CN112695078A - 一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法 - Google Patents

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CN112695078A CN202110161962.5A CN202110161962A CN112695078A CN 112695078 A CN112695078 A CN 112695078A CN 202110161962 A CN202110161962 A CN 202110161962A CN 112695078 A CN112695078 A CN 112695078A
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Abstract

本发明公开了一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，包括以下步骤：首先采用菌丝诱导实验获得以菌丝相生长的白色念珠菌，然后用转录组测序方法（RNA‑seq）分析菌丝诱导前后念珠菌转录组差异并筛选毒力相关基因，接着采用革兰氏染色方法和细胞增殖率检测分析经白色念珠菌感染后的不同宿主细胞各自的损伤情况；最后用逆转录‑荧光定量PCR方法（qRT‑PCR）分析念珠菌感染不同种类宿主细胞后毒力基因表达的差异。本方法可明确了菌丝形成与念珠菌某些毒力因子伴生关系，筛选出了在念珠菌感染不同细胞时出现差异性激活的潜在毒力相关基因，对阐明念珠菌感染宿主不同分子机制和筛选用于诊断的高特异性、高可信度念珠菌毒力基因提供了证据。

Description

一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法
技术领域
本发明涉及白色念珠菌毒力相关基因的技术领域，具体为一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法。
背景技术
白色念珠菌（Candida albicans）是真菌中最常见的人类病原菌，是健康宿主皮肤、黏膜和消化道正常菌群的组成部分，然而，当免疫防御系统受损或正常菌群平衡被破坏时，其就会转化为机会性致病杀手，可引起浅表黏膜感染或全身性疾病，并导致较高死亡率，事实上，念珠菌的传播是导致艾滋病患者口咽疾病、女性外阴阴道炎症，以及糖尿病患者、早产儿和外科患者侵袭性真菌病的主要原因。这其中包括了白色念珠菌与上皮细胞直接接触破坏上皮细胞；血管内植入被污染的器材以及在外伤及外科手术处理时进入血液，趁机通过黏附和渗入血管内皮而进入深部脏器引起一些易感人群全身性感染；以及穿过血管进入组织中激活固有免疫细胞（如巨噬细胞）进而引起的一系列“遭遇战”，无论是念珠菌的浅表性感染还是系统性感染，在此过程中念珠菌与宿主细胞间的相互作用结果都将决定了感染的最终结局。白色念珠菌是一种形态双相型真菌，能够在各种环境下以各种可逆形态如酵母型（Y）、假菌丝型或菌丝型（H）生长，念珠菌由酵母向菌丝的转变（yeast-to-hyphae transition）能力已被证明对其致病性是必需的，除了从形态转变可作为一种毒力特性，念珠菌也可介导多种侵袭性酶入侵宿主组织以及逃避宿主抗真菌感染免疫，在白念珠菌的致病中起到关键作用。