CN112898386B - 一种大黄鱼肌球蛋白重链抗菌肽lcmhc及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大黄鱼肌球蛋白重链抗菌肽LCMHC，其氨基酸序列为GAQLQKKIKELQARI，抗菌肽的分子量为1724道尔顿。本发明抗菌肽，可有效抑制金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等致病性微生物生长，可作为制备预防或抑制金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌感染的药物。本发明为后续进一步研究大黄鱼肌球蛋白重链抗菌肽作为食品防腐剂和防止鱼病的饲料添加剂开发奠定了基础。

Description

一种大黄鱼肌球蛋白重链抗菌肽LCMHC及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大黄鱼肌球蛋白重链抗菌肽LCMHC及其应用。

背景技术

致病性微生物广泛存在于自然界中，其中金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌常存在于食品生产、加工和储运等各个环节中，导致食品污染，从而对人类的健康安全造成威胁。如何利用天然的抗菌剂抑制金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌等致病性微生物在食品生产、加工和储运等各个环节中的存在，是我们亟待研究的主要问题。

抗菌肽（AMPs）是当生物受到微生物侵入后机体迅速产生的高效、广谱的天然抗菌活性物质，广泛存在植物、动物、昆虫、细菌等不同类型生物体中，具有安全性高、抑菌效果好等特点。与传统的抗生素不同，天然的抗菌肽不会对人体产生危害，并且在体内性质稳定，对真核细胞无毒，但对原核细胞杀伤力大，因此，可以广泛的应用在食品工业中。

大黄鱼（Larimichthys crocea）是我国重要的海水经济鱼类，是我国海水箱单品养殖产量最高的鱼种之一，其中鱼体内部蛋白质含量高，富含多种微量元素。肌球蛋白重链（myosin heavy chain）是肌球蛋白的基本组成单位，在保证肌细胞正常工作中发挥着重要的作用。大黄鱼肌球蛋白重链属肌肉纤维蛋白，在大黄鱼体内主要是保持肌肉各项功能，并无抑菌作用。本研究首次发现了大黄鱼肌球蛋白重链中的抗菌序列，可为大黄鱼或其它鱼类的肌球蛋白中寻找抗菌肽提供技术参考。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种大黄鱼肌球蛋白重链抗菌肽LCMHC及其应用，解决了上述背景技术中的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：提供了一种大黄鱼肌球蛋白重链抗菌肽LCMHC，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：

GAQLQKKIKELQARI

所述肌球蛋白重链抗菌肽LCMHC的分子量为1724道尔顿，所带电荷为+3，总疏水性比为40%，通过APD3预测该肽可能形成α螺旋，并且在同一疏水表面上可能至少具有3个残基。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：提供了一种大黄鱼肌球蛋白重链抗菌肽LCMHC在制备抗菌药物中的应用，该抗菌药物用于抑制和/或杀灭金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌中的一种或多种。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：提供了一种抗菌药物，其有效成分包括大黄鱼肌球蛋白重链抗菌肽LCMHC，所述抗菌肽LCMHC的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

在本发明一较佳实施例中，所述抗菌药物的有效成分为大黄鱼肌球蛋白重链抗菌肽LCMHC，所述抗菌肽LCMHC的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

在本发明一较佳实施例中，所述抗菌药物用于抑制和/或杀灭金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌中的一种或多种。

本发明首先利用ProtParam EXPASY和HeliQuest两个在线服务器对大黄鱼肌球蛋白序列筛选和计算，然后通过I-TASSER服务器对大黄鱼肌球蛋白重链结构进行预测，发现了对金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌具有很强抗菌作用的抗菌肽序列GAQLQKKIKELQARI，命名LCMHC，分子量为1724道尔顿，所带电荷为+3，总疏水性比为40%，通过APD3预测该肽可能形成α螺旋，并且在同一疏水表面上可能至少具有3个残基。

抗菌肽可以从至少如下两方面对细菌造成破坏：一方面，破坏细胞膜的同时改变细菌细胞膜的通透性，并抑制细胞膜生成，降低细菌污染食品及加工器具的可能性；另一方面，对细菌的DNA有一定损伤作用，抑制细菌的DNA合成从而导致细菌裂解死亡。

本发明的抗菌肽可以采用本领域技术人员已知的方法合成，例如固相合成，并采用本领域技术人员已知的方法进行纯化，例如高效液相色谱法。

实施本发明，具有如下有益效果：

本发明以大黄鱼肌球蛋白重链为研究对象，并通过筛选和计算，发现一个全新氨基酸序列的多肽LCMHC。研究LCMHC对副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等细菌的抑菌活性；并利用透射电镜观察LCMHC对其破坏程度；同时提起副溶血性弧菌的基因组DNA，验证其对副溶血性弧菌的DNA的影响作用。实验结果表明，该肽对副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等细菌具有明显抑制作用，并且在低强度超声的作用下，对副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等致病性微生物产生了更加强烈的抑制效果，说明LCMHC在一定条件下可以与超声发生抑菌协同作用。

