JP2018531579A - 害虫を制御するためのｓｎａｐ２５核酸分子 - Google Patents

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Abstract

本開示は、鞘翅目害虫を含む、害虫の標的コード配列及び標的転写非コード配列のRNA干渉介在性阻害を介した、害虫の制御のための核酸分子、及びその使用方法に関する。本開示はまた、害虫の制御に有用な核酸分子を発現するトランスジェニック植物を作製する方法、ならびに当該方法により得られる植物細胞及び植物に関する。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その開示内容がその全体で参照により本明細書に援用される、2015年7月16日に出願された米国仮特許出願第62/193,502号明細書の出願日の利益を主張するものである。
本発明は、概して、害虫（例えば鞘翅目の害虫）を起因とする植物被害を遺伝的に制御することに関する。特定の実施形態において、本発明は、植物防御作用を提供するための、標的コードポリヌクレオチド及び標的非コードポリヌクレオチドの特定に関するものであり、ならびに害虫の細胞内で標的コードポリヌクレオチド及び非コードポリヌクレオチドの発現を転写後に抑制又は阻害するための組み換えＤＮＡ技術の使用に関するものである。
ウェスタンコーンルートワーム（WCR：western corn rootworm）、（Diabrotica virgifera virgifera Leconte）は、北米で最も破壊的なコーンルートワーム種のうちの１種であり、米国中西部のトウモロコシを栽培している地域において特に懸案事項となっている。ノーザンコーンルートワーム（NCR：northern corn rootworm）、（Diabrotica barberi Smith 及び Lawrence）は、WCRとほぼ同じ地域に共に生息する近縁の種である。米国で多大な影響を与えているジアブロティカ（Diabrotica）の関連亜種は他に数種ある：メキシカンコーンルートワーム（MCR：Mexican corn rootworm）（D.D. virgifera zeaeKrysan 及び Smith）；サザンコーンルートワーム（SCR：southern corn rootworm）（D. undecimpunctata howardiBarber）；D.バルテアタ ルコンテ（D. balteata LeConte）；D.ウンデシムプンクタタ・テネラ（D. undecimpunctata tenella）；D.スペシオサ ゲルマール（D. speciosaGermar）；及びジュウイチホシウリハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）。米国農務省は、コーンルートワームによって毎年１０億ドルの収入減が生じていると推測しており、そのうち８億ドルが収穫高の損失、２億ドルが処置のためのコストである。
WCR及びNCRの両方の卵が、夏季に土壌中に産卵される。昆虫は卵期のままで越冬する。卵は楕円形、白色であり、0.004インチ（約0.1ミリ）未満の長さである。幼虫は５月下旬又は６月上旬に孵化し、正確な孵化のタイミングは、温度変化及び位置によって毎年変化する。新たに孵化した幼虫は、0.125インチ（約3.2ミリ）未満の長さの白色の芋虫である。孵化するとすぐに幼虫はトウモロコシの根を食べ始める。コーンルートワームは３つの幼虫齢を経る。数週間、摂食をした後、幼虫は蛹へと脱皮する。コーンルートワームは土壌中で蛹となり、その後、７月と８月に成虫として土壌から出てくる。成虫のルートワームは約0.25インチ（約6.4ミリ）の長さである。
コーンルートワームの幼虫はトウモロコシと、他の数種の草の上で完全に発育する。キンエノコロ（yellow foxtail）の上で育った幼虫はもっと遅くに現れ、トウモロコシの上で育った幼虫よりも、成虫の頭蓋の大きさが小さい。Ellsbury ら (2005) Environ.Entomol.34:627-34. WCRの成虫はトウモロコシの毛、花粉、及び露出した穂先の穀粒を餌とする。もしトウモロコシの生殖組織が現れる前にWCRの成虫が出てきた場合、成虫は葉組織を餌とする場合もあり、そのために植物の生長が遅くなり、さらには、宿主植物が死んでしまう場合もある。しかしながら成虫はすばやく望ましい毛及び花粉へと、それらが利用可能になり次第、移動してしまう。NCRの成虫もまたトウモロコシ植物の生殖組織を餌とするが、対照的にトウモロコシの葉は滅多に食べない。
トウモロコシのルートワーム被害の大部分は幼虫の摂食によるものである。新たに孵化したルートワームはトウモロコシの細根を最初に食べ始め、根端へと潜り込む。幼虫が大きく成長するにつれ、一次根を食べ、そして潜り込む。コーンルートワームが多くなると、幼虫の摂食によって頻繁に、トウモロコシの茎の根本にまで幅広く根の削り込みが生じる。深刻な根の損傷により、水と栄養素を植物へと移送する根の能力が損なわれ、植物の生育が低下し、穀物生産高の低下が生じ、多くの場合、その結果として全生産高の劇的な低下が生じる。また深刻な根の損傷は多くの場合、トウモロコシ植物の倒伏が生じ、そのために収穫がより困難となり、さらには生産高の低下も生じる。また、成虫がトウモロコシの生殖組織を食べることにより、穂先の毛の削り込みが生じる場合もある。もし花粉飛散期間にこの「毛の刈り取り」が充分に深刻なものであった場合、受粉が妨害されてしまう可能性がある。
輪作、化学殺虫剤、バイオ農薬（例えば芽胞形成グラム陽性菌のバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、Bt毒素を発現するトランスジェニック植物、又はそれらの組み合わせによりコーンルートワームの制御が試みられている場合もある。輪作は、農地用途に望ましくない制限をかけるという不利益に悩まされる。さらに、一部のルートワーム種は大豆農地にも産卵するため、トウモロコシと大豆で輪作を行った場合の効果は低くなる。
化学殺虫剤がコーンルートワームの制御の実現に関し、最も信頼されている戦略である。しかしながら、化学殺虫剤の使用は不完全なコーンルートワーム制御戦略である。化学殺虫剤のコストを、殺虫剤の使用にもかかわらず発生し得るルートワーム損害のコストに加えた場合、コーンルートワームにより米国において毎年１０憶ドルを超える損失となる可能性がある。高密度の幼虫、多雨、及び不適切な殺虫剤の塗布はすべて、不十分なコーンルートワームの制御を生じさせる場合がある。さらに、殺虫剤の継続的な使用によって殺虫剤抵抗性のルートワーム株が選択され、ならびに非標的種に対する毒性が原因となり深刻な環境問題が生じる場合がある。
RNA干渉（RNAi）は、内因性の細胞経路を利用するプロセスであり、これによって標的遺伝子のすべて、または適切なサイズの任意の位置に特異的な干渉RNA（iRNA）分子（例えばdsRNA分子など）が、それらにコードされたｍRNAの分解を生じさせる。RNAiを使用し、多くの種及び実験系、例えば、カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）、植物、昆虫胚、及び組織培養の細胞において、遺伝子の「ノックダウン」が行われている。例えば、Fire ら (1998) Nature 391:806-11; Martinezら (2002) Cell 110:563-74; McManus 及び Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-47.を参照のこと。
RNAiは、DICERタンパク質複合体を含む内因性経路を介してmRNAの分解を行う。DICERは長いdsRNA分子を、低分子干渉RNA（siRNA）と名付けられている、およそ20ヌクレオチドの短い断片へと分解する。このsiRNAが、２つの一本鎖RNAの、パッセンジャーストランドとガイドストランドへとほどかれる。パッセンジャーストランドは分解され、ガイドストランドはRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）へと組み込まれる。マイクロリボ核酸（miRNA）は構造的に非常によく似た分子であり、ハイブリダイズされたパッセンジャーストランドとガイドストランドを繋ぐポリヌクレオチド「ループ」を含有する前駆分子から開裂され、RISCへと同様に組み込まれることもできる。ガイドストランドが相補的なmRNA分子に特異的に結合したとき、転写後遺伝子サイレンシングが発生し、RISC複合体の触媒成分であるアルゴノート（Argonaute）による開裂が誘導される。このプロセスは、例えば植物、線形動物、及び一部の昆虫などの一部の真核生物において、siRNA及び／又はmiRNAの初期濃度がわずかであっても、生物体全体で全身に広がることが知られている。
siRNA及び／又はmiRNAに相補的な転写物のみが開裂、及び分解されるため、mRNA発現のノックダウンは配列特異的である。植物においては、数種のDICER遺伝子の機能群が存在する。RNAiの遺伝子サイレンシング効果は数日間持続する。実験条件下では、多数の標的転写物の90％以上の低下が生じ、結果として対応するタンパク質値も低下させられる。昆虫においては、少なくとも２つのDICER遺伝子が存在し、DICER1は、アルゴノート１によるmiRNA誘導性分解を促進する。Lee ら (2004) Cell 117 (1):69-81. DICER2は、アルゴノート２によるsiRNA誘導性分解を促進する。
米国特許第7,612,194号ならびに米国特許出願公開2007/0050860、2010/0192265及び2011/0154545は、ウェスタンコーンルートワーム（D. v. virgifera LeConte）の蛹から単離された9112個の発現配列タグ（EST）配列のライブラリを開示している。米国特許第7,612,194号及び米国特許出願公開2007/0050860において、植物細胞でのアンチセンスRNAの発現のために、その中に開示されているウェスタンコーンルートワーム（D. v. virgifera）液胞型H＋−ATPase（V-ATPase）のいくつかの固有部分配列のうちの１つに相補的な核酸分子をプロモーターに操作可能に連結することについて提唱している。米国特許出願公開2010/0192265は、植物細胞でのアンチセンスRNAの発現のために、未知及び非公開の機能のウェスタンコーンルートワーム（D. v. virgifera）遺伝子の固有部分配列（この部分配列は、C.エレガンス（C. elegans）のC56C10.3遺伝子産物に対し58％同一であると述べられている）に相補的な核酸分子をプロモーターに操作可能に連結することを提唱している。米国特許出願公開2011/0154545は、植物細胞でのアンチセンスRNAの発現のために、ウェスタンコーンルートワーム（D. v. virgifera）のコートマーベータサブユニット遺伝子の２個の固有部分配列に相補的な核酸分子をプロモーターに操作可能に連結することを提唱している。さらに米国特許第7,943,819号は、ウェスタンコーンルートワーム（D. v. virgifera LeConte）の幼虫、蛹、及び切断中腸から単離された906個の発現配列タグ（EST）のライブラリを開示しており、植物細胞での二本鎖RNAの発現のために、ウェスタンコーンルートワーム（D. v. virgifera）の荷電多胞体4b遺伝子の固有部分配列に相補的な核酸分子をプロモーターに操作可能に連結することを提唱している。
