JP2005287395A - 魚類分解性能を有する微生物及びそれを用いる魚類分解処理方法ならびにその分解物を含む植物生長促進・改良剤 - Google Patents

Abstract

【課題】植物生長促進・改良剤を魚類の破砕物から製造する。
【解決手段】魚類分解性能を有するブレビバチルス属に属する微生物及びそれを用いて得られる植物生長促進・改良剤に係る。
【選択図】なし

Description

本発明は、魚類分解性能を有する新規な微生物、及びそれを用いて魚類を分解処理する方法に関する。さらに、本発明は、前記分解物を含む植物生長促進・改良剤に関する。

１９８０年代からブラックバス（オオクチバス）、ブルーギル等の外来魚が全国各地で大量に繁殖し、それによって在来種の生態系が崩壊の危機にさらされている。これらの生態系を守るため、各地でこれら外来魚の駆除が行われている。日本最大の淡水湖である琵琶湖を擁する滋賀県では、２００２年１０月より外来魚のリリース禁止条例が可決されるに至っている。

このように、外来魚を捕獲し、処分するという活動が各地で実施されている一方で、捕獲した外来魚の再利用についての検討が進められている。例えば、家畜用飼料として用いる方法、食用とする方法等が提案されている。その中でも、肥料としての用途が脚光を浴びている。すなわち、これら外来魚の破砕物を有機肥料として利用する試みが提案されている。化学肥料は永年の使用によって土中への蓄積が起こり、これにより土中微生物の種類及び量が低減する結果、土壌の悪化を引き起こす。これに対し、有機肥料は、土中微生物にそのような悪影響をもたらすことがなく、良質の土壌を維持することができる。従って、魚類の破砕物を有機肥料として有効に用いることができれば、化学肥料の代替品として土壌環境の改善に寄与できることが期待される。

しかしながら、一般的に魚類の破砕物をそのまま有機肥料として用いる場合には、他の一般的な有機肥料（油粕、鶏糞等）と同様に土中での分解に時間がかかるため、速効性（即効性）に欠けるという問題がある。かかる速効性の問題を改善することができれば、捕獲された魚類の有効利用の促進につながるものの、未だそのような技術は開発されるに至っていない。

従って、本発明の主な目的は、植物生長促進・改良剤を魚類の破砕物から製造することにある。

本発明者は、上記従来技術の問題点に鑑みて鋭意検討を重ねた結果、ブレビバチルス属に属する微生物を魚類に適用することによって上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、下記の魚類分解性能を有する微生物及びそれを用いる魚類分解処理方法ならびにその分解物を含む植物生長促進・改良剤に係る。

１． 魚類分解性能を有するブレビバチルス属に属する微生物。

２． 魚類分解性能を有するＢＧＭ１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９７０９）。

３． 前記項１又は２に記載の微生物を魚類破砕物に作用させることによって魚類分解物を得ることを特徴とする魚類分解処理方法。

４． 魚類破砕物が、スズキ目の魚類の粉砕物である前記項３記載の方法。

５． スズキ目の魚類が、サンフィッシュ科に属する魚の少なくとも１種である前記項４記載の方法。

６． 魚類破砕物に作用させる微生物が、実質的に請求項１又は２の微生物からなる前記項３〜５のいずれかに記載の方法。

７． 前記項３〜６のいずれかに記載の方法によって得られる魚類分解物を含む植物生長促進・改良剤。

８． アブラナ科、バラ科、キク科、ナス科、ウリ科、イネ科又はマメ科の植物の生長促進に用いるための前記項７記載の植物生長促進・改良剤。

９． 植物の根毛密度の増大及び主根の短縮の少なくとも１つを促進する前記項７又は８に記載の植物生長促進・改良剤。

１０． 前記項７〜９のいずれかに記載の植物生長促進・改良剤を植物育成培地に含有させることを特徴とする植物育成方法。

本発明の微生物によれば、ブルーギル、ブラックバス等の魚類を分解できる性能を有するのみならず、その分解によって植物の生長に有用な物質を作り出すことができる。特に、食用に供される植物（野菜、果物等）の生長を促進又は改良することができる。

