CN102643891B - 一种检测化学物致癌性和促癌性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测化学物致癌性和促癌性的方法。使用转染HPV16 E6E7基因的Balb/c 3T3细胞，通过细胞转化实验检测化学物的致癌性和促癌性。与传统的II阶段Balb/c 3T3细胞转化实验相比，该方法可使细胞形成更多的转化灶，明显提高实验的敏感性；并可以有效缩短实验时间，节省人力财力投入，降低检测成本；避免使用额外的致癌剂和促癌剂，有助于保护环境和实验人员安全，该方法可用于评价化学物的致癌性和促癌性，还可以从药品、化学品、环境污染物和工业废弃物等中筛查未知致癌物和促癌物，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种检测化学物致癌性和促癌性的方法。
背景技术
体外细胞转化实验是指细胞在致癌物诱导下产生特定的表型改变，主要体现在生长和行为控制能力的变化，如细胞形态的改变、克隆形成模式的紊乱、非锚定依赖性生长能力的获得、自分泌生长因子的产生以及对适合宿主的致瘤性等。
由于Balb/c 3T3细胞转化实验与动物致瘤实验结果具有较高的一致性，因此被国际癌症研究所(IARC)认定为一种有效的评价致癌物的方法，实验终点是细胞形态学的转变和转化灶的形成。该方法的优点是操作简单、实验周期较短、结果稳定可靠、重复性好、排除体内复杂的神经内分泌等因素的干扰、便于在体外直接观察和记录细胞癌变过程，是从细胞生物学水平上研究肿瘤发生与发展的基本技术。
Balb/c 3T3细胞系是Aaronson等在1968年建立的，来源于14-17天的Balb/c小鼠胚胎。最早的实验方案是由Kakunaga于1973年提出的，之后经历了很多改进，如pH、血清、细胞培养方法、接种密度、化学物处理方式、细胞培养时间、细胞对致癌物的应答等。尽管一些优化方案可以增加转化频率，但仍需进一步改进以提高实验敏感性，并将血清等对细胞转化实验结果的影响降至最小。目前国际普遍采用的检测化学物致癌性和促癌性的实验方法是II阶段Balb/c 3T3细胞转化实验，其步骤包括：取对数生长期Balb/c 3T3细胞，以1×104个/瓶接种至培养瓶中，用含10％(V/V)胎牛血清的DMEM培养基培养，24h后加入化学物1，第4天换含2％(V/V)胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养，分别于第7、10、14天加入化学物2，培养4周，每周换液2次，细胞经甲醇固定、Giemsa染色，计数转化灶。在检测化学物致癌性时，加入的化学物2为12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)；在检测化学物促癌性是，加入的化学物1为3-甲基胆蒽(MCA)。该方法存在以下问题：
(1)该实验中细胞在化学物的诱导下形成的转化灶数不多，实验的敏感性不够高；
(2)实验周期较长，人力财力投入较大，检测成本较高；
(3)需要额外使用阳性致癌物MCA和阳性促癌物TPA。
发明内容
本发明的目的是提供了一种敏感的检测化学物致癌性和促癌性的体外细胞转化实验方法，解决了细胞形成的转化灶数不多，实验的敏感性不高，实验周期较长以及需要额外使用阳性致癌物和阳性促癌物等问题。
为达到此目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测化学物致癌性和促癌性的体外细胞转化实验方法，包括以下步骤：
(1)将转染HPV16 E6E7基因的Balb/c 3T3细胞以1×103-1×105个/瓶接种于细胞培养瓶，加入含有10％(V/V)胎牛血清、100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素与1％(V/V)谷氨酰胺的DMEM培养基，在37℃，5％(V/V)CO2孵箱中培养24h；
(2)将培养24h后的时间点记为第1天的起始点，在第1-21天加入含有化学物的DMEM培养基或DMEM/F12(1∶1)培养基，培养3周，细胞会表现出致密多层、丧失接触抑制、排列紊乱的生长特性，形成明显的肉眼可见的转化灶，转化灶边缘的细胞可自由定向生长并向周围单层细胞侵袭生长，根据细胞形成转化灶的个数，来判断化学物是否具有致癌性和促癌性。
上述步骤(2)中所述的DMEM培养基或DMEM/F12(1∶1)培养基中含有1-10％(V/V)胎牛血清。
