CN109453366A

CN109453366A - 一种抗肿瘤蛋白质的制备方法及用途

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Publication number: CN109453366A
Application number: CN201811356093.6A
Authority: CN
Inventors: 程洋; 付海田; 石晓丹; 玄英花; 张馨心; 楚瑞林
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-11-14
Filing date: 2018-11-14
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2038-11-14
Also published as: CN109453366B

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤蛋白质的制备方法及用途，属于生物医药技术领域。本发明首次筛选并验证了SWQ ID NO.1所示蛋白在抗肿瘤方面的应用，CCK8增值实验结果显示PvEXP100蛋白可显著抑制肝癌细胞HepG2细胞的增殖，抑制率高达80.1％，几乎完全抑制HepG2细胞的迁移性能。本发明的PvEXP100蛋白可作为活性成分或原料制备抗肿瘤药物，具有广阔的应用前景。

Description

一种抗肿瘤蛋白质的制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤蛋白质的制备方法及用途，属于生物医药技术领域。

背景技术

疟疾是伴随人类出现最早的疾病，至今仍是全球范围内最重要的感染性疾病之一。目前关于疟疾的研究大多数集中在不同种属疟原虫入侵机制和疟疾疫苗的研发，而对疟原虫的药用价值或潜在的临床应用价值研究较少。有临床数据表明肿瘤患者感染疟原虫后，患者体内的肿瘤生长受到抑制，揭示疟原虫在临床肿瘤治疗的应用可能性。疟原虫主要通过虫体表面或内部携带的蛋白与肝细胞或红细胞表面受体结合后侵入到机体内，但由于从疟原虫裂殖子提取蛋白困难巨大，难以高效获得。

发明内容

一种PvEXP100蛋白质在制备抗肿瘤药物方面的应用；所述PvEXP100蛋白质含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括但不限于制备抗肺癌、肝癌的药物。

在本发明的一种实施方式中，所述药物包括但不限于疫苗、抑制剂、免疫调节剂。

本发明的第二个目的是提供一种制备所述PvEXP100蛋白质的方法，包括以下步骤：

1)扩增编码所述PvEXP100蛋白质的基因，将扩增的目的基因连接到表达载体上，得到重组质粒；

2)将成功表达目的基因的重组质粒转化到表达细胞中，诱导目的蛋白的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：

1)设计引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示引物，扩增目的基因，将扩增的目的基因连接到表达载体上；

2)将目的基因测序正确的重组质粒转化到表达细胞中，通过IPTG诱导目的蛋白的表达，并进一步制备纯化的目的蛋白样品。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体可以为原核细胞表达载体、真核细胞表达载体或昆虫细胞表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述的表达细胞可以为原核表达细胞、真核表达细胞或昆虫细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pET28a(+)，所述表达细胞为E.coliBL21(DE3)。

本发明的第三个目的是提供一种抗肿瘤的药物，其含有PvEXP100蛋白质或其活性物质，及药学上可接受的载体。

本发明还要求保护所述PvEXP100蛋白质在制备非医药用途的产品方面的应用。

有益效果：申请人对间日疟原虫蛋白进行分析筛选，发现PvEXP100是一个输出蛋白，其位于裂殖子膜表面，本发明首次筛选并验证了PvEXP100蛋白在抗肿瘤方面的应用，CCK8增值实验结果显示PvEXP100蛋白可显著抑制肝癌细胞HepG2细胞的增殖，抑制率高达80.1％，几乎完全抑制HepG2细胞的迁移性能。本发明的另外一个目的是提供本发明所制备的蛋白PvEXP100在制备抗肿瘤药物中的应用，即以本发明的PvEXP100蛋白为活性成分或原料的抗肿瘤药物，特别是肺癌、肝癌、前列腺癌。

附图说明

图1为PvEXP100蛋白考马斯亮蓝染色示意图(A)和Western blotting检测图(B)，

图2为CCK8法检测PvEXP100对HepG2细胞的增殖抑制效果；

图3为Transwell小室迁移法检测检测PvEXP100对HepG2细胞的迁移抑制效果。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例1PvEXP100重组质粒的构建

