BR112014029020A2 - resistência mediada do rhg1 ao nematóide de cisto da soja - Google Patents

Abstract

  RESISTÊNCIA MEDIADA POR RHG1 PARA NEMATÓIDE DE CISTO DA SOJA. Métodos para aumentar a resistência das plantas, em especial a soja, para nematóides, em especial, nematoides de cisto da soja, são providos neste documento. Os métodos incluem o aumento da expressão de Glyma18g02580, Glyma18g02590 e/ou Glyma18g2610 em células de uma planta e, em particular, em células das raízes de uma planta para aumentar a resistência das células de plantas e plantas de nemátodos. Os métodos incluem o aumento da expressão utilizando promotores constitutivos ou através do aumento do número de cópias dos polinucleótidos. Construções para expressar estes polipéptidos, células transgênicas, plantas transgênicas e métodos para gerar os mesmos também são providas. Métodos para classificação de células de plantas para resistência ou susceptibilidade aos nematóides também são providos.

Description

RESISTÊNCIA MEDIADA POR RHG1 PARA NEMATÓIDE DE CISTO DA SOJA

REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. 61/646.017, depositado em 11 de maio de 2012, e Pedido de Patente Provisória dos Estados Unidos No. 61/676.854, depositado em 27 de julho de 2012, e Pedido Utilitário dos Estados Unidos No. 13/843,447, depositado em 15 de março de 2013, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

DECLARAÇÃO SOBRE PESQUISA PATROCINADA PELO GOVERNO FEDERAL

[0002] Esta invenção foi desenvolvida com o apoio do governo, com os números de subvenção 06- CRHF-0-6055 e 10 CRHF-0-6055 concedido pelo USDA/NIFA. O governo tem certos direitos sobre a invenção.

LISTAGEM DA SEQUÊNCIA

[0003] Uma listagem da sequência acompanha este pedido e aqui incorporada por referência na sua totalidade. A listagem da sequência foi depositada com o pedido como um arquivo de texto em 13 de maio de 2013.

HISTÓRICO

[0004] Nematóide de cisto da soja (NCS) é atualmente a doença economicamente mais prejudicial para a produção de soja dos Estados Unidos na maioria dos anos. As estimativas sugerem que NCS responde por mais de $ 700 milhões de redução da produção de soja nos Estados Unidos anualmente. NCS também impacta seriamente a produção de soja em outros países, como o Brasil, Argentina e China. Variedades de soja com maior resistência à NCS foram identificadas, mas a resistência é quantitativa e a eficácia varia de acordo com genótipos de nematoides; portanto, o uso de variedades mais resistentes ainda pode resultar em perda de produtividade da soja devido ao NCS.

[0005] A base genética para a resistência ao NCS foi parcialmente definida, para o nível de loci genética, e as fontes adequadas do locus de soja Rhg1 contribuem de forma significativa para a resistência ao NCS. Antes do presente trabalho, os genes específicos e produtos de genes que controlam a resistência NCS mediada por Rhg1 não foram documentados com sucesso.

SUMÁRIO

[0006] Métodos para aumentar a resistência de uma planta aos nemátodos, em particular a resistência cada vez maior de soja ao NCS são aqui providos. Vários produtos de genes do locus de rhg1-b são identificados e a relação entre os produtos de genes com a resistência ao NCS na soja é demonstrada. Estes genes e produtos de genes podem também aumentar a resistência de outras plantas, incluindo, mas não se limitando a, beterraba, batatas, milho, ervilhas, feijões ou de nematóides, em particular a nematóides de cisto.

[0007] Em um aspecto, métodos para aumentar a resistência de uma planta aos nematóides, adequadamente nematóides que formam cisto, adequadamente NCS, aumentando a expressão ou alterando o padrão de expressão número de cópias do gene de um polinucleótido que codifica um polipéptido Glyma18g02580, um polipéptido Glyma18g02590, um polipéptido Glyma18g02610, um polipeptídeo que possui 90% ou mais de identidade com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6, ou SEQ ID NO: 3, ou um homólogo ou variante funcional de qualquer um dos polipéptidos acima referidos em células da planta são providos. O uso de combinações dos polipéptidos é visionado. Os polinucleótidos que codificam estas sequências polipeptídicas podem ser derivados de 82 Williams, PI88788 ou Peking (PI 548402), variedades de soja ou outras fontes de polinucleótidos. As sequências polipeptídicas são fornecidas e os polimorfismos entre as sequências em diferentes variedades são anotados. O aumento da expressão dos polinucleótidos em células da planta aumenta a resistência da planta ao nematoides. Adequadamente, a expressão é aumentada em células da raiz da planta. Adequadamente, a expressão de, pelo menos, dois dos polinucleótidos é aumentada. Adequadamente, a expressão de, pelo menos, três dos polinucleótidos é aumentada.

[0008] Em outro aspecto, métodos para aumentar a resistência de uma planta aos nematóides, adequadamente nematoides que formam cisto, adequadamente NCS alterando (aumentando ou diminuindo) a expressão em células na raiz da planta de um polipéptido idêntico ou semelhante ao, pelo menos, uma parte de SEQ ID NO: 1 de Glyma18g02580, SEQ ID NO:2, 5 ou 6 do Glyma18g02590 ou SEQ ID NO: 3 de Glyma18g02610 em relação à expressão nas células da raiz da planta de um polipéptido cuja expressão pode ser utilizada como um controle, tais como Glyma11g35820, são providos. Adequadamente, a expressão de, pelo menos, dois dos polinucleótidos é aumentada. Adequadamente, a expressão de, pelo menos, três dos polinucleótidos é aumentada. Alternativamente ou adicionalmente, a expressão dos polinucleótidos que codificam os polipéptidos de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g2580 também pode ser aumentada.

[0009] Em outro aspecto, métodos para identificar plantas que exibem níveis úteis de resistência da planta aos nematoides adequadamente nematoides que formam cisto, adequadamente NCS alterando

(aumentando ou diminuindo) a expressão em células na raiz da planta de um polipéptido idêntico ou semelhante ao, pelo menos, uma parte de SEQ ID NO: 1 de Glyma18g02580, SEQ ID NO:2, 5 ou 6 do Glyma18g02590 ou SEQ ID NO: 3 de Glyma18g02610 em relação à expressão nas células da raiz da planta de um polipéptido cuja expressão pode ser utilizada como um controle, tais como Glyma11g35820, são providos. Adequadamente, a expressão de pelo menos dois dos polipéptidos está a um nível mais elevado do que em plantas que são mais susceptíveis ao NCS. Adequadamente, a expressão de, pelo menos, três dos polinucleótidos está em um nível mais elevado. Alternativamente ou adicionalmente, a expressão dos polinucleótidos que codificam os polipéptidos de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g2580 também pode estar a um nível mais elevado.

[00010] Em ainda outro aspecto, uma construção que compreende um promotor ligado operacionalmente a um polinucleótido que codifica pelo menos uma parte do polipéptido Glyma18g02580 compreendendo SEQ ID NO: 1, um polipéptido Glyma18g02590 compreendendo SEQ ID NO: 2,5 ou 6,, um polipéptido Glyma18g02590 compreendendo SEQ ID NO: 3 ou um polipéptido tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou um homólogo ou parte funcional de qualquer um dos polipéptidos acima referidos ou combinações destes são providos. A construção pode ser utilizada para gerar plantas ou sementes transgênicas.

[00011] Em ainda outro aspecto, uma planta transgênica que compreende um polinucleótido exógeno ou não-nativo que codifica pelo menos uma parte do polipéptido Glyma18g02580 compreendendo SEQ ID NO: 1, um polipéptido Glyma18g02590 compreendendo SEQ ID NO: 2,5 ou 6,, um polipéptido Glyma18g02590 compreendendo SEQ ID NO: 4, um polipéptido Glyma18g02610 compreendendo SEQ ID NO: 3 ou um polipéptido tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, ou um homólogo ou uma parte funcional de qualquer um dos polipéptidos acima mencionados ou combinações destes, ou os polipéptidos aqui descritos aqui de PI88788 ou fonte Peking-fonte são providos. A planta transgênica aumentou a resistência aos nematóides, adequadamente nematóides que formam cisto, adequadamente NCS. Adequadamente, a planta transgênica compreende pelo menos um polinucleótido que codifica, pelo menos, dois ou, pelo menos, três dos polinucleótidos que codificam os polipéptidos Glyma18g02580, Glyma18g02590, e Glyma18g02610.

[00012] Em outro aspecto, uma célula transgênica compreendendo um polinucleótido que codifica um polipéptido capaz de aumentar a resistência aos nematóides, adequadamente nematóides que forma cisto, adequadamente NCS é provido. O polipéptido inclui pelo menos uma parte de um polipéptido tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou sequências semelhantes derivadas de PI88788 (tal como SEQ ID NO: 5) ou fonte Peking (tal como SEQ ID NO: 6) ou combinações destes. Adequadamente, o polipéptido inclui pelo menos dois ou três polipéptidos tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:

3.

[00013] Em outro aspecto, métodos de produção de uma planta transgênica com a introdução de um polinucleótido exógeno que codifica pelo menos uma parte de um polipéptido Glyma18g02580 possuindo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 1 polipéptido Glyma18g02590 tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 2, 5 ou 6, ou polipéptido Glyma18g02610 tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 3, ou homólogos ou combinações destes são providos. A planta transgênica tem expressão aumentada de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 em uma célula de uma raiz da planta. A planta transgênica aumentou a resistência aos nematóides, adequadamente nematóides que formam cisto, adequadamente NCS em comparação a uma planta de controle. Adequadamente, a planta transgênica tem expressão aumentada pelo menos dois dos polinucleótidos ou três dos polinucleótidos que codificam os polipéptidos Glyma18g02610, Glyma18g02590, e Glyma18g02580.

[00014] Em ainda outro aspecto, métodos para identificar moléculas que interagem com o locus Rhg1, transcrições Glyma18g02610, Glyma18g02590 e/ou Glyma18g02580, ou polípéptidos Glyma18g02610, Glyma18g02590 e/ou Glyma18g02580 são providos. Os métodos incluem a detecção de moléculas capazes de se ligarem ao locus de Rhg1, transcrições de Glyma18g02610, Glyma18g02590 Glyma18g02580 RNA, ou polipéptidos Glyma18g02610, Glyma18g02590 ou Glyma18g02580.

[00015] Em ainda outro aspecto, são providos métodos de identificação do fenótipo de resistência ou a susceptibilidade de uma planta aos nematoides de cisto. O método inclui a detecção de um marcador genético associado à resistência ou susceptibilidade do nematoide do cisto em uma primeira célula de planta e comparando o marcador genético na primeira célula da planta com o marcador genético em uma segunda célula vegetal com um fenótipo de resistência ou susceptibilidade conhecido ou uma célula de planta de controle. O marcador genético pode ser variações na sequência, diferenças de metilação, diferenças de expressão de mRNA, produção discreta de RNA ou outras diferenças aqui identificadas. Adequadamente, o marcador genético é associado com características do locus de Rhg- 1, tais como aqueles descritos neste documento. Adequadamente, o marcador genético é o número de cópias do genoma de pelo menos um dos Glyma18g02600, Glyma18g02610, Glyma18g02590 ou Glyma18g02580 Adequadamente, a planta é soja e os nematóides são NCS.

[00016] Em um aspecto, métodos para aumentar a resistência de uma planta aos nematóides, adequadamente nematóides que formam cisto, adequadamente NCS, aumentando a expressão ou alterando o padrão de expressão número de cópias do gene de um polinucleótido que codifica um polipéptido Glyma18g02610, um polipéptido Glyma18g02590, um polipéptido Glyma18g02580, um polipeptídeo que possui 90% ou mais de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 3, ou um homólogo ou variante funcional ou combinações de qualquer um dos polipéptidos acima referidos em células da planta. Adequadamente, o polinucleótido codifica para pelo menos dois ou todos os três polipéptidos Glyma18g02610, Glyma18g02590 ou Glyma18g02580. Os polipéptidos ou uma célula que codifica para o polipéptido podem então ser aplicados à planta, sementes da planta ou ao solo no qual as sementes podem ser plantadas. A aplicação aumenta a resistência da planta ao nematoides..

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00017] A Figura 1 é uma representação pictórica do ciclo de vida de NCS.

[00018] A Figura 2 é uma representação pictórica de uma estratégia de silenciamento de genes que utiliza sequências artificiais microRNA artificiais para focar um gene de interesse.

[00019] A Figura 3 mostra a existência de três genes em rhg1-b que contribuem para a resistência NCS. A Figura 3A é uma fotografia que mostra raízes infestadas de NCS representativas; cilindro vascular da raiz e nematóides corados com fucsina ácida. Menos nematóides progridem de estágios J2 para J3, J4, macho adulto ou fêmea adulta repleta de ovos (cisto) nas raízes resistentes ao NCS. A Figura 3B é um gráfico que mostra que o desenvolvimento NCS além da fase J2 nas raízes transgênicas da variedade de soja Fayette com o gene silenciado designado, em relação ao controles Williams 82 (resistente ao NCS ) e Fayette não silenciado (resistente ao NCS). O desvio padrão médio ± erro da média. *: Fayette (silenciado) significativamente diferente do Fayette (não silenciado), com base na ANOVA, p <0,05. EV: transformado com o vetor vazio.

[00020] A Figura 4 é um conjunto de gráficos que mostram que o desenvolvimento do nematóide é impactado pelo nível de silenciamento. As Figuras 4Aand 4C mostram que o desenvolvimento do nematóide nas raízes Williams 82 e Fayette foi transformado com o vetor vazio (VV), ou Fayette transformado com o silenciamento das construções (2580RNAi ou ami2590) era dependente do nível de silenciamento. Raízes transgênicas com abundância reduzida de transcrição do alvo (+) exibiram desenvolvimento nematóide semelhante a Williams 82 (suscetível a NCS), enquanto as raízes transgênicas com nível de transcrição não silenciado (-) tiveram desenvolvimento semelhante ao nematóide Fayette (resistente ao NCS). As Figuras 4B e 4D mostram a abundância da transcrição de genes alvo em raízes de (A) ou (C), respectivamente, medidas por qPCR. A Transcrição SKP16 utilizada como referência e normalizada para Fayette-EV. Os resultados da Figura 4B e 4D foram utilizados para colocar as raízes em “bem silenciado” (+) ou “não silenciado adequadamente” (-) categorias mostradas na Figura 4A e 4C. As Figuras 4A e 4B são Glyma18g02580. As Figuras 4C e 4D são Glyma18g02610. As barras representam desvio padrão médio ± erro da média.

[00021] A Figura 5 mostra que uma repetição de 31,2 kb que eleva a expressão dos genes codificados está presente em haplótipos resistentes ao NCS do locus Rhg1. A Figura 5A é um diagrama esquemático de locus de Rhg1 de Williams 82 (parte superior), e cinco inserções fosmid de haplótipo rhg1-b. As sequências de ADN do genoma de referência de soja mostradas para os dois locais designados. Números e ícones de bloco referem-se a genes de soja (por exemplo, Glyma18g02540). Fosmids #3, 4 e 5 carregam os segmentos de genoma rhg1-b que abrangem junções repetidas. A Figura 5B mostra a sequência de junção repetida Rhg1 de quatro fontes diferentes de resistência ao NCS (comparar com referência a sequências do genoma na (Figura 5A). A Figura 5C é um gráfico que mostra o número de leituras de toda a sequência de disparos do genoma, que correspondente à região do genoma de referência mostrado em verde na Figura 5A foi dez vezes maior do que nas regiões adjacentes do genoma para rhg1-b no cromossoma 18 ou para os loci homólogos Rhg1 nos cromossomas 11 e 2. A Figura 5D é um gráfico que mostra que a abundância da transcrição de genes codificados na região de repetições em 31 kb é muito maior em raízes de variedades de soja resistentes ao NCS relativos às variedades suscetíveis ao NCS. O desvio padrão médio ± erro de média mostrado para qPCR; resultados para Glyma18g02600 estavam no limite de detecção

[00022] A Figura 6 mostra a detecção de Fiber-FISH de variação do número de cópias de Rhg1 em linhagens de soja amplamente utilizadas. A Figura 6A é um diagrama esquemático mostrando as duas sondas adjacentes isoladas a partir de um único clone fosmid DNA genômico PI88788 (rhg1-b) cuja inserção se estende por uma junção de repetição, gerando uma sonda de 25,2 kb (etiqueta verde) e uma sonda adjacente de 9,7 kb (etiqueta vermelha) . DNA para sondas de fibra de peixe com rótulos verde e vermelho são mostrados nas regiões de sequências correspondentes de Williams 82. O fragmento de 25,2 kb de haplótipo rhg1-b utilizados para sonda verde era um único fragmento de DNA contínuo que se estende por uma junção de repetição. A Figura 6B mostra uma composição de quatro imagens de fibra de peixe (quatro fibras de DNA) por genótipo, e diagrama de sonda. Padrão alternado de hibridação vermelho e verde em fibras individuais de DNA genômico indica dez e três cópias repetidas diretos do bloco 31 kb em Rhg1 lócus de Fayette (rhg1-b derivado do PI 88788) resistente ao SCN e Peking (PI 548402), respectivamente, e uma cópia por Rhg1 haplótipo no SCN-sensíveis barras Williams 82. Branco = 10 mm, o que corresponde a cerca de 32 kb, utilizando uma taxa de conversão A/mm 3,21 kb.

[00023] A Figura 7 mostra que múltiplas variedades resistentes ao NCS contêm a junção de DNA indicativa de uma repetição dentro do locus Rhg1, e exibem expressão elevada de genes totalmente codificados na repetição. A Figura 7A é uma representação esquemática de iniciadores de PCR utilizados na Figura 7B (ver também a Figura 5). A Figura 7B é uma fotografia de um gel que mostra os resultados de PCR utilizando iniciadores oligonucleotídicos direcionados para fora mostrados na Figura 7A, que correspondem a sequências nas extremidades externas do segmento de 31 kb do locus do Rhg1, que se repete em algumas variedades da soja. R indica resistente a NCS e S indica variedade de soja suscetível à NCS.. Para os iniciadores 81 e 82, ver a Tabela 4. A Figura 7C mostra a Sequência de DNA de 11 variedades resistentes à NCS e revela sequência idêntica para a junção da repetição indicando uma origem compartilhada. A barra vermelha indica junção da repetição (ver também a Figura 5). A Figura 7D é um gráfico que mostra a abundância de transcrição de genes codificados em Rhg1 (normalizado para SKP16), revelando uma expressão elevada de genes codificados totalmente dentro das repetições de Rhg1 de PI 88788 ou fontes Peking, relativas à expressão dos mesmos genes em variedades suscetíveis à NCS. As barras representam desvio padrão médio ± erro da média. Glyma18g02600 é expresso abaixo de 0,01% do SKP16 (CT> 35 ciclos). A Figura 7E é uma análise da mancha de RNA para Glyma18g02570 utilizando RNA colhido de raízes de plantas inteiras de Fayette e Forrest (resistente à NCS) e Williams 82 (suscetível à NCS). * indica a banda correspondente ao tamanho esperado de transcrição de Glyma18g02570 (1,2 kb). A banda em

1,8 kb corresponde à ligação ribossômica não específica. Cultivares Fayette e Forrest (que contêm repetições do segmento de DNA 31kb) mostram o mesmo padrão de bandas de Williams 82 (que contém uma única cópia do segmento de DNA 31kb); nenhuma transcrição alternativa para Glyma18g02570 foi detectada como resultado do DNA repetido em Fayette e Forrest. RACE PCR de plantas que carregam rhg1-b confirmou transcrições de corpo inteiro (a transcrição termina conforme anotado no genoma de referência) para Glyma18g02580, -2.590 e -2.610.

[00024] A Figura 8 é um gráfico que mostra qPCR genes dentro e fora da repetição Rhg1. RNA colhido de raízes de três plantas individuais cultivadas em vasos, 5 dias pós-emergência. Barras cinza escuro são estimadas em linhas de elevado número de cópias com base em gDNA qPCR e cDNA . Barras cinza claro são linhas que contêm baixo número de cópias, que exigem também Rhg4 para a resistência total.

[00025] Figura 9 apresenta exemplo de fotografias de gel e uma tabela que resume muitos experimentos que mostram que as cultivares resistentes e sensíveis têm metilação diferencial de DNA em ou adjacente aos genes na região duplicada, especialmente nas regiões promotoras. Em experiências McrBC, DNA genômico metilado é clivado por McrBC, o que reduz a abundância do produto de PCR, enquanto que nos experimentos Hpall, DNA genômico metilado não é clivado por Hpall e é o ADN não metilado que é clivado, levando a abundância reduzida do produto PCR.

[00026] A Figura 10 é uma fotografia de um Western blot, que mostra que uma versão marcada de epitopo da proteína Glyma18g02610, produzida a partir de um polinucleótido introduzido nas raízes transgênicas, é expresso em raízes transgênicas Williams 82 e Fayette e os produtos são similares em tamanho.