进一步，DMEM/F12(1∶1)培养基中还含有50-500μg/ml牛胰岛素、50-500μg/ml人转铁蛋白、5-50μg/ml乙醇胺、5-100ng/ml亚硒酸钠。
本发明使用转染HPV16 E6E7基因的Balb/c 3T3细胞，通过细胞转化实验检测化学物的致癌性和促癌性，与传统的II阶段Balb/c 3T3细胞转化实验相比，该方法可使细胞形成更多的转化灶，明显提高实验的敏感性；可以有效缩短实验时间，节省人力财力投入，降低检测成本；避免使用额外的致癌剂和促癌剂，有助于保护环境和实验人员安全，该方法可用于评价化学物的致癌性和促癌性，还可以从药品、化学品、环境污染物和工业废弃物等中筛查未知致癌物和促癌物，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为细胞形成转化灶的形态显微图。转化细胞表现出嗜碱深染、致密多层、丧失接触抑制、排列紊乱、转化灶边缘的细胞自由定向生长、向周围单层细胞侵袭生长等特性。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明所使用的转染HPV16 E6E7基因的Balb/c 3T3细胞的优选实施例进行详细描述，其构建方法为：
(1)大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
从37℃培养16-20h的新鲜平板上挑取DH5α单菌落，接种于5ml不含抗菌素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养12-16h。从上述培养物中按1∶100(V/V)接种于50ml LB培养基中继续培养至菌液OD600值为0.4-0.6时，将细菌转移到无菌、用冰预冷的50ml离心管中，冰浴30min。于4℃下4000rpm离心10min，弃上清，将离心管倒置1min，使残留培养液流尽，以10ml用冰预冷的100mmol/L CaCl2溶液重悬细菌沉淀，冰浴30min。于4℃下4000rpm离心10min，弃上清，每50ml初始培养物用2ml预冷的含15％(V/V)甘油的100mmol/L CaCl2溶液重悬细菌沉淀，分装成100μl每管，-80℃保存备用。
(2)质粒的转化
自冰箱中取出感态受大肠杆菌，插入湿冰中溶解20分钟；加入1μl含HPV16全基因组的质粒，轻轻旋转混匀，冰浴30分钟；于42℃水浴中热休克大肠杆菌90秒，迅速移入湿冰中，静置2分钟；加入800μl已37℃预热的无抗生素LB培养液，置于37℃恒温箱摇床150-160rpm温育1h；取50μl已转化的感受态细胞涂于含100μg/ml氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，将平板置于室温至待干燥后，倒置于37℃的培养箱中220rpm过夜培养12-16小时，检查各培养皿中是否出现菌落。
(3)质粒的小量制备
以1∶1000(V/V)的比例在LB培养液中加入氨苄青霉素溶液，挑选琼脂平板上的单菌落接种到5ml培养基中，37℃摇床220rpm培养过夜，培养时间不能超过16h；将培养物分装在两个1.5ml离心管中，13000rpm离心1min，弃上清，将管口倒置在纸巾上，管壁上不应有残留上清；加入4℃预冷的250μl P1溶液(含50mmol/LGlucose、25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、10mmol/L EDTA(pH8.0)，使用前需加入RNaseA)，剧烈振荡，充分悬浮细菌沉淀；加入250μl新鲜配制的P2溶液(含0.2mol/L NaOH、1％(V/V)SDS)，温和混匀，冰浴3min，至液体清亮；加入4℃预冷的350μl N3溶液(含5mmol/LKAc 60ml、11.5％(V/V)冰乙酸、28.5％(V/V)ddH2O)，温和混匀，冰浴10min，13000rpm离心10min；小心吸取上清，将上清转移至另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇室温沉淀30min，13000rpm离心10min；弃上清，沉淀用70％乙醇洗一次，室温晾干；用30μl含100μg/ml RNaseA的TE(pH 8.0)溶解沉淀，37℃水浴30-60min；用紫外分光光度计测定OD260及OD280，计算核酸纯度及核酸含量。
(4)HPV16E6E7基因扩增：
