果将是具有增强抗性的非转基因系(可以想象由此调节)。可以以这种方式使用的转基因技术的实例包括靶向锌指、核酶或其它序列靶向的酶(其在Rhg1基因座上或接近Rhg1基因座上产生双链DNA断裂)、来自噬菌体λ或其它类似系统如frt/flp的Cre/loxP系统，转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、人工DNA或RNA序列(其设计为与Rhg1重组，可以被瞬时引入)，或“改组(shuffle)”DNA的酶，如哺乳动物Rag1酶或DNA易位酶。其它实例是涉及DNA重组、DNA重排和/或DNA修复途径的内源性植物基因的突变或改变的表达。

上述筛选方法也可以用于筛选大豆分离株(大豆)和密切相关物种(野生大豆(Glycine soja)、短绒野大豆(Glycine tomentella)或其它大豆属物种)的抗性标志物，然后抗性品系可自然地或人为地与大豆杂交以产生具有可变拷贝数的大豆或者在Rhg1位点的序列。然后，在这样筛选中鉴定出的任何有用等位基因可以使用传统育种或转基因技术引入到大豆中。相似的系统可用于其它植物

产生携带目的性状，如对线虫(如SCN)增加的抗性的植物品种的非转基因方法对于本领域技术人员是可获得的，其包括传统育种、产生染色体异常的化学或其它方法，如化学诱导染色体加倍和染色体缺失后的多倍体人工补救(rescue)，敲除DNA修复机制或通过产生染色体断裂而增加重组或基因复制的可能性。非转基因地增加Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580的表达或拷贝数的其它方法包括以下：筛选编码影响Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580表达的miRNA或其它小RNA、植物转录因子、或其它遗传组件的植物DNA中的突变；通过如前文所述地筛选植物的线虫抗性、Rhg1拷贝数或者其它Rhg1基因或蛋白表达性状从而筛选大田或繁殖种群中的在拷贝数或在Rhg1序列上的自发突变；杂交育种包含在Rhg1上的不同或相同拷贝数而在两侧的任一侧具有截然不同多态性的品系，接着使用来自Rhg1基因座侧翼两个不同基因型的分子标志物来选择Rhg1上的重组；化学或放射诱变或植物组织培养/再生，产生染色体不稳定性或基因表达的变化，接着如前文所述地筛选植物的线虫抗性、Rhg1拷贝数或者其它Rhg1基因或蛋白表达性状；或通过传统遗传杂交育种向含有Rhg1的品系引入非转基因基因座，产生或增加基因组不稳定性，接着筛选植物的线虫抗性或Rhg1拷贝数。可用于产生基因组不稳定性的基因座的实例包括活性转座子(天然或人工从其它物种引入的)、激活内源性转座子的基因座(例如，影响DNA甲基化或小RNA加工的突变，例如拟南芥中met1或或在玉米中mop1的等效突变)、影响DNA修复或抑制异常重组的植物基因突变，如与酵母的Sgs1解旋酶或大肠杆菌RecQ功能上直系同源或相似的那些，或介导异常重组的基因如酵母的RAD50或RAD52的过表达。本领域技术人员可以发现其它增加Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580表达的转基因和非转基因方法。

本文所述的和所使用的多核苷酸和/或多肽可以编码来自rhg1-b基因座的Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580的全长或功能性片段，或Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580的天然存在的或工程化的变体，或基于类似于Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580或其编码产物的全部或部分的核苷酸或氨基酸组合的部分或全部的衍生多核苷酸或多肽。编码多肽的其它多核苷酸还可以包含在构建体中，例如Glyma18g02600(其编码SEQ ID NO：4的多肽)。所述多肽可以与本文提供的序列至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。编码所述多肽的多核苷酸与在公共大豆遗传序列数据库中可获得的序列可以是至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同。

可以增加由Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580编码的多肽的表达，合适地，与未处理的、易感性的或其它对照植物或植物细胞相比，所述多肽的水平至少1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、7、10、15、20或25倍地增加。对照细胞或对照植物是可比较的植物或细胞，其中Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580表达没有增加，如用空载体转染的相同基因型的植物，或用不同多核苷酸转基因的植物。

对线虫增加的抗性可以如上所述进行测定。增加的抗性可以通过具有以下的植物来测量：具有发展超过J2阶段的侵入线虫的更低百分比、在根部形成胞囊的更低速率、胞囊内SCN卵产量减少、每株植物总SCN卵产量减少和/或在每个植物的基础上或每生长面积基础上与在类似的生长环境中生长的对照植物相比更高的大豆产量。测量SCN抗性的其它方法也将是为本领域技术人员已知的。在本文所述的增加对线虫抗性的方法中，所得到的植物相比于未处理的或对照植物或植物细胞可以具有至少10％增加的抗性。合适地，与对照相比增加的抗性为至少15％、20％、30％、50％、100％、200％、500％。合适地，具有对线虫增加抗性的植物的雌性指数是源自在相同实验中用相似线虫种群感染的相同或类似植物基因型的未处理或对照植物的雌性指数的约80％或更少的。更合适地，实验性感染后的雌性指数不超过源自在相同实验中用相似线虫种群感染的相同或类似植物基因型的对照植物的雌性指数的60％、40％或20％。合适地，当种在被SCN严重感染的田地中(例如，每100立方厘米土壤中超过2500SCN卵)，田地种植植物的大豆颗粒产量比同基因对照植物高2％。更合适地，颗粒产量增加比在类似的环境中生长的同基因对照植物多至少3％、4％或5％。

本文提还供的是构建体，其包括启动子，所述启动子可操作地连接到编码包含SEQ ID NO：1-3或5-6或其片段或功能变体的多肽的Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580多核苷酸。还包括来自其它大豆品种的这些序列的同源物或变体。所述构建体可以进一步包括Glyma18g02600或其它基因。所述构建体可被引入到植物中以制成转基因植物，或可以被引入到植物或植物的部分，如植物组织、植物愈伤组织、植物根或植物细胞。合适地，所述启动子是植物启动子，合适地，所述启动子是在植物的根细胞中可操作的。所述启动子可以是组织特异性的、诱导型的、组成型，或发育调节的。所述构建体可以是表达载体。构建体可用于产生转基因植物或转基因细胞。所述多肽可以是与SEQ IDNO：1-3或5-6的序列至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。所述构建体可以包含所有三种多核苷酸和可以介导所有三个多肽的表达。

本发明还提供转基因植物，其包括编码本文鉴定的和所述的rhg1-b多肽的非固有或外源多核苷酸。合适地，所述转基因植物是大豆。本文鉴定的与线虫抗性相关的大豆多核苷酸和多肽也可以用于生产能够表达本文所述的大豆基因的转基因糖甜菜、土豆、玉米、豌豆、菜豆。或者，可以通过与本文鉴定的大豆基因和多肽进行比较来鉴定来自这些植物的同源基因或多肽，这些基因可用于产生转基因植物。与对照非转基因植物相比转基因植物表达升高水平的Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580多肽，所述对照非转基因植物来自相同品系、品种或栽培品种或表达除Glyma18g02610、Glyma18g02590和/或Glyma18g02580多肽以外的转基因对照。与对照植物相比，转基因植物也具有对线虫尤其是SCN增加的抗性。这些转基因植物的部分(portion)或部分(part)也是有用的。植物的部分或部分包括但不限于，植物细胞、植物组织、植物的子代、植物无性繁殖体(asexual propagate)、植物种子。

本发明还提供转基因植物细胞，其包括编码能够提高对线虫诸如SCN抗性的多肽的多核苷酸。合适地，所述植物细胞是大豆植物细胞。合适地，所述细胞能够再生成植物。所述多肽包含SEQ ID NO：1-3或5-6或其片段、变体或组合的序列。所述多肽可以是与所提供的序列85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。所述转基因细胞可见于在种子。植物如大豆植物可以包含所述转基因细胞。所述植物可以从包含转基因细胞的种子种植来，或者可以通过本领域技术人员中已知的任何其它方法来种植。本发明还提供了包含转基因细胞的嵌合植物。

在转基因植物中多肽和编码所述多肽的多核苷酸的表达相对于在对照大豆植物中固有多肽的表达水平被改变。特别是在植物根中多肽的表达增加。对照植物相比，所述转基因植物具有对线虫增加的抗性。用那些本领域技术人员可获得的方法，可从转基因细胞或愈伤组织中产生转基因植物。

下面提供的实施例是为了说明而不是限制本发明或权利要求的范围。本文引用的所有参考文献和附录通过引用其整体并入本文。

实施例

为了鉴定在PI88788大豆中由Kim等人2010鉴定的基因座中赋予对SCN抗性的基因(由末端BARCSOYSSR_18_0090和BARCSOYSSR_18_0094限定的染色体间隔内)，使用候选基因检测方法。这种方法描述在Melito等人(BMC PlantBiology 2010,10:104)中，将其全文引用并入本文中。简单地说，使用抗性大豆品种Fayette使用在上述定义的Rhg1基因座上的各种基因完成这种候选基因方法，所述抗性大豆品种Fayette携带Rhg1基因座的源自PI88788的rhg1-b等位基因，制造携带基因沉默构建体的转基因大豆根，然后再测试这些转基因根对SCN抗性的损失。所用的沉默策略示于图2。Melito等人的参考文献中使用的人工microRNA被换成了针对Rhg1基因座内各种候选或推定基因的人工microRNA序列。由大豆Ubi3启动子驱动人工microRNA的表达。所述构建体还包含GFP报告子，使得转化的根可以很容易地通过GFP表达鉴定。用根瘤农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)生产表达人工micro-RNA(amiRNA)或发夹(RNAi)构建体的转基因大豆根。表达GFP的根被选作进一步分析。转基因根接种SCN来测试人工microRNA表达决定(condition)的候选基因沉默所造成的对SCN抗性的减少或增加。