[00027] A Figura 11A é um gráfico que mostra a análise da expressão do gene PCR quantitativo de genes no locus Rhg1 em raízes sensíveis e resistentes que mostram que alguns destes genes não só são mais altamente expressos em cultivares resistentes (como também é mostrado na Figura 11), mas também exibem alguma regulação positiva após a inoculação com NCS.

[00028] A Figura 11B é um gráfico que mostra a análise da expressão do gene PCR quantitativo após o tratamento com jasmonato de metilo ou com água, o que revela que Glyma18g02610 é expressa mais altamente em resposta a níveis elevados de jasmonato de metilo.

[00029] A Figura 12 é um conjunto de fotografias que mostram a coloração histoquímica da expressão GUS do promotor na raiz pilosa Fayette com (B, D, F e H) ou sem (A, C, E, e G) a inoculação de nematoides. A e B mostram Glyma18g02580. C e D mostram Glyma18g02590. E e F mostram Glyma18g02610. G e H mostram Glyma14g06080.

[00030] A Figura 13 provê as sequências de nucleótidos e de aminoácidos para Glyma18g2590 das variedades indicadas.

[00031] A Figura 14 é um esquema gerado por computador da estrutura tridimensional de Glyma18g2590, mostrando os polimorfismos entre as variedades na estrutura.

[00032] A Figura 15 é um gráfico que mostra a elevada resistência à NCS conferida por superexpressão simultânea de múltiplos genes, ao invés da superexpressão de genes individuais da repetição 31 kb rhg1-b. Desenvolvimento de NCS além da fase J2 é relatado para as raízes transgênicas de soja (variedade Williams 82) com superexpressão dos genes individuais designados, ou superexpressando todos os genes codificados dentro da repetição 31 kb (Glyma18g02580, -2.590, -

2.600 e -2.610), relativos aos controles Williams 82 (suscetíveis a NCS) e Fayette (resistente à NCS). Desvio padrão médio ± erro da média para a raízes transformadas com vetor vazio (VV) ou construções de superexpressão de genes (OX). *: Williams 82 - OX diferem significativamente e Williams 82 - VV baseado em ANOVA, p <0,05.

[00033] A Figura 16 é um conjunto de gráficos que expressam que o nativo Fayette Glyma18g02590 alelo em Williams 82 não altera o desenvolvimento NCS. A Figura 16A é um gráfico que mostra o desenvolvimento similar de nematóides em raízes transgênicas de 82 de Williams que expressam vetor vazio (VV), ou Williams 82 expressando o alelo Fayette (b-tipo rhg1) de Glyma18g02590 sob o controle de sequências promotoras de Fayette Glyma18g02590 (2590FayP:: 2590Fay) . Williams 82 transformado com qualquer construção permitiu o avanço de uma maior proporção de nematóides além do estágio J2 em comparação com Fayette-EV. A Figura 16B é um gráfico que mostra a abundância da transcrição para Glyma18g02590 nas raízes da Figura 16A, medido por qPCR. A transcrição SKP16 utilizada como referência; dados normalizados para Williams 82 - EV. As barras na Figura 16A e Figura 16B representam desvio padrão médio ± erro da média.

[00034] A Figura 17 é um gráfico que mostra que qPCR revela elevada abundância de transcrição dos genes projetados em raízes transformadas com a construção da superexpressão simultânea de gene múltiplo da Figura 15, e sem elevação significativa da expressão PR-1. Raízes transgénicas carregadas na construção de múltiplos genes (OX) ou vetor vazio (VV). Resultados similares obtidos no segundo experimento independente com eventos transgênicos diferentes, exceto abundância de PR-1 foram mais similares (mais próximos de 1,0) entre Williams 82 - EV, Fayette-EV e raízes Williams-boi no segundo experimento. As barras representam desvio padrão médio ± erro da média. Os dados para Glyma18g02600 são menos confiáveis para Williams-EV e Fayette-EV, pois seu sinal qPCR estava no limite de detecção qPCR preciso (CT> 33).

[00035] A Figura 18 é um conjunto de gráficos que mostram que a superexpressão de Glyma18g2580, Glyma18g2590 e Glyma18g2610 em combinação pode conferir resistência em uma variedade Williams 82 suscetível.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00036] Métodos de identificação de plantas resistentes ou susceptíveis a nematóides de cisto, tais como o nematóide do cisto da soja (NCS), métodos de avaliação do nível de resistência ou de suscetibilidade de uma planta a nematóides, tais como NCS, métodos para aumentar a resistência de uma planta ou células de plantas aos nematóides de cisto e métodos de geração de materiais de plantas transgênicas, incluindo células transgênicas e plantas, são providos aqui. Além disso, construções incluindo polinucleótidos que codificam os polipéptidos Rhg1 aqui descritos ou homólogos ou suas variantes são aqui providas como SEQ ID NO: 1-6. Plantas transgênicas ou células de plantas transgênicas com maior resistência aos nematóides de cisto, particularmente NCS, carregam um transgene que codifica um polinucleótido derivado de Rhg1 não nativo ou exógeno que codifica os polipéptidos de SEQ ID NOs: 1-6 são aqui proporcionados. Plantas não transgênicas que carregam os polipéptidos ou produzidas para expressar níveis aumentados dos polipéptidos ou polinucleótidos que codificam os polipéptidos são também descritas.

[00037] NCS é causado pelos nematóides Heterodera glycines. O ciclo de vida do nematóide é mostrado na Figura 1. Uma vez que um campo é infestado com este nematóide, não há meios economicamente viáveis de eliminar NCS A atual gestão de NCS muitas vezes centra-se na rotação de culturas e plantio de variedades resistentes à NCS de soja para controlar populações de H. glycines por vários anos, bem como o uso de soja resistente à NCS e/ou tolerante à NCS para facilitar o rendimento aceitável da safra do ano. Profissionais adotaram "Raça" e terminologias do "Tipo Hg" para descrever populações H. glycines de acordo com sua capacidade de superar fontes conhecidas de resistência à NCS da planta.

[00038] Existem várias raças e tipos de Hg e resistência da soja a um tipo podem oferecer pouca ou nenhuma proteção contra outro tipo de nematóide. Além disso, H. glycines são organismos cruzados nos quais as populações locais são geneticamente heterogêneas (e novos genótipos de nematóides podem ser introduzidos), daí as populações locais podem sofrer mudanças na raça ou Hg Tipo de tal forma que a resistência à NCS da planta anteriormente eficaz pode perder a eficácia. Portanto, a capacidade para identificar qual soja é resistentes a quais populações de nematóides H. glycines e uma maior capacidade de produzir geneticamente plantas com resistência aumentada a mais de um tipo de população de nematóides é necessária.

[00039] Soja com resistência aumentada a NCS está disponível e tem sido utilizada em experiências de cruzamento para gerar soja que seja mais resistente à NCS. O locus rhg1 de soja de Peking foi anteriormente identificado, mapeado para uma região do cromossoma 18 (anteriormente conhecido como grupo de ligação G), e um gene em que o locus que codifica um produto com repetições ricas em leucina e um domínio de proteína cinase (quinase LRR) presumivelmente explica o aumento da resistência ao SCN. Em plantas que carregam o lócus rhg1-b derivado de soja PI88788, NCS ainda penetra e inicia a alimentação, mas uma alta percentagem do sincícios não persiste e passam a sequência completa do desenvolvimento de nematóides (muda através dos estágios J3 e J4 até a idade adulta, fertilização sexual e transição do sexo feminino para um cisto cheio de embrião e ambientalmente persistente)

[00040] A base molecular desta resistência parcial à NCS não é compreendida. Apesar de 50 anos de pesquisa em NCS, um patógeno causando centenas de milhões de dólares de perdas econômicas nos EUA anualmente, não houve relatos públicos confirmados de um gene de resistência à NCS clonado de soja antes do pedido de prioridade.

[00041] Além disso, o mapeamento genético fino do locus rhg1, que também é conhecido como o locus rhg1, ou por outras designações mais restritas, tais como rhg1-b, foi concluído em plantas que transportam a fonte PI88788 de Rhg1, e novos marcadores associados com o genótipo de resistência foram identificados. Veja Kim, M., DL Hyten, A.F. Bent e B.W. Diers, 2010. Mapeamento fino do locus de resistência à NCS rhg1-b do genoma da planta PI 88788. 3:81-89, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. PI88788 foi escolhido porque é a fonte de resistência em muitas linhas cruzadas atualmente comercializadas como resistentes a NCS. Estes marcadores estão intimamente ligados com a resistência ou suscetibilidade a NCS e podem ser úteis para identificar ou prever se as linhagens de soja tendem a apresentar um fenótipo resistente à NCS ou sensível à NCS. O mapa refinado do locus rhg1-b do PI88788 sugeriu que o gene LRR-quinase que é muito próximo do locus rhg1-b não realiza contribuições significativas para o fenótipo de resistência à NCS. O estudo de Melito e colaboradores 2010, que utilizou raízes transgênicas expressando transcrições de corpo inteiro ou construções que silenciam parcialmente a expressão de transcritos, também não encontraram nenhuma evidência para apoiar uma função para o rhg1-b proximal Glyma18g02680 LRR-quinase na resistência à NCS. Kim e colaboradores demonstraram que os componentes genéticos rhg1-b associados com a resistência à NCS/fenótipo de susceptibilidade de PI88788 e os seus derivados encontram-se dentro do intervalo cromossómico definido pelas extremidades BARCSOYSSR_18_0090 e BARCSOYSSR_18_0094. O mapeamento genético da estrutura fina mais recente definiu um intervalo para rhg1-b que corresponde a um intervalo de 67 kb carregando 11 genes previstos no genoma sequenciado de NCS-suscetíveis de Williams 82 de soja ADDIN EN.CITE Kim 2010 2389 2389 <key app=\ Veja a Figura 5.

[00042] Neste documento, relatamos a identificação e teste funcional de vários genes no intervalo genético rhg1-b. No locus Rhg1, várias cópias (dez, sete ou três cópias nas variedades estudadas até à data) de um segmento cromossômico que codificam quatro genes identificados no locus Rhg1 estão presentes nas variedades de soja resistentes à NCS, enquanto que apenas uma cópia deste segmento está presente nas variedades suscetíveis à NCS testadas que não possuem alelos Rhg1 derivados de variedades resistentes, como PI88788, PI437654 ou Peking. Veja as Figuras 5 e 6. O silenciamento de qualquer um dos três genes dentro do bloco do gene com cópias múltiplas que utiliza miRNA leva ao aumento da suscetibilidade à NCS nas raízes de soja transgênica. Em raízes transgénicas de uma variedade de soja previamente suscetível à NCS, a superexpressão simultânea de três ou quatro dos genes rhg1-b do bloco de genes de múltiplas cópias leva a um aumento da resistência à NCS. Os genes no bloco são expressos em níveis significativamente mais elevados nas variedades de soja resistentes ao NCS testados. Fatores de trans-atuação em Fayette também não são suficientes para conduzir a expressão elevada de sequência de DNAs que carregam estes 2kb de Glyma18g02590 ou Glyma18g02610 sequência de DNA do promotor, quando estas sequências são integradas em loci diferente rhg1-b em Fayette. Metilação de DNA em vários locais no locus Rhg1 é polimórfico entre linhas resistentes à NCS e susceptíveis à NCS, e isto pode contribuir para as diferenças de expressão de genes que se correlacionam com a resistência à NCS. O número de cópias deste locus de também se correlaciona com os níveis de expressão dos polipeptídeos Glyma18g2580, Glyma18g2590 e Glyma18g2610 e mRNAs para o nível de resistência à NCS. Portanto, a dosagem de gene com base no aumento do número de cópias da região repetida do DNA pode ser um fator chave para mediar um aumento da expressão dos polipéptidos e aumento da resistência à NCS. Muitas partes destes resultados foram relatados em Cook, DE, Lee, TG, Guo, X., Melito, S., Wang, K., Bayless, A., Wang, J., Hughes, TJ, Willis, DK, Clemente , T., Diers, BW, Hudson, ME e Bent, A.F. 2012. Variação do Número de Cópias de Múltiplos Genes no Rhg1 media resistência aos nematóides na soja. Ciência 338:1206-1209 e o material online de suporte associado (Materiais Suplementares) encontrada em www.sciencemag.org/content/suppl/2012/10/10/science.1228746.DC1.html, que são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[00043] O fenótipo de resistência ou a susceptibilidade de uma planta pode ser previsto com precisão valiosa por comparação de um marcador genético na planta com o mesmo marcador genético ou marcador selecionável em uma segunda planta com resistência ou susceptibilidade do fenótipo conhecidas. Assim, os métodos de classificação de uma primeira planta ou célula de planta para resistência ou susceptibilidade aos nematóides de cisto são aqui providos. Os métodos incluem a detecção de um marcador genético ou um marcador selecionável associado com a resistência ao nematoide do cisto ou susceptibilidade a nematóides de cisto na primeira célula da planta e utilizando o marcador para prever a resistência ou a susceptibilidade da primeira planta ou célula de planta aos nematóides. Previsão não significa uma garantia de 100% do fenótipo em relação a resistência ou susceptibilidade da planta aos nematóides de cisto. A etapa de predição pode incluir a comparação do marcador na primeira planta ou célula vegetal com o marcador de uma segunda planta ou célula vegetal com um fenótipo de resistência ou susceptibilidade conhecido. O fenótipo marcador ou genótipo da segunda célula é preditivo do fenótipo de resistência ap nematoide do cisto na primeira célula. A previsão podem ser utilizada para selecionar soja resistente ou células vegetais resistentes para utilização na geração de linhas de plantas resistentes. As plantas incluem mas não estão limitados a açúcar beterrabas, batatas, milho, ervilhas ou feijão.

[00044] Uma planta inclui qualquer parte da planta, incluindo, mas não limitado a um conjunto, planta, uma parte de uma planta, tal como uma parte de um germoplasma raiz, folha, caule, sementes, vagem, flor, célula, tecido ou qualquer planta ou progenia da mesma. Germoplasma refere-se a material genético de um indivíduo ou grupo de indivíduos ou um clone derivado de uma linha,

cultivar, variedade ou cultura. Planta refere-se a plantas inteiras ou partes dos mesmos, incluindo, mas não limitadas a, células vegetais, protoplastos vegetais, células de cultura de tecidos de plantas ou de calos. Por exemplo, a planta de soja refere-se a plantas de soja inteiras ou partes das mesmas, incluindo, mas não limitadas a, células vegetais, protoplastos vegetais, células de cultura de tecidos de plantas ou de calos. Uma célula de planta refere-se a células colhidas a partir de ou derivadas de qualquer parte das plantas ou células de cultura de tecidos ou calos.

[00045] O locus rhg1 é uma região cromossômica identificada como uma região importante para a resistência à NCS. Um locus é uma região cromossômica onde um ou mais determinantes do traço, de genes, ácidos nucleicos, ou marcadores polimórficos estão localizados. Um locus da característica quantitativa (LCQ) refere-se a um locus genético polimórfico onde o gene subjacente controla uma característica que é medida quantitativamente e contém, pelo menos, dois alelos que afetam diferencialmente a expressão de um fenótipo ou genótipo em pelo menos um fundo genético, com o dito locus de contabilidade por parte mas não toda a variação observada na característica fenotípica geral que está sendo avaliada. Um marcador genético é uma sequência de nucleótido ou sequência de aminoácidos que pode ser utilizada para identificar um locus geneticamente ligado, tal como um LCQ. Exemplos de marcadores genéticos incluem, mas não estão limitados a, polimorfismos de base única (PBU), repetições de sequências simples (RSS; ou microssatélites), uma alteração do local de reconhecimento pela enzima de restrição, número de cópia genômica de genes específicos ou sequências alvo ou outras diferenças baseadas sequência entre uma planta suscetível e resistente.

[00046] Os marcadores genéticos ou selecionáveis podem ser detectados utilizando uma variedade de métodos analíticos, incluindo RFLP, AFLP, análise de sequência, análise de hibridação, tais como análise de hibridação específica de alelo, PCR diferencial ou outros métodos tais como aqueles conhecidos aos técnicos na área. A lista de polimorfismos de nucleotídeo único entre a soja resistente e suscetível na região da cópia de múltiplos genes de Rhg1 é apresentado na Tabela 3 nos Exemplos. Em outra realização, o marcador é o número de cópias genômicas, ou uma estimativa do número de cópias genômicas, de pelo menos um dos genes ou sequências de DNA encontradas na região replicadas das linhas resistentes. Em ainda outra realização, o marcador é o segmento de DNA genômico que carrega a extremidade entre a região replicada em Glyma18g02610 e Glyma18g02570 como mostrado nas Figuras 5 e 6. Os métodos de seleção também podem incluir a análise de características, polimorfismos de fenótipo ou marcadores selecionáveis não definidos por diferenças na sequência de DNA ou RNA, tais como as diferenças na metilação de uma sequência de ADN, ou os níveis de expressão de polipéptido ou nos níveis de expressão de genes. Como mostrado nos Exemplos, o locus Rhg1 de resistência à NCS, em particular, as regiões do promotor de Glyma18g02610, Glyma18g02590 e Glyma18g02580, foi altamente metilado nas plantas resistentes, em comparação com plantas susceptíveis. Distinções de metilação em e adjacente a estes genes, por exemplo, nas regiões do promotor e a montante dos genes, podem ser utilizadas para distinguir entre as linhagens resistentes e susceptíveis. Além disso, as plantas resistentes tiveram os níveis de mRNA mais elevados para Glyma18g02610, Glyma18g02590 e Glyma18g02580 em relação às plantas suscetíveis. Ver Figura 5. Portanto, os métodos para detectar os níveis de expressão de gene de qualquer destes gentes, por exemplo através do monitoramento de abundância de mRNA, podem ser utilizados nos métodos aqui descritos. Em outra realização, o marcador pode ser o nível de expressão de proteína de pelo menos um de Glyma18g02610, Glyma18g02590 e Glyma18g02580. Quaisquer destas diferenças podem ser utilizadas como uma tela para testar uma planta ou célula vegetal susceptível de ser resistente ou susceptível aos nematóides.

[00047] Os marcadores descritos acima estão ligados ao fenótipo de aumento da resistência a nematóides de cisto ou, alternativamente, à susceptibilidade a nematóides de cisto. Os métodos de detecção podem compreender ampliar o marcador ou uma porção do mesmo para produzir um produto amplificado. A presença do produto pode ser indicativa do marcador ou o produto amplificado pode ser sequenciado. O produto amplificado pode também ser avaliado através de sensibilidade diferencial para uma endonuclease de restrição. O marcador pode ser detectado usando análise de hibridação específica do alelo, PCR quantitativa, análise de Northern blot, análise de Western blot ou outra metodologia. Os métodos de detecção ou avaliação de marcadores genéticos ou fenotípicos de características tais como as aqui descritas estão disponíveis para os técnicos na área, muitos destes métodos são fornecidos nos Exemplos, e prevê-se que os novos métodos podem ser desenvolvidos no futuro para detectar os polimorfismos Rhg1 aqui descritos. Por exemplo, os marcadores podem ser utilizados para detectar a presença ou ausência da região Rhg1 com múltiplas cópias durante a criação de processos de seleção.

[00048] Um locus ligado descreve uma situação em que um marcador genético e a característica estão estreitamente ligados no cromossoma, de tal modo que o marcador genético e o traço não se segregam de forma independente, e a recombinação entre o marcador genético e o traço não ocorre durante a meiose com uma frequência elevada. O marcador genético e a característica podem segregar de forma independente, mas geralmente isto não ocorre. Por exemplo, um marcador genético para uma característica só pode segregar independentemente de uma característica 5% do tempo; adequadamente apenas 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25%, ou menos do tempo. Marcadores genéticos com uma relação mais estreita com os lócus de produção de característica servirão como melhores marcadores, pois segregam independentemente da característica com menos frequência, pois o marcador genético está mais intimamente ligada à característica. Os marcadores genéticos que detectam diretamente locais nucleótidos polimórficos que causam variação na característica de interesse são particularmente úteis para a sua precisão na produção da planta assistida pelo marcador. Portanto, os métodos de classificação aqui providos podem ser utilizados na reprodução tradicional, biologia recombinante ou programas de melhoramento transgênico ou híbrido para selecionar ou classificar variedades resistentes.

