CN114796180A - 多球壳菌素和芬戈莫德在抑制耳念珠菌的方面的用途 - Google Patents

多球壳菌素和芬戈莫德在抑制耳念珠菌的方面的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及多球壳菌素和芬戈莫德在抑制耳念珠菌的方面的用途。与现有技术相比，本发明涉及的化合物多球壳菌素和芬戈莫德可以抑制耳念珠菌所有四个分支的临床菌株细胞生长。本发明涉及的化合物多球壳菌素和芬戈莫德可以抑制耳念珠菌酵母型、聚集型和菌丝型细胞的生长。多球壳菌素通过抑制蛋白质翻译和氨基酸合成而抑制耳念珠菌细胞生长。芬戈莫德诱导耳念珠菌产生细胞氧化压力ROS并杀死耳念珠菌细胞。

Description

多球壳菌素和芬戈莫德在抑制耳念珠菌的方面的用途
技术领域
本发明涉及医药化学领域，尤其是涉及一种多球壳菌素和芬戈莫德在抑制耳念珠菌的方面的用途。
背景技术
耳念珠菌是一种新发真菌病原体。2009年日本首次报道发现耳念珠菌及其感染病例，随后10年间，耳念珠菌席卷了全球六个大洲40多个国家。这引起了各国疾病防控部门、科学家、临床医生甚至媒体的高度重视。自2019年首次报道耳念珠菌后，中国各地区也陆续有耳念珠菌报道。
耳念珠菌作为“超级真菌”，已对全球的人类健康构成了威胁，这是因为该菌鉴定困难、传播性强、致死率高、以及耐药性强。耐药乃至多重耐药是耳念珠菌的突出特征，是耳念珠菌感染治疗失败及流行难以控制的主要原因。2019年，美国疾控中心在抗生素耐药威胁报告中将耳念珠菌列为紧迫威胁。可见，耳念珠菌耐药问题已相当严重，新药的研发迫在眉睫。
在真核生物中，鞘脂在维持细胞膜的功能和完整性中起重要作用。丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)催化L-丝氨酸和棕榈酰辅酶a的缩合反应生成3-酮二氢鞘氨醇，这是鞘脂生物合成的第一步同时也是决速步骤。多球壳菌素(Myriocin)也被称为 ISP-I，是一种免疫抑制剂。Myriocin的化学式为C21H39NO6，即2S,3R,4R,6E-2-氨基-3,4-二羟基。Myriocin可以从两种虫草真菌Myriococcum albomyces和Isaria sinclairii中分离得到。Myriocin的化学物质在结构上类似于鞘氨醇，对SPT有强大的抑制作用，被用作免疫抑制剂和治疗其他疾病，如糖尿病和癌症。有报道称，多球壳菌素对白念珠菌和曲霉菌有一定的抑制能力。
芬戈莫德(Fingolimod，又被称作FTY720)是sphingosine 1-phosphate(S1P)受体调节剂，其化学式为C19H33NO2，即2-amino-2-[2-(4-octylphenyl)]-1,3-propanediolhydrochloride。1992年研究者通过免疫抑制天然产物ISP-I(Myriocin)的化学修饰，使Myriocin的结构大幅度简化，找到了一种非手性对称的2-取代的2-氨基丙烷-1,3- 二醇骨架，用于体内免疫抑制活性(抑制大鼠同种异体皮肤排斥试验或延长大鼠同种异体皮肤移植存活率)，并最终发现了FTY720。FTY720可以显著延长移植物存活，并通过诱导淋巴细胞凋亡、加速外周循环的成熟淋巴细胞归巢和抑制T细胞从胸腺向外周血循环的转移等方式减少外周血中的淋巴细胞，体现出强大的免疫抑制作用。
目前，现有技术中并没有关于多球壳菌素(Myriocin)和芬戈莫德(Fingolimod，又被称作FTY720)是否对耳念珠菌有抑制作用。
发明内容
针对现有技术中耳念珠菌耐药性强的问题，本发明提供多球壳菌素和芬戈莫德在抑制耳念珠菌的方面的用途。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面，提供多球壳菌素在制备抑制耳念珠菌或治疗耳念珠菌感染的药物上的应用。