根接种两周后通过确定每个根中已经发展超过J2阶段的总线虫种群的比例测量大豆相对于已知抗性和易感性对照的对SCN的抗性(图3A)。沉默的三个紧密相关基因中的任何一个，即在SCN-抗性大豆品种Fayette的rhg1-b基因座上的Glyma18g2580、Glyma18g2590和Glyma18g2610中的任何一个，显著减少SCN抗性(图3B)。抗性的消耗取决于靶转录本的减少(图4)。基因座中和基因座周围的其它基因沉默没有影响SCN抗性(例如，图3B中基因Glyma18g02570和2620)。

预计的Glyma18g02610蛋白产物包含伤口诱导蛋白结构域(Pfam结构域PF07107；M.Punta等人，(2012)The Pfam protein families database.Nucleic AcidsResearch Database Issue 40:D290-D301and Logemann et al.,(1988)Differentialexpression of genes in potato tubers after wounding.Proc Natl Acad Sci USA 85:1136–1140)，之前证明在冰植物(冰叶日中花(Mesembryanthemum crystallinum))中的同源(55％相同)蛋白质响应生物和非生物刺激(Yen等人,Environmental anddevelopmental regulation of the wound-induced cell wall protein WI12in the halophyteice plant.Plant Physiol.127:517-528)。在目前Glyma18g02610的注释蛋白产物不具有对本领域的普通技术人员显而易见的其它众所周知的蛋白质结构域或推断的生化功能。然而，上述结果表明Glyma18g02610对完全的由Rhg1介导的SCN抗性而言是必要的。

在大豆Rhg1上四个基因的基因组复制存在于被测SCN抗性品系中

在rhg1-b基因座物理结构的同时研究发现一个不寻常基因组配置。一个编码有助于SCN抗性的上述三个基因的31.2kb的基因组段，以多拷贝存在于SCN抗性品系中(图5、6)。携带来自rhg1-b遗传间隔的基因组DNA的福斯质粒(fosmid)克隆插入的DNA序列鉴定了一个独特的DNA接合处(junction)，其不存在于公开的Williams82大豆基因组，其中Glyma18g02570的3'片段紧邻(着丝粒向)Glyma18g02610下游的基因间序列(图5A)。所述基因组重复包含Glyma18g02580、-2590、-2600和-2610的全拷贝以及Glyma18g02570的最后两个外显子。含rhg1-b品系的全基因组鸟枪测序揭示所述间隔相对周围或同源区域的10倍大的深度覆盖(图5B)，表明多次重复的存在。

测序和PCR扩增证实在来自多个SCN-抗性大豆登录(accession)的DNA中存在Glyma18g02610-2570接合处，包括携带重要商业价值的Rhg1基因座的PI88788，Peking和PI437654单倍型的登录(图5C和图7)。在包括Williams82的四个受测试SCN-易感性品种中没有检测到接合处(图7B)。这构成了对经济理想的Rhg1基因座等位基因的直接测试。来自不同来源的SCN抗性的接合位点中共有同一性表明在Rhg1上赋予抗性初始事件的共同起源。

Fiber-FISH(荧光原位杂交)被利用来直接决定在Rhg1基因座的不同单倍型中31kb的重复段的拷贝数和排列。使用这些探针产生的杂交模式和DNA纤维长度估计(图6和表1)是与在Williams82中存在的单拷贝重复相一致，如参考大豆基因组。在Fayette中，Fiber-FISH表明预测的31kb重复段的每DNA纤维十拷贝，以相同的配置遍及多个取样的核中，该模式显示10个直接重复以头-到-尾排列相邻(图6和表1)。明显没有其它拷贝(例如，在其它基因座)。在来自大豆品系Peking的样本中，每DNA纤维三个拷贝以明显直接重复方向存在(图6)。虽然Fiber-FISH不能解决小序列差异，所有接合处扩增PCR产物的单一尺寸和从福斯质粒或基因组DNA测序拼接的所有接合处序列的一致性(图7)进一步表明相邻直接重复拷贝的存在。

表1 Fiber-FISH杂交信号的长度估计。N:分析的DNA纤维数

为了发现更多拷贝数和DNA多态性，我们使用由Perry Cregan博士提供的序列数据分析41个大豆品系(来自目前嵌套关联基因作图研究的“NAM父母”)的全基因组重测序(WGS)数据。所述数据组由全基因组鸟枪法测序读数组成，所述读数由使用Illumina Hiseq设备和操作规程所产生且具有测序覆盖的平均深度范围为5至60倍。将所述读数作图到Williams82参考基因组(Phytozome，拼接189)，并分析相对于SCN易感性品系Williams82的读数深度(read depth)(RD)、INDEL和SNP。当这种Illumina读数深度被用来估计在Rhg1基因座的拷贝数时，采用的方法类似用于产生图5B的那些，所分析的41个大豆品系中的8个具有大于5的平均值、标准偏差的不同的对约31kb Rhg1区归一化的读数深度(对应于如上所述rhg1-b重复段)，其不同于对应于rhg1-b重复段区域的紧邻侧翼的两个30kb区的阅读深度。见表2。那些品系中的7个具有范围从9.2到9.9拷贝的估计拷贝数。当谱系可获得时，这些品系在其谱系中具有PI88788，并已在实验室和/或田地试验被分类为SCN-抗性。预计携带Rhg1重复的其它基因型具有2.9的估计拷贝数。其谱系包含Peking和PI437654两者。如果它们不偶联非连锁基因座Rhg4的优选等位基因，源自Peking和PI437654的Rhg1基因座被广泛认为在赋予SCN抗性上非常低效的。所有其它基因型(33)估计含有本文所述的约31kb的Rhg1DNA的一个拷贝。33品系中具有可用的、之前确定的SCN抗性表型的全部12个品系作为SCN易感性被列出，而SCN抗性表型的信息对于其它21个品系是不容易获得的。作为对照，读数深度被用来估计在染色体11同源区上拷贝数。在所有测试的基因型中估计拷贝数为大约1。除了表2中所示的那些品系外，我们最近确定的一种称作Cloud的品种(PI548316)，其携带7拷贝的Rhg1基因座重复段，显示中间水平的SCN抗性。

表2：在各种大豆品种中Rhg1基因座拷贝数分析。

在Rhg1出现的第一复制事件的来源是未知的，但可能是附近Tyl/Copia-样逆转录转座子RTvr1或RTvr2活动的结果。后来拷贝数量扩张可通过在减数分裂重组期间在同源重复之间罕见的不等价交换事件而发生。

在rhg1-b上的复制基因区块内的基因比来自SCN-易感性Rhg1单倍型的其同源物更高水平地表达

使用定量PCR(qPCR)分析的基因表达确定了发现影响SCN抗性的三个基因在SCN-抗性品种比易感性品系表现出更大的根中转录本丰度(图5D和图7D)。与此相反，在SCN-抗性和易感性品种之间，侧翼紧邻SCN-影响基因的基因的转录本丰度没有明显差异(图5：在根中Glyma18g02600表达等于或低于qPCR的检测的限制；cDNA克隆和RNAseq方法，参见Cook等人，2012methods and Severinet al.RNA-Seq Atlas of Glycine max:A guide to the soybean transcriptome.Bmc PlantBiology,2010)。对Glyma18g02580、-2590和-2610确认全长转录本，对于Glyma18g02570没有检测到杂交重复接合处的转录本(图7E)。上述表明一种或多种SCN-影响基因的表达升高可能是SCN抗性升高的主要原因。

定量实时PCR(qPCR的)也被用于在Hg型大豆品系非接种根中检查和比较在Rhg1基因座的5个基因的mRNA的转录本丰度。这些品系已建立并且被研究人员接受为代表SCN抗性大豆品系的有用和多样化组(Niblack等人,2002,J.ofNemat.34(4):279–288；T.L.Niblack,K.N.Lambert,G.L.Tylka,2002,Annu.Rev.Phytopathol.44:283-303)。如图8所示，这些基因中的3个，Glyma18g02580、Glyma18g02590和Glyma18g02610，在7个受测的SCN差异的每一个中相对于SCN易感性品系Williams82都表达更高。在基因座上的另一基因Glyma18g02600在SCN抗性品系中也更高表达，但对于Glyma18g02600的数据可能不太准确，绝对测量的Glyma18g02600转录本水平接近检测极限(与来自大豆根的已公布RNA-seq数据相一致)。作为对照，相邻但不重复的基因Glyma18g02570对所有测试的基因型显示相似的表达模式。在一个单独的实验中，两个其它基因Glyma18g02620和Glyma18g02630，位于重复的着丝粒侧侧翼，也显示出贯穿SCN抗性和易感性品系相似的转录本丰度。

SCN抗性基因型中的四个(Peking、PI90763、PI89772和PI437654)对于四个基因Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610和Glyma18g02600的mRNA丰度水平上彼此相似。在这些基因型中，对于这四个重复基因的转录物丰度相对Williams 82高1.5至5倍。另一方面，与Williams 82和前四个基因型相比，SCN-抗性基因型Cloud、PI88788和209332在Rhg1基因升高的mRNA丰度水平上彼此相似。在Cloud、PI88788和PI209332基因型中，对于重复基因的转录本丰度从4到20倍更高。这些数据表明，增加编码这四个基因的DNA拷贝数提高了转录本丰度。还有对于DNA拷贝数和转录本丰度的强分组，使得至少有两类：基因型Peking、90763、89772和437654一起的一类，而基因型Cloud、PI88788和209332一起的一类。我们注意到，这些Rhg1基因型(拷贝数)和Glyma18g02580/Glyma18g02590/Glyma18g02610表达水平分组与Colgrove等人报道的SCN抗性表型分组之间的相关性，2008(Colgrove,A.L.,和T.L.Niblack.2008.Correlation offemale indices from virulence assays on inbred lines and field populations ofHeterodera glycines.Journal of Nematology 40:39-45)。尽管Glyma18g02600在SCN抗性品系中更高地表达，然而并没有找到如其它3个基因重复中发现的拷贝数和转录物丰度之间明确的关系。这表明增加的DNA含量确实增加转录物丰度，但对与Glyma18g02600不是以剂量依赖的方式。

