CN104031121B - 一种虫草抗菌肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种虫草抗菌肽及其制备方法。该一种虫草抗菌肽，所述虫草抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的一种虫草抗菌肽，其从蛹虫草菌株中分离得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；经过抗菌实验测定，其对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有抑菌作用，体现出了抑菌活性，实现了从蛹虫草中获取具有抑菌活性的抗菌肽的技术效果，进而可进行全面的推广应用。

Description

一种虫草抗菌肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种虫草抗菌肽及其制备方法。

背景技术

抗菌肽是生物体免疫系统为抵御外源性病原微生物入侵而产生的一类多肽物质，是先天免疫的重要组成成分。目前，在抗菌肽数据库(Antimicrobial Peptide Database，APD)中已经有2353条抗菌肽，其中有215个细菌素，305个植物抗菌肽，12个真菌抗菌肽和1773个动物宿主防御肽。

由于抗菌肽能够抑制革兰氏阳性和阴性细菌、真菌、病毒及寄生物等。此外，抗菌肽还对免疫系统具有调控作用。相比传统抗生素抗菌肽具有抗菌谱广、热稳定性好、杀菌快速、作用专一、多样化的应用潜力以及不易产生耐药性等优点。因此，抗菌肽有望成为新型的抗菌药物。目前，已有几种抗菌肽进入临床研究，多种抗菌肽应用于食品保鲜以及饲料添加剂。

抗菌肽的分布极为广泛，在病毒、细菌到植物、昆虫、软体动物、甲壳动物、两栖动物、鱼类、鸟类及哺乳动物等生物中均有发现。具体的，抗菌肽是由基因编码的一类多肽。所有抗菌肽均是由一段包含信号序列的前体翻译后修饰而来。在不同生物体内，分泌抗菌肽的部位不尽相同，抗菌肽的氨基酸组成也相差甚远。根据其氨基酸组成及结构特点，一般将抗菌肽分为以下五种类型：线性阳离子α-螺旋抗菌肽、富含特殊氨基酸的阳离子抗菌肽、含有二硫键的抗菌肽、阴离子抗菌肽、大型蛋白质的片段。α-螺旋型抗菌肽是其中一大类，在自然界广泛存在，它们与细菌细胞膜互作，依静电引力靠近并结合在质膜表面，随之疏水结构域插入质膜中，当抗菌肽达到一定浓度后，通过分子聚集和膜内分子间相互位移破坏细胞膜稳定性，增加膜通透性，形成离子通道，引起去极化；或形成较大通道，使细胞内容物外泄，最终导致细胞死亡。

蛹虫草是药食两用的新资源食品，是唯一实现规模化人工种植的虫草真菌。研究表明，虫草多肽在毫克水平就能发挥作用，安全评价药理和功能检测结果也证明虫草多肽无毒、无副作用、营养价值和生物利用率均极高。因此，以蛹虫草为研究材料，制取虫草多肽，并进行应用是相关领域中的研究热点。

在相关技术中，通常利用碱性蛋白酶水解蛹虫草子座热水浸提虫草素后的剩余物；再通过电泳进行分离纯化，获得分子量在3180～5620之间的多肽混合物。这些多肽混合物虽具有一定的清除自由基、抗脂质过氧化的能力；但是，均不能体现出抑菌活性。进而严重了限制了其推广应用。

综上，以蛹虫草为了来源，制取一种具有抑菌活性的虫草抗菌肽是本领域亟待解决的一个技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种虫草抗菌肽及其制备方法，以解决上述的问题。

在本发明的实施例中提供了一种虫草抗菌肽，其从蛹虫草菌株中分离得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；经过抗菌实验测定，其对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有抑菌作用，体现出了抑菌活性，实现了从蛹虫草中获取具有抑菌活性的抗菌肽的技术效果，进而可进行全面的推广应用。

