CN103725676A - 家蚕w染色体适合转基因定点插入的靶序列及其位点和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了家蚕W染色体适合转基因定点插入的靶序列及其位点和应用，其靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，该序列为家蚕W染色体上的特异序列，在Z染色体和常染色体上并不含有此序列，并且本发明公开的靶序列上插入外源基因后能够正常表达，因此可以作为家蚕W染色体上外源基因定点插入的位点制备W染色体连锁转基因家蚕，对家蚕雌雄鉴定具有重要意义。

Description

家蚕W染色体适合转基因定点插入的靶序列及其位点和应用

技术领域

本发明涉及一种核苷酸序列，具体涉及家蚕W染色体上适合转基因定点插入的靶序列及其位点，还涉及该靶序列和位点在转基因定点插入报告基因表达盒中的应用。

背景技术

家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目昆虫，蚕丝业是许多地区农民的主要经济收入来源之一，蚕丝业为世界经济、文化、社会发展做出了重要贡献。优良蚕品种选育一直都是蚕业科学研究的重点和蚕桑业发展的基础，传统良种选育的主要目标是高产和优质。

家蚕的体细胞染色体数是28对，其中27对是常染色体，另外一对是性染色体。在雌蚕中，性染色体不成对，叫做ZW；在雄蚕中成对，叫做ZZ。雌蚕可以产生两种卵，一种是27+W，一种是27+Z，两种卵的比数相等；而雄蚕只能产生一种精子，即27+Z。带有W的卵跟带有Z的精子结合，得到ZW合子，发育成为雌蚕；带有Z的卵跟带有Z的精子结合，得到ZZ合子，发育成为雄蚕。因此，家蚕是ZW型性决定，雌蚕是异配性别，雄蚕是同配性别，下代个体的性别是由卵细胞带的是Z染色体还是W染色体决定。

蚕种分为母种和杂交种，蚕种生产单位饲养母种并制备杂交种，蚕农饲养杂交种。雄蚕在体质抗性、饲料效率、茧丝品质等方面都优于雌蚕，因此蚕农希望能够单养雄蚕。但蚕种生产单位必须同时饲养多个母种的雌雄个体，并在制种前将雌雄个体分开，以防止自交。在短短的几天蛹期对大量的蚕蛹进行雌雄鉴定，不但工作量非常大，而且不能保证100%正确。培育具有W染色体连锁标记基因的限性品种成为解决以上两个问题的有效方法，限性品种能够根据其限性特征在非破坏条件下鉴别雌雄。培育限性品种的传统方法主要是通过杂交的方式，将已有限性品种的卵色、体色、茧色等限性性状导入实用品种，再经过很多代长时间的回交选纯，最后培育成生产品种。但是，这种方法具有很大局限性，比如：在导入限性性状的同时带入了其他不良性状、限性性状不稳定导致后代出现分离、选育周期过长，等等。因此，要克服传统育种方法的这些缺点，需要利用新的技术和方法。

转基因技术是将人工分离和修饰过的基因片段导入到生物体基因组中的一种方法，导入基因的表达将引起生物体性状的可遗传修饰。目前，转基因技术已经成为现代生物学研究中的一项重要技术，在基因功能研究、生物素材创新、品种遗传改良等方面发挥着重要作用。合适的转座子是转基因成功的重要条件，piggyBac转座子首次从杆状病毒侵染粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）昆虫TN-368细胞株系时分离得到，它是一种DNA型转座子。piggyBac转座子长2476bp，含有ITR（13bp）和2个RNA聚合酶Ⅱ启动子及1个聚腺苷酸信号，在该信号的侧面是一个编码转座酶的ORF，该转座子总是在TTAA目标位点处特异插入。piggyBac转座子能够准确切除DNA片段并将其插入到基因组中，插入片段遵循孟德尔遗传规律被稳定遗传；而且它携带的基因片段大小没有限制，引起的染色体整合频率也较高。因此，piggyBac转座子目前已经在很多物种中广泛使用。经过研究人员的长期摸索证明，piggyBac转座子是最适合家蚕转基因的转座子。

利用转基因技术，在W染色体特异插入一个标记基因或者条件性致死基因，是制备雌特异转基因家蚕的有效方法。但是，家蚕W染色体上面包含大量的重复序列，基因组测序工作目前尚未完成，而且W染色体上的大量转座元件会抑制插入基因的表达。因此，要找到一条适合转基因插入的W染色体序列非常困难。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供家蚕W染色体上适合外源片段定点转基因插入的靶序列；本发明的目的之二在于提供家蚕W染色体适合转基因定点插入的位点；本发明的目的之三在于提供家蚕W染色体适合转基因定点插入的位点的应用。

