CN108265076B - OsSAPK9蛋白及其编码基因在提高水稻耐铝性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种OsSAPK9蛋白及其编码基因在提高水稻耐铝性中的应用。本发明通过研究发现，OsSAPK9过表达的水稻植株对Al胁迫的抗性显著增强，过表达植物的株高减少比例显著少于对照，表明该基因可以用于改良水稻对Al胁迫的抗性。本发明对于培育耐铝水稻新品种具有重要的意义，适合于推广应用。

Description

OsSAPK9蛋白及其编码基因在提高水稻耐铝性中的应用
技术领域
本发明涉及一种OsSAPK9蛋白及其编码基因在提高水稻耐铝性中的应用。
背景技术
Al毒害被认为是酸性(pH<5.0)土壤中作物生长最重要的限制因素之一。Al是地壳中含量最丰富的金属元素之一。在自然条件下，Al通常以难溶性的硅酸盐或氧化铝的形式存在，对植物没有毒性。但是在酸性条件下(pH<5.0),低浓度的Al离子就会对大多数植物产生毒害作用。而我国作为世界主要酸雨区之一，酸性土壤比例占全国总面积的30％，其中南方的红黄壤是典型的酸性土壤，有机质贫乏，养分含量低，交换性的Al占阳离子交换量的20％-80％，已经成为植物生长的主要限制因子。
大量研究发现Al不仅影响根部吸收水分和营养物质，还能影响叶片的衰老速度、光合作用强度、气孔开度、叶片的受光姿态等。Al对植物的毒性主要是通过抑制根系生长进而影响整株植物的生长发育,其中最明显的影响是引起植物的株高降低和根长变短。
目前，采用表型鉴定、遗传分析以及QTL定位等方法，发现拟南芥、水稻的耐铝性为数量性状，受多个基因控制。水稻抗铝QTL在12条染色体上均有分布，但是至今对水稻耐铝相关基因研究较少。发现和鉴定水稻耐铝相关基因，是改良水稻的耐铝性、提高水稻产量的基础，具有重要的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种OsSAPK9蛋白及其编码基因在提高水稻耐铝性中的应用。
本发明提供了一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将编码OsSAPK9蛋白的基因导入出发植物，得到耐铝性提高的转基因植物。
本发明还保护一种提高植物耐铝性的方法，包括如下步骤：增加植物中OsSAPK9蛋白的表达量和/或活性，从而提高植物耐铝性。
以上任一所述OsSAPK9蛋白，获自水稻，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。
为了使(a)中的OsSAPK9蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述(b)中的OsSAPK9可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsSAPK9蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
所述“编码OsSAPK9蛋白的基因(简称OsSAPK9基因)”为如下(1)或(2)或(3)：
(1)编码区如序列表的序列1自5’末端第1-1086位核苷酸所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码与植物耐铝性相关功能的蛋白质的DNA分子；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与植物耐铝性相关功能的蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
所述方法中，所述OsSAPK9基因可以通过重组表达载体导入出发水稻。所述重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到水稻细胞或组织中。
所述重组表达载体具体可为将载体pMDC43的重组位点中插入了序列表的序列1所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
本发明还保护所述OsSAPK9蛋白的应用，为如下(c1)或(c2)：
(c1)调控植物耐铝性；
(c2)提高植物耐铝性。
本发明还保护所述OsSAPK9基因的应用，为如下(c1)或(c2)：
(c1)调控植物耐铝性；
(c2)提高植物耐铝性。
本发明还保护OsSAPK9蛋白或OsSAPK9基因或以上任一所述方法在植物育种中的应用。
所述育种的目的是选育耐铝性高的植物。
以上任一所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为稻属植物。所述稻属植物具体可为水稻，例如水稻品系9804。
本发明通过研究发现，OsSAPK9过表达的水稻植株对Al胁迫的抗性显著增强，过表达植物的株高减少比例显著少于对照，表明该基因可以用于改良水稻对Al胁迫的抗性。本发明对于培育耐铝水稻新品种具有重要的意义，适合于推广应用。
