CN106008677B - 一种抗菌肽se37及其应用 - Google Patents
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Abstract
本专利公开了生物技术领域的一种抗菌肽SE37，其氨基酸序列为：Ser‑Glu‑Thr‑Arg‑Pro‑Val‑Leu‑Asn‑Arg‑Leu‑Phe‑Asp‑Lys‑Ile‑Arg‑Gln‑Val‑Ile‑Arg‑Lys‑Phe‑Glu‑Lys‑Gly‑Ile‑Lys‑Glu‑Lys‑Ser‑Lys‑Arg‑Phe‑Phe‑Asp‑Gly‑Leu‑Leu。通过实验证明本发明抗菌肽不但对大肠杆菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，四种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，而且具有很低的溶血活性，稳定性好，抗菌活性强，具有高效广谱抑菌作用，可作为抗生素替代品使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域的一种多肽，具体涉及一种抗菌肽SE37及其应用。
背景技术
抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是生物体防御外界病原体侵袭时产生的由基因编码、核糖体合成的一类小分子活性多肽，是生物体内先天性防御系统的重要组成成分。AMP作为一种生物活性小分子，普遍具有抗细菌、真菌、病毒、原虫等活性，另外，还可以作为药物传递载体，抗肿瘤剂，免疫调节剂以及信号分子等。
抗生素作为一类重要的临床用药，自被应用以来已拯救了无数人的生命，但近年来，由于药物滥用药物残留和细菌耐药性等问题日益严重，越来越多的国家开始寻求抗生素替代品，而抗菌肽因其独特的生物活性以及不同于传统抗生素的特殊的作用机理，已成为最具潜力的抗生素替代品之一，同时在新型食品、药品、护肤品以及化妆品防腐剂中的应用也越来越广泛，具有良好的发展前景。
抗菌肽的相关研究最早可以追溯到1975年，当时瑞典科学家G.Bomam等在惜古比天才蛹中注入大肠杆菌，之后在其血液淋巴细胞中发现了一种具有抗菌活性的碱性多肽类物质，即抗菌肽Ceropins。经过40几年的研究，目前已从动物、植物、细菌和病毒中发现了超过2500种抗菌肽。
虽然天然抗菌肽具有普遍的优点，但也存在着某些明显的不足。例如，相当一部分天然的抗菌肽抑菌活性较低、稳定性较差、毒性较高，或者导致真核细胞发生溶血等；另外，部分抗菌肽对耐药菌的抑制效果差，不能满足实际应用的要求；而通过对天然抗菌肽进行改造或全新合成得到的人工抗菌肽可以在很大程度上改善以上某些甚至所有缺点，以适应不同应用需求。
发明内容
本发明针对上述存在的技术问题，提供一种抑菌活性强、可有效抑制耐药菌的抗菌肽SE37。以及提供该抗菌肽在抗菌药中的应用范围。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种抗菌肽SE37，所述抗菌肽的氨基酸序列为：Ser-Glu-Thr-Arg-Pro-Val-Leu-Asn-Arg-Leu-Phe-Asp-Lys-Ile-Arg-Gln-Val-Ile-Arg-Lys-Phe-Glu-Lys-Gly-Ile-Lys-Glu-Lys-Ser-Lys-Arg-Phe-Phe-Asp-Gly-Leu-Leu。
本发明的抗菌肽SE37中，S和E是短肽前两个氨基酸的缩写，37是氨基酸数，为本领域的常规命名方法。该抗菌肽SE37不但对大肠杆菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，四种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，而且具有很低的溶血活性，稳定性好，抗菌活性强，具有高效广谱抑菌作用，可作为抗生素替代品使用。
进一步，所述抗菌肽SE37为α螺旋直链多肽，含有37个氨基酸残基，分子量大小为4504.40Da，等电点是11.34。
进一步，所述抗菌肽SE37应用于制备抗菌剂。
进一步，所述抗菌肽SE37应用于制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染的广谱抗菌药物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明技术方案进一步说明：
本发明抗菌肽SE37产品为SEQ ID NO. 1中的氨基酸序列，其序列为：Ser-Glu-Thr-Arg-Pro-Val-Leu-Asn-Arg-Leu-Phe-Asp-Lys-Ile-Arg-Gln-Val-Ile-Arg-Lys-Phe-Glu-Lys-Gly-Ile-Lys-Glu-Lys-Ser-Lys-Arg-Phe-Phe-Asp-Gly-Leu-Leu。
序列特征：序列类型为氨基酸序列，含有37个氨基酸残基（该抗菌肽也可称为抗菌肽SE37），分子量大小为4504.40Da，等电点是11.34，链型为α螺旋直链。
本实施例抗菌肽SE37产品是采用自动多肽合成仪按照常规多肽固相合成，最终得到的抗菌肽SE37经高效液相色谱分析，其纯度≥98%，其具体的合成步骤如下：
1） 树脂溶涨：称取取代度为0.4mmol/g的0.6g 2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，将树脂放入反应管中，加DCM(15ml/g)溶剂，振荡30min。
2） 接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉DCM溶剂，加入3倍树脂物质的量的Fmoc-L-Leu-OH氨基酸，再加入10倍树脂物质的量的DIEA，最后加入少量DMF溶解，振荡1h后，用DMF和DCM交替清洗6遍。
3） 脱保护：加15ml 20%哌啶DMF溶液 (15ml/g)，振荡5min后抽掉哌啶DMF溶液，再加15ml 20%哌啶DMF溶液(15ml/g)，振荡15min。
4） 检测：抽掉哌啶DMF溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃～110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。