米国特許第7,612,194号ならびに米国特許出願公開2007/0050860、2010/0192265及び2011/0154545には、V-ATPaseのいくつかの固有部分配列と機能未知の固有部分配列を除き、RNA干渉のために、その中に列記される９千個超の配列のいずれか特定配列を使用することについて、さらなる提唱は提示されていない。さらに、米国特許第7,612,194号ならびに米国特許出願公開2007/0050860、2010/0192265及び2011/0154545は、dsRNA又はsiRNAとして使用される場合に、コーンルートワーム種において、提示される九千を超える配列のその他のどれが致死的であるか、又は別の点で有用であるかについては何の示唆も提示していない。米国特許第7,943,819号は、荷電多胞体タンパク質4ｂ遺伝子の固有部分配列以外に、その中に列記される九百を超える配列のいずれか固有の配列のRNA干渉のための使用に関し、何も提唱していない。さらに、米国特許第7,943,819号も、dsRNA又はsiRNAとして使用される場合にコーンルートワーム種において、提示される九百を超える配列のその他でどれが致死的であるか、又は別の点で有用であるかについては何の示唆も提示していない。米国特許出願公開2013/040173及びPCT国際特許出願公開WO 2013/169923は、トウモロコシにおけるRNA干渉に関し、 Diabrotica virgifera Snf7遺伝子から誘導された配列の使用を記載している。 （また、Bolognesi ら (2012) PLOS ONE 7(10): e47534. doi:10.1371/journal.pone.0047534にも開示されている)。
コーンルートワームDNA（例えば前述のDNA）に相補的な配列の大多数は、dsRNA又はsiRNAとして使用された際、植物に対し、コーンルートワーム種からの防御作用をもたらさない。例えば、Baum ら (2007) Nature Biotechnology 25:1322-1326において、数種のWCR遺伝子標的のRNAiによる阻害効果が記載されている。これら著者らは、検証した８〜26個の標的遺伝子が、520ng/cm2を超える非常に高いiRNA（例えばdsRNA）濃度でも、鞘翅目害虫に、実験的に有意な死亡率をもたらすことができなかったと報告している。
米国特許第7,612,194号、及び米国特許公開2007/0050860の著者らは、ウェスタンコーンルートワームを標的とする、トウモロコシ植物におけるin plantaRNAiを最初に報告している。Baum ら (2007) Nat.Biotechnol.25(11):1322-6. これらの著者らは、トランスジェニックRNAiトウモロコシ開発に対する、標的遺伝子候補をスクリーニングするための、ハイスループットin vivo食事性RNAiシステムを記載している。290個の遺伝子の初期遺伝子プールのうち、14個のみが、幼虫制御の可能性を示した。最も高い効果のあった二本鎖RNA（dsRNA）のうちの１つは、液胞ATPaseサブユニットA（V-ATPase）を標的としており、対応する内因性mRNAの急速な抑制をもたらし、低濃度のdsRNAで特異的RNAi反応を誘発した。したがって、これらの著者らが、害虫制御ツール候補としてのin plantaRNAiの可能性を最初に報告した一方で、比較的小さな候補遺伝子セットからも有効な標的を先験的に正確に特定することはできなかったことも同時に報告している。
本明細書において、例えば、ウェスタンコーンルートワーム（D. v.virgifera LeConte (WCR)；ノーザンコーンルートワーム（D. barberi Smith 及び Lawrence (NCR)；サザンコーンルートワーム（D. u. howardi Barber (SCR)；メキシカンコーンルートワーム（D. v. zeae Krysan 及び Smith (MCR)；D.バルテアタ ルコンテ（D. balteata LeConte）；D.u.テネラ（D. u. tenella）；ジュウイチウリホシハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）；及びD.スペシオサ ゲルマール（D. speciosa Germar）などの鞘翅目害虫をはじめとする害虫の制御を目的とした核酸分子（例えば、標的遺伝子、DNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、及びhpRNAなど）、及びその使用方法が開示される。特定の例において、害虫の１つ以上の天然核酸の少なくとも一部に対して相補的であり得る例示的な核酸分子が開示される。
これら、及びさらなる例において、天然核酸配列が標的遺伝子であってもよく、その産物は例えば限定されないが、代謝プロセスに関与してもよく、又は幼虫の発達に関与してもよい。一部の例において、標的遺伝子発現の、それに相補的なポリヌクレオチドを含む核酸分子による転写後阻害は、害虫に対し致命的であってもよく、又は害虫の成長及び／又は活性の低下をもたらすものであってもよい。特定の例において、可溶性NSF付着タンパク質受容体（SNARE：soluble NSF attachment protein receptor）の構成要素である、本明細書において例えばsnap25又はsnap25ホモログと呼称されている、シナプトソーム関連タンパク質25kDa（synaptosomal-associated protein 25kDa）を、転写後サイレンシングの標的遺伝子として選択してもよい。特定の例において、転写後阻害に有用な標的遺伝子は、snap25遺伝子であり、本明細書においては、Diabrotica virgifera snap25-1(例えば、配列番号１）、及びD. virgifera snap25-2（例えば、配列番号３）と呼称される遺伝子である。従って、配列番号１、配列番号１の相補配列、配列番号３、配列番号３の相補配列、及び／又は前述のいずれかの断片のポリヌクレオチドを含有する単離核酸分子（例えば、配列番号５〜８）が本明細書に開示される。
また、標的遺伝子産物内のアミノ酸配列に対し少なくとも約85％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸分子が開示される（例えば、snap25遺伝子の産物）。例えば、核酸分子は、配列番号２（D. virgifera SNAP25-1)、配列番号４(D. virgifera SNAP25-2)、及び／又はD. virgifera snap25-1もしくはD. virgifera snap25-2の産物内のアミノ酸配列に対し、少なくとも85％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してもよい。さらに、標的遺伝子産物内のアミノ酸配列に対し少なくとも約85％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの逆相補であるポリヌクレオチドを含有する核酸分子が開示される。
また、例えばsnap25遺伝子などの害虫標的遺伝子のすべて、又は一部に相補的なiRNA（例えば、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA及びhpRNA）分子の製造に使用することができるcDNAポリヌクレオチドが開示される。特定の実施形態において、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA及び／又はhpRNAは、例えば植物又は細菌などの遺伝子改変生物体により、in vitro又はin vivoで製造されてもよい。特定の例において、snap25遺伝子（例えば、配列番号１及び配列番号３）のすべて、又は一部に対し相補的なiRNA分子を製造するために使用することができるcDNA分子が開示される。
さらに、鞘翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための手段、及び植物に対して鞘翅目害虫防御を提供する手段が開示される。鞘翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害する手段は、配列番号８３〜８８、及びそれらの相補配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドからなる一本鎖RNA分子又は二本鎖RNA分子である。鞘翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための手段の機能的均等物としては、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び／又は配列番号８を含有する鞘翅目snap25遺伝子から転写されるRNAのすべて、又は一部に対し実質的に相同な一本鎖RNA分子又は二本鎖RNA分子が挙げられる。鞘翅目害虫防御を植物に提供するための手段は、プロモーターに操作可能に連結された鞘翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための手段をコードするポリヌクレオチドを含有するDNA分子であり、当該DNA分子は、植物ゲノムに組み込まれることができる。
さらに、害虫群（例えば鞘翅目害虫）を制御するための方法が開示され、当該方法は、害虫（例えば鞘翅目害虫）に、害虫により取り込まれると害虫内の生物学的機能を阻害するよう機能する、iRNA（例えば、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA及びhpRNA）分子を提供することを含む。
一部の実施形態において、鞘翅目害虫群を制御するための方法は、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドのすべて又は一部を含有するiRNA分子を鞘翅目害虫に提供することを含む：配列番号８３；配列番号８３の相補配列；配列番号８４；配列番号８４の相補配列；配列番号８５；配列番号８５の相補配列；配列番号８６；配列番号８６の相補配列；配列番号８７；配列番号８７の相補配列；配列番号８８；配列番号８８の相補配列；鞘翅目害虫（例えば、WCR）の天然snap25ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド；鞘翅目害虫の天然snap25ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの相補配列；配列番号１、３、及び５〜８のいずれかのすべて又は一部を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体（例えば、WCR）の天然コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド；及び配列番号１、３、及び５〜８のいずれかのすべて又は一部を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの相補配列。