附图说明
图1为实施例1中过表达植株PCR鉴定结果。
图2为实施例1中野生型植株和过表达植株的Western blot结果。
图3为实施例1中野生型植物和过表达植株的相对表达量鉴定结果。
图4为实施例1中野生型和过表达植株经Al胁迫后根部不同时期的不同酶活性测定结果。
图5为实施例1中野生型和过表达植株经Al胁迫后地上部不同时期的不同酶活性测定结果。
图6为实施例1中野生型植株和过表达植株经Al处理后根长和株高降低百分比测定结果。
图7为实施例1中野生型植株和过表达植株经Al处理后表型鉴定结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
OsSAPK9基因的编码区序列如序列表的序列1所示，编码序列表的序列2所示的蛋白质(OsSAPK9蛋白)。
水稻品系9804(简称9804水稻)：参考文献：谢学文，于晶，徐建龙，周永力，黎志康.玉米细菌性条斑病非寄主抗性基因Rxo1转化水稻的研究.生物工程学报，2007，23(4)：607-611.；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
载体pDONR201：Invitrogen公司，货号：11798-014。
载体pMDC43:BioVector NTCC典型培养物保藏中心。
根癌农杆菌EHA105：BioVector NTCC典型培养物保藏中心。
诱导培养基：CaCl2·2H2O 440mg，KH2PO4 170mg，MgSO4·7H2O 370mg，NH4NO31650mg，KNO3 1900mg，KI 0.83mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，H3BO3 6.2mg，Na2MoO4·2H2O0.25mg，MnSO4·4H2O 22.3mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，ZnSO4·7H2O 8.6mg，Na2-EDTA·2H2O37.3mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，2，4-D 2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂3g，去离子水加至1L。
侵染培养基：配制方法参见参考文献：Hiei Y,Ohta S,Komari T,etal.Efficient transformation of rice(Oryza sativa,L.)mediated byAgrobacterium,and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J].PlantJournal,1994,6(2):271–282.。将参考文献中乙酰丁香酮的浓度替换为200μM。
共培养培养基：在诱导培养基中加入乙酰丁香酮和葡萄糖，使乙酰丁香酮在培养基中的终浓度为200μM，葡萄糖在培养基中的终浓度为10g/L。
抑菌培养基：在诱导培养基中头孢霉素，使头孢霉素在培养基中的终浓度为500mg/L。
筛选培养基：在诱导培养基中加入潮霉素和头孢霉素，使潮霉素在培养基中的终浓度为65mg/L，头孢霉素在培养基中的终浓度为500mg/L。
预再生培养基：CaCl2·2H2O 440mg，KH2PO4 170mg，MgSO4·7H2O 370mg，NH4NO31650mg，KNO3 1900mg，KI 0.83mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，H3BO3 6.2mg，Na2MoO4·2H2O0.25mg，
MnSO4·4H2O 22.3mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，ZnSO4·7H2O 8.6mg，Na2-EDTA·2H2O37.3mg，FeSO4·7H2O27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂3g，激动素2mg，萘乙酸1mg，去离子水加至1L；倒平板之前加入潮霉素并使其浓度为50mg/L。
再生培养基：CaCl2·2H2O 440mg，KH2PO4 170mg，MgSO4·7H2O 370mg，NH4NO31650mg，KNO3 1900mg，KI 0.83mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，H3BO3 6.2mg，Na2MoO4·2H2O0.25mg，MnSO4·4H2O 22.3mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，ZnSO4·7H2O 8.6mg，Na2-EDTA·2H2O37.3mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂6g，激动素2mg，萘乙酸1mg，去离子水加至1L；倒平板之前加入潮霉素并使其浓度为50mg/L。