本发明的实施例中提供的这种虫草抗菌肽的制备方法具体包括以下步骤：

步骤A：将蛹虫草菌株斜面菌种接入到萨氏琼脂改良固体培养基中，培养至产生斜面孢子；利用无菌水将得到的所述斜面孢子洗下，并转接到三角瓶中，振荡培养，得到孢子悬液；

步骤B：将所述孢子悬液转接到萨氏液体培养基中，恒温振荡培养之后静置、过滤，得到菌丝体；

步骤C：将所述菌丝体烘干至粉末状后加入蒸馏水，提取过夜后过滤，得到滤液；

步骤D：将所述滤液进行旋转蒸发浓缩，并同时加入饱和硫酸铵溶液，静置后离心，得到第一浓缩液，在所述第一浓缩液中再次加入饱和硫酸铵溶液，得到预定饱和度的第二浓缩液，将所述第二浓缩液离心，得到沉淀样品，在所述沉淀样品中加入蒸馏水进行溶解，得到样品溶解液；将所述样品溶解液利用蒸馏水透析后冷冻干燥，得到粗蛋白样品；

步骤E：将所述粗蛋白样品利用CM-52阳离子交换柱进行洗脱，得到洗脱组份，再将洗脱组份透析后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到14KD的蛋白质条带；

步骤F:切下所述蛋白质条带，并进行液质联用质谱检测，得到质谱数据，并进行分析，得到虫草抗菌肽及其序列。

通过发明实施例提供的这种制备方法可实现以蛹虫草菌株为来源，获得具有抑菌活性的虫草抗菌肽。

可选的，在步骤A中：所述萨氏琼脂改良固体培养基，按照重量份数计，其有效组份包括：

麦芽糖4-6份、蛋白胨8-12份、酵母膏4-6份、琼脂18-22份、葡萄糖18-22份、水900-1100份。

可选的，在步骤A中：

所述将蛹虫草菌株斜面菌种接入到萨氏琼脂改良固体培养基中，培养至产生斜面孢子具体包括：

将蛹虫草菌株斜面菌种接入到萨氏琼脂改良固体培养基中，在25℃±1℃培养4-5天。

可选的，在步骤B中：

所述孢子悬液与所述萨氏液体培养基的体积比为1:10；

所述恒温振荡培养的条件为：培养温度为25-27℃，培养时间为4-5天，转速为180-220r/min；

所述静置的时间为6-12小时。

可选的，在步骤C中，具体包括：称取干燥菌丝体粉末，按质量比为1:8-14的比例加入蒸馏水，并在4℃提取过夜，过滤后，得到所述滤液。

可选的，在步骤D中：

所述将所述第二浓缩液离心，得到沉淀样品具体包括：将所述第二浓缩液静置后在8000r/min的转速下离心18-22分钟，除去上清液，得到所述沉淀样品。

可选的，在步骤E中的所述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中：

浓缩胶的浓度为10-16％、分离胶的浓度为4-5％、染色液为考马斯亮蓝R-250。

附图说明

图1示出了本发明实施例一提供的制备方法的流程图；

图2示出了本发明实施例二提供的制备方法中获得的虫草多肽的质谱数据图。

具体实施方式

在本发明中，虫草抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体的，其氨基酸序列为-M-A-I-T-A-A-K-V-L-E-T-R-；其命名为cordyampin-2。分子式为C₅₆H₁₀₂N₁₆O₁₇S₁，分子量为1303.59，为a-螺旋结构，疏水率30％，静电荷为+1，90℃时稳定。

下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明提供的这种虫草抗菌肽的制备方法做进一步的详细描述。

实施例一

在本发明的实施例中提供了一种虫草抗菌肽的制备方法，包括以下步骤，请参考图1：

步骤101：将蛹虫草菌株斜面菌种接入到萨氏琼脂改良固体培养基中，培养至产生斜面孢子；利用无菌水将得到的所述斜面孢子洗下，并转接到三角瓶中，振荡培养，得到孢子悬液；

在步骤101中，通过萨氏琼脂改良固体培养基的培养，蛹虫草菌株斜面菌种会生长至产生大量的斜面孢子，然后再利用无菌水即可将斜面孢子洗下，在进行振荡培养，即可得到孢子悬液，备用。

步骤102：将所述孢子悬液转接到萨氏液体培养基中，恒温振荡培养之后静置、过滤，得到菌丝体；

得到的孢子悬液通过萨氏液体培养基培养之后，再进行振荡培养后过滤(去除滤液)，即可得到蛹虫草菌种菌丝体，备用。

步骤103：将所述菌丝体烘干至粉末状后加入蒸馏水，提取过夜后过滤，得到滤液。

得到的菌丝体通过烘干之后，需用蒸馏水对其进行溶解(在4℃过夜提取)，过滤取滤液，再进行旋转蒸发浓缩。

步骤104：将所述滤液进行旋转蒸发浓缩，并同时加入饱和硫酸铵溶液，静置后离心，得到第一浓缩液，在所述第一浓缩液中再次加入饱和硫酸铵溶液，得到预定饱和度的第二浓缩液，将所述第二浓缩液离心，得到沉淀样品，在所述沉淀样品中加入蒸馏水进行溶解，得到样品溶解液；将所述样品溶解液利用蒸馏水透析后冷冻干燥，得到粗蛋白样品。