特定の実施形態において、害虫に取り込まれることで機能し、害虫内の生物学的機能を阻害するiRNAは、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドのすべて又は一部を含有するDNAから転写される：配列番号１；配列番号１の相補配列；配列番号３；配列番号３の相補配列；配列番号５；配列番号５の相補配列；配列番号６；配列番号６の相補配列；配列番号７；配列番号７の相補配列；配列番号８；配列番号８の相補配列；配列番号１、３、及び５〜８のいずれかのすべて又は一部を含有する、ジアブロティカ（Diabrotica）生物体（例えば、WCR）の天然コードポリヌクレオチド；配列番号１、３、及び５〜８のいずれかのすべて又は一部を含有する、ジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの相補配列。
また、本明細書において、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及び／又はhpRNAが、食物をベースとしたアッセイにおいて害虫に提供され得る、又はdsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及び／もしくはhpRNAを発現する遺伝子改変植物細胞において害虫に提供され得る方法が開示される。これらの例、及びさらなる例において、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及び／又はhpRNAは、害虫に摂取されてもよい。本発明のdsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及び／又はhpRNAの摂取によってその後、害虫においてRNAiが生じてもよく、次いで害虫の活性に必須な遺伝子のサイレンシングが生じ、最終的には死がもたらされてもよい。したがって、害虫の制御に有用な例示的ポリヌクレオチドを含有する核酸分子が害虫に提供される方法が開示される。特定の例において、本発明の核酸分子の使用により制御される鞘翅目害虫は、WCR、NCR、又はSCRであってもよい。
前述の、及び他の特性は、添付の図１〜２に関連して進展する以下のいくつかの実施形態の詳細な記述からより明白となる。
図１は、一対のプライマーと一つの転写鋳型からdsRNAを作製するために使用された戦略の描写を含む。 図２は、二つの転写鋳型からdsRNAを作製するために使用された戦略の描写を含む。
配列表
添付の配列表に列記される核酸配列は、37 C.F.R. §1.822に規定されるヌクレオチド塩基に対する標準的な略号を使用して示されている。列記される核酸配列及びアミノ酸配列は、記載される様式で配置されたヌクレオチド及びアミノ酸のモノマーを有する分子（すなわち、それぞれポリヌクレオチド及びポリペプチド）を定義する。列記される核酸配列及びアミノ酸配列はまた、記載される様式で配置されたヌクレオチド及びアミノ酸のモノマーを含有するポリヌクレオチド又はポリペプチドの遺伝子を各々定義する。遺伝子コードの冗長性の考慮し、コード配列を含むヌクレオチド配列は、その参照配列からなるポリヌクレオチドと同じポリペプチドをコードするポリヌクレオチド類も記載していると理解されたい。さらに、アミノ酸配列は、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドORF類も記載していると理解されたい。
各核酸配列の１つの鎖のみが示されているが、提示されている鎖を任意に参照することにより相補鎖も含まれるものと理解される。一次核酸配列の相補配列及び逆相補配列は、当該一次配列により必然的に開示されており、別段の記載が明示されていない限り（又は、当該配列がある文脈から別であることが明らかではないかぎり）、核酸配列の相補配列及び逆相補配列は、当該核酸配列に対する任意の参照により含まれている。さらに、当分野において理解されているように、RNA鎖のヌクレオチド配列は、それが転写されるDNA配列により決定されるものであり（ウラシル（U）核酸塩基がチミン（T）に置き換えられることを除く）、RNA配列は、当該配列をコードするDNA配列に対する任意の参照により含まれる。添付の配列表において：
配列番号１は、本明細書の一部においてWCRsnap25-1とも呼称される、例示的なWCRsnap25DNAを含有するコンティグを示している。
CAAGTTACTAGTGAATCTGTTCTATTTCTTCTCCGTGCTCCACCCTCTTTAGTCCGAAAAAATGCCTGCGCCTGCTGCTGCTGAAAATGGAGCGCCCAGGACGGAACTGCAAGAGCTCCAGCTCAAAGCTGGGCAAGTTACAGATGAGTCCCTGGAAAGCACAAGGCGTATGTTGGCTCTCTGCGAAGAGAGTACCGATGCTGGCACGAAGACATTGGAGATGGTCCACCATCAAGGCGAACAATTGGACCGGATCGAGGATGGAATGGACCAGATCAACACCGATATGCGAGAGGCTGAAAAGAATTTGACTGGAATGGAAAAATGCTGTGGCCTTTGTGTGTTACCATGTCAAAAGGGCTCATCGTTCAAAGAAGACGAAGGAACGTGGAAGGGCAACGACGACGGAAAAGTCGTCAACAACCAACCCCAACGAATGATGGACGATCGGAACGGAATGGGCCCTCAAGGCGGATACATCGGCAGGATCACGAACGACGCGCGAGAGGACGAAATGGAAGAAAACGTCGGCCAAGTCAACACCATGATCGGTAATCTGCGTAACATGGCTATCGATATGGGTTCGGAGTTGGAAAATCAAAATAGGCAAATCGATCGTATCAATCTCAAGGGTGAATCCAACGCGACGAGGATAGAGGTGGCCAACCAGCGGGCACATGACCTTCTCAAGTAGACACAACACACAAAAACACTGAAAAGTTTTTACTTTCTATCATTTTTTGCGATTCCAACTCGTTCCTACTGGGTACTTGAAACAATTAAATATCTATTGCTTTTTTAGCTACTTAATTAGTCAGTGTTCAATAATATATAAATGCTGTTTCGTAACTAACAAAACTAGAATAATCGTCGTGGTGACATAATCATGAAAAGTTTATAAAACATCTATAATTTGGTCCTTTCACGTCATTATTTTCAATTTTACGACGTTTTAGAATGGTTCCTAAGACGGTTAACGTTTTAATAACAAACGTATACTCTGTTTCATTAAACAATCGTTTCTGTAGCTTTAATTGTTATAAATTAGCGATGATGTTACAGGTACCAAAAGGCAGTGTTGCCAATTATTTATCAGTCTGTGTATTAGAAGTAATGAATCATAAGAATCCGGCTCGAAGGACCAAATGCTTATGTAGGAAATATTCTTGAAGAAAATGGTCTTGCTTAGATCTGCCCATTTCGTGGGAACGAACCTATATTTACGTGTAGGCCGATCGAGTGAAAGTTACAAAATTGCGTTCGCATACGTTTTTAAGAGGCGCAATAAATCAGATAAAGTATCAAGAGGTTGTGTGTCAAAATAGCAGTATTACCAATTACTAATTAGTCTTTGTGCTAGTATTTGAGTTGGCATACACTGTTGTGTGGAAAACTGAACAATACGCTATTCATTTGAAGAACTGCTTCAAATAATAGCAAATAATAGAAGTATAGATCGGAGAAACACCGTAAAAAATCGGGCAAAAAGTTGCTTTATATAAAAATTCAATGAACGAGGAAGTTTATCATTAAGTGGACTTTGGAAGAGAACTGGAAGGAAACTGTTCAGTCAGTCACGAAGTTATATGTGATAATAAATGTTTAATCTTTAAATTTGAAAACAAAACCGCCAATTTAATGATAGAGATCATAAAGGATCTTAAATACTACGAAAAAAATTGTCAGTTCTATCGAGTAAGTTTCAGTTTGATTTCATTTGCCTTATTTATGGCCCTATTTGGAAATGTAAGCGTTAATGCCCATTGCCCATTGCCCATGCCATTTTCATGGTAAATACTATTTAAATTAGTAGCATTGTAGTTTATGTTGGTATATTGTATGAAAAAATCAAATTTATTACTATTTTATAACTAAAAAGCTATAGAAACGACGAATATTATTATCAGAGGTAAATGCAACGATTCAAAGAAGGCAAAAAGTTAGGTTAAGATACCTGTCACTGATATTATAACCAGAATCTCTTGGTCGTTTGTTAATTATACTTAAATCATTGTTCCACGTTGTTAAAGGCACATAAAGAGTAAGTATCTTCGACCAAAGTTATCAGAACTCTTCTATCTTTCATAATATATCTTAGCAATAACAGCTTCAACGTGAAAGGATCAACTAATATTCCACATATTGTGTACATAAAAAACACTGATTATTTTACAATAATATTGAGCTCTCACTGCAACAGTTGTTGTTCTTTGGTTTGAATTGTTTTGTAGAATTTTCGAACACGTTCACTGCCAGTGTGTATCGAAAACGCACTTGAAAACTCGGGTAACAATTATCTGATGCTAGGTGATTGGTTATCACATAATCAGCAGTGAACATGAGAGTTGTTGATAAAAAAACCAAATAAAAATAAATGCCTCAAATCTTTTTTTTTTTCAAGAGAACAAATTTAAAACTAAACTTCAGAAACTCTACCTTCTTGTTCGGTGACGAAATTTACGCATATAATCTGCCTTTTTTCCAGTATTGTCGCCAATATTAAGGCAGTCGTCTTATCATACAAGTTTTTTTGGTCTTTTTGGCGTTACCTTCGACTTAGTGATGATAATAAGCTATTCAAATTTAAAAACAGATTTTAGTCACTGGGTGCTAGATCGGGACATTTCAACGGTTTTGATGATTTCTTTATAATCCTAAATTTTGAATTTTTCCAGTTGCACTGAGACATTAGATACTATACATCTTTTTGTTTGTACTTTTACATTAAACAATACTTACTACAGATTGATTATGTCACCATGACAGTACTTGAACAAACGCTATTCAATTTTTATATTTAGAAAGAGTATAAAGTTGAGGGACCAGGTTGAAAGGTACAGTGTTGAATAGTATAACAGCCGCATGATTGAATTTTATCTGTAAATATTACTTTAATTAATTATGGCGCTAGATTTTTGTTCTGTTTGTTTTCTATTAATAAATATTTAAATTTTATACCGATGTTTAATTTGGTAGGTCTAATTCTAGCTGTAGAATTAAAAAGTTTAAGTGGGTAAATACGAGAACCGAGTGCGTTAACGTAGAACTTGAACCATATCTATCCAAAGCACTGTATTTTAGTGTGTATATCCCTAACAATTAGATTACTAGTTTTTTTCATAAAACGCAACTTATACCGAACAAAAATTATTACATGATGTCATTTCAGCCTAAAGCGAGTAAGACAGTAATGCCAACTGTCATGTGTCAAATGTCATAAAAGTCATGTATAAAAGTTCAGCCGAACAATTTCCAAATATGAACAGTTGTTGGCGACCATGAAAAAGATCTGTCAGAGTTGAATTTATGTCGAAAACACGACATTTTAGAATTTTTGTAGGTGTTTTTATTCTGTAGAAGTTGCCCGTTCATCACATATATACATTATCATAATTTAATCTATACCGTAACGAATACATCATAACGCTTCAGGTATTTTATTAAAAATCTCTTGAATGATGACAATATATGTAACAGATTGAGTGGTAAATGTCTTTTTTTTGTAATTTTTTTGGTAGGTAATCGTTTTTTATTCACGAAACTAAGTATGAAAAAGCTAAGACTAAGTGGAATAACATTTTTAAAATATGATTTACAAATATATTTTGTGTATGGCTTTTCATCAGTGTAATTAAATCGTTTTAATAAATATAGTTGGTTTAGACGTTGTCAAACATAAAGACGTTTGACAATGTCTACACGAACCATTCTTTTTGAGGTTACCTCTGTGCCTGATTTGTCAAATTGTCATCTGTGCCTTGCCACTCTTGGCAGTAAATGTATATCCGTACCCAGTACTGTCAATTTACTTCGTTGTTTGTTCTGTTCTTTTTGTAATAAGTTGGTTCATTAATAGGACATTTCAACGATTCTCATTTGTTTCG
配列番号２は、本明細書の一部において、WCR SNAP25-1とも呼称される、例示的なWCRsnap25DNAによりコードされるWCR SNAP25ポリペプチドのアミノ酸配列を示している：
MPAPAAAENGAPRTELQELQLKAGQVTDESLESTRRMLALCEESTDAGTKTLEMVHHQGEQLDRIEDGMDQINTDMREAEKNLTGMEKCCGLCVLPCQKGSSFKEDEGTWKGNDDGKVVNNQPQRMMDDRNGMGPQGGYIGRITNDAREDEMEENVGQVNTMIGNLRNMAIDMGSELENQNRQIDRINLKGESNATRIEVANQRAHDLLK
配列番号３は、本明細書の一部の場合においては、WCRsnap25-2とも呼称される、さらなる例示的なWCRsnap25DNAを含有するコンティグを示している。
AAAAAGGCAACCAATTATACAGCAGCAGTGATGTTACAGTAGTTGCGAGGGTCCGGCTGGTTTGTTATTTGATTAAGTGGTTATTGACGTTAGAAGGGAAATTTCTAAATTAATCCCTGACATTCGGATTGTTAAGTGTGTTATGTGATAACTCCAAGTTACTAGTGAATCTGTTCTATTTCTTCTCCGTGCTCCACCCTCTTTAGTCCGAAAAAATGCCTGCGCCTGCTGCTGCTGAAAATGGAGCGCCCAGGACGGAACTGCAAGAGCTCCAGCTCAAAGCTGGGCAAGTTACAGATGAGTCCCTGGAAAGCACAAGGCGTATGTTGGCTCTCTGCGAAGAGAGTCACGAAGTTGGCATGAAGACCCTGGTCATGCTGGATGAACAGGGCGAACAATTGGACCGGATCGAGGATGGAATGGACCAGATCAACACCGATATGCGAGAGGCTGAAAAGAATTTGACTGGAATGGAAAAATGCTGTGGCCTTTGTGTGTTACCATGTCAAAAGGGCTCATCGTTCAAAGAAGACGAAGGAACGTGGAAGGGCAACGACGACGGAAAAGTCGTCAACAACCAACCCCAACGAATGATGGACGATCGGAACGGAATGGGCCCTCAAGGCGGATACATCGGCAGGATCACGAACGACGCGCGAGAGGACGAAATGGAAGAAAACGTCGGCCAAGTCAACACCATGATCGGTAATCTGCGTAACATGGCTATCGATATGGGTTCGGAGTTGGAAAATCAAAATAGGCAAATCGATCGTATCAATCTCAAGGGTGAATCCAACGCGACGAGGATAGAGGTGGCCAACCAGCGGGCACATGACCTTCTCAAGTAGACACAACACACAAAAACACTGAAAAGTTTTTACTTTCTATCATTTTTTGCGATTCCAACTCGTTCCTACTGGGTACTTGAAACAATTAAATATCTATTGCTTTTTTAGCTACTTAATTAGTCAGTGTTCAATAATATATAAATGCTGTTTCGTAACTAACAAAACTAGAATAATCGTCGTGGTGACATAATCATGAAAAGTTTATAAAACATCTATAATTTGGTCCTTTCACGTCATTATTTTCAATTTTACGACGTTTTAGAATGGTTCCTAAGACGGTTAACGTTTTAATAACAAACGTATACTCTGTTTCATTAAACAATCGTTTCTGTAGCTTTAATTGTTATAAATTAGCGATGATGTTACAGGTACCAAAAGGCAGTGTTGCCAATTATTTATCAGTCTGTGTATTAGAAGTAATGAATCATAAGAATCCGGCTCGAAGGACCAAATGCTTATGTAGGAAATATTCTTGAAGAAAATGGTCTTGCTTAGATCTGCCCATTTCGTGGGAACGAACCTATATTTACGTGTAGGCCGATCGAGTGAAAGTTACAAAATTGCGTTCGCATACGTTTTTAAGAGGCGCAATAAATCAGATAAAGTATCAAGAGGTTGTGTGTCAAAATAGCAGTATTACCAATTACTAATTAGTCTTTGTGCTAGTATTTGAGTTGGCATACACTGTTGTGTGGAAAACTGAACAATACGCTATTCATTTGAAGAACTGCTTCAAATAATAGCAAATAATAGAAGTATAGATCGGAGAAACACCGTAAAAAATCGGGCAAAAAGTTGCTTTATATAAAAATTCAATGAACGAGGAAGTTTATCATTAAGTGGACTTTGGAAGAGAACTGGAAGGAAACTGTTCAGTCAGTCACGAAGTTATATGTGATAATAAATGTTTAATCTTTAAATTTGAAAACAAAACCGCCAATTTAATGATAGAGATCATAAAGGATCTTAAATACTACGAAAAAAATTGTCAGTTCTATCGAGTAAGTTTCAGTTTGATTTCATTTGCCTTATTTATGGCCCTATTTGGAAATGTAAGCGTTAATGCCCATTGCCCATTGCCCATGCCATTTTCATGGTAAATACTATTTAAATTAGTAGCATTGTAGTTTATGTTGGTATATTGTATGAAAAAATCAAATTTATTACTATTTTATAACTAAAAAGCTATAGAAACGACGAATATTATTATCAGAGGTAAATGCAACGATTCAAAGAAGGCAAAAAGTTAGGTTAAGATACCTGTCACTGATATTATAACCAGAATCTCTTGGTCGTTTGTTAATTATACTTAAATCATTGTTCCACGTTGTTAAAGGCACATAAAGAGTAAGTATCTTCGACCAAAGTTATCAGAACTCTTCTATCTTTCATAATATATCTTAGCAATAACAGCTTCAACGTGAAAGGATCAACTAATATTCCACATATTGTGTACATAAAAAACACTGATTATTTTACAATAATATTGAGCTCTCACTGCAACAGTTGTTGTTCTTTGGTTTGAATTGTTTTGTAGAATTTTCGAACACGTTCACTGCCAGTGTGTATCGAAAACGCACTTGAAAACTCGGGTAACAATTATCTGATGCTAGGTGATTGGTTATCACATAATCAGCAGTGAACATGAGAGTTGTTGATAAAAAAACCAAATAAAAATAAATGCCTCAAATCTTTTTTTTTTCAAGAGAACAAATTTAAAACTAAACTTCAGAAACTCTACCTTCTTGTTCGGTGACGAAATTTACGCATATAATCTGCCTTTTTTCCAGTATTGTCGCCAATATTAAGGCAGTCGTCTTATCATACAAGTTTTTTTGGTCTTTTTGGCGTTACCTTCGACTTAGTGATGATAATAAGCTATTCAAATTTAAAAACAGATTTTAGTCACTGGGTGCTAGATCGGGACATTTCAACGGTTTTGATGATTTCTTTATAATCCTAAATTTTGAATTTTTCCAGTTGCACTGAGACATTAGATACTATACATCTTTTTGTTTGTACTTTTACATTAAACAATACTTACTACAGATTGATTATGTCACCATGACAGTACTTGAACAAACGCTATTCAATTTTTATATTTAGAAAGAGTATAAAGTTGAGGGACCAGGTTGAAAGGTACAGTGTTGAATAGTATAACAGCCGCATGATTGAATTTTATCTGTAAATATTACTTTAATTAATTATGGCGCTAGATTTTTGTTCTGTTTGTTTTCTATTA
配列番号４は、本明細書の一部において、WCR SNAP25-2とも呼称される、例示的なWCRsnap25-2DNAによりコードされる、さらなるWCR SNAP25ポリペプチドのアミノ酸配列を示している：
MPAPAAAENGAPRTELQELQLKAGQVTDESLESTRRMLALCEESHEVGMKTLVMLDEQGEQLDRIEDGMDQINTDMREAEKNLTGMEKCCGLCVLPCQKGSSFKEDEGTWKGNDDGKVVNNQPQRMMDDRNGMGPQGGYIGRITNDAREDEMEENVGQVNTMIGNLRNMAIDMGSELENQNRQIDRINLKGESNATRIEVANQRAHDLLK
配列番号５は、本明細書の一部の場合においては、WCRsnap25-1reg1（領域１）とも呼称される、例示的なWCRsnap25DNAを示しており、dsRNAの産生に関する一部の例において使用されている。
CAAGTTACAGATGAGTCCCTGGAAAGCACAAGGCGTATGTTGGCTCTCTGCGAAGAGAGTACCGATGCTGGCACGAAGACATTGGAGATGGTCCACCATCAAGGCGAACAATTGGACCGGATCGAGGATGGAATGGACCAGATCAACACCGATAT
配列番号６は、本明細書の一部の場合においては、WCRsnap25-2reg1（領域１）とも呼称される、例示的なWCRsnap25DNAを示しており、dsRNAの産生に関する一部の例において使用されている。