多球壳菌素的英文名字是Myriocin，化学式为C21H39NO6。
进一步地，所述多球壳菌素在制备抑制耳念珠菌耐药株细胞生长的药物上的应用。
再进一步地，所述多球壳菌素在制备抑制四个分支的耳念珠菌耐药株细胞生长的药物上的应用。
进一步地，所述多球壳菌素在制备抑制耳念珠菌不同形态细胞生长的药物上的应用。
进一步地，本发明涉及的化合物多球壳菌素可以抑制耳念珠菌酵母型、聚集型和菌丝型细胞的生长。
进一步地，所述多球壳菌素在制备抑制耳念珠菌蛋白质翻译和氨基酸合成途径的药物上的应用。通过抑制蛋白质翻译和氨基酸合成途径来抑制耳念珠菌生长。
进一步地，所述多球壳菌素的最低抑菌浓度在0.03mg/L到0.5mg/L之间。
本发明第二方面，提供芬戈莫德在制备抑制耳念珠菌或治疗耳念珠菌感染的药物上的应用。
芬戈莫德的英文名字是Fingolimod，化学式为C19H33NO2，是多球壳菌素Myriocin修饰后的衍生物。
进一步地，所述芬戈莫德在制备抑制耳念珠菌耐药株细胞生长的药物上的应用。
再进一步地，所述芬戈莫德在制备抑制四个分支的耳念珠菌耐药株细胞生长的药物上的应用。
进一步地，所述芬戈莫德在制备抑制耳念珠菌不同形态细胞生长的药物上的应用。
进一步地，本发明涉及的化合物芬戈莫德可以抑制耳念珠菌酵母型、聚集型和菌丝型细胞的生长。
进一步地，所述芬戈莫德在制备产生细胞氧化压力ROS，以杀死耳念珠菌细胞的药物上的应用。通过产生细胞氧化压力ROS，并快速杀死细胞来抑制耳念珠菌生长。
进一步地，所述芬戈莫德的最低抑菌浓度在4mg/L到16mg/L之间。
以上发明内容中，所述四个分支分别是指南亚分支、东亚分支、南非分支以及南美分支。
南亚分支的耳念珠菌包括菌株BJCA001、B1、CBS12766、CBS12767、B11203、B11205、CBS12768、CBS12769、CBS12770、CBS12771、CBS12772、CBS12773、 CBS12774、CBS12775、CBS12776、CBS12777、CBS14918、CBS15108、CBS15109。
东亚分支的耳念珠菌包括菌株CBS12372、CBS12373、CBS10913。
南非分支的耳念珠菌包括菌株A4675、C1921、C1922、RICU1、C2、C3、 C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、 C19、C20、C22、CMU-109、B11222。
南美分支的耳念珠菌包括菌株B11245。
本发明通过研究，发现并明确了以下结论：
多球壳菌素和芬戈莫德对所有测试的49株耳念珠菌都有抑制作用，实验室抑制率达100％。
多球壳菌素和芬戈莫德对耳念珠菌耐药株和多重耐药株都有抑制作用，实验室抑制率达100％。
多球壳菌素和芬戈莫德对耳念珠菌四个分支的菌株都有抑制作用，实验室抑制率达100％。
多球壳菌素和芬戈莫德对耳念珠菌不同形态菌株都有抑制作用，实验室抑制率达100％。
多球壳菌素是通过抑制耳念珠菌中蛋白质翻译和氨基酸合成途径而实现抑制细胞的生长的。
芬戈莫德是通过产生细胞氧化压力ROS，并快速杀死细胞实现来抑制耳念珠细胞生长的。
本发明确定了多球壳菌素和芬戈莫德对耳念珠菌不同分支的临床分离株和不同形态的菌株有高效的抑制能力。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
多球壳菌素和芬戈莫德都能够有效抑制具有多重耐药性耳念珠菌的生长，可以弥补临床一线抗真菌药物不足和普遍耐药的现状。多球壳菌素和芬戈莫德也都曾用于人体其他疾病的治疗，有开发成药物的潜力。
附图说明
图1为耳念珠菌的系统发育分析。49个本发明使用的菌株，还有一个是刚发现的耳念珠菌第五个分支菌株。采用了General Time Reversible(GTR)模型和伽玛分布(GammaDistribution)，以及1000个bootstrap值。中点作为根。
