CN111100902A - 一种基于sim靶点抗kshv/ebv相关肿瘤小分子化合物筛选方法和应用 - Google Patents

一种基于sim靶点抗kshv/ebv相关肿瘤小分子化合物筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及了筛选抗疱疹病毒相关肿瘤的小分子化合物的方法。该方法包括如下步骤：(1)建立LANA与SUMO2蛋白互作系统；(2)利用上述蛋白互作系统，在细胞水平标准化合物筛选；所述的LANA与SUMO2蛋白互作系统是带标签的LANA1‑329(LANA1‑329ΔSIM1+2)与带互补标签的SUMO‑2(ΔGG)。本发明还包括用上述方法筛选获得的化合物的应用，以及使用这些化合物抑制疱疹病毒的方法。这些化合物经体内外试验证明其对疱疹病毒及疱疹病毒感染阳性肿瘤细胞的具有不同程度地靶向杀伤效果，有效性可达nM级，有望用于临床预防和治疗疱疹病毒相关疾病。

Description

一种基于SIM靶点抗KSHV/EBV相关肿瘤小分子化合物筛选方 法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种抗KSHV/EBV相关肿瘤的小分子化合物 及其筛选和应用。
背景技术
卡波氏肉瘤病毒(Kaposi’s sarcoma-associated Herpesvirus，KSHV)，又称人类疱 疹病毒8型(HHV-8)，于1994年由Chang和Moore发现并鉴定[1]，作为一种肿瘤病毒，是 多种人类恶性肿瘤的主要病原体，与卡波氏肉瘤(Kaposi’s Sarcoma，KS)、原发渗出性 淋巴瘤(Primary Effusion Lymphoma，PEL)以及多中心性Castleman病(MulticentricCastleman’s disease，MCD)发生相关[2-4]。卡波氏肉瘤也是艾滋病患者在HIV滴度得到控制的情况下发生死亡的主要病因之一[5]，原发渗出性淋巴瘤目前尚无最佳治疗方案且预后很 差，平均生存时间仅为6个月左右[4]，更重要的是，目前尚未建立针对KSHV引发恶性肿瘤的治疗方法或疫苗，因此，KSHV相关肿瘤的治疗尚需寻求更有效的新思路及方法。
众所周知，KSHV生活周期包括潜伏(latency)和裂解复制(lytic replication)两个感染阶段，在原发感染初期，潜伏期和裂解复制期基因均有表达，经过几轮的复制，裂 解期基因表达降低，仅少数潜伏期相关毒基因表达，如ORF73(LANA)、ORF72(vCyclinD)、 K12(Kaposin)和K13(vFLIP)，主要负责病毒附加体维持、复制和宿主细胞转化。其中LANA 发挥着重要的功能：以C端连接KSHV环形的附加体(episome)DNA，N端结合于宿主细胞 的染色质，形成病毒基因组存在模式，随着宿主细胞增殖分裂而潜伏复制的独特方式[6]。KSHV 生活周期如图1所示。
SUMO(Small ubiquitin-like modifier)具有与泛素分子(Ubiquitin)相近的分子 量和相似修饰环，故而属于类泛素分子家族[7]。在哺乳类动物细胞中目前发现至少有四类 SUMO成亚型：SUMO-1，SUMO-2，SUMO-3和SUMO-4。其中，SUMO-1只能形成单个SUMO修饰，SUMO-2和SUMO-3高度同源，序列一致性高达97％，可形成多聚SUMO修饰；而SUMO-4具有 组织特异性(主要表达于胰脏)，且功能尚不清楚[8]。
与泛素分子相似，SUMO信号可被一类SUMO互作多肽基序(SUMO-interactingmotif) 识别结合，目前认为有三种较为肯定的保守基序分别为：K-X3- 5-I/V-I/L-I/L-X3-D/E/Q/N-D/E-D/E、h-h-x-S-x-S/T-a-a和V/I-x-V/I-V/I[9-11]。我们课 题组前期的工作发现，LANA蛋白的N端有2个串联的SIM基序(SUMO-interacting motif)， 可招募包括多聚SUMO2化修饰的KAP1和sin3A在内的多种蛋白，形成转录抑制复合体，促 进KSHV基因沉默和维持附加体的稳定传代，当LANA蛋白N端的2个SIM位点发生突变， KSHV基因组稳定性丧失[12]。该研究提出，LANA是通过被一种具有分子开关功能的因子SUMO2 修饰，完成对KSHV病毒维持潜伏感染状态的调节，且潜伏期LANA蛋白的SIM位点是有效 消除KSHV潜伏感染的潜在靶点。
二甲基雌二醇是雌二醇的天然代谢产物，作为实验候选药物，具有抑制血管生成功效 [13]，在一些癌细胞系中可诱导细胞凋亡[14]。此外，亦有研究表明，2-ME2可作为一种微管抑 制剂，抑制肿瘤细胞增殖[15]。
盐酸阿霉素属于蒽醌类化合物，亦有研究发现该类化合物可诱导卡波氏肉瘤病毒的裂 解复制[16]，常与其他化疗药物联用，是一种广谱的抗肿瘤药物，临床上也已用于治疗淋巴 瘤。
短杆菌肽(Gramicidin)是从短芽孢杆菌(Bacillus brevis)培养物中提取获得[17]，属 于多肽类物质，通常我们提及的短杆菌肽是一种总称，主要包括短杆菌肽A，短杆菌肽B， 短杆菌肽C，短杆菌肽D，短杆菌肽S等，但有时也特指一种，本发明所指的是短杆菌肽A，B 和C混合物。目前短杆菌肽治疗用途仅限于局部应用，因其可以低于细菌细胞死亡的浓度 进行诱导溶血，因此不能在内服用。其主要作为局部抗生素，用于皮肤化脓性疾病的预防 和治疗。
替西罗莫司是西罗莫斯的一种衍生物、前药，用于治疗肾细胞癌静脉注射药物，作为 mTOR抑制剂，可以影响蛋白合成进而干扰细胞增殖。
Cambogin是一种多环多异戊二烯化的小分子化合物，在藤黄属植物中可提取得到， 之前的研究发现，Cambogin在成神经管细胞瘤和和乳腺癌细胞具有抗凋亡的作用[13]，但其 抗病毒的功能目前尚无报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新的筛选抗疱疹病毒相关肿瘤的小分子化合物的 方法和系统。
