CN116063444A - 抗菌肽CATHPb1协同抗生素在制备抗菌剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗菌肽CATHPb1协同抗生素在抗菌感染中的应用，所述抗菌肽CATHPb1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明中的抗菌肽CATHPb1对临床常用抗生素具有广谱协同抗菌作用，联合使用后杀菌作用迅速，可清除和抑制细菌生物膜，明显延长耐药菌感染小鼠的存活时间。本发明的结果表明，CATHPb1能够显著提高抗生素的杀菌能力，提高抗生素对生物膜的清除和抑制作用，动物实验结果表明，CATHPb1能够提高小鼠耐药菌感染的生存率。CATHPb1在对抗耐药菌感染领域具有广泛的应用前景。

Description

抗菌肽CATHPb1协同抗生素在制备抗菌剂中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及抗菌肽CATHPb1协同抗生素在制备抗菌剂中的应用。
背景技术
抗生素是指由微生物产生的在低浓度下能够抑制或杀死其他微生物的化学物质。抗生素由于具有预防和治疗动物感染性疾病、抗肿瘤、抗病毒、农业杀虫除草的作用，从发现至今在人类健康事业中做出了巨大贡献。但是，随着抗生素在防治疾病中的大量使用，特别是不科学的滥用，细菌耐药性和药物残留等问题日益突出。广泛耐药和全耐药的细菌导致的死亡率正在逐年上升，严重影响人类的生命。因此研发新型高效抗耐药菌感染的新药或新型治疗方案日益重要。
把抗生素联合使用可以有效提高治疗效果。抗生素的联合用药指的是，同时或者先后应用两种或者两种以上的抗生素治疗微生物感染引起的相关疾病，事实证明，合理的联合用药具有增强药物的疗效、减轻药物的毒副作用等优点。但是近些年来，耐多药超级细菌发展很快，甚至最近又出现“全耐药”的鲍曼不动杆菌。抗生素组合对多重耐药菌感染疗效甚微。
抗菌肽是生物体基因编码的一种天然小分子多肽，是生物体免疫系统的一种重要分子，对细菌、真菌、病毒甚至原虫、肿瘤细胞均具有直接的杀灭作用。抗菌肽具有分子量小、结构简单、抗菌活性强、杀菌机制独特、毒性低和不易引起耐药性等优点，因此自发现之日起就被认为是具有极大开发潜力的新一代抗生素。到目前为止，已从不同生物体中发现超过2600多种不同的抗菌肽，而且其数目还在增加。并且随着越来越多的抗生素耐药微生物的出现，使得抗菌肽在医药行业和食品添加剂等领域有良好的应用前景。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种来源于缅甸蟒的天然抗菌肽CATHPb1与抗生素的抗菌组合物，CATHPb1与抗生素具有协同的抗菌作用，以及两者联用对耐药菌感染的动物具有治疗作用，其可在临床上作为抗生素增效剂使用，解决了传统抗生素易产生耐药性等不足之处。
本发明的第一个目的是提供抗菌肽CATHPb1协同抗生素在制备抗菌剂中的应用，其中，抗菌肽CATHPb1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
Lys1-Arg2-Phe3-Lys4-Lys5-Phe6-Phe7-Arg8-Lys9-Ile10-Lys11-Lys12-Gly13-Phe14-Arg15-Lys16-Ile17-Phe18-Lys19-Lys20-Thr21-Lys22-Ile23-Phe24-Ile25-Gly26-Gly27-Thr28-Ile29-Pro30-Ile31。
进一步地，所述抗生素包括喹诺酮类抗生素、碳青霉烯类抗生素、β内酰胺类抗生素、大环内酯类、氨基糖苷类、糖肽类、氯霉素类、多粘菌素类、利福霉素类等。
进一步地，所述抗生素选自环丙沙星、左氧氟沙星、美罗培南、氨苄青霉素、红霉素、庆大霉素、万古霉素、氟苯尼考、新霉素、多粘菌素、利福平或甲氧苄啶。
进一步地，所述的抗菌剂用于抗细菌感染，所述细菌包括革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。
进一步地，所述的革兰氏阳性细菌包括但不限于金黄色葡萄球菌等。