为实现上述发明目的，提供如下技术方案：

家蚕W染色体适合转基因定点插入的靶序列，所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

优选的，所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.19第1-120位所示。

其获得方法是通过胚胎显微注射的方式将piggyBac[3×p3EGFP afm]转基因载体导入不同家蚕品种，利用该载体随机插入的特性，制备了135个转基因家蚕系统，并从中筛选出一个雌特异的转基因品系W-T。荧光检测结果显示，在卵期、幼虫期、蛹期和蛾期，W-T的雌个体在神经系统和复眼发出绿色荧光，而雄个体没有荧光；PCR检测结果显示只有W-T的雌个体含有EGFP序列而雄个体不含有；Southern blot检测结果显示外源基因以单拷贝方式插入在W-T的W染色体上；通过反向PCR对插入位点进行了检测，并设计引物通过PCR扩增的方法对插入位点左边和右边的基因组序列进行了再次克隆验证，将测序结果在家蚕基因组数据库进行比出，发现其中一条序列没有相同序列，表明本发明获得的是一条W染色体特异的序列；连续11代的调查结果表明报告基因在W-T中稳定遗传。因此该序列能够用于制备W染色体连锁的转基因家蚕品系，作为适合定点转基因插入的W染色体特异序列。

2.家蚕W染色体适合转基因定点插入的位点，所述位点位于如SEQ ID NO.19所示核苷酸序列上的任意位置。

优选的，所述位点位于如SEQ ID NO.19所示核苷酸序列的3’端。

3.所述家蚕W染色体适合转基因定点插入的位点在定点插入报告基因表达盒中的应用。

优选的，所述报告基因为荧光报告基因、卵色基因、体色基因、茧色基因、斑纹基因或条件性调控基因。

更优选的，所述报告基因为绿色荧光蛋白基因。

本发明的有益效果在于：本发明公开了家蚕W染色体适合转基因定点插入的靶序列，由于家蚕W染色体上面存在大量和常染色体重复的序列，并且还存在大量转座元件，会抑制外源基因的表达，本发明克隆出的序列为W染色体特异的序列，插入外源基因后正常表达，并能够在后代稳定遗传，也不会发生性状分离，为外源片段定点转基因插入在W染色体提供了靶标序列；利用本发明公开的靶序列制备W染色体连锁转基因家蚕，可以在整个生命周期（卵期、幼虫期、蛹期、蛾期）进行雌雄鉴别，而且荧光标记清楚，雌雄个体的彻底分离避免了自交造成的损失，保证杂交蚕种100%的杂交率，节约生产成本，而且提高蚕种产量和质量；对丝茧生产而言，利用W-T的限性特征，在幼虫期分离雌雄，可以实现雌雄蚕分户饲养，雌雄茧分别收烘、分别缫丝利用，提高养蚕业的综合收益。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为W染色体连锁转基因家蚕W-T的荧光观察结果（A和A′：W-T的雌蛾分别在白光和绿色荧光下进行观察；B和B′：W-T的雄蛾分别在白光和绿色荧光下进行观察）。

图2为外源片段在W-T中的拷贝数检测（A：通过PCR检测EGFP，1表示NT♂检测结果、2表示NT♀检测结果、3表示W-T♂检测结果和4表示W-T♀检测结果，M表示marker；B：Southern blot检测，1表示W-T♀的基因组被Bgl II彻底消化和2表示W-T♀的基因组被Xba I分别彻底消化，然后用EGFP的探针进行杂交，白色箭头指示目标条带）。

图3为W-T的插入位点分析（A：插入物在W-T基因组中的位置示意图，SG-R和SG-L分别代表插入位点右边和左边邻近的W染色体基因组序列，虚线表示未知的W染色体序列，TTAA是piggyBac切割和粘贴的特异位点，GCC是HaeIII的酶切位点，引物W-T-R sense、W-T-R anti、W-T-L sense和W-T-L anti的箭头指示PCR扩增方向；(a)piggyBac[3×p3EGFP afm]载体示意图，3×p3-EGFP-SV40是报告标记基因，PR和PL分别表示右臂和左臂；(b)和(c)分别为克隆的SG-R和SG-L序列。B和C分别为SG-R和SG-L序列在家蚕基因组数据库中的比对结果）。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、转基因显微注射和雌特异转基因家蚕W-T的筛选