本发明要解决的另一个技术问题是提供使用上述系统筛选到的化合物在制备抗疱疹感 染阳性药物中的应用。
针对现有技术存在的上述问题，本发明在无数次试验的基础上提供了新的抗疱疹病毒 相关肿瘤的化合物的筛选系统，利用该系统筛选到有较好抗KSHV/EBV相关肿瘤效果的化合 物，包括4个FDA化合物及1个天然小分子，并通过体内体外试验进行验证。本发明所提 供的靶向SIM位点的小分子药物可特异抗KSHV病毒复制，其抗潜伏感染的高特异性、有效 性可达nM级。
本发明提供了一种筛选抗KSHV/EBV相关肿瘤的小分子化合物的方法，该方法依次包括 如下步骤：
(1)建立LANA与SUMO2蛋白互作系统；
(2)利用上述蛋白互作系统，在细胞水平标准化合物筛选。
如本发明的优选实施例所示，该方法还包括验证试验，例如抗肿瘤作用的验证，消减 病毒复制能力的验证，等等。
所述的LANA与SUMO2蛋白互作系统，是在Promega公司NanoBiT蛋白互作系统(Cat.#N2014)制备的能反映互作效应的、带标签的LANA1-329(LANA1-329 ΔSIM1+2)与带互补标签的SUMO-2(ΔGG)。
其中，LANA与SUMO2蛋白互作系统使用的载体可以从表2中选择，例如使用 LANAI-329-SmBIT/LgBIT-SUMO2。
在本发明的一个优选实施例中，步骤(2)的筛选过程是：将LANA与SUMO2蛋白互作系统按照1∶1(1ug/per)，利用FuGENER HD转染试剂(Cat.#E2311)在人胚肾293细胞内共 表达36h后，分别加入单体化合物，共培养过夜后通过Nano-Glo Live Cell Reagent (Cat.#N2011)比较Luminescence读值，检测小分子化合物抑制LANA与SUMO-2特异结合 的能力。
本发明中，筛选到的化合物可以进一步以疱疹病毒感染阴性和阳性细胞为试验对象， 进行抗疱疹病毒的验证试验。
所述的抗疱疹病毒的验证试验是指细胞毒力实验、细胞增殖实验或者靶向性实验的验 证。
然后，筛选到的化合物可以利用模式动物进行给药试验。例如，采用荷瘤的严重联合 免疫缺陷型小鼠作为模型。所述的荷瘤是通过注射疱疹病毒感染阳性的细胞成瘤。
本发明的方法用于筛选的化合物具有明确的结构式，例如，从化合物库中筛选，或者 以纯的、市售的化合物单体或者通过其他方式获取的化合物单体。
相应的本发明提供了一种筛选抗疱疹病毒的化合物的标准，具体而言，该标准和方法 包括如下步骤：
(1)首先在细胞水平建立一种可行的蛋白互作系统(LANA与SUMO2)，即在Promega公司NanoBiT蛋白互作系统(Cat.#N2014)基础上进行了适应性调整，找到一组合适的(LANA与SUMO2)组合方式，并再次确证了实验室之前的研究成果；
(2)利用上述蛋白互作系统，在细胞水平分别进行化合物库(例如，在本发明中使用 18种草药单体提取物和1840个FDA化合物库)筛选，找到8个化合物。
其中，二甲基雌二醇(2-Methoxyestradiol)，盐酸阿霉素(Doxorubicinhydrochloride)，短杆菌肽(Gramicidin)，替西罗莫司(Temsirolimus)等化合物已被 美国食品要监督管理局认可，背景清晰，可直接应用于临床。而筛选到的两个草药单体提 取物：Cambogin和Garcimultiflorones H，结构相似。
(3)通过KSHV阴性、阳性细胞水平验证试验。
例如，本发明中主要包括使用细胞毒力实验，细胞增殖实验，靶向性验证实验等，确 证上述化合物的特异性和有效性；
(4)利用免疫缺陷小鼠，通过体内试验验证化合物作用。
例如，使用严重联合免疫缺陷小鼠(SCID)腹腔注射BCBL-1 luciferase细胞成瘤后， 经给药实验发现Cambogin对肿瘤发展具有显著抑制作用。
(5)EBV阴性和阳性细胞水平验证。
结果显示，Cambogin，Clofarabine和Gramicidin对γ亚科疱疹病毒的具有广谱性。
本发明的方法筛选到的小分子化合物可以用于制备抗疱疹病毒感染相关肿瘤药物，所 述化合物包括二甲基雌二醇、盐酸阿霉素、短杆菌肽、替西罗莫司、Cambogin或者Garcimultiflorones H。
二甲基雌二醇(2-Methoxyestradiol)，其分子结构式如下：
Figure BSA0000172865870000051
2-甲氧基雌二醇(2-ME2)是雌二醇的一种天然代谢产物，作为实验候选药物，可以抑制肿瘤生长所需的新血管的形成，是一种血管生成抑制剂。另有研究表明，在体外可诱导一些癌细胞凋亡。
盐酸阿霉素(Doxorubicin hydrochloride)，其分子结构如下：
Figure RE-GDA0001948260980000062
盐酸阿霉素是一种核酸类似物，可在细胞有丝分裂时抑制核酸的合成，该化合物抗 瘤谱较广，对多种肿瘤细胞均有杀伤作用。
短杆菌肽(Gramicidin)，其分子结构如下：
Figure RE-GDA0001948260980000071
短杆菌肽(Gramicidin)是从短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的培养物中提取获得， 属于多肽类物质，通常提及的短杆菌肽是一种总称，包括短杆菌肽A，短杆菌肽B，短杆菌 肽C，短杆菌肽D，短杆菌肽S等，有时也特指其中之一种，本研究发现的是短杆菌肽A，B和C混合物。
替西罗莫司(Temsirolimus)，其分子结构如下：
Figure BSA0000172865870000061
替西罗莫司是西罗莫斯的一种衍生物、前药，用于治疗肾细胞癌静脉注射药物，作为 mTOR的抑制剂，可以影响蛋白合成进而干扰细胞增殖。
Figure BSA0000172865870000062
Cambogin在藤黄属植物中可提取得到，在成神经管细胞瘤和和乳腺癌细胞具有抗凋亡 的作用[13]，但其抗病毒的功能目前尚无报道。目前关于Garcimultiflorones H的研究较少， 该化合物可能是Garcinia.Multiflora众多同根异构体中的一种，而Garcinia.Multiflora 具有多种生物学功能，比如细胞毒性，抗炎症[14]，抗氧化[15]，抗艾滋病病毒[16]。此外，根 据化学结构式可以看出，Cambogin和Garcimultiflorones H均属于多环多异戊二烯化的小 分子化合物。