本研究拟对白色念珠菌分别感染人阴道上皮细胞、人脐静脉内皮细胞和人单核源性巨噬细胞后从念珠菌的菌丝形成、细胞黏附、侵袭性酶等毒力基因的表达方面进行对比分析，这项研究目前尚未见报道，研究结果拟以对念珠菌与不同宿主细胞相互作用机制的深入研究，对由正常定植状态转变为具有较高毒力的感染状态的念珠菌毒力基因及时诊断提供有价值的依据和线索，所以我们提出了一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，以便于解决上述中提出的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，以解决上述背景技术中提出对白色念珠菌分别感染人阴道上皮细胞、人脐静脉内皮细胞和人单核源性巨噬细胞后从念珠菌的菌丝形成、细胞黏附、侵袭性酶等毒力基因的表达方面进行对比分析，这项研究目前尚未见报道，研究结果拟以对念珠菌与不同宿主细胞相互作用机制的深入研究，对由正常定植状态转变为具有较高毒力的感染状态的念珠菌毒力基因及时诊断提供有价值的依据和线索的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，包括
一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，包括：
步骤1：准备好菌株，细胞系和主要材料
菌株：白色念珠菌SC5314株，购自北纳生物菌种收藏中心，菌株在沙堡罗琼脂平板上活化培养后，实验前一天于新鲜配制液体YPD（2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖、50μg/ml氯霉素）培养基中30℃，220 r/min过夜培养，达对数相生长后用于实验；人单核细胞系THP-1、人阴道上皮细胞系VK2/E6E7和人脐静脉内皮细胞系HUVEC均购自中科院上海细胞库，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，使用添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640细胞培养液传代培养；
步骤2：菌丝诱导实验
取对数生长相的白色念珠菌菌液，收集、清洗、计数；
步骤3：转录组测序与数据分析
按说明书方法提取菌丝诱导前和诱导后的白色念珠菌的总RNA，将质检合格的总RNA样本（包含生物学重复）送至华大基因进行转录组测序（RNA-seq）分析，测序原始数据经过预处理后，得到白色念珠菌菌丝诱导前后各样本的有效转录组数据；
步骤4：细胞毒性分析
取过夜培养的白色念珠菌菌液，收集、洗涤、计数后备用；
步骤5：念珠菌感染宿主细胞的形态学观察
胰酶消化、收集并洗涤HUVEC、VK2/E6E7或PMA处理的THP-1细胞单层，用含1%FBS的RPMI-1640培养液调整细胞数为2×106/ml；
步骤6：逆转录和荧光定量PCR分析（qRT-PCR）
按照感染复数1（念珠菌:HUVEC细胞）或0.1（念珠菌:VK2/E6E7或THP-1细胞）建立1h、2 h、4 h和8 h感染模型，裂解处理宿主细胞后，4℃离心收集菌体，分别提取上述各时间点的念珠菌总RNA，按逆转录酶操作说明配制20 ml逆转录体系，于42℃反应60 min，70℃加热5 min终止反应；
步骤7：统计学分析
所获得实验数据均以多次实验结果平均值±标准偏差表示。
优选的，所述步骤1中悬浮生长状态的人单核细胞THP-1在实验前需经10 ng/ml佛波酯（PMA）诱导分化48 h待贴壁培养后方可用于后续研究，主要仪器：生化培养箱、CO2细胞培养箱、生物安全柜、恒温摇床、正置显微镜、倒置显微镜、多功能酶标仪、荧光定量PCR仪、细胞计数仪、微量高速离心机、台式大容量离心机；其他主要试剂：RNA提取试剂盒、溶壁酶、逆转录酶、SYBR荧光定量PCR试剂、革兰氏染色试剂。
优选的，所述步骤2中新鲜配制下列菌丝诱导液：①RPMI 1640细胞培养液；②FBS；③无菌水配制的10% FBS（v/v）；④含10% FBS的 RPMI 1640细胞培养液；⑤无菌水；⑥YPD液体培养基。用YPD调整菌数为5×106/ml，取样镜检拍照，作为菌丝诱导前的对照，对应不同诱导条件，于37℃恒温培养箱内分别孵育1 h、2 h、3 h和4 h，每个时间点取菌液，于显微镜下观察菌丝形成情况，拍照记录，每种菌丝诱导体系的每个时间点各设置一个平行对照。