图2为菌株BJCA001和B11245酵母形态、菌丝形态和聚集形态细胞。
图3为Myriocin处理耳念珠菌细胞后的DCFH-DA和PI染色。用Myriocin(10 ug/mL)、两性霉素B、DMSO分别处理大约1*107个耳念珠菌细胞，0.5小时、2 小时和24小时后，用DCFH-DA和PI染色观察。
图4为FTY720处理耳念珠菌细胞后的DCFH-DA和PI染色。用FTY720(10 ug/mL和1ug/mL)分别处理大约1*107个耳念珠菌细胞，0.5小时后，用DCFH-DA 和PI染色观察。
图5为Myriocin抑菌杀菌实验。Before：处理前的细胞数量，FLC：氟康唑处理，CAS：卡泊芬净处理，AMB：两性霉素B处理，DMSO：二甲亚砜处理， ddH2O：双蒸水处理；四个耳念珠菌测试株代表四个分支。采用T-test检测了各处理之间的差异*p<0.05，**p<0.01，*＊*p<0.001。
图6为Myriocin和DMSO处理耳念珠菌细胞整体基因表达谱的比较分析。使用两倍差异截断率和错误发现率(FDRs)小于0.05来定义差异表达基因。
(A)描述差异表达基因的维恩图。(B)选择差异表达基因，表明基因的功能分类。Log2(Myriocin/DMSO)，Log2(读取用Mriocin/DMSO处理的样品计数)。
图7为FTY720抑菌杀菌实验。Before：处理前的细胞数量，FLC：氟康唑处理，CAS：卡泊芬净处理，AMB：两性霉素B处理，DMSO：二甲亚砜处理，ddH2O：双蒸水处理；四个耳念珠菌测试株代表四个分支。采用T-test检测了各处理之间的差异*p<0.05，**p<0.01，＊＊＊p<0.001。
图8为Myriocin、FTY720和四种常用抗真菌药物对临床分离耳念珠菌的最低抑菌浓度检测结果。
具体实施方式
本发明内容均基于实验室测试结果，实施例中的实验方法，如无特别说明，均为报道的微生物学常规操作方法。所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
一、实验部分。
耳念珠菌测试菌
本发明共收集了来自国内外不同医疗机构或菌种保藏中心的49株耳念珠菌临床分离株，用于后续的药敏测试。
耳念珠菌培养
YPD培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)进行培养细胞。酵母细胞和聚集型细胞，在37℃培养2天。菌丝形态细胞，首先在YPD培养基中30℃培养 2天，然后转移到25℃培养5天。
DNA提取
(1)挑取适量菌体于200μL DNA裂解液中，颠倒混匀后，置于70℃水浴锅水浴30分钟。(DNA裂解液配方，称取2.04g醋酸锂固体溶解于适量双蒸水中，再加入10mL 10％十二烷基磺酸钠溶液，定容至100mL)。
(2)加入600μL无水乙醇，颠倒混匀后12000rpm离心1分钟，弃上清。
(3)加入600μL 75％乙醇，重悬沉淀后12000rpm离心1分钟，弃上清。
(4)将空的EP管置于离心机中，12000rpm离心2分钟，用移液枪将残留的液体吸尽。
(5)将空的EP管开盖，在室温下放置2-3分钟使乙醇完全挥发。
(6)加入30μL双蒸水，利用移液枪将沉淀吸打，待其完全溶解后，13000rpm 快速离心10s，得到上清液即为耳念珠菌基因组DNA，可置于-20℃冰箱中保存备用。
注：用此方法提取的耳念珠菌基因组DNA一般用于PCR反应中。在20μL PCR 反应体系中，吸取2μL上清液作为基因组模板加入即可。
ITS PCR扩增及测序