水培营养液：硫酸铵754g/5L，二水·磷酸二氢钠201.25g/5L，硫酸钾357g/5L，二水·氯化钙586.75g/5L，七水·硫酸镁1622.5g/5L，四水·氯化锰7.5g/5L，硼酸4.67g/5L，五水·硫酸铜0.1575g/5L，四水·钼酸铵0.37g/5L，六水·氯化铁38.5g/5L，七水·硫酸锌0.17625g/5L，柠檬酸59.5g/5L，溶剂为水。
A液：称取分析纯KH2PO427.216克，用蒸馏水定容至1000毫升。
B液：称取分析纯K2HPO4·3H2O45.644克，用蒸馏水定容至1000毫升。
0.05M/L磷酸缓冲液(pH＝7.8)：A液21.25ml+B液228.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
130mM/L Met(甲硫氨酸)：取1.9399克Met用磷酸缓冲液定容至100ml。
750μM/L四氮唑蓝(NBT)：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml。
100μM/L EDTA-Na2:取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。
20μM/L FD(核黄素):0.00753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml。
SOD反应液：将0.05M/L磷酸缓冲液(pH＝7.8)、130mM/L Met(甲硫氨酸)、750μM/L四氮唑蓝(NBT)、100μM/L EDTA-Na2、20μM/L FD(核黄素)和水按照体积比为15：3：3：3：3：2.5进行配制。
POD反应液：取0.1M/L pH＝6.0的磷酸缓冲液50毫升于烧杯中，加入愈创木酚28微升，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30％(体积百分含量)H2O2水溶液19微升混合。
0.1M/L的H2O2溶液：0.568毫升30％(体积百分含量)H2O2水溶液，用蒸馏水定容至100毫升。
0.1M/L的pH＝7.0磷酸缓冲液：97.5毫升A液+152.5毫升B液，用蒸馏水定容至500毫升。
CAT反应液：0.1M/L的H2O2溶液5毫升+0.1M/L的pH＝7.0的磷酸缓冲液20毫升。
实施例1、OsSAPK9基因功能分析
一、OsSAPK9基因过表达载体构建
1、提取9804水稻叶片的总RNA，反转录为cDNA。
2、以步骤1得到cDNA为模板，采用引物attB-F和引物attB-R进行PCR扩增，得到扩增产物。
attB-F1：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGAGAGGGCGGCGG-3′；
attB-R1：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGACATGGCATATACGATCTCTCCG-3。
3、通过BP反应，将步骤2得到的扩增产物导入载体pDONR201，得到含有序列表的序列3所示的双链DNA分子的阳性入门克隆质粒pDONR201-OsSAPK9(已经测序验证)。
BP反应体系：扩增产物2.7μL(50-100ng)，载体pDONR201 1.0μL(30-50ng)，5×BPReaction Buffer 1.0μL，BP Enzyme mix 0.3μL。
BP反应条件：25℃温浴1h。
4、取步骤3得到的阳性入门克隆质粒pDONR201-OsSAPK9，与载体pMDC43进行LR反应，得到含有序列表序列1所示的双链DNA分子的过表达载体35S::GFP-OsSAPK9(已经测序验证)。
LR反应体系：入门克隆质粒pDONR201-OsSAPK9 1μL(50-100ng)，载体pMDC431μL(50-100ng)，LR enzyme mix 0.5μL。
LR反应条件：25℃温浴1h。
二、过表达转基因水稻的获得
1、取9804水稻的成熟种子，机械脱壳，挑取饱满光洁无菌斑的种子进行消毒。
2、将步骤1消毒后的种子接种到诱导培养基28℃、暗培养14天左右，选取外观良好，生长力好的愈伤组织。
3、取步骤一构建的过表达载体35S::GFP-OsSAPK9，导入根癌农杆菌EHA105，得到重组菌EHA105/OsSAPK9。
4、取步骤3得到的重组菌EHA105/OsSAPK9，用侵染培养基重悬菌体，得到菌悬液。