进一步地，所述的革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等。
进一步地，该抗菌剂在抗耐药菌感染中发挥重要作用，尤其是对耐药菌的抑制作用尤为显著。
进一步地，该抗菌剂还可作为抗生物膜药物，优选为抗细菌生物膜药物，可用于协同清除生物膜和/或抑制生物膜形成。
随着抗生素的广泛应用，细菌对抗生素产生的耐药现象日益加重，给临床抗感染治疗带来了极大的挑战。近年来细菌对抗生素的耐药现象日益严重，随着对生物膜研究的深入，发现细菌对抗生素的耐药性不仅与耐药菌株的大量产生有关，亦与致病菌在体内形成生物膜有关。细菌生物膜(Bacterial Biofilm，BF)是细菌在生长过程中为适应生存环境而不可逆地粘附于非生物或生物表面形成的一种与浮游细胞相对应的生长方式，由细菌和自身分泌的胞外基质形成。细菌生物膜的耐药机制不同于浮游菌，有效浓度的抗菌药物能迅速杀死浮游生长的细菌和BF表面的细菌，但对BF深处的细菌却难以有效杀灭，当细菌以BF形式存在时耐药性明显增强，抗生素不能有效清除BF，还可诱导耐药性产生。BF通过多种机制参与耐药形成，如抗菌药物渗透障碍、营养限制、生物膜内外环境不均一、BF特殊的生物膜表型、热休克蛋白、细菌密度感应系统、细胞内蛋白酶、微生物的应激反应等，不同机制间还存在协同作用。因此，微生物生物膜相关感染相比于一般的细菌感染更加复杂难治，生物膜引起的微生物耐药明显增加，有学者认为，约65％的感染与生物膜有关，本发明通过动物实验研究抗菌肽CATHPb1协同抗生素对耐药菌株感染的治疗效果，以及对两者协同清除生物膜的活性测定，发现了一种新的抗耐药菌治疗方式和抗生物膜药物，在抗感染领域有巨大的应用潜力。
进一步地，抗菌肽CATHPb1对上述致病菌的最小抑菌浓度为1.17-37.5μg/mL，协同多种抗生素后发挥作用的最小浓度为0.07-9.38μg/mL。
本发明的第二个目的是提供一种抗菌药物组合物，该组合物中包括抗菌肽CATHPb1和抗生素，抗菌肽CATHPb1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
Lys1-Arg2-Phe3-Lys4-Lys5-Phe6-Phe7-Arg8-Lys9-Ile10-Lys11-Lys12-Gly13-Phe14-Arg15-Lys16-Ile17-Phe18-Lys19-Lys20-Thr21-Lys22-Ile23-Phe24-Ile25-Gly26-Gly27-Thr28-Ile29-Pro30-Ile31。
进一步地，所述抗生素选自环丙沙星、左氧氟沙星、美罗培南、氨苄青霉素、红霉素、庆大霉素、万古霉素、氟苯尼考、新霉素、多粘菌素、利福平或甲氧苄啶。
本发明的第三个目的是提供上述抗菌药物组合物在制备人用或兽用抗菌药物、防腐剂、饲料添加剂或化妆品添加剂等中的应用。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明公开了抗菌肽CATHPb1对临床常用抗生素具有广谱协同作用，协同作用后杀菌作用迅速，提高动物对耐药细菌感染的抵抗力，提高感染动物的存活率，在治疗耐药菌感染领域具有广泛的应用前景。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为CATHPb1协同美罗培南对大肠杆菌的杀菌动力学结果；
图2为CATHPb1和美罗培南对鲍曼不动杆菌ATCC19606已形成生物膜的协同清除作用结果；左图为CATHPb1对美罗培南清除已形成的细菌生物膜的协同作用；右图为美罗培南对CATHPb1清除已形成的细菌生物膜的协同作用；
图3为CATHPb1和美罗培南对鲍曼不动杆菌ATCC19606生物膜形成的协同抑制作用结果；左图为CATHPb1对美罗培南抑制细菌生物膜形成的协同作用；右图为美罗培南对CATHPb1抑制细菌生物膜形成的协同作用；
图4为CATHPb1与美罗培南联合使用对小鼠耐药鲍曼不动杆菌感染的治疗结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1CATHPb1的制备