また、本発明の植物生長促進・改良剤は、有機物であるため、化学肥料のように土壌環境を悪化させるようなことがなく、土中微生物に適した環境を維持することが可能である。

一方、本発明の分解処理方法により、ブルーギル、ブラックバス等の外来魚を廃棄しなくても、農業等に再利用できる。また、食用に供される魚でも、その不要な部分を再利用することができる。このため、本発明は、資源の有効利用の促進にも大いに貢献することができる。

１．ブレビバチルス属に属する微生物
本発明微生物は、魚類分解性能を有するブレビバチルス属（Brevibacillus）に属する微生物である。この微生物は、より具体的には独立行政法人産業技術総合研究所の特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９７０９（通知年月日：平成１６年３月３日）として寄託された新規の菌株である。

この微生物は、例えば滋賀県の琵琶湖産ブルーギルの表皮から採取された菌を後記の実施例で示す処理（スクリーニング）を実施することによって分離することができる。

本発明微生物で分解の対象となる魚類は限定的でなく、例えばスズキ目等をはじめ、各種の魚類に適用することが可能である。これらは、淡水魚又は海水魚のいずれであってもよい。特に、本発明では、体脂肪分の少ない魚類に好適に用いることができる。従って、一般的には、スズキ目の魚類に好適である。スズキ目の魚類としては、例えばブラックバス、ブルーギル、アジ、ウミタナゴ、スズキ、ハゼ、ボラ等が挙げられる。この中でも、特にサンフィッシュ科に属する魚が好適である。特にオオクチバス属又はブルーギル属に属する魚の少なくとも１種がより好ましい。オオクチバス属に属する魚としては、ブラックバス、コクチバス等が挙げられる。ブルーギル属に属する魚としては、例えばブルーギル等を挙げることができる。

また、本発明微生物によって分解できる魚類において、その部位は限定されず、筋肉、内臓、表皮、骨格等のすべてを対象とすることができる。従って、後記に示すように、魚を前処理せずに１匹丸ごと破砕したものを分解処理に用いることができる。また、特定の部位だけを分解処理に供することもできる。従って、本発明微生物は、食用等に用いた後の不要な部分の分解処理にも有効である。
２．魚類の分解方法
本発明の魚類分解方法は、本発明微生物を魚類破砕物に作用させることを特徴とする。

魚類は、その本体を破砕して破砕物として処理する。これによって、より短時間で分解することができる。破砕方法としては限定的でなく、その程度も所望の分解時間等に応じて適宜設定すれば良い。破砕は、例えばミキサー、ニーダー、クラッシャー等の公知の装置を用いて実施することができる。例えば、捕獲された魚類をそのまま又は適当な洗浄を施した後にミキサーに投入し、所定の破砕を行えば良い。破砕の程度は限定的でないが、水に分散又は溶解できる程度に処理することが望ましい。例えば、破砕物がミンチ状となるまで破砕処理することが望ましい。また、本発明では、前記のように、不要な部位（例えば頭部、ウロコ、内臓等）を回収し、これを破砕したものを分解処理の対象とすることもできる。

次いで、破砕物に本発明微生物を作用させる。本発明では、微生物を作用させるに先立って、破砕物を滅菌処理することが好ましい。滅菌処理することによって、本発明微生物による分解作用をより優先的に進行させることができ、より効果的な植物生長促進・改良剤を提供することができる。本発明では、実質的に本発明微生物のみによる分解によって優れた植物生長促進・改良剤を得ることができる。

滅菌処理の方法は限定的でなく、例えば高圧蒸気滅菌（オートクレーブ）等の公知の滅菌方法を採用することができる。また、公知又は市販の滅菌装置を用いて滅菌を行うこともできる。この場合、滅菌処理に先立って、予め破砕物に水を加えることが望ましい。加える水の配合量は、破砕物１００重量部（水を添加する前に含まれていた水分を含む重量をいう。以下同じ。）に対して２０〜１５０重量部程度、好ましくは８０〜１２０重量部とすれば良い。