其中，二甲基雌二醇、盐酸阿霉素、短杆菌肽、替西罗莫司、Cambogin或者Garcimultiflorones H可以是药物的活性成分，与药学上可以接受的成分配合，制成药剂。
上述应用主要针对疱疹病毒，尤其是γ亚科疱疹病毒。例如，本发明的优选实施例中 使用KSHV或者EBV。
较好的，本发明的化合物是抗疱疹病毒潜伏的药物。
或者，所述的抗疱疹病毒药物是能够抑制疱疹病毒的病毒拷贝数增加的药物。
或者，所述的抗疱疹病毒药物是抑制疱疹病毒阳性细胞增殖的药物。
本发明还包括一种抑制体外疱疹病毒的方法，所述的方法包括在疱疹病毒感染阳性细 胞的培养环境中加入上述抗疱疹病毒感染相关肿瘤药物。
所述的细胞可以是肿瘤细胞，尤其是含有LANA蛋白的SIM位点的细胞。
上述列举的几种化合物中，有些目前已应用于临床，比如，盐酸阿霉素以及硫酸阿霉 素临床用于治疗淋巴瘤，但本发明所筛选获得这些小分子化合物的抗疱疹病毒的功能目前 均尚无报道。
本发明提供了一种抑制体外疱疹病毒的方法，包括在疱疹病毒感染阳性细胞的培养环 境中加入二甲基雌二醇、盐酸阿霉素、短杆菌肽、替西罗莫司、Cambogin或者Garcimultiflorones H。
其中，所述的疱疹病毒是KSHV或者EBV，所述的细胞是肿瘤细胞。
较好的，所述的细胞中含有LANA蛋白的SIM位点。
本发明有益的技术效果在于：
卡波氏肉瘤病毒编码的LANA蛋白是病毒维持潜伏感染的关键蛋白，它通过被一种具有 分子开关功能的因子SUMO2修饰，完成对KSHV病毒维持潜伏感染状态的调节，当LANA蛋 白N端的2个SIM位点发生突变，KSHV基因组稳定性丧失，这提示存在于LANA蛋白N端SIM位点是有效消除KSHV潜伏感染的潜在靶点。
本发明从细胞水平建立一种可行的蛋白互作系统(LANA与SUMO2)，即我们首先在Promega公司NanoBiT蛋白互作系统(Cat.#N2014)基础上进行了适应性调整，再次确证了实验室之前的研究成果：疱疹病毒编码的LANA蛋白SIM位点与SUMO2特异结合，结合的功 能结构域SIM位点的缺失能有效地破坏LANA与SUMO2的特异结合；其次，本发明靶向SIM 位点筛选到小分子化合物Cambogin，该化合物经体内外试验证明其对KSHV阳性肿瘤细胞的 靶向杀伤效果。
本筛选从体内外试验反复确证表明其结果可靠性，另外，KSHV及EBV作为肿瘤病毒， 目前已报道与多种疾病发生相关，但目前临床并没有有效的治疗药物，本发明有望为临床 治疗提供新思路。
附图说明
图1.KSHV生活周期示意图。
图2.NanoBiT蛋白互作系统工作原理。
图3.SUMO2与LANA SIM结构域特异结合筛选系统的建立。
图4.靶向SIM位点的天然小分子化合物筛选确证。
图5.小分子化合物对KSHV/EBV染毒和未染毒细胞的细胞毒性(A)及对不同细胞的IC50值(B)。
图6.小分子化合物对KSHV/EBV病毒拷贝数的影响。
图7A.荧光显微镜观察Cambogin和Garcimultiflorones H对KSHV感染Hela细胞效率影响。
图7B.定量PCR检测Cambogin和Garcimultiflorones H对KSHV感染Hela细胞病毒基因组拷贝数的影响。
图8.小分子化合物对KSHV/EBV染毒细胞体外增殖的影响。
图9.Cambogin和Garcimultiflorones H对KSHV染毒和未染毒细胞的体外Colony生 成的影响。
图10.免疫共沉淀检测Cambogin对LANA与SUMO2互作的靶向抑制作用。
图11.Cambogin对SCID小鼠体内BCBL1肿瘤生长的抑制作用。A)给药方案；B)给药前后肿瘤的大小；C)给药前后肿瘤大小的荧光定量比较。
图12.实施例5中Cambogin对AD169-GFP(HCMV，MO10.3)感染MRC5人胚肺成纤维 细胞的影响。
图13.卡波氏肉瘤疱疹病毒KSHV(ORF72)及EB病毒(EBNA1)基因组定量的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明进行具体描述。
实施例1：LANA中与SUMO-2特异结合SIM结构域的确证
1、Promega公司NanoBiT蛋白互作系统(Cat.#N2014)工作原理
NanoBiT是一种基于将荧光素酶拆分为两个亚基，其中大的命名为LgBiT，分子量17.6kDa，小的为SmBiT，含11种氨基酸，当待测蛋白共表达时，由于相互作，LgBiT与SmBiT被相互牵引亲近，形成有功能的荧光素酶，进而在底物作用下发出荧光信号，但本身LgBiT与SmBiT二者的结合力很弱(KD＝190μM)，所以可用于检测细胞内的蛋白质相互作用。LgBiT和SmBiT之间的交互是可逆的。此外，该系统提供一对强相互作用的蛋白作为阳性对照(LgBIT-PRKAR2A/SmBIT-PRKACA)，以及标签蛋白Halo tag-SmBiT与待检测蛋白构成阴 性对照(本发明涉及待测蛋白为LANA蛋白，即LANA 1-329-LgBIT或者LgBIT-LANA1-329)， 一般说来，已知的蛋白质相互作用水平高于LgBiT融合蛋白与
Figure BSA0000172865870000092
SmBiT显示的发光 水平的10到1000倍就判定为阳性结合。本实验以LANA与SUMO2相互作用为例，模式图如 图2所示。
2、构建相关质粒
通过Promega提供的带有多克隆位点的LgBiT载体和SmBiT载体从C端或N端构建待测蛋白(LANA1-329，LANA1-329 ΔSIM1+2，SUMO-2(ΔGG))的融合蛋白。本实验选用 BglII/EcoRI作为酶切位点，具体组合方式如下表1所示：
表1
Figure BSA0000172865870000091
Figure BSA0000172865870000101