优选的，所述步骤3中在RNA-seq在线数据分析平台通过样本属性、样本表达量、实验组间差异和基因注释等条件选择后，分析侵袭性酶类、菌丝形成、细胞黏附等念珠菌毒力基因在菌丝诱导前后的差异表达，差异倍数以log2表示，对log2³2的高可信度差异表达基因进行基因本体论（Gene Ontology，GO），此外，根据差异基因GO结果进一步挖掘，用生物学功能注释的标准词汇表术语（GO term）筛选出与菌丝形成、致病性、细胞黏附、与宿主细胞相互作用等与白色念珠菌毒力可能相关的新候选基因。
优选的，所述步骤4中过夜培养的VK2/E6E7、HUVEC和经PMA处理的THP-1细胞单层细胞经胰酶消化、收集和PBS洗涤后用细胞培养液重悬并调整细胞数量至5×104个动物细胞/ml，按100 ml/孔加入96孔细胞培养板指定位置，按照感染复数（念珠菌数与细胞数的比值）分别为10、1、0.1和0.01，在上述已加有动物细胞的孔中分别再加入100 ml已用RPMI1640（含1%FBS）细胞培养液定量稀释的念珠菌菌液，置37℃、5% CO2培养箱内感染24 h，分别通过乳酸脱氢酶（LDH）释放的检测和WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐）的检测（即Cell Counting Kit，CCK试剂盒）对细胞死亡率和细胞存活率进行分析，具体操作按照试剂盒说明书进行，并按照要求提前在感染前设置各种所需对照样孔，LDH测定时用酶标仪于490 nm处测定各样孔吸光度，取650 nm处作为参考波长，细胞死亡率（%）=（处理样品吸光度－样品对照孔吸光度） /（细胞最大酶活性的吸光度－样品对照孔吸光度）×100；CCK测定时用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，以650nm作为参考波长，细胞存活率（%）=（感染样品吸光度－纯菌对照吸光度） /（正常细胞对照吸光度－培养基对照吸光度）×100，用Excel软件绘制细胞死亡率和存活率曲线，据此可计算念珠菌yi3不同感染复数感染宿主细胞24 h的半致死剂量LD50。
优选的，所述步骤5中向12孔细胞培养板每孔加入一片直径15 mm的圆形玻片，以感染复数1将念珠菌与HUVEC细胞共孵育；以感染复数0.1分别将念珠菌与VK2/E6E7或THP-1细胞共孵育。将上述12孔板于CO2培养箱中分别孵育1 h、2 h、4 h和8 h，同时设置相应时间点的纯菌液阴性对照，孵育结束后，每孔内玻片经PBS小心清洗后用冷甲醇溶液固定样品15min，按照革兰氏染色试剂盒说明书方法对玻片表面进行革兰氏染色处理，随后镜检分析。
优选的，所述步骤6中各感染时间后所制备的念珠菌cDNA为模板，对文献已报道以及RNA-seq分析后筛选的36个念珠菌毒力基因或潜在毒力基因进行荧光定量PCR分析（qPCR），EFB1、RPP2B、PMA1和IMH3等基因作为内参，取其各时间点的Ct值几何平均数作为内参对照，按qPCR试剂盒说明配制25 mL体系，采用两步法，通过excel软件整理各样本的原始数据（Ct值），通过2-ΔΔCt方法进行数据统计分析。
优选的，所述步骤7中的电解方法为采用Excel软件数据统计功能进行数据分析，P<0.05认为有显著差异，RNA-seq数据分析中采用Q值，即校正后的P值，Q<0.05认为有显著差异。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：该应用结合菌丝诱导、转录组测序和荧光定量PCR的菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的筛选方法；