次いで、破砕物に本発明微生物を作用させて分解処理する。この場合、破砕物と本発明微生物とを混合し、一定時間培養すれば良い。一般的には、破砕物（培地）１００重量部に対して０．５〜１０重量部の本発明微生物を添加（植菌）し、３５〜５５℃程度の温度下（好ましくは５０℃程度）で２４〜７２時間程度培養すれば良い。この場合、攪拌しながら培養することが好ましい。攪拌の程度は、破砕物の固形分濃度等にもよるが、一般的に１００〜１５０ｒｐｍ程度の範囲内で適宜設定することができる。攪拌の度合いはフラスコの形状により異なるが、一般的には攪拌速度を上げて酸素供給を増やすことによって分解を促進することができる。

培養が完了した後、本発明微生物による分解物を回収し、精製することなくそのまま植物生長促進・改良剤の有効成分として使用することができる。ただし、本発明では、必要に応じて精製工程、抽出工程等を実施することを妨げない。
３．植物生長促進・改良剤
本発明の植物生長促進・改良剤は、本発明の微生物を魚類破砕物に作用させることによって得られる魚類分解物を含むことを特徴とする。

本発明分解物は、植物生長促進又は植物生長改良剤に有効な成分として機能する。本発明において、植物の生長を促進するとは、植物体の重量の増加及び外観の形状の拡大を含み、特に食用に供せられる部分（葉、茎、根、塊茎、種子、果実等）を含む。

本発明における植物生長の促進は、特に主根の短縮、根毛密度の増加及び側根の減少の少なくとも１つによって特徴付けられる。ただし、これら特徴に限定されず、他の部分の増殖その他の特徴的な変化も、本発明の生長の概念に包含される。

また、本発明の改良剤としての機能は、例えば根菜類における糖度の増加、外観における色の変化、奇形根の低減化、野菜類の味覚の改善等の各種の改良が包含される。

本発明促進・改良剤では、必要に応じて上記分解物のほか、公知又は市販の肥料に含まれている成分（カリ成分Ｋ₂Ｏ、リン成分Ｐ₂Ｏ₅又は窒素成分Ｎ）を配合することもできる。また、例えばＭｎＳＯ₄、Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇、ＺｎＳＯ₄、ＣｕＳＯ₄、（ＮＨ₄）₆ＭｏＯ₂₄、ＦｅＳＯ₄、Ｎａ₂-ＥＤＴＡ等も添加することができる。これらは無水物又は水和物の形態のいずれであっても良い。さらに、本発明による分解物は、市販の液体肥料等に添加して使用することもできる。

また、本発明促進・改良剤は、必要に応じて水によって希釈することもできる。水を配合する場合には、予め水を添加しておいても良いし、あるいは使用時に水で薄めて用いても良い。

本発明の植物生長促進・改良剤は、実質的にあらゆる種類の植物に適用するこができる。特に食用に供される植物に好適である。例えば、アブラナ科（小松菜、キャベツ、カブ、白菜、水菜、ダイコン等）、バラ科（イチゴ、ビワ等）、キク科（レタス等）、ナス科（トマト、ナス、ジャガイモ等）、ウリ科（キュウリ、カボチャ等）、イネ科（イネ、ムギ等）、マメ科（大豆、小豆、ソラマメ等）等の各種の植物に適用できる。

本発明の植物生長促進・改良剤による効果は、例えばポット栽培試験、農場試験等によって確認することができる。その他にも、試験管を用いる植物生長活性測定法（植物試験管法）を用いれば、より迅速かつ簡便に植物生長促進効果を確認することができる。この方法によれば、試験管中の寒天培地上で植物を生長させるものであるため、植物体を傷つけることなく、根を観察することができる。

本発明の植物生長促進・改良剤により植物を育成する場合には、植物育成培地に本発明促進・改良剤を含有させれば良い。例えば、植物育成培地が土壌である場合には、本発明促進・改良剤を土壌に混入すれば良い。また、水耕栽培の場合には、例えば養液に本発明促進・改良剤を溶解させたり、ロックウールに含浸させれば良い。また、本発明の植物生長促進・改良剤は、元肥又は追肥のいずれの形態でも使用することができる。さらに、他の一般的な肥料（有機肥料又は化学肥料）とともに使用することもできる。