5、将完成步骤2的愈伤组织浸泡于步骤4制备的菌悬液中，侵染20min。侵染后将菌悬液倒掉，取愈伤组织，用无菌滤纸吸干水分，然后置于共培养培养基上，28℃暗培养50-55h。
6、完成步骤5后，挑选表面没有明显农杆菌的愈伤组织移至抑菌培养基中，28℃暗培养3-4天。
7、完成步骤6后，将愈伤组织移至筛选培养基上28℃暗培养30天，每10天继代一次。
8、完成步骤7后，取新鲜潮霉素抗性的愈伤组织，接于预再生培养基中，28℃暗培养7天，然后置于光照培养间(12h光照/12h黑暗)继续培养7天后转入再生培养基上，继续光照培养，直至生长出再生植株，得到T0代植株。TO代植株自交，得到T1代植株。T1代植株自交，得到T2代植株。T2代植株自交，得到T3代植株。
三、转空载水稻的获得
采用载体pMDC43替代过表达载体35S::GFP-OsSAPK9按照实施例1步骤二的1-8进行操作，得到转空载体株系(CK)。
四、过表达转基因水稻的鉴定
1、取步骤二获得的各个株系的T2代植株，提取植株叶片总DNA。以总DNA为模板，采用引物pMDC43-TF和pMDC43-TR组成的引物对进行PCR鉴定。采用过表达载体35S::GFP-OsSAPK9作为阳性对照，采用9804水稻的总DNA作为阴性对照。
pMDC43-TF:5’-TTGGCTTTGATGCCGTTCT-3’；
pMDC43-TR:5’-TCGGATTCCATTGCCCAG-3’。
如果对于某一TO代植株，其抽样检测的T2代植株的PCR鉴定结果均为阳性，该TO代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系。
部分植株的PCR鉴定结果如图1所示。图1中，M为DNA Maker，P为过表达载体35S::GFP-OsSAPK9，WT为9804水稻的总DNA，泳道1-6依次对应6个不同株系的T2代植株。结果表明，除第2个泳道中没有扩增出明显的阳性条带，其余植株均能扩增出与质粒载体一致的特异条带，表明了第2泳道对应的植株为假阳性植株，其余株系均为纯合的过表达转基因株系。
2、选取步骤1过表达转基因株系中的2个转基因株系(OE-1、OE-2)的T2代植株，取500mg植株叶片的总蛋白，用标签抗体GFP进行Western blot检测。采用9804水稻叶片总蛋白(WT)和转空载体株系(CK)叶片总蛋白作为对照。
检测结果如图2所示。结果表明：野生型9804水稻和转空载体转基因株系中均未检测到目的条带，转基因株系中均检测到目的条带。
3、选取步骤1过表达转基因株系中的2个转基因株系(OE-1、OE-2)的T2代植株，提取各植株叶片的总RNA并反转录为相同浓度的cDNA，采用内参基因action-F/action-R和SAPK9-RT-F/SAPK9-RT-R进行荧光定量PCR鉴定。采用9804水稻叶片总蛋白(WT)和转空载体株系(CK)叶片cDNA作为对照。
Actin-F：5’-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3’；
Actin-R：5’-GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3’；
SAPK9-RT-F：5’-ATCAGTCTACAAGCCAGTCCAG-3’；
SAPK9-RT-R：5’-TCCTCATCGCTCAAGTCCC-3’。
检测结果如图3所示。结果表明，野生型9804水稻的OsSAPK9基因的相对表达量与转空载体转基因株系无明显差异，转基因株系中的OsSAPK9基因的相对表达量显著高于野生型9804水稻。
五、根部Al含量测定
待测植株为：野生型9804水稻、2个转基因株系(OE-1、OE-2)的T3代植株、转空载体株系的T3代植株(CK)。
1、每份待测植株选取同等数量待测水稻的种子，利用5％的双氧水进行消毒10分钟，再用蒸馏水进行冲洗2-3遍，将种子放置于30℃恒温培养箱培育催芽。
2、待步骤1水稻种子催芽后，选取芽长一致的种子分别播于粘有纱网的泡沫孔板(10行x13列)中，每孔播2粒，每份材料播3列每列10孔。
3、完成步骤2后，将其放置于28℃恒温培养箱进行水培(水培营养液的pH＝4.5，12h光照/12h黑暗)。每隔4天，换一次水培营养液。
4、待水稻植物长至三叶一心时，将水培营养液中添加AlCl3(AlCl3在水培营养液中的浓度为10mM/L)，每四天换一次含有10mM/L AlCl3的水培营养液，其他条件不变。
5、剪取每份材料不同时间点(6h、12、2d、6d、10d)经过铝(10mM/L)处理的水稻根部，用蒸馏水洗涤15mins，每份材料每个时间点各取4株。
6、将步骤5中的水稻根，浸泡于10ml含有0.02％(质量百分含量)KIO3的0.2％(质量百分含量)苏木精水溶液中，室温静置1h，然后用蒸馏水冲洗15mins。