原核表达质粒Pet28a(+)、宿主菌BL21(DE3)及诱导用的IPTG均购自北京全式金生物科技有限公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶、pfu DNA聚合酶、dNTP均购自TakaRa公司。引物的合成和核苷酸序列测序均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。琼脂糖亲和介质镍柱(Ni)购自QIAGEN公司；His-Taq标签抗体购自Cell Signaling Technology公司。

设计引物通过PCR获取间日疟原虫PvEXP100蛋白的基因序列，引物如下：SEQ IDNO.3：GGATCCATGTTCTGGAAAGTAAAGGGG；SEQ ID NO.4：CTCGAGCAAAAGAAGGGCAACCATCAG，其中GGATCC为SEQ ID NO.3的酶切位点BamHⅠ；CTCGAG为SEQ ID NO.4的酶切位点XhoⅠ。

以卵形疟原虫基因组为模板，通过PCR扩增获得PvEXP100基因序列，扩增程序：94℃预变性3min，94℃变性10s、50℃退火30s、72℃延伸90s，循环35次，最后72℃延伸10min。

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测目的基因扩增条带，然后经过胶回收后，用BamHⅠ及XhoⅠ限制性内切酶对PCR产物及pET28a(+)37℃酶切2h，通过T4连接酶将目的基因过夜连接到原核表达载体pET28a(+)。

将连接的重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞：从-80℃取出E.coli DH5α细胞。立即放置于冰上,取连接的产物4μL加入到50μl感受态细胞中，混匀冰浴30min，42℃热激90后取出置于冰浴中2min。在管中加入无抗性的LB培养基1ml，放入37℃摇床中250rpm振荡培养1h。离心后取100μl培养基将菌体重悬，涂匀在含卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上置于37℃孵箱中倒置培养过夜后观察菌落生长情况。挑取单克隆，提取质粒后进行测序。测序结果显示，目的基因序列正确。

实施例2重组蛋白PvEXP100的表达

将测序正确的阳性单克隆接种5ml含卡那霉素的LB培养基，37℃培养过夜，将菌液接种于新鲜500ml含卡那霉素的LB培养基中，当OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入1mmol/L IPTG，诱导8h。取诱导的PvEXP100进行超声破碎裂解，经10％SDS-PAGE电泳分析表明PvEXP100蛋白主要定位于包涵体中，分子量大小与预期相符。

通过8M尿素溶解包涵体释放PvEXP100蛋白，该蛋白在碳末端带有His-tag标签，因此采用GE公司的His-tag镍柱，按试剂盒说明书进行Ni²⁺亲和色谱纯化。用不同浓度的咪唑将蛋白提纯，咪唑的浓度分别为20mM、50mM、100mM、150mM和250mM，150mM咪唑洗下的蛋白经12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色验证分析。并进一步用Western Blot分析目的蛋白纯度。

考马斯亮蓝染色结果显示所得纯化产物为目的蛋白，分子量大小与预期相符(图1A)。Western Blot结果显示所表达蛋白的纯度较高、特异性强(图1B)。

实施例3PvEXP100蛋白抗肿瘤活性鉴定

(1)CCK8法检测PvEXP100对肿瘤细胞增殖性能的抑制作用

取对数期HepG2用含有10％FBS的DMEM培养基调整细胞浓度为5×10⁴/mL，以每孔100μL接种于96孔板，置5％CO₂，37℃培养箱中培养6h，待细胞贴壁后弃上清，PBS缓冲液清洗除去未贴壁细胞。样品组分别加入100μL不同浓度(10，50，100μg/mL)的药物，空白组加入等体积培养基。继续培养24h后，每孔加入10μLCCK8溶液，继续置培养箱中培养2h后，450nm处测定吸光值。以剂量为25μg/mL抗肿瘤药物5-Fu为对照。细胞增殖率(％)＝实验组A450/对照组A450×100。