本発明促進・改良剤の使用量は、対象とする植物の種類、土壌の質、栽培方法等に応じて適宜決定することができる。

以下、実施例及び比較例を用いて本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されない。

実施例１
（１）ＢＧＭ１株のスクリーニング
まず、琵琶湖産ブルーギル（大きさ１０〜１５ｃｍ、体重３０〜６０ｇ）を生のまま１匹まるごと滅菌水の中に入れ、十分に攪拌した。その後、懸濁液を滅菌水に希釈し、ＬＢ寒天プレート上に塗布した（ＬＢ寒天プレート：１重量％ペプトン、０．５重量％酵母エキス、０．５重量％ＮａＣｌ、２重量％寒天、ｐＨ７．０）。温度３０℃、３７℃又は５０℃で２４時間培養後、シングルコロニー分離を行った。

次いで、シングルコロニーにした菌株を用い、ブルーギル培地（ミキサーで粉砕したブルーギル１０ｇを１００ｍｌの水に懸濁後、１２１℃で１５分オートクレーブしたもの）に植菌し、それぞれの分離した温度で４８時間振とう培養した（１２０回転）。

培養後、遠心分離（８．０００ｇ×１５分）し、上清にトリクロロ酢酸（終濃度３％）になるように加え、遠心分離（８．０００ｇ×１５分）し、タンパク質を除去した。上清のペプチド・アミノ酸量をニンヒドリン法を用いて分析した。

ニンヒドリン法は、各サンプルにトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を終濃度６ ％（ｖ／ｖ）になるように加え、１０．０００ｇ、１０分で遠心分離した。ＴＣＡ処理後、各画分１ｍｌにニンヒドリン溶液１ｍｌ加え、よく撹拌し、沸騰水中で１５分反応させた。１５分後、５０％エタノール５ｍｌを加え、流水中で冷却した。反応液をＡ５７０ｎｍ（分光光度計）で測定（製品名「ＵＶ−１６０Ａ」島津製作所製）し、チロシンを用いて作成した検量線からペプチド・アミノ酸濃度を算出した。

上記ニンヒドリン溶液は以下のように調製した。すなわち、ニンヒドリン０．８ｇ、ヒドリンダンチン０．１２ｇにメチルセルソルブ３０ｍｌ、４Ｎ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１０ｍｌを加えた。４Ｎ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）は、酢酸ナトリウム三水和物２７２ｇに氷酢酸５０ｍｌ加え、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ５．５に調整し、全量を５００ｍｌとした。

ニンヒドリン法によって分析した結果、ペプチド・アミノ酸を最も多量に生成した菌株を選別した（ＢＧＭ１株）。
（２）菌株の同定
分離した菌株の同定は、菌株の１６ＳリボソームＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ）遺伝子の一部の塩基配列を解析することにより行った。すなわち、各菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の一部をＰＣＲ法により増幅処理したＤＮＡ断片をクローニングして、塩基配列の分析を行った。

１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の中央部分を増幅するプライマーを用いて、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。反応組成を表１に示す。

ＰＣＲ反応の条件は、以下の通り行なった。反応温度９４℃、反応時間５分で処理を行い、変性反応（温度９４℃、１分間）＋アニーリング反応（温度7０℃、１分間）＋伸長反応（温度７２℃、１分間）のサイクルを２サイクル繰返し、反応条件のうちアニーリング反応温度を１℃下げたサイクルを２サイクル繰返し、以後、アニーリング反応温度を１℃づつ下げて、アニーリング反応温度が６１℃になるまで、２サイクルづつ繰り返した。引続き、変性反応（温度９４℃、１分間）＋アニーリング反応（温度６０℃、１分間）＋伸長反応（温度７２℃、１分間）のサイクルを２０サイクル繰り返した。２０サイクル終了後、温度７２℃、３分間インキュベートした。ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ産物の確認を１．５％アガロースゲル電気泳動により行った。

DNA Ligation Kit Ver.2 (TAKARA)を用いて、ＰＣＲ反応にて得られた増幅ＤＮＡ断片とクローニングベクター「pT7Blue T-Vector only (Novagen社製)」の結合反応を行った。次いで、結合反応処理した試料を形質転換用大腸菌Competent High DH5α(TOYOBO)に形質導入操作を行った。選抜薬剤を含有したＬＢ培地の寒天平板培地に形質導入処理した大腸菌を塗布してコロニーを形成させ、インジケータ色素を指標として、目的ＤＮＡ断片が挿入されたベクターを保持する大腸菌菌株を取り出した。

