CN111374169A

CN111374169A - 一种天然抗菌肽As-CATH5在食品防腐保鲜中的应用

Info

Publication number: CN111374169A
Application number: CN201911311020.XA
Authority: CN
Inventors: 王义鹏; 张芬; 韩亚楠; 于海宁; 陈燕
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2020-07-07
Anticipated expiration: 2039-12-18
Also published as: CN111374169B

Abstract

本发明公开了一种天然抗菌肽As‑CATH5在食品防腐保鲜中的应用。本发明中的天然抗菌肽As‑CATH5对常见食品腐败菌具有广谱高效的抗菌作用，杀菌作用迅速，与传统防腐剂对羟基苯甲酸丁酯有较好的协同作用。As‑CATH5与对羟基苯甲酸丁酯联合使用显著抑制腐败菌生长，提高感官评价分数，延长食品贮藏时间。在三文鱼肉、熟肉酱和鲜榨果汁食品贮藏实验中，As‑CATH5显著抑制腐败菌生长，提高感官评价分数，延长食品贮藏时间。在橙汁贮藏实验中，As‑CATH5与对羟基苯甲酸丁酯联合使用，显著抑制腐败菌生长，延长食品贮藏时间，呈现良好的协同效果。此外，As‑CATH5可被胰蛋白酶完全降解，对人体无毒副。As‑CATH5作用作为新型食品防腐剂具有广泛的应用前景。

Description

一种天然抗菌肽As-CATH5在食品防腐保鲜中的应用

技术领域

本发明涉及一种天然抗菌肽As-CATH5在食品防腐保鲜中的应用，属于食品化学技术领域。

背景技术

在食品工业中，腐败微生物是食品生产和保存过程中的重大危害，造成不必要的浪费和巨大的经济损失。腐败微生物会导致食品的物理化学性质改变，从而使食品失去原来的品质、营养价值和组织特性，最终导致不符合食品卫生标准。细菌、霉菌和酵母会导致食品腐败，其中细菌和霉菌最常见。为了抑制腐败微生物的生长，食品工业采用了多种保存方法，包括化学和物理保存技术。但是，食品腐败仍是一个重大问题。

化学防腐剂是过去几十年来在食品工业中广泛使用的最经济，最有效的方法之一。目前已批准可用于食品存储的化学防腐剂有苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐、对羟基苯甲酸酯类、二氧化硫、亚硫酸盐和亚硝酸盐等。然而，化学防腐剂潜在的毒性以及消费者对天然健康食品的需求，越来越迫切地需要从植物、动物和微生物中开发天然化学物质作为新型食品生物防腐剂。

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是一组天然存在的肽，广泛分布于几乎所有类型的多细胞生物中，是宿主先天免疫系统的重要物质，在抵抗微生物入侵的免疫反应中起着关键作用。AMPs可直接作用于几乎所有种类的微生物(包括细菌，真菌，病毒，甚至寄生虫)，发挥抗菌活性。特别对其中一些微生物耐药菌株作用显著。此外，许多AMPs还广泛参与增强和调节宿主的免疫反应，增强宿主对病原微生物的免疫力。因此，AMPs可作为常规抗生素的替代品，在细菌感染性疾病的治疗领域具有巨大的潜在应用价值。抗菌肽作为食品生物防腐剂目前已有相关报道，而且已有一个抗菌肽产品—乳酸链球菌素Nisin作为食品防腐剂在市场上应用多年。但是，目前报道的抗菌肽类生物防腐剂存在两个缺点：首先是抗菌谱窄，只能杀死部分食品腐败菌，如Nisin只对革兰氏阳性腐败菌有效。其次绝大多数抗菌肽稳定性差，容易被食品中的酶类降解，单独作为防腐剂使用无法长期发挥效果。

发明内容

本发明的目的是解决传统化学防腐剂和现有的抗菌肽的不足，本发明提供一种天然抗菌肽As-CATH5在食品防腐保鲜中的应用。As-CATH5对常见食品腐败菌具有广谱高效的抗菌作用，杀菌作用迅速，与传统防腐剂对羟基苯甲酸丁酯有较好的协同作用。As-CATH5与对羟基苯甲酸丁酯联合使用显著抑制腐败菌生长，提高感官评价分数，延长食品贮藏时间。作为新型食品防腐剂具有广泛的应用前景。

本发明的第一个目的是提供一种天然抗菌肽As-CATH5在食品防腐保鲜中的应用。

进一步地，所述的天然抗菌肽As-CATH5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的应用是采用天然抗菌肽As-CATH5抑制或杀灭食品中的腐败菌。