3、SUMO-2与LANA中SIM结构域特异结合的确证
根据Promega公司NanoBiT蛋白互作系统，将带标签的不同LANA1-329(LANA1-329Δ SIM1+2)与带互补标签的SUMO-2(ΔGG)，按照1∶1(1ug/per)，利用FuGENER HD转染试剂(Cat.#E2311)在人胚肾293细胞内共表达48h后，通过Nano-Glo Live Cell Reagent(Cat.#N2011)比较Luminescence读值确定与SUMO-2特异结合的组合。
经比较，我们找到了最佳的组合方式，即LANA1-329-SmBIT与LgBIT-SUMO2结合能力最强。附图为各组合下具体实验结果，如表2所示。条形图如图3所示。
表2
Figure BSA0000172865870000102
Figure BSA0000172865870000111
实施例2：靶向SIM位点的小分子化合物筛选
1、单体化合物溶解
本实验所需化合物分别来自上海中医药大学徐宏喜教授课题组以及上海药物研究所 童贤昆课题组，所有单体化合物均选用DMSO(Sigma，Cat.#67-68-5)作为促溶剂，-20℃ 分装保存。如表3，4所示。
表3 上海中医药大学徐宏喜教授课题组送样清单(18个单体化合物)
Figure BSA0000172865870000112
Figure BSA0000172865870000121
表4 中科院上海药物所童贤昆教授课题组送样清单(部分，FDA化合物)
Figure BSA0000172865870000131
2、靶向SIM位点的小分子化合物筛选
根据实施例1实验结果，将LANA1-329-SmBIT/LgBIT-SUMO2按照1∶1(1ug/per)， 利用FuGENER HD转染试剂(Cat.#E2311)在人胚肾293细胞内共表达36h后，分别加入18 种单体化合物，共培养12小时后通过Nano-Glo Live Cell Reagent(Cat.#N2011)比较Luminescence读值，检测小分子化合物抑制LANA与SUMO-2特异结合的能力。结果如图4 所示。经三次实验重复比较，我们发现二甲基雌二醇(2-Methoxyestradiol)，盐酸阿霉 素(Doxorubicin hydrochloride)，短杆菌肽(Gramicidin)，硫酸博来霉素(BleomycinSulfate)，双硫仑(Disulfiram)，替西罗莫司(Temsirolimus)，以及草药提取物Cambogin和Garcimultiflorones H具有较好的抑制作用。
3、小分子化合物的基本性质
Figure BSA0000172865870000141
2-甲氧基雌二醇(2-ME2)是雌二醇的一种天然代谢产物，作为实验候选药物，可抑制肿瘤生长所需的新血管的形成，是一种血管生成抑制剂。
盐酸阿霉素(Doxorubicin hydrochloride)，其分子结构如下：
Figure RE-GDA0001948260980000152
盐酸阿霉素是一种核酸类似物，可在细胞有丝分裂时抑制核酸的合成，因此该化合物 抗瘤谱较广，对多种肿瘤细胞均有杀伤作用。
短杆菌肽(Gramicidin)，其分子结构如下：
Figure RE-GDA0001948260980000153
短杆菌肽(Gramicidin)由短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的培养物中提取得到，属于 多肽类物质。
替西罗莫司，其分子结构如下：
Figure BSA0000172865870000151
替西罗莫司是西罗莫斯的一种衍生物、前药，用于治疗肾细胞癌静脉注射药物，作为mTOR抑制剂，可影响蛋白合成进而干扰细胞增殖。
Figure BSA0000172865870000152
Cambogin在藤黄属植物中可提取得到，在成神经管细胞瘤和和乳腺癌细胞具有抗凋亡 的作用[13]，但其抗病毒的功能目前尚无报道。目前关于Garcimultiflorones H的研究较少， 该化合物可能是Garcinia.Multiflora众多同根异构体中的一种，而Garcinia.Multiflora 具有多种生物学功能，比如细胞毒性，抗炎症[14]，抗氧化[15]，抗艾滋病病毒[16]。此外，根据 化学结构式可以看出，Cambogin和Garcimultiflorones H均属于多环多异戊二烯化的小分子 化合物。
实施例3：靶向SIM位点的小分子化合物Cambogin确证
1、KSHV阴性和阳性细胞水平验证试验
KSHV阴性细胞系BJAB，KSHV阳性细胞系BCBL1，均生长于含有10％灭活的胎牛血清、终浓度为100uM的青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基中。K-BJAB细胞在培养过程中 除了需要上述物质外还需要添加终浓度1ug/ml Puromycine，内皮细胞iSLK额外添加 250ug/ml G418和1.2mg/ml的Hygromycine，KSHV感染的iSLK细胞K-iSLK需额外添加 250ug/mlG418、1.2mg/ml Hygromycine和1ug/ml的Puromycine。所有细胞均在37℃、CO2浓度为5％的细胞培养箱中培养。嘌呤霉素、青霉素和链霉素购买自生工生物工程(上海) 股份有限公司；胎牛血清购买自Biological Industries公司；DMEM、RPMI1640培养基来 自HyClone公司。
1.1、MTT检测Cambogin和Garcimultiflorones H对细胞毒性