(1)、用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成来源于爬行类动物缅甸蟒CATHPb1的全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。
(2)、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。
(3)、纯化的CATHPb1用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
本发明的抗菌肽CATHPb1的氨基酸序列为：Lys1-Arg2-Phe3-Lys4-Lys5-Phe6-Phe7-Arg8-Lys9-Ile10-Lys11-Lys12-Gly13-Phe14-Arg15-Lys16-Ile17-Phe18-Lys19-Lys20-Thr21-Lys22-Ile23-Phe24-Ile25-Gly26-Gly27-Thr28-Ile29-Pro30-Ile31。其由31个氨基酸组成，分子量为3800.8Da，等电点为12.33，其中所有氨基酸均为L-型。
实施例2CATHPb1和抗生素对常见致病菌的协同抗菌活性检测
(1)、分别挑取保存于斜面上的试验菌株均匀涂布于营养肉汤固体培养基MH液体培养基(青岛海博生物技术有限公司)平板上，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2mg/mL的CATHPb1样品溶液10μL，于37℃倒置培养18-20小时，观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明样品抗菌活性越强。
(2)、CATHPb1最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration)测定(2倍稀释法)：
选择上步实验中具有抑菌圈的菌株进行MIC测定实验。试验菌株接种到MH液体培养基中，37℃振荡培养到对数生长期，而后用新鲜MH液体培养基将培养至对数生长期的培养液稀释到2×105cfu/mL待用。
按照表1中的稀释方法，在无菌96孔板各孔中预先加入100μL MH液体培养基，然后在第一孔中加入100μL用MH液体培养基稀释到一定浓度的经0.22μm孔滤膜过滤的的CATHPb1样品溶液，混匀后取100μL加入第2孔，依次倍比稀释(参见表1)，自第9孔吸出100μL弃去，第10孔系对照管。
表1稀释方法
Figure BDA0003739257410000061
向各孔中加入已稀释好的菌株培养液100μl，将96孔板放置37℃缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。
(3)CATHPb1与抗生素协同作用的测定。
FICI由棋盘分析确定。选择(1)中具有抑菌圈的菌株进行棋盘法测定实验。试验菌株接种到MH液体培养基中，37℃振荡培养到对数生长期，而后用新鲜MH液体培养基将培养至对数生长期的培养液稀释到5×105cfu/mL。在无菌96孔板各孔中加入90μL细菌稀释液。
按照表1中的稀释方法，在无菌1.5mL Ep管中各孔中预先加入100μLMH液体培养基，然后在第一孔中加入用MH液体培养基稀释到一定浓度的CATHPb1样品溶液和抗生素(美罗培南、环丙沙星、左氧氟沙星、多粘菌素B、氨苄青霉素、氟苯尼考、甲氧苄啶、利福平、新霉素、红霉素和万古霉素)溶液。混匀后取100μL加入第2孔，依次倍比稀释(参见表1)，每孔分别加入对应浓度5μL CATHPb1和抗生素，放置37℃缓慢振荡培养20h。FIC根据以下公式计算：FIC指数＝MICAB/MICA+MICBA/MICB＝FICA+FICB。MICA是化合物A单独的MIC，MICAB是化合物A与化合物B组合的MIC，MICB是化合物B单独的MIC，MICBA是化合物B与化合物A组合的MIC，FICA是化合物A的FIC，FICB是化合物B的FIC。协同作用定义为FIC指数≤0.5。
表2.CATHPb1与抗生素的协同抗菌作用
Figure BDA0003739257410000071
Figure BDA0003739257410000081