[00049] Nos métodos aqui descritos, a resistência à NCS ou fenótipo de susceptibilidade de uma primeira soja é identificada comparando o marcador genético na primeira soja ao da segunda soja, com um fenótipo de resistência conhecido. A segunda soja pode ser conhecida por ser resistente a NCS. Portanto, uma primeira soja com o mesmo marcador genético que a segundo soja é também susceptível de ser resistente à NCS. Sojas resistentes são conhecidas na área e incluem, mas não estão limitadas a PI88788, Peking, Hartwig, Fayette, Forrest, LD02-5320, LD02-5025, e LD01-7323 ou linhas que carregam loci que contribuíram ou foram derivados destas cultivares, tais como os fornecidos na Tabela 2. Em particular, os métodos permitem a identificação de plantas de soja tendo resistência aumentada para Raça 3 SCN e outras populações de nematóides, semelhantes ao PI88788. Alternativamente, a segunda soja pode ser conhecida por ser susceptível a NCS. Portanto, uma primeira soja com o mesmo marcador genético que a segundo soja é também susceptível de ser resistente à NCS. Sojas susceptíveis são conhecidas na área e incluem, mas não estão limitadas a, "Williams 82", Essex, Thorne, Sturdy, LG03-1672, e LG00-3372 ou linhas que carregam os loci que contribuíram ou foram derivados de um destes cultivares, tais como os fornecidos na Tabela 2. Em particular, os métodos permitem a identificação de plantas de soja com susceptibilidade para NCS semelhante ao do 'Williams 82.' Embora a resistência à NCS seja amplamente observada como uma característica quantitativa, o termos susceptibilidade e resistência ,conforme utilizado nos parágrafos anteriores, referem-se a características qualitativas, de modo que a identificação como soja resistente indica que a soja é mais resistente do que a linhagem de soja susceptível na qual a mesma está sendo comparada. Do mesmo modo, a identificação de um soja como soja susceptível indica que a soja é mais sensível do que a linha de soja resistente na qual a mesma está sendo comparada.

[00050] Resistência (ou sensibilidade) à NCS pode ser avaliada em diversas formas, algumas das quais são conhecidas aos técnicos na área. Nos exemplos, as raízes de soja foram inoculadas experimentalmente com NCS e a capacidade dos nematóides para amadurecer (muda e prosseguir para as fases de desenvolvimento além de J2) nas raízes das plantas foi avaliada em comparação com uma planta de controle susceptível e/ou resistente. Um teste de estufa NCS também é descrito nos Exemplos e provê uma indicação do número de cistos de uma planta e é relatado como o índice fêmea. O aumento da resistência a nematóides também pode ser manifestado como uma mudança na eficácia de resistência em relação a populações de nematóides ou genótipos específicos. Além disso, mas não exclusivamente, sojas susceptíveis a NCS cultivadas em campos infestados NCS provocarão a diminuição significativa do rendimento das culturas, em comparação com a soja resistente ao NCS comparável. A melhoria de qualquer uma dessas métricas tem utilidade, mesmo se todas as métricas acima não forem alteradas.

[00051] Tal como demonstrado nos Exemplos, um conjunto de três genes encontrados em um segmento repetido em tandem do cromossoma 18 foi identificado, cujo silenciamento levou a um aumento da susceptibilidade à NCS em uma variedade resistente. Os três genes são encontrados, juntamente com um quarto gene, que faz parte de um quinto gene, e outras sequências de DNA no segmento do cromossoma aproximadamente 31 kb de comprimento, que está presente em 10 cópias nas variedades de soja que possuem o alelo rhg1-b ou haplótipo de Rhg1 que está em uso comercial generalizado para o controle de NCS na doença da soja. Este segmento de cromossomo Rhg1 é encontrado em pelo menos três cópias em todas as variedades resistentes à NCS testadas até o momento. Várias variedades resistentes carregam três, sete ou dez cópias e as versões de número de cópia mais elevado de Rhg1 expressam níveis mais elevados de transcrições para os três genes. Versões do número de cópia mais elevado de Rhg1 também conferem maior resistência à NCS (exibem menos confiança na presença simultânea de alelos desejáveis de outra resistência à NCS LCQ, tais como Rhg4, a fim de efetivamente conferir a resistência à NCS, em relação aos haplótipos Rhg1 com menor número de cópias repetidas Rhg1). Nos Exemplos, a superexpressão de três genes em uma variedade susceptível tornou as raízes mais resistentes à NCS. Métodos para aumentar a resistência de uma planta aos nematoides de cisto selecionando as plantas que carregam marcadores genéticos associados com alelos Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 que estão presentes dentro do locus Rhg1 são descritos. Como se mostra nos Exemplos, os polimorfismos genéticos, que variam de polimorfismos de um único nucleótido a rearranjos de gene (ou seja, duplicações de genes) e as diferenças na metilação pode ocorrer em outras linhas de plantas Glycine max e outras espécies de glicina, as quais podem alterar a expressão ou impacto biológico de um ou mais genes ligados ao locus Rhg1, e uma cuidadosa seleção de alelos desejáveis de genes específicos no locus Rhg1 pode ser desejável para permitir a seleção de plantas com resistência aumentada à NCS.

[00052] Métodos para aumentar a resistência de uma planta aos nematóides de cisto, incluindo mas não se limitando a NCS, através do aumento da expressão ou alteração do padrão de expressão ou o aumento do número de cópias de um polinucleótido que codifica o Glyma18g02610 (SEQ ID NO:3), Glyma18g02590 ( SEQ ID NOs: 2, 5 e 6), e/ou Glyma18g02580 (SEQ ID NO: 1) polipéptidos ou fragmentos funcionais ou suas variantes nas células da planta também são fornecidos. O polipéptido pode ser de 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico às sequências previstas. Sequenciamos os genes de variedades resistentes e detectamos alguns polimorfismos nas regiões codificadoras e poucas alterações que resultam em uma mudança no aminoácido. O polipéptido Glyma18g2590 tem alguns polimorfismos significativos entre as variedades resistentes e sensíveis que parecem estar funcionalmente relacionadas com a resistência à NCS, como mostrado nos Exemplos.

[00053] Adequadamente, a expressão dos polipeptidos codificados por Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 é aumentada em uma raiz da planta. Adequadamente, a expressão dos polipeptidos codificados por Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 é aumentada em células da raiz da planta. A planta é adequadamente uma planta de soja ou suas partes. Os polinucleótidos podem também ser transferidas para outras plantas sem soja, ou homólogos destes polipéptidos ou polinucleótidos que codificam os polipéptidos de outras plantas, ou genes sintéticos que codificam produtos semelhantes aos polipéptidos codificados por Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 podem ser superexpressos nestas plantas. Outras plantas incluem, mas não estão limitadas a, açúcar beterrabas, batatas, milho, ervilhas ou feijão. A superexpressão dos genes pode aumentar a resistência de plantas a partir dessas outras espécies de nemátodos e, em particular, os nematóides do cisto, tais como o nematoide do cisto da soja, Heterodera glycines, nematoide do cisto da beterraba sacarina Heterodera schacthii, os nematoides do cisto da batata Globodera pallida e nematoides relacionados que causam doença semelhante na batata, tais como Globodera rostochiensis, o nematóide do cisto do milho Heterodera zeae, e a nematóide de cisto da ervilha Heterodera goettingiana.

[00054] A expressão dos polinucleótidos pode ser aumentada pelo aumento do número de cópias do polinucleótido na planta, nas células da planta, adequadamente células das raízes, através da identificação de plantas em que isto já tenha ocorrido. Estas plantas podem então ser utilizadas em métodos tradicionais de cruzamento. Adequadamente, o polinucleótido está presente em três, sete ou mesmo dez cópias. Adequadamente, pelo menos, dois ou os três polinucleótidos que codificam os polipéptidos ou os polipéptidos de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e Glyma18g02580 são expressos. Alternativamente, a expressão pode ser aumentada utilizando tecnologia recombinante de DNA, por exemplo, utilizar sólidos promotores para conduzir a expressão aumentada de um ou mais polinucleótidos.

[00055] Além disso, métodos para aumentar a resistência de uma planta aos nematoides de cisto podem ser desenvolvidos por clonagem de sequências a montante do Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 de linhas resistentes em linhas susceptíveis. Para esses métodos, sequências de nucleótidos que possuem pelo menos 60%, 70% ou 80% de identidade com sequências de nucleótidos que flanqueiam as regiões de codificação de proteínas de Glyma18g02610, Glyma18g02590 ou Glyma18g02580 (ou sequências que possuem pelo menos 80%, 85%, ou 90% de identidade para as regiões de codificação de proteínas), incluindo as referidas regiões flanqueadoras 5 'e 3' as regiões não transferidas do mRNA para estes genes, e incluindo também quaisquer outras sequências de DNA genômico que se estendem da região de codificação de proteína destes genes para a proteína de regiões de codificação de genes adjacentes podem ser utilizadas.

[00056] O aumento na expressão de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 na planta pode ser medido ao nível da expressão do mRNA ou ao nível de expressão do polipéptido codificado por Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580. O nível de expressão pode ser aumentado em relação ao nível de expressão de uma planta de controle, como mostrado nos Exemplos. A planta de controle pode ser uma planta susceptível à NCS ou uma planta resistente à NCS. Por exemplo, uma planta susceptível, tais como "Williams 82" pode ser transformada com um vetor de expressão, de modo a que as raízes das plantas transformadas expressam níveis aumentados de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 em comparação com uma planta não transformada ou uma planta transformada com uma construção que não altera a expressão de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580, resultando em maior resistência a nematóides. Por outro lado, o controle pode ser uma planta parcialmente resistente a nematóides e o aumento da expressão de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 pode resultar em um aumento da resistência aos nematóides. Por outro lado, a planta pode ser resistente a nematóides e o aumento da expressão de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 pode resultar em um aumento da resistência aos nematóides. Sendo assim, a planta pode ser mais resistente a certas populações de nematóides, raças, tipos de Hg ou estirpes e menos resistentes a outras populações de nematóides, raças, tipos de Hg ou estirpes, e o aumento da expressão de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 pode resultar em aumento da resistência a algumas das populações de nematóides, raças, tipos de Hg ou estirpes.

[00057] Nos Exemplos, uma diminuição na expressão de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 é mostrada para aumentar a susceptibilidade da soja resistente à NCS para maturação à NCS. Além disso, as raízes da soja susceptível à 'Williams 82 "mostraram que têm níveis mais baixos de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 mRNA, em comparação com a linha de Fayette resistente. Como os baixos níveis de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 mRNA estão correlacionados com suscetibilidade do nematóide, e aumento dos níveis de correlação com a resistência, e redução direta de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 mRNA é causalmente associada a uma maior susceptibilidade do nematóide de tecidos resistentes anteriormente, aumentando os níveis de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 na soja, em muitos casos, aumentar a resistência da soja aos nematóides, em particular NCS. Na Figura 15, o aumento da expressão de uma combinação de Glyma18g02600, Glyma18g02610, Glyma18g02590, e Glyma18g02580 foi mostrado para aumentar a resistência à NCS de uma linha susceptível. O aumento da expressão de três genes, Glyma18g02610, Glyma18g02590 e Glyma18g02580 também revelou aumentar a resistência de uma variedade susceptível de NCS na Figura 18. O aumento da expressão de menos de três desses polinucleótidos ou dos polipéptidos codificados pelos polinucleótidos pode ser igualmente eficaz para aumentar a resistência .

[00058] Expressão de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 pode ser aumentada em uma variedade de maneiras, incluindo várias evidentes aos técnicos na área, e podem incluir metodologias transgênicas, não transgênicas e tradicionais. Por exemplo, a expressão do polipéptido codificado por Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 pode ser aumentada através da introdução de uma construção, incluindo um promotor operacional na planta operacionalmente ligada a um polinucleótido que codifica o polipéptido nas células da planta. Adequadamente, as células são células de raiz. Por exemplo, a expressão do polipéptido codificado por Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 pode ser aumentada através da introdução de um transgene, incluindo um promotor operacional na planta operacionalmente ligada a um polinucleótido que codifica o polipéptido nas células da planta. O promotor pode ser um promotor constitutivo ou induzível capaz de induzir a expressão de um polinucleótido em toda ou parte da planta, raízes das plantas ou células de raízes das plantas. Em outra realização, a expressão de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 pode ser aumentada pelo aumento da expressão do polipéptido nativo em uma planta ou nas células da planta, tais como as células das raízes da planta. Em outra realização, a expressão de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 pode ser aumentada pelo aumento da expressão do polipéptido nativo em uma planta ou nas células da planta, tais como o local de alimentação de nematoides, sincício ou células adjacentes ao sincício. Em outra realização, a expressão de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 pode ser aumentada pelo aumento da expressão do polipéptido nativo em uma planta ou nas células da planta, tais como os locais de contato do nematóide com as células da planta. Em outra realização, a expressão pode ser aumentada através do aumento do número de cópias de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580. Outros mecanismos para aumentar a expressão de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 incluem, mas não estão limitados ao aumento da expressão de um ativador transcricional, reduzindo a expressão de um repressor transcricional, adição de uma região potencializadora capaz de aumentar a expressão de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580, aumentando a estabilidade do mRNA, que altera a metilação do DNA, a acetilação de histonas ou outras modificações da cromatina epigenética ou na vizinhança dos genes relevantes, ou aumento da estabilidade da proteína ou polipéptido.

[00059] Além do uso tradicional de tecnologia transgênica para introduzir cópias adicionais ou aumentar a expressão dos genes e mediar o aumento da expressão dos polipéptidos da Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 em plantas, a tecnologia transgênica ou não transgênica pode ser utilizada de outras formas para aumentar a expressão dos polipeptídeos. Por exemplo, a cultura de tecido da planta e a regeneração, mutações ou alterações na expressão de genes da planta diferentes de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580, ou tecnologias transgênicas, podem ser usadas para criar instabilidade no locus Rhg1 ou o genoma da planta que mais geralmente criam mudanças no número de cópias do locus Rhg1 ou comportamento da expressão do gene. O novo número de cópias ou comportamento da expressão do gene pode então ser estabilizado pela retirada das mutações ou tratamentos indutores de variação, por exemplo, por propagação da planta ou cruzamento convencional adicional. Em um dos exemplos, embora a planta transgênica seja utilizada para criar a mudança no número de cópias, o resultado seria uma linha não transgênica (e concebivelmente regulada como tal) com maior resistência, devido ao aumento do número de cópias do locus. Exemplos de tecnologias transgênicas que podem ser utilizadas desta maneira incluem dedos de zinco, ribozimas ou outras enzimas alvo de sequência que criam cadeia dupla de quebras de DNA ou próximo ao locus Rhg1, o sistema Cre / loxP do bacteriófago lambda ou outros sistemas semelhantes, como frt / flp, Nucleases do Efetor do Ativador de Transcrição (TALENS), sequências artificiais de DNA ou RNA concebidas para recombinar com Rhg1 que podem ser introduzidas transitoriamente, ou enzimas que “confundem” o DNA, tais como as enzimas Rag1 de mamíferos ou transposases de DNA. As mutações ou alterações na expressão de genes de plantas endógenas envolvidas na recombinação de DNA, o rearranjo de DNA e/ou vias de reparação de DNA são exemplos adicionais.

[00060] Os métodos de classificação descritos acima podem também ser utilizados para pesquisar os isolados de soja (Glycine max) e espécies intimamente relacionadas (Glycine soja, Glycine tomentella ou outras espécies de Glycine ) nos marcadores de resistência, e as linhas resistentes podem ser cruzadas naturalmente ou artificialmente com a soja desenvolver um soja com um número de cópias variante ou sequência no local Rhg1. Quaisquer alelos úteis identificadas em tais telas podem ser introduzidos utilizando a reprodução tradicional ou tecnologia transgênica na soja. Sistemas semelhantes estão disponíveis para outras plantas

[00061] Os meios não-transgénicos de geração de variedades de plantas que transportam características de interesse, tais como uma maior resistência aos nematóides, tais como NCS, estão disponíveis aos técnicos na área e incluem o melhoramento convencional, químico ou outro meios de geração de anomalias cromossômicas, tal como induzido quimicamente na duplicação de cromossomos e salvamento artificial de poliploides seguidos de perda cromossômica, mecanismos de reparo do DNA ou aumento da probabilidade de recombinação ou duplicação do gene pela geração de quebras cromossômicas. Outros meios para aumentar de forma não transgenética a expressão ou número de cópias de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 incluem o seguinte: classificação de mutações no DNA da planta codificando miRNAs ou outros RNAs pequenos, fatores de transcrição, plantas ou outros elementos genéticos que impactam Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou expressão Glyma18g02580; classificação de grandes populações de campo ou de reprodução de variação espontânea em número de cópias de Rhg1ou sequência de Rhg1 pela triagem de plantas para resistência aos nematóides, número de cópias de Rhg1ou outras características dos genes ou de expressão de proteínas Rhg1 conforme descrito no parágrafos anteriores; cruzamento de linhas que contêm o mesmo ou diferente do número de cópias no Rhg1 mas têm polimorfismos distintos de ambos os lados, seguido pela seleção de recombinantes em Rhg1 utilizando marcadores moleculares a partir de dois genótipos diferentes que flanqueiam o locus Rhg1; substâncias químicas ou mutagênese de radiação ou tecido vegetal cultura/regeneração que cria instabilidade cromossômica ou mudanças na expressão gênica, classificação de plantas para resistência aos nematóides, número de cópias Rhg1 ou outras características dos genes ou de expressão de proteínas Rhg1 conforme descrito no parágrafos anteriores; ou introdução pelo cruzamento genético convencional de loci não- transgênico que cria ou aumenta a instabilidade do genoma em Rhg1 - contendo linhas, seguido de avaliação de plantas para qualquer resistência ao nematóide ou número de cópias Rhg1 Exemplos de loci que poderiam ser utilizados para criar instabilidade genômica incluem transposões ativas (naturais ou artificialmente introduzidas de outras espécies), loci endógenos que ativam os transposões (por exemplo, mutações que afetam a metilação do DNA ou processamento de RNA pequeno, tais como mutações equivalentes a met1 em Arabidopsis ou mop1 no milho), mutação de genes de plantas que impactam a reparação do DNA ou suprimem a recombinação ilegítima, tais como os ortólogos ou similares em função à helicase Sgs1 de levedura ou RecQ de E. coli, ou a superexpressão de genes, tais como RAD50 ou RAD52 de levedura que medeiam a recombinação ilegítima. Os técnicos na área podem encontrar outros métodos transgênicos e não transgénicos para aumentar a expressão de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580.

[00062] Os polinucleótidos e/ou polipéptidos aqui descritos e utilizados podem codificar a de comprimento completo ou um fragmento funcional de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 do loco rhg1-b , ou ocorrendo naturalmente ou produziu variação de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580, ou um polinucleótido ou polipéptido derivado na totalidade ou parte da qual é baseado em combinações de nucleótidos ou de aminoácidos semelhantes a totalidade ou porções de Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 ou os seus produtos codificados. Os polinucleótidos adicionais que codificam polipéptidos podem também ser incluídos na construção, tais como Glyma18g02600 (que codifica o polipéptido de SEQ ID NO:4). O polipéptido pode ser, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico às sequências aqui providas. Os polinucleótidos que codificam os polipéptidos podem ser, pelo menos, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idênticos às sequências disponíveis no banco de dados de sequência genética de soja pública .

[00063] A expressão do polipéptido codificado por Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 pode ser aumentada, adequadamente o nível de polipéptido é aumentada em pelo menos 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20 ou 25 vezes, em comparação com as plantas não tratadas, susceptíveis ou outras plantas de controle ou células vegetais. As células de controle ou plantas de controle são plantas ou células comparáveis em que a expressão Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 não foi aumentada, tal como uma planta com o mesmo genótipo transfectada com vetor vazio ou transgênico para um polinucleótido distinto.

[00064] O aumento da resistência aos nematóides pode ser medido como descrito acima. O aumento da resistência pode ser medido pela planta que tem uma percentagem mais baixa de invasão de nematóides que se desenvolvem após o estágio J2, uma menor taxa de formação de cistos nas raízes, redução da produção de ovos NCS nos cistos, redução da produção global de ovo NCS por planta, e/ou maior rendimento da soja, em uma base por planta, ou uma base por área de cultivo, conforme comparado com uma planta de controle cultivada em um ambiente de crescimento semelhante. Outros métodos de medição da resistência à NCS também irá serão conhecidos aos técnicos na área. Nos métodos de aumento da resistência aos nematóides aqui descritos, a planta resultante pode ter, pelo menos, 10% de aumento da resistência em comparação com a planta não tratada ou de controle ou células vegetais. Adequadamente, o aumento na resistência é, pelo menos, 15%, 20%, 30%, 50%, 100%, 200%, 500%, em comparação com um controle. Adequadamente, o índice de fêmeas da planta com o aumento da resistência a nematóides é de cerca de 80% ou menos do índice de fêmeas de uma planta não tratada ou de controle derivada do mesmo genótipo da planta ou semelhante, infestado com uma população de nematóides semelhantes na mesma experiência. Mais adequadamente, o índice de fêmeas após a infecção experimental não é mais de 60%, 40% ou 20% da planta de controle derivada do mesmo genótipo da planta ou semelhante, infestado com uma população de nematóides semelhantes na mesma experiência. Adequadamente, quando cultivada em campos altamente infestados com NCS (por exemplo, mais de 2500 ovos NCS por 100 centímetros cúbicos de solo), a produção de grãos de soja de plantas cultivadas no campo são de 2% maior do que as plantas de controle isogênico. Mais adequadamente, o aumento de rendimento é, pelo menos, 3%, 4%, ou 5% em relação ao crescimento de plantas de controle isogênico cultivadas em ambientes semelhantes.