不同基因群针对不同感染模型的表达特征对于念珠菌感染机制的进一步探究以及筛选用于诊断的新颖、高特异性和高可信度的念珠菌毒力基因均是有意义的。而HWP1、ECE1和ALS3无论在单独的菌丝形成时还是感染过程中均高表达，而感染过程也伴有菌丝形成，可见它们均是白色念珠菌感染的必要条件，菌丝形成与念珠菌某些毒力因子伴生，所筛选新的潜在毒力基因在念珠菌感染不同细胞时出现差异性激活现象，念珠菌感染不同细胞可能具有各自的毒力基因群。这对阐明念珠菌感染宿主的不同分子机制和筛选用于诊断的高特异性、高可信度念珠菌毒力基因提供了依据。
附图说明
图1为本发明白色念珠菌培养状态示意图；
图2为本发明白色念珠菌菌丝形成对比示意图；
图3为本发明两相形态的转录组全景差异示意图；
图4为本发明白色念珠菌感染不同宿主细胞的半数致死量示意图；
图5为本发明白色念珠菌在感染三种不同的宿主细胞对THP-1细胞反
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例提供一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，以下对上述方法进行详细介绍。
首先根据上述实验步骤可以得到实验结果，对于实验结构进行分析酵母型白色念珠菌在含FBS的RPMI 1640细胞培养液中菌丝形成相对最快，诱导前的白色念珠菌SC5314株外形呈椭圆酵母状，菌体直径在10 ~15mm左右（图1）；经不同诱导剂诱导后，念珠菌菌丝均明显形成（P<0.05）；在整个实验中，白色念珠菌在RPMI 1640+10%FBS的诱导体系里菌丝形成最为显著，最长达300 mm左右，且在仅诱导1 h后，其菌丝形成程度即显著高于其他组（P<0.05，如图2所示）；YPD诱导菌丝能力次之，其他RPMI 1640组、FBS组和10%FBS组的菌丝形成情况相似，从FBS对菌丝诱导的作用来看，10%FBS已有足够诱导能力；从无菌水诱导结果可看出，37℃条件也是菌丝形成的重要条件之一；除了水中诱导之外，其他实验组的菌丝形成长度增长均呈时效性；
白色念珠菌两相形态的转录组全景差异显著RNA-seq数据分析显示，白色念珠菌菌丝诱导前的酵母型样本（Ca_yeast）和菌丝诱导4 h后的菌丝型样本（Ca_hyphae）共同表达的基因数为7054个，只在Ca_yeast中有表达的基因167个，仅在Ca_hyphae中表达的基因137个，如图3A所示；Ca_hyphae较Ca_yeast有1520条基因表达上调（差异表达倍数³2，即log2转换后的差异倍数³1，下同），图中用红点表示；有1315条基因表达量下调，图中用蓝点表示，如图3B所示；将差异表达倍数在4倍及以上（Ca_hyphae/Ca_yeast³4，即log2³2）的所谓高可信度差异表达基因进行GO 注释，筛选出与菌丝形成过程相关性较高的基因405个，用RNA-seq在线数据分析系统做GO 富集分析，如下图3C所示；从图中可见差异表达基因在菌丝形成、致病性、细胞黏附、与宿主细胞相互作用等方面都有体现；通过对差异基因GO分布结果进一步挖掘，筛选出与菌丝形成、致病性、细胞黏附、与宿主细胞相互作用等与白色念珠菌侵袭力可能相关的且未见广泛报道的候选基因7个，这些基因在菌丝诱导后均出现显著的表达上调（Q<0.01）如图3所示，结果如表1所示；
表1 筛选出的可能的白色念珠菌侵袭力相关新基因
基因ID 其他基因ID log2(Ca_hyphae/Ca_yeast) Q值(Ca_yeast-vs-Ca_hyphae) 基因定义
C3_06090C_A OCH1 8.57 9.68E-30 alpha 1,6-mannosyltransferase
C1_13450W_A HYR1 9.35 3.99E-64 agglutinin-like protein
C1_10400C_A FGR41 9.48 3.64E-34 chitinase
CR_10450C_A SPT3 6.98 1.45E-16 transcription initiation protein
CR_07620W_A AAT21 3.05 4.35E-11 aspartate aminotransferase, cytoplasmic