将KSHV阴性细胞系BJAB，iSLK，KSHV阳性细胞系BCBL1，K-BJAB，K-iSLK铺于96 孔板，每孔10000个细胞，同时加入100uM，10uM，1uM Cambogin和Garcimultiflorones H同时设置未处理组及DMSO处理组。另外，Oblongifolin L和E-7：18 I-5，II-5，I-7，II-7，I-3’，I-4’，II-4’-heptahydroxy[I-3，II-8]flavononylflavone为初 筛时发现对LANA与SUMO2结合无明显抑制作用的化合物，作为本实验的阴性对照，下同) 加入MTT至终浓度1mg/mL，37℃孵育4小时之后弃掉，加入MTT solvent 150uL室温避 光2h后，酶标仪490nm读板，根据公式计算细胞活力。结果如图5所示。
MTT结果显示，Cambogin，Garcimultiflorones H对KSHV阳性阴性细胞系均有一定程度的杀伤作用。表明他们具有一定的细胞毒性。
1.2、Cambogin可抑制KSHV病毒拷贝数
将KSHV阳性细胞系BCBL1、K-iSLK及K-BJAB细胞按接种密度0.25million/mL种 于T25培养瓶中，同时加入100nM Cambogin和Garcimultiflorones H，设置未处理组及 DMSO处理组，放回至细胞培养箱中培养，处理12，24，48，72h，分别提取细胞总DNA(HMW 法)，Q-PCR绝对定量分别检测抑制病毒拷贝数的能力。Q-PCR引物如下表4所示：
表4
Figure BSA0000172865870000171
Q-PCR反应体系，其中2×SYBG green Mix(购自翊圣公司)10ul，上下游引物各0.5ul， DNA 50ng，ddH2O补齐至20ul。PCR反应条件95℃，3min，95℃30s，50℃30s，72℃30s共40个循环然后为72℃延伸10min，最后一步为溶解曲线。
经检测，我们发现，Cambogin可抑制KSHV病毒复制，可达nM级，Garcimultiflorones H则无此能力。结果如图6所示。
1.3、Cambogin可抑制KSHV感染Hela细胞能力
将1.5x10^5Hela细胞铺于24孔板，待细胞密度至70-80％，-80℃取20ul KSHV悬液加入到500ul Hela细胞中进行离心感染(1500rpm，25℃)1h，37度培养2h后，PBS洗 两遍，换新的培养基，分别加入500nM Cambogin和Garcimultiflorones H，设置未处理组 及DMSO处理组，处理12，24，48，72h后荧光显微镜下观察感染效率，流式细胞术统计 GFP荧光比例，同时Q-PCR检测KSHV病毒拷贝数。流式细胞术统计不同时间GFP比例如图 7A所示，荧光显微镜下观察感染效率如图7A所示。
流式细胞术统计分析发现Cambogin在感染后72h时较Garcimultiflorones H具有明 显的抑制作用。
Q-PCR结果也证实Cambogin在感染后72h时较Garcimultiflorones H具有明显的抑 制作用，如图7B所示。
1.4、Cambogin可以抑制细胞增殖及KSHV病毒复制
将KSHV阳性细胞系BCBLl细胞按接种密度0.01million/mL种于T25培养瓶中，同时加入1uM Cambogin和Garcimultiflorones H，设置未处理组及DMSO处理组，放回至细胞 培养箱中培养，处理1，2，3，4，5，6，7，8天，分别对其进行活细胞计数(Backman) 并于第五天提取细胞总DNA(HMW法)，Q-PCR相对定量检测Cambogin抑制病毒拷贝数的能 力。Q-PCR引物如下表5所示：
表5
Figure BSA0000172865870000181
活细胞计数结果如图8所示，Cambogin较Garcimultiflorones H可抑制BCBL-1细胞增 殖，Q-PCR结果显示其也具有很好的病毒清除效果。
1.5、克隆形成实验确证Cambogin具有清除肿瘤细胞能力
iSLK或K-iSLK细胞经胰酶消化后取相同的细胞数量(3000/per)重新接种到直径为 10cm的细胞培养皿中，同时加入500nM Cambogin和Garcimultiflorones H，同时设置未处理组及DMSO处理组，细胞放回至细胞培养箱中继续培养，每三天换液及化合物，生长 14天后，吸掉细胞上清，用PBS洗一遍，加入2ml 4％的多聚甲醛室温固定20min。细胞固 定后用浓度为0.1％的结晶紫对细胞进行染色。染色后用水将多余的染料冲洗干净，用扫描 仪对细胞群落进行扫描。
结果如图9所示，我们可以看到，Cambogin具有很好的清除肿瘤细胞的能力，Garcimultiflorones H则无此能力。
1.6、Cambogin特异抑制LANA与SUMO2的相互作用
将人胚肾293细胞铺于10cm dish，待细胞密度长至60-70％，将 LANA1-1162-myc/FLAG-SUMO2按照1∶1(10ug/per)PEI转染共表达，在37℃，5％CO2 培养12小时换液，同时加入100nM DMSO，Cambogin，Garcimultiflorones H及未处理组， 48小时后收细胞，并做免疫共沉淀。
经免疫印迹如图10所示，我们可以看到，Cambogin可以有效地抑制LANA与SUMO2相互作用，而Garcimultiflorones H则没有此作用。
1.7 Cambogin可以抑制KSHV相关肿瘤细胞增殖
将10x10^6 BCBL-1 luciferase腹腔注射于40只严重免疫缺陷鼠体内(均为雌性)， 待35天后通过小动物活体成像仪(IVIS Spectrum CT，PerkinElmer)检测肿瘤大小，待肿 瘤长均等大小，即ROI(光量子数约10^10-10^11左右)重新分组：PBS组，DMSO组，高剂量组(Cambogin 25mg/kg)，低剂量组(Cambogin 2.5mg/kg)，每组5只小鼠。各处理组 采取隔天注射，每种处理10次。25天后再次成像，观察处理前后肿瘤变化。
经小动物活体成像技术如图11所示，我们可以看到，Cambogin可以抑制肿瘤生长，且具有剂量依赖抑制效果(2.5mg/kg抑制能力低、25mg/kg抑制能力高)。
实施例4：Cambogin，Clofarabine和Gramicidin可抑制EBV阳性细胞增殖