由表2可见，CATHPb1对表2中的抗生素均表现出协同抗菌活性，FIC指数值处于≤0.5的范围，表明CATHPb1和实验中所用的抗生素都有协同作用。
实施例3 CATHPb1协同抗生素杀菌效果测定
(1)CATHPb1和美罗培南杀菌速度测定
鲍曼不动杆菌ATCC19606用MH液体培养基(青岛海博生物技术有限公司)在37℃培养12小时，然后用新鲜的MH液体培养基稀释成1×106CFU/mL的菌悬液。将溶解于灭菌的去离子水中的美罗培南、CATHPb1样品加入到细菌悬液中，使美罗培南终浓度为1×MIC，CATHPb1的终浓度为1/2×，1/4×MIC，联合使用组终浓度为1/2×MIC美罗培南+1/2×MICCATHPb1。将加入美罗培南、CATHPb1样品的菌液放置于37℃培养箱中震荡培养，分别在0、15、30、60、120和180分钟取50μL菌液稀释1000倍，然后取50μL稀释的菌液涂布到MH固体培养基平板上，37℃培养箱培养过夜后菌落计数。该实验用美罗培南作为阳性对照，灭菌的去离子水作为阴性对照。
结果如图1所示，美罗培南对鲍曼不动杆菌的杀菌作用速度极慢，CATHPb1杀菌效果略微快于美罗培南组，但是不能杀灭细菌。而CATHPb1与美罗培南联合使用组杀菌速度显著快于CATHPb1和美罗培南单独使用组，表明CATHPb1与美罗培南协同作用能够显著提高杀菌速度。
(2)CATHPb1和美罗培南协同杀菌活性测定。
鲍曼不动杆菌ATCC19606用MH液体培养基(青岛海博生物技术有限公司)在37℃培养12小时，然后用新鲜的MH液体培养基稀释成1×106CFU/mL的菌悬液。将溶解于灭菌的去离子水中的美罗培南、CATHPb1样品加入到细菌悬液中，使美罗培南终浓度为1/16×，1/8×，1/4×，1/2×，1×MIC，CATHPb1的终浓度为1/16×，1/8×，1/4×，1/2×MIC。将加入美罗培南、CATHPb1样品的菌液放置于37℃培养箱中震荡培养，120分钟后取50μL菌液稀释1000倍，然后取50μL稀释的菌液涂布到MH固体培养基平板上，37℃培养箱培养过夜后菌落计数，灭菌的去离子水作为阴性对照。
结果如表3所示，单独使用美罗培南组在1×MIC的浓度不能杀灭细菌，与CATHPb1联合使用后在1/16×MIC的浓度也可以杀灭全部细菌，表明CATHPb1与美罗培南协同作用能够显著提高杀菌活性。
表3 CATHPb1协同美罗培南对鲍曼不动杆菌的杀菌活性
Figure BDA0003739257410000091
实施例4 CATHPb1与抗生素协同清除生物膜活性测定
鲍曼不动杆菌ATCC19606菌株接种到MH液体培养基(青岛海博生物技术有限公司)中，37℃振荡培养到对数生长期，用新鲜MH液体培养基将菌液稀释到1×107CFU/ml备用。96孔板无菌PBS封边，每孔加入100μl稀释后的菌液，于37℃培养箱培养48h。小心去除每个孔的上清液，无菌PBS洗涤3次。每孔加入稀释后的多肽(参见表4)l00μl，5个平行。空白组加入MH l00μl。
表4稀释方法
Figure BDA0003739257410000092
Figure BDA0003739257410000101
于37℃培养箱培养24h。弃上清，用PBS洗涤3次，用50μl甲醇固定15min，于超净台边上吹干。每孔加入结晶紫染液l00μl，静置30min。弃去结晶紫染液，用PBS洗涤3次，吸干。加入200μl无水乙醇溶解结晶紫30min，600nm处测吸光度。结果如图2所示。
由图2可见，抗菌肽CATHPb1具有浓度依赖的清除生物膜活性，而抗生素美罗培南不具有清除生物膜活性，但CATHPb1与美罗培南联合使用具有显著的协同清除生物膜活性，且其协同作用呈浓度依赖性。
实施例5 CATHPb1与抗生素协同抑制生物膜形成活性测定
鲍曼不动杆菌ATCC19606菌株接种到MH液体培养基(青岛海博生物技术有限公司)中，37℃振荡培养到对数生长期，用新鲜MH液体培养基将菌液稀释到2×107CFU/ml备用。96孔板无菌PBS封边，每孔加入50μl稀释后的菌液，加入稀释后的多肽(参见表4)50μl，5个平行。空白组加入MH 50μl。
表5稀释方法