ベクターに目的ＤＮＡ断片が挿入されている事をミニプレップ法にて確認した後に、大腸菌からベクターを回収して、遺伝子配列分析用の試料とした。回収したベクターＤＮＡを鋳型としてpUC-M13（5'-GTTTTCCCAGTCACGACG-3'）（配列番号２）及びT7-Pro（5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'）（配列番号３）の２種類のプライマーを用い、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (PE Biosystems)を使用して、ＤＮＡ配列分析装置で分析する試料を調製した。

調製した試料の塩基配列の分析は、遺伝子配列解析装置ジェネティックアナライザ ABI PRISM 310 （ABI社製品）を用いて行った。前記ＢＧＭ１株の１６ＳｒＲＮＡ領域の中央部分の配列を配列番号１に示す。

解析した１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の配列データとＤＮＡデータベースに収録されている１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列情報との相同検索を行った結果、Brevibacillus borstelensis strain LMG15536と９９．０％の相同性を示し、Brevibacillus borstelensis strain M63とも９９．０％の相同性を示した。これにより、Brevibacillus 属であると同定した。なお、種に関しては、１００％の相同性ではないため、ｓｐ．（スピーシズ）とし、最終的に生化学的同定と併せ、Brevibacillus sp.と同定し、Brevibacillus sp. BGM1と命名した。

また、得られたＢＧＭ１株の菌学的性質を調べた。その表２に示す。

（３）分解処理
ブルーギルと蒸留水を１対１（ブルーギル１００ｇ：蒸留水１００ｍｌ）の割合で混合し、破砕した。その破砕物を用い、１０％（ｗ／ｖ）ブルーギル培地を作製した。このブルーギル培地を各種の菌株を用いて４８時間分解させた。

用いた菌株は、タンパク分解菌であるＨＡ１２株（Bacillus circulans：ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）及びＨＡ１９株（Bacillus stearothermophilus：ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２９）、中性プロテアーゼ欠損株であるBacillus subtilis ＭＴ−２株（研究室保存株）、油脂分解菌であるBurkhorderia cepacia ＤＷ２−１株（研究室保存株）、Burkhorderia cepacia ＤＷ１５−２株（研究室保存株）、ＴＨＬ６株（研究室保存株）及び酵母様真菌ＴＨＬ７株（研究室保存株）、アミラーゼ生産菌であるBacillus subtilis ＹＮ−３５株（研究室保存株）及びBacillus subtilis Ｍｕ−３株（研究室保存株）、そしてブルーギル分解菌の前記スクリーニングによって得られた菌株ＢＧＭ１株を用いた。なお、上記の「研究室保存株」とは、立命館大学理工学部化学生物工学科（滋賀県草津市）に保存されている意である。

また、培養温度は、ＨＡ１２株、ＨＡ１９株及びＢＧＭ１株はそれぞれ５０℃、ＭＴ−２株は３７℃、ＤＷ２−１株、ＤＷ１５−２株、ＴＨＬ６株、ＴＨＬ７株、ＹＮ−３５株及びＭｕ−３株はそれぞれ３０℃とした。分解後、各分解物のペプチド・アミノ酸濃度を測定した。その結果を表３及び図１に示す。

この結果からも明らかなように、高プロテアーゼ生産菌であるＨＡ１２株、ＨＡ１９株及びＢＧＭ１株において高い分解性能が確認された。特に、ＢＧＭ１株は、１０．７１ｍｇ／ｍｌという最も高い値を示した。

また、ＢＧＭ１株による分解物について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＬＰＣ）によるパターンを調べた。比較対照として、根毛形成が報告されているＤＳＰ（Bacillus circulans HA12 による大豆分解物：特開２００３−７３２１０）を用いた。その結果を図２に示す。