Rhg1DNA甲基化状态对于复制基因区块内的基因是栽培品种依赖的。

为了解决导致在SCN-抗性栽培品种中观察到的更高基因表达的机制，我们利用甲基化敏感的限制性内切酶消化以及PCR来评估了Rhg1基因座的DNA甲基化。McrBC是特异地切割含有5-甲基胞嘧啶(5-mC)的DNA而使未甲基化DNA保持完整的内切酶。使用McrBC孵育DNA，然后进行PCR，如果产物跨越甲基化胞嘧啶则不能产生产物。当测试大豆基因组DNA在Rhg1基因座上的甲基化时，我们鉴定了在SCN-抗性和SCN-易感性栽培品种之间显著的和可重复的差异。例如，在McrBC消化和未消化的来自抗性品种的基因组DNA之间，对于Glyma18g02610启动子或编码区的三个不同的引物对或者没有扩增出产物，或产物大大减少(图9)。无论基因组DNA模板是否被消化，用于PCR的引物对从易感性栽培品种收集的DNA产生相似的产物，这表示很少或没有DNA甲基化。

有趣的是，高度甲基化的DNA和升高的基因表达之间的一致相关性被发现在受测SCN-抗性栽培品种中。Glyma18g02580、Glyma18g02590和Glyma18g02610的启动子区都是甲基化的并具有较高的转录。邻近的基因Glyma18g02620并没有显示在抗性和易感性栽培品种之间多态性甲基化或改变的基因表达(图9)。

2580、2590和2610基因的进一步鉴定

对来自Fayette(未接种SCN)的Glyma18g02590和Glyma18g02610进行RACEPCR显示，来自SCN-抗性PI88788单倍体的转录本与Williams 82(SCN-易感性)基因组序列相关联的注释转录本具有相同的起始和终止位点，其可在Phytozome上获得(http://www.phytozome.net/cgi-bin/gbrowse/soybean/)。作为在SCN-抗性相对SCN-易感性大豆品系(未接种SCN)之间的容易检测的蛋白质降解或翻译后修饰差异的初始测试，通过使用1.5kb的Fayette固有启动子驱动Glyma18g02590-HA(2590_Fayette::2590-HA)或使用3.2kb的Fayette固有启动子驱动Glyma18g02610-HA(2610_Fayette::2610-HA)进行的蛋白印迹的蛋白免疫检测实验发现可检测的蛋白产物，对于各蛋白质其大致迁移预测的尺寸，并没有显示Williams 82相对Fayette的蛋白尺寸差异(图10)。

为了探索Glyma18g02580、Glyma18g02590和Glyma18g02610对在大豆中SCN发育的影响与SCN诱导基因表达相关的可能性，我们分析了从抗性和易感性品系严重SCN感染的根段切出的根组织的基因表达。在SCN-抗性Fayette中观察到适度增加的Glyma18g02580和Glyma18g02610表达，与SCN-易感性Williams 82相比在未接种的Fayette中已经存在以上高水平表达(图11)。

为了进一步探索Glyma18g02580、Glyma18g02590和Glyma18g02610对在大豆根中SCN发育的影响与SCN诱导表达相关的可能性，制成启动子-GUS融合构建体(Prom_2580::GUS、Prom_2590::GUS、Prom_2610::GUS)并在转基因根中表达。转基因根接种SCN 5天后进行GUS活性染色(图12)。Prom_2580::GUS根具有中等水平的背景染色，似乎在感染J2SCN头部具有膨胀的植物微管组织的更明亮染色(明显发育的合胞体)。Prom_2590::GUS根具有非常低水平的背景染色，以及一致地在明显的合胞体具有更强GUS染色，以及新生侧根根尖的强染色。Prom_2610::GUS根具有非常高水平的背景染色，但似乎也在可能形成合胞体的区域被更强地染色。在明显的合胞体中升高的GUS染色水平类似于我们在阳性对照启动子-GUS实验中观察到的那些，其利用之前表征的Glyma14g06080的合胞体诱导型启动子。如上所述，预计Glyma18g02610编码的蛋白质包含伤口诱导蛋白结构域(Pfam07107)和在冰植物(冰叶日中花)中的同源(55％相同)蛋白，其被证明响应生物和非生物刺激两者。暴露至MeJA的非转基因Fayette大豆植物与邻近基因相比具有显著升高的Glyma18g02610转录本丰度，进一步证明这个基因的胁迫相关表达(图11)。

三个鉴定出的rhg1-b基因中的任一个的氨基酸多态性或过表达不导致对其自身的SCN抗性。从所有可获得的rhg1-b序列读数(在多个重复拷贝)看出，没有鉴定出相对于Williams 82的Glyma18g02580、Glyma18g02600或Glyma18g02610的预示氨基酸多态性。来自rhg1-b的Glyma18g02590一些拷贝类似于Williams 82序列，而其它则包含一组多态性，特别是在预测的α-SNAP蛋白的预测C末端6个氨基酸(表3，由cDNA测序证实)。

表3.在rhg1-b的31kb重复内的氨基酸多态性。通过比较福斯质粒克隆序列与拼接的大豆基因组Glyma1版本预测编码蛋白质的基因的位置。(L)或(R)表示接合处的左或右侧。*表示基于Williams 82拼接基因组的在氨基酸位置287和288之间插入1个氨基酸(3bp DNA序列)(Glyma1；www.phytozome.net)。

基因ID

氨基酸位置

W82

#1

#3

#4(L)

#5(L)

#5(R)

2590

203

Q

K

Q

K

-

K

2590

285

E

Q

E

Q

2590

286

D

H

D

H

2590

287

D

E

D

E

2590

287-288*

-

A

-

A

2590

288

L

I

L

I

也分析了全基因组测序(WGS)数据的DNA多态性诸如插入或缺失(INDEL)和单核苷酸多态性(SNP)。在具有估计拷贝数范围为9至10的7种基因型中，鉴定出相对于参考Williams 82序列的一些SNP。如上所述，包含在DNA的重复rhg1-b段中的一个基因Glyma18g02590相对于Williams 82含有DNA多态性。有一个单一SNP，在位置1,643,192上的C到A(Williams 82到PI88788所衍生出的)，其导致Q到K的氨基酸取代。有3个SNP存在于C-末端，存在于位置1,644,965(G到C)、1,644,968(G到C)和1,644,974(C至A)，以及在碱基1,644,972后的3bp插入(GGC)，它们共同将Williams 82蛋白的最后5个氨基酸从EEDLT改变为QHEAIT。核苷酸和氨基酸序列显示在图13中。3个bp插入导致在PI88788衍生品系中一个额外的氨基酸。所有碱基对位置对应于Williams 82基因组的1.1版本，拼接189。在Williams 82和PI88788来源的Rhg1之间，在大约31kb的Rhg1重复DNA区内观察到许多SNP和INDEL多态性，在那些直接包括Glyma18g02580、Glyma18g02590，Glyma18g2600和Glyma18g02610的最后开放阅读框之外的核苷酸区中。在来自NAM测序项目的具有估计拷贝数范围为9至10的7个大豆品系中，Illumina测序分析读数深度表明有9个非常相似的在rhg1-b的PI88788型重复的拷贝，以及一个部分在rhg1-b的Williams 82样重复拷贝。

来自大豆NAM亲本测序项目的大豆品系LD01-5907，其携带估计拷贝数为3，还含有影响Glyma18g02590氨基酸序列的DNA多态性。DNA多态性不同于在PI88788衍生品系发现的那些，但发生在类似的位置。在位置1,643,225有一个SNP，其导致D到E的氨基酸取代。有2个SNP存在于C-末端，发生在位置1,644,968(G至T)和1,644,974(C至A)，以及在碱基1,644,972之后的3碱基插入(GGT)，其共同将Williams 82蛋白的最后5个氨基酸从EEDLT改变为YEVIT。3bp的插入导致在在Glyma18g02590蛋白产物中一个额外的氨基酸，这与源自Peking或PI437654来源的Rhg1基因座一致。

使用3＇RACE和cDNA测序证实了通过WGS分析鉴定的Glyma18g02590的DNA多态性的表达。在SCN抗性基因型Cloud、PI88788和PI209332中，鉴定两种不同的Glyma18g02590转录本。一个序列对应于Williams 82参考型序列，而另一个对应于来自PI88788衍生的抗性来源(来自NAM亲本)的序列。PI88788衍生的相对Williams 82型cDNA序列的比例遵循对DNA序列所观察到的。即，PI88788衍生的Glyma18g02590的cDNA是测序的总转录本的大约90％。这与这些基因型含有源自PI88788的31kb DNA段的8或9个拷贝的数据。也在PI88788中分析了存在于Glyma18g02610的5'UTR中的SNP。序列类型的比例配合其它观察。

在SCN-抗性基因型Peking、PI90763、PI89772和PI437654中，针对Glyma18g02590鉴定两种不同的转录本。序列之一对应于来自NAM测序项目的Peking/PI437654衍生的抗性来源的LD01-5907序列。参见图13。还从四个SCN-抗性基因型Peking、PI90763、PI89772和PI437654的每一个中检测到cDNA的替代形式，其在所有四个来源中具有相同类型的多态型。这种明显的mRNA剪接同种型有36个核苷酸删除导致Glyma18g02590同种型少了12个氨基酸，如图13所示。删除发生在外显子6的末端以及剪接至外显子7的阅读框。来自Peking、PI90763，PI89772和PI437654的测序产物中没有一个包含Williams 82型Glyma18g02590序列，与WGS分析是一致的。基于测序的cDNA的比例，在这些品系中非常接近70％至90％的Glyma18g02590转录物是全长版本。

各种多态性可导致在Glyma18g2590多肽中的功能上差异，并三维建模在图14中，其依赖于酵母Sec17蛋白的溶解晶体结构。删除的α-螺旋以浅灰色示出。应当指出，这些多态性都聚集在靠近预测折叠的Glyma18g02590的C末端的一个总区域中，其是α-SNAP蛋白同源物，并且实质功能数据可用于真核生物的α-SNAP蛋白，其表明蛋白此区的具体功能(例如,Barnard RJ,Morgan A,&Burgoyne RD(1996)Domains of alpha-SNAP required for the stimulation of exocytosis and forN-ethylmalemide-sensitive fusion protein(NSF)binding and activation.Molecularbiology of the cell 7(5):693-701；Barnard RJ,Morgan A,&Burgoyne RD(1997)Stimulation of NSF ATPase activity by alpha-SNAP is required for SNARE complexdisassembly and exocytosis.J Cell Biol 139(4):875-883；Jahn R&Scheller RH(2006)SNAREs-engines for membrane fusion.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.7(9):631-643.)