Figure BDA0003739257410000102
于37℃培养箱培养24h。弃上清，用PBS洗涤3次，用50μl甲醇固定15min，于超净台边上吹干。每孔加入结晶紫染液l00μl，静置30min。弃去结晶紫染液，用PBS洗涤3次，吸干。加入200μl无水乙醇溶解结晶紫30min，600nm处测吸光度。结果如图3所示。
由图3可见，抗菌肽CATHPb1具有浓度依赖的抑制生物膜形成活性，而抗生素美罗培南不具有抑制生物膜形成活性，但CATHPb1与美罗培南联合使用具有显著的协同抑制生物膜形成活性，且其协同作用呈浓度依赖性。
实施例6 CATHPb1和美罗培南协同治疗小鼠耐药菌感染的效果研究
以下实施例中所用小鼠购自苏州大学实验动物中心，在实验室适应性喂养1周后，随机分组饲养，每组20条。实验共设6个组：细菌感染组、2.5mg/kg CATHPb1组、5mg/kgCATHPb1组、10mg/kg美罗培南组、2.5mg/kg CATHPb1+10mg/kg美罗培南组、5mg/kg CATHPb1+10mg/kg美罗培南组。
前期利用连续传代法诱导耐美罗培南鲍曼不动杆菌ATCC19606菌株。该耐药菌株用MH液体培养基(青岛海博生物技术有限公司)在37℃培养12小时，用PBS缓冲液洗涤两次并重悬成5×105CFU/mL的菌悬液备用。小鼠腹腔注射稀释好的菌悬液(200μL/只)，注射细菌2小时后用PBS溶解的和抗生素样品。注射结束后小鼠继续喂养108小时，观察活力，计算最终存活率。
结果如图4所示，CATHPb1能够提高美罗培南的抗感染作用。注射2.5mg/kg的CATHPb1和10mg/kg美罗培南能够显著提高细菌感染后小鼠的存活率，可达100％。
综上，本发明以小鼠为实验动物的研究结果表明，CATHPb1能够增强美罗培南对耐药鲍曼不动杆菌的杀菌效果，提高小鼠的存活率。CATHPb1在协同抗生素治疗细菌感染领域具有广泛的应用前景。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Figure BDA0003739257410000121

Claims (10)

1.抗菌肽CATHPb1协同抗生素在制备抗菌剂中的应用，其特征在于：所述抗菌肽CATHPb1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗生素选自环丙沙星、左氧氟沙星、美罗培南、氨苄青霉素、红霉素、庆大霉素、万古霉素、氟苯尼考、新霉素、多粘菌素、利福平或甲氧苄啶。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的抗菌剂用于抗细菌感染。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述细菌包括革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的革兰氏阳性细菌包括金黄色葡萄球菌；所述的革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌或鲍曼不动杆菌。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗菌剂用于抗耐药菌感染。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗菌剂还可作为抗生物膜药物。
8.一种抗菌药物组合物，其特征在于：所述抗菌药物组合物中包括抗菌肽CATHPb1和抗生素，所述抗菌肽CATHPb1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
9.根据权利要求8所述的抗菌药物组合物，其特征在于：所述抗生素选自环丙沙星、左氧氟沙星、美罗培南、氨苄青霉素、红霉素、庆大霉素、万古霉素、氟苯尼考、新霉素、多粘菌素、利福平或甲氧苄啶。
10.权利要求8或9所述的抗菌药物组合物在制备人用或兽用抗菌药物、防腐剂、饲料添加剂或化妆品添加剂中的应用。
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