根据HPV16全基因组序列，用Oligo 7引物分析软件辅助设计，使用引物F(包含BamH I酶切位点和Kozak序列)和R(包含EcoR I酶切位点)扩增E6E7基因，引物序列如下：
F：cgggatcc GCCACC ATGCACCAAAAGAGAACTG
R：ccggaattc TTATGGTTTCTGAGAACAGATG
PCR反应体系包含：10×扩增缓冲液5μl、dNTP(2.5mM each)5μl、上游引物F(20μM)1μl、下游引物R(20μM)1μl、EX Taq酶0.3μl、含HPV16全基因组的质粒2μl、ddH2O 35.7μl，总体积50μl，PCR扩增程序为：95℃初始变性5min(1 cycle)；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s(30 cycles)；72℃最终延伸10min(1cycle)。
(5)DNA琼脂糖凝胶电泳
将洗净、干燥的制胶板水平放置在工作台上，插入梳子；配置1.2％的琼脂糖，微波炉加热使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至50℃左右；以1∶10(V/V)的比例加入goodview染液，混匀，灌胶；待凝胶凝固后，小心拔去梳子；将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液；上样，110V电泳30min。
(6)PCR产物凝胶回收
采用凝胶回收试剂盒(MinElute Gel Extraction Kit，购自QIAGEN公司)对PCR产物进行凝胶回收。切下含目的条带的凝胶，称其质量，加入3倍体积QG Buffer溶解凝胶；50℃孵育10min，摇晃混匀，直至完全溶解；混合物颜色应为黄色(pH＞7.5)。若为橙色或紫色，则需加入10μl 3mol/L NaAC，颜色则变为黄色；加入1倍体积异丙醇沉淀DNA，翻转混匀，静止5min；吸取混合物至Silica柱上，13000rpm离心1min；吸下管液体至柱子上，13000rpm离心1min，弃下管滤液；加入500μl QG Buffer使DNA结合于Silica柱，13000rpm离心1min，弃下管滤液；加入750μl PE Buffer，13000rpm离心1min，弃下管滤液，13000rpm离心2min；换新离心管，加入10μl已50℃预热的EB Buffer至Silica柱上，13000rpm离心3min，洗脱DNA。
(7)HPV E6E7基因的连接和转化
将回收纯化的HPV E6E7基因片段与pMD19-T载体混合，加入T4DNA连接酶和连接酶缓冲液，补充ddH2O至10μl，4℃连接过夜，取连接反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，放入37℃恒温箱摇床，150-160rpm摇晃培养1h。在已涂含100μg/ml氨卞青霉素的LB琼脂平板皿中央滴加40μl X-gal和4μl IPTG，用涂布器涂均匀，37℃温育直至液体全部消失。取50μl菌液涂板，剩余150μl涂于另一个板中，待干燥后，倒置，存放于37℃的培养箱中过夜培养12-16h，检查各培养皿中是否出现菌落，重组质粒呈白斑，野生型呈蓝斑。
(8)阳性克隆的筛选及鉴定
使用菌落PCR法初步鉴定阳性克隆。在接种转化产物的LB琼脂平板上随机选取几个白色菌落和几个蓝色菌落，使用高压灭菌的牙签挑取一部分菌落，在配制好的25μl PCR反应液中轻轻搅拌几下后进行PCR反应，循环25次，取9μl做凝胶DNA电泳，观察是否插入基因片段，若有大小相同的目的条带，则说明对应菌落为阳性克隆。
(9)阳性克隆测序、提取、内切酶分析
对初步鉴定为阳性克隆的菌体进行DNA测序。从测序正确的菌液中提取质粒，对质粒和pcDNA3.1目的载体进行BamH I和EcoR I双酶切。
酶切反应体系为：内切酶缓冲液5μl、10×BSA 5μl、BamH I 2.5μl、EcoR I 2.5μl、质粒10μl、ddH2O 25μl，总体积50μl，所有操作均在冰上进行，混合均匀，于37℃恒温水浴锅中保温3小时，进行限制性核酸内切酶酶切反应。
(10)DNA琼脂糖凝胶电泳及酶切产物回收纯化
取未酶切的质粒与酶切反应液进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切反应结果，使用凝胶成像仪拍照。对酶切产物进行回收纯化。
(11)HPV16 E6E7基因与pcDNA3.1载体的连接