AATGGAAGAAAACGTCGGCCAAGTCAACACCATGATCGGTAATCTGCGTAACATGGCTATCGATATGGGTTCGGAGTTGGAAAATCAAAATAGGCAAATCGATCGTATCAATCTCAAGGGTGAATCCAACGCGACGAGGATAGAGGTGGCCAACCAGCGGGCACATGACCTTCTCAAG
配列番号７は、本明細書の一部の場合においては、WCRsnap25-1v1（バージョン１）とも呼称される、さらなる例示的なWCRsnap25DNAを示しており、dsRNAの産生に関する一部の例において使用されている。
CAAGTTACAGATGAGTCCCTGGAAAGCACAAGGCGTATGTTGGCTCTCTGCGAAGAGAGTACCGATGCTGGCACGAAGACATTGGAGATGGTCCACCATCAAGGCGAACAATTGGACCGGATCGAGGATGGAATGGACCAGATCAACAC
配列番号８は、本明細書の一部の場合においては、WCRsnap25-2v1（バージョン１）とも呼称される、さらなる例示的なWCRsnap25DNAを示しており、dsRNAの産生に関する一部の例において使用されている。
TGGGTTCGGAGTTGGAAAATCAAAATAGGCAAATCGATCGTATCAATCTCAAGGGTGAATCCAACGCGACGAGGATAGAGGTGGCCAACCAGCGGGCACATGACCTTCTCAAG
配列番号９は、T7ファージプロモーターのヌクレオチド配列を示している。
配列番号１０は、例示的なYFPコード配列の断片を示している。
配列番号１１〜１８は、dsRNAの産生に関する一部の例において使用される、snap25-1reg1、snap25-2reg1、snap25-1 v1、及びsnap25-2 v1を含有する例示的なWCRsnap25配列の一部を増幅するために使用されたプライマーを示している。
配列番号１９は、例示的なYFP遺伝子を示している。
配列番号２０は、アネキシン領域１のDNA配列を示している。
配列番号２１は、アネキシン領域２のDNA配列を示している。
配列番号２２は、ベータ スペクトリン２領域１のDNA配列を示している。
配列番号２３は、ベータ スペクトリン２領域２のDNA配列を示している。
配列番号２４は、mtRP-L4領域１のDNA配列を示している。
配列番号２５は、mtRP-L4領域２のDNA配列を示している。
配列番号２６〜５３は、dsRNA合成のために、アネキシン、ベータ スペクトリン２、mtRP-L4、及びYFPの遺伝子領域を増幅するために使用されたプライマーを示している。
配列番号５４は、TIP41様タンパク質をコードするトウモロコシDNA配列を示す。
配列番号５５は、T20VNプライマーオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
配列番号５６〜６３は、トウモロコシにおけるdsRNA転写物発現解析のためのプライマーとプローブを示す。
配列番号６４は、バイナリーベクター主鎖検出に使用されたSpecRコード領域の一部のヌクレオチド配列を示す。
配列番号６５は、ゲノムコピー数解析に使用されたAAD1コード領域のヌクレオチド配列を示す。
配列番号６６は、トウモロコシのインベルターゼ遺伝子のDNA配列を示す。
配列番号６７〜７５は、遺伝子コピー数決定、及びバイナリーベクター主鎖検出に使用されたDNAオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
配列番号７６〜８１は、dsRNA転写物トウモロコシ発現解析のためのプライマーとプローブを示す。
配列番号８２は、例示的なリンカーポリヌクレオチドを示しており、それらはRNA転写物中に転写された際に「ループ」を形成し、ヘアピン構造を形成する：
AGTCATCACGCTGGAGCGCACATATAGGCCCTCCATCAGAAAGTCATTGTGTATATCTCTCATAGGGAACGAGCTGCTTGCGTATTTCCCTTCCGTAGTCAGAGTCATCAATCAGCTGCACCGTGTCGTAAAGCGGGACGTTCGCAAGCTCGT
配列番号８３〜８８は、例示的なsnap25ポリヌクレオチド及びその断片を含有する核酸から転写された例示的なRNAを示す。
［発明の詳細な説明］
Ｉ． いくつかの実施形態の概要
本発明者らは、dsRNAを発現するトランスジェニック植物に対し最もふさわしい標的害虫種のうちの１種；ウェスタンコーンルートワームを使用し、害虫管理用ツールとしてのRNA干渉（RNAi）を開発した。これまでのところ、ルートワーム幼虫におけるRNAiの標的として提唱されているほとんどの遺伝子は、実際にはその目的を達していない。本明細書において、本発明者らは、例示的な害虫である、ウェスタンコーンルートワームにおける、snap25ののRNAi介在性ノックダウンを記載し、それは、たとえば摂取された又は注入されたsnap25 dsRNAを介してiRNA分子が送達されたときに、致死性の表現型を有することが示されている。本明細書の実施形態において、昆虫への給餌によりsnap25のdsRNAを送達する能力によって、害虫（例えば、鞘翅目）の管理に非常に有用なRNAi効果がもたらされる。snap25介在性RNAiと他の有用なRNAi標的（例えば、米国特許出願14/577,811に記載されているROP RNAi標的、米国特許出願62/133,214 に記載されているRNAポリメラーゼI１ RNAi標的、米国特許出願14/577,854に記載されているRNAポリメラーゼII140 RNAi標的、米国特許出願62/133,202に記載されているRNAポリメラーゼII215 RNAi標的、米国特許出願62/133,210に記載されているRNAポリメラーゼII33 RNAi標的）、米国特許出願62/095487に記載されているncm RNAi標的、米国特許出願14/705,807に記載されているDre4 RNAi標的、米国特許出願62/063,199に記載されているCOPIアルファRNAi標的、米国特許出願62/063,203に記載されているCOPIベータRNAi標的、米国特許出願62/063,192に記載されているCOPI ガンマRNAi標的、米国特許出願62/063,216に記載されているCOPI デルタRNAi標的、米国特許出願62/193505に記載されているprp8 RNAi標的、米国特許出願62/168,613に記載されている転写伸長因子spt5（transcription elongation factor spt5） RNAi標的、及び米国特許出願62/168,606に記載されている転写伸長因子spt6 RNAi標的）を組み合わせることにより、例えばルートワーム（例えば、幼虫のルートワーム）において複数の標的配列が影響を受ける可能性があり、それによってRNAi技術を含む、害虫管理の持続的な方法が開発される機会が増加し得る。
本明細書において、害虫（例えば、鞘翅目）の寄生を遺伝的に制御するための方法及び組成物が開示される。害虫群のRNAi介在性制御を目的とした標的遺伝子としての使用のための、害虫のライフサイクルに必須な１つ以上の遺伝子を特定する方法もまた提供される。成長、生存、及び／又は発達に必須な１つ以上の標的遺伝子を抑制するように、RNA分子をコードするDNAプラスミドベクターを設計してもよい。一部の実施形態において、RNA分子は、dsRNA分子を形成することができてもよい。一部の実施形態において、害虫の標的遺伝子のコード配列又は非コード配列に対し相補的な核酸分子を介して、標的遺伝子発現の転写後抑制、又は標的遺伝子阻害の転写後抑制のための方法が提供される。これら、及びさらなる実施形態において、害虫に、標的遺伝子のコード配列又は非コード配列に相補的な核酸分子のすべて又は一部から転写されたdsRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、miRNA分子、及び／又はhpRNA分子を１つ以上摂取させ、それにより植物防御作用をもたらしてもよい。
したがって、一部の実施形態は、標的遺伝子のコード配列及び／又は非コード配列に相補的なdsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及び／又はhpRNAを使用し、標的遺伝子産物の発現を配列特異的に阻害し、害虫（例えば、鞘翅目）の少なくとも部分的な制御を達成することを含む。例えば、配列番号１、３、及びそれらの断片のうちの１つに明記されているポリヌクレオチドを含有する単離及び精製された核酸分子のセットが開示される。一部の実施形態において、標的遺伝子の転写後サイレンシング又は阻害を目的として、これらのポリヌクレオチド、それらの断片、又はこれらのポリヌクレオチドのうちの１つを含む遺伝子から、安定化されたdsRNA分子が発現されてもよい。ある実施形態において、単離及び精製された核酸分子は、配列番号１、及び３（例えば、配列番号５〜８）、ならびに／又は、それらの相補配列のいずれかのすべて又は一部を含有する。
一部の実施形態は、少なくとも１つのiRNA（例えばdsRNA）分子をコードする組み換えDNAを少なくとも１つ、そのゲノム中に有する組み換え宿主細胞（例えば植物細胞）を含む。特定の実施形態において、害虫（例えば、鞘翅目）により摂取されたときに、当該害虫の標的遺伝子の発現を転写後にサイレンシングする、又は阻害する、コード化dsRNA分子が提供される。組み換えDNAは、例えば、配列番号１、３、及び５〜８のうちのいずれか、配列番号１、３、及び５〜８のうちのいずれかの断片、ならびに配列番号１、３、及び５〜８のうちの１つを含有する遺伝子の部分配列からなるポリヌクレオチド、ならびに／又はそれらの相補配列、を含有してもよい。
一部の実施形態は、配列番号８３もしくは配列番号８４（例えば、配列番号８５〜８８を含有する群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド）又はそれらの相補配列のすべて、又は一部を含有するiRNA（例えば、dsRNA）分子を少なくとも１つコードする組み換えDNAをそのゲノム中に有する組み換え宿主細胞を含む。害虫（例えば、鞘翅目）により摂取されたときに、iRNA分子は、標的snap25 DNA（例えば、配列番号１、３、及び５〜８からなる群から選択されるポリヌクレオチドのすべて又は一部を含有するDNA）の発現を、当該害虫又は当該害虫の子孫において、サイレンシング、又は阻害し、それにより当該害虫の成長、発達、活性、及び／又は摂食の停止をもたらしてもよい。
一部の実施形態において、dsRNA分子を形成することができるRNA分子を少なくとも１つコードする組み換えDNAを少なくとも１つ、そのゲノム中に有する組み換え宿主細胞は、形質転換された植物細胞であってもよい。一部の実施形態は、かかる形質転換植物細胞を含有するトランスジェニック植物を含む。かかるトランスジェニック植物に加え、いずれかトランスジェニック植物世代の子孫植物、トランスジェニック種子、及びトランスジェニック植物の産物がすべて提供され、それら各々が組み換えDNAを含有する。特定の実施形態において、dsRNA分子を形成することができるRNA分子は、トランスジェニック植物細胞において発現されてもよい。したがって、これら及び他の実施形態において、dsRNA分子は、トランスジェニック植物細胞から単離されてもよい。特定の実施形態において、トランスジェニック植物は、トウモロコシ（Zea mays)、及びイネ（Poaceae）科の植物を含有する群から選択される植物である。