7、将步骤6中水稻根，浸泡于10ml 1M/L HCl中，静置1h，室温离心12000rpm，10mins，取上清液，测定OD490nm值。Al含量＝A490*V/W，V为上清液体积(ml)，W为根鲜重(g)。
测定结果如表2所示。
表2水稻材料根部Al吸收量统计结果
结果表明，随着胁迫时间的增加，各份材料的根部Al含量逐渐增加。除12h，过表达转基因植株根部Al含量显著低于野生型水稻植株根部Al含量和转空载体株系植株根部Al含量，表明过表达转基因株系的抗Al性要强于野生型水稻株系。
六、抗氧化酶活(Superoxide Dismutase，SOD；Peroxidase；POD、Catalase，CAT)测定
待测植株为：野生型9804水稻、2个转基因株系(OE-1、OE-2)的T3代植株、转空载体株系的T3代植株(CK)。
1、每份待测植株选取同等数量待测水稻的种子，利用5％的双氧水进行消毒10分钟，再用蒸馏水进行冲洗2-3遍，将种子放置于30℃恒温培养箱培育催芽。
2、待步骤1水稻种子催芽后，选取芽长一致的种子分别播于粘有纱网的泡沫孔板(10行x13列)中，每孔播2粒，每份材料播3列每列10孔。
3、完成步骤2后，将其放置于28℃恒温培养箱进行水培(水培营养液的pH＝4.5，12h光照/12h黑暗)。每隔4天，换一次水培营养液。
4、待水稻植物长至三叶一心时，将水培营养液中添加AlCl3(AlCl3在水培营养液中的浓度为10mM/L)，每四天换一次含有10mM/L AlCl3的水培营养液，其他条件不变。
5、剪取每份材料不同时间点(6h、12、2d、6d、10d)经过铝(10mM/L)处理的水稻根部和地上部(茎与叶)，用蒸馏水洗涤15mins，每份材料每个时间点各取4株，参照如下方法进行酶活性测定：
(1)酶液的制备：称取0.5g待测水稻根部，放入研钵中，加5毫升pH＝7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，冷冻离心20分钟，上清液(酶液)倒入试管中，置于-20℃下保存待用。
(2)SOD的测定：取型号相同的试管，吸取20微升的酶液，加入3毫升SOD反应液，4000Lux照光30分钟，同时取四支试管，三支做对照，一支做空白(不加酶液，以pH＝7.8的磷酸缓冲液代替)；空白置暗处，对照与酶液同置于4000Lux条件下照光30分钟，遮光保存，以空白调零，560nm比色。SOD总活性(吸光度/g·FW)＝(ACK—AE)×V/(W×0.5×ACK)，单位：NBT光还原50％。
(3)POD的测定：20微升酶液+3毫升POD反应液于比色皿中，在470nm下每隔1分钟读数一次，共读三次，以每分钟吸光度变化值(ΔA470/min·mg pr或ΔA470/mgFW)表示酶活力的大小。POD活性(ΔA470/min·gFW)＝ΔA470×V/Va/W＝ΔA470×5/0.02/0.5＝ΔA470×500。
(4)CAT的测定：0.1毫升(或50微升)酶液+2.5毫升CAT反应液，240nm下比色，每隔1分钟读数1次，共读数3次。CAT活性(Δ240/min·gFW)＝Δ240×/0.05/0.5＝Δ240×200＝Δ240×V/Va/W
测定结果如图4和5所示。结果表明，在根部酶活测定方面，过表达转基因株系的SOD、POD总酶活性高于野生型水稻植株，而SOD酶活性，除了4d，均达到显著水平。其中过表达株系OE-1和OE-2的SOD、CAT酶活性先升高后降低，分别在铝处理后8d、4d到达最大值，而POD酶活性则随着时间推移而降低；野生型水稻的SOD、CAT酶活性先升高后降低，POD酶活性先降低再升高后降；野生型水稻植株与过表达转基因株系的POD、CAT酶活性随着时间的推移最后趋向于一致。
地上部酶活的变化趋势与根部相反。野生型、过表达株系OE-1和OE-2地上部的CAT酶活性随着时间的推移而降低，POD酶活性则是先升高后降；过表达转基因株系SOD酶活性在0d显著低于野生型水稻，后期均与野生型水稻植株无显著差异。
转空载体株系的检测数值与野生型无显著差异。
上述结果表明：OsSAPK9过表达转基因植株根部的抗氧化能力要强于野生型水稻植株，由于根部抗氧化能力增强进而使过表达转基因植株地上部的抗氧化酶活性低于野生型水稻植株。
七、表型鉴定
待测植株为：野生型9804水稻、2个转基因株系(OE-1、OE-2)的T3代植株、转空载体株系的T3代植株(CK)。
1、每份待测植株选取同等数量待测水稻的种子，利用5％的双氧水进行消毒10分钟，再用蒸馏水进行冲洗2-3遍，将种子放置于30℃恒温培养箱培育催芽。
2、待步骤1水稻种子催芽后，选取芽长一致的种子分别播于粘有纱网的泡沫孔板(10行x13列)中，每孔播2粒，每份材料播3列每列10孔。
3、完成步骤2后，将其放置于28℃恒温培养箱进行水培(水培营养液的pH＝4.5，12h光照/12h黑暗)。每隔4天，换一次水培营养液。