PCR反应体系20μL：rTaq缓冲液2μL，dNTP Mix 2μL，引物ITS1和NL4 各1μL，热裂解法提取耳念珠菌基因组DNA模板2μL，rTaq(酶)0.15μL，双蒸水补足至20μL。其中ITS1引物序列为：5’-GTAGGTGAACCTGCGG’-3’,NL4序列为5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’。
PCR反应程序：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次；72℃最终扩增4分钟；16℃降温5分钟。PCR产物用浓度为1％的琼脂糖凝胶(含有Gel-Red核酸染料)电泳检测，在紫外凝胶成像系统下观察。确认PCR条带大小正确后，将未纯化PCR送生工生物工程(上海)股份有限公司进行二代测序。
系统发育树的构建
49株耳念珠菌ITS序列通过Mafft v7.015b比对后生成比对文件，然后通过 Mega5构建最大似然系统发育树，采用的是General Time Reversible(GTR)模型，伽玛分布(Gamma Distribution)，以及1000个bootstrap自引分析。
最低抑菌浓度检测
最低抑菌浓度检测是根据CLSI M27(第三版)和之前报道实施的。耳念珠菌在 SD培养基(2％葡萄糖，0.67％YNB，氨基酸、尿嘧啶、腺苷酸混合物)中35℃培养24小时后，接种到RPMI1640培养基中(w/v,1.04％RPMI 1640,3.45％MOPs,用氢氧化钠调pH为7.0)。每200ul培养基中接种的细胞数大约是500个，并且加入一定浓度的测试药品。药品的浓度为0.03-256ug/mL。所有测试使用的是96孔细胞培养板，酵母细胞在35℃培养24小时后，用酶标仪测定每个孔的OD600，作为衡量菌浓度的指标。由于耳念珠菌的菌丝形态和聚集形态细胞生长慢于酵母细胞，其培养时间会增加到48小时。克柔念珠菌ATCC 6258作为质量控制菌株。其中所需用到的药物中，Myriocin和FTY720购自APExBIO公司(中国北京)，氟康唑、卡泊芬净、两性霉素B和氟胞嘧啶购自Sigma-Aldrich公司(中国北京)。
ROS和PI染色
本发明研究利用DCFDA-ROS检测试剂盒(Beyotime公司，上海，中国)和核酸染料碘化丙啶(PI)染色分别检测ROS产生情况和细胞死亡情况。收集活化后的 RICU1和CBS12766菌株细胞，分别将其浓度调整至2×107个细胞/mL。加入浓度均为10μg/mL的FTY720或Myriocin各1μL，分别在37℃下培养0.5、2和24 小时，用AMB和DMSO处理的细胞作为对照。收集细胞，用PBS洗涤1次后加入DCFDA探针和PI试剂，37℃暗培养30分钟。通过荧光显微镜(Carl Zeiss Imager A2,Zeiss,Gottingen,Germany)观察荧光信号的产生情况。其中绿色荧光信号表示有 ROS产生，红色荧光信号表示细胞死亡。
杀菌实验
分别选取四个不同遗传分支的耳念珠菌，即CBS12766、CBS10913、RICU1 和B11245菌株进行实验。模拟测定MIC的方法，用血球计数板计数后用RPMI1640 溶液稀释，将各个菌株浓度调整为每100μL中500个cells。
在Before组中加入100μL RPMI1640和100μL菌液。
在Myriocin组中加入2μg/mL的Myriocin(溶于RPMI1640中)100μL和100μL 菌液，其工作浓度为1μg/mL。
在FTY720组中加入2μg/mL的FTY720(溶于RPMI1640中)100μL和100μL 菌液，其工作浓度为1μg/mL。
在DMSO组中加入3.2μL DMSO、96.8μL RPMI1640和100μL菌液。
在AMB组中加入2μg/mL的AMB(溶于RPMI1640中)100μL和100μL菌液，其工作浓度为1μg/mL。
在CAS组中加入10μg/mL的CAS(溶于RPMI1640中)100μL和100μL菌液，其工作浓度为5μg/mL。