C3_07310C_A SLK19 3.26 1.13E-19 trichohyalin
CR_06670W_A CFL11 3.31 3.02E-07 arginyl-tRNA synthetase
菌丝型白色念珠菌感染状态下的三种宿主细胞均出现损伤，白色念珠菌SC5314感染三种宿主细胞后分别通过LDH释放的检测和CCK检测对细胞死亡率和细胞存活率进行分析；结果显示，在三种感染模型中，随着感染复数增大，宿主细胞死亡率均呈明显升高趋势，细胞存活率呈降低趋势；在感染复数为0.1感染THP-1细胞时，通过LDH释放检测得细胞死亡率为65.36%±3.65%，通过CCK-8检测得细胞存活率为53.54%±2.14%；在以感染复数为0.1感染VK2/E6E7细胞时，细胞死亡率为58.57%±7.65%，细胞存活率为47.70.54%±5.34%；在以感染复数为1感染HUVEC细胞时，细胞死亡率为48.46%±3.97%，细胞存活率为48.51%±2.86%；由此可确定念珠菌感染不同宿主细胞的半数致死量（LD50）；具体结果如图4A和4B所示；
借助革兰氏染色技术，对不同感染时间后的念珠菌和宿主细胞进行固定后染色，白色念珠菌SC5314株呈蓝紫色，宿主细胞呈玫红色；由显微镜下观察结果可见，白色念珠菌感染不同细胞1 h至8 h中，菌丝均随时间延长而增长，4 h后均有假菌丝形成趋势，与念珠菌单独在细胞培养液中孵育后的菌丝形成趋势相当，可见细胞培养环境对菌丝形成的诱导影响要远大于不同宿主细胞的影响；从念珠菌对于宿主细胞的黏附程度来看，感染HUVEC细胞1 h后即出现明显黏附，而在感染2 h后才出现与THP-1或VK2/E6E7细胞明显的黏附，这或许与感染HUVEC时较高的感染复数有关；从念珠菌对宿主细胞的影响程度来看，感染THP-1或HUVEC细胞2 h后，宿主细胞即出现明显空泡现象，而VK2/E6E7细胞出现明显空泡发生在感染后8 h；可见大量分枝型假菌丝的生成明显增大了念珠菌的侵袭能力，如图4C所示；
感染三种宿主细胞时的白色念珠菌毒力基因差异表达各有特征，根据2-ΔΔCt法，qRT-PCR结果中表示基因差异表达倍数变化的即为2-ΔΔCt；若按差异表达倍数在两倍及以上为显著差异来，则ΔΔCt³1或£-1均代表基因有显著性差异表达；由图5可知，白色念珠菌在感染三种不同的宿主细胞后，对THP-1细胞的反应最为强烈，在36个参与分析的基因（侵袭性酶基因SAP1~SAP10、LIP1~LIP9、PLB1、PLB2；菌丝形成与细胞黏附相关基因HWP1、ECE1、ALS1、ALS3、RAS1；新筛选的毒力可能相关基因OCH1、HYR1、FGR41、SPT3、AAT21、SLK19、CFL11、LAT1、LSC2、ACT1和5个管家基因）中，除了SAP9、ALS1、LSC2、AAT21和LAT1等基因无显著性差异表达之外，其余基因均表达上调，且在感染2~4 h出现高峰（图5A）；念珠菌对HUVEC细胞的反应次之，绝大多数侵袭性酶家族基因出现显著上调表达，感染4 h后，表达呈现高峰，感染8 h后轻微回落；菌丝形成相关基因HWP1和ALS3在整个感染过程中持续呈上调表达，在感染4 h后差异表达最为显著；FGR41、SPT3和CFL11等新筛选基因在感染过程中也呈现持续高表达的趋势（图5B）；在感染VK2/E6E7细胞后，念珠菌HWP1、ALS3、ECE1等菌丝形成相关基因有显著性上调表达，而其余基因均未表现出表达升高趋势，甚至有些基因如PLB2、LIP6、ACT1等在感染过程中出现了显著而持续性的下调表达；值得注意的是，与氨基酸转运相关的基因LAT1在感染早期出现了显著性高表达后在感染4 h后表达回落至正常水平；EFB1、RPP2B、PMA1和IMH3等几个管家基因的表达水平在整个感染过程中未见显著性差异（图5C）；作为对照，在细胞培养液中单独孵育1 h、2 h、4 h和8 h的白色念珠菌其侵袭性酶相关基因SAP5和SAP9、菌丝形成及细胞黏附相关基因HWP1、ECE1和ALS3，以及研究中筛选出的感兴趣基因AAT21和SLK19等基因均出现显著且相对持续的上调表达；其他基因在1~8 h的孵育过程中未见显著性差异表达（图5D）；