[00065] As construções são providas aqui, incluindo um promotor ligado operacionalmente a um polinucleótido Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 que codifica um polipéptido que compreende a SEQ ID NO: 1-3 ou 5-6 ou um fragmento ou variante funcional deste. Também estão incluídos os homólogos ou variantes destas sequências de outras variedades de soja. As construções podem ainda incluir Glyma18g02600 ou outros genes. As construções podem ser introduzidas em plantas para produzir plantas transgênicas ou podem ser introduzidas em plantas ou partes de plantas, tais como o tecido de planta, calos de plantas, raízes das plantas ou células vegetais. Adequadamente, o promotor é um promotor vegetal, adequadamente o promotor está operacional em células da raiz da planta. O promotor pode ser específico do tecido, induzível e constitutivo, ou regulado pelo desenvolvimento. As construções podem ser um vetor de expressão. A construção pode ser utilizada para gerar plantas transgênicas ou sementes transgênicas. O polipéptido pode ser de 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico às sequências de SEQ ID NO: 1-3 ou 5-6. As construções podem compreender os três polinucleótidos e podem mediar a expressão dos três polipéptidos.

[00066] As plantas transgênicas, incluindo um polinucleótido não nativo ou exógeno que codifica os polipéptidos rhg1-b identificados e aqui descritos são também providas. Adequadamente, as plantas transgênicas são a soja. Os polinucleótidos e os polipéptidos de soja aqui identificados como associados à resistência a nematóides também podem ser utilizados para gerar beterraba de açúcar, batatas transgênicas, milho, ervilhas, feijões ou capazes de expressar os genes de soja aqui descritos. Alternativamente, os genes homólogos ou polipéptidos destas plantas podem ser identificados por comparação com os genes de soja e polipéptidos aqui identificados e estes genes podem ser utilizados para gerar plantas transgênicas. As plantas transgênicas expressam níveis aumentados de polipéptido Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 em comparação com uma planta não transgênica de controle da mesma linha, variedade ou cultivar ou um controle transgênica que expressa um polipéptido que não seja Glyma18g02610, Glyma18g02590, e/ou Glyma18g02580 . As plantas transgênicas também têm resistência aumentada aos nematóides, em particular, NCS, em comparação com uma planta de controle. As porções ou partes dessas plantas transgênicas são também úteis. As porções e partes de plantas inclui, mas não estão limitadas a, células vegetais, tecido vegetal, planta, progenitura de plantas, propagações assexuadas de plantas, sementes de plantas.

[00067] Células vegetais transgênicas que compreendem um polinucleótido que codifica um polipéptido capaz de aumentar a resistência aos nematóides, tais como NCS, também são providas. Adequadamente, as células vegetais são células vegetais de soja. Adequadamente, as células são capazes de regenerar uma planta. O polipéptido compreende as sequências de SEQ ID NOs:1-3 ou 5-6 ou seus fragmentos, variantes ou as suas combinações. O polipéptido pode ser de 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico às sequências previstas. As células transgénicas podem ser encontradas em uma semente. Uma planta, tal como uma planta de soja, pode incluir as células transgênicas. A planta pode ser cultivada de uma semente que compreende células transgênicas ou pode ser cultivadas por quaisquer outros meios disponíveis para os técnicos na área. Plantas quiméricas compreendendo células transgênicas são também providas.

[00068] A expressão do polipéptido e polinucleótidos que codificam os polipéptidos na planta transgênica é alterada em relação ao nível de expressão dos polipeptídeos nativos em uma planta de soja de controle. Em particular, a expressão dos polipéptidos na raiz da planta é aumentada. A planta transgênica aumentou a resistência aos nematóides em comparação a uma planta de controle. A planta transgênica pode ser gerado de uma célula transgênica ou calo usando métodos disponíveis aos técnicos na área.

[00069] Os Exemplos fornecidos abaixo pretendem ser ilustrativos e não limitativos do âmbito da invenção ou das reivindicações. Todas as referências e apêndices aqui citados são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

EXEMPLOS

[00070] Para identificar o gene que confere resistência ao NCS na soja PI88788 no locus identificado por Kim e colaboradores., 2010 (no intervalo cromossômico definido pelo extremidade BARCSOYSSR_18_0090 e BARCSOYSSR_18_0094), uma abordagem de teste do gene candidato foi utilizada. Esta abordagem é descrita em Melito e colaboradores. (BMC Biologia de Plantas 2010, 10:104), que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Em resumo, esta abordagem do gene candidato foi completada com vários genes no locus Rhg1 definido acima, utilizando uma variedade de soja resistente Fayette, que carrega o alelo rhg1-b-PI88788 derivado do locus Rhg1, para produzir raízes transgênicas da soja que carregam construções de silenciamento de genes e, em seguida, testam essas raízes transgênicas quanto à perda de resistência NCS. A estratégia de silenciamento utilizada é representada na Figura 2. Um microARN artificial utilizada na referência de Melito e colaboradores foi substituído com sequências de microRNA artificiais dirigidas contra vários candidatos ou genes putativos no locus de Rhg1. A expressão dos microRNAs artificiais foi conduzida pelo promotor Ubi3 de soja. A construção continha também um repórter GFP tal que as raízes transformadas pudessem ser prontamente identificadas pela expressão GFP. Raízes de soja transgênica que expressam construções micro-RNA artificiais (amiRNA) ou hairpina (RNAi) foram produzidas utilizando Agrobacterium rhizogenes. Raízes que expressam GFP foram selecionadas para posterior análise. Raízes transgênicas foram inoculadas com NCS para testar a diminuição ou aumento da resistência ao NCS causado pelo silenciamento do gene candidato condicionado pela expressão microARN artificial.

[00071] A resistência da soja ao NCS foi medida duas semanas após a inoculação de raiz, determinando a proporção da população do nematóide total que tinha avançado além da fase J2 em cada raiz (Fig. 3A), em relação aos controles resistentes e susceptíveis conhecidos. Silenciando qualquer um dos três genes estreitamente ligados, nomeadamente Glyma18g2580, Glyma18g2590 e Glyma18g2610, no locus rhg1-b da variedade de soja resistente ao NCS Fayette reduziu significativamente a resistência ao NCS (Fig. 3B). Depleção de resistência era dependente da redução da transcrição alvo (Fig. 4). Silenciamento de outros genes e em torno do local não impactaram a resistência à NCS (por exemplo, Fig 3B, genes Glyma18g02570 e 2620).

[00072] O produto proteico previsto Glyma18g02610 contém um domínio de proteína Induzido por Ferida (domínio Pfam PF07107;. M. Punta e colaboradores, (2012), O banco de dados das famílias de proteínas Pfam. Emissão de banco de dados de Ácidos Nucléicos 40:D290-D301 e Logemann e colaboradores, (1988) Expressão diferencial de genes em tubérculos de batata após o ferimento.. Proc Natl Acad Sci EUA 85: 1136-1140) e um homólogo (55% idêntico) proteína na planta de gelo (Mesembryanthemum crystallinum) foi previamente demonstrado ser sensível a ambos os estímulos bióticos e abióticos (Yen e colaboradores, Regulação Ambiental e de desenvolvimento da proteína da parede celular induzida por ferida WII2 na planta de gelo halofite. Fisiologia da Planta. 127:517-528). O produto de proteína anotada de Glyma18g02610 não tem outros domínios proteicos amplamente conhecidos ou funções bioquímicas inferidas que, no momento atual, são óbvias aos técnicos na área. No entanto, os resultados acima indicam que Glyma18g02610 é necessária para a completa resistência NCS mediada por Rhg1.

[00073] Uma duplicação genômica de quatro genes em Rhg1 em Glycine max está presente nas linhas resistentes à NCS testadas

[00074] Estudo concomitante da estrutura física do locus rhg1-b revelou uma configuração genômica incomum. Um segmento de genoma de 31,2 kb, que codifica os três genes acima que contribuem para a resistência à NCS está presente em várias cópias em linhas resistentes à NCS (Figs. 5, 6). A sequência de DNA das inserções do clone fosmid que carregam DNA genômico do intervalo genético rhg1-b identificou uma junção única de DNA, não presente no genoma de soja Williams 82 publicado, em que um terceiro fragmento de Glyma18g02570 3 é imediatamente adjacente à sequência intergênica a jusante (centrométrico a) Glyma18g02610 (Fig. 5B). A repetição genômica contém cópias completas de Glyma18g02580, -2590 , -2600 e -2610, bem como os dois exons finais da Glyma18g02570. Toda a sequência de disparo do genoma de uma linha contendo rhg1-b revelou profundidade dez vezes maior de cobertura deste intervalo relativo às regiões vizinhas ou homólogas (Fig. 5B), o que sugere a presença de múltiplas repetições.

[00075] A sequenciação e amplificação de PCR confirmou a presença da junção Glyma18g02610- 2570 no DNA a partir de múltiplos acessos de soja resistentes à NCS, incluindo adesões que carregam o PI comercialmente importante 88.788, Peking e PI 437.654 haplótipos do locus Rhg1 (Fig. 5C e a Fig. 7). A junção não foi detectada em quatro variedades susceptíveis à NCS testadas, incluindo Williams 82 (Fig. 7B). Isto constitui um teste direto para alelos economicamente desejáveis do locus Rhg1. A identidade compartilhada dos locais de junção de diferentes fontes disparáveis de resistência à NCS sugere uma origem compartilhada do evento inicial que confere resistência a Rhg1.

[00076] Fibra de Peixe (fluorescência na hibridização no local) foi utilizada para determinar diretamente o número de cópias e arranjo do segmento de repetição 31 kb em diferentes haplótipos do locus Rhg1. O padrão de hibridização e as estimativas da extensão da fibra de DNA utilizam estas sondas (Fig. 6 e na Tabela 1) são consistentes com a presença de uma única cópia da repetição na Williams 82, como no genoma de referência de soja. Em Fayette, fibra de peixe revelou dez cópias por fibra de DNA do segmento de repetição 31 kb previsto, na mesma configuração ao longo dos núcleos múltiplos incluídos na amostra, em um padrão indicando dez repetições diretas em um arranjo cabeça-a-cauda (Fig. 6 e Tabela 1). Não há cópias adicionais (por exemplo, em outros locais) evidentes.

Em amostras de linha de soja Peking, três cópias por fibra de DNA estavam presentes na aparente orientação de repetição direta (Fig. 6). Embora a fibra de peixe não possa resolver pequenas diferenças na sequência, o tamanho único de todos os produtos de PCR na amplificação da junção e a consistência de todas as sequências de junção montadas a partir de fosmid ou sequenciamento de DNA genômico (Fig. 7) sugerem ainda a presença de cópias repetidas diretas adjacentes.

Extensão de sinais de Extensão estimada de sinais de fibra de peixe (µm) fibra de peixe (kb) N: Williams 82 8.60 ± 0.49 27.60 ± 1.58 20 Fayette 96.56 ± 7.54 309.94 ± 24.2 20 Peking 34.42 ± 2.91 110.48 ± 9.34 20 Tabela 1. Estimativas de comprimento para sinais de hibridação de fibra de peixe. N: número de fibras de DNA analisadas.

[00077] Para identificar o número de cópias adicionais e polimorfismos de DNA, analisamos todos os dados de resequenciamento do genoma (WGS) para 41 linhagens de soja, os "pais NAM" de um estudo de mapeamento da associãção atual, utilizando dados de sequência fornecidos pelo Dr. Perry Cregan. O conjunto de dados consiste das leituras de sequenciamento de disparo do genoma produzidas usando equipamentos e protocolos Illumina HiSeq, com profundidade média de cobertura de sequenciamento que varia de 5 a 60 vezes. As leituras foram mapeadas para o genoma de referência 82 Williams (Phytozome, montagem 189) e analisadas quanto à profundidade da leitura (RD), INDELs e SNPs em relação à linha susceptível à NCS Williams 82. Quando esta profundidade de leitura Ilumina foi utilizada para estimar o número de cópias no Rhg1 no local, usando métodos análogos aos usados para gerar a Figura 5B, 8 das 41 linhas de soja analisadas apresentaram uma profundidade de leitura normalizada para a região de aproximadamente 31 kb Rhg1 (correspondente ao segmento de repetição rhg1-b descrito acima) que diferiam por mais do que 5 desvios padrão da média a partir da profundidade de leitura das duas regiões 30 kb, flanqueando imediatamente a região correspondente ao segmento de repetição rhg1-b. Veja a Tabela 2. Sete dessas linhas apresentaram um número de cópias estimado variando de 9,2 a 9,9 cópias. Estas linhas têm PI 88.788 em sua linhagem, onde a linhagem está disponível, e foram classificadas como resistentes à NCS em testes de laboratório e/ou no campo. O outro genótipo previsto para realizar repetições Rhg1 apresentou um número de cópias estimado de 2,9. Sua linhagem contém Peking e PI 437654. O loci Rhg1 derivado de Peking e PI 437654 são amplamente reconhecidos como muito menos eficazes na atribuição de resistência à

NCS se não estiverem acoplados com alelos preferenciais de um locus desvinculado, Rhg4. Todos os outros genótipos (33) foram calculadas para conter uma cópia de aproximadamente 31 kb de Rhg1 DNA descrito neste documento.

Doze das 33 linhas que tiveram um fenótipo de resistência à NCS disponível previamente determinado foram listados como susceptíveis à NCS, embora as informações sobre o fenótipo de resistência à NCS não foram prontamente disponíveis para as outras 21 linhas.

Como controle, a profundidade de leitura foi utilizada para estimar o número de cópia na região homóloga no cromossoma 11. O número de cópias estimado foi de aproximadamente 1 em todos os genótipos testados.

Em adição a estas linhas mostradas na Tabela 2, que recentemente determinaram que uma variedade conhecida como Nuvem (PI 548316), que mostra níveis intermédios da resistência à NCS, carrega sete cópias do segmento de repetição do locus Rhg1. Tabela 2: Análise do número de cópias do locus Rhg1 em diversas variedades de soja.

Estimativa do número de cópias Genótipo Cromossoma 18 Cromossoma 11 Homólogo

[00078] A fonte do primeiro evento de duplicação a surgir em Rhg1 não é conhecida, mas possivelmente foi o resultado de atividade próxima a Ty1/retrotransposon de cópia RTvr1 ou RTvr2. Expansão posterior do número de cópias pode ter ocorrido por eventos raros de intercâmbio desigual entre repetições homólogas durante a recombinação meiótica.

[00079] Genes dentro do bloco gene duplicado na rhg1-b são expressos em níveis mais elevados do que os seus homólogos de haplótipos Rhg1 susceptíveis a NCS

[00080] A análise da expressão do gene utilizando PCR quantitativo (qPCR) determinou que os três genes encontrados para impactar a resistência à NCS exibe significativamente mais abundância de transcrição em raízes de variedades resistentes à NCS relativos a linhas sensíveis (Fig. 5D e a Fig. 7D). Em contrapartida, a abundância da transcrição para genes imediatamente flanqueando os genes que impactam NCS não diferiram significativamente entre as variedades resistentes e suscetíveis à NCS (Fig. 5; expressão Glyma18g02600 em raízes é igual ou inferior aos limites de detecção de qPCR, clonagem de cDNA e métodos RNAseq; Veja Cook e colaboradores. 2012 métodos e Severin e colaboradores. RNA-Seq Atlas de Glycine max: Um guia para o transcriptoma de soja. Bmc Plant Biology, 2010). Transcrições de corpo inteiro foram confirmadas para Glyma18g02580, -2590 e - 2610, e nenhuma transcrição de junção repetida híbrida foi detectada por Glyma18g02570 (Fig. 7E). O acima sugeriu que a expressão elevada de um ou mais genes que impactam NCS poderia ser uma causa principal de resistência elevada à NCS.

[00081] PCR em tempo real quantitativo (qPCR) também foi utilizado para analisar e comparar a abundância da transcrição mRNA de cinco genes no locus Rhg1 nas raízes sem inoculação das linhagens de soja do tipo Hg. Estas linhas foram estabelecidas e aceitas pelos pesquisadores como a representação de um conjunto útil e diversificado de linhagens de soja resistentes à NCS (Niblack e colaboradores., 2002, J. de Nemat. 34 (4): 279-288; TL Niblack, KN Lambert, GL Tylka de 2002, Annu. Rev. Phytopathol. 44:283-303). Abundância da transcrição para três dos genes, Glyma18g02580, Glyma18g02590, e Glyma18g02610 são todos expressos mais elevadamente em cada um dos 7 diferenciais testados NCS em relação à linha susceptível NCS Williams 82, como mostrado na Figura 8. Outro gene no locus, Glyma18g02600, estava também mais elevadamente expresso nas linhas resistentes à NCS; no entanto, os dados para Glyma18g02600 podem ser menos precisos, e o nível de transcrição absoluta medida de Glyma18g02600 foi próximo do limite de detecção (consistente com dados publicados de seq. de RNA das raízes da soja). Como controle, um gene vizinho, mas não duplicado, Glyma18g02570 mostra padrão de expressão semelhante para todos os genótipos testados. Em uma experiência separada, dois genes adicionais, Glyma18g02620 e Glyma18g02630, flanqueando a repetição para o lado centromérico, também mostram abundância de transcrição semelhante em todas as linhas resistentes e suscetíveis à NCS.

[00082] Quatro dos genótipos resistentes à NCS (Peking, PI 90763, PI 89772, 437654 e PI) são semelhantes entre si em seu nível de abundância mRNA para os quatro genes Glyma18g02580, Glyma18g02590, Glyma18g02610 e Glyma18g02600. Nestes genótipos, a abundância da transcrição é 1,5 a 5 vezes maior para os quatro genes repetidos relativos a Williams 82. Separadamente, o genótipos resistentes a NCS Nuvem, PI 88788, e 209.332 são semelhantes entre si em seus níveis de abundância mRNA elevados para genes Rhg1 em comparação com Williams 82 e os quatro genótipos anteriores. A abundância da transcrição variou entre 4 e 20 vezes maior para os genes repetidos na Nuvem, genótipos PI 88788 e PI 209332. Estes dados mostram que o aumento do número de cópias de DNA que codificam estes quatro genes aumenta a abundância da transcrição. Há também um forte agrupamento para o número de cópias do DNA e a abundância da transcrição, produzindo, pelo menos, duas classes com genótipos Peking, 90763, 89772, 437654 em conjunto, e os genótipos Nuvem, PI

88.788, e 209.332 em conjunto. Notamos a correlação destes genótipo Rhg1 (número de cópias) e grupos de nível de expressão Glyma18g02580/Glyma18g02590/Glyma18g02610 com os agrupamentos de fenótipo com resistência à NCS relatados por Colgrove e colaboradores. 2008 (Colgrove, AL, e TL Niblack. 2008. Correlação dos índices femininos de ensaios de virulência em linhagens puras e populações de campo de Heterodera glycines. Journal of Nematology 40:39-45). Embora Glyma18g02600 seja mais elevadamente expresso em linhagens resistentes à NCS, não há uma clara relação entre o número de cópias e a abundância da transcrição, encontrados para os outros três genes na repetição. Isto sugere que o aumento do teor de DNA faz aumentar a abundância da transcrição, mas não de uma forma dependente da dose para Glyma18g02600. Estado de Metilação de DNA Rhg1 é dependente do cultivo para genes no bloco de gene duplicado.

[00083] Para abordar o mecanismo que conduz à expressão do gene mais elevada observada em cultivares resistentes à NCS, avaliamos a metilação de DNA do locus Rhg1 utilizando digestão com enzima de restrição sensível a metilação e PCR. McrBC é uma endonuclease que cliva especificamente ADN contendo 5-metilcitosina (5-MC), quando intacta em DNA não metilado. DNA incubado com McrBC e submetidos a PCR não consegue produzir um produto se o produto se espalha por citosinas metiladas. Foram identificadas diferenças significativas entre as cultivares resistentes à NCS e susceptíveis a NCS, quando o DNA genômico de soja foi testado para a metilação no locus Rhg1. Por exemplo, três pares de iniciadores diferentes para o promotor Glyma18g02610 ou regiões de codificação não conseguiram amplificar um produto, ou o produto foi grandemente reduzido, entre DNA genômico digerido e não digerido por McrBC de cultivares resistentes (Figura 9). Os mesmos pares de iniciadores utilizados para PCR com o DNA colhido de cultivares sensíveis produziu produtos semelhantes se o molde de DNA genômico foi digerido ou não, o que indica pouca ou nenhuma metilação de DNA.