4、待水稻植物长至三叶一心时，将水培营养液中添加AlCl3(AlCl3在水培营养液中的浓度为10mM/L)，每四天换一次含有10mM/L AlCl3的水培营养液，其他条件不变，同时设置不添加AlCl3的对照组(更换培养液时也不添加AlCl3)20天后测量每份材料的株高与根长，记录数据。每个株系取20株。
结果如图6和7所示。图7中，WT-C/T分别为野生型9804水稻对照组和处理组；CK-C/T分别为转空载体的转基因植株对照组和处理组；OE-1-C/T、OE-2-C/T分别为过表达转基因植株对照组和处理组。结果表明，野生型9804植株、转空载体水稻与过表达转基因植株OE-1和OE-2经铝胁迫处理前后，根长降低比值分别为10.81％、10.90％、10.21％和10.41％，四者之间并无显著差异；但是经铝胁迫处理前后，野生型9804水稻株高降低比值为13.88％，转空载体水稻植株高降低值为13.96％,与野生型9804水稻植株无显著差异。OsSAPK9转基因植株OE-1和OE-2的株高降低比值分别为8.97％和7.64％，均显著低于野生型9804水稻植株株高降低比值。经过20天处理后，野生型9804植株的叶片衰老程度明显重于过表达转基因植株，与转空载体水稻植株无明显差异。表明OsSAPK9基因过表达可以提高水稻对Al胁迫的抗性。
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
中国农业科学院深圳生物育种创新研究院
<120> OsSAPK9蛋白及其编码基因在提高水稻耐铝性的应用
<160> 2
<210> 1
<211> 1086
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza sativa）
<400> 1
atggagaggg cggcggcggg gccgctgggg atggagatgc cgataatgca cgacggtgac 60
aggtacgagc tggtgaagga gatcgggtcg gggaacttcg gcgtcgcccg cctcatgcgc 120
aaccgcgcct ccggcgacct cgtcgccgtc aagtacatcg accgcggcga gaagattgac 180
gagaacgtgc agagggagat catcaaccac aggtcgctgc gccaccccaa catcatccga 240
ttcaaggagg ttattctgac gccgacgcat ctcgcgatcg tcatggagta cgcctccggc 300
ggcgagctct tcgagcgcat ctgcagcgcc ggccgcttca gcgaggacga ggctcgtttc 360
ttcttccagc agctgatatc tggagttagc tactgccatt ccatgcaagt atgccatcgt 420
gacttaaagc tggagaacac tctgctagat ggaagtactg ctcctcgctt gaagatatgt 480
gactttggtt actcgaagtc atcggttctt cattcacaac caaaatcaac agttggaact 540
ccagcttata ttgctccaga agttttgctc aagaaagaat acgatggaaa gattgccgat 600
gtttggtcat gcggtgtgac gctctacgtg atgttggttg gcgcataccc tttcgaggat 660
cctgaagatc ccaagaactt cagaaagaca attcagaaaa tattgggtgt tcagtactca 720
attccagact atgtccacat atctccggag tgccgcgatc tcattacgag gatttttgtt 780
ggcaacccag ctagtaggat caccatgcct gagataaaga accacccatg gttcatgaag 840
aacatcccgg ctgacctcat ggatgatggc atggttagca atcagtacga ggagcctgac 900
cagccgatgc agaatatgaa cgagatcatg cagatactgg cagaagcaac aattccagca 960
gcaggcacca gtggaatcaa ccagttcttg actgacagcc ttgacctcga cgacgacatg 1020
gaggatatgg actcggacct tgaccttgac attgagagca gcggagagat cgtatatgcc 1080
atgtaa 1086
<210> 2
<211> 361
<212> PRT
<213> 水稻（Oryza sativa）
<400> 2
Met Glu Arg Ala Ala Ala Gly Pro Leu Gly Met Glu Met Pro Ile Met