一部の実施形態は、害虫（例えば、鞘翅目）の細胞において、標的遺伝子の発現を調節する方法を含む。これら、及び他の実施形態において、核酸分子が提供されてもよく、この場合において、当該核酸分子は、dsRNA分子を形成することができるRNA分子をコードするポリヌクレオチドを含有する。特定の実施形態において、dsRNA分子を形成することができるRNA分子をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに操作可能に連結されてもよく、及び転写終結配列に操作可能に連結されていてもよい。特定の実施形態において、害虫細胞において標的遺伝子の発現を調節する方法は、以下を含む：（a）dsRNA分子を形成することができるRNA分子をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを用いて、植物細胞を形質転換すること；（b）当該形質転換植物細胞を、複数の形質転換植物細胞を含有する植物細胞培養の進行が可能となるために充分な条件下で培養すること；（c）当該ベクターがそのゲノム中に組み込まれている形質転換植物細胞を選択すること；及び（d）選択された形質転換植物細胞が、当該ベクターのポリヌクレオチドによりコードされているdsRNA分子を形成することができるRNA分子を含有することを決定すること。ベクターがそのゲノム中に組み込まれており、及び当該ベクターのポリヌクレオチドによりコードされるdsRNA分子を含有する植物細胞から、植物を再生させてもよい。
したがって、そのゲノム中に組み込まれたdsRNA分子を形成することができるRNA分子をコードするポリヌクレオチドを有するベクターを含有する植物細胞もまた開示され、この場合において当該トランスジェニック植物は、当該ベクターのポリヌクレオチドによりコードされるdsRNA分子を含有している。特定の実施形態において、dsRNA分子を形成することができるRNA分子の植物における発現は、当該形質転換植物又は当該形質転換植物細胞に（例えば、当該形質転換植物、当該植物の一部（例えば、根）又は植物細胞を餌とすることにより）接触している害虫（例えば、鞘翅目）の細胞における標的遺伝子の発現を調節するのに充分であり、それにより、当該害虫の成長及び／又は生存が阻害される。本明細書に開示されるトランスジェニック植物は、害虫蔓延に対する防御を示してもよく、及び／又は強化された防御を示してもよい。特定のトランスジェニック植物は、以下からなる群から選択される鞘翅目害虫の１つ以上に対する防御及び／又は強化された防御を示してもよい：WCR、NCR、SCR、MCR、D.バルテアタ ルコンテ（D. balteataLeConte）、D.u.テネラ（D. u. tenella）、ジュウイチウリホシハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）、及びD.スペシオサ ゲルマール（D. speciosa Germar）。
また本明細書において、例えばiRNA分子などの制御剤を、害虫（例えば、鞘翅目）へと送達する方法が開示される。かかる制御剤は、昆虫群の摂食、成長、又はさもなければ宿主において損害を生じさせる能力に機能的障害を直接又は間接的に生じさせることができる。一部の実施形態において、安定化されたdsRNA分子を害虫に送達させ、当該害虫において少なくとも１つの標的遺伝子を抑制し、それによって、RNAiを生じさせ、当該害虫の宿主において植物被害を減少させる、又は取り除くことを含む方法が提供される。一部の実施形態において、害虫において標的遺伝子の発現を阻害する方法は、当該害虫の成長、生存、及び／又は発達の停止を生じさせることができる。
一部の実施形態において、植物、動物、及び／又は植物もしくは動物の周囲環境における使用のためのiRNA分子（例えば、dsRNA）を含有し、害虫（例えば、鞘翅目）の寄生の撲滅又は減少を実現する組成物（例えば、局所用組成物）が提供される。特定の実施形態において、組成物は、害虫に食べられる栄養組成物又は食物源であってもよい。一部の実施形態は、害虫が利用可能な栄養組成物又は食物源を作製することを含む。iRNA分子を含有する組成物の摂取は、害虫の１つ以上の細胞による分子の取り込みを発生させることができ、それによって次いで、当該害虫の細胞において少なくとも１つの標的遺伝子の発現の阻害を発生させることができる。害虫寄生による植物又は植物細胞への損害、又は摂取は、当該害虫の宿主に、iRNA分子を含有する組成物を１つ以上提供することによって、当該害虫が存在している任意の宿主組織もしくは環境の中又は上で、限定され、よく又は除外されていてもよい。
RNAi餌（RNAi baits）は、dsRNAが食物、又は誘因物質、又はその両方と混合されたときに形成される。害虫が餌を食べたとき、害虫はdsRNAも吸収する。ベイト剤は、顆粒剤、ゲル剤、フロアブル粉末、液体、または固体の形態をとることができる。別の実施形態において、snap25は、本明細書に参照により援用される米国特許第8,530,440号に記載されるような餌用製剤へと組み込まれてもよい。餌については一般的に、害虫の環境中に、又は環境周囲に置かれ、例えばWCRは、当該餌と接触し、及び／又は当該餌に誘引されることができる。
本明細書に開示される組成物及び方法は、害虫（例えば、鞘翅目）による損害を制御するための他の方法及び組成物と一緒に組み合わせて使用されてもよい。例えば、害虫から植物を防御するための本明細書に記載されるiRNA分子は、害虫に対し有効な化学物質、かかる害虫に対して有効な農薬、輪作、RNAi介在法及びRNAi組成物の特性とは異なる特性を示す組み換え遺伝子法（例えば、植物における、害虫に対して有害なタンパク質（例えば、Bt毒素及びPIP-1ポリペプチド（米国特許出願公開2014/0007292 A1を参照のこと））の組み換え生成）、及び／又は他のiRNA分子の組み換え発現の１つ以上の追加の使用を含む方法において使用されてもよい。
ＩＩ． 略語
dsRNA 二本鎖リボ核酸
GI 成長阻害
NCBI 全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）
gDNA ゲノムデオキシリボ核酸
iRNA 阻害性リボ核酸（inhibitory ribonucleic acid）
ORF オープンリーディングフレーム
RNAi リボ核酸干渉
miRNA マイクロリボ核酸
shRNA 低分子ヘアピンリボ核酸
siRNA 低分子阻害的リボ核酸
hpRNA ヘアピンリボ核酸
UTR 非翻訳領域
WCR ウェスタンコーンルートワーム（Western corn rootworm）(Diabrotica virgifera virgiferaLeConte)
NCR ノーザンコーンルートワーム（Northern corn rootworm）(Diabrotica barberi Smith 及び Lawrence)
MCR メキシカンコーンルートワーム（Mexican corn rootworm）(Diabrotica virgifera zeae Krysan 及び Smith)
PCR ポリメラーゼ鎖反応
qPCR 定量的ポリメラーゼ鎖反応
RISC RNA誘導サイレンシング複合体
SCR サザンコーンルートワーム（Southern corn rootworm）(Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)
SEM 平均標準誤差
YFP 黄色蛍光タンパク質
ＩＩＩ． 用語
以下の記載及び表において、多くの用語が使用されている。所与のかかる用語の範囲を含む、明細書及び請求項の明白で一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される：
鞘翅目害虫：本明細書において使用される場合、「鞘翅目害虫」という用語は、鞘翅目の害虫を指し、ジアブロティカ（Diabrotica）属の害虫を含み、それらはトウモロコシ及び他のイネ科植物を含む農作物及び農産物を餌とする。特定の例において、鞘翅目害虫は、ウェスタンコーンルートワーム（D. v. virgifera LeConte (WCR)）；ノーザンコーンルートワーム（D. barberi Smith 及び Lawrence (NCR)）；サザンコーンルートワーム（D. u. howardi (SCR)）；メキシカンコーンルートワーム（D. v. zeae (MCR)）；D.バルテアタ ルコンテ（D. balteata LeConte）；D.u.テネラ（D. u. tenella）；ジュウイチホシウリハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）；及びD.スペシオサ ゲルマール（D. speciosa Germar）を含むリストから選択される。
（生物体との）接触：本明細書において使用される場合、生物体（例えば、鞘翅目害虫）「との接触」又は「による取り込み」という用語は、核酸分子に関しては、当該生物体への核酸分子の内面化を含み、例えば限定されないが：当該生物体による（例えば、摂食による）分子の摂取；当該生物体と、核酸分子を含む組成物との接触；及び核酸分子を含有する溶液に生物体が浸ることを含む。
コンティグ：本明細書において使用される場合、「コンティグ」（contig）という用語は、単一の遺伝源に由来する重複DNAセグメントのセットから再構築されたDNA配列を指す。
トウモロコシ植物：本明細書において使用される場合、「トウモロコシ植物」という用語は、Zea mays（トウモロコシ）の種の植物を指す。
発現：本明細書において使用される場合、コードポリヌクレオチド（例えば、遺伝子又は導入遺伝子）の「発現」とは、核酸転写ユニット（例えば、ｇDNA又はcDNAを含む）のコード化情報が、細胞の使用可能な部分、使用不可能な部分、又は構造部分へと転換されるプロセスを指し、多くの場合、タンパク質の合成を含んでいる。遺伝子発現は、遺伝子発現を増加又は低下させる剤への、例えば細胞、組織、又は生物体の曝露などの外部シグナルにより影響され得る。遺伝子の発現はまた、ＤＮＡからＲＮＡ、蛋白質への経路のいずれかで制御され得る。遺伝子発現の制御は、例えば転写、翻訳、ＲＮＡの輸送及びプロセッシング、例えばｍＲＮＡなどの中間分子の分解に対する作用を制御することにより発生するか、又はそれらが生成された後の特定の蛋白質分子の活性化、不活化、区画化、又は分解を介して発生するか、又はそれらの組み合わせにより発生する。遺伝子発現は、当分野に公知の任意の方法によりRNAレベルで、又はタンパク質レベルで測定することができ、ノーザンブロット、RT-PCR、ウェスタンブロット、又はin vitro、in situ、もしくはin vivoのタンパク質活性のアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。
遺伝物質：本明細書において使用される場合、「遺伝物質」という用語は、全ての遺伝子、ならびに例えばDNA及びRNAなどの核酸分子を含む。