EBV与KSHV一样，同属于疱疹病毒γ亚科，生活周期分为潜伏期和裂解复制期， 我们猜想Cambogin可以抑制EBV病毒复制。本发明选用EBV阴性细胞系BJAB，EBV阳性细 胞系B95.8，LCL，均生长于含有10％灭活的胎牛血清、终浓度为100uM的青霉素和链霉素 的RPMI1640培养基中。所有细胞均在37℃、CO2浓度为5％的细胞培养箱中培养。嘌呤霉 素、青霉素和链霉素购买自生工生物工程(上海)股份有限公司；胎牛血清购买自BiologicalIndustries公司；DMEM、RPMI1640培养基来自HyClone公司。
1、MTT检测Cambogin，Garcimultiflorones H对细胞毒性
将EBV阴性细胞系BJAB，EBV阳性细胞系B95.8，LCL铺于96孔板，每孔10000个 细胞，同时加入100uM，10uM，1uM Cambogin和Garcimultiflorones H，同时设置未处理 组及DMSO处理组，于加入MTT至终浓度1mg/mL，37℃孵育4小时之后弃掉，加入MTT solvent150uL室温避光2h后，酶标仪490nm读板，根据公式计算细胞活力。结果如图5所示。MTT 实验结果显示Cambogin较Garcimultiflorones H对EBV阳性阴性细胞系有一定程度的杀 伤作用。
将EBV阴性(BJAB)阳性细胞系B95.8，LCL细胞按接种密度0.2million/mL种于 T25培养瓶中，同时加入不同浓度Clofarabine和Gramicidin，设置未处理组及DMSO处理 组，放回至细胞培养箱中培养，处理24，48，72，96hr，分别对其进行活细胞计数(Backman) 检测细胞活性，活细胞计数结果显示，Clofarabine和Gramicidin对EBV阳性细胞呈现杀 伤作用，其中，Clofarabine(氯法拉滨)并不能较好的靶向LANA与SUMO2相互作用的SIM 位点，且临床主要用于治疗急性淋巴细胞白血病，这里不再对该化合物赘述。
2、Cambogin可抑制EBV病毒拷贝数
将EBV阳性细胞系LCL，B95.8细胞按接种密度0.25million/mL种于T25培养瓶中，同时加入100nM Cambogin和Garcimultiflorones H，设置未处理组及DMSO处理组，放回 至细胞培养箱中培养，处理12，24，48，72h，分别提取细胞DNA(HMW法)，Q-PCR绝对定 量检测Cambogin抑制病毒拷贝数的能力。Q-PCR引物如下表6所示：
表6
Figure BSA0000172865870000201
Q-PCR反应体系，其中2×SYBG green Mix(购自翊圣公司)10ul，上下游引物各0.5ul， DNA 50ng，ddH2O补齐至20ul。PCR反应条件95℃3min，95℃30s，50℃30s，72℃30s共40个循环然后为72℃延伸10min，最后一步为溶解曲线。经检测，我们发现，Cambogin 较Garcimultiflorones H可抑制EBV病毒复制，可达nM级，如图6所示。
3、Cambogin，Clofarabine和Gramicidin可以抑制EBV阳性细胞体外增殖
将EBV阳性细胞系B95.8和LCL细胞按接种密度0.01及0.1million/mL种于T25培养瓶中，同时加入1uM Cambogin和Garcimultiflorones H，设置未处理组及DMSO处理组，放回至细胞培养箱中培养，处理1，2，3，4，5，6，7，8天，分别对其进行活细胞计数(Backman)检测Cambogin抑制细胞增殖的能力。活细胞计数结果如图8所示，Cambogin较Garcimultiflorones H可抑制B95.8，LCL细胞增殖。
将EBV阴性(BJAB)阳性细胞系B95.8，LCL细胞按接种密度0.2million/mL种于T25培养瓶中，同时加入不同浓度Clofarabine和Gramicidin，设置未处理组及DMSO处理组， 放回至细胞培养箱中培养，处理24，48，72，96hr，分别对其进行活细胞计数(Backman) 检测细胞活性，活细胞计数结果显示，Clofarabine和Gramicidin可以抑制EBV阳性细胞 增殖。
实施例5：Cambogin对HCMV没有显著抑制作用
MRC5人胚肺成纤维细胞在6％FBS的DMEM培养基中培养，细胞长至70-80％，感染相应 滴度AD169病毒，感染后两小时，移去病毒，用培养基洗一遍，分别加入1uM和500nMCambogin 处理后4天或8天后拍照，收上清待TCID50检测滴度，收细胞检测HCMV即刻早期蛋白表 达情况，结果如图12所示。由上述实验结果不难发现，Cambogin对HCMV感染没有显著抑 制作用。
总结：(1)本发明首先从细胞水平建立一种可行的蛋白互作系统(LANA与SUMO2)，即 我们首先在Promega公司NanoBiT蛋白互作系统(Cat.#N2014)基础上进行了适应性调整， 确证了实验室之前的研究成果：卡波氏肉瘤病毒编码的LANA蛋白SIM位点与SUMO-2特异 结合，结合的功能结构域SIM位点的缺失能有效地破坏LANA与SUMO2的特异结合；(2)初步筛选出靶向SIM位点的Cambogin与Garcimultiflorones H，且二者结构类似；(3)但体 外实验研究表明Garcimultiflorones H对KSHV病毒复制无有效抑制作用，相反，Cambogin 可抑制KSHV病毒复制，且其抗潜伏感染的高特异性、有效性可达nM级，(4)体内实验确 证了Cambogin具有靶向杀伤KSHV相关肿瘤的能力；此外，Cambogin，Clofarabine和 Gramicidin三种化合物，除KSHV病毒有效抑制作用外，对同属于疱疹病毒γ亚科的肿瘤 病毒EBV也有显著抑制效果。
上述实验中各步骤及试剂如下。
1、MTT solution，如表7所示。
表7
浓HCl NP-40 异丙醇
4mM 0.1％ 补齐50ml
MTT细胞活力计算：