它的抑菌机理是首先协同低强度超声的声穿孔作用，然后破坏细菌的细胞膜，促使抗菌肽快速通过细胞膜进入细菌细胞，同时它对细菌的基因组DNA造成损伤，影响细菌的生长繁殖。

附图说明

图1为抗菌肽LCMHC结构示意图。

图2为抗菌肽LCMHC对副溶血弧菌最低抑制浓度（MIC）；

A：LCMHC（250μg/mL）；B：超声结合LCMHC（250μg/mL）；

C：LCMHC（125μg/mL）；D：超声结合LCMHC（125μg/mL）；

E：LCMHC（62.5μg/mL）；F：超声结合LCMHC（62.5μg/mL）；

G：LCMHC（31.25μg/mL）；H：超声结合LCMHC（31.25μg/mL）。

图3为抗菌肽LCMHC对金黄色葡萄球菌最低抑制浓度（MIC）；

A：LCMHC（250μg/mL）；B：超声结合LCMHC（250μg/mL）；

C：LCMHC（125μg/mL）；D：超声结合LCMHC（125μg/mL）；

E：LCMHC（62.5μg/mL）；F：超声结合LCMHC（62.5μg/mL）；

G：LCMHC（31.25μg/mL）；H：超声结合LCMHC（31.25μg/mL）。

图4为时间杀灭动力学曲线；

（A）副溶血性弧菌时间杀灭动力学曲线；

（B）金黄色葡萄球菌时间杀灭动力学曲线；

（■）空白对照；（●）LCMHC处理；（▲）超声+ LCMHC处理。

图5为副溶血性弧菌透射电镜图；

（A）空白对照组；

（B）肽LCMHC处理的副溶血性弧菌；

（C）超声结合肽LCMHC的副溶血性弧菌。

图6为金黄色葡萄球菌透射电镜图；

（A）空白对照组；

（B）抗菌肽LCMHC处理的金黄色葡萄球菌；

（C）超声结合抗菌肽LCMHC的金黄色葡萄球菌。

图7为不同条件下金黄色葡萄球菌膜通透性变化。

图8为不同条件下抗菌肽LCMHC圆二色谱变化。

图9为不同条件下副溶血性弧菌基因组DNA凝胶电泳图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 抗菌肽的筛选

利用抗菌肽预测在线服务器ProtParam EXPASY和HeliQuest对大黄鱼肌球蛋白重链序列中可能存在的抗菌序列进行预测，并对可能具有抗菌序列的电荷、疏水性和可靠性进行分析，最终筛选出氨基酸序列GAQLQKKIKELQARI化学合成（由北京中科亚光生物科技有限公司合成），并进行抑菌活性验证。

实施例2 最低抑制浓度（MIC）测定

将副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌在37℃培养12 h至对数生长期，在0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液中稀释至10^6-7 CFU/mL。将抗菌肽溶于磷酸盐缓冲中，37℃等体积与菌混合后分别进行孵育、（0.3 W/cm²）超声处理1h。最低抑菌浓度（MIC）是指在37℃孵育过夜后，能够抑制细菌生长的抗菌肽最低浓度。如图2、图3所示，LCMHC孵育对副溶血性弧菌的最低抑菌浓度（MIC）为125μg/mL、LCMHC超声对副溶血性弧菌的最低抑菌浓度（MIC）为62.5μg/mL；LCMHC孵育对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）为125μg/mL、LCMHC超声对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）为31.25μg/mL。

实施例3 TIMEKILL测定

将副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌在37℃培养12 h至对数生长期，在0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液中稀释至10^3-4 CFU/mL。取MIC浓度肽37℃等体积与菌混合后分别进行孵育、（0.3 W/cm²）超声处理，每隔30分钟取样涂平板，37℃培养过夜后记录菌落总数。由结果可知，抗菌肽对副溶血性弧菌及金黄色葡萄球菌均在1 h开始有明显效果；随后继续呈下降趋势，在2.5h趋于平缓；超声和抗菌肽共同作用下，细菌数量减少的更快，因此，超声可以帮助LCMHC缩短杀菌时间，提高杀菌效率（图4）。