白色念珠菌可以两相型形态生存，即酵母型和菌丝型，已有文献报道，菌丝型形成有利于白色念珠菌感染宿主细胞；一方面是通过菌丝延长从而破坏宿主细胞，如内皮细胞等；另一方面则是因为念珠菌某些黏附因子或侵袭性酶随着菌丝形成而表达，如ALS3或SAP家族某些酶，所以菌丝一旦形成则标志着白色念珠菌已携带一定侵袭力；侵袭力属于念珠菌毒力的组成部分，由此可看出，除了黏附因子和侵袭性酶作为直接毒力因子之外，念珠菌菌丝的形成也是重要毒力因素；研究中首先确认了与念珠菌感染细胞相适应的菌丝诱导条件，37℃和细胞培养液组分均可促进念珠菌菌丝形成，其中RPMI 1640培养液的诱导能力与Holtappels等人研究结果相符，FBS和37℃的诱导效果与Fleischmann等人结果相符；
本研究中通过RNA-seq筛选并关注了菌丝型中显著性高表达的毒力相关基因，作为念珠菌感染不同宿主细胞模型中毒力基因表达分析的理论基础；发现白色念珠菌从酵母型转变为菌丝型前后，基因定量分析结果和差异表达分布都呈现明显区别，这与Grumaz等人的转录组分析结果有相符之处，但本研究所揭示的菌丝和酵母两相间各自表达的基因比例与已有文献中报道存在不同，这或许与菌株或诱导条件差异有关；对RNA-seq数据中有关侵袭性酶类、细胞黏附和菌丝形成等主要毒力基因的表达结果分析后发现，部分分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAP家族）和常见的菌丝形成相关基因上调表达，这与已有报道结果部分相符，即部分在菌丝型表达念珠菌侵袭力相关基因也参与了菌丝形成调节，但研究中发现在菌丝型共表达的SAP7基因在以往研究中未见报道；此外，已有文献中作为白色念珠菌管家基因的LSC2和ACT1在菌丝型中出现上调表达，揭示这些基因在不同生理条件下表达尚存在不稳定性，受到感染条件影响；对差异基因GO分布从菌丝形成、致病性、细胞黏附、与宿主细胞相互作用等方面进一步挖掘，筛选出与白色念珠菌侵袭力可能相关的且未见广泛报道的7个新的潜在基因，即OCH1、HYR1、FGR41、SPT3、AAT21、SLK19和CFL11，这些基因的表达特征在念珠菌针对不同宿主细胞的感染模型建立后，或许会为念珠菌致病机制的深入研究打开新的突破口；
从念珠菌对不同宿主细胞感染后的基因差异表达结果来看，白色念珠菌对人THP-1的反应最为强烈，这或许与巨噬细胞表面广泛存在最为主要的“经典”念珠菌表面模式识别受体有关，宿主活跃的固有免疫反应能力同时也激发了念珠菌的侵袭力；在感染中，念珠菌对HUVEC细胞反应次之，有研究表明内皮细胞可内吞白色念珠菌，这一点与巨噬细胞对念珠菌的相互作用类似，两种宿主细胞表面很可能有相似的受体，从而使得白色念珠菌在面对THP-1或HUVEC时有相似的反应；念珠菌感染VK2/E6E7细胞后，除了调控菌丝形成的基因有上调表达以外，侵袭性酶类基因大都表示“沉默”，也有文献表明，念珠菌侵袭上皮细胞有其不同的机制；此外，本研究中念珠菌感染不同宿主细胞后其毒力基因差异表达的特征也具有重要意义，比如SAP9基因和AAT21基因表达很可能与菌丝形成正相关，在感染中发挥的作用较小；LIP6基因在念珠菌感染三种细胞时均出现显著地上调表达；HYR1、FGR41、SPT3和CFL11基因的高表达在THP-1和HUVEC的感染中十分显著；而RAS1、OCH1、SLK19基因的高表达只出现在念珠菌感染THP-1细胞后；LAT1的感染早期高表达仅出现在感染VK2/E6E7细胞中；这些不同基因群针对不同感染模型的表达特征对于念珠菌感染机制的进一步探究以及筛选用于诊断的新颖、高特异性和高可信度的念珠菌毒力基因均是有意义的；而HWP1、ECE1和ALS3无论在单独的菌丝形成时还是感染过程中均高表达，而感染过程也伴有菌丝形成，可见它们均是白色念珠菌感染的必要条件。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，包括：