在FLU组中加入512μg/mL的FLU(溶于RPMI1640中)100μL和100μL菌液，其工作浓度为128μg/mL。
在ddH2O组中加入3.2μL ddH2O、96.8μL RPMI1640和100μL菌液(加入ddH2O 的量根据FLU组而定)。
其中before组吸打混匀后，吸取100μL混合液体涂布于YPD平板上，设置三个生物学平行。其余组在35℃培养箱中培养24h后，稀释合适的倍数后，吸取100μL 混合液体涂布于YPD平板上，设置三个生物学平行。计数出涂板后的菌落数，并换算成各组涂板前200μL混合液体中的细胞数目。
转录组(RNAseq)分析
耳念珠菌的酵母细胞接种到RPMI 1640培养基(10.4g/L RPMI 1640、34.53g/LMOPS，完全溶解后利用NaOH调节pH至7.0，利用0.22微米滤膜过滤除菌)过夜生长。然后将耳念珠菌细胞重新接种到新鲜的RPMI 1640培养基中，在35℃下生长至OD600＝1.8。然后用Myriocin(工作浓度1mg/L，溶解于DMSO)或等体积的 DMSO在相同温度下处理2小时。收集处理后的细胞，用于总RNA提取和RNA-seq 分析，进行三次生物重复。
RNA-Seq分析利用Illumina NovaSeq平台(由Berry Genomics Co.，北京，中国)构建和测序文库。通过对每个样本进行测序，大约获得了36-60亿(G)reads。使用带有默认参数的HiSat2v2.0.5软件，将clean reads与耳念珠菌转录组(来自NCBI 数据库，登录号:GCA_002759435.2 6)对齐。用DESeq2R package分析差异表达基因。定义差异表达基因的标准有三个:(1)至少一个样本的FPKM值等于或大于20；(2) 平均变化率等于2倍以上的；(3)错误发现率(FDRs)小于等于0.05。
二、研究结果
(1)测定耳念珠菌临床耐药株耐药性
本发明首先测定了所有49株耳念珠菌的氟康唑(FLC)、卡泊芬净(CAS)、两性霉素B(AMB)和氟胞嘧啶(Fluytosine)的最低抑菌浓度，结果如图8以及表1所示。 47株耳念珠菌耐受氟康唑(≥32mg/L)，2株为氟康唑敏感(2mg/L)。有一菌株耳念珠菌B11222卡泊芬净的最低抑菌浓度为16mg/L，表现为卡泊芬净耐药。菌株B11203和B11205的两性霉素B的最低抑菌浓度是4mg/L，表现为两性霉素B 耐药。此外，这两菌株B11203和B11205氟胞嘧啶的最低抑菌浓度为128mg/L，还表现为氟胞嘧啶耐药。总的来说，49株耳念珠菌中，只有2株菌是敏感株，剩余菌株都为临床耐药株。而B11222可以耐受氟康唑和卡泊芬净，B11203、B11205 可以耐受氟康唑、两性霉素B和氟胞嘧啶，是多重耐药株。
(2)确定耳念珠菌遗传进化分支
目前，世界所有发现的耳念珠菌为四个主要进化分支和一个新发现的分支(只有一个临床分离株)。本发明利用ITS PCR及sanger测序，构建了49株耳念珠菌测试菌株的系统发育树图。如图1的系统发育分析所示。
本发明分析的49个耳念珠菌覆盖了目前世界上主要流行的四个耳念珠菌遗传进化分支。
(3)Myriocin和FTY720对耳念珠菌生长的抑制作用
本发明测定了Myriocin和FTY720对49个耳念珠菌临床分离株的抑制作用，结果如图8以及表1所示。Myriocin和FTY720对所有49个耳念珠菌测试株均有抑制作用。Myriocin的最低抑菌浓度在0.03mg/L到0.5mg/L之间，FTY720的最低抑菌浓度在4mg/L到16mg/L之间。
49个耳念珠菌分属于目前世界上主要流行的耳念珠菌四个分支，如图8以及表1所示，Myriocin和FTY720对四个遗传分支的耳念珠菌都有抑制作用。