进一步地，所述的腐败菌为琼氏不动杆菌、约翰逊不动杆菌、粪嗜冷杆菌、奇异变形杆菌、草莓假单胞菌、恶臭假单胞菌、沙雷氏菌、多食鞘氨醇杆菌、海藻希瓦氏菌、腐败希瓦氏菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、河流漫游杆菌中的一种或几种。

进一步地，所述的应用还包括采用天然抗菌肽As-CATH5与对羟基苯甲酸丁酯协同作用，抑制或杀灭食品中的腐败菌。

本发明的第二个目的是提供一种包含天然抗菌肽As-CATH5的食品防腐剂。

进一步地，所述的防腐剂中还包括对羟基苯甲酸丁酯。

进一步地，所述防腐剂中，天然抗菌肽As-CATH5与对羟基苯甲酸丁酯质量比为1:0.5～2。

本发明的有益效果是：

本发明中的天然抗菌肽As-CATH5对常见食品腐败菌具有广谱高效的抗菌作用，杀菌作用迅速，与传统防腐剂对羟基苯甲酸丁酯有较好的协同作用。As-CATH5与对羟基苯甲酸丁酯联合使用显著抑制腐败菌生长，提高感官评价分数，延长食品贮藏时间。在三文鱼肉、熟肉酱和鲜榨果汁食品贮藏实验中，As-CATH5显著抑制腐败菌生长，提高感官评价分数，延长食品贮藏时间。在橙汁贮藏实验中，As-CATH5与对羟基苯甲酸丁酯联合使用，显著抑制腐败菌生长，延长食品贮藏时间，呈现良好的协同效果。此外，As-CATH5可被胰蛋白酶完全降解，对人体无毒副作用。As-CATH5作为新型食品防腐剂具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为As-CATH5在生鱼片中的杀菌效果；

图2为As-CATH5在熟肉酱中的杀菌效果；

图3为As-CATH5在鲜榨橙汁中的杀菌效果；

图4为pH值测定结果；

图5为联合使用时在鲜榨橙汁中的杀菌效果；

图6为胰蛋白酶对As-CATH5的降解水平。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：

As-CATH5的制备

(1)、As-CATH5的化学合成方法：用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成As-CATH5的全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。

(2)、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。

(3)、纯化的As-CATH5用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

天然抗菌肽As-CATH5由22个氨基酸组成，分子量2557.1Da,等电点12.03。所述As-CATH5氨基酸序列为：

Thr1Arg2Arg3Lys4Phe5Trp6Lys7Lys8Val9Leu10Asn11Gly12Ala13Leu14Lys15Ile16Ala17Pro18Phe19Leu20Leu21Gly22，其中所有氨基酸均为L-型。

实施例2：

As-CATH5对常见腐败菌的抗菌活性检测：

采用最小抑菌浓度法测定。选择鱼肉分离腐败菌株进行MIC测定实验。试验菌株接种到MH液体培养基(英国OXOID公司)中，37℃振荡培养到对数生长期，而后用新鲜MH液体培养基将培养至对数生长期的菌液稀释到2×10⁵CFU/ml待用。

在无菌96孔板各孔中预先加入100μl LB液体培养基，然后在第一孔中加入100μl用MH液体培养基稀释到一定浓度的经0.22μm孔滤膜过滤的的As-CATH5样品溶液，混匀后取100μl加入第2孔，依次倍比稀释(参见表1)，自第9孔吸出100μl弃去，第10孔系对照管。

表1稀释方法

将96孔板放置37℃缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果如表2所示。

由表2可见，相较于防腐剂对羟基苯甲酸丁酯，As-CATH5对检测的分离腐败菌均表现出更强的抗菌活性。

表2 As-CATH5对腐败菌抗菌活性

实施例3：

As-CATH5杀菌速度测定：

选取四株腐败菌(琼氏不动杆菌、海藻希瓦氏菌、奇异变形杆菌、枯草芽孢杆菌)用MH液体培养基(英国OXOID公司)在37℃培养12小时，然后用新鲜的MH液体培养基稀释成10⁶CFU/ml的菌悬液。将溶解于灭菌的去离子水中的As-CATH5样品加入到菌悬液中，使终浓度为5×MIC。将加入As-CATH5样品的菌液放置于37℃培养箱中震荡培养，分别在0、15、30、60、90、120和180分钟取10μl菌液稀释1000倍，然后取50μl稀释的菌液涂布到MH固体培养基平板上，37℃培养箱培养过夜后菌落计数。该实验用对羟基苯甲酸丁酯作为阳性对照，灭菌的去离子水作为阴性对照。