将回收纯化的HPV16 E6E7基因片段与pcDNA3.1载体片段混合，加入T4 DNA连接酶和连接酶缓冲液，补充ddH2O至10μl，4℃连接过夜。
(12)重组质粒的转化
将HPV16 E6E7基因与pcDNA3.1目的载体连接后的重组质粒，转化DH5α感受态细胞。使用酶切鉴定法初步检定阳性克隆：从LB琼脂平板上挑取若干个菌落，接种到5ml含100μg/ml氨卞青霉素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜，进行质粒提取，然后用BamH I和EcoR I对质粒进行酶切鉴定，含有插入基因片段的对应菌落为阳性克隆。对阳性克隆后进行测序，构建重组质粒pcDNAE6E7。
(13)重组质粒的提取与纯化
用质粒提取试剂盒(QIAprep Spin Miniprep Kit，购自QIAGEN公司)制备、纯化pcDNAE6E7重组质粒。将测序正确的菌液接种至5mlLB培养基中，37℃220rpm培养过夜，培养时间不能超过16h；将培养物分在两个1.5ml离心管中，13000rpm离心1min，弃上清，将管口倒置在纸巾上，管壁上不应有残留上清；加入4℃预冷的P1溶液250μl，剧烈振荡，充分悬浮细菌沉淀。悬浮需充分，对光观察，不应留有小的菌块，否则会影响菌体的裂解；加入250μl P2溶液，温和混匀，避免剧烈震荡，否则将导致基因组DNA的污染。放置1-2min，待溶液有粘性，有些澄清为止，此时溶液应为均一的蓝色；加入350μl N3溶液，温和混匀，直至沉淀由疏松状态变为相对紧密，体积明显缩小为止，此时溶液由蓝色变为无色，13000rpm离心10min。若离心后凝结块未沉淀沉淀到管底部，应再次翻转混合数次，12000rpm离心3min；将上清加入Silica柱中，13000rpm离心1min；弃下管滤液，加入750μl PE溶液，13000rpm离心1min，重复一次；弃滤液，13000rpm离心2min；换新离心管，在柱中央加入60μl EB溶液，室温静置1min，13000rpm离心1m，洗脱质粒DNA；用紫外分光光度计测定260nm及280nm的OD值，计算核酸纯度及核酸含量，调整质粒浓度为0.1-2.0μg/ml，贮存于-20℃备用。
(14)pcDNAE6E7重组质粒转染Balb/c 3T3细胞
将生长状态良好，健康无污染，处于对数生长期呈亚汇合状态的Balb/c 3T3细胞使用胰蛋白酶液进行消化，用含10％(V/V)FBS不含任何抗生素的DMEM培养液中和，制成单细胞悬液，以1.6×105个/孔接种于6孔板；取2μg质粒加入到100μl无血清培养基OPIT-MEM中，加入已在室温放置1h左右的FuGENE HD转染试剂6μl，轻轻混匀，室温放置20min；将上述试剂加入6孔板中，轻轻晃动2-5次，充分混匀，于孵箱中培养48h。
(15)阳性细胞克隆的筛选及初步培养
待转染HPV16 E6E7基因的Balb/c 3T3细胞达亚汇合状态时传代，加入含400μg/ml G418的培养基培养3周，每隔两天换液，之后更换为含200μg/ml G418的细胞培养液培养一周，此时可见抗性细胞克隆形成，显微镜下观察细胞克隆生长情况，并标记其位置；每组各挑取20个细胞克隆，吸弃细胞培养液，Versen液清洗细胞两次，将克隆环轻轻罩在细胞克隆上面，吸取10μl胰蛋白酶消化液消化，加入20μl细胞培养液，轻轻吹打细胞，转移到24孔板中，用含200μg/mlG418的细胞培养液进行扩大培养，收获细胞，提取细胞蛋白，经western blot检测该细胞可有效表达HPV16 E6E7蛋白，此时获得可稳定表达HPV16 E6E7基因的Balb/c 3T3细胞。
在优选实施例1-6和对照实施例1-6中，所使用的培养基A为DMEM培养基，其中含有10％(V/V)胎牛血清、100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素、1％(V/V)谷氨酰胺；培养基B为DMEM培养基，其中含有5％(V/V)胎牛血清、100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素、1％(V/V)谷氨酰胺；培养基C为DMEM/F12(1∶1)培养基，其中含2％(V/V)胎牛血清、50μg/ml链霉素、50U/ml青霉素、0.6％(V/V)谷氨酰胺、200μg/ml牛胰岛素、200μg/ml人转铁蛋白、12.2μg/ml乙醇胺0.034μg/ml亚硒酸钠。