1 5 10 15
His Asp Gly Asp Arg Tyr Glu Leu Val Lys Glu Ile Gly Ser Gly Asn
20 25 30
Phe Gly Val Ala Arg Leu Met Arg Asn Arg Ala Ser Gly Asp Leu Val
35 40 45
Ala Val Lys Tyr Ile Asp Arg Gly Glu Lys Ile Asp Glu Asn Val Gln
50 55 60
Arg Glu Ile Ile Asn His Arg Ser Leu Arg His Pro Asn Ile Ile Arg
65 70 75 80
Phe Lys Glu Val Ile Leu Thr Pro Thr His Leu Ala Ile Val Met Glu
85 90 95
Tyr Ala Ser Gly Gly Glu Leu Phe Glu Arg Ile Cys Ser Ala Gly Arg
100 105 110
Phe Ser Glu Asp Glu Ala Arg Phe Phe Phe Gln Gln Leu Ile Ser Gly
115 120 125
Val Ser Tyr Cys His Ser Met Gln Val Cys His Arg Asp Leu Lys Leu
130 135 140
Glu Asn Thr Leu Leu Asp Gly Ser Thr Ala Pro Arg Leu Lys Ile Cys
145 150 155 160
Asp Phe Gly Tyr Ser Lys Ser Ser Val Leu His Ser Gln Pro Lys Ser
165 170 175
Thr Val Gly Thr Pro Ala Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu Leu Lys Lys
180 185 190
Glu Tyr Asp Gly Lys Ile Ala Asp Val Trp Ser Cys Gly Val Thr Leu
195 200 205
Tyr Val Met Leu Val Gly Ala Tyr Pro Phe Glu Asp Pro Glu Asp Pro
210 215 220
Lys Asn Phe Arg Lys Thr Ile Gln Lys Ile Leu Gly Val Gln Tyr Ser
225 230 235 240
Ile Pro Asp Tyr Val His Ile Ser Pro Glu Cys Arg Asp Leu Ile Thr
245 250 255
Arg Ile Phe Val Gly Asn Pro Ala Ser Arg Ile Thr Met Pro Glu Ile
260 265 270
Lys Asn His Pro Trp Phe Met Lys Asn Ile Pro Ala Asp Leu Met Asp
275 280 285
Asp Gly Met Val Ser Asn Gln Tyr Glu Glu Pro Asp Gln Pro Met Gln
290 295 300
Asn Met Asn Glu Ile Met Gln Ile Leu Ala Glu Ala Thr Ile Pro Ala
305 310 315 320
Ala Gly Thr Ser Gly Ile Asn Gln Phe Leu Thr Asp Ser Leu Asp Leu
325 330 335
Asp Asp Asp Met Glu Asp Met Asp Ser Asp Leu Asp Leu Asp Ile Glu
340 345 350
Ser Ser Gly Glu Ile Val Tyr Ala Met
355 360

Claims (4)

1.OsSAPK9蛋白及其编码基因在提高植物耐铝性中的应用；
所述OsSAPK9蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示；
所述植物为水稻。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述编码基因为编码区如序列表的序列1自5’末端第1-1086位核苷酸所示的DNA分子。
3.权利要求1中所述OsSAPK9蛋白及其编码基因在植物育种中的应用；所述育种的目的是选育耐铝性高的植物；
所述植物为水稻。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述编码基因为编码区如序列表的序列1自5’末端第1-1086位核苷酸所示的DNA分子。
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