实施例4 透射电镜分析

以10^6-7 CFU/mL的细菌在37℃下用2×MIC的LCMHC和超声共同处理2 h，然后在2700 g下离心10 min，用磷酸盐缓冲液（pH 7.2）洗涤两次。用1%的锇酸固定后，用95%乙醇脱水，然后丙酮处理20 min。样品在70℃下烘烤24 h，在铜网格上制备70-90 nm的薄片，然后用柠檬酸铅和乙酸铀酯染色。用H-7650透射电子显微镜观察和捕获超微结构。

用透射电镜观察了抗菌肽LCMHC和超声波对副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌超微结构的影响。对照样品显示组织分布均匀，无渗漏，细胞膜和细胞壁光滑。然而，用超声处理后，细胞膜和细胞壁出现一些模糊和不规则，LCMHC协同超声处理后，副溶血性弧菌完全空泡化，内溶物质流出；而金黄色葡萄球菌也出现了细胞内部组织分布不均匀，内溶物质流出的情况，证实了低强度超声肽LCMHC具有协同杀菌的效果（图5、图6）。

实施例5 LCMHC对细菌细胞膜通透性的影响

为了研究抗菌肽LCMHC对通透性影响，以副溶血性弧菌为例，将细菌置于低浓度的LCMHC下培养，观察其对细胞膜通透性的影响。具体操作如下：通过离心收集金黄色葡萄球菌细胞，再重悬于以乳糖为唯一碳源的M9培养基中，37℃摇床培养至OD600<0.4，然后与不同浓度的等体积LCMHC相应稀释液混合。将混合物加入96孔平底板中，在37℃下分别进行孵育、0.3 W/cm²超声处理1h，然后加入0.5 mg/mL的ONPG混匀后进行摇床培养观察并测定其在（0-8h）的OD420的变化。

单独超声处理对细胞膜通透性也无明显影响；而经抗菌肽LCMHC超声处理后细胞膜通透性有明显增加，如图7所示。膜通透性的增加有助于抗菌物质进入细菌内部，也容易使细胞内物质流出。因此，抗菌肽LCMHC能明显增加金黄色葡萄球菌膜通透性是该肽的一个很好的特征，表明它可以被用作抑菌剂。

实施例6 圆二色谱测定抗菌肽LCMHC二级结构

用Jasco810光谱偏振仪（Jasco，东京）CD在25℃下以100nm/min的扫描速度测定了抗菌肽LCMHC的平均残基摩尔椭圆度。将抗菌肽LCMHC溶于25mM十二烷基硫酸钠（SDS）中，最终浓度为0.20 mg/mL，然后将0.2 mg/mLSDS溶液加到1mm石英比色皿中，用两次扫描从190~2nm扫描其光谱。如图8所示，曲线在190nm处存在正吸收峰，208nm左右和215nm左右存在两处负吸收峰，这是典型的α螺旋结构吸收峰，因此可证实抗菌肽LCMHC具有α螺旋结构。

实施例7 抗菌肽LCMHC与细菌DNA的相互作用

采用DNA凝胶阻滞法研究了抗菌肽LCMHC与副溶血性弧菌基因组DNA的相互作用。将副溶血性弧菌在37℃的50 mL 营养肉汤培养基中培养12 h，用细菌260和280 nm的光密度比（OD260/OD280≥1.90）评价提取的基因组DNA的纯度。接下来，将3μL DNA（100 ng/μL）与连续量的抗菌肽LCMHC在25℃下混合，分别进行静置和（0.3 W/cm²）超声1h，将混合物在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳。使用GelDoc XR凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）在紫外线照射下观察凝胶阻滞，如图9所示。

经超声处理的副溶血性弧菌DNA条带无明显变化，而经抗菌肽LCMHC处理的DNA有轻微暗淡，同时超声结合抗菌肽LCMHC处理的DNA条带完全消失；表明抗菌肽LCMHC对副溶血性弧菌DNA有抑制损伤作用，而超声处理促进了抗菌肽LCMHC与DNA的结合。

序列表

<110> 集美大学

<120> 一种大黄鱼肌球蛋白重链抗菌肽LCMHC及其应用

<130> P68249

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Ala Gln Leu Gln Lys Lys Ile Lys Glu Leu Gln Ala Arg Ile

1 5 10 15

Claims (4)

1.一种大黄鱼肌球蛋白重链抗菌肽LCMHC，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的大黄鱼肌球蛋白重链抗菌肽LCMHC在制备抗菌药物中的应用,其特征在于：所述抗菌药物用于抑制和/或杀灭金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌。

3.一种抗菌药物，其特征在于：其有效成分为大黄鱼肌球蛋白重链抗菌肽LCMHC，所述抗菌肽LCMHC的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

4.如权利要求3所述的一种抗菌药物，其特征在于：所述抗菌药物用于抑制和/或杀灭金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌。

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