B11222可以耐受氟康唑和卡泊芬净，B11203、B11205可以耐受氟康唑、两性霉素B和氟胞嘧啶，是多重耐药株，Myriocin和FTY720对包括菌株B11205和 B11222等具有多重耐耳念珠菌同样具有较强的抑制作用。
表1：Myriocin、FTY720和四种常用抗真菌药物对临床分离耳念珠菌的最低抑菌浓度检测
Figure RE-GDA0003020391380000091
Figure RE-GDA0003020391380000101
(4)Myriocin和FTY720对不同形态耳念珠菌的抑制
耳念珠菌可以形成酵母形态、菌丝形态或聚集形态细胞，参考图2，图2为菌株BJCA001和B11245酵母形态、菌丝形态和聚集形态细胞。不同的细胞形态影响着耳念珠菌的毒性和对真菌药物的抗性。因此，本发明检测了两株耳念菌株(BJCA001和B11245)不同细胞形态对Myriocin和FTY720的敏感性。如表2所示， 24小时时，Myriocin对两株耳念珠菌三种细胞类型的最低抑菌浓度≤0.03mg/L， FTY720对两株耳念珠菌三种细胞类型的最低抑菌浓度为4mg/L，由于不同形态细胞生长速度有差异，BJCA001的聚集型细胞和B11245的菌丝型细胞的空白对照也未能长起来。因此又测试了48小时的抑制情况。在48小时时，Myriocin对两株耳念珠菌三种细胞类型的最低抑菌浓度均≤0.25mg/L，FTY720对两株耳念珠菌三种细胞类型的最低抑菌浓度均≤8mg/L，表明Myriocin和FTY720可以抑制目前耳念珠菌已报道的各种形态的细胞的生长。
表2：耳念珠菌不同细胞类型对Myriocin和FTY720的敏感性测试
Figure RE-GDA0003020391380000102
Figure RE-GDA0003020391380000111
(5)Myriocin抑制耳念珠菌机制探索
为了探索Myriocin的抑菌机制，本发明测定了Myriocin处理前后的氧化压力(ROS)，并用PI染色确定细胞是否死亡。
Myriocin处理耳念珠菌细胞后的DCFH-DA和PI染色。用Myriocin(10 ug/mL)、两性霉素B、DMSO分别处理大约1*107个耳念珠菌细胞，0.5小时、2 小时和24小时后，用DCFH-DA和PI染色观察。结果如图3所示，Myriocin、AMB 和DMSO处理CBS12766菌株和RICU1-A1菌株0.5h后，都没有诱导细胞ROS，也没有观察到细胞死亡。Myriocin处理2h后，CBS12766菌株比RICU1-A1菌株先开始产生ROS，并伴随有个别细胞死亡。Myriocin处理后和阴性对照DMSO相比，效果差别不大。Myriocin处理24h后，CBS12766菌株和RICU1-A1菌株都能观察到一些细胞产生ROS并死亡，但和阴性对照DMSO相比差别不大。可见， Myriocin并不是通过诱导耳念珠菌产生ROS并使细胞死亡。
为了进一步验证上述结论，本发明做了如下的杀菌抑菌实验。用Myriocin、 FLC、CAS、AMB、DMSO和双蒸水分别处理4株(分别代表四个主要遗传分株) 耳念珠菌细胞24小时后使用CFU测定活细胞数，
结果如图5所示，图5中，Before：处理前的细胞数量，FLC：氟康唑处理， CAS：卡泊芬净处理，AMB：两性霉素B处理，DMSO：二甲亚砜处理，ddH2O：双蒸水处理；四个耳念珠菌测试株代表四个分支。采用T-test检测了各处理之间的差异*p<0.05，**p<0.01，＊＊＊p<0.001。
结果可以看出，经过Myriocin处理后，RICU1-A1和CBS12766的活细胞数与接种后的细胞数基本保持一致，而CBS10913和B11245的活细胞数分别下降了约 84.8％和40.2％。表明Myriocin对耳念珠菌的主要抑制作用应该是抑菌活性，而不是杀菌活性。菌株CBS10913和B11245在经过Myriocin处理后仍有一部分细胞存活，延长处理时间可导致部分耳念珠菌细胞死亡。