步骤104为通过旋转蒸发浓缩将菌丝体制备成粗蛋白样品的操作，具体的，在加入饱和硫酸铵溶液的过程中，需要缓慢加入，且第一浓缩液具体为浓缩汁饱和度为35％的液体；第二浓缩液为浓缩至饱和度为70％的液体。在得到第一浓缩液的过程中，加入了饱和硫酸铵溶液的滤液需静置6-8小时，然后再在8000r/min离心20min，取上清弃沉淀，获得第一浓缩液。根据上清体积(第一浓缩液)再次加入饱和硫酸铵溶液至70％饱和度，充分搅拌后，4℃冰箱静置过夜，再次离心(8000r/min离心20min)取沉淀，此为35-70％饱和度的硫酸铵沉淀样品。

步骤105：将所述粗蛋白样品利用CM-52阳离子交换柱进行洗脱，得到洗脱组份，再将洗脱组份透析后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到14KD的蛋白质条带。

粗蛋白样品再溶(20mmol/L pH6.0PBS缓冲液)后利用CM-52阳离子交换柱进行洗脱，得到洗脱组份；洗脱组份经过透析(具体为水透析)、冻干(至粉末状)后，再进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓缩胶浓度为4％，分离胶浓度为15％，上样量25微升)，得到14KD的蛋白质条带。

步骤106：切下所述蛋白质条带，并进行液质联用质谱检测，得到质谱数据，并进行分析，得到虫草抗菌肽及其序列。

具体的，在步骤106中，肽段检测的操作可以利用液质联用质谱(tandem high performance liquid chromatography with massspectrometry,LC-MS/MS)检测，获得的质谱数据利用Data Analysis软件标峰后，进行分析，即可获得知晓其序列的虫草抗菌肽。

接下来，为了使得本发明实施例一的制备方法得到更好的应用，本发明还在上述实施例一的基础之上提供了实施例二，实施例二是实施例一的虫草抗菌肽的进一步限定和增加，现做详细的阐述和解释，请参考图1-图2：

实施例二

本实施例的虫草抗菌肽包括以下步骤：

1、将蛹虫草菌株斜面菌种接入到萨氏琼脂改良固体培养基中，培养至产生斜面孢子；利用无菌水将得到的所述斜面孢子洗下，并转接到三角瓶中，振荡培养，得到孢子悬液；

具体的，在该步骤中，所述萨氏琼脂改良固体培养基，按照重量份数计，其有效组份包括：麦芽糖4-6份、蛋白胨8-12份、酵母膏4-6份、琼脂18-22份、葡萄糖18-22份、水900-1100份；更具体的，麦芽糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、琼脂20g、葡萄糖20g、水1000ml，pH自然，121℃，灭菌20min。

在所述将蛹虫草菌株斜面菌种接入到萨氏琼脂改良固体培养基中，培养至产生斜面孢子具体包括：将蛹虫草菌株斜面菌种接入到萨氏琼脂改良固体培养基中，在25℃±1℃培养4-5天。

2、将所述孢子悬液转接到萨氏液体培养基中，恒温振荡培养之后静置、过滤，得到菌丝体。

具体的，步骤2按照以下具体步骤操作：按照10％(v/v)将孢子悬液接种于装有250ml萨氏液体培养基的500ml三角瓶中，26℃，200r/min，恒温振荡培养4d，然后静置培养6-12d。过滤得蛹虫草菌株Cmamp-1菌丝体。

3、将所述菌丝体烘干至粉末状后加入蒸馏水，提取过夜后过滤，得到滤液。

具体的，上述步骤具体按照以下操作进行：将菌丝体在40℃-60℃烘干得到蛹虫草菌株Cmamp-1干菌丝体，然后再称取干燥菌丝体粉末，按质量比为1:8-14的比例加入蒸馏水，并在4℃提取过夜，过滤后，得到滤液。