结果如图2所示，随着蛋白浓度的升高，PvEXP100蛋白对HepG2细胞增殖的抑制作用逐渐上升。当浓度为100μg/mL，该蛋白对该肿瘤细胞抑制率达到约80.1％，高于剂量为25μg/mL抗肿瘤药物5-Fu对肿瘤细胞的抑制效果(67.2％)。

(2)Transwell迁移法检测PvEXP100对肿瘤细胞迁移性能的抑制作用

PvEXP100对HEPG2迁移的影响用transwell迁移法进行测定，步骤如下：24孔板各孔中加入0.6mL含有不同PvEXP100样品的DMEM培养基(含有10％FBS)；HEPG2用1％FBS的DMEM培养基调整细胞浓度为5×10⁵/mL，取0.1mL接种于transwell小室中，然后将小室移至含有样品的培养基的孔上方，放置过程及培养过程中防止接触面气泡的产生。孵育24h后，取出transwell小室，弃除上清，用棉签擦拭小室上室内壁细胞，并用PBS漂洗去除细胞碎片后，将小室置于用PBS配置的90％乙醇溶液中固定10min。风干后的小室置于用0.1％结晶紫溶液中染色30min，其中结晶紫母液为甲醇配制的0.5％溶液，临用前用生理盐水或PBS稀释。染色结束后，用PBS漂洗数次去除多余染料，显微镜下拍照记录细胞迁移情况。

结果如图3所示，实验组迁移至下室的肿瘤细胞数量逐渐减少，通过对各组细胞个数的统计发现，PvEXP100蛋白对HepG2细胞迁移性能的抑制率基本达到100％，与剂量为25μg/mL的抗肿瘤药物5-Fu作用相当。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种抗肿瘤蛋白质的制备方法及用途

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 936

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Phe Trp Lys Val Lys Gly Arg Ala Phe Ala Phe Val Phe Leu Ser