结果如表3-6所示，As-CATH5对4株腐败菌的杀菌速度极其迅速，在15分钟内即可杀死所有细菌，而阳性对照对羟基苯甲酸丁酯杀菌速度较慢。

表3 As-CATH5对琼氏不动杆菌的杀菌速度

表4 As-CATH5对海藻希瓦氏菌的杀菌速度

表5 As-CATH5对奇异变形杆菌的杀菌速度

表6 As-CATH5对枯草芽孢杆菌的杀菌速度

实施例4：

As-CATH5与对羟基苯甲酸丁酯的协同抗菌效果测定：

采用棋盘微稀释法测定抗菌肽As-CATH5与对羟苯甲酸丁酯的协同作用。将琼氏不动杆菌、海藻希瓦氏菌、奇异变形杆菌、枯草芽孢杆菌在37℃的MH肉汤中培养至指数生长期，再用新鲜的MH稀释至2×10⁶CFU/ml。

As-CATH5在MH培养基连续沿行稀释(50μl)，对羟基苯甲酸丁酯在MH培养基中沿列稀释(50μl)，在96孔板中创建一个11×7矩阵。每孔添加50μl细菌培养液，37℃孵育18h。用微孔板阅读器(Bio-Tek ELX800，美国)测定各孔。确定As-CATH5的FIC，其中FICA为抗菌肽A在单独A组合时的MIC(FICA＝MICA+B/MICA)，FICB为单独B组合时对羟基苯甲酸丁酯的MIC(FICB＝MICA+B/MICB)。FIC指数计算为FICindex＝FICA+FICB。协同作用定义为FICindex≤0.5，无交互作用定义为0.5<FICindex≤4，拮抗作用定义为FICindex>4。

结果如表7所示，除奇异变形杆菌外，As-CATH5与对羟基苯甲酸丁酯对腐败菌菌表现出较强的协同作用。

表7 As-CATH5与对羟基苯甲酸丁酯的协同抗菌效果

实施例5：

As-CATH5在食品基质中的应用：

(1)、As-CATH5在生鱼片中的杀菌效果

从当地超市(中国江苏苏州)购买新鲜生鱼片(4℃)立即进行实验准备。将三文鱼肉切成1cm×0.8cm×0.2cm的小块，用2mg/ml的As-CATH5浸泡20min，沥干后放入无菌离心管，4℃冰箱保存6天。随机选取鱼样本，匀质化，涂于MH琼脂板上，分别于0、3、6天进行微生物菌落测定。阳性对照采用对羟基苯甲酸丁酯。

结果如图1所示，As-CATH5在生鱼片保存过程中并没有起到有效的防腐作用。对照组和As-CATH5的总活菌数在整个贮藏期间无明显差异。与对照组相比，对羟基苯甲酸丁酯明显降低了生鱼片在贮藏期间的细菌总数(P<0.01)。

(2)、As-CATH5在熟肉酱中的杀菌效果

鲜肉生三文鱼在121℃下灭菌30min，加入无菌PBS溶液用组织匀浆机制备成肉酱。加入As-CATH5值肉酱中使其终浓度为200μg/mL。琼氏不动杆菌在MH肉汤中孵育至对数生长期，PBS缓冲液洗涤三次。肉酱中加入菌液使其终浓度为1×10⁴CFU/ml。样品在25℃保存5天，并于每天同一时间取样稀释，涂布MH固体平板进行微生物菌落计数。阳性对照采用对羟基苯甲酸丁酯。

结果如图2所示，在肉酱的保鲜实验中，As-CATH5表现出一定的杀菌作用。与对照组相比，As-CATH5组菌落数在贮藏初期4天内明显减少(P<0.01)。

(3)、As-CATH5在鲜榨橙汁中的杀菌效果

采用榨汁机提取鲜榨橙汁。在橙汁中添加As-CATH5使其终浓度为200μg/mL。样品在25℃中保存5天。并于每天同一时间取样稀释，涂布MH固体平板进行微生物菌落计数。阳性对照采用山梨酸钾和苯甲酸钠。