优选实施例1：本发明的检测苯并[a]芘(B[a]P)致癌性的方法
取对数生长期的转染HPV16 E6E7基因的Balb/c 3T3细胞，以1×104个/瓶接种，用培养基A培养24h后，于第1天换成含1μg/mlB[a]P的培养基B，第4、9、14天换成培养基B，共培养3周。
对照实施例1：传统的检测B[a]P致癌性的方法
取对数生长期的Balb/c 3T3细胞，以1×104个/瓶接种，用培养基A培养24h后，于第1天换成含1μg/ml B[a]P的培养基A，第4天换成培养基C，第7、10、14天换成含0.1μg/ml TPA的培养基C，第17、21、24天换成培养基C，共培养4周。
按照上述两种细胞转化实验方法，每组做8个平行实验，细胞经甲醇固定、Giemsa染色，计数转化灶，传统的检测B[a]P致癌性的II阶段Balb/c 3T3细胞转化实验可形成3.0±0.9个转化灶，本发明方法可形成更多的转化灶，为9.0±1.6个(P＜0.01)，明显提高实验的敏感性，并有效缩短实验时间。
优选实施例2：本发明的检测苯并[a]蒽(B[a]A)致癌性的方法
取对数生长期的转染HPV16 E6E7基因的Balb/c 3T3细胞，以1×104个/瓶接种，用培养基A培养24h后，于第1天换成含10μg/mlB[a]A的培养基B，第4、9、14天换成培养基B，共培养3周。
对照实施例2：传统的检测B[a]A致癌性的方法
取对数生长期的Balb/c 3T3细胞，以1×104个/瓶接种，用培养基A培养24h后，于第1天换成含10μg/ml B[a]A的培养基A，第4天换成培养基C，第7、10、14天换成含0.1μg/ml TPA的培养基C，第17、21、24天换成培养基C，共培养4周。
按照上述两种细胞转化实验方法，每组做8个平行实验，细胞经甲醇固定、Giemsa染色，计数转化灶，传统的检测B[a]A致癌性的II阶段Balb/c 3T3细胞转化实验可形成2.9±0.8个转化灶，本发明方法可形成更多的转化灶，为13.0±2.0个(P＜0.01)，明显提高实验的敏感性，并有效缩短实验时间。
优选实施例3：本发明的检测二苯并[a，h]蒽(DB[ah]A)致癌性的方法
取对数生长期的转染HPV16 E6E7基因的Balb/c 3T3细胞，以1×104个/瓶接种，用培养基A培养24h后，于第1天换成含3μg/mlDB[ah]A的培养基B，第4、9、14天换成培养基B，共培养3周。
对照实施例3：传统的检测DB[ah]A致癌性的方法
取对数生长期的Balb/c 3T3细胞，以1×104个/瓶接种，用培养基A培养24h后，于第1天换成含3μg/ml DB[ah]A的培养基A，第4天换成培养基C，第7、10、14天换成含0.1μg/ml TPA的培养基C，第17、21、24天换成培养基C，共培养4周。
按照上述两种细胞转化实验方法，每组做8个平行实验，细胞经甲醇固定、Giemsa染色，计数转化灶，传统的检测DB[ah]A致癌性的II阶段Balb/c 3T3细胞转化实验可形成3.3±1.0个转化灶，本发明方法可形成更多的转化灶，为12.9±1.7个(P＜0.01)，明显提高实验的敏感性，并有效缩短实验时间。
优选实施例4：本发明的检测12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)促癌性的方法
取对数生长期的转染HPV16 E6E7基因的Balb/c 3T3细胞，以1×104个/瓶接种，用培养基A培养24h后，于第1天换成培养基B，第4、9天换成含0.1μg/ml TPA的培养基C，第14天换为培养基C，共培养3周。
对照实施例4：传统的检测TPA促癌性的方法
取对数生长期的Balb/c 3T3细胞，以1×104个/瓶接种，用培养基A培养24h后，于第1天换成含0.2μg/ml MCA的培养基A，第4天换培养基C培养，第7、10、14天换成含0.1μg/ml TPA的培养基C，第17、21、24天换成培养基C，共培养4周。
按照上述两种细胞转化实验方法，每组做8个平行实验，细胞经甲醇固定、Giemsa染色，计数转化灶，传统的检测TPA促癌性的II阶段Balb/c 3T3细胞转化实验可形成2.8±1.0个转化灶，本发明方法可形成更多的转化灶，为12.4±2.4个(P＜0.01)，明显提高实验的敏感性，并有效缩短实验时间。
优选实施例5：本发明的检测苯并[a]蒽(B[a]A)促癌性的方法