步骤1：准备好菌株，细胞系和主要材料
菌株：白色念珠菌SC5314株，购自北纳生物菌种收藏中心，菌株在沙堡罗琼脂平板上活化培养后，实验前一天于新鲜配制液体YPD（2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖、50μg/ml氯霉素）培养基中30℃，220 r/min过夜培养，达对数相生长后用于实验；人单核细胞系THP-1、人阴道上皮细胞系VK2/E6E7和人脐静脉内皮细胞系HUVEC均购自中科院上海细胞库，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，使用添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640细胞培养液传代培养；
步骤2：菌丝诱导实验
取对数生长相的白色念珠菌菌液，收集、清洗、计数；
步骤3：转录组测序与数据分析
按说明书方法提取菌丝诱导前和诱导后的白色念珠菌的总RNA，将质检合格的总RNA样本（包含生物学重复）送至华大基因进行转录组测序（RNA-seq）分析，测序原始数据经过预处理后，得到白色念珠菌菌丝诱导前后各样本的有效转录组数据；
步骤4：细胞毒性分析
取过夜培养的白色念珠菌菌液，收集、洗涤、计数后备用；
步骤5：念珠菌感染宿主细胞的形态学观察
胰酶消化、收集并洗涤HUVEC、VK2/E6E7或PMA处理的THP-1细胞单层，用含1%FBS的RPMI-1640培养液调整细胞数为2×106/mL；
步骤6：逆转录和荧光定量PCR分析（qRT-PCR）
按照感染复数1（念珠菌:HUVEC细胞）或0.1（念珠菌:VK2/E6E7或THP-1细胞）建立1 h、2h、4 h和8 h感染模型，裂解处理宿主细胞后，4℃离心收集菌体，分别提取上述各时间点的念珠菌总RNA，按逆转录酶操作说明配制20 mL逆转录体系，于42℃反应60 min，70℃加热5min终止反应；
步骤7：统计学分析
所获得实验数据均以多次实验结果平均值±标准偏差表示。
2.根据权利要求1所述的一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，其特征在于：所述步骤1中悬浮生长状态的人单核细胞THP-1在实验前需经10 ng/ml 佛波酯（PMA）诱导分化48 h待贴壁培养后方可用于后续研究，主要仪器：生化培养箱、CO2细胞培养箱、生物安全柜、恒温摇床、正置显微镜、倒置显微镜、多功能酶标仪、荧光定量PCR仪、细胞计数仪、微量高速离心机、台式大容量离心机；其他主要试剂：RNA提取试剂盒、溶壁酶、逆转录酶、SYBR荧光定量PCR试剂、革兰氏染色试剂。
3.根据权利要求1所述的一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，其特征在于：所述步骤2中新鲜配制下列菌丝诱导液：①RPMI 1640细胞培养液；②FBS；③无菌水配制的10% FBS（v/v）；④含10% FBS的 RPMI 1640细胞培养液；⑤无菌水；⑥YPD液体培养基。用YPD调整菌数为5×106/ml，取样镜检拍照，作为菌丝诱导前的对照，对应不同诱导条件，于37℃恒温培养箱内分别孵育1 h、2 h、3 h和4 h，每个时间点取菌液，于显微镜下观察菌丝形成情况，拍照记录，每种菌丝诱导体系的每个时间点各设置一个平行对照。