4、所述滤液进行旋转蒸发浓缩，并同时加入饱和硫酸铵溶液，静置后离心，得到第一浓缩液，在所述第一浓缩液中再次加入饱和硫酸铵溶液，得到预定饱和度的第二浓缩液，将所述第二浓缩液离心，得到沉淀样品，在所述沉淀样品中加入蒸馏水进行溶解，得到样品溶解液；将所述样品溶解液利用蒸馏水透析后冷冻干燥，得到粗蛋白样品。

具体的，上述步骤按照以下操作进行：将滤液进行旋转蒸发浓缩，根据浓缩液体积缓慢加入饱和硫酸铵溶液至35％饱和度，4℃冰箱静置6-8h，8000r/min离心18-22分钟，取上清弃沉淀。根据上清体积再次加入饱和硫酸铵溶液至70％饱和度，充分搅拌后，4℃冰箱静置过夜，再如前法离心(8000r/min离心18-22分钟)取沉淀，此为35-70％饱和度的硫酸铵沉淀样品。加入适量蒸馏水将沉淀重新溶解，装入已预处理的透析袋内，用蒸馏水4℃透析，透析过夜彻底除去硫酸铵离子，冷冻干燥得到粗蛋白样品。

5、将所述粗蛋白样品利用CM-52阳离子交换柱进行洗脱，得到洗脱组份，再将洗脱组份透析后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到14KD的蛋白质条带。

具体的，在改步骤中，具体按照以下操作进行洗脱：冻干的粗蛋白样品用20mmol/L pH6.0PBS缓冲液溶解，上样预先用20mmol/L pH6.0PBS缓冲液平衡好的CM-52阳离子交换柱，流动相是20mmol/LPBS缓冲液，pH6.0，并加入NaCl至浓度梯度为0.1、0.3、0.6、0.9mol/L，流速15ml/h，收集组分。操作前将流动相和样品溶液过滤(0.22um)。组分检测波长280nm，室温进行。从柱子上洗脱得到Cm-01蛋白质组分(即洗脱组份)。将Cm-01蛋白质组分转入透析袋用水透析12h，取出冻干得到Cm-01蛋白质组分冻干样品。

对Cm-01蛋白质组分冻干样品的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作条件具体为：将Cm-01蛋白质组分冻干样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓缩胶浓度为4-5％，分离胶浓度为10-16％，上样量25uL；电泳条件为浓缩胶70V下电泳40min，分离胶电泳4-5h，用考马斯亮蓝R-250染色，甲醇-乙酸为脱色液)，得到约14KD的蛋白质条带；通过上述的洗脱以及电泳操作，即可获得14KD的蛋白质条带(即虫草抗菌肽)。

6、切下所述蛋白质条带，并进行液质联用质谱检测，得到质谱数据，并进行分析，得到虫草抗菌肽及其序列。

具体的，在该步骤中，切下SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳14KD的蛋白质胶条，用液质联用质谱(tandem high performance liquidchromatography with mass spectrometry,LC-MS/MS)检测。检测条件如下：

1、还原烷基化蛋白质消化操作流程

a.将胶点样品加50μL DD.H₂O洗两次，10min/次；

b.加50mM NH₄HCO₃/乙腈＝1：1溶液(考染脱色液)50μL，超声脱色5min或37℃脱色20min，吸干；

c.重复步骤2，直至蓝色褪去；

d.加乙腈50μL脱水至胶粒完全变白，真空抽干10min；

e.加10mM DTT(10μL1M DTT，990μL25mM NH₄HCO₃配制)20μL，56℃水浴1h；

f.冷却到室温后，吸干，快速加55mM IAM(55μL1M IAM，945μL25mM NH₄HCO₃配制)20μL，置于暗室45min；

g.依次用25mM NH₄HCO₃(2X10分钟)、25mM NH₄HCO₃+50％乙腈溶液(2X10分钟)和乙腈洗(10分钟)，乙腈脱水到胶粒完全变白为止，真空抽干10min；

h.将0.1μg/μL的酶储液以25mM NH₄HCO₃稀释10～20倍，每EP管加2～3μL，稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，4℃或冰上放置30min，待溶液被胶块完全吸收，加25mM NH₄HCO₃至总体积10-15μL置37℃，消化过夜；

i.加入1％TFA终止反应，使TFA终浓度为0.1％，振荡混匀，离心，上清液为进样样品。

2、LC-MS/MS鉴定

取10ul进样样品上机进行LC-MS/MS检测，具体仪器型号和参数如下：

液相：prominence nano2D(shimazhu)