实验结果表明，杀菌的阳性对照药物AMB能杀死99.9％以上的耳念珠菌并对所有菌株都有杀菌活性。相较于AMB，短期使用Myriocin并不能杀死耳念珠菌。而长时间的处理，如24小时，Myriocin无法也杀死clade I和clade III的菌株，在但对clade II和clade IV有一定的杀菌能力。
(6)Myriocin处理后对耳念珠菌整体基因表达谱的影响
为了进一步探索Myriocin的抑菌机制，本发明分别利用Myriocin和二甲亚砜(DMSO)处理CBS12766耳念珠菌细胞，然后进行RNA-Seq和查表达分析。
图6为Myriocin和DMSO处理耳念珠菌细胞整体基因表达谱的比较分析。使用两倍差异截断率和错误发现率(FDRs)小于0.05来定义差异表达基因。(A)描述差异表达基因的维恩图。(B)选择差异表达基因，表明基因的功能分类。 Log2(Myriocin/DMSO)，Log2(读取用Mriocin/DMSO处理的样品计数)。
从图6可以看出，总的来看，Myriocin和DMSO处理后鉴定出385个差异表达基因，Myriocin处理后有217个基因上调，168个基因下调。差异表达基因在翻译、氨基酸代谢、营养物质转运、细胞壁和转录调控等几个生物学方面体现。
首先，在Myriocin处理后的细胞中，大量编码核糖体和翻译相关蛋白质的基因(例如RPL和RPS基因)和氨基酸代谢相关基因(例如LYA和ARO基因，芳香族氨基酸生物合成)被抑制，这表明Myriocin抑制耳念珠菌细胞的代谢活动。其次，在Myriocin处理后的细胞中，许多参与应激或抗真菌反应的基因被上调。例如，常由抗真菌药物诱导或参与白念珠菌耐药的基因(DDR48、GRP2、MDR1和RCT1) 上调。第三，许多细胞膜和细胞壁相关基因表达差异，包括编码营养物质转运体和受体以及GPI蛋白的基因。第四，至少有12个编码转录因子的基因表达差异，有些基因(如BRG1、GAL4和FHL1)可能在不同的生物过程中发挥全局调控作用。总的来看，大量编码核糖体和翻译相关蛋白质的基因被抑制，这势必会导致细胞翻译过程被阻断，因此抑制了细胞的生长。
(7)FTY720抑制耳念珠菌机制探索
为了探索FTY720的抑菌机制，本发明测定了FTY720处理前后的氧化压力 (ROS)，并用PI染色确定细胞是否死亡。
FTY720处理耳念珠菌细胞后的DCFH-DA和PI染色。用FTY720(10ug/mL 和1ug/mL)分别处理大约1*107个耳念珠菌细胞，0.5小时后，用DCFH-DA和 PI染色观察。结果如图4所示，FTY720、AMB和DMSO处理CBS12766菌株和 RICU1-A1菌株0.5h后，可以明显观察FTY720可以快速诱导耳念珠菌产生大量 ROS并使细胞死亡，效果强于阳性对照AMB。在将FTY720药物浓度降低10倍后(1μg/mL)，仍然能观察到该现象。这表明FTY720可以快速诱导耳念珠菌产生大量ROS杀死耳念珠菌细胞。
为了进一步验证上述结论，本发明做了如下的杀菌抑菌实验。用FTY720、FLC、CAS、AMB、DMSO和双蒸水分别处理4株(分别代表四个主要遗传分株)耳念珠菌细胞24小时后使用CFU测定活细胞数，结果如图7所示。图7为FTY720抑菌杀菌实验。Before：处理前的细胞数量，FLC：氟康唑处理，CAS：卡泊芬净处理，AMB：两性霉素B处理，DMSO：二甲亚砜处理，ddH2O：双蒸水处理；四个耳念珠菌测试株代表四个分支。采用T-test检测了各处理之间的差异*p<0.05， **p<0.01，＊＊＊p<0.001。通过图7可看出，经过FTY720处理后，所有菌株没有细胞存活，表明FTY720对耳念珠菌的主要抑制作用的确是杀菌作用。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.多球壳菌素在制备抑制耳念珠菌或治疗耳念珠菌感染的药物上的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多球壳菌素在制备抑制四个分支的耳念珠菌耐药株细胞生长的药物上的应用；