なお、カラムは、市販のカラム（製品名「ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷ」（東ソー製）を用い、溶離液は、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた。流速は１ｍｌ／分とした。検出は、紫外検出器により行った。図２中、Ａ：ＤＳＰ、２８０ｎｍ、Ｂ：ブルーギル分解物、２８０ｎｍ、Ｃ：ＤＳＰ、２２０ｎｍ、Ｄ：ブルーギル分解物、２２０ｎｍをそれぞれ示す。

図２の結果より、大豆由来のＤＳＰとブルーギル分解物のＨＰＬＣパターンは異なり、互いに異なるペプチドから構成されていることがわかる。また、ＢＧＭ１株により分解したブルーギル分解産物は、低分子のペプチドまで効率良く分解されていることが確認された。一方、ＢＧＭ１株を用いたブラックバス分解産物のＨＰＬＣパターンも同様に調べたが、ブルーギル分解産物のＨＰＬＣパターンとほぼ同じであった。
（４）試験管アッセイ及び土壌アッセイ
前記（３）で得られた分解物をそれぞれ用いて試験管アッセイ及び土壌アッセイを行った。
＜試験管アッセイ＞
試験管に植物生長培地を１０ｍｌ入れ、オートクレーブ後、滅菌したＤＳＰ又はサンプル（ペプチド・アミノ酸濃度；３０μｇ／ｍｌ）を加えた。この培地は、表４に示す培地組成に対して表５に示す微量栄養素溶液１ｍｌを添加したものを用いた。

培地が固まった後、滅菌した小松菜の種子を１粒入れた。これを植物培養器（製品名「グロースキャビネット」三洋電機製）中にて２５℃、１５，０００ルクスの条件下で１週間生育させた。１週間経過後、生育した小松菜を試験管から取り出し、主根の長さ及び根毛増加（根毛はメチレンブルーで染色して実態顕微鏡で観察）を調べた。その結果を図３及び図４に示す。

これより、ＢＧＭ１株が、主根の長さ２０ｍｍ程度となり、最も主根の短縮効果が高く現れていることがわかる。

また、根毛の増加については、ＨＡ１２株、ＨＡ１９株及びＢＧＭ１株に著しい根毛増加が見られ、ＤＳＰと同様の主根短縮と根毛増加が見られた。
＜土壌アッセイ＞
小松菜の種子を市販の育苗ポット（製品名「ジフィーセブン」（株）サカタのタネ製）に２、３粒蒔き、２５℃、１５，０００ルクスで１週間生育させた。１週間後、間引きし、５００ｍｌのポットに植え替えた（培養土及び赤玉土は市販のものを用いた）。植え替え後はサンプル１００ｍｌ（ペプチド・アミノ酸濃度；３００μｍ／ｍｌ）を加えて３週間生育させ、地上部の重量を測定した。その結果を図５に示す。

図５に示すとおり、ＨＡ１２株とＨＡ１９株による分解物には生長促進効果がほとんど見られなかった。これに対し、ＢＧＭ１株を用いた場合は生長促進効果が認められた。これについては、２つの理由が考えられる。一つは、ＢＧＭ１株がＨＡ１２株やＨＡ１９株よりも分解能が優れているため、無機物の量が増え、植物の生長が早まったこと、二つ目は、ＢＧＭ１株がブルーギル及びブラックバスを分解することにより新たな根毛増殖活性物質を産生したからという考えである。

実施例２
ＢＧＭ１株によるブルーギル分解物（以下「ＤＧＢ」と略記する。）による植物生長促進・改良効果等を調べた。
（１）ダイコンにおけるＤＧＰの植物生長促進・改良効果
前記試験管アッセイによって ＤＧＰにＤＳＰ様の主根短縮、根毛形成促進が認められた。そこで、このＤＧＰの植物生長促進効果について解析した。
＜ＤＧＰの調製＞
１０％（ｗ／ｖ）ブルーギル培地１００ｍｌにＢＧＭ１前培養液を１％植菌し、５０℃で４８時間培養した。
＜植物アッセイ＞
ＤＧＰ又は化学肥料を用い、図６に示す試験区からなる農地でそれぞれダイコン３ヶ月間生育させた。化学肥料は、市販の液体化学肥料（製品名「ハイポネックス」ハイポネックスジャパン製）の１０００倍希釈液を用いた。図６では、５ｍ×１０ｍを１つの試験区とする農地を３区画用い、それぞれ１）化学肥料のみ、２）化学肥料及びＤＧＰ、３）ＤＧＰのみという区分けをした。ＤＧＰ及び化学肥料の投与は、表６に示す組み合わせで行った。