柱料：C18，5um，150A(Eprogen)

流速：400nl/min

液相梯度：

A液：100％H₂O，0.1％FA；B液：100％ACN，0.1％FA；

质谱仪器：MicrOTOF-QII(BrukerDaltonics)；

数据采集软件：BrukerDaltonicsmicrOTOFcontrol；

MS/MS扫描范围：50-2200m/z；

碰撞气体：氩气；

毛细管电压：1500V；

干燥气体温度：150℃。

通过上述的检测和数据分析，即可得知所获取的虫草抗菌肽的氨基酸序列及其理化性质。

本发明还提供了一种合成该虫草抗菌肽的方法，具体包括以下步骤：

1、接肽前树脂处理：

①称取100毫克FMOC-Arg(PBF)-2CL-TRT-resin到砂芯过滤反应器中；

②在过滤反应器中加入二氯甲烷浸泡洗涤6次，每次5毫升，过滤除去洗涤的二氯甲烷；

③DMF洗涤5次即可放入仪器反应器中进行接肽反应。

接肽在431A自动合成仪上进行，称取FMOC-Arg(PBF)-2CL-TRT-resin到放入反应器中，然在合成仪中依次加入按照多肽的序列顺序从C端逐渐加入Fmoc-氨基酸，同时要加入相同摩尔的PYBOP试剂和HOBT试剂，每一个氨基酸反应周期时间为40分钟，合成多肽cordyampin-2-M-A-I-T-A-A-K-V-L-E-T-R-。

2、肽链的纯化

先采Waters600E纯化系统确定目标肽-M-A-I-T-A-A-K-V-L-E-T-R-，再使用C18反相柱子，条件为：A相为95％的水(甲醇配比)，B相为95％的甲醇(甲醇配比)，然后各加0.1％的TFA，检测波长：220nm，流速:1mL/min。

在上样品之前先用A相平衡柱子15分钟，然后上样，从A到B溶液梯度洗脱25min，收集多肽cordyampin-2洗脱峰，质谱鉴定纯度为95％将收集的cordyampin-2多肽液经冷冻干燥获得多肽cordyampin-2冻干粉。

通过本发明实施例二的方法获得的虫草抗菌肽具体的抑菌实验例如下所述：

分别将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌液(浓度108CFU/ml)100ul涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板，冰箱静置30min后，将无菌牛津杯置于带菌的平板上，每个牛津杯加100ul不同浓度的多肽cordyampin-2水溶液(虫草抗菌肽)，37℃±0.5℃培养48h。结果发现：多肽cordyampin-2浓度在≥16ug/ml的生长枯草芽孢杆菌平板上有抑菌圈，多肽cordyampin-2浓度在≥8ug/ml的大肠杆菌生长平板上有抑菌圈，多肽cordyampin-2浓度在≥16ug/ml的金黄色葡萄球菌生长平板上有抑菌圈。表明多肽cordyampin-2对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有抑制作用。

通过测定发现：cordyampin-2水溶液(虫草抗菌肽)对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC浓度分别为16ug/ml、8ug/ml、16ug/ml；同样，通过测定发现，cordyampin-2水溶液(虫草抗菌肽)对乳腺癌细胞有抑制作用，最小抑制浓度为5umol/L；另外，通过抑菌试验测定，其对芽孢杆菌胞菌、肺炎双球菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷白杆菌、流感嗜血杆菌以及β溶血性链球菌均具有抑制效果，其MIC浓度分别为8ug/mL、32ug/mL、16ug/mL、32ug/mL和32ug/mL。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种虫草抗菌肽，其特征在于，所述虫草抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种根据权利要求1所述的虫草抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括：

按照SEQ ID NO:1所示的虫草抗菌肽序列的顺序在自动合成仪上进行接肽，从C端逐渐加入Fmoc-氨基酸，同时要加入相同摩尔的PYBOP试剂和HOBT试剂，合成所述虫草抗菌肽并进行肽链纯化，得到虫草抗菌肽。