细胞活力*(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100
A(加药)：具有细胞、MTT溶液和药物溶液的孔的吸光度
A(空白)：具有培养基和MTT溶液而没有细胞的孔的吸光度
A(0加药)：具有细胞、MTT溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力
2、HMW法提细胞DNA
1)加入400ul HMW buffer重悬细胞(180ul)，同时加入40ul 10％ SDS，20ul10mg/ul 蛋白酶K，60℃水浴孵育5h
2)加入等体积苯酚氯仿(1∶1)，4℃12000rpm/5min，收集上清，重复操作一次；
3)加入1/10体积的醋酸钠，2倍体积的冰乙醇，-80℃1h，4℃12,000rpm/5min；
4)70冰乙醇洗一次，4℃12000rpm/5min，
5)晾干(20min)，用ddH2O(20ul)溶解，放-20℃保存
HMW buffer配制(充分混匀后4℃保存)：如表8所示。
表8
1M Tris-HCl(pH＝7.5) 0.5M EDTA(pH＝8.0) 5M NaCl ddH2O
1ml 2ml 3ml 94ml
卡波氏肉瘤疱疹病毒KSHV(ORF72)及EB病毒(EBNA1)标准曲线，如图13所示。
3、PEI方法转染人胚肾293细胞
(1)细胞传代：转染前24h分离人胚肾293至含10％胎牛血清的DMEM培养基中进行传代培养，待细胞密度达60-70％，进行转染
(2)试管中加入适量质粒，并用无血清的DMEM稀释质粒，并吹打混匀。按照10cm 培养皿1ml+10ug的DNA进行准备。
(3)转染复合体形成。将配好的PEI试剂(1ug/uL)加入到已稀释好的DNA中，PEI 与DNA(ug)的混合比率为3∶1(10cm培养皿：PEI-30ul：10ug DNA)
加入后立即吹打约10下混匀，室温下孵育20分钟
(4)质粒与PEI试剂孵育20min后将混合物吹打混匀后加到细胞中，37℃培养6-10hr 后，细胞换液。转染后48小时内收获转染细胞
4、免疫共沉淀实验(Co-IP)
(1)蛋白提取
a)收取细胞
将人胚肾293细胞转移到离心管中的细胞经2000rpm离心5min后，倒掉上清，沉淀用预冷的PBS洗2遍，每次洗细胞包括用5ml PBS重悬细胞，4℃2000rpm离心5min。
b)裂解细胞
细胞经PBS清洗后吸掉上清，细胞沉淀用含有四种蛋白酶抑制剂Pepstantin、Aprotinin、PMSF、Leupeptin的RIPA裂解液(蛋白酶抑制剂均购自美国Amresco公司； RIPA细胞裂解液购自北京经科宏达生物技术有限公司)进行裂解。裂解过程在冰上进行， 裂解30min每5min震荡一次，本实验以800ul细胞裂解液裂解细胞进行细胞裂解。
c)离心去除细胞碎片
细胞裂解后14500rpm 4℃离心5min，收集上清，上清即提取后的细胞蛋白。
(2)标准曲线的绘制和蛋白定量
绘制标准曲线
a)将G250从4℃取出后，平衡到室温，将BSA用ddH2O稀释到100ug/ml。
b)按照表1-1所示配制反应体系，使蛋白浓度按梯度依次升高。
c)将配好后的反应体系震荡混匀，室温静置显色5min。
d)显色后，在波长595nM处测量吸光光度值，根据读数绘制标准曲线，横坐标为蛋白浓度，纵坐标为吸光光度值，如表9所示。
表9 标准曲线绘制
Figure BSA0000172865870000231
蛋白定量过程同标准曲线绘制，方法如下：
a)提取后的待测蛋白各取1、2、5、10ul分别加入到EP管中，加水定容至100ul。
b)向稀释后的不同浓度的待测蛋白中加入500ul G250，震荡混匀后室温静置显色5-10min。
c)在波长595nM处测量吸光光度值，根据做好的标准曲线计算待测蛋白浓度。根据蛋白定量结果并取全蛋白的5％作为input。
(3)向剩余蛋白中加入10ul的protein A/G珠子，1ul的IgG1，4℃摇床上孵育1hr排除非特异性蛋白的结合。
(4)蛋白与protein A/G和IgG抗体孵育后4000rpm离心30s，吸取上清至新的离 心管中。离心后的珠子沉淀用TBS洗三次，每次清洗包括加入600ul的TBS重悬，4000rpm 离心30s。清洗后的珠子加50ul TBS重悬。
(5)向(3)吸取的上清蛋白中加入1ug所需检测蛋白的抗体4℃摇床上过夜孵育，使抗体与目的蛋白充分的结合。
(6)蛋白与抗体过夜结合后，加入20ul的protein A/G，4℃摇床上孵育2hr，使protein A/G与抗体充分的结合。
(7)珠子与抗体和蛋白结合后，4000rpm离心30s，吸掉上清，珠子沉淀用TBS洗三遍，每次清洗包括加入600ul的TBS重悬，4000rpm离心30s。清洗后的珠子加50ul的TBS 重悬。
(8)向(3)和(6)重悬的珠子中加入10ul 6×loading Buffer，轻微震荡(防止 珠子粘到管壁上)混匀后100℃金属浴煮5min，短暂离心后吸取上清进行western blot鉴 定。
(9)免疫印迹(western blot)
凝胶的制备和SDS-PAGE电泳
1)凝胶模具的装配：制胶的玻璃板使用前用清水洗干净后，喷上酒精用Kimwipes无 尘纸擦拭干净晾干后用夹子在制胶架上夹好。
2)分离胶的配制。根据蛋白分子量大小配制合适浓度的分离胶，本实验选用6％SDS-PAGE。各试剂配好后应立即混匀，以避免凝胶，试剂混匀后加入到玻璃板夹层中。分 离胶加入到玻璃板后，加入少量异丙醇，封闭分离胶，室温静置30min-1hr使分离胶彻底 凝固。
3)浓缩胶的配制。分离胶凝固后，倒掉异丙醇，并用水将玻璃板中残留的异丙醇清洗干净，加入配制好的浓缩胶，并立即将梳子水平插入到浓缩胶层，室温静置1hr。
4)待浓缩胶凝固后将梳子缓慢垂直取出，将配好的凝胶固定在电泳夹上放入电泳槽中，倒入电泳缓冲液。
5)取定量后的蛋白样品与6×loading Buffer混匀，100℃金属浴煮5min，待 样品冷却后将样品加入到凝胶孔中，留出一孔加入预染Maker。