然而，只表达了强组成型启动子或固有启动子序列下游的Fayette多态性rhg1-b型Glyma18g02590没有增加Williams 82转基因根的SCN抗性反应(图15和图16)，这表明rhg1-b SCN抗性的需要超出这2590种氨基酸多态性。但是，这些多态性可能在SCN抗性上显示贡献作用，而这在这些实验中检测不到。当仅使用强组成型启动子单独表达时，Glyma18g02580或Glyma18g02610的过表达也未能增加SCN抗性(图13)。这些数据是初步的但可以指示抗性表型需要多于单个基因或对介导抗性是必要的某些其他因素。

结合以上，测试了在31kb重复段内的一组基因的同时过表达作为SCN抗性的可能来源。制成单个重组DNA构建体，其中基因Glyma18g02580、Glyma18g2590、Glyma18g2600和Glyma18g2610中的每一个都被融合到强启动子。在两个独立的实验中，对于每个DNA构建体共同测试>25个独立转基因事件，通过这一组基因的同时过表达对SCN的抗性在SCN-易感性Williams 82中显著升高(图15)。尽管被过表达的基因中的3个编码预测的氨基酸产物与SCN-易感性Williams 82的产物相同，以及使用的多态性Fayette rhg1-b Glyma18g02590基因当其自身过表达时不足以造成在SCN抗性上的可检测改变的事实，仍然赋予增加的SCN抗性(图15)。值得注意的是，在这些转基因根中没有PR-1的显著升高，这可能已表明防御的非特异性升高(图16)。我们还测试在Williams 82中同时过表达Glyma18g02580、Glyma18g02590_Fayette和Glyma18g02610对SCN抗性的影响。我们观察到在过表达Glyma18g02580、Glyma18g02590_Fayette和Glyma18g02610的Williams 82的转基因根中相对于Williams 82空载体根中对SCN的抗性增加，如图17所示。这些数据表明，过表达这种基因组合导致增强的SCN抗性。

这些结果揭示了疾病抗性的新机制：源自在Rhg1基因座的拷贝数变化的多个不同但紧密相连基因的表达多态性。这种知识表明未来提高Rhg1介导的对非常重要的大豆SCN疾病定量抗性的功效的方法，例如通过分离携带更多拷贝的31kbRhg1重复的大豆品系，或通过相关基因的转基因过表达。这些方法也可以适用于其它物种，以及对其它内寄生线虫的抗性。

Rhg1介导的抗性的生化机制尚不清楚。其它测序植物基因组没有携带预测的Glyma18g02610蛋白的密切相关(close)同源物，虽然已经研究了在冰植物中具有55％同一性的创伤诱导蛋白。使用Phyre2预测的Glyma18g02610三级结构的模型表明，具有98％的置信度，Glyma18g02610与△(5)-3-酮类固醇异构酶/核转运因子2家族蛋白的PhzA/B亚家族具有48％相似性。因此，Glyma18g02610可能参与生产对线虫有毒的吩嗪类化合物。因此，Glyma18g2610应用至植物、土壤或种子可抑制易感植物中的线虫。Glyma18g02610蛋白的分泌或有助于疾病抗性的其它植物产品可能被Glyma18g02590α-SNAP蛋白影响。因为其是在大豆参考基因组中编码的至少五个α-SNAP同源物中的一个，Glyma18g02590可经历亚功能化(subfunctionalization)或新功能化(neofunctionalization)。完全测序的植物基因组携带两打或超过五打许多亚型的注释的氨基酸转运蛋白(www.phyotzome.net)，其可参与在细胞之间或在亚细胞器之间的氨基酸运入和/或运出。大豆和其它物种的Glyma18g02580蛋白以及其最密切相关的转运蛋白没有在功能上充分表征，所以Glyma18g02580通过在侵染点(feeding site)改变特定氨基酸或氨基酸衍生物的水平来改变线虫延续(success)的概念仅仅是关于Glyma18g02580的SCN-威慑功能的进一步研究的许多可行假说之一。

不同基因区块的拷贝数变异(CNV)，而不是单个基因家族的CNV赋予Rhg1介导的SCN抗性。最近在高粱、水稻、和大豆中的基因组结构的分析已经报道高水平的CNV，以及具有假定生物和非生物胁迫相关基因的CNV区域重叠的倾向。目前的工作提供CNV赋予的重要疾病抗性性状的具体实例。在人类和昆虫中，适应性性状已经与特定单个基因的CNV相关。功能相关的但非同源基因的单拷贝簇在多细胞真核生物中极不寻常的，但已报告其与植物次生代谢关联。我们提供涉及两个以上的重复的CNV实例，所述重复编码多个基因产物，其对于适应相同重要的环境约束是必不可少的。考虑到植物基因组的高度重复性和可塑性，以及在CNV和表型之间的相对未探索的联系，很有可能一些其它复杂性状被一般类型的CNV控制(我们报告了大豆Rhg1)。

材料和方法：

根瘤农杆菌大豆根转化

根瘤农杆菌株Arqua1通过冻融进行转化，如之前Wise,A.A.,Z.Liu和A.N.Binns,Three methods for the introduction of foreign DNA into Agrobacterium.Methods Mol Biol,2006.343:p.43-53和Hofgen,R.和L.Willmitzer,Storage ofcompetent cells for Agrobacterium transformation.Nucleic Acids Research,1988.16(20):p.9877-9877所报道。将细胞涂布在具有适当抗生素的选择介质中，在28℃孵育两天。根瘤农杆菌株Arqua1来自Jean-Michel Ane博士，威斯康星大学麦迪逊分校。缺少真菌或病毒污染的宏观迹象的大豆种子在具有氯气的干燥罐进行表面消毒16-20小时，通过将3.5ml 12N盐酸加入到100ml家用漂白剂(6％的次氯酸钠)中产生所述氯气。每个实验至少20个种子铺于在100×25mm的皮氏板中的萌发介质中(甘博格(Gamborg)氏B5盐(3.1g/L)、2％蔗糖、1X甘博格氏B5维生素、7％Noble琼脂、pH5.8)。用Micropore胶带(3M,St.Paul,MN)包裹板，并在生长室中(18/6光照/黑暗小时)在26℃孵育大约一周。在萌芽后5-7天通过轻轻地用无菌镊子从下胚轴除去大豆子叶来收获它们。用无菌镊子和Falcon#15解剖刀，在将解剖刀侵泡在根瘤农杆菌悬液(在无菌ddH₂O中OD₆₀₀0.6-0.7)后在横跨子叶的背轴面做若干浅切口。然后，将子叶背轴侧朝下置于共培养介质(CCM)中(0.31g/L甘博格氏B5盐、3％蔗糖、1X甘博格氏B5维他命(BioWorld,Dublin OH),0.4g/L L-半胱氨酸,0.154g/L二硫苏糖醇,0.245g/L硫代硫酸钠、40mg/L乙酰丁香酮、5％Noble琼脂、pH 5.4)在100x 15mm皮氏板中，在琼脂的表面具有一片70mm滤纸(Whatman,Piscataway,NJ)以防止根瘤农杆菌过度生长。板用封口膜(parafilm)包住在黑暗中在室温下温育三天。然后，将外植体转移至100x 15mm皮氏板中的发根培养基(HRM)中(4.3g/L MS盐(Sigma Co.,St.Louis,MO)、2％蔗糖、1X甘博格氏B5维他命(BioWorld,Dublin,OH)、7％Noble琼脂、0.15g/L头孢噻肟、0.15g/L羧苄青霉素、pH 5.6)，受伤的面朝上。Micropore胶带包裹板并在黑暗中在室温下孵育直至根萌出，通常约2个星期。使用荧光立体显微镜(具有GFP2过滤的LEICA MZ FL III)基于质粒载体编码的GFP表达来检测转基因大豆根。转基因大豆根尖段(2-3cm)被转移至HRM。避免了表达不完整荧光条的根(嵌合体)或显示整体低水平GFP荧光的根。从不同的接种部位或不同子叶产生的独立转基因事件维持独立地用于RNA提取和线虫数目统计分析。

线虫维持(maintenance)

来自威斯康星州Racine的、由Ann MacGuidwin(威斯康星大学麦迪逊分校)收集的SCN种群(Hg型7)维持在易感性大豆品种Williams 82中。种子在2张湿纸巾之间萌发，所述湿纸巾卷起来竖直放在玻璃烧杯中并在底部有少量的水持续2-4天。发芽的种子随后种植在高压灭菌处理的4:1砂：土壤混合物并用单株植物2000个大豆胞囊线虫卵进行接种，并在28℃的生长室中生长。感染～50天后，当大豆在R2(全面开花)时收集胞囊，并使用筛和离心从土壤和根提取胞囊。简言之，将来自感染皿中土壤和根置于一罐水中并搅拌。使土壤-胞囊-水混悬液(slurry)穿过710μm-250μm筛塔，以及使来自250μm筛的混合物回流至50ml塑料离心管。将所述管在2000rpm离心4分钟，然后将上清液倒出。将60％的蔗糖溶液加入到管中，搅拌，并在2000rpm离心2分钟。然后，通过250μm筛收集在上清液中的胞囊。收集的胞囊在4℃储存在含两次消毒的火石沙的密封塑料袋中。