[00084] Curiosamente, uma correlação consistente entre o DNA hipermetilado e expressão gênica elevada foi identificada nas cultivares resistentes à NCS testados. A região promotora para Glyma18g02580, Glyma18g02590 e Glyma18g02610 foram todos metiladas e apresentaram maior transcrição. Um gene vizinho, Glyma18g02620, não apresentou metilação polimórfica ou a expressão do gene alterado entre cultivares resistentes e suscetíveis (Figura 9). Caracterização adicional de 2580, 2590 e 2610 genes

[00085] RACE PCR para Glyma18g02590 e Glyma18g02610 de Fayette (não inoculados com NCS) revelou que as transcrições derivadas do haplótipo PI88788 resistente à NCS tem locais idênticos de início e interrupção das transcrições anotadas associados com a sequência de genoma Williams 82 (susceptível à NCS) que está disponível em Phytozome (http://www.phytozome.net/cgi- bin/gbrowse/soybean/). Como um teste inicial para a degradação da proteína facilmente detectável ou diferenças de modificação pós-transporte entre linhas de soja resistentes à NCS, em oposição a linhas de soja susceptíveis à NCS (não inoculadas com NCS), ensaios de imunodetecção de proteína por western blot utilizando 1,5 kb do promotor nativo Fayette que conduzem Glyma18g02590- HA (2590Fayette:: 2590-HA) ou utilizam 3.2kb do promotor nativo Fayette Glyma18g02610-HA (2610Fayette:: 2610-HA) revelou um produto de proteína detectável que migrou a aproximadamente o tamanho previsto para as respectivas proteínas, e não revelou diferenças de tamanho da proteína em Williams 82 em oposição a Fayette (Figura 10).

[00086] Para explorar a possibilidade de que os impactos de Glyma18g02580, Glyma18g02590 e Glyma18g02610 sobre desenvolvimento de NCS na soja correlacionam-se com a expressão do gene induzível por NCS, analisamos a expressão gênica em tecido de raiz excisada de segmentos de raiz fortemente infestados de linhagens resistentes e suscetíveis. Modestos aumentos na expressão de Glyma18g02580 e Glyma18g02610 foram observados em Fayette resistente à NCS, acima dos níveis elevados de expressão já presentes no Fayette não inoculado em comparação com Williams 82 susceptível a NCS (Figura 11).

[00087] Para explorar ainda mais a possibilidade de que os impactos de Glyma18g02580, Glyma18g02590 e Glyma18g02610 no desenvolvimento de NCS nas raízes de soja estejam correlacionados com a expressão induzível de NCS, construções de fusão GUS do promotor (Prom2580::GUS, Prom2590::GUS, Prom2610::GUS) foram feitas e expressas em raízes transgênicas. Raízes transgênicas foram coradas para a atividade GUS 5 dias após a inoculação com NCS (Figura 12). Raízes Prom2580:: GUS apresentaram um nível moderado de coloração de fundo e pareciam ter a coloração mais brilhante do tecido da planta vascular inchada no centro da infecção J2 SCN (aparente syncytia em desenvolvimento). Raízes Prom2590:: GUS mostraram níveis muito baixos de coloração de fundo e de forma consistente maior coloração GUS em sincícios aparente, juntamente com forte coloração das pontas das raízes laterais emergentes. Raízes Prom2610:: GUS apresentaram altos níveis de coloração de fundo, mas também pareciam estar mais manchadas em áreas susceptíveis à formação de sincícios. Os níveis de coloração elevada GUS em sincícios aparentes foram semelhantes aos observados em experiências GUS do promotor de controle positivo usando o promotor indutível por sincício anteriormente caracterizado por Glyma14g06080. Como observado acima, a proteína prevista codificada Glyma18g02610 contém um domínio de proteína induzido por ferida (Pfam07107) e uma proteína homóloga (55% idêntica) na planta do gelo (Mesembryanthemum crystallinum) que demonstrou ser sensível a ambos os estímulos bióticos e abióticos. As plantas da soja não transgênicas Fayette expostas ao MeJA apresentaram abundância de transcrição significativamente elevada Glyma18g02610 em comparação com genes vizinhos, documentando ainda expressão associada ao estresse deste gene (Figura 11).

[00088] Polimorfismo de aminoácidos ou a super-expressão de qualquer um dos três genes rhg1-b identificados não representam a resistência à NCS. De todas as leituras de sequência rhg1-b disponível (através de múltiplas cópias repetidas), nenhum polimorfismo de aminoácido previsto em relação à Williams 82 foi identificado para Glyma18g02580, Glyma18g02600 ou Glyma18g02610. Algumas cópias de Glyma18g02590 de rhg1-b se assemelham a sequência Williams 82, enquanto outras contêm um conjunto de polimorfismos, nomeadamente na compatibilidade C prevista aos nematóides são também fornecidos terminais seis aminoácidos da proteína SNAP-α previstos (Tabela 3, confirmados por sequenciação de cDNA).

[00089] Tabela 3. Polimorfismos de aminoácidos dentro das séries 31 kb em rhg1-b. A posição dos genes codificadores de proteínas foi prevista por comparação das sequências do clone fosmid para a versão Glyma1 da montagem do genoma da soja. (L) ou (R) indicam o lado esquerdo ou direito da junção. * Indica uma inserção de um aminoácido (3 pb da sequência de ADN) entre a posição de aminoácido 287 e 288 com base na montagem do genoma Williams 82 (Glyma1; www.phytozome.net).

Gene ID Posição de W82 #1 #3 #4(L) #5(L) #5(R) aminoácido 2590 203 Q K Q K - K 2590 285 E Q E Q Q Q 2590 286 D H D H H H 2590 287 D E D E E E 2590 287-288* - A - A A A 2590 288 L I L I I I

[00090] Os dados de sequenciamento de genoma completo (WGS) também foram analisados para polimorfismos de DNA, tais como inserções ou deleções (Indels) e polimorfismos de nucleotídeo único (PNUs). Nos sete genótipos com um número de cópias estimado que varia de 9 a 10, uma série de PNUs foram identificados em relação à sequência de referência Williams 82. Um gene contido no segmento rhg1-b repetido de DNA, Glyma18g02590, contém polimorfismos de DNA correspondentes a Williams 82 como definido acima. Existe um único PNU, C para A (Williams 82 a 88.788 PI derivado), na posição 1.643.192 que resulta em uma substituição de aminoácidos Q a K. Existem três PNUs presentes no terminal C, que ocorrem em posições 1.644.965 (G para C), 1.644.968 (G para C), e 1.644.974 (C para A), e uma inserção de 3 pb após o base 1.644.972 (GCG) que coletivamente mudam os últimos 5 aminoácidos da proteína Williams 82 de EEDLT para QHEAIT. As sequências de nucleótidos e de aminoácidos são mostradas na Figura 13. A inserção 3 pb provoca um aminoácido extra nas linhas derivadas de PI 88.788. Todas as posições de pares de bases correspondem à Williams 82 genoma versão 1.1, conjunto 189. Inúmeros polimorfismos PNUs e Indel foram observados na região DNA de repetição Rhg1 31 kb aproximada, entre Williams 82 e PI 88788- fonte Rhg1, nas regiões de nucleótidos fora daqueles que compreendem diretamente o quadro final de leitura aberta de Glyma18g02580, Glyma18g02590, Glyma18g2600 e Glyma18g02610. Análise da profundidade de leitura de sequenciamento de Illumina nas sete linhagens de soja do projeto de sequenciamento NAM com um número de cópias estimado que varia de 9 a 10, indicou que havia 9 cópias muito semelhantes da repetição do tipo PI-88788 em rhg1-b, e um cópia parcial da repetição Williams 82 em rhg1-b.

[00091] A linha de soja LD01-5907 do projeto de sequenciação NAM de soja, que carrega um número de cópias estimado de 3, também contém polimorfismos de DNA que afetam a sequência de aminoácidos para Glyma18g02590. Os polimorfismos de DNA são diferentes dos encontrados nas linhas derivadas PI 88.788, mas ocorrem em posições semelhantes. Existe um único PNU na posição

1.643.225 C que resulta em uma substituição de aminoácidos D a E. Existem dois PNUs presentes no terminal C, que ocorrem em posições 1.644.968 (G a T), 1.644.974 (C a A), e uma inserção de 3 pb após o base 1.644.972 (GCG) que coletivamente mudam os últimos 5 aminoácidos da proteína Williams 82 de EEDLT para YEVIT. A inserção 3 pb provoca um aminoácido extra no produto de proteína Glyma18g02590 em linhas com um locus Rhg1 derivado de Peking ou fontes PI 437.654.

[00092] Os polimorfismos de DNA para Glyma18g02590 identificados através da análise WGS foram confirmados para ser expressos utilizando sequenciamento de 3 'RACE e cDNA. Em genótipos resistentes à NCS Nuvem, PI 88788 e PI 209332, foram identificadas duas transcrições Glyma18g02590 diferentes. Uma das sequências correspondeu a sequência do tipo de referência Williams 82, e a outro corresponde à sequência de PI-88.788 derivado de fontes resistentes (de NAM). A proporção da sequência derivada de PI-88788 versus cDNA do tipo 82 segue a observada para a sequência de DNA. Ou seja, CDNA de PI 88.788 derivado Glyma18g02590 é aproximadamente 90% do total das transcrições sequenciadas. Isto é consistente com os dados que estes genótipos contêm 8 ou 9 cópias do segmento de DNA derivado de PI 31kb 88788. Um PNU presente em 5 'UTR de Glyma18g02610 também foi analisado em PI 88788. A proporção dos tipos de sequências se ajusta a outras observações.

[00093] Em genótipos resistentes a PNUs Peking, PI 90763, PI 89772 e PI 437654 duas transcrições diferentes foram identificadas para Glyma18g02590. Uma das sequências corresponde à sequência da

LD01-5907 da fonte resistente derivada de Peking/PI 437.654 do projeto de sequenciação NAM. Ver Figura 13. Uma forma alternativa de cDNA foi também detectada a partir de cada um dos quatro genótipos resistentes à NCS Peking, PI 90763, 89772 PI, PI e 437.654, com o mesmo tipo de polimorfismo nas quatro fontes. Este aparente isoforma de divisão de mRNA tinha 36 nucleótidos suprimidos, resultando em uma isoforma Glyma18g02590 com menos de 12 aminoácidos, como mostrado na Figura 13. A eliminação ocorre no final do exon 6 e se divide na estrutura do exon 7. Nenhum dos produtos sequenciados de Peking, PI 90763, PI 89772 e PI 437654 continham a sequência Glyma18g02590 do tipo Williams 82, consistente com a análise WGS. Com base na proporção de cDNAs sequenciados, muito aproximadamente 70% a 90% da transcrição de Glyma18g02590 é a versão completa nestas linhas.

[00094] Os vários polimorfismos podem resultar em diferenças funcionais no polipéptido Glyma18g2590 e são modelados tridimensionalmente na Figura 14, a qual se baseia na estrutura cristalina resolvida da proteína de levedura Sec17. A alfa-hélice excluída é mostrada em cinza claro. Note-se que estes polimorfismos estão agrupados em uma área geral perto do terminal-C do Glyma18g02590 dobrado previsto, o que é um homólogo da proteína SNAP-alfa, e que os dados substanciais funcionais estão disponíveis para as proteínas alfa-SNAP eucariota que sugerem funções específicas desta região da proteína (por exemplo, Barnard RJ, Morgan A, & Burgoyne RD (1996) Domínios de alfa-SNAP necessários para a estimulação da exocitose e para ligação e ativação da proteína de fusão sensível a N-etilmalemida (NSF). Biologia molecular da célula 7 (5):693-701; Barnard RJ, Morgan A, e Burgoyne RD (1997) Dinamização da atividade NSF ATPase por alfa-SNAP é necessária para a desmontagem complexa SNARE e exocitose. J Cell Biol 139 (4):875-883; Jahn R & Scheller RH (2006) SNAREs - motores para a fusão da membrana. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7(9):631-643.)

[00095] No entanto, expressando apenas o Fayette polimórfico tipo rhg1-b Glyma18g02590 a jusante de um sólido promotor constitutivo ou promotor nativo, a sequência não aumentou a reação de resistência à NCS das raízes transgênicas Williams 82 (Fig. 15 e a Fig. 16), sugerindo que a resistência à NCS rhg1-b requer mais do que este polimorfismo aminoácido 2590. Mas tais polimorfismos podem desempenhar uma função contributiva na resistência à NCS que não foi detectada nestas experiências. Superexpressão de Glyma18g02580 ou Glyma18g02610 também não conseguiu aumentar a resistência à NCS (Fig. 13) quando expressada isoladamente utilizando um sólido promotor constitutivo. Estes dados são preliminares e podem indicar que o fenótipo de resistência requer mais do que um único gene ou qualquer outro fator que é necessário para mediar a resistência.

[00096] Em vista do descrito acima, a superexpressão simultânea do conjunto de genes no segmento de repetição de 31 kb foi testada como uma possível fonte de resistência à NCS. Uma única construção de DNA recombinante foi feita a cada um dos genes Glyma18g02580, Glyma18g2590, Glyma18g2600 e Glyma18g2610 foi fundido com um sólido promotor. Em duas experiências separadas que testaram conjuntamente >25 eventos transgênicos independentes para cada construção de DNA, a resistência à NCS foi significativamente aumentada em Williams 82 susceptível a NCS por superexpressão simultânea deste conjunto de genes (Fig. 15). O aumento da resistência à NCS foi conferido, embora o fato de três dos genes serem superexpressos codifica os produtos de aminoácidos idênticos aos Williams 82 susceptíveis à NCS, e o gene Glyma18g02590 Fayette rhg1-b polimórfico que foi usado não foi suficiente para causar uma mudança detectável na resistência à NCS quando superexpresso (Fig. 15). Note que não houve aumento significativo do PR-1 nestas raízes transgênicas, o que pode indicar elevação não específica de defesas (Fig. 16). Também testamos o impacto de, simultaneamente, superexpressão Glyma18g02580, Glyma18g02590Fayette, e Glyma18g02610 na resistência à NCS em Williams 82. Observamos aumento da resistência à NCS nas raízes transgênicas da superexpressão de Williams 82 Glyma18g02580, Glyma18g02590Fayette, e Glyma18g02610 em relação aos vetores vazios de Williams 82, como mostrado na Figura 17. Estes dados indicam que a superexpressão desta combinação de genes resulta em maior resistência à NCS.

[00097] Estes resultados revelam um novo mecanismo para resistência a doenças: um polimorfismo de expressão para vários genes diferentes, mas intimamente ligados, derivados através da variação do número de cópias no locus Rhg1. Este conhecimento sugere futuras abordagens para melhorar a eficácia da resistência quantitativa mediada por Rhg1 à doença da soja extremamente importante NCS, por exemplo, através de isolamento de linhagens de soja que carregam mais cópias da repetição 31 kb Rhg1, ou através da superexpressão transgênica dos genes relevantes . Estas abordagens podem ser aplicadas em outras espécies, bem como, para a resistência a outros nematóides endoparasitas.

[00098] Os mecanismos bioquímicos de resistência mediada por Rhg1 continuam desconhecidos. Outros genomas sequenciados de plantas não carregam homólogos próximos da proteína Glyma18g02610 prevista, embora uma proteína indutível à ferida em planta de gelo com 55% de identidade tenha sido estudada. Modelagem do Glyma18g02610 previu estrutura terciária usando

Phyre2 indicado, com 98% de confiança, similaridade de 48% dos Glyma18g02610 à subfamília phzA/B de Delta(5)-3-/proteínas da família de fator 2 de isomerase cetosteróide/transporte nuclear. Portanto, Glyma18g02610 pode participar da produção de compostos de fenazina-que são tóxicos para nematóides. Assim, a aplicação de Glyma18g2610 em plantas, solo ou sementes pode inibir nematóides em plantas suscetíveis. A secreção da proteína Glyma18g02610 ou outros produtos vegetais que contribuem para a resistência a doenças pode ser impactada por Glyma18g02590 ou proteína -SNAP. Como Glyma18g02590 é um dos pelo menos cinco homólogos -SNAP codificados no genoma de referência de soja, Glyma18g02590 podem ter sofrido subfuncionalização ou neofuncionalização. Genomas de planta totalmente sequenciados carregam duas dúzias de mais de cinco dezenas de transportadores de aminoácidos anotados de muitos subtipos (www.phyotzome.net), que podem estar envolvidos na importação e/ou exportação de aminoácidos entre as células ou entre organelas subcelulares. A proteína Glyma18g02580 e seus transportadores mais estreitamente relacionados de soja e de outras espécies não estão bem caracterizados funcionalmente, de modo que o conceito de que Glyma18g02580 altera o sucesso do nematóide alterando os níveis de aminoácidos ou derivados de aminoácidos específicos no local de alimentação é apenas uma das muitas hipóteses viáveis para futuros estudos sobre a função de dissuasão de NCS de Glyma18g02580.

[00099] Variação do número de cópias (VNC) de um bloco de genes diferentes, ao invés de VNC para uma família única de genes, confere resistência à NCSS mediada por Rhg1. Análises recentes da arquitetura do genoma em sorgo, arroz e soja relataram altos níveis de VNC, e uma tendência para a sobreposição de regiões de VNC com genes relacionados ao estresse biótico e abiótico postulado. O presente trabalho representa um exemplo concreto de VNC conferindo uma valiosa característica de resistência à doença. Nos seres humanos e insetos, características adaptativas foram associadas com VNC em genes individuais específicos. Aglomerações de cópia simples de genes funcionalmente relacionados, mas não homólogos, são altamente incomuns em eucariotos multicelulares, mas foram relatadas em associação com o metabolismo secundário de plantas. Fornecemos um exemplo único de VNC, envolvendo mais de duas repetições, com a repetição que codifica vários produtos de genes que são necessários para a adaptação à mesma restrição ambiental importante. Dada a natureza altamente repetitiva e a plasticidade dos genomas das plantas e a associação relativamente pouco explorada entre VNC e fenótipos, parece provável que uma série de outras características complexas sejam controladas pelo tipo geral de VNC relatado para soja Rhg1.

Materiais e métodos: Transformação da Razi da Soja Agrobacterium rhizogenes

[000100] A estirpe A. rhizogenes Arqua1 foi transformada por congelação-descongelação, como previamente relatado por Wise, AA, Z. Liu, e A.N. Binns, Três métodos para a introdução de DNA estranho em Agrobacterium. Methods Mol Biol, 2006. 343: p. 43-53 e Hofgen, R. e L. Willmitzer, Armazenamento de células competentes para a transformação Agrobacterium. Nucleic Acids Research, 1988. 16 (20): p. 9877-9877. As células foram plaqueadas em meio seletivo com o antibiótico apropriado e incubadas a 28°C durante dois dias. A. rhizogenes estirpe Arqua1 foi recebido do Dr. Jean-Michel Ane, da Universidade de Wisconsin Madison. As sementes de soja que não contêm sinais macroscópicos de fungos ou contaminação viral foram esterilizadas à superfície durante 16-20 h em um frasco exsicador com gás cloro produzido pela adição de 3,5 ml de HCl 12 N em 100 ml de lixívia doméstica (hipoclorito de sódio a 6%). Pelo menos 20 sementes por experimento foram semeadas nos meios de germinação (sais B5 de Gamborg (3,1 g/L), 2% de sacarose, de 1X vitaminas B5 Gamborg, 7% de agar Noble, pH 5,8) em 100 x 25 mm e placas de Petri. As placas foram envoltas com fita micropore (3M, St. Paul, MN) e incubadas a 26º em uma câmara de crescimento (18/6 horas de luz/escuridão) durante aproximadamente uma semana. Cotilédones de soja foram colhidos 5-7 dias após a germinação, delicadamente retirando-os dos hipocótilos com uma pinça estéril. Com uma pinça estérel e bisturi Falcon nº 15, várias fatias rasas foram feitas em toda a superfície abaxial dos cotilédones após mergulhar o bisturi em suspensão A. rhizogenes (OD600 0,6- 0,7 em ddH20 estéril ). Os cotilédones foram então colocados abaxial voltados para baixo em um meio de co-cultura (MCC) (/sais B5 da L Gamborg 0,31 g, 3% de sacarose, vitaminas B5 de 1X Gamborg (Bioworld, Dublin OH), 0,4 g/L L-cisteína, 0,154 g/L de ditiotreitol, 0,245 g/L de tiossulfato de sódio, 40 mg/L de acetosiringona, 5% de agar Noble, pH 5,4) em 100 x 15 mm placas de Petri com um pedaço de 70 mm de papel de filtro (Whatman, Piscataway, NJ) sobre o superfície do agar, para evitar o supercrescimento de A. rhizogenes. As placas foram envoltas com parafilme e incubadas no escuro à temperatura ambiente durante três dias. Os explantes foram então transferidos para um meio de raiz pilosa (GRH) de 4,3 g/L de MS sais (Sigma Co., St. Louis, MO), 2% de sacarose, vitaminas B5 Gamborg de 1X (BioWorld, Dublin, OH), 7% Noble agar, 0,15 g/L cefotaxima, 0,15 g/L carbenicilina, pH 5,6 em cada 100 x 15 mm placas de Petri, virados para cima. As placas foram envoltas com fita micropore e incubadas no escuro à temperatura ambiente até o surgimento das raízes, geralmente em cerca de 2 semanas. Raízes de soja transgênica foram detectadas com base na expressão GFP codificada por vetor plasmid, usando um estereoscópico de fluorescência (LEICA MZ FL III com filtro GFP2). Segmentos de ponta da raiz de soja transgênica (2-3 cm) foram transferidos para HRM. Raízes que estavam expressando tiras incompletas de fluorescência (quimeras) ou exibindo níveis globais baixos de fluorescência da GFP foram evitadas. Eventos transgênicos independentes, gerados a partir de diferentes locais de inoculação ou diferentes cotilédones, foram mantidos separadamente para extração de RNA e ensaios demográficos de nematóides. Manutenção de Nematóide

[000101] Uma população NCS de Racine, Wisconsin (Hg tipo 7), colhida por Ann MacGuidwin (University of Wisconsin-Madison), foi mantida no cultivo de soja suscetível Williams 82. As sementes foram germinadas entre dois pedaços úmidos de toalha de papel que foram enrolados e colocados verticalmente em um copo de vidro com uma pequena quantidade de água na parte inferior por 2-4 dias. As sementes germinadas foram plantadas em mistura autoclavada 4:1 de areia:solo e inoculadas com 2000 ovos de H. glycines por planta, e cresceram em uma câmara de crescimento a 28°C. Cistos foram coletados ~ 50 dias após a infecção, quando a soja estava em R2 (florescimento pleno) e extraídos de solo e das raízes, utilizando peneiras e centrifugação. Resumidamente, o solo e as raízes dos potes infectados foram colocados em um jarro de água e agitados. A lama da água do cisto do solo passou através de uma torre de crivo de 710μm - 250 µm, e a mistura do crivo de 250 µm foi lavado em um tubo cônico de plástico de 50 ml. Os tubos foram centrifugados a 2000 rpm durante 4 minutos, e o sobrenadante foi decantado. Uma solução de sacarose a 60% foi adicionada aos tubos, agitada, e centrifugada a 2000 rpm durante 2 min. Cistos no sobrenadante foram colhidos em um crivo de 250 µm. Cistos coletados foram armazenados a 4 C em sacos de plástico hermeticamente fechados e contêm areia de sílex esterilizada duas vezes. Ensaio da demografia dos nematóides

[000102] Ensaios da demografia de nematóide foram realizados em Melito e colaboradores, infra. Foram utilizados novos segmentos radiculares vigorosos (2-3 cm incluindo ponta da raiz). Todas as raízes (todos os genótipos em um experimento) foram codificadas com um número aleatório antes da inoculação, para mascarar informações do genótipo da raiz dos investigadores que coloriram raízes duas semanas mais tarde e determinaram o número de nematóides em cada categoria de desenvolvimento do nematóide. Para inóculo, ovos H. glycines foram colhidos quebrando cistos abertos com uma grande tampa de borracha e colhendo os ovos em uma peneira consistindo de peneiras de 250 µm - 75 µm - 25 µm (Teste Padrão dos EUA com Peneiras). Os ovos foram coletados com uma peneira de 25 µm e enxaguados.