6)电泳。设定电压至80V运行30min后，调节电压至120V直到溴酚蓝到达分离胶 的底部，停止电压。
7)转膜：将预先剪好的合适大小的NC膜、滤纸和海绵浸泡在转膜缓冲液中，待电泳结束后，将凝胶取出放入到转膜缓冲液中，组装转印夹层，组装顺序(从下往上)：黑面、海绵、2层滤纸、凝胶、NC膜、2层滤纸、海绵、白面。将组装好的夹层组合放入含有转 膜缓冲液的转印槽中，电压100V低温转印60min。
8)膜的封闭：转膜完成后，取出NC膜，用含有5％脱脂奶粉的PBS室温封闭30min。
9)一抗的结合：NC膜封闭完成后用TBST清洗三次，每次3-5min。洗后将配制好的一抗加入到NC膜中，4℃摇床缓慢振荡孵育过夜。
10)二抗的结合：一抗过夜结合后将抗体吸出，并用TBST清洗膜三次，每次3-5min，向洗后的膜中加入配制好的二抗，室温振荡孵育1h。
11)显色：二抗孵育1hr后，吸出，并用TBST洗膜三次，每次3-5min，清洗后在 Li-cor双红外激光显色仪上扫描显色。
5、KSHV颗粒的诱导与纯化
(1)含有KSHV的iSLK-16细胞复苏后传代至T75培养瓶至细胞密度约90％。
(2)向细胞培养上清中加入终浓度为1mM Dox和1mM BuNa处理细胞四天，诱导病毒释放
(3)收取细胞上清，3000rpm室温离心10min，丢掉细胞碎片。
(4)将离心后的上清通过0.45um的滤膜过滤到超离管中，使用转头编号为SW32Ti的Backman离心机24,000rpm 4℃条件下离心2.5hr。
(5)吸掉上清，病毒沉淀用一定体积的DMEM培养基重悬，获取病毒悬液，分装后储存在-80℃长期使用。
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Claims (20)

1.一种筛选抗KSHV/EBV相关肿瘤的小分子化合物的方法，其特征在于，该方法依次包括如下步骤：
(1)建立LANA与SUMO2蛋白互作系统；
(2)利用上述蛋白互作系统，在细胞水平标准化合物筛选；
所述的LANA与SUMO2蛋白互作系统是带标签的LANA1-329(LANA1-329 ΔSIM1+2)与带互补标签的SUMO-2(ΔGG)。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括抗肿瘤作用的验证试验。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，筛选到的化合物以疱疹病毒感染阴性和阳性细胞为试验对象，进行抗疱疹病毒的验证试验。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗疱疹病毒的验证试验是指细胞毒力实验、细胞增殖实验或者靶向性实验的验证。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，筛选到的化合物利用模式动物进行给药试验。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的模式动物是荷瘤的严重联合免疫缺陷型小鼠。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的荷瘤是通过注射疱疹病毒感染阳性的细胞成瘤。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，筛选到的化合物以HCMV AD169病毒感染MRC5为试验对象，进行抗疱疹病毒的验证试验。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用于筛选的化合物具有明确的结构式。
10.一种权利要求1所述的方法筛选到的分子化合物在制备抗疱疹病毒感染相关肿瘤药物中的应用，其特征在于所述分子化合物为二甲基雌二醇、盐酸阿霉素、短杆菌肽、替西罗莫司、Cambogin或者Garcimultiflorones H。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，二甲基雌二醇、盐酸阿霉素、短杆菌肽、替西罗莫司、Cambogin或者Garcimultiflorones H是药物的活性成分。
12.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的疱疹病毒是γ亚科疱疹病毒。
13.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的疱疹病毒是KSHV或者EBV。
14.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的抗疱疹病毒药物是抗疱疹病毒潜伏的药物。
15.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的抗疱疹病毒药物是能够抑制疱疹病毒的病毒拷贝数增加的药物。
16.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的抗疱疹病毒药物是抑制疱疹病毒阳性细胞增殖的药物。
17.一种抑制体外疱疹病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括在疱疹病毒感染阳性细胞的培养环境中加入二甲基雌二醇、盐酸阿霉素、短杆菌肽、替西罗莫司、Cambogin或者Garcimultiflorones H。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的疱疹病毒是KSHV或者EBV。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的细胞是肿瘤细胞。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的细胞中含有LANA蛋白的SIM位点。
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