将家蚕“大造”、“P50”等品种蚕卵在温度为46℃条件浸酸5分钟解除滞育，浸酸溶液是比重为1.073的盐酸，然后放于温度为15℃、80%湿度的黑暗环境中催青30天左右直至孵化，孵化后将蚁蚕收好置于温度为25℃，湿度为80%的标准条件下饲养，化蛾以后将雌雄蚕蛾交配4小时，拆对后产下的蚕卵为非滞育蚕卵，用于下一步的显微注射。

将产下的蚕卵在干净的载玻片上排列整齐，在蚕卵产后2小时用Eppendorf显微注射仪将piggyBac [3×p3 EGFP afm]转基因载体和辅助质粒A3H，一起注射进5300粒蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25℃、相对湿度80%的环境中催青10天左右孵化，将孵化的G0代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾，G0代蚕蛾通过自交或回交共获得602个蛾圈G1代蚕卵，用

电动宏观荧光显微镜观察G1胚胎筛选并获得135个阳性蛾圈。

选择雌性转基因个体的G1蛾圈，将其和正常亲本的雄蛾杂交，制备G2转基因系统；再用

电动宏观荧光显微镜观察，选择雌性转基因个体的G2系统，将其和正常亲本的雄蛾杂交，制备G3转基因系统，再用

电动宏观荧光显微镜观察；最终我们筛选出一个来自于P50的转基因系统，在G1、G2、G3连续3代，其所有的雌性个体都是转基因而无任何雄性转基因个体（图1），因此，获得的转基因系统理论上为W染色体连锁的转基因家蚕，命名为W-T。每一代都将W-T的雌蛾和正常亲本的雄蛾进行杂交，制备后代蚕种。

实施例2、转基因系统W-T的拷贝数检测

设计GFP突变系EGFP和家蚕内参基因GAPDH（BmGAPDH）的引物，EGFP的正向引物为5'-gtgagcaagggcgaggagct-3'（SEQ ID NO.1），反向引物为5'-cttgtacagctcgtccatgcc-3'（SEQID NO.2）；BmGAPDH的正向引物为5'-cattccgcgtccctgttgctaat-3'（SEQ ID NO.3），反向引物为5'-gctgcctccttgaccttttgc-3'（SEQ ID NO.4）。提取W-T雌蚕(W-T♀)、W-T雄蚕(W-T♂)、非转基因雌蚕(NT♀)、非转基因雄蚕(NT♂)的基因组，以其为模板进行PCR扩增反应。扩增BmGAPDH基因的PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸10秒，共25个循环，最后72℃延伸10分钟；扩增EGFP的PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、56℃退火40秒、72℃延伸10秒，共28个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示4个样品都能扩增出BmGAPDH的目标条带，而只在W-T♀中扩增出EGFP的目的条带（图2A），说明W-T确实是W染色体连锁的转基因家蚕。

将W-T♀的基因组用Bgl II和Xba I分别进行彻底消化，利用制备EGFP的探针（EGFP探针是地高辛标记的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2扩增的产物）进行Southern blot检测（具体方法参考蒋亮的博士学位论文，基于转基因工程的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)抗性素材创新及抗性机制）。结果显示两种酶切产物都只有一条EGFP的杂交条带（图2B），说明插入片段以单拷贝数方式插入家蚕W染色体。

实施例3转基因系统W-T的插入位点检测

将W-T♀的基因组用Hae III进行彻底消化并自连，利用转座子特异引物pBacL和pBacR进行反向PCR扩增。pBacR用于扩增piggyBac[3×p3EGFP afm]右臂（PR）的部分序列和邻近的基因组序列（SG-R），pBacR引物序列具体如下，pBacR F；5'-tacgcatgattatctttaacgta-3'（SEQ ID NO.5）；pBacR R：5’-gtactgtcatctgatgtaccagg-3’（SEQID NO.6），pBacL用于扩增piggyBac[3×p3EGFP afm]左臂（PL）的部分序列和邻近的基因组序列（SG-L），pBacL引物序列具体如下，pBacL F：5'-atcagtgacacttaccgcattgaca-3'（SEQ IDNO.7），pBacL R：5'-tgacgagcttgttggtgaggattct-3’（SEQ ID NO.8），位置如图3A所示。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，然后与pMD19-T载体连接，连接反应在T4DNA连接酶作用下，16℃过夜连接，然后转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。其中SEQ ID NO.9中第1-23位为pBacR正向引物序列，第516-538位表示pBacR反向引物序列，第1-246位和第489-538位为PR部分序列，第251-484位为SG-R序列，第247-250位的GGCC为HaeIII的酶切位点；第485-488位的TTAA为piggyBac的特异插入位点；SEQ ID NO.10中第1-25位为pBacL正向引物，第640-664位为反向引物；第1-159位和第332-664位为PL部分序列，第164-327位为SG-L序列，第160-164位的TTAA为piggyBac的特异插入位点，第328-331位为GGCC为HaeIII的酶切位点。