Os ovos foram colocados em uma câmara de escotilha com ZnCl2 3 mM durante incubação à temperatura ambiente no escuro durante 5-6 dias.

Veja Wong, ATS, G.L.

Tylka e R.G.

Hartzler, Efeitos de oito herbicidas em incubação in vitro de Heterodera glycines-. Journal of Nematology, 1993. 25 (4): p. 578-584. Nemátodos J2 eclodidos foram esterilizados à superfície durante 3 min em 0,001% de cloreto mercúrico e lavados três vezes com água destilada estéril, e suspensos em 0,05% de temperatura ambiente com baixo ponto de fusão de agarose a fim de facilitar uma distribuição uniforme.

Baum, TJ, M.J.E.

Wubben, KA Hardy, H.

Su, e S.R.

Rodermel, Uma tela para os mutantes de Arabidopsis thaliana com alterações na vulnerabilidade aos Heterodera schachtii.

Journal of Nematology, 2000. 32 (2): p. 166-173. O número de nematóides ativos foi determinado através da visualização de uma alíquota sob microscópio estereoscópico, pelo menos, meia hora depois da esterilização da superfície e lavagem, e 200-250 J2s ativos foram inoculadas em cada segmento de raiz fresca.

Raízes inoculadas com nematóides foram mantidas no meio GRH a 28°C; crescimento radicular substancial ocorreu tipicamente durante as duas semanas subsequentes.

A infecção por nematóides e desenvolvimento no âmbito destes sistemas radiculares foi monitorado através da limpeza e coloração com fucsina ácida, geralmente 15 dias após a inoculação (dpi). Bybd, D.W., T.

Kirkpatrick, and K.R.

Barker, Uma técnica melhorada para compensação e coloração de tecidos vegetais para a detecção de nematóides.

Journal of Nematology, 1983. 15 (1): p. 142-143. O ensaio demográfico de nematóide foi concluído com o registro do número de nematóides em cada sistema radicular que exibiu uma morfologia semelhante a qualquer J2 (fina), J3 nematóides femininos (em formato de de salsicha), masculino alongado, ou nematoides fêmeas adultos J4/, como observado no texto e nas figuras.

Normalmente, 20-80 nematóides estavam presentes em cada raiz; raízes que contêm menos do que dez nematóides foram excluídos de análises posteriores.

Os resultados foram expressos como % de nematóides que se desenvolveu além do estágio J2 ([J3 + machos adultos + fêmeas adultas] [J2 + J3 + machos adultos + fêmeas adultas]/). Cada ponto de dados foi normalizado para a média de raízes Williams 82 transformadas com o vetor vazio, do mesmo experimento.

Todos os dados apresentados baseiam-se em pelo menos dois experimentos replicados biológicos independentes (n> 12 raízes transformadas de forma independente para cada barra no gráfico de barras).

Tabela do Iniciador

[000103] As sequências dos iniciadores utilizados para realizar este estudo são listadas na Tabela 4 e referenciadas pelo número neste documento. Tabela 4. Sequências de DNA de iniciadores oligonucleotídicos utilizados para PCR.

No ID ID Iniciador Sequência Seq: Silenciamento de Construções 1 2570 hpRNAi _F AGGATCCATTTAAATCAAGTACTCTTCCCCACAAAAGCT 19 2 2570 hpRNAi _R ACCTAGGAGGCGCGCCTGGGGCCATTTCAGTAATTAGGTC 20 3 2580 hpRNAi _F acctaggaggcgcgccTCATGAAGGTTCTCGGCGTAG 21 4 2580 hpRNAi _R aggatccatttaaatCCACCAGTGAATTCCAAACCA 22 2590 hpRNAi _F GAcctaggcgcgccGGACTTGGTCGTCAACACAGTC 23 6 2590 hpRNAi _R GCggatccatttaaatGAGCAGCAAACTGGGCAACT 24 7 2600 hpRNAi _F acctaggaggcgcgccGCCAAATTCAAAAGGCTTGCT 25 8 2600 hpRNAi _R aggatccatttaaatCACCATTCAACATGCCTGTCA 26 9 2610 hpRNAi _F taacctaggaggcgcgccACAACTCCTTCCGATTCGTTCCG 27 2610 hpRNAi _R caggatccatttaaatAGATACAACCACCTGAATACGCCC 28 11 2620 hpRNAi _F AGGATCCATTTAAATCTCGCAACACCATATCCAGAGTA 29 12 2620 hpRNAi _R ACCTAGGAGGCGCGCCGGTGTTAAGGTCGAACCTGCGAA 30 13 2590-1 I miR-s gaTATTGGTTATAGCAACACCGTtctctcttttgtattcc 31 14 2590-1 II miR-a gaACTTTGCTATAACCAATAtcaaagagaatcaatga 32 2590-1 III miR*s gaACAGTGTTGCTATTACCAATTtcacaggtcgtgatatg 33 16 2590-1 IV miR*a gaAATTGGTAATAGCAACACTGTtctacatatatattcct 34 17 2610-1 I miR-s gaTATTTCCCGACCCGACGGGACtctctcttttgtattcc 35 18 2610-1 II miR-a gaGTCCCGTCGGGTCGGGAAATAtcaaagagaatcaatga 36 19 2610-1 III miR*s gaGTACCGTCGGGTCCGGAAATTtcacaggtcgtgatatg 37 2610-1 IV miR*a gaAATTTCCGGACCCGACGGTACtctacatatatattcct 38 21 2610-2 I miR-s gaTATCCAGTCACCGCGACGTGGtctctcttttgtattcc 39 22 2610-2 II miR-a gaCCACGTCGCGGTGACTGGATAtcaaagagaatcaatga 40 23 2610-2 III miR*s gaCCCCGTCGCGGTGTCTGGATTtcacaggtcgtgatatg 41 24 2610-2 IV miR*a gaAATCCAGACACCGCGACGGGGtctacatatatattcct 42

Abundância da Transcrição Usando qPCR gm18: 2570 F_qPCR TGAGATGGGTGGAGCTCAAGAAC 43 26 gm18: 2570 R_qPCR AGCTTCATCTGATTGTGACAGTGC 44 27 gm18: 2580 F_qPCR CGTGTAGAGTCCTTGAAGTACAGC 45 28 gm18: 2580 R_qPCR ACCAGAGCTGTGATAGCCAACC 46 29 gm18: 2590 F_qPCR TCGCCAAATCATGGGACAAGGC 47 gm18: 2590 R_qPCR CAATGTGCAGCATCGACATGGG 48 31 gm18: 2600 F_qPCR GCTTCAGTCAAGAAAATGTGCATG 49 32 gm18: 2600 R_qPCR CACCCGAAACCGCGACACAAATG 50 33 gm18: 2610 F_qPCR AGGTCACGTGTTGCCGTTG 51 34 gm18: 2610 R_qPCR AAACCACACCAATAACAACAAAGCTCT 52 gm18: 2620 F_qPCR AAGCCCAACAGGCCAAAGAGAG 53 36 gm18: 2620 R_qPCR ACACCAAATGGGTTCGCACTTC 54 37 gm18: 2630 F_qPCR TTGTGGAAGTGAAAGTCGGTTTGC 55 38 gm18: 2630 R_qPCR GTTGTCACGTTTCCCGTAACAATG 56 39 EF1b_For.qRT CCACTGCTGAAGAAGATGATGATG 57 40 EF1b_Rev.qRT AAGGACAGAAGACTTGCCACTC 58 41 SKIP16_For.qRT GAGCCCAAGACATTGCGAGAG 59 42 SKIP16_Rev.qRT CGGAAGCGGAAGAACTGAACC 60 43 UKN2_For.qRT GCCTCTGGATACCTGCTCAAG 61 44 UKN2_Rev.qRT ACCTCCTCCTCAAACTCCTCTG 62 45 ACT11_For.qPCR ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC 63 46 ACT11_Rev.qPCR GCTGGTCCTGGCTGTCTCC 64 47 UNK1_For.qPCR TGGTGCTGCCGCTATTTACTG 65 48 UNK1_Rev.qPCR GGTGGAAGGAACTGCTAACAATC 66 49 TIP41_For. qPCR AGGATGAACTCGCTGATAATGG 67 50 TIP41_Rev.qPCR CAGAAACGCAACAGAAGAAACC 68 51 PR-1 (6790) F TGCTTGGTCACCTGGAAGTTGG 69 52 PR-1 (6790) R AACTTCCTGCGAGCTGCGATAC 70 53 PR-1 (6800) F AGTCATTGTGGGTGATCATGCTG 71 54 PR-1 (6800) R GCAGCGTTGTGTGCATTAACAAAG 72

Vetores de Expressão 55 Ox2610-SalF2 gtcgacATGCGCATGCTCACCGG 73

56 P2610fused-R TATTGCGAGAACCAAACCGG 74 57 Ox2590Sal-F GGgtcgacATGGCCGATCAGTTATCGAAGG 75 58 Ox2590fused-R AGTAATAGCCTCATGCTGCTCAAGTT 76 59 TerXba-R ACtctagaGCGCATGTCTTGCGTTGATG 77 60 GmubiXba-F GCtctagaGGGCCCAATATAACAACGACG 78 61 TerKpn-R TCggtaccGCGCATGTCTTGCGTTGATG 79 62 PPA Linker_Top GatgtcTTAATTAAtatctgtGGGCCCactatGGCGCGCCaatgtaaA 80 AGCTTttacattGGCGCGCCatagtGGGCCCacagata 81 63 PPA Linker_Bottom TTAATTAAgacatCTGCA 64 Ox2600-F ATGGTTTCGGTTGATGATGGG 82 65 Ox2600-R TTTTTGTGCATATAAGGGGTTCAT 83 66 NosHind-F GCaagcttGATCATGAGCGGAGAATTAAGGG 84 67 Nos2600-R CCCATCATCAACCGAAACCATAGATCCGGTGCAGATTATTTGG 85 68 Nos2600-F CCAAATAATCTGCACCGGATCTATGGTTTCGGTTGATGATGGG 86 69 NosAsc-R TCggcgcgccGCGCATGTCTTGCGTTGATG 87 70 Ox2580-F ATGTCTCCGGCCGCCG 88 71 Ox2580-R TGACTTGCTACTAAAAGCATTATATATGTTG 89 72 NosAsc-F CAggcgcgccGATCATGAGCGGAGAATTAAGGG 90 73 Nos2580-R CGGCGGCCGGAGACATAGATCCGGTGCAGATTATTTGG 91 74 Nos2580-F CCAAATAATCTGCACCGGATCTATGTCTCCGGCCGCCG 92 75 NosSbf-R TGcctgcaggGCGCATGTCTTGCGTTGATG 93 76 M13 F GTAAAACGACGGCCAG 94 77 M13 R CAGGAAACAGCTATGAC 95 78 pSM101 seq GTCTTGATGAGACCTGCTGCG 96 79 g2590pHind-F CTTaagcttGAATGGTTTTTGTTTTGTTGTCTCTCAC 97 80 g2590pSal-R TTGGTCGACCGTATCATCCAATG 98

Ponte PCR 81 SCN_Res Bridge F TTTAGCCTGCTCCTCACAAATTC 99 82 SCN_Res Bridge R TTGGAGAATATGCTCTCGGTTGT 100

Sondas para Análise Northern e Transcrição Alt 83 2570F_qPCR TGAGATGGGTGGAGCTCAAGAAC 101 84 2570 UTR Rev CAAGTACTCTTCCCCACAAAAGC 102

85 2570 put exon F TGCAGTTTTAGTGGAAAGGCC 103 86 2570 exon 6 R TCATCAAGCTCAACTTGAATCCC 104

RACE PCR 87 2590-5GSP GATCGGCCATTTTCCTCCGATCGAAACA 105 88 2590-5NGSP GACGACCAAGTCCAAATCCAAAACCCGC 106 89 2590-3GSP AAGCCAAAGAACTTGAGCAGCATGAGGC 107 90 2590-3NGSP CTGTCCAGTTGTTCGTCTTACACATCCA 108 91 2610-5GSP GGCGACGATCTTGACGACGGCGTT 109 92 2610-5NGSP TCATACAGTGCAACCACCAGCCGCG 110 93 2610-3GSP GGACGAGGTCACGTGTTGCCGTTGCT 111 94 2610-3NGSP TTCACCACTATGGGCGTATTCAGGTGGT 112 95 2580-3GSP CCTGGGGGATTCCAAAGGAACGC 113 Construção do Vetor para transformação de soja

[000104] Vetores binários pSM101 e pSM103 para a transformação de soja foram construídos como descrito previamente em Melito e colaboradores. Para gerar e clonar amiRNAs de soja, foram utilizados o Web microRNA Designer (http://wmd3.weigelworld.org) e protocolos. O conceito é mais bem documentada em outras referências. Veja Schwab, R., S. Ossowski, M. Riester, N. Warthmann, e D. Weigel, silenciamento de genes altamente específicos por microRNAs artificiais em Arabidopsis. Célula vegetal, 2006. 18 (5): p. 1121-1133. DNA da soja foi extraído de qualquer expansão de trifolíolos de soja ou de raízes de soja, utilizando um método CTAB relatado anteriormente. Doyle, J.J. and E.E. Dickson, Preservação da planta-amostras para análise de endonuclease de restrição de DNA. Táxon, 1987. 36 (4): p. 715-722. Os fragmentos de PCR para a construção amiRNA TA foram clonados utilizando o kit de clonagem pCR8/GW/TOPO TA (Life Technologies Corp., Carlsbad CA) (Tabela abril 13-24). Vetores binários pGRNAi1 e pGRNAi2 para a transformação de soja foram um presente da Parrot Wayne, University of Georgia (não publicado). Para cada grampo, um fragmento de ADN 300-600bp foi amplificado por PCR (Tabela 4, 1-12) usando polimerase Phusion HF (New England Biolabs, Ipswich, MA) e kit de síntese de cDNA iScript (Biorad, Hercules, CA) como um molde, conforme as instruções do fabricante. Os produtos de PCR foram clonados TA como descrito anteriormente. Os iniciadores utilizados para gerar os fragmentos de DNA foram concebidos para conter locais de restrição AvrW/AscI (iniciador direto) e BamHI/SwaI (iniciador reverso) para permitir a clonagem em pGRNAi1 e pGRNAi2. Para gerar o primeiro braço do grampo, a inserção e o vetor foram digeridos sequencialmente com as endonucleases de restrição SwaI e AscI utilizando o protocolo recomendado pelo fabricante (New England Biolabs, Ipswich, MA). O DNA foi separado em um gel de agarose a 1,0% corado com brometo de etídio, e respectivos fragmentos de DNA foram purificados em gel usando o kit de extração de gel Qiaquick (Qiagen, Valencia, CA) e ligou-se em conjunto durante a noite a 4º C utilizando a ligase de DNA T4 (Promega, Madison, WI). O mesmo procedimento foi utilizado para inserir o segundo braço da construção do grampo utilizando as endonucleases de restrição BamHI e AvrII.

Para construir vetores individuais de superexpressão do gene para Glyma18g02580 (Tabela 4 70, 71), Glyma18g02590 (Tabela 4 57, 58) e Glyma18g02610 (Tabela 4 55, 56), ORF de comprimento total foram amplificados por PCR de cDNA de Fayette utilizando polimerase Phusion HF e TA clonado em pCR8/GW/TOPO como descrito anteriormente.

Glyma18g02600 (Tabela 4 67, 68) foi clonado do DNA genômico através de métodos semelhantes, pois nenhum CDNA Glyma18g02600 foi detectado em bibliotecas de ADNc de raiz.

Glyma18g02610 e Glyma18g02590 ORFs foram recombinados com pGWB14 (promotor CaMV 35S, terminador 6 HA-NOS) utilizando a reação de clonase LR (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Veja Nakagawa, T., T.

Kurose, T.

Hino, K.

Tanaka, M.

Kawamukai, Y.

Niwa, K.

Toyooka, K.

Matsuoka, T.

Jinbo, e T.

Kimura, Desenvolvimento da série de vetores binários de gateway, pGWBs, para realizar a construção eficiente de genes de fusão para a transformação de plantas.

J Biosci Bioeng, 2007. 104 (1): p. 34-41. Glyma18g02610 (Tabela 4 55, 59) foi amplificado por PCR de pGWB14 e TA clonado em pCR8. Esse vetor e pSM103 foram digeridos com XbaI/KpnI e ligados para produzir GmUbiprom: 2610-HA: NOSterm (OE: 2610-HA). O mesmo procedimento foi utilizado para Glyma18g02590 (Tabela 4 57, 59), exceto o fragmento amplificado continha os locais Xbal/Sall e TA clonado em CR8. 2590-HA:NOSterm e pSM103 foram digeridos com XbaI/Sall e ligados para obter GmUbiprom:2590-HA:NOSterm (OE:2590-HA). O OE completo:2590-HA também foi digerido (XbaI / Sall) e ligado em pSM103 contendo OE:2610-HA para produzir OE:2610-OE:2590. Para gerar a construção de superexpressão de quatro genes, os locais de restrição PacI, PspOMI e AscI foram adicionados a pSM101 entre os locais PstI / HindIII por emparelhamento dos oligos (Tabela 4 62, 63) para gerar pSM101+. A cassete de superexpressão com dois genes (OE:2610- OE:2590) foi movido para o novo pSM101+ usando as enzimas de restrição PstI/KpnI e ligadura.