阻害：本明細書において使用される場合、「阻害」という用語は、コードポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）に対する作用を記載するために使用される場合、当該コードポリヌクレオチドから転写されたmRNAの細胞レベルにおける測定可能な低下を指し、及び／又はコードポリヌクレオチドのペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質産物の細胞レベルにおける測定可能な低下を指す。一部の例において、発現がほぼ消失するよう、コードポリヌクレオチドの発現が阻害される場合がある。「特異的阻害」とは、特異的阻害が行われる細胞において、他のコードポリヌクレオチド（例えば遺伝子）の発現に影響を与えることなく、標的コードポリヌクレオチドを阻害することを指す。
昆虫：本明細書において有害生物に関連して使用される場合、「害虫」という用語は、鞘翅目害虫を具体的に含む。一部の例において、「害虫」という用語は、ウェスタンコーンルートワーム（D. v. virgifera LeConte (WCR)）；ノーザンコーンルートワーム（D. barberi Smith 及び Lawrence (NCR)）；サザンコーンルートワーム（D. u. howardi (SCR)）；メキシカンコーンルートワーム（D. v. zeae (MCR)）；D.バルテアタ ルコンテ（D. balteata LeConte）；D.u.テネラ（D. u. tenella）；ジュウイチホシウリハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）；及びD.スペシオサ ゲルマール（D. speciosa Germar）を含むリストから選択されるジアブロティカ（Diabrotica）属の鞘翅目害虫を具体的に指す。
単離した：「単離された」生物学的構成要素（例えば、核酸又はタンパク質）は、当該構成要素が天然に存在している、生物体の細胞中の他の生物学的構成要素（すなわち、他の染色体及び余剰染色体のＤＮＡならびにＲＮＡ、及びタンパク質）から、当該構成要素において化学的変化又は機能的変化に影響を与えながら、実質的に分離され、から離れて生成され、又はから精製されている（例えば、核酸は、染色体中の残りのＤＮＡと当該核酸を繋ぐ化学的結合を破壊することにより、染色体から単離することができる）。「単離されている」核酸分子及びタンパク質としては、標準的な精製法により精製された核酸分子及びタンパク質が挙げられる。またこの用語は、宿主細胞中での組み換え発現により調製された核酸及びタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質、及びペプチドを包含する。
核酸分子：本明細書において使用される場合、「核酸分子」という用語は、多量体型のヌクレオチドを指す場合があり、RNA、cDNA、gDNAのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含み、ならびにそれらの合成型及び混合型ポリマーを含む場合がある。ヌクレオチド及び核酸塩基は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型を指す場合がある。本明細書において使用される場合、「核酸分子」は、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」と同義である。別段の言及がない限り、核酸分子は通常、少なくとも１０塩基の長さである。慣例により、核酸分子のヌクレオチド配列は、その分子の５’末端から３’末端へと読まれる。核酸分子の「相補配列」とは、その核酸分子の核酸塩基と塩基対を形成することができる核酸塩基を有するポリヌクレオチドを指す（すなわち、A-T/U、及びG-C）。
一部の実施形態は、mRNA分子の相補配列であるRNA分子へと転写される鋳型DNAを含有する核酸を含む。これらの実施形態において、mRNA分子に転写される核酸の相補配列は、５’から３’の方向で存在しており、RNAポリメラーゼ（５’から３’の方向にDNAを転写する）は、mRNA分子にハイブリダイズすることができる相補配列から核酸を転写する。別段の記載がない限り、又は文脈から別段であることが明白でない限り、「相補配列」という用語は、参照核酸の核酸塩基と対を形成することができる、５’から３’の核酸塩基を有するポリヌクレオチドを指す。同様に、別段であることが明白に記載されていない限り（又は文脈から別段であることが明白でない限り）、核酸の「逆相補配列」とは、逆方向の相補配列を指す。前述を、以下の解説において説明する：
ATGATGATG ポリヌクレオチド
TACTACTAC ポリヌクレオチドの「相補配列」
CATCATCAT ポリヌクレオチドの「逆相補配列」
本発明の一部の実施形態は、ヘアピンRNA形成RNAi分子を含む場合がある。これらのRNAi分子において、RNA干渉により標的とされている核酸の相補配列、及び逆相補配列の両方が、同じ分子中に存在していてもよく、それにより、一本鎖RNA分子が「折り重なる」ことができ、及び相補配列を含む領域上にそれ自身をハイブリダイズし、相補的ポリヌクレオチドを反転させることができる。
「核酸分子」には、例えば一本鎖型及び二本鎖型のDNA、一本鎖型のRNA、ならびに二本鎖型のRNA（dsRNA）などの全てのポリヌクレオチドが含まれる。「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」という用語は、個々の一本鎖又は二本鎖のいずれかとしての核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を指す。「リボ核酸（RNA）」という用語は、iRNA（阻害的RNA）、dsRNA（二本鎖RNA）、siRNA（低分子干渉RNA）、shRNA（低分子ヘアピンRNA）、mRNA（メッセンジャーRNA）、miRNA（マイクロRNA）、hpRNA（ヘアピンRNA）、tRNA（トランスファーRNA、対応するアシル化アミノ酸での荷電、又は非荷電いずれも）、及びcRNA（相補的RNA）を含む。「デオキシリボ核酸」（DNA）という用語は、cDNA、gDNA、及びDNA-RNAハイブリッドを含む。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」ならびにそれらの「断片」という用語は、gDNA、リボソームRNA、トランスファーRNA、メッセンジャーRNA、オペロン、ならびにペプチド、ポリペプチド又はタンパク質コードする、又はコードするよう適合され得る低分子化改変ポリヌクレオチドのすべてを含む用語として当分野の当業者に理解されている。
オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドは、短い核酸ポリマーである。オリゴヌクレオチドは、長い核酸セグメントの開裂により形成されてもよく、又は個々のヌクレオチド前駆体の重合により形成されてもよい。自動合成により、最大で数百塩基の長さのオリゴヌクレオチドの合成が可能である。オリゴヌクレオチドは相補核酸に結合することができるため、DNA又はRNAを検出するためのプローブとして使用することができる。DNA（オリゴデオキシリボヌクレオチド）から構成されるオリゴヌクレオチドを、DNA増幅技術であるPCRで使用してもよい。PCRでは、オリゴヌクレオチドは多くの場合、「プライマー」と呼称され、これによりDNAポリメラーゼはオリゴヌクレオチドを伸長させ、相補鎖を複製することができる。
核酸分子は、天然型、及び／又は非天然型のヌクレオチド結合によって、共に連結された天然型ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドのいずれか、又は両方を含んでもよい。核酸分子は化学的に、又は生化学的に修飾されてもよく、又は非天然型ヌクレオチド塩基もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有してもよいことが、当分野の当業者には容易に認識されるであろう。かかる修飾としては、例えば、標識、メチル化、１つ以上の天然型ヌクレオチドとアナログの置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、非荷電結合：例えばホスホン酸メチル、リン酸トリエステル、アミド亜リン酸エステル、カルバマートなど；荷電結合：例えばチオリン酸エステル、ジチオリン酸エステルなど；ペンデント部分（pendent moieties）：例えば、ペプチド；挿入剤：例えば、アクリジン、ソラレンなど；キレーター；アルキレーター；及び修飾結合：例えば、アルファアノマー核酸など）が挙げられる。また「核酸分子」という用語は、一本鎖、二本鎖、部分二重鎖、三重鎖、ヘアピン化、環状、及び南京錠構造をはじめとするトポロジー構造の全てを含む。
本明細書においてDNAに関して使用される場合、「コードポリヌクレオチド」、「構造的ポリヌクレオチド」、又は「構造的核酸分子」という用語は、適切な制御エレメントの制御下に置かれたときに、転写及びmRNAを介してポリペプチドへと最終的に翻訳されるポリヌクレオチドを指す。RNAに関しては、「コードポリヌクレオチド」という用語は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質へと翻訳されるポリヌクレオチドを指す。コードポリヌクレオチドの境界は、５’末端の翻訳開始コドンと、３’末端の翻訳停止コドンにより決定される。コードポリヌクレオチドとしては、gDNA、cDNA、EST、及び組み換えポリヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「転写された非コードポリヌクレオチド」とは、例えば５’UTR、３’UTR、及びイントロン部分などの、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されないmRNA分子の部分を指す。さらに「転写された非コードポリヌクレオチド」とは、例えば構造的RNA（例えば、5S rRNA、5.8S rRNA、16S rRNA、18S rRNA、23S rRNA、及び28S rRNAなどにより例示されるリボソームRNA（ｒRNA）；トランスファーRNA（ｔRNA）、及び例えばU4、U5、U6などのsnRNAといった、細胞内で機能するRNAへ転写される核酸を指す。転写された非コードポリヌクレオチドとしてはまた、例えば限定されないが、低分子細菌性非コードRNAを記載するためにしばしば使用される低分子RNA（sRNA）、低分子核内RNA（snoRNA）、マイクロRNA、低分子干渉RNA（siRNA）、Piwi-interacting RNA（piRNA）、及び長い非コードRNAが挙げられる。さらには、「転写された非コードポリヌクレオチド」とは、RNA分子へと転写される、核酸中に遺伝子内「スペーサー」として天然に存在し得るポリヌクレオチドを指す。
致死的RNA干渉：本明細書において使用される場合、「致死的RNA干渉」という用語は、例えばdsRNA、miRNA、siRNA、shRNA、及び／又はhpRNAが送達される対象個体の死、又は活性の低下をもたらすRNA干渉を指す。