线虫数目统计分析

如Melito等人进行线虫数目统计分析，如下文。利用有活力的新根段(包括根尖2-3cm)。所有的根(实验中所有的基因型)在接种之前随机编码，以对调查者遮蔽根基因型信息，所述调查者在两周后对根进行染色以确定在每个线虫发育类别中的线虫数目。为用于接种，使用大橡胶塞破开胞囊以及在由250μm-75μm--25μm筛(美国标准试验筛)组成的筛堆叠上收集卵来收集大豆胞囊线虫。从25μm筛收集卵并漂洗。卵置于具有3mM氯化锌的孵化室中以在室温下黑暗中孵化5-6天。参见Wong,A.T.S.,G.L.Tylka和R.G.Hartzler,Effects of 8herbicides on in-vitrohatching of Heterodera-glycines.Journal of Nematology,1993.25(4):p.578-584。在0.001％氯化汞中对孵出的J2线虫进行表面灭菌3分钟，再用无菌蒸馏水洗涤三次，然后在室温下悬浮在0.05％低熔点琼脂糖中以促进均匀分布。Baum,T.J.,M.J.E.Wubben,K.A.Hardy,H.Su和S.R.Rodermel,A screen for Arabidopsis thalianamutants with altered susceptibility to Heterodera schachtii.Journal of Nematology,2000.32(2):p.166-173。在表面杀菌和洗涤后至少一个半小时在立体显微镜下通过观看等分部分来确定活性线虫的数目，之后200-250个活性J2接种到每个新鲜根段中。具有线虫接种的根在28℃维持在HRM介质中；典型地，在随后的2周发生实质性根生长。通常在接种15天(dpi)后，通过清洁和用酸性品红染色来监测在这些根系统中的线虫感染和发育。Bybd,D.W.,T.Kirkpatrick和K.R.Barker,An improvedtechnique for clearing and staining plant-tissue for detection of nematodes.Journal ofNematology,1983.15(1):p.142-143。然后，通过记录在每个根系统中线虫数量来完成线虫数目统计分析，如在文中和图中所指出的，所述线虫显示类似以下的形态学：J2(薄)、J3(香肠状)、伸长的雄性或者J4/成年雌性的线虫。通常情况下，20-80个线虫存在于每个根中；从进一步分析中排除含有少于10个线虫的根。结果表示为已经发育超过J2阶段的线虫的百分比％([J3+成年雄性+成年雌性]/[J2+J3+成年雄性+成年雌性])。每个数据点被归一化至来自相同实验的使用空载体转化的Williams 82根的平均值。所有报告的数据基于至少两个独立的生物重复实验(对于每个柱状图上的每个柱为n>12个独立转化的根)。

引物表

用来进行这项研究的引物序列列在表4中，在本文中以编号引用。

表4：用于PCR的寡核苷酸引物的DNA序列。

用于大豆转化的载体构建

如Melito等人之前所述，构建用于大豆转化的双元载体pSM101和pSM103。为了生成和克隆大豆amiRNA，使用Web microRNA Designer(http://wmd3.weigelworld.org)和操作规程。这个概念在其它文献中更完全地记录。参见Schwab,R.,S.Ossowski,M.Riester,N.Warthmann和D.Weigel,Highly specificgene silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis.Plant Cell,2006.18(5):p.1121-1133。使用以前报道的CTAB方法，从膨胀的大豆三叶(trifoliate)或大豆根中提取大豆DNA。Doyle,J.J.和E.E.Dickson,Preservation of plant-samples for DNArestriction endonuclease analysis.Taxon,1987.36(4):p.715-722。使用pCR8/GW/TOPO TA克隆试剂盒(Life Technologies Corp.,Carlsbad CA)(表4中的13-24)，TA克隆amiRNA构建体的PCR片段。用于大豆转化的双元载体pGRNAi1和pGRNAi2是来自佐治亚大学Wayne Parrot的礼物(未发表)。对于每个发夹，根据每个制造商的说明，使用Phusion HF聚合酶(New England Biolabs,Ipswich,MA)和iScript cDNA合成试剂盒(Biorad,Hercules,CA)对作为模板的300-600bp的DNA片段进行PCR扩增(表4中的1-12)。如之前所述对PCR产物进行TA克隆。用于产生DNA片段的引物被设计成含有限制性位点AvrII/AscI(正向引物)和BamHI/SwaⅠ(反向引物)以允许克隆到pGRNAi1和pGRNAi2。使用制造商推荐的操作规程(New England Biolabs,Ipswich,MA)，用限制性内切酶SwaⅠ和AscI依次消化插入物和载体以产生发夹的第一臂。在溴化乙锭染色的1.0％琼脂糖凝胶上分离DNA，并用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)对各个DNA片段进行凝胶纯化，并使用T4DNA连接酶(Promega,Madison,WI)在4℃过夜连接在一起。使用限制性内切酶BamHI和AvrⅡ，使用相同方法插入发夹构建体的第二臂。为构建Glyma18g02580(表4中的70、71)、Glyma18g02590(表4中的57、58)和Glyma18g02610(表4中的55、56)的单基因过表达载体，如前所述，使用Phusion HF聚合酶从Fayette的cDNA中对全长ORF进行PCR扩增，并在pCR8/GW/TOPO中进行TA克隆。通过类似的方法从基因组DNA克隆Glyma18g02600(表4中的67、68)，因为在根cDNA文库中没有检测到Glyma18g02600cDNA。根据每个生产商的说明通过使用LR克隆酶反应(LifeTechnologies Corp.,Carlsbad,CA)，将所述Glyma18g02610和Glyma18g02590ORF与pGWB14(CaMV 35S启动子，6X HA-NOS终止子)进行重组。参见Nakagawa,T.,T.Kurose,T.Hino,K.Tanaka,M.Kawamukai,Y.Niwa,K.Toyooka,K.Matsuoka,T.Jinbo和T.Kimura,Development of series of gateway binary vectors,pGWBs,forrealizing efficient construction of fusion genes for plant transformation.J Biosci Bioeng,2007.104(1):p.34-41。从pGWB14中PCR扩增Glyma18g02610(表4中的55、59)并TA克隆到pCR8。用XbaI/KpnI消化这个载体和pSM103，并连接以产生GmUbi_prom:2610-HA:NOS_term(OE:2610-HA)。相同的方法被用于Glyma18g02590(表4中的57、59)，除了以下不同：所述扩增子中包含XbaI/SalⅠ位点、和TA克隆到pCR8.2590-HA:NOS_term以及用XbaI/SalI消化pSM103并连接以产生GmUbi_prom:2590-HA:NOS_term(OE:2590-HA)。全长OE：2590-HA还被消化(XbaI/SalI)，并被连接到含有OE:2610-HA的pSM103中以产生OE:2610-OE:2590。为了产生4个基因过表达的构建体，通过退火寡核苷酸(表4中的62、63)在位点PstI/HindII之间将限制性位点PacI、PspOMI和AscI加入到pSM101中以产生pSM101+。使用限制酶PstI/KpnI和连接将两个基因过表达盒(cassette)(OE:2610-OE:2590)移动到新的pSM101+中。使用重叠PCR(表4中的65-68)将Nos启动子加入到pCR8中的Glyma18g02600并TA克隆到pCR8。在LR克隆酶反应中将这种载体与pGWB16(无启动子、4xMyc-NOS终止子)重组以产生Nos_prom:2600-myc:Nos_term(OE:2600-myc)。使用PCR扩增OE：2600-myc(表4中66，72)并TA克隆到pCR8，再使用限制性内切酶HinIII/AscI亚克隆到pSM101+(OE：2610-OE：2590)以获得三个基因的过表达载体((OE:2610-OE:2590-OE:2600)。采用具有引物71-74的重叠PCR将Nos启动子加入在pCR8中的Glyma18g02580并TA克隆到pCR8。在LR克隆酶反应中此载体与pGWB16一起使用以得到Nos_prom:2580-myc:Nos_term(OE:2580-myc)。扩增OE：2580-myc(表4中72、75)并TA克隆，然后亚克隆到三个基因过表达载体以得到四个基因过表达载体pSM101+OE:2610-OE:2590-OE:2600-OE:2580。Williams 82互补的固有Fayette Glyma18g02590(2590_FayP:2590_Fay)构建体亚克隆至含有所需等位基因的福斯质粒。在SalI消化后，包含PI88788Glyma18g02590的6.5kb DNA片段从福斯质粒分离出来，并使用SalI限制位点克隆到pSM101。所述序列含有大约1kb的5'调节DNA序列。通过扩增来自福斯质粒的PCR产物(表4中的79、80)，将所述亚克隆区紧邻上游的5'调节序列的另外600bp加入到所述构建体中，并用限制性酶HindIII/SalI插入。所得构建体含有大约1.6kb的天然存在的FayetteGlyma18g02590等位基因的5'调节序列。使用在威斯康星大学麦迪逊生物技术中心的DNA测序服务，利用ABI Big Dye循环测序试剂盒(双脱氧链终止)和ABI 3730xlDNA分析仪(Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)的桑格(Sanger)测序在各个步骤确认载体序列。