Um promotor Nos foi adicionado ao Glyma18g02600 em pCR8 utilizando sobreposição PCR (Tabela 4 65-68) e TA clonado em pCR8. Este vetor foi recombinado com pGWB16 (sem promotor, terminator 4xMyc-NOS) em uma reação de clonasse LR para produzir Nosprom:2600-myc:Nosterm (OE:2600-myc). EO:2600-myc foi amplificado por PCR (Tabela 4 66, 72) e TA clonado pCR8, e subclonado em pSM101+ (OE:2610-OE:2590) utilizando enzimas de restrição HinIII/AscI, para se obter vetor de superexpressão com três genes (OE:2610-OE:2590- OE:2600). Um promotor Nos foi adicionado ao Glyma18g02580 em pCR8 utilizando sobreposição PCR com iniciadores 71-74 e TA clonados em pCR8. Este vetor foi usado com pGWB16 em uma reação de clonase LR para produzir Nosprom:2580-myc:Nosterm (OE:2580-myc). EO:2580-myc foi amplificado (Tabela 4 72, 75) e TA clonado, e subclonado no vetor de superexpressão com três genes, resultante no vetor de superexpressão com quatro genes pSM101 + OE:2610-OE:2590-OE:2600 OE:2580. A construção do nativo Fayette Glyma18g02590 (2590FayP:2590Fay) para complementação de Williams 82 foi subclonada de um fosmid contendo o alelo desejado. Um fragmento de DNA de 6,5 kb contendo o PI 88788 Glyma18g02590 foi isolado de uma fosmid após digestão de sal e clonado em pSM101 utilizando o local de restrição de sal. Esta sequência continha aproximadamente 1 kb da sequência 5 de DNA regulatório . Um adicional de 600 pb de sequência regulatória 5 diretamente a montante da região subclonada foi adicionado à construção, amplificando um produto PCR (Tabela 4 79, 80) do fosmid e inserido usando as enzimas de restrição HindIII/Sal. A construção resultante continha aproximadamente 1,6 kb de ocorrência natural de sequência reguladora 5 do alelo Fayette Glyma18g02590. Sequências de vetores foram confirmadas em várias etapas utilizando sequenciamento Sanger com Kit de sequenciamento de ciclo ABI Big Dye (didesoxi- terminação da cadeia) e Analisadores ABI 3730xl DNA (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA), utilizando o serviço de sequenciamento de DNA da Universidade de Wisconsin- Madison Biotechnology Center. Tempo Real Quantitativo PCR

[000105] PCR quantitativo (qPCR) foi realizado utilizando MyIQ ou CFX96 em tempo real do sistema de detecção de PCR (BioRad, Hercules, CA). cDNA foi sintetizado de RNA usando kit de síntese de iScript cDNA (Biorad, Hercules, CA) pelo protocolo de fabricantes pela adição de 0,825 ug a 1,0 ug de RNA, dependendo do experimento. O RNA total foi extraído do tecido da raiz de soja convencional e transgênica. O RNA foi extraído de plantas de soja convencionais cultivadas em mistura Metro durante duas semanas a 26C e 16 horas de luz antes da coleta de tecidos. Aproximadamente 200 mg de tecido foi coletado de cada planta, imediatamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 ° C.

Material de raiz transgênica foi coletado de raízes crescendo ativamente em HRM, como descrito anteriormente.

Aproximadamente 50-100 mg de tecido foi coletado de cada planta, imediatamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 ° C.

O RNA foi extraído utilizando o Mini Kit RNeasy (Qiagen, Valência, CA) ou o reagente TRIzol (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) seguindo protocolos de fabricantes.

Concentrações de RNA foram determinadas usando o espectofotômetro NanoDrop-1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA). O DNA foi removido das amostras de RNA, utilizando qualquer DNase I sem RNase (Qiagen, Valência, CA) ou sem DNA A (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) seguindo os protocolos de fabricação.

A integridade de RNA foi determinada utilizando o BioAnalisador 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ou 500 ng de RNA total foram separados em um gel de agarose a 1,2% corado com brometo de etídio e visualizados sob luz UV para garantir a qualidade do RNA após a extração. reações qPCR foram realizadas usando SYBR Green Supermix QI ou SsoFast EvaGreen Supermix (Biorad, Hercules, CA). As concentrações dos iniciadores para todas as reações estavam entre 0,2 µM e 0,3 µM.

Duas repetições técnicas foram realizadas por RNA.

Curvas de eficiência foram geradas por pares de inicializadores qPCR utilizando cDNA do Fayette cultivar ou Williams 82 após a etapa 3- 4, 3-5 diluições.

Após aamplificação, foi realizada uma curva de fusão do programa.

Para garantir que o sinal fluorescente qPCR não afete os resultados de DNA, 100 ng de extração de RNA foram adicionadas diretamente ao IQ SYBR Green Supermix ou SsoFast EvaGreen Supermix com inicializadores.

A Contaminação de DNA foi considerada insignificante se os valores do CT não forem detectados até depois de 32-35 ciclos.

A reação de controle foi realizada em paralelo com uma amostra de cDNA conhecida.

Abundância da transcrição de genes em Rhg1 foi medido utilizando inicializadores XX.

Um total de seis pares de iniciadores foram testados como genes de referência (EF1B, SKIP16, UNK2, ACT11, UNK1, TIP41) (Tabela 4 39-50). Hu, R.B, C.M.

Fan, H.Y.

Li, Q.Z.

Zhang, e Y.F.

Fu, Avaliação de genes putativos de referência para a normalização da expressão gênica em soja por tempo real quantitativo RT-PCR.

Bmc Biologia Molecular, 2009. 10: p. 12. Genes de referência foram validados por meio de análise Bestkeeper.

Pfaffl, M.W., A.

Tichopad, C.

Prgomet, e T.P.

Neuvians, Determinação de genes estáveis de armazenamento, genes alvo diferencialmente regulados e a integridade da amostra: BestKeeper - ferramenta Excel baseada em meio de correlações de pares.

Biotechnology Letters, 2004. 26 (6): pág. 509-515. Pares de iniciadores SKP16 e TIP41 foram selecionados e utilizados em experiências subsequentes.

Raízes transgênicas expressando construções de vetor vazio análogas aos vetores que carregam o silenciamento de genes ou construções de expressão de genes foram incluídas nas experiências como controles e utilizadas para padronizar a expressão do gene. Os resultados foram considerados nos limites de detecção, se os valores de CT foram>35 (isto é, para transcrições Glyma18g02600). Análise da junção de repetição de DNA

[000106] A presença de uma junção de repetição foi confirmada usando PCR (Tabela 4 81, 82) e DNA genômico de soja de cultivares resistentes à NCS Fayette, Hartwig, Newton e cultivares suscetíveis à NCS Williams 82, Essex, Thorne e Sturdy. Extração de DNA e PCR foi realizada como descrito anteriormente. Possíveis impactos da retrotransposons sobre evolução de locus Rhg1 foram investigados através da busca de sequências com similaridade para retrotransposons de plantas conhecidas. Uma sequência de 185 pb com 75% de identidade com repetição do terminal com 5´ e 3´ de extensão das regiões (LTR) de TY1/retrotransposões de copia RTvr1 e RTvr2 está presente dentro de 400 pb da junção duplicação rhg1-b. Análise estatística

[000107] Os dados foram analisados pela ANOVA usando o Minitab (v.14), com o Modelo Linear Geral e Teste Simultâneo Tukey. Construção da biblioteca Fosmid

[000108] Semente de Introdução da Planta de soja (PI) 88788 foi obtido da coleta de germoplasma de soja USDA. As plantas foram cultivadas em uma câmara de crescimento fixada a um fotociclo de 18/6 horas (dia / noite), 23/20°C (dia / noite) e 50% de umidade relativa durante 1-2 semanas. Tecido foliar jovem foi coletado de seis a 15 indivíduos para cada linha. O DNA genômico foi extraído usando brometo de cetrimônio (CTAB). As amostras de plantas foram moídas e transformadas em um pó fino em azoto líquido, transferidas para 20 ml de tampão de extração CTAB (2% de CTAB, 100 mM de Tris pH 9,5, 1,4 M NaCl, 1% de PEG 6000, 20 mM de EDTA, 2% de polivinilpirrolidona, 2.5%  - mercaptoetanol), e colocados a 65 °C durante 1 h. Após a incubação, um volume igual de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1, pH 6,7) foi adicionado ao tubo e centrifugado a 8000 g a 10°C durante 10 min. A fase (topo) aquosa foi transferida para um novo tubo e um volume igual de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) foi adicionado à fase aquosa e centrifugado. A fase (topo) aquosa foi então transferida para um novo tubo e 0,7 volumes de álcool isopropílico foram adicionados à fase aquosa. Após misturar bem, a fase aquosa foi centrifugada e o sedimento ressuspenso em 70% de

EtOH, centrifugado a 7.500 g durante 10 min. Após a centrifugação, o sedimento foi ressuspenso em 100 ul de TE (Tris 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM). O DNA foi tratado com RNase A, por incubação em 20 ug/ml de RNase A a 37°C durante 1 h. A biblioteca fosmid PI 88.788 foi construída utilizando o CopyControl ( Kit de Produção da Biblioteca Fosmid (Epicentre, Madison, WI) seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, 20 ug de DNA fracionado pelo tamanho foi utilizado para o fim de reparação. Grupos fragmentos de 35-45 kb de DNA foram clonados no Vetor pCC1FOS™ . DNA ligado foi embalado usando Extratos de empacotamento MaxPlax™ Lambda e transformados no Phage deformação resistente a T1 EPI 300 ™-T1R E. coli Sequenciamento e montagem do clone fosmid

[000109] Cinco clones fosmid candidatos foram identificados pela classificação da aglomeração em PCR utilizando iniciadores com base no intervalo rhg1-b da sequência de referência Williams 82. Uma vez que foi confirmado que as sequências finais estavam associadas à região antecipada da sequência do genoma de referência de soja, elas foram sequenciadas utilizando Roche 454 GS FLX+ sistema (Roche) e Illumina MiSeq (Illumina). 1-3 ug de DNA de clone fosmid foi usado para fazer bibliotecas de sequenciamento emparelhado para 454 / GS FLX+. Após a construção da biblioteca, bibliotecas de código de barras combinados foram carregadas para uma pista da célula de fluxo de sequenciamento e sequenciadas. O tempo médio de leitura foi 463 pb. O número de leituras geradas de 454/GS FLX+ é como se segue: clone fosmid #1 na Fig. 2A). 10.865, #2: 6271, nº 3: 6648, #4: 6520, e #5: 9390. As leituras foram montados utilizando a associação Phrap/Cross_ (www.phrap.org) e CAP3. Huang, GZ, R. Allen, EL Davis, T.J. Baum, e R.S. Hussey, Engenharia resistência ampla de galhas em plantas transgênicas por silenciamento RNAi de um gene de parasitismo nematóide de galhas conservado e essencial. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006. 103 (39): p. 14.302-14.306. Para o MiSeq, 0,3-2 ug de ADN foi utilizado para fazer a biblioteca de sequenciação. O tamanho médio do fragmento de DNA foi de 550 pb (intervalo de 430- 720 pb). 154 ciclos de cada extremidade dos fragmentos foram realizados utilizando um kit de sequenciamento TruSeq SBS versão 1 e analisados com Casava1.8 (gasoduto 1.8). Durante as leituras, os escores médios de qualidade para cada base foram mais de 30. O número de leituras geradas de MiSeq é o seguinte: clone fosmid #1 na Fig. 2A). 1067403, #2: 814728, #3: 1156784, #4: 1091852 e #5: 946.028. ABySS foi usado para montar a leituras de MiSeq. Simpson, JT, K. Wong, S.D. Jackman, J.E. Schein, S.J.M. Jones, e I. Birol, Abyss: Uma montadora paralela para dados de seqüência de leitura curta. Genome Research, 2009. 19 (6): p. 1117-1123. O resultado foi visualizada usando Geneious. Sequências homopoliméricas e outras regiões problemáticas foram sequenciadas manualmente usando Sanger primer walking. Todo o sequenciamento de disparo do genoma e leitura em profundidade na região duplicada

[000110] Todo o sequenciamento de disparo de genoma de uma linha de produção LD09-15087ª, uma linha quase isogênica (NIL), que abriga rhg1-b do PI 88.788, foi realizado utilizando a tecnologia Illumina. 1,5 ug de DNA genÔmico foi sequenciado utilizando o instrumento Ilumina HiSeq 2000 com 100 pb de sequenciamento emparelhado no Centro de Biotecnologia da Universidade de Illinois. O tamanho do fragmento de DNA para toda a biblioteca de sequenciamento de disparo do genoma foi de 600 pb; a biblioteca foi carregada em uma pista de uma célula de fluxo e sequenciada utilizando a versão 3 do kits de sequenciamento e Casava 1,8 (gasoduto 1.9). 312909668 lê (cerca de 28 × cobertura do genoma da soja 1.1 gb) foram gerados com todas as posições com escores médios de qualidade 30 ou superior. Para examinar a profundidade da cobertura dentro da região duplicada, leituras de sequenciamento foram alinhadas com a versão Glyma1 da montagem do genoma da soja. Novoalign (v 2.08.01) (http://www.novocraft.com) com opções finais emparelhadas (PE 600120) foi utilizado para alinhar as leituras para o genoma de referência. Cerca de 95,1% de leituras foram alinhadas com a sequência de referência. O número de leituras alinhadas ao intervalo alvo foi contado a partir de um arquivo BAM usando SAMtools (v 0.1.18). Intervalo alvo é a seguinte: "Bloco" na Fig. 5B). uma região de 31,2 kb (1,632,225-1,663,455 no cromossomo 18), "Bloco-1": região com o mesmo tamanho que a região de interesse a montante, e "Bloco+1": região com o mesmo tamanho que a região de interesse a jusante. Regiões homólogas no cromossomo 11 ("Bloco" na Fig. 5B:. 37,392,345-37,434,356 bp) e 2 ("Bloco": 47,772,323-47,791,521 pb) foram identificados utilizando BLASTN. Abordagens análogas foram utilizadas com os dados da sequência NAM de soja. A Tabela mostra as sequências de aminoácidos para os quatro genes.

[000111] Tabela 5: As sequências de aminoácidos para Glyma18g2580, Glyma18g2590, Glyma18g2600 e Glyma18g2610

[000112] > Glyma18g02580.1 | PACid:16307711 (SEQ ID NO: 1)

[000113] MSPAAGVSVPLLGDSKGTPPPASVPGAVFNVATSIVGAGIMSIPAIMKVLGVVPAFA

MILVVAVLAELSVDFLMRFTHSGETTTYAGVMREAFGSGGALAAQVCVIITNVGGLILYLIIIG DVLSGKQNGGEVHLGILQQWFGIHWWNSREFALLFTLVFVMLPLVLYKRVESLKYSSAVSTL LAVAFVGICCGLAITALVQGKTQTPRLFPRLDYQTSFFDLFTAVPVVVTAFTFHFNVHPIGFEL AKASQMTTAVRLALLLCAVIYLAIGLFGYMLFGDSTQSDILINFDQNAGSAVGSLLNSLVRVS YALHIMLVFPLLNFSLRTNIDEVLFPKKPMLATDNKRFMILTLVLLVFSYLAAIAIPDIWYFFQF LGSSSAVCLAFIFPGSIVLRDVKGISTRRDKIIALIMIILAVVTSVLAISTNIYNAFSSKS*

[000114] > Glyma18g02590.1 | PACid:16307712 (SEQ ID NO: 2)

[000115] MADQLSKGEEFEKKAEKKLSGWGLFGSKYEDAADLFDKAANCFKLAKSWDKAGA

TYLKLASCHLKLESKHEAAQAHVDAAHCYKKTNINESVSCLDRAVNLFCDIGRLSMAARYLK EIAELYEGEQNIEQALVYYEKSADFFQNEEVTTSANQCKQKVAQFAAQLEQYQKSIDIYEEIA RQSLNNNLLKYGVKGHLLNAGICQLCKEDVVAITNALERYQELDPTFSGTREYRLLADIAAAI DEEDVAKFTDVVKEFDSMTPLDSWKTTLLLRVKEKLKAKELEEDDLT*

[000116] > Glyma18g02610.1 | PACid:16307714 (SEQ ID NO: 3)

[000117] MRMLTGDSAADNSFRFVPQSIAAFGSTVIVEGCDSARNIAWVHAWTVTDGMITQIR

EYFNTALTVTRIHDSGEIVPARSG

[000118] > Glyma18g02600.1 | PACid:16307713 (SEQ ID NO: 4)

[000119] MVSVDDGIVNPNDEIEKSNGSKVNEFASMDISATQKSYLNSEDPQRRLQGTLISSSV

TNRINFLKFGSASAKFKRLATERDQVSISVPSPRSKSLRSRFSGMFAQKLDWASVKKMCMEWI RNPVNMALFVWIICVAVSGAILFLVMTGMLNGVLPRKSKRNAWFEVNNQILNAVFTLIPNDIS SLRKVYCKNVTYKPHEWTHMMVVVILLHVNCFAQYALCGLNLGYKRSERPAIGVGICISFAI AGLYTILSPLGKDYDCEMDEEAQVQITASQGKEQLREKPTEKKYSFASKDQQRVVENRPKWS GGILDIWNDISLAYLSLFCTFCVLGWNMKRLGFGNMYVHIAIFMLFCMAPFWIFLLASVNIDD DNVRQALAAVGIILCFLGLLYGGFWRIQMRKRFNLPAYDFCFGKPSASDCTLWLPCCWCSLA

QEARTRNNYDLVEDKFSRKETDTSDQPSISPLAREDVVSTRSGTSSPMGSTSNSSPYMMKTSSS PNSSNVLKGYYSPDKMLSTLNEDNCERGQDGTMNPLYAQK* Fiber-FISH

[000120] Núcleos de soja foram lisados para liberar grandes segmentos cromossômicos e, em contraste com os métodos FISH mais padronizados, os segmentos de cromossoma foram descondensados para gerar fibras estendidas antes da fixação das lâminas de microscopia e hibridar com as sondas de DNA marcadas por fluorescência. Tecidos foliares jovens foram coletados de plantas de crescimento rápido de Williams 82, de Peking, e Fayette. Isolamento de núcleos, preparação de fibras DNA, e fibra-FISH foram realizados seguindo protocolos publicados. Jackson, SA, M.L. Wang, H.M. Goodman, e J. Jiang, Aplicação de fibra-FISH no mapeamento físico de Arabidopsis thaliana. Genoma, 1998. 41 (4): p. 566-72. Um clone fosmid abrangendo uma repetição rhg1-b de PI 88788 foi digerido com a exonuclease Smal (New England Biolabs, Ipswich, MA). Os produtos da digestão de restrição foram separados em um gel de 0,7% e isolados utilizando o kit de extração de gel Qiaex II (Qiagen, Valência, CA). Sondas de DNA foram marcadas com biotina-16- UTP ou digoxigenina-11-dUTP (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) utilizando uma reação de transferência nick de padrão. As imagens fiber-FISH foram processadas com o software Meta Imaging Série 7.5. O contraste final das imagens foi processado utilizando o software Adobe Photoshop CS3. As medições citológicas dos sinais da fibra-FISH foram convertidas em kilobases utilizando uma taxa de conversão de 3,21 kb/μm . Análise da Transcrição

[000121] Para confirmar a anotação de transcrições em Rhg1, amplificação rápida das extremidades de cDNA (RACE) PCR foi realizada para Glyma18g02580 (Tabela 4 95), Glyma18g02590 (Tabela 4 87- 90) e Glyma18g02610 (Tabela 4 91- 94) utilizando o kit SMARTer RACE cDNA por protocolos fabricante (ClonTech, Mountain View, CA). Após RACE, os produtos PCR foram clonados em pCR8 TA/GW/TOPO como mencionado anteriormente. Colônias aleatoriamente escolhidas foram sequenciadas (Tabela 4 76, 77) como descrito para confirmar as extremidades 5 'e 3' das transcrições individuais. Para detectar potenciais isoformas de transcrição, análise Northern foi realizada utilizando métodos padrão. As sondas foram geradas para Glyma18g02570 (Tabela 4 83, 84). Ausência de transcrições truncadas Glyma18g02570 (Tabela 4 85, 86) derivadas de junções de repetição de 31,2 kb também foi confirmada por PCR de ADNc, utilizando um iniciador reverso 2570 e um iniciador direto no exon mais fortemente previsto a montante da junção da repetição. Hebsgaard, S.M., P.G. Korning, N. Tolstrup, J. Engelbrecht, P. Rouze, e S. Brunak, previsão local Splice em Arabidopsis thaliana pré- mRNA, combinando informações de sequência local e global. Nucleic Acids Research, 1996. 24 (17): p. 3439-3452. Estudos de abundância de transcrições usando qPCR também indicaram que não há uma transcrição Glyma18g02570 semelhante produzida pela inserção de DNA repetida. Abundância da transcrição Glyma18g02570 foi medida utilizando iniciadores (Tabela 4 25, 26) que amplificam os dois exons finais e, portanto, deve amplificar o genoma de referência (de comprimento completo; Williams 82) Glyma18g02570 transcritos e possíveis transcritos Glyma18g02570 híbridos que são transcritos de DNA que abrange a junção da repetição. Se o DNA repetido produziu uma transcrição alternativa, estes primers que amplificam produto adicional de genótipos com a repetição. No entanto, não foram detectadas diferenças na abundância transcrição entre variedades resistentes à SCN e suscetíveis à SCN usando inicializadores Glyma18g02570 25 e 26. Previsão e comparação da estrutura de proteínas

[000122] A estrutura da proteína para o produto do gene Glyma18g02610 previsto foi modelada, e proteínas com as estruturas mais homólogas foram identificadas utilizando Phyre2, com configurações padrão. Kelley, L.A. and M.J.E. Sternberg, Predição de estrutura de proteínas na Web: um estudo de caso utilizando o servidor Phyre. Nature Protocols, 2009. 4 (3): p. 363-371. Análise de Metilação