为了对测序结果所得的插入位点序列进行再次验证，我们以SG-R和部分PR的序列SEQID NO.11作为模板，设计了W-T-R引物，正向引物为：5'-acagctcgtatacccatcta-3'（SEQ IDNO.12），反向引物为5'-tgtttctattatgtataagttaagc-3'（SEQ ID NO.13）；以SG-L和部分PL的序列SEQ ID NO.14作为模板，设计了W-T-L引物，正向引物为5'-gtgacacttaccgcattg-3'（SEQID NO.15），反向引物为5'-tttgttgcgtcagttgtta-3'（SEQ ID NO.16）。以W-T♀的基因组为模板进行PCR扩增反应。扩增W-T-R的PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、50℃退火40秒、72℃延伸45秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；扩增W-T-L的PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、49℃退火40秒、72℃延伸40秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，然后与pMD19-T载体连接，连接反应在T4DNA连接酶作用下，16℃过夜连接，然后转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果分别如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示。

将SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10进行比对分析，证明反向PCR的结果确实是正确的。由于目前还没有完成家蚕W染色体的基因组测序工作，因此家蚕基因组数据库（SilkDB）没有包含W染色体序列。将SG-R（图3A（b），SEQ ID NO.19）和SG-L（图3A（c），SEQ ID NO.20）的序列放在SilkDB进行比对，没有发现与SG-R相同的序列，说明其是一条家蚕W染色体特异的序列；SilkDB中存在一条和SG-L相同的序列，该序列位于16号染色体的nscaf3058上面，证明SG-L是家蚕基因组上的一条重复序列。

实施例4、转基因系统W-T性连锁性状的遗传稳定性分析

将获得的雌性转基因W-T G3与正常亲本的雄蛾杂交，子代再与正常亲本的雄蛾杂交从G4到G14，连续11代、每代随机选择5个蛾圈，分别调查雌雄个体数和是否发出绿色荧光，结果如表1所示。

表1.W-T的遗传分析结果

注：E(+)和E(-)分别表示具有EGFP荧光和不具有EGFP荧光。

结果显示，在W-T的后代中，雌个体都是具有绿色荧光而雄个体都没有绿色荧光，说明W-T的限性性状在后代中进行了稳定遗传。

在G4、G9和G14，分别随机选择96个雌个体和96个雄个体，提取基因组DNA。用W-T-L引物和内参BmGAPDH对雌个体基因组DNA分别进行PCR检测，扩增结果显示所有雌个体都扩增出了BmGAPDH和W-T-L的目标条带；用EGFP引物和内参BmGAPDH对雄个体基因组DNA分别进行PCR检测，扩增结果显示每个雄个体都扩增出了BmGAPDH的目标条带，但没有扩增出EGFP的目标条带。这些结果均表明W-T的插入位点没有发生变化，位于家蚕的W染色体上。经遗传分析和分子检测表明，在W染色体特异序列上插入报告基因表达盒后，报告基因在W-T进行了稳定遗传，并在后代中正常表达。因此，SEQ ID NO.19能够作为家蚕W染色体上适合转基因定点插入的靶序列和靶位点，在此靶序列上插入报告基因制备W染色体连锁转基因家蚕，可以在整个生命周期（卵期、幼虫期、蛹期、蛾期）进行雌雄鉴别，有助于雌雄个体的彻底分离，提高蚕业养殖的经济效益。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.家蚕W染色体适合转基因定点插入的靶序列，其特征在于：所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

2.根据权利要求1所述家蚕W染色体适合转基因定点插入的靶序列，其特征在于：所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.19第1-120位所示。

3.家蚕W染色体适合转基因定点插入的位点，其特征在于：所述位点位于如SEQ ID NO.19所示核苷酸序列上的任意位置。

4.根据权利要求3所述家蚕W染色体适合转基因定点插入的位点，其特征在于：所述位点位于如SEQ ID NO.19所示核苷酸序列的3’端。

5.权利要求3或4所述家蚕W染色体适合转基因定点插入的位点在定点插入报告基因表达盒中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述报告基因为荧光报告基因、卵色基因、体色基因、茧色基因、斑纹基因或条件性调控基因。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述报告基因为绿色荧光蛋白基因。

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