4.根据权利要求1所述的一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，其特征在于：所述步骤3中在RNA-seq在线数据分析平台通过样本属性、样本表达量、实验组间差异和基因注释等条件选择后，分析侵袭性酶类、菌丝形成、细胞黏附等念珠菌毒力基因在菌丝诱导前后的差异表达，差异倍数以log2表示，对log2³2的高可信度差异表达基因进行基因本体论（Gene Ontology，GO），此外，根据差异基因GO结果进一步挖掘，用生物学功能注释的标准词汇表术语（GO term）筛选出与菌丝形成、致病性、细胞黏附、与宿主细胞相互作用等与白色念珠菌毒力可能相关的新候选基因。
5.根据权利要求1所述的一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，其特征在于：所述步骤4中过夜培养的VK2/E6E7、HUVEC和经PMA处理的THP-1细胞单层细胞经胰酶消化、收集和PBS洗涤后用细胞培养液重悬并调整细胞数量至5×104个动物细胞/ml，按100ml/孔加入96孔细胞培养板指定位置，按照感染复数（念珠菌数与细胞数的比值）分别为10、1、0.1和0.01，在上述已加有动物细胞的孔中分别再加入100 ml已用RPMI 1640（含1%FBS）细胞培养液定量稀释的念珠菌菌液，置37℃、5% CO2培养箱内感染24 h，分别通过乳酸脱氢酶（LDH）释放的检测和WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐）的检测（即Cell Counting Kit，CCK试剂盒）对细胞死亡率和细胞存活率进行分析，具体操作按照试剂盒说明书进行，并按照要求提前在感染前设置各种所需对照样孔，LDH测定时用酶标仪于490 nm处测定各样孔吸光度，取650 nm处作为参考波长，细胞死亡率（%）=（处理样品吸光度－样品对照孔吸光度） /（细胞最大酶活性的吸光度－样品对照孔吸光度）×100；CCK测定时用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，以650 nm作为参考波长，细胞存活率（%）=（感染样品吸光度－纯菌对照吸光度） /（正常细胞对照吸光度－培养基对照吸光度）×100，用Excel软件绘制细胞死亡率和存活率曲线，据此可计算念珠菌以不同感染复数感染宿主细胞24 h的半致死剂量LD50。
6.根据权利要求1所述的一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，其特征在于：所述步骤5中向12孔细胞培养板每孔加入一片直径15 mm的圆形玻片，以感染复数1将念珠菌与HUVEC细胞共孵育；以感染复数0.1分别将念珠菌与VK2/E6E7或THP-1细胞共孵育，将上述12孔板于CO2培养箱中分别孵育1 h、2 h、4 h和8 h，同时设置相应时间点的纯菌液阴性对照，孵育结束后，每孔内玻片经PBS小心清洗后用冷甲醇溶液固定样品15 min，按照革兰氏染色试剂盒说明书方法对玻片表面进行革兰氏染色处理，随后镜检分析。
7.根据权利要求1所述的一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，其特征在于：所述步骤6中各感染时间后所制备的念珠菌cDNA为模板，对文献已报道以及RNA-seq分析后筛选的36个念珠菌毒力基因或潜在毒力基因进行荧光定量PCR分析（qPCR），EFB1、RPP2B、PMA1和IMH3等基因作为内参，取其各时间点的Ct值几何平均数作为内参对照，按qPCR试剂盒说明配制25 mL体系，采用两步法，通过excel软件整理各样本的原始数据（Ct值），通过2-ΔΔCt方法进行数据统计分析。
8.根据权利要求1所述的一种筛选菌丝态白色念珠菌毒力相关基因的方法，其特征在于：所述步骤7中的电解方法为采用Excel软件数据统计功能进行数据分析，P<0.05认为有显著差异。RNA-seq数据分析中采用Q值，即校正后的P值，Q<0.05认为有显著差异。
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