３ヶ月後、ダイコンをすべて収穫し、奇形ダイコンを除く総収量を測定した。ダイコンの葉数、葉重、根長、根径、根重を測定した。ダイコンの測定の仕方を図７に示す。図７に示すように、収穫直後のダイコンの総重量を測定した後、任意に選んだダイコンの根と葉とを切り離し、切り取った葉と根の重量をそれぞれ測定した。このとき、葉数、根長及び根径も測定した。その測定結果を表７に示す。

これより、元肥が化学肥料で追肥がＤＧＰの場合に最終的な個体のサイズが最も大型化していることがわかる。このことから、土壌に栄養源が豊富に存在する場合に、ＤＧＰを与えることが生長促進及び個体の大型化に最も効果的であることがわかる。

また、ダイコンの糖度を糖度測定器「Digital Refractometer DBX-55」ATAGO(株)製を使用して測定した。３連の実験をしてＤＧＰの糖度平均は２．８％、化学肥料を施肥した産物は２．０％、化学肥料とDGPの両方を与えたものは２．５％であった。このように、糖度はＤＧＰを与えた場合のダイコンが最も高い値を示し、実際に食べてみても他のものよりも甘味を強く感じた。しかも、ダイコンの色においてもＤＧＰのみ与えた場合が最も白くなった。このことから、ＤＧＰを用いることが食品価値の高いダイコンを生み出すと考えられる。

さらに、収穫されたダイコンのうち奇形率を調べたところ、ＤＧＰ単独の場合が概して少なかった。これにより、ＤＧＰが奇形率の低減化にも寄与していることがわかる。
（２）ブルーギル分解物による土壌微生物数の変化
土壌ＤＮＡ量から微生物の個体数を導く検量線を用いて土壌中の微生物数を測定した。
＜ＤＮＡ抽出（攪拌法）＞
５０ｍｌ遠心チューブに土壌１．０ｇを取り、ＤＮＡ抽出バッファー８ｍｌを加え、さらに２０％ＳＤＳ１ｍｌを加えて１，０００ｒｐｍ、２５℃で２０分間攪拌した。

次に、遠心分離（６,０００ｇ、２０℃、１０ｍｉｎ）し、上清７００μｌをマイクロチューブに分取した。７００μｌのクロロホルムイソアミルアルコールを加えて混合し、遠心分離（１６,０００ｇ、２０℃、１０ｍｉｎ）を行った。

水層（上層）６００μｌを新しいチューブに回収し、３６０μｌのイソプロパノール（２−プロパノール）を加えて混合した。・遠心分離（１６，０００ｇ、２０℃、１０ｍｉｎ）し、上清を除去した（沈殿回収）。

７０％エタノールを１ｍｌ加え、遠心分離（１６,０００ｇ、２０℃、１０ｍｉｎ）した。

上清を除去し（沈殿回収）、アスピレーターで３０分乾燥させた。
＜ＤＮＡ量の測定＞
ＤＮＡ量の測定にはアガロース電気泳動の写真をKODAK 1D Image Analysis software（KODAK、東京）を用い、エチジウムブロマイドを標識としたＤＮＡバンドの蛍光強度測定を行った。
＜ＤＡＰＩ染色法＞
５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（4,6-diamino-2-phenylindole Dihydrochloride）溶液を調製した。

培養液、土壌懸濁液を菌数が１０⁴〜１０⁶になるように希釈し、希釈液９５０μｌをマイクロチューブに分取した。この希釈液にＤＡＰＩ溶液２５０μｌを加えた（最終濃度：１μｇ／ｍｌ）。さらに２５％グルタルアルデヒド５０μｌを希釈液に加えた（最終濃度：１％）この溶液を攪拌後、遮光して４℃、１〜２日保存した。溶液１ｍｌを０．２μｍのメンブレンフィルターで減圧濾過し、菌体を回収した。フィルターを蛍光顕微鏡下で観察し、菌数を測定した。
＜検量線の作成＞
上記の方法で得られたＤＮＡ量と菌数を比較し、検量線を作成した。その検量線を図８に示す。また、検量線に基づいて土壌微生物の比較をした結果を図９に示す。