实时定量PCR

使用MyIQ或CFX96实时PCR检测系统(BioRad,Hercules,CA)进行定量PCR(qPCR)。根据制造者说明使用iScript cDNA合成试剂盒(Biorad,Hercules,CA)通过加入0.825ug至1.0ug的RNA(根据实验)从RNA合成cDNA。从常规和转基因大豆的根组织中提取总RNA。RNA提取自常规大豆植物，其在组织收集之前在26℃和16小时光照中生长在Metro混合物中两周。从各植物收集大约200mg的组织，立即快速冷冻在液氮中并储存在-80℃。如前所述，从活跃生长在HRM中的根收集转基因根材料。从各根收集大致50-100mg的组织，快速冷冻在液氮中并储存在-80℃。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)或TRIzol试剂(LifeTechnologies Corp.,Carlsbad,CA)根据制造商操作规程提取RNA。使用NanoDrop-1000分光光度计(spectophotomoter)(Thermo Scientific,Waltham,MA)测定RNA浓度。使用不含RNAase的DNase I(Qiagen,Valencia,CA)或DNA-free(Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)根据制造商操作规程去除DNA。使用2100BioAnlyzer(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)来确定RNA的完整性，或者在溴化乙锭染色的1.2％琼脂糖凝胶中使500ng的总RNA进行电泳并在UV光下可视化以确保提取后的RNA的质量。使用IQ SYBR Green Supermix或SsoFast EvaGreenSupermix(Biorad,Hercules,CA)进行qPCR反应。所有反应的引物浓度在0.2μM和0.3μM之间。对于每个RNA运行两个技术重复。使用来自栽培品种Fayette或Williams 82的cDNA遵循3-4步骤、3-5倍稀释制成qPCR引物对的效率曲线。扩增后，运行解链曲线(melt curve)程序。为确保qPCR的荧光信号不是DNA的结果，100ng的RNA提取物与引物直接加入到IQ SYBR Green Supermix或SsoFastEvaGreen Supermix中。如果在32-35个循环后没有检测到CT值，则DNA污染被认为是可以忽略不计。使用已知cDNA样本并行运行对照反应。对于在Rhg1基因的转录本丰度使用引物X-X测量。一共有六个引物对作为参考基因进行测试(EF1B,SKIP16,UNK2,ACT11,UNK1,TIP41)(表4中的39-50)。Hu,R.B.,C.M.Fan,H.Y.Li,Q.Z.Zhang和Y.F.Fu,Evaluation of putative reference genes for gene expressionnormalization in soybean by quantitative real-time RT-PCR.Bmc Molecular Biology,2009.10:p.12。使用Bestkeeper分析验证参考引物。Pfaffl,M.W.,A.Tichopad,C.Prgomet和T.P.Neuvians,Determination of stable housekeeping genes,differentiallyregulated target genes and sample integrity:BestKeeper-Excel-based tool usingpair-wise correlations.Biotechnology Letters,2004.26(6):p.509-515。引物对SKP16和TIP41被选定并在随后的实验中使用。与携带基因沉默或基因表达构建体的载体类似地，表达空载体构建体的转基因根作为对照包含在实验中并用于将基因表达标准化。如果CT值是>35，则结果被认为是在检出限中(即，对于Glyma18g02600转录本)。

DNA重复接合处分析

使用PCR(表4中的81、82)和来自SCN抗性栽培品种Fayette、Hartwig、Newton以及SCN易感性栽培品种Williams 82、Essex、Thorne和Sturdy的大豆基因组DNA证实重复接合处的存在。如前述进行DNA提取和PCR。通过研究与已知植物逆转录转座子相似的序列来调查逆转录转座子对Rhg1基因座进化的可能影响。与Ty1/copia样逆转录转座子RTvr1和RTvr2的5'和3'长末端重复(LTR)区具有75％同一性的185bp序列存在于400bp的rhg1-b复制接合处内。

统计分析

通过ANOVA使用Minitab(v.14)通过General linear Model和TukeySimultaneous Test分析数据。

福斯质粒文库构建

从USDA大豆种质收集获得大豆植物引种(Plant Introduction)(PI)88788的种子。植物生长在设定为18/6小时(日/夜)的光周期、23/20℃(日/夜)和50％的相对湿度的生长室1-2周。对每个品系从6-15个个体中收集嫩叶组织。使用西曲溴铵(CTAB)提取基因组DNA。植物样本在液氮中研磨成细粉末，转移到20ml的CTAB提取缓冲液中(2％CTAB100mM Tris pH 9.5、1.4M NaCl、1％PEG6000、20mM EDTA、2％聚乙烯吡咯烷酮、2.5％β-巯基乙醇)，并放置在65℃下1小时。温育后，等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，pH 6.7)加入到该管中，然后在10℃在8,000g离心10分钟。水相(上)转移到新管中，将等体积的氯仿：异戊醇(24：1)加入到水相中并离心。然后，将水相(上)转移到新的试管中，并且将0.7体积的异丙醇加入到水相中。充分混合后，将水相离心，将沉淀(pellet)重悬于70％EtOH中，7,500g离心10分钟。离心后，将沉淀重新悬浮于100ul的TE(10mM Tris pH 7.5,1mM EDTA)中。使用RNAase A通过在20ug/ml的RNAase A在37℃孵育1小时来处理DNA。使用CopyControl^TM福斯质粒文库生产试剂盒(Epicentre,Madison,WI)按照制造商的操作规程构建PI88788的福斯质粒文库。简言之，20μg尺寸分馏的DNA用于末端修复。DNA的35-45kb片段池被克隆在pCC1FOS^TM载体中。使用MaxPlax^TM Lambda Packaging Extracts来包装连接后的DNA，并将其转化至噬菌体T1抗性的EPI 300^TM-T1^R大肠杆菌株中。

福斯质粒克隆测序和拼接(assembly)

通过基于PCR的池筛选使用基于Williams 82参考序列的rhg1-b间隔(interval)的引物鉴定5个候选的福斯质粒克隆。一旦确认了末端序列匹配参考大豆基因组序列的预期区域，就使用Roche 454/GS FLX+系统(Roche)和Illumina MiSeq(Illumina)两者进行测序。对于454/GS FLX+，1-3ug的福斯质粒DNA用于制造末端配对的测序文库。文库构建后，条形码(barcoded)文库池被加载到测序流(flow)细胞的一条通道(lane)中并测序。平均读数长度为463bp。从454/GS FLX+生成的读数(read)数目如下：在图2A的福斯质粒克隆#1：10,865、#2：6,271、#3：6,648、#4：6,520和#5：9,390。使用Phrap/Cross_match(www.phrap.org)和CAP3拼接所述读数。Huang,G.Z.,R.Allen,E.L.Davis,T.J.Baum和R.S.Hussey,Engineering broad root-knot resistance in transgenic plants by RNAi silencing of aconserved and essential root-knot nematode parasitism gene.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,2006.103(39):p.14302-14306。对于MiSeq，使用0.3-2ug的DNA来制备测序文库。平均DNA片段尺寸为550bp(范围从430至720bp)。使用TruSeq SBS测序试剂盒版本1对于该片段的每个末端进行154次循环，并用Casava1.8(传递管道(pipeline)1.8)进行分析。整个读数中，对每个碱基(base)的平均质量得分超过30。由MiSeq生成的读数数目如下：在图2A的福斯质粒克隆#1：1,067,403、#2：814,728、#3：1,156,784、#4：1,091,852和#5：946,028。ABySS用于拼接来自MiSeq的读数。Simpson,J.T.,K.Wong,S.D.Jackman,J.E.Schein,S.J.M.Jones和I.Birol,ABySS:A parallel assembler for short read sequence data.Genome Research,2009.19(6):p.1117-1123。使用Geneious使结果可视化。使用桑格引物步移(Sanger primerwalking)对均聚序列和其它有问题的区域进行手动测序。

在复制区的全基因组鸟枪测序和读数深度

使用Illumina技术进行大豆育种品系LD09-15087a(具有来自PI88788的rhg1-b的接近等基因系(NIL))的全基因组鸟枪测序。在伊利诺斯大学生物技术中心利用Illumina HiSeq2000仪器使用100bp末端配对测序对1.5ug的基因组DNA进行测序。用于大豆全基因组鸟枪测序文库的DNA片段尺寸为600bp；所述文库加载到流动细胞的一个通道中，并使用第3版的测序试剂盒和Casava 1.8(传递管道1.9)进行测序。生成312,909,668读数，在所有位置的平均质量评分是30或更高(约28×1.1gb大豆基因组的覆盖)。为了检查复制区内的覆盖深度，来自测序的读数与Glyma1版本的大豆基因组拼接比对。具有配对末端选项(PE 600,120)的Novoalign(v 2.08.01)(http://www.novocraft.com)用于将读数与参考基因组进行比对。大约95.1％的读数与参考序列进行比对。从BAM文件使用SAMtools(V 0.1.18)计算与靶间隔比对的读数数目。靶间隔如下：在图5B“区块”：31.2kb区(18号染色体上1,632,225-1,663,455)、“区块-1”：目的区上游的相同尺寸区，和“区块+1”：目的区下游的相同尺寸区。使用BLASTN来鉴定11号染色体上的同源区(在图5B“区块”：37,392,345-37,434,356bp)和2号染色体上的同源区(“区块”：47,772,323-47,791,521bp)。类似的方法被用于大豆NAM亲本序列数据。表5显示了所述四个基因的氨基酸序列。

表5：Glyma18g2580、Glyma18g2590、Glyma18g2600和Glyma18g2610的氨基酸序列。

>Glyma18g02580.1|PACid:16307711(SEQ ID NO:1)

MSPAAGVSVPLLGDSKGTPPPASVPGAVFNVATSIVGAGIMSIPAIMKVLGVVPAFAMILVVAVLAELSVDFLMRFTHSGETTTYAGVMREAFGSGGALAAQVCVIITNVGGLILYLIIIGDVLSGKQNGGEVHLGILQQWFGIHWWNSREFALLFTLVFVMLPLVLYKRVESLKYSSAVSTLLAVAFVGICCGLAITALVQGKTQTPRLFPRLDYQTSFFDLFTAVPVVVTAFTFHFNVHPIGFELAKASQMTTAVRLALLLCAVIYLAIGLFGYMLFGDSTQSDILINFDQNAGSAVGSLLNSLVRVSYALHIMLVFPLLNFSLRTNIDEVLFPKKPMLATDNKRFMILTLVLLVFSYLAAIAIPDIWYFFQFLGSSSAVCLAFIFPGSIVLRDVKGISTRRDKIIALIMIILAVVTSVLAISTNIYNAFSSKS*