1 5 10 15

Tyr Ala Ser Phe Val His Ser Asp Lys Ala Val Asn Leu Gly Asn Ala

20 25 30

Leu Ala Gly Gly Ile Ser Gly Gly Ile Ser Gly Gly Ile Ser Gly Gly

35 40 45

Leu Ser Ser Gly Leu Ala Ser Gly Ile Ser Gly Gly Leu Ser Asn Ser

50 55 60

Ala Ala Ala Ser Thr Ala Leu Leu His Ala Ala Val Gly Lys Gly Pro

65 70 75 80

Asn Met His Thr Cys Gln Ser Ala Gly Cys Ala Ser Tyr Lys Ser Ile

85 90 95

Thr Pro Ser Asp Ala Gly Asp Cys Leu Asn Gly Phe Ile Cys Lys Glu

100 105 110

Cys Lys Arg Thr His Ala Lys Asn Pro Asn Ile Cys Phe Tyr Ser Ser

115 120 125

Leu Gln Gly Phe Glu Ser Leu Tyr Glu Ala His Leu Glu Asp Phe Thr

130 135 140

Gln Pro Thr Pro Tyr Asp Arg Phe Asn Val Pro Leu Val Lys Ser Ser

145 150 155 160

Lys Gly Glu Asn Asn Arg Gly Asp Ala Ser Ser Asp Ser Gly Arg Glu

165 170 175

Val Ser Pro Asn Asp Glu Ser Gly Asp His Arg Arg Gly Ser Leu Ser

180 185 190

Gln Gly Gly Asp Asp Asp Gly Glu Lys Gly Asp Leu Gln Arg Ser Gly

195 200 205

Arg Asp Gly Lys Ala Gly Gly Ser Arg Phe Pro Arg Ala Leu Glu Glu

210 215 220

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Ser Ala

225 230 235 240

Lys Glu Lys Arg Gly Gly His Lys Gly Gly Asn Ser Pro Gln Gly Gly

245 250 255

Asn Asn Gly Gly Asn Asn Phe Asp Ala Gly Tyr Glu Thr Glu Ser Phe

260 265 270

Leu Gln Lys Ser Pro Asp His Val His Arg Lys Gly Asp Leu His Lys

275 280 285

Leu Ala Lys Glu Gly Gly Arg Glu Gln His Thr Asn Ala His Met His

290 295 300

Ile His Thr His Met His Thr His Thr His Asn Glu Leu Met Ser Gly

305 310 315 320

Lys Glu Gly Leu Leu Ser Ser Val Glu Thr His Val Arg Leu Gly Ile

325 330 335

Ser Glu Gly Gly Tyr Asn Arg Gly Ala Ser Glu Ser Pro Gly Arg His

340 345 350

Ser Gly Val Ser Ser Gly Ala Ser Val Ser Met Gly Thr Ala Ala His

355 360 365

Gly Gly Thr Ala Ala Glu Ser Gly Tyr Ser Phe Ala Glu Ser Glu Arg

370 375 380

Gly Lys Glu Lys Ile Val Tyr Lys Arg Leu Lys Ile Ser Leu Asn Asn

385 390 395 400

His Glu Glu Tyr Phe Lys Ser Lys Met Asn Lys Cys His Val Gly Gly

405 410 415

Asp Gly Val Ala Thr Leu Tyr Val Lys Val Leu Leu Gln Ile Val Lys

420 425 430

Asp Lys Asn Asp Val Tyr Val Asp Val Ser Arg Arg Ser Gly Ser Ser

435 440 445

His Met Ser Pro Gly Ser Gly Gly Gln Lys Gly Lys Glu Gly Lys Lys

450 455 460

Ala Asn Gly Arg Ser Glu Ser Gly Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp

465 470 475 480

Ala Glu Glu Ser Asp Asp Asp Glu Tyr Met Arg Lys Ser Gln Ser Ala

485 490 495

Met Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Tyr Arg Ser Gly Ala Glu Thr Asp Ser

500 505 510

Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Gly Gly Arg Ala Ala Val Asn

515 520 525

Arg Tyr Ala Tyr Val Glu Leu His Gly Gly Ala Gln Asn Lys Ala Ala

530 535 540

Asn Glu Ala Ala Asn Asp Ala Ala Thr Trp Gly Ala Ala Lys Glu Pro

545 550 555 560

Leu Ser Leu Leu Gln Val Arg Glu Asp Leu Asp Gly Asp Ser Met Gly

565 570 575

Asn Tyr Tyr Lys Ser Arg Asn Gly Phe Phe Lys Ser Ile Phe Lys Arg

580 585 590

Val Phe Lys Lys Lys Gly Asp Ser Asp Glu Asp Ala Gly Gly Gly Asp

595 600 605

Asp Glu Asp Ser Asp Glu Glu Pro Gln Gly Gly Lys Lys Lys Arg Arg

610 615 620

Trp Arg Phe Pro Trp Lys Arg Arg Arg Gly Lys Gly Ser Gln Leu Gln

625 630 635 640

Gly Gly Asp Asp Asn Asp Asp Glu Gly Glu Ser Glu Asp Glu Ser Arg

645 650 655

Ser Thr Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Gly Leu Phe Gly Arg Ser