5） 第一次清洗：依次用DMF(10ml/g)清洗两次，甲醇(10ml/g)清洗两次，DMF(10ml/g)清洗两次。
6） 缩合：分别加入3倍树脂物质的量的Fmoc-L-Leu-OH氨基酸和HBTU到反应管，用尽量少的DMF溶解，立刻加入10倍树脂物质的量的NMM，反应30min。
7）第二次清洗：依次用DMF(10ml/g)清洗一次，甲醇(10ml/g)清洗两次，DMF(10ml/g)清洗两次。
8） 重复二至六步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。
9） 最后一个氨基酸连接后，脱保护，按照下列方法洗树脂：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干10min。
10） 从树脂上切割多肽：树脂和切割液比例按照10ml/g，恒温振荡120min。（切割液按体积百分数配制，可以为TFA 94%、水2.5%、EDT 2.5%、TIS 1%或者TFA 95%、水2%、EDT2%、TIS 1%）。
11） 吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚层析出来，再用乙醚洗六次，然后常温挥干。即得粗品肽序。
12）用HPLC纯化多肽：
(1) 取粗品肽序200mg放入器皿中，用2-5ml 浓度为50%的乙腈水溶液溶清，可以稍微超声2min。
(2) 用0.45μm滤膜过滤溶解液。
(3) 分析：取3μl用分析级HPLC分析粗品。流动相是水和乙腈，时间30min，梯度洗脱，先将HPLC用起始梯度平衡5min然后进样，起始梯度水95%，乙腈5%，结束比例水5%，乙腈95% ；
(4)制备：将溶解好的样品，做进样准备。制备HPLC平衡10min，起始梯度水95%，乙腈5%，结束梯度水25%，乙腈75% 梯度时间40min。收集从检测器出来的样品。
(5)鉴定：将收集下来的样品，取样进行纯度和MS的鉴定。
13） 将纯化后的溶液冻干，得到成品。
14） 将白色粉末状的多肽，密封包装，-20度保存。
抗菌肽SE37最小抑菌浓度（MIC）的测定：
分别将大肠杆菌（ATCC8739），铜绿假单胞菌(CMCC10104)，金黄色葡萄球菌(ATCC6538)培养对数期，用2×液体MHB培养基稀释至2×105 CFU/ml。在96孔板中依次加入稀释成梯度的抗菌肽母液50μl，向各孔中加入已稀释好的菌液50μl，混匀后于37℃静置培养16小时，震荡后测定600nm处的光吸收值，以100μg/ml氨苄青霉素做阳性对照。结果判定：取检测不到细菌生长的孔作为最小抑菌浓度，结果如表1所示。
表1抗菌肽SE37的抑菌效果
从表1可以看出，SE37对革兰氏阴性和阳性菌都有较好的抑菌效果，其中对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，具有较好的研究开发价值。
本发明产品抗菌肽SE37的溶血活性检测：
1） 采集新鲜的大鼠血液，待静置分层，去除上层血清，加入生理盐水，用吸管轻轻吹散管底的红细胞，1000 rpm离心5 min，用吸管小心吸取上层生理盐水并弃去，直至上清液没有红色。
2） 取底部压实的红细胞2滴，加入2.0ml的等渗PBS重悬红细胞，配置成4%血红细胞悬液。
3） 实验组：加入50μl不同浓度的，用等渗PBS溶解的抗菌肽，然后加入50μl配置好的4%血红细胞悬液。
4） 阳性对照：每一个孔加入50μl纯水，50μl配置好的4%血红细胞悬液。阴性对照：每一个孔加入50μl等渗PBS，50μl配置好的4%血红细胞悬液。
5） 37℃孵育1 h后，1 000 g离心96孔板5 min后，从各孔吸取50μl上清到96孔板中，415 nm波长测定OD值，计算溶血百分比=[(实验孔OD值-阴性孔OD值)/(阳性孔OD值-阴性孔OD值)]×100。
结果表明，在400μM的浓度下，抗菌肽SE37对红细胞的溶血率与阴性对照相当，说明本发明抗菌肽SE37对红细胞的参透脆性可以忽列不计。
本发明产品抗菌肽SE37对临床分离耐药菌株的抑菌活性测定：
采用前面MIC值测定方法，分别测定抗菌肽SE37对四个不同病人分离到的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株的抑菌活性，结果见表2。
表2抗菌肽SE37的对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抑菌效果
从表2可以看出，抗菌肽SE37对不同病人来源的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株都有一定的抑菌效果，具有良好的抗生素替代品药物研究开发价值。
综上所述，本发明抗菌肽产品不产生溶血性，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有较高小的抗菌作用。所以，本发明产品抗菌肽SE37在制备抗感染革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌疾病药物中能够得到较佳的应用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种抗菌肽SE37，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为：Ser-Glu-Thr-Arg-Pro-Val-Leu-Asn-Arg-Leu-Phe-Asp-Lys-Ile-Arg-Gln-Val-Ile-Arg-Lys-Phe-Glu-Lys-Gly-Ile-Lys-Glu-Lys-Ser-Lys-Arg-Phe-Phe-Asp-Gly-Leu-Leu。
2.如权利要求1所述的抗菌肽SE37的应用，其特征在于：所述抗菌肽应用于制备抗菌剂。
3.如权利要求1所述的抗菌肽SE37的应用，其特征在于：所述抗菌肽应用于制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染的广谱抗菌药物。
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