[000123] Metilação de DNA específica de locus foi analisada utilizando a endonulease específica de metilação McrBC, ou endonuclease sensível à metilação HpaII seguida por PCR. McrBC (New England Biolabs, Ipswich, MA) digere ADN com as citosinas metiladas de um modo independente da sequência, embora DNA não seja digerido. Hpall (New England Biolabs, Ipswich, MA) digere DNA na sequência de reconhecimento CCGG, mas a atividade de endonuclese de HpaII é bloqueada por metilação da citosina. As digestões de restrição foram realizadas utilizando 600-700ng de ADN e os protocolos do fabricante. As reações de controle foram criadas por adição da mesma quantidade de DNA ao tampão da reação, sem enzima de restrição. As amostras, com e sem a enzima de restrição, foram incubadas a 37 C durante 90 minutos e inativada pelo calor a 65 C durante 20 minutos. DNA foi visualizado em um gel corado com brometo de etídio a 0,8% para assegurar a digestão de ADN. Ambas as amostras de DNA digeridas e controladas foram usadas para PCR subsequente usando polimerase GoTaq Flexi DNA (Promega, Madison, WI). Para DNA tratado com McrBC, iniciadores de PCR que mediram DNA metilado não geraram o produto pretendido após PCR, pois o modelo DNA seria digerido por McrBC. DNA que não foi metilado ou não tratado com a enzima produziu um produto com o tamanho esperado. Para DNA tratado com Hpall, iniciadores PCR que mediram a sequência de DNA em que a citosina foi metilado produziu um produto de PCR com o tamanho esperado. CCGG sequência de DNA que não foi metilada foi clivada por Hpall e falhou em produzir um produto PCR. DNA incubadas em tampão sem Hpall geraram produtos PCR esperados. Veja a tabela no Apêndice F e a figura para obter detalhes sobre os inicializadores e os resultados. Análise de Western Blot

[000124] O tamanho e abundância da proteína foram medidos usando procedimentos Western blot e de imunodetecção (Ausubel e colaboradores 1997). Resumidamente, a proteína foi extraída a partir de raízes de soja transgénicas por homogeneização de tecido de raiz congelada e resuspensão do material em tampão de amostra 2x Tricina (TrisCl 0,1 M/0,3%de SDS, pH 6,8, 24% glicerol, 8% SDS, 0,2 M de DTT) a 1:1 w rácio/v. Um volume igual de cada amostra de proteína foi separado em um gel de poliacrilamida Tris-tricina (9,8% gel de separação, 3,9% de gel de empilhamento) usando eletroforese na cassete Biorad Mini Protean3 (Biorad, Hercules CA). As amostras são separadas a 35 volts durante cerca de uma hora, seguido de outra hora a 160 volts. O gel foi transferido para um cassete de transferência e aquoso transferido para uma membrana de nitrocelulose Protran (Whatman, Piscataway, NJ). A transferência foi realizada durante uma hora a 80 volts a temperatura ambiente. Após a transferência, as membranas foram coradas em proteína total usando 0,1% de Ponceau S (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em 5% de ácido acético e fotografadas. Ponceau S foi descorado em ddH20, e a membrana foi bloqueada durante a noite a 4 (C em TBST 20 mM Tris pH 7,5, 8g/l de NaCl, 0,1% de Tween) transportando 5% de leite. Mais 5% de leite em TBST foi adicionado à membrana e colocado em um agitador à temperatura ambiente durante 30 minutos. A membrana foi incubada com o anticorpo primário HÁ diretamente HA conjugado a peroxidase de rábano (HRP) a uma diluição 1:1000 na concentração de 5% de leite TBST durante 90 minutos. A membrana foi lavada 3x em TBST à temperatura ambiente em um agitador durante 20 minutos cada. Substrato de Duração Estendida Supersignal West Dura (Thermo Scientific, Waltham, MA) o kit ECL foi utilizado seguindo os protocolos de fabricante para detectar o anticorpo HA-HRP na membrana. A memebrana foi exposta a filme Cl-Xposure (Thermo Scientific, Waltham, MA) e desenvolvida.

Claims (60)

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO DE AUMENTAR A RESISTÊNCIA DE UMA PLANTA AOS NEMATOIDES, caracterizado por compreender o aumento da expressão, alteração do padrão de expressão ou o aumento do número de cópias de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídio Glyma18g02580, um polipeptídio Glyma18g02590, ou um polipeptídio Glyma18g02610, um polipeptídio que possui 90% ou mais de identidade com a SEQ ID NO: 1 (2580), SEQ ID NO: 2 (2590), SEQ ID NO: 3 (2610), SEQ ID NO: 5 (2590-88788), SEQ ID NO: 6 (2590-Peking) ou homólogos, variantes funcionais ou combinações de qualquer um dos polipeptídios acima referidos em células vegetais, em que o aumento da expressão do polinucleotídeo em células vegetais aumenta a resistência da planta ao nematoides.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado em que a expressão é aumentada por via de transformação genética da planta.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado em que a planta é selecionada da soja, beterraba, batatas, milho, ervilhas e feijões.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 1-3, caracterizado em que a expressão é aumentada em células da raiz da planta.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 1-4, caracterizado em que a expressão do polipeptídio é aumentada pelo aumento da expressão do polinucleotídeo nativo.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 1-4, caracterizado em que a expressão do polipeptídio é aumentada através da introdução de uma construção, incluindo um promotor operacional na planta operacionalmente ligada a um polinucleotídeo que codifica o polipeptídio nas células da planta.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 1-4, caracterizado em que a expressão do polipeptídio é aumentada através da introdução de um transgene, caracterizado por compreender um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica o polipeptídio na planta.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 1-4, caracterizado em que a expressão do polipeptídio é aumentada através da introdução de uma ou mais cópias de um polinucleotídeo que codifica, pelo menos, dois de um polipeptídio Glyma18g02580, um polipeptídio Glyma18g02590 e um polipeptídio Glyma18g02610.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado em que as cópias são introduzidas no lócus Rhg1 da planta.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado em que pelo menos três cópias do polinucleotídeo são introduzidas na planta.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado em que pelo menos dez cópias do polinucleotídeo são introduzidas na planta.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado em que a expressão de um polipeptídio Glyma18g02580, um polipeptídio Glyma18g02590 e um polipeptídio Glyma18g02610 são aumentadas.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por aumentar ainda o padrão de expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídio Glyma18g02600, ou um polipeptídio que possui 90% ou mais de identidade com a SEQ ID NO: 4 (02600).

14. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado em que a planta aumentou a resistência aos nematoides de cisto, ou nematoides de cisto da soja (NCS), em comparação com uma planta de controle.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado em que o aumento da resistência pode ser medido pela planta que tem uma percentagem mais baixa de invasão de nematoides que se desenvolvem após o estágio J2, uma menor taxa de formação de cistos nas raízes, redução da produção de ovos NCS nos cistos, redução da produção global de ovo NCS por planta, e/ou maior rendimento da soja, em uma base por planta, ou uma base por área de cultivo, conforme comparado com uma planta de controle cultivada em um ambiente de crescimento semelhante.

16. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 1-15, caracterizado em que o índice de nematoides fêmea da planta após a exposição aos nematoides é mais baixo do que o de uma planta de controle.

17. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 1-16, caracterizado em que as sequências derivadas de PI88788-, PI437654-, ou fontes derivadas Peking são usadas no lugar das sequências Williams 82 fornecidas na Tabela 5.

18. CONSTRUÇÃO, caracterizada por compreender um promotor ligado operacionalmente a um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma parte do polipeptídio Glyma18g02580 compreendendo

SEQ ID NO: 1, um polipeptídio Glyma18g02590 compreendendo SEQ ID NO: 2,5 ou 6,, um polipeptídio Glyma18g02590 compreendendo SEQ ID NO: 3 ou um polipeptídio tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou um homólogo ou parte funcional de qualquer um dos polipeptídios acima referidos ou combinações destes são providos.

19. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada em que o promotor é um promotor vegetal.

20. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada em que o polinucleotídeo codifica os três polipeptídios.

21. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada em que o polinucleotídeo codifica pelo menos dois polipeptídios.

22. CONSTRUÇÃO, de acordo com qualquer das reivindicações 18-21, caracterizado em que o polinucleotídeo codifica ainda um polipeptídio Glyma18g02600.

23. CÉLULA TRANSGÊNICA, caracterizada por compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídio capaz de aumentar a resistência aos nematoides, o polipeptídio possuindo pelo menos 90% de identidade com um polipeptídio Glyma18g02580 compreendendo SEQ ID NO: 1, um polipeptídio Glyma18g02590 compreendendo SEQ ID NO: 2,5 ou 6,, um polipeptídio Glyma18g02590 compreendendo SEQ ID NO: 3 ou um polipeptídio tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou um homólogo ou parte funcional de qualquer um destes ou combinações destes.

24. CÉLULA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada em que o polinucleotídeo codifica para pelo menos dois dos polipeptídios selecionados de Glyma18g02610, Glyma18g02590 e Glyma18g02580.

25. CÉLULA TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada em que o polinucleotídeo codifica para pelo menos um polipeptídio Glyma18g02610, um polipeptídio Glyma18g02590 e um polipeptídio Glyma18g02580.

26. CÉLULA TRANSGÊNICA, de acordo com qualquer das reivindicações 23-25, caracterizada em que o polinucleotídeo está presente em, pelo menos, três cópias na planta.

27. CÉLULA TRANSGÊNICA, de acordo com qualquer das reivindicações 23-25, caracterizada em que o polinucleotídeo está presente em, pelo menos, três cópias na planta.

28. CÉLULA TRANSGÊNICA, de acordo com as reivindicações 23-27, caracterizada em que o polinucleotídeo codifica ainda um polipeptídio Glyma18g02600.

29. CÉLULA TRANSGÊNICA, de acordo com as reivindicações 23-28, caracterizado em que a planta é selecionada da soja, beterraba, batatas, milho, ervilhas e feijões.

30. SEMENTE, caracterizada por compreender a célula transgênica, de acordo com qualquer das reivindicações 23-29.

31. PLANTA CRESCIDA DA SEMENTE, caracterizado de acordo com a reivindicação 30.

32. PLANTA TRANSGÊNICA, caracterizada por compreender a célula, de acordo com qualquer das reivindicações 23-29.

33. PARTE, DESCENDÊNCIA OU PROPAGAÇÃO ASSEXUADA DA PLANTA TRANSGÊNICA, caracterizado de acordo com a reivindicação 32.

34. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA COM AUMENTO DA RESISTÊNCIA AOS NEMATOIDES, caracterizado por compreender a introdução de um polinucleotídeo exógeno que codifica pelo menos uma parte de um polipeptídio Glyma18g02580 possuindo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 1 polipeptídio Glyma18g02590 tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 2, 5 ou 6, ou polipeptídio Glyma18g02610 tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 3, ou um homólogo, variante funcional ou suas combinações em uma célula de planta de soja ou progénie da mesma, em que a expressão do polipeptídio é aumentada em uma célula de raiz da planta de soja, e em que a planta aumentou a resistência aos nematoides em comparação com uma planta de controle.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado em que o polinucleotídeo codifica para pelo menos dois dos polipeptídios selecionados de Glyma18g02610, Glyma18g02590 e Glyma18g02580.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado em que o polinucleotídeo codifica pelo menos um polipeptídio Glyma18g02610, um polipeptídio Glyma18g02590 e um polipeptídio Glyma18g02580.

37. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 34-36, caracterizado em que o polinucleotídeo codifica ainda um polipeptídio Glyma18g02600.

38. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 34-37, caracterizado em que o polinucleotídeo está presente em, pelo menos, três cópias na planta.

39. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 34-37, caracterizado em que o polinucleotídeo está presente em, pelo menos, dez cópias na planta.

40. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 34-38, caracterizado em que a planta é selecionada da soja, beterraba, batatas, milho, ervilhas e feijões.

41. MÉTODO DE CLASSIFICAÇÃO DE UMA PRIMEIRA PLANTA OU CÉLULA DE PLANTA PARA RESISTÊNCIA OU SUSCEPTIBILIDADE AOS NEMATOIDES, caracterizado por compreender. detectar um marcador genético ou um marcador selecionável na primeira célula da planta, o marcador genético ou do marcador selecionável associado com resistência do nematoide do cisto ou susceptibilidade aos nematoides do cisto; e predizer a resistência ou a susceptibilidade da primeira célula de planta para os nematoides.

42. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado em que o marcador genético é o estado de metilação do promotor, a região a montante do gene do corpo ou, pelo menos, um dos Glyma18g02610, Glyma18g02590, ou Glyma18g02580.

43. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado em que o marcador genético é o nível de transcrição de RNA, transcrição ou expressão da proteína de pelo menos um dos Glyma18g02610, Glyma18g02590, Glyma18g02580 ou Glyma18g02600.

44. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado em que o nível é medido em células de raiz.

45. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado em que o marcador genético é o número de cópias do genoma de pelo menos um dos Glyma18g02610, Glyma18g02590, Glyma18g02580, Glyma18g02600 ou qualquer parte da região de 31,2 kb Rhg1 identificada como presente em várias cópias em variedades resistentes.

46. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado em que o marcador genético é o segmento de DNA genômico de realização de uma junção de repetição entre Glyma18g02610 e Glyma18g02570.

47. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado em que o marcador genético é a transcrição ou nível de expressão da proteína de pelo menos um dos Glyma18g02610, Glyma18g02590, Glyma18g02600 ou Glyma18g02580 após ou em contato com um nematoide.

48. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado em que o marcador genético é um polimorfismo de um só nucleotídeo em pelo menos um de Glyma18g02610, Glyma18g02590, Glyma18g02580, Glyma18g02600 ou na região de repetição Rhg1 a 31,2 kb.

49. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado em que o marcador genético é a presença ou ausência de mais do que uma cópia de uma região genômica, caracterizado por compreender pelo menos um dos Glyma18g02600, Glyma18g02610, Glyma18g02590, ou Glyma18g02580.

50. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 41-49, caracterizado em que a etapa de previsão é caracterizada por compreender a comparação do marcador na primeira célula da planta para o marcador em uma segunda célula de planta com um fenótipo de resistência ou susceptibilidade conhecido, em que o fenótipo da segunda célula é preditivo do fenótipo na primeira célula.

51. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 41-50, caracterizado em que a segunda célula de planta é resistente NCS, é PI88788, Peking ou transporta um lócus Rhg1 derivado de PI88788 ou Peking ou outras fontes de resistência NCS mediadas por Rhg1.

52. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41-51, caracterizado em que a segunda célula vegetal é susceptível à NCS é "Williams 82", "Lee 84”, Essex ou carrega um lócus Rhg1 derivado de "Williams 82", "Lee 84”, Essex ou outras variedades em que o lócus Rhg1 é menos eficaz na mediação da resistência à NCS do que o lócus Rhg1 de PI88788 ou Peking.

53. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 41-52, caracterizado em que NCS é controlado por rhg1-b, é um Race 3 NCS, um tipo de Hg NCS que falta a designação "2" em sua designação do Tipo Hg ou Hg NCS Tipo que falta a "1 "designação em sua designação do Tipo Hg.

54. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 41-53, caracterizado em que a detecção é caracterizada por compreender a amplificação do marcador ou uma parte do marcador para produzir um produto amplificado e determinar a totalidade ou parte da sequência de ADN do produto amplificado, ou avaliar o marcador usando uma sensibilidade diferencial aos endonuclease de restrição, análise de hibridação específica de alelo, PCR específica de alelo, de alta densidade matriz de análise de nucleotídeos, a PCR quantitativa, análise de Northern blot, análise de microssatélites, ELISA ou análise de Western blot.

55. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 41-54, caracterizado em que a previsão é utilizada para selecionar células vegetais resistentes para utilização no desenvolvimento de linhas de soja resistentes.

56. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 41-54, caracterizado em que a previsão é utilizada para selecionar células vegetais resistentes à beterraba, batata, milho, ervilha ou feijão.

57. MÉTODO PARA AUMENTAR A RESISTÊNCIA DE UMA PLANTA AOS NEMATOIDES, caracterizado por compreender a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídio de SEQ ID NO:1, um polipeptídio Glyma18g02590 de SEQ ID NO: 2,5 ou 6,, um polipeptídio Glyma18g02610 de SEQ ID NO: 6 ou um polipeptídio tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou um seu homólogo, variante funcional ou uma combinação de qualquer dos polipeptídios acima mencionados em uma célula, e a aplicação do polipeptídio ou uma célula compreendendo o polipeptídio para a planta, sementes da planta ou ao solo no qual as sementes podem ser plantadas, caracterizado a aplicação aumenta a resistência da planta ao nemátodos.

58. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado em que o polinucleotídeo codifica pelo menos dois de um polipeptídio Glyma18g02610, um polipeptídio Glyma18g02590 e um polipeptídio Glyma18g02580.

59. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado em que o polinucleotídeo codifica um polipeptídio Glyma18g02610, um polipeptídio Glyma18g02590 e um polipeptídio Glyma18g02580.

60. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 57-59, caracterizado em que o polinucleotídeo codifica ainda um polipeptídio Glyma18g02600.

Ciclo de Vida de Nematoide de Cisto de Soja (NCS)

Fêmea

Cisto

Macho Ovo 1/21

Não Incubado J1

Penetrando J2

Em Incubação J2 Raiz da soja

Figura 1

Figura 2: Estratégia de silenciamento: miRNAs artificiais

Substituir a sequência de miR319a pela sequência amiRNA direcionando o gene de interesse, sob o controle de um forte promotor de soja

Promotor de Ubi3 de Soja 2/21

Clonagem

Caminho canamicina (R)

local de nascimento PBR322

Figura 3

Fêmea adulta (cisto) 3/21

Nematoides maturados além de J2 (#>J2)/(total Fayette – Não Silenciado #), normalizado Fayette – Silenciado

Nematoides maturados além de J2 Nematoides maturados além de J2

Figura 4 (#>J2)/(total #), normalizado (#>J2)/(total #), normalizado

Abundância de transcrição Abundância de transcrição Normalizada para Fayette Normalizada para Fayette

Figura 5

Genoma de Referência:

Fosmídeos: (a partir de PI 88788) 5/21

Abundância de transcrição relativa à Williams 82 Número de leituras por kb

Homeólogos

Homeólogos

Região de Genoma de Referência

Figura 6 6/21

Abundância de transcrição relativa à SKP16 (escala de log2) Figura 7

Genoma de Referência:

Fenótipo de Resistência de SCN:

Logo de Sequência 8/21

Abundância de transcrição relativa

Figura 8

Figura 9

Metilação de DNA

Sim a a Não

Sim a 10/21 a Sim a Não

Metilação de DNA

Sim a a Sim a Não

Figura 9 Região Analisada (posição Presença de Metilação Metilação nt relativa à ATG) Tratamento de DNA Fayette Forrest Hartwig Williams82 Essex Polimórfica Gm18:2570 -770 até -1415 McrBC Sim Sim Sim Sim Não -115 até -850 McrBC Sim Sim Sim Sim Não Gm18:2580 58 até -72 McrBC & HpaII Não Não Não Não Não Não 1203 até -72 McrBC Não Não Não Não Não Não 2639 até 1833 McrBC Não Não Não Não Não Não Gm18:2580/2590 (relativo a 2590 ATG) -1692 até -1042 McrBC Sim Não Não Não Não Sim 11/21

-1255 até -709 McrBC Sim Não Não Não Sim -798 até -154 McrBC Sim Não Sim Gm18:2590 3669 até 4230 McrBC Não Não Não Não Não Não Gm18:2600 -230 até 455 McrBC Não Não Não Não Não Gm18:2610 -2052 até -1301 McrBC Sim Sim Sim Não Não Sim -1324 até -184 McrBC Sim Sim Não Não Sim -132 até 757 McrBC Sim Não Não Não Não Sim -132 até 179 HpaII Sim Sim Sim Não Não Sim -216 até 5 HpaII Sim Sim Sim Sim Sim Não 138 até 256 HpaII Sim Sim Sim Não Não Sim Gm18:2620 -1880 até -1080 McrBC Não Não Não Não Não Não -890 até -80 McrBC Não Não Não Não Não Não

Figura 11

Figura 10 Expressão de gene relativa à Expressão de gene relativa à expressão no tempo zero Williams82 não inoculada

Figura 12 13/21

Figura 13 (Continua na próxima página)

Figura 13 (Continua na próxima página)

Figura 13 (Continua na próxima página) 16/21

Figura 14

Modelado para Estrutura de Cristal Sec17

Polimorfismos nas Variedades Resistentes a NCS

Figura 15 Nematoides maturados além de J2 (# >J2)/(total #); normalizados

18/21

Figura 16 Nematoides maturados além de J2 (# >J2)/(total #); normalizados

19/21 Abundância de transcrição relativa à Williams 82-EV

Figura 17 Abundância de transcrição relativa à Williams 82-EV (escala de log2)

20/21

Figura 18 Nematoides maturados além de J2 (# >J2)/(total #) Nematoides de porcentagem com morfologia avançada

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