660 665 670

Asn Arg Lys Gly Arg Gly Lys Gly Arg Asp Glu Ser Asp Asp Gly Asp

675 680 685

Asp Gly Glu Glu Gly Glu Asp Ser Asp Asp Glu Glu Ala Ser Gly Gly

690 695 700

Ser Gly Gln Arg Gly Ala Lys Lys Gly Lys Arg Asn Gly Lys Gly Ser

705 710 715 720

Gly Thr Lys Gly Gly Arg Phe Glu Glu Thr Lys Ser Lys Met Gly Ser

725 730 735

Leu Phe Ala Lys Val Lys Arg Lys Ile Leu Pro Val Lys Gln Lys Leu

740 745 750

His Ile Glu Ala Phe Phe Asn Ser Ile Ile Val Lys Ser Cys Arg Asn

755 760 765

Ala Leu Lys Trp Glu Gly Asn Met Phe Arg Lys Gln Ser Leu Val Glu

770 775 780

Met Thr Leu Lys Val Pro Val Lys Leu Lys Tyr Ile Lys Gly Glu Pro

785 790 795 800

Leu His Phe Phe Arg Ser Gly Tyr Glu Val Ile Leu Thr Cys Arg Asn

805 810 815

Cys Asp Glu Val Leu Phe Asn Ser Cys Val Gln Val Tyr Cys Ala Lys

820 825 830

Arg Ala Ser Lys Glu Glu Arg Ala Val Ala His His Gly Gly His Ala

835 840 845

Asp Gly Gly Ala Leu Gly Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ile Thr Ala

850 855 860

Ala Ser Thr Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ser Pro Ala Ser Pro Tyr

865 870 875 880

Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Ser Asp Val Ser Pro Leu Ala Met Ile His

885 890 895

Tyr Asn Gly Gln Tyr Phe Pro Gly Ser Val Thr Pro Glu Ala Asp Tyr

900 905 910

Phe Ser Ser Asp Gly His Met Cys Val Ser Tyr Ser Val Val Leu Val

915 920 925

Thr Leu Met Val Ala Leu Leu Leu

930 935

<210> 2

<211> 2811

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgttctgga aagtaaaggg gagggccttc gcgttcgtct tcctctcata cgccagcttc 60