结果如图3所示，在果汁保鲜实验中，As-CATH5的杀菌作用最强。与对照组相比，As-CATH5在整个5天的贮藏期间显著降低了总活菌数(P<0.01)。

实施例6：

pH值测定：

采用榨汁机提取鲜榨橙汁。在橙汁中添加As-CATH5使其终浓度为200μg/mL。样品在25℃中保存8天。并于每天同一时间使用数字pH计测定样品的pH值。以对羟基苯甲酸丁酯、山梨酸钾、苯甲酸钠为阳性对照。

结果如图4所示，As-CATH5在25℃下贮藏8天，pH值均有轻微下降的趋势。As-CATH5与常规防腐剂处理组间差异无统计学意义(P>0.05)。

实施例7：

感官评价分析：

新鲜生三文鱼切成1cm×0.8cm×0.2cm的小块，用2mg/ml的As-CATH5物浸泡20min，沥干后置于无菌离心管中，25℃保存5天。每天同一时间对生三文鱼进行感官评价。其方法基于先前报道的质量指数法，涉及四个重要的质量参数，包括外观、气味、硬度和整体接受度。随机选取七位有经验的评委根据质量指数法对所有样本进行评分，评分范围为1-5分，其中5分代表最好的质量(表2)，低于3分为不能接受。

结果如表8所示，所有的组在外观、气味、硬度和整体接受度上都随储存时间延长而降低。但PBS组下降较快，第2天感官评分降至3分以下，不能接受。相比之下，As-CATH5组和常规防腐剂组在第2天的感官评分仍高于3。抗菌肽组的得分与传统防腐剂对羟基苯甲酸丁酯、山梨酸钾、苯甲酸钠组非常接近。

表8感官评价结果

实施例8：

As-CATH5与对羟基苯甲酸丁酯协同效果在食品基质中的应用：

采用榨汁机提取鲜榨橙汁。正常实验组在橙汁中分别添加As-CATH5、对羟基苯甲酸丁酯使其终浓度为200μg/mL。协同实验组在橙汁中联合添加As-CATH5、对羟基苯甲酸丁酯使其终浓度都为100μg/mL。样品在25℃中保存5天。并于每天同一时间取样稀释，涂布MH固体平板进行微生物菌落计数。

结果如图5所示，在果汁保鲜实验中，As-CATH5与对羟基苯甲酸联合使用，与PBS组相比显著降低了总活菌数(P<0.01)，而且大大降低了防腐剂的使用量。

实施例9：

蛋白酶降解试验:

采用反相高效液相色谱法测定胰蛋白酶对As-CATH5的降解作用。在PBS缓冲液中制备As-CATH5和胰蛋白酶溶液(Gibco,USA)，最终摩尔比为300:1，分别在37℃下孵育3h和6h。用反相高效液相色谱法(Thermo Scientific Syncronis C18柱，250mm×4.6mm)提取和分析样品，用乙腈/水(含0.1％TFA)线性梯度混合洗脱。

结果如图6所示，As-CATH5被胰蛋白酶逐步降解，逐渐从100％下降为25.56％(3h)，最终降至21.48％(6h)。表明As-CATH5作为新型防腐剂，可在肠道内完全降解，避免了多肽在体内的积累和毒性。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 一种天然抗菌肽As-CATH5在食品防腐保鲜中的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 1

Thr Arg Arg Lys Phe Trp Lys Lys Val Leu Asn Gly Ala Leu Lys Ile

1 5 10 15

Ala Pro Phe Leu Leu Gly

20

Claims

1.一种天然抗菌肽As-CATH5在食品防腐保鲜中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的天然抗菌肽As-CATH5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用是采用天然抗菌肽As-CATH5抑制或杀灭食品中的腐败菌。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用还包括采用天然抗菌肽As-CATH5与对羟基苯甲酸丁酯协同作用，抑制或杀灭食品中的腐败菌。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的腐败菌为琼氏不动杆菌、约翰逊不动杆菌、粪嗜冷杆菌、奇异变形杆菌、草莓假单胞菌、恶臭假单胞菌、沙雷氏菌、多食鞘氨醇杆菌、海藻希瓦氏菌、腐败希瓦氏菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、河流漫游杆菌中的一种或几种。

6.一种包含天然抗菌肽As-CATH5的食品防腐剂。

7.根据权利要求6所述的食品防腐剂，其特征在于，所述的防腐剂中还包括对羟基苯甲酸丁酯。

8.根据权利要求7所述的食品防腐剂，其特征在于，所述的防腐剂中，天然抗菌肽As-CATH5与对羟基苯甲酸丁酯的质量比为1:0.5～2。