これらの結果からも明らかなように、これらの土壌微生物数は１０の９乗オーダーであり、ＤＧＰ単独の場合は化学肥料単独の場合よりも多い土壌微生物が確認された。また、化学肥料＋ＤＧＰでは、化学肥料のみの添加した時に比べておよそ２割の微生物数の増加が見られる。これは、ＤＧＰの添加が微生物数の増加を引き起こしたと考えられる。

実施例３
表８に示す各種の魚のＢＧＭ１分解物について、その植物生長促進・改良効果を調べた。

各魚本体は、ミキサーで粉砕後１０％（ｗ/ｖ）になるよう水を加え滅菌した。その後、１％ＢＧＭ１株を植菌し、５０℃、４８時間、１２０ｒｐｍの条件で分解を行った。分解物は、遠心分離後、上清のペプチド・アミノ酸濃度をニンヒドリン法で測定した。その結果を図１０に示す。この結果、ＢＧＭ１株は、海水魚も分解可能であることが確認された。ただし、この実験では、海水魚より淡水魚の方を効率よく分解する傾向が認められた。

植物生長促進・改良効果について、実施例１（４）と同様にして試験管アッセイを実施した。その結果を図１１及び図１２に示す。

根毛増殖試験結果、アジ分解物（ＢＧＭ１株及びＨＡ１２株）に根毛増殖活性が認められた。この結果から、ＢＧＭ１株等による分解において、淡水魚だけでなく海水魚にも植物生長効果があることがわかる。魚種から判断すると、スズキ目の魚類には共通するタンパク質が存在し、その分解物に根毛増殖効果等があると考えられる。また、微生物に関し、ＢＧＭ１株は魚類分解に適した菌であり、より強い根毛活性を生じさせる特徴を有していることがわかる。

ブルーギル分解物のペプチド・アミノ酸濃度を示すグラフである。 ブルーギル分解物とＤＳＰの各ＨＰＬＣパターンを示す図である。 ブルーギル分解物の生理活性効果（主根短縮効果）を示すグラフである。 ブルーギル分解物の生理活性効果（根毛増加効果）を示すグラフである。 ブルーギル分解物の生長促進効果を示すグラフである。 ダイコン栽培の農地区画を示す図である。 ダイコンの測定方法を示す図である。 微生物−ＤＮＡ量の検量線を示す図である。 ＤＧＰによる土壌微生物の変化を示す図である。 各種魚のＢＧＭ１による分解物のペプチド・アミノ酸濃度を示すグラフである。 サンマ及びアジの分解物による効果（主根長測定結果）を示すグラフである。 サンマ及びアジの分解物の根毛増殖効果を示す図である。

Claims (10)

1. 魚類分解性能を有するブレビバチルス属に属する微生物。
2. 魚類分解性能を有するＢＧＭ１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９７０９）。
3. 請求項１又は２に記載の微生物を魚類破砕物に作用させることによって魚類分解物を得ることを特徴とする魚類分解処理方法。
4. 魚類破砕物が、スズキ目の魚類の粉砕物である請求項３記載の方法。
5. スズキ目の魚類が、サンフィッシュ科に属する魚の少なくとも１種である請求項４記載の方法。
6. 魚類破砕物に作用させる微生物が、実質的に請求項１又は２の微生物からなる請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
7. 請求項３〜６のいずれかに記載の方法によって得られる魚類分解物を含む植物生長促進・改良剤。
8. アブラナ科、バラ科、キク科、ナス科、ウリ科、イネ科又はマメ科の植物の生長促進に用いるための請求項７記載の植物生長促進・改良剤。
9. 植物の根毛密度の増大及び主根の短縮の少なくとも１つを促進する請求項７又は８に記載の植物生長促進・改良剤。
10. 請求項７〜９のいずれかに記載の植物生長促進・改良剤を植物育成培地に含有させることを特徴とする植物育成方法。