gtgcattcgg ataaagcggt taacctgggg aatgcgctgg cgggggggat tagcgggggg 120

attagcggcg gaattagcgg cgggttgagc agcggtttgg ccagcggaat aagcggcgga 180

cttagcaact ccgccgccgc ttcgaccgcc ctgctgcacg cggccgtggg gaagggaccc 240

aacatgcaca cgtgccagtc ggccgggtgc gcctcataca agagcatcac gcccagcgat 300

gcaggagact gcctaaacgg gttcatctgc aaggagtgta aaagaaccca cgcgaagaac 360

ccaaacatct gcttctactc ctccctccaa ggatttgaaa gtttatatga agcacatcta 420

gaggatttta cacaaccaac gccctacgac cgtttcaacg tcccattggt taagtccagc 480

aaaggggaga acaacagggg ggacgcctca agtgacagtg gtagggaggt ctcccctaat 540

gacgaatcgg gggatcaccg cagaggcagt ctctcacaag gaggagacga cgatggagag 600

aagggggacc tccaacgcag tggcagggat ggcaaagcag gaggtagtcg cttcccacgg 660

gcgttagaag aagaggaaga agaagaggag gaggaggaag acgacgacga cgactctgcg 720

aaagaaaaac gtggtggaca taaagggggc aactcccctc agggggggaa caacggaggg 780

aacaatttcg acgcaggtta cgaaacggag tcatttctgc agaaatcgcc tgaccatgtt 840

catagaaaag gtgatctaca caagttggcg aaagaggggg ggcgggagca gcacacaaac 900

gctcacatgc atatacacac gcacatgcac actcacacgc ataacgaatt gatgtccgga 960

aaagagggac tccttagctc ggtggagacg cacgtgcggc ttggcatcag tgaggggggc 1020

tacaacaggg gagcgtccga atctccgggg aggcacagcg gcgtgagcag cggtgcctct 1080

gtcagcatgg gcaccgctgc tcatggaggc actgctgctg agagtggcta ctccttcgcc 1140

gagtccgagc ggggcaaaga aaaaatcgtc tacaagcgac tcaaaataag cctgaacaat 1200

cacgaggagt atttcaaaag caaaatgaat aagtgtcacg tgggggggga cggagtggcc 1260

actctgtatg tgaaggtgct gctgcagatt gttaaggata agaacgacgt ctatgtggac 1320

gtgagtagga ggagcggctc gtctcacatg agcccagggt cgggtgggca gaaggggaag 1380

gaagggaaga aggcaaacgg gaggagcgaa tcggggaagg aagaggagga agaagaggac 1440

gcggaagaga gtgacgacga tgagtacatg cggaagtctc aaagcgccat ggggggggga 1500

gggtacggtt accgctcagg cgcggagacg gacagcgata gcgacagcga cagcgacagc 1560

gatggggggc gcgcggcggt gaataggtac gcctacgtgg agctgcacgg gggggcgcaa 1620

aacaaagcgg cgaacgaagc ggcgaacgat gcggctacct ggggggcggc gaaggaaccg 1680

ctctccctcc tccaggtgag ggaggacctg gacggagact ccatggggaa ctactacaag 1740

tcgcgcaacg ggttcttcaa atcgattttc aaacgggttt ttaaaaaaaa aggagactcg 1800

gatgaagacg cagggggggg ggacgacgag gacagtgatg aggagcccca gggggggaag 1860

aagaagcgga ggtggagatt cccctggaag agacgaaggg ggaagggcag ccaactgcag 1920

ggcggcgacg acaatgacga cgagggcgag agcgaggatg agtcacgcag cacaagacgt 1980

aggaggggag gcaggcgggg gctattcggt cggtccaatc gaaagggcag aggcaaaggg 2040

agagacgaaa gtgatgatgg cgatgacggc gaagaaggcg aagactcaga cgatgaagag 2100

gccagtgggg gcagtggaca aaggggggca aaaaaaggaa aacgaaacgg taagggaagc 2160

ggaaccaagg ggggcagatt cgaggagacc aaatcaaaaa tgggtagcct ctttgccaaa 2220

gtgaagagga agattctccc cgtaaaacaa aaactacaca tagaggcgtt cttcaatagc 2280

atcatcgtaa agtcatgtag gaatgccctc aagtgggagg gcaacatgtt tcggaagcag 2340

tcgctcgtcg agatgactct caaggtcccg gttaaactga aatacataaa gggggagcct 2400

ctgcatttct tccgttcggg ctacgaagtc attttaactt gccgcaactg cgatgaggtt 2460

ctcttcaact cgtgtgtgca ggtctactgc gccaagcgag cgagcaaaga ggaacgggcg 2520

gtggcgcacc acggcgggca cgcggacgga ggagccctgg ggagcggcgc aaccgcagct 2580

gccattactg ccgcttccac tgctgccgcc actgccgctg cttcccccgc atcgccgtac 2640

ctttactcgg cgagcccgtc cgacgtctcc ccgctggcaa tgatccatta caacgggcag 2700

tacttccccg gcagtgtaac ccccgaggca gactacttca gcagcgatgg gcacatgtgc 2760

gttagctact cggtcgttct cgtcacgctg atggttgccc ttcttttgta g 2811

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggatccatgt tctggaaagt aaagggg 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctcgagcaaa agaagggcaa ccatcag 27

Claims

1.一种蛋白质在制备抗肿瘤药物方面的应用，其特征在于，所述蛋白质含有SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括但不限于制备抗肺癌、肝癌或前列腺癌的药物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括但不限于疫苗、抑制剂、免疫调节剂。

4.一种制备SEQ ID NO.1所示蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)扩增编码所述疟原虫蛋白的基因，将扩增的目的基因连接到表达载体上，得到重组质粒；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征碍于，具体包括如下步骤：

1)设计SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示引物，扩增目的基因，将扩增的目的基因连接到表达载体上；

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述表达载体为原核细胞表达载体、真核细胞表达载体或昆虫细胞表达载体。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的表达细胞为原核表达细胞、真核表达细胞或昆虫细胞。

8.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pET28a(+)，所述表达细胞为E.coli BL21(DE3)。

9.SEQ ID NO.1所示的蛋白质在制备非医药用途的产品方面的应用。

10.含有SEQ ID NO.1所示蛋白质的药物。