>Glyma18g02590.1|PACid:16307712(SEQ ID NO:2)

MADQLSKGEEFEKKAEKKLSGWGLFGSKYEDAADLFDKAANCFKLAKSWDKAGATYLKLASCHLKLESKHEAAQAHVDAAHCYKKTNINESVSCLDRAVNLFCDIGRLSMAARYLKEIAELYEGEQNIEQALVYYEKSADFFQNEEVTTSANQCKQKVAQFAAQLEQYQKSIDIYEEIARQSLNNNLLKYGVKGHLLNAGICQLCKEDVVAITNALERYQELDPTFSGTREYRLLADIAAAIDEEDVAKFTDVVKEFDSMTPLDSWKTTLLLRVKEKLKAKELEEDDLT*

>Glyma18g02610.1|PACid:16307714(SEQ ID NO:3)

MRMLTGDSAADNSFRFVPQSIAAFGSTVIVEGCDSARNIAWVHAWTVTDGMITQIREYFNTALTVTRIHDSGEIVPARSG

>Glyma18g02600.1|PACid:16307713(SEQ ID NO:4)

MVSVDDGIVNPNDEIEKSNGSKVNEFASMDISATQKSYLNSEDPQRRLQGTLISSSVTNRINFLKFGSASAKFKRLATERDQVSISVPSPRSKSLRSRFSGMFAQKLDWASVKKMCMEWIRNPVNMALFVWIICVAVSGAILFLVMTGMLNGVLPRKSKRNAWFEVNNQILNAVFTLIPNDISSLRKVYCKNVTYKPHEWTHMMVVVILLHVNCFAQYALCGLNLGYKRSERPAIGVGICISFAIAGLYTILSPLGKDYDCEMDEEAQVQITASQGKEQLREKPTEKKYSFASKDQQRVVENRPKWSGGILDIWNDISLAYLSLFCTFCVLGWNMKRLGFGNMYVHIAIFMLFCMAPFWIFLLASVNIDDDNVRQALAAVGIILCFLGLLYGGFWRIQMRKRFNLPAYDFCFGKPSASDCTLWLPCCWCSLAQEARTRNNYDLVEDKFSRKETDTSDQPSISPLAREDVVSTRSGTSSPMGSTSNSSPYMMKTSSSPNSSNVLKGYYSPDKMLSTLNEDNCERGQDGTMNPLYAQK*

Fiber-FISH

将大豆细胞核裂解以释放出大量的染色体段，以及与更标准的FISH方法相反，将染色体段固定于显微镜载玻片并杂交到荧光标记的DNA探针之前，将染色体段浓缩以产生延伸的DNA纤维。从Williams 82、Peking和Fayette的快速增长的植物中收集嫩叶组织。根据操作规程进行核分离、DNA纤维制备和fiber-FISH。Jackson,S.A.,M.L.Wang,H.M.Goodman和J.Jiang,Application of fiber-FISH inphysical mapping of Arabidopsis thaliana.Genome,1998.41(4):p.566-72。使用核酸外切酶SmaI(New England Biolabs,Ipswich,MA)来消化跨越来自PI88788的rhg1-b重复的福斯质粒克隆。在0.7％凝胶中分离限制性消化的产物，并使用Qiaex II凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)分离出来。用生物素-16-UTP或地高辛-11-dUTP(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)使用标准的切口平移反应来标记DNA探针。使用Meta Imaging Series 7.5软件加工fiber-FISH图像。使用AdobePhotoshop CS3软件加工图像的最终对比度。使用3.21kb/μm的转换率将Fiber-FISH信号的细胞学测量转变成千碱基。

转录本分析

为了证实在Rhg1的转录本注释，对Glyma18g02580(表4中的95)、Glyma18g02590(表4中的87-90)和Glyma18g02610(表4中的91-94)使用SMARTerRACE cDNA试剂盒根据制造商的操作规程(ClonTech,Mountain View,CA)进行cDNA末端的快速扩增(RACE)PCR。RACE之后，如前所述，PCR产物被TA克隆到pCR8/GW/TOPO。如所述对随机选择的菌落进行测序(表4中的76、77)以确认个体转录本的5'和3'末端。为检测潜在转录本亚型，使用标准方法进行Northern分析。生成用于Glyma18g02570的探针(表4中的83、84)。还通过来自cDNA的PCR，使用在重复接合处上游的最强预测外显子中2570的反向引物和正向引物，证实不存在源自31.2kb的重复接合处的截断Glyma18g02570转录本(表4中的85、86)。Hebsgaard,S.M.,P.G.Korning,N.Tolstrup,J.Engelbrecht,P.Rouze和S.Brunak,Splice site prediction in Arabidopsis thaliana pre-mRNA by combininglocal and global sequence information.Nucleic Acids Research,1996.24(17):p.3439-3452。使用qPCR的转录本丰度的研究还表明，没有由重复的DNA插入产生的Glyma18g02570样转录本。使用引物(表4中的25、26)测量Glyma18g02570转录本丰度，所述引物扩增最后两个外显子并因此应扩增参考基因组(全长；Williams 82样)Glyma18g02570转录本以及从跨越重复接合处的DNA转录的可能的杂交Glyma18g02570转录本。如果重复的DNA产生可替代的转录本，这些引物将从具有重复的基因型扩增出其它产物。然而，使用Glyma18g02570引物25和26没有检测出SCN抗性和SCN易感性品种之间在转录本丰度上的差异。

蛋白质结构预测和比较

对预测的Glyma18g02610基因产物的蛋白质结构进行建模，使用默认设置的Phyre2确定具有最同源结构的蛋白，Kelley,L.A.和M.J.E.Sternberg,Protein structureprediction on the Web:a case study using the Phyre server.Nature Protocols,2009.4(3):p.363-371。

甲基化分析

使用甲基化特异性内切酶McrBC、或者甲基化敏感性内切酶HpaII和随后的PCR，分析基因座特异的DNA甲基化。McrBC(New England Biolabs,Ipswich,MA)与以不依赖序列的方式消化具有甲基化胞嘧啶的DNA，而未甲基化的DNA不被消化。HpaII(New England Biolabs,Ipswich,MA)在识别序列CCGG处消化DNA，但HpaII的核酸内切酶活性被胞嘧啶甲基化所阻止。使用制造商的操作规程和600-700ng的DNA进行限制性消化。通过将相同量的DNA加入到没有限制性酶的反应缓冲液中来设立对照反应。使用和不使用限制酶的样本于37℃温育90分钟，并在65℃加热20分钟灭活。0.8％溴化乙锭染色凝胶中可视化DNA以确保DNA消化。消化的和对照的DNA样本两者随后用于利用GoTaq Flexi DNA聚合酶(Promega,Madison WI)的PCR中。对于用McrBC处理的DNA，在PCR之后，跨越甲基化DNA的PCR引物不会产生预期产物，因为模板DNA将被McrBC消化。没有甲基化的或没有用所述酶处理过的DNA得到预期尺寸的产物。对于用HpaII处理的DNA，横跨DNA序列CCGG(其中胞嘧啶也被甲基化)的PCR引物得到预期尺寸的PCR产物。没有甲基化的DNA序列CCGG被HpaII切割，没有得到PCR产物。在没有HpaII的缓冲液中孵育的DNA得到预期的PCR产物。对于引物细节和结果参见附录F中的表格和图。

Western印迹分析

使用Western印迹和免疫检测方法(Ausubel et al.1997)测定蛋白尺寸和丰度。简言之，通过将冷冻根组织匀质化从转基因大豆根提取蛋白，并以1:1w/v比例将所述材料重新悬浮在2x Tricine样本缓冲液(0.1M TrisCl/0.3％SDS pH6.8、24％甘油、8％SDS、0.2M DTT)。在Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝胶(9.8％分离胶、3.9％浓缩胶)中使用电泳在Biorad Mini Protean3盒(Biorad,Hercules CA)中分离相等体积的每个蛋白质样本。将样本在35伏分离大约一小时，然后在160伏分离另外1小时。将所述凝胶移至转移盒和含水中，转移到Protran硝基纤维素膜(Whatman,Piscataway,NJ)。在室温下在80伏进行转移一个小时。转移之后，使用在5％乙酸中的0.1％丽春红S((Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)对膜进行染色，以染色总蛋白并进行成像。在ddH₂0进行丽春红S脱色，在具有5％牛奶的TBST(20mM TrispH7.5、8g/L NaCl、0.1％Tween)中在4℃过夜来封闭所述膜。新的在TBST中的5％牛奶加入到所述膜中，并放置在摇床上在室温下进行30分钟。将所述膜与直接缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的HA一级抗体以1：1000的浓度在5％牛奶TBST中孵育90分钟。在TBST中于室温下在摇床上洗涤膜3次，每次20分钟。根据制造商操作规程使用Supersignal West Dura Extended Duration Substrate(ThermoScientific,Waltham,MA)ECL试剂盒以检测在膜上的HA-HRP抗体。将所述膜曝光至CL-Xposure薄膜(Thermo Scientific,Waltham,MA)并显影。

Claims

1.一种增加植物对线虫抗性的方法，所述方法包括增加多核苷酸的表达、改变多核苷酸的表达模式或增加多核苷酸的拷贝数，所述多核苷酸在植物的细胞中编码Glyma18g02580多肽、Glyma18g02590多肽或Glyma18g02610多肽、与SEQID NO:1(2580)、SEQ ID NO:2(2590)、SEQ ID NO:3(2610)、SEQ ID NO:5(2590-88788)、SEQ ID NO:6(2590-Peking)具有90％或更高同一性的多肽或任何前述多肽的同源物、功能变体或其组合，其中在所述植物的细胞中增加的多核苷酸表达增加了所述植物对线虫的抗性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达通过植物的遗传转化来增加。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述植物选自大豆、糖甜菜、土豆、玉米、豌豆和菜豆。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在所述植物根的细胞中增加所述表达。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过增加固有多核苷酸的表达来增加所述多肽的表达。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过将构建体引入所述植物的细胞中来增加所述多肽的表达，所述构建体包含与编码所述多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过将转基因并入所述植物中来增加所述多肽的表达，所述转基因包含与编码所述多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过引入编码Glyma18g02580多肽、Glyma18g02590多肽和Glyma18g02610多肽中的至少两个的多核苷酸的一个或多个拷贝来增加所述多肽的表达。