所述四个分支分别是指南亚分支、东亚分支、南非分支以及南美分支，
南亚分支的耳念珠菌包括菌株BJCA001、B1、CBS12766、CBS12767、B11203、B11205、CBS12768、CBS12769、CBS12770、CBS12771、CBS12772、CBS12773、CBS12774、CBS12775、CBS12776、CBS12777、CBS14918、CBS15108、CBS15109，
东亚分支的耳念珠菌包括菌株CBS12372、CBS12373、CBS10913，
南非分支的耳念珠菌包括菌株A4675、C1921、C1922、RICU1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C22、CMU-109、B11222，
南美分支的耳念珠菌包括菌株B11245。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多球壳菌素在制备抑制耳念珠菌不同形态细胞生长的药物上的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多球壳菌素在制备抑制耳念珠菌蛋白质翻译和氨基酸合成途径的药物上的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多球壳菌素的最低抑菌浓度在0.03mg/L到0.5mg/L之间。
6.芬戈莫德在制备抑制耳念珠菌或治疗耳念珠菌感染的药物上的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述芬戈莫德在制备抑制耳念珠菌不同形态细胞生长的药物上的应用。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述芬戈莫德在制备抑制四个分支的耳念珠菌耐药株细胞生长的药物上的应用；
所述四个分支分别是指南亚分支、东亚分支、南非分支以及南美分支，
南亚分支的耳念珠菌包括菌株BJCA001、B1、CBS12766、CBS12767、B11203、B11205、CBS12768、CBS12769、CBS12770、CBS12771、CBS12772、CBS12773、CBS12774、CBS12775、CBS12776、CBS12777、CBS14918、CBS15108、CBS15109，
东亚分支的耳念珠菌包括菌株CBS12372、CBS12373、CBS10913，
南非分支的耳念珠菌包括菌株A4675、C1921、C1922、RICU1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C22、CMU-109、B11222。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述芬戈莫德在制备产生细胞氧化压力ROS，以杀死耳念珠菌细胞的药物上的应用。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述芬戈莫德的最低抑菌浓度在4mg/L到16mg/L之间。
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CN111803476A (zh) * 2020-08-14 2020-10-23 华中科技大学协和深圳医院 芬戈莫德用于抑制革兰阳性细菌活性的用途

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