取对数生长期的转染HPV16 E6E7基因的Balb/c 3T3细胞，以1×104个/瓶接种，用培养基A培养24h后，于第1天换成培养基B，第4、9天换成含10μg/ml B[a]A的培养基C，第14天换为培养基C，共培养3周。
对照实施例5：传统的检测B[a]A促癌性的方法
取对数生长期的Balb/c 3T3细胞，以1×104个/瓶接种，用培养基A培养24h后，于第1天换成含0.2μg/ml MCA的培养基A，第4天换培养基C培养，第7、10、14天换成含10μg/ml B[a]A的培养基C，第17、21、24天换成培养基C，共培养4周。
按照上述两种细胞转化实验方法，每组做8个平行实验，细胞经甲醇固定、Giemsa染色，计数转化灶，传统的检测B[a]A促癌性的II阶段Balb/c 3T3细胞转化实验可形成2.7±0.7个转化灶，本发明方法可形成更多的转化灶，为11.3±1.9个(P＜0.01)，明显提高实验的敏感性，并有效缩短实验时间。
优选实施例6：本发明的检测苯并[ghi]苝(B[ghi]P)促癌性的方法
取对数生长期的转染HPV16 E6E7基因的Balb/c 3T3细胞，以1×104个/瓶接种，用培养基A培养24h后，于第1天换成培养基B，第4、9天换成含10μg/ml B[ghi]P的培养基C，第14天换为培养基C，共培养3周。
对照实施例6：传统的检测B[ghi]P促癌性的方法
取对数生长期的Balb/c 3T3细胞，以1×104个/瓶接种，用培养基A培养24h后，于第1天换成含0.2μg/ml MCA的培养基A，第4天换培养基C培养，第7、10、14天换成含10μg/ml B[ghi]P的培养基C，第17、21、24天换成培养基C，共培养4周。
按照上述两种细胞转化实验方法，每组做8个平行实验，细胞经甲醇固定、Giemsa染色，计数转化灶，传统的检测B[ghi]P促癌性的II阶段Balb/c 3T3细胞转化实验可形成2.2±1.1个转化灶，本发明方法可形成更多的转化灶，为11.5±2.1个(P＜0.01)，明显提高实验的敏感性，并有效缩短实验时间。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (3)
1.一种检测化学物致癌性和促癌性的方法，包括以下步骤：
（1）将转染HPV16 E6E7基因的Balb/c 3T3细胞以1×103-1×105个/瓶接种于细胞培养瓶，加入含有10%V/V胎牛血清、100 μg/ml链霉素、100 U/ml青霉素与1%V/V谷氨酰胺的DMEM培养基，在37℃，5%V/V CO2孵箱中培养24 h；
（2）将培养24 h后的时间点记为第1天的起始点，在第1-21天加入含有化学物的DMEM培养基或DMEM/F12按照1:1混合而成的培养基，培养3周，细胞会表现出致密多层、丧失接触抑制、排列紊乱的生长特性，形成明显的肉眼可见的转化灶，转化灶边缘的细胞可自由定向生长并向周围单层细胞侵袭生长，根据细胞形成转化灶的个数判断化学物是否具有致癌性和促癌性。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的DMEM培养基或DMEM/F12按照1:1混合而成的培养基中含有1-10%V/V胎牛血清。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：DMEM/F12按照1:1混合而成的培养基中还含有50-500 μg/ml牛胰岛素、50-500 μg/ml人转铁蛋白、5-50 μg/ml乙醇胺、5-100 ng/ml亚硒酸钠。
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| Combined oral carcinogenicity of HPV-16 and benzo(a)pyrene: an in vitro multistep carcinogenesis model;Park NH;《Oncogene》;19951231;第10卷(第11期);2145-2153 * |
| Park NH.Combined oral carcinogenicity of HPV-16 and benzo(a)pyrene: an in vitro multistep carcinogenesis model.《Oncogene》.1995,第10卷(第11期),2145-2153. |
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