9.根据权利要求8所述的方法，其中将所述拷贝引入植物的Rhg1基因座。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸的至少三个拷贝被引入到所述植物中。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸的至少十个拷贝被引入到所述植物中。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中Glyma18g02580多肽、Glyma18g02590多肽和Glyma18g02610多肽的表达增加。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括增加多核苷酸的表达，或改变多核苷酸的表达模式，所述多核苷酸编码Glyma18g02600多肽或与SEQID NO:4(02600)具有90％或更高同一性的多肽。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述植物与对照植物相比具有对胞囊线虫、或大豆胞囊线虫(SCN)增加的抗性。

15.根据权利要求14所述的方法，其中通过植物来测量增加的抗性，所述植物与在类似生长环境中生长的对照植物相比具有更低百分比的发育超过J2阶段的侵入线虫、在根上更低速率的胞囊形成、暴露于线虫的植物减少的线虫雌性指数、胞囊内减少的SCN卵产生、每个植物减少的整体SCN卵产生、以每个植物为基础或每生长面积为基础的大豆种子的更高产量。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中暴露于线虫后所述植物的线虫雌性指数低于对照植物的线虫雌性指数。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中在表5中提供的源自PI88788-、PI437654-、或Peking-衍生来源的序列用于取代Williams 82序列。

18.一种构建体，其包含与多核苷酸可操作地连接的启动子，所述多核苷酸编码含有SEQ ID NO:1的Glyma18g02580多肽，含有SEQ ID NO:2、5或6的Glyma18g02590多肽、含有SEQ ID NO:3的Glyma18g02610多肽、或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的多肽、或任何前述多肽的同源物或功能部分、或其组合。

19.根据权利要求18所述的构建体，其中所述启动子是植物启动子。

20.根据权利要求18或19所述的构建体，其中所述多核苷酸编码所述多肽中的全部三个。

21.根据权利要求18或19所述的构建体，其中所述多核苷酸编码所述多肽中的至少两个。

22.根据权利要求18至21中任一项所述的构建体，其中所述多核苷酸还编码Glyma18g02600多肽。

23.一种转基因细胞，其包含编码能够增加对线虫抗性的多肽的多核苷酸，所述多肽与含有SEQ ID NO:1的Glyma18g02580多肽，含有SEQ ID NO:2、5或6的Glyma18g02590多肽，含有SEQ ID NO:3的Glyma18g02610多肽具有至少90％同一性、或所述多肽是与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的多肽、或其同源物或功能部分或其组合。

24.根据权利要求23所述的转基因细胞，其中所述多核苷酸编码选自Glyma18g02610、Glyma18g02590和Glyma18g02580的多肽中的至少两个。

25.根据权利要求23所述的转基因细胞，其中所述多核苷酸至少编码Glyma18g02610多肽、Glyma18g02590多肽、和Glyma18g02580多肽。

26.根据权利要求23至25中任一项所述的转基因细胞，其中所述多核苷酸在所述植物中以至少三个拷贝存在。

27.根据权利要求23至25中任一项所述的转基因细胞，其中所述多核苷酸在所述植物中以至少十个拷贝存在。

28.根据权利要求23至27中任一项所述的转基因细胞，其中所述多核苷酸还编码Glyma18g02600多肽。

29.根据权利要求23至28中任一项所述的转基因细胞，其中所述植物选自大豆、糖甜菜、土豆、玉米、豌豆和菜豆。

30.一种含有根据权利要求23至29中任一项所述的转基因细胞的种子。

31.一种从根据权利要求30所述的种子中生长的植物。

32.一种含有根据权利要求23至29中任一项所述的细胞的转基因植物。

33.一种根据权利要求32所述的转基因植物的部分、后代或无性繁殖体。

34.一种生产对线虫具有增加抗性的转基因植物的方法，所述方法包括将外源多核苷酸引入到大豆植物细胞或其后代，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的Glyma18g02580多肽，与SEQ ID NO:2、5或6具有至少90％同一性的Glyma18g02590多肽，或者与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的Glyma18g02610多肽、或其同源物、功能变体或组合，从而在所述大豆植物的根细胞中增加所述多肽的表达，以及从而所述植物与对照植物相比对线虫具有增加的抗性。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述多核苷酸编码选自Glyma18g02610、Glyma18g02590和Glyma18g02580的多肽中的至少两个。

36.根据权利要求34所述的方法，其中所述多核苷酸至少编码Glyma18g02610多肽、Glyma18g02590多肽和Glyma18g02580多肽。

37.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中多核苷酸还编码Glyma18g02600多肽。

38.根据权利要求34-37中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸在所述植物中以至少三个拷贝存在。

39.根据权利要求34-37中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸在所述植物中以至少十个拷贝存在。

40.根据权利要求34-38中任一项所述的方法，其中所述植物选自大豆、糖甜菜、土豆、玉米、豌豆和菜豆。

41.一种筛选对线虫抗性或易感性的第一植物细胞的方法，所述方法包括：

在第一植物细胞中检测遗传标志物或可选择的标志物，所述遗传标志物或可选择的标志物与胞囊线虫抗性或对胞囊线虫的易感性相关；

预测第一植物细胞对线虫的抗性或易感性。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述遗传标志物是Glyma18g02610、Glyma18g02590或Glyma18g02580中至少一个的启动子、上游区或基因体的甲基化状态。

43.根据权利要求41所述的方法，其中所述遗传标志物是Glyma18g02610、Glyma18g02590、Glyma18g02580、或Glyma18g02600中至少一个的RNA转录本、转录或蛋白表达水平。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述水平在根细胞中测量。

45.根据权利要求41所述的方法，其中所述遗传标志物是鉴定为在抗性品种中以多拷贝存在的31.2kb Rhg1区的Glyma18g02610、Glyma18g02590、Glyma18g02580、Glyma18g02600或任何部分中的至少一个的基因组拷贝数。

46.根据权利要求41所述的方法，其中所述遗传标志物是携带Glyma18g02610和Glyma18g02570之间的重复接合处的基因组DNA段。

47.根据权利要求41所述的方法，其中所述遗传标志物是与线虫接触后或接触时Glyma18g02610、Glyma18g02590、Glyma18g02600或Glyma18g02580中的至少一个的转录或表达水平。

48.根据权利要求41所述的方法，其中所述遗传标志物是Glyma18g02610、Glyma18g02590、Glyma18g02580或Glyma18g02600中的至少一个或在31.2kb Rhg1重复区内的单核苷酸多态性。

49.根据权利要求41所述的方法，其中所述遗传标志物是含有Glyma18g02600、Glyma18g02610、Glyma18g02590或Glyma18g02580中的至少一个的基因组区的多于一个拷贝的存在或不存在。

50.根据权利要求41-49中任一项所述的方法，其中预测步骤包括将第一植物细胞中的标志物与已知抗性或易感性表型的第二植物细胞中的标志物进行比较，其中第二细胞的表型是第一细胞表型的预示。

51.根据权利要求41-50中任一项所述的方法，其中第二植物细胞是SCN抗性的，其是PI88788或Peking、或携带源自PI88788或Peking或Rhg1介导的SCN抗性的其它来源的Rhg1基因座。

52.根据权利要求41-51中任一项所述的方法，其中第二植物细胞是SCN易感性的，其是‘Williams 82’、‘Lee 84’、Essex或携带源自‘Williams 82’、‘Lee 84’、Essex或其它品种的Rhg1基因座，其中Rhg1基因座在介导SCN抗性上比PI88788或Peking的Rhg1基因座更加低效。

53.根据权利要求41-52中任一项所述的方法，其中SCN由rhg1-b控制，其是Race 3SCN、在其Hg型命名中缺少“2”命名的SCN Hg型、或者在其Hg型命名中缺少“1”命名的SCN Hg型。

54.根据权利要求41-53中任一项所述的方法，其中检测包括扩增所述标志物或所述标志物的部分以产生扩增产物；以及确定所述扩增产物的DNA序列的全部或部分；或使用对限制性内切酶的不同敏感性、等位基因特异性杂交分析、等位基因特异性PCR、高密度核苷酸阵列分析、定量PCR、Northern印迹分析、微卫星分析、ELISA或Western印迹分析来评估所述标志物。

55.根据权利要求41-54中任一项所述的方法，其中所述预测用于选择抗性植物细胞用于开发抗性大豆品系。

56.根据权利要求41-54中任一项所述的方法，其中所述预测用于选择抗性植物细胞用于开发抗性糖甜菜、土豆、玉米、豌豆或菜豆。

57.一种增加植物对线虫抗性的方法，所述方法包括在细胞中表达多核苷酸，所述多核苷酸编码SEQ ID NO:1的Glyma18g02580多肽，SEQ ID NO:2、5或6的Glyma18g02590多肽，SEQ ID NO:6的Glyma18g02610多肽、与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有90％或更高同一性的多肽、或任何前述多肽的同源物、功能变体或组合；以及将所述多肽或含有所述多肽的细胞应用到所述植物、植物种子、或种子可被种植的土壤，其中所述应用增加了所述植物对线虫的抗性。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述多核苷酸编码Glyma18g02610多肽、Glyma18g02590多肽或Glyma18g02580多肽中的至少两个。

59.根据权利要求57所述的方法，其中所述多核苷酸编码Glyma18g02610多肽、Glyma18g02590多肽和Glyma18g02580多肽。

60.根据权利要求57-59中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸还编码Glyma18g02600多肽。