ゲノム：本明細書において使用される場合、「ゲノム」という用語は、細胞の核内に存在する染色体DNAを指し、また細胞の細胞内成分内に存在する細胞小器官DNAも指す。本発明の一部の実施形態において、DNA分子が植物細胞のゲノムへと組み込まれるように、DNA分子は植物細胞に導入されてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、DNA分子は、植物細胞の核DNAに組み込まれてもよく、又は植物細胞の葉緑体もしくはミトコンドリアのDNAへと組み込まれてもよい。「ゲノム」という用語は、細菌に適用される場合、細菌細胞内の染色体及びプラスミドの両方を指す。本発明の一部の実施形態において、DNA分子が細菌のゲノムへと組み込まれるように、DNA分子は細菌に導入されてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、DNA分子は、染色体に組み込まれていてもよく、又は安定プラスミドとして存在してもよく、又は安定プラスミド内に存在してもよい。
配列の同一性：２つのポリヌクレオチド又はポリペプチドの文脈において本明細書で使用される場合、「配列同一性」又は「同一性」という用語は、規定の比較ウィンドウ上で最大一致で並べられたとき、２つの分子の配列中の同一である残基を指す。
本明細書において使用される場合、「配列同一性の割合」という用語は、最適に並べられた２つの分子配列（例えば核酸配列又はポリペプチド配列）を、比較ウィンドウ上で比較することにより決定される値を指す場合があり、この場合において比較ウィンドウの配列部分は、２配列の最適なアライメントのために、基準配列（付加又は欠失を含んでいない）と比較し、付加又は欠失（すなわちギャップ）を含有する場合がある。割合は、比較ウィンドウにおいて、同一のヌクレオチド残基又はアミノ酸残基が両配列に存在する位置の数を決定し、合致した位置の数を出し、合致した位置の数を位置の総数で割り、100を掛けて配列同一性の割合を出すことにより算出される。参照配列に対する比較において、各位置で同一である配列は、当該参照配列に対し100％同一であるとされ、逆もまた同じとなる。
比較のための配列アライメントの方法は当分野において公知である。様々なプログラム及びアライメントアルゴリズムが記載されており、例えば以下がある：Smith 及び Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman 及び Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson 及び Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins及び Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins 及び Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet ら (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang ら (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson ら (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana ら (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. 配列アライメント法及び相同性算出に関する詳細な検討については、例えば、下記に見出される：Altschul ら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.
The National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST（商標）; Altschul ら (1990))は、いくつかの配列解析プログラムと関連した用途に対し、National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD)、及びインターネットをはじめとするいくつかの源から利用可能である。このプログラムを使用し、どのように配列同一性を決定するかについての説明は、インターネットのBLAST（商標）の「ヘルプ」の項で入手可能である。核酸配列の比較に関しては、BLAST「商標」（Blastn）の「Blast 2 sequences」機能を、デフォルトのパラメーターに設定されたデフォルトBLOSUM62マトリクスを使用して、用いることができる。この方法で評価する場合、参照ポリヌクレオチド配列に対して高い配列類似性を有する核酸は、高い同一性割合を示す。
特異的ハイブリダイズの可能性／特異的相補性：本明細書において使用される場合、「特異的にハイブリダイズ可能」及び「特異的相補性」という用語は、核酸分子と標的核酸分子の間に安定で特異的な結合が発生するのに充分な程度の相補性を示す用語である。２つの核酸分子の間のハイブリダイゼーションは、当該２つの核酸分子の核酸塩基の間の逆平行のアライメントの形成を含む。その後この２つの分子は逆鎖上の対応する塩基と水素結合を形成し、そしてもしこれが充分に安定であった場合には、当分野に公知の方法を使用して検出することが可能な二重鎖分子を形成することができる。ポリヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸と100％相補的であることは必ずしも必要ではない。しかしながら、ハイブリダイゼーションが特異的であるために存在しなければならない相補性の量は、使用されるハイブリダイゼーション条件の関数である。
特有のストリンジェンシーを生じさせるハイブリダイゼーション条件は、選択したハイブリダイゼーション法の性質、及びハイブリダイズする核酸の組成と長さに応じて変化する。概して、ハイブリダイゼーションの温度、及びハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特にＮａ＋及び／又はＭｇ＋＋の濃度）が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するが、洗浄時間もストリンジェンシーに影響を与える。特定のストリンジェンシーの程度を得るために必要とされるハイブリダイゼーション条件に関する算定は当分野の当業者に公知であり、例えば、Sambrook ら編 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd 編, vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9及び11；ならびにHames 及びHiggins 編 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985.に検討されている。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細な説明及びガイダンスは、例えば、Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993；及びAusubel ら編 Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995.に見出され得る。
本明細書において使用される場合、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション分子の配列と、標的核酸分子内の相同ポリヌクレオチド配列の間のミスマッチが20％未満である場合にのみハイブリダイゼーションが発生する条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、特定のレベルのストリンジェンシーを含む。したがって本明細書において使用される場合、「中程度のストリンジェンシー」条件とは、20％を超える配列ミスマッチを伴う分子がハイブリダイズしない条件であり、「高いストリンジェンシー」の条件は、10％を超えるミスマッチを伴う配列がハイブリダイズしない条件であり、及び「非常に高いストリンジェンシー」の条件は、５％を超えるミスマッチを伴う配列がハイブリダイズしない条件である。
以下は代表的な非限定的ハイブリダイゼーション条件である。
高いストリンジェンシー条件（少なくとも90％の配列同一性を共有するポリヌクレオチドを検出する）：5xSSC緩衝液、65℃、16時間のハイブリダイゼーション；2xSSC緩衝液、室温で各々15分間の洗浄を２回；及び0.5xSSC緩衝液、６５℃で各々20分の洗浄を２回。
中程度のストリンジェンシー条件（少なくとも80％の配列同一性を共有するポリヌクレオチドを検出する）：5x〜6xSSC緩衝液、65℃〜70℃、16〜20時間のハイブリダイゼーション；2xSSC緩衝液、室温で各々５〜20分間の洗浄を２回；及び1xSSC緩衝液、55℃〜70℃で各々30分の洗浄を２回。
非ストリンジェントな対照条件（少なくとも50％の配列同一性を共有するポリヌクレオチドがハイブリダイズする）：6xSSC緩衝液、室温〜55℃、16〜20時間のハイブリダイゼーション；2x〜3xSSC緩衝液、室温〜55℃で各々20〜30分間の洗浄を少なくとも２回。
本明細書において使用される場合、「実質的に相同」又は「実質的な相同性」という用語は、核酸に関し、ストリンジェントな条件下で、参照核酸にハイブリダイズする連続核酸塩基を有するポリヌクレオチドを指す。例えば、配列番号１、３及び５〜８のいずれかの参照核酸に対し、実質的に相同である核酸は、ストリンジェントな条件（例えば、上記に示される中程度のストリンジェントな条件）下で参照核酸にハイブリダイズする核酸である。実質的に相同なポリヌクレオチドは、少なくとも80％の配列同一性を有していてもよい。例えば、実質的に相同なポリヌクレオチドは、例えば、79％；80％；約81％；約82％；約83％；約84％；約85％；約86％；約87％；約88％；約89％；約90％；約91％；約92％；約93％；約94％；約95％；約96％；約97％；約98％；約98.5％；約99％；約99.5％；及び約100％などの80％〜100％の配列同一性を有していてもよい。実質的な相同性の特性は、特異的ハイブリダイゼーションに密接に関係している。例えば、特異的結合が望ましい条件下、例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非標的ポリヌクレオチドへの核酸の非特異的結合を回避するのに充分な程度の相補性がある場合、核酸分子は特異的にはハイブリダイズする。
本明細書において使用される場合、「オルソログ」という用語は、共通の先祖核酸から進化した、２以上の種の遺伝子を指し、当該２以上の種において同じ機能を保持している場合がある。
本明細書において使用される場合、５’から３’の方向で読まれたポリヌクレオチドの各ヌクレオチドが、３’から５’の方向で読まれたときに、他のポリヌクレオチドの各ヌクレオチドに対し相補的である場合、２つの核酸分子は、「完全な相補性」を示すと言われる。参照ポリヌクレオチドに対し相補的なポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの逆相補配列に対し、配列同一性を示す。これらの用語及び記載は当分野においてよく定義されており、当分野の当業者には容易に理解される。
操作可能に連結された：第一のポリヌクレオチドは、当該第一のポリヌクレオチドが、第二のポリヌクレオチドと機能的関係がある場合、第二のポリヌクレオチドに操作可能に連結されている。組み換えで生成された場合、操作可能に連結されたポリヌクレオチドは多くの場合連続的であり、及び２つのタンパク質コード領域を繋げる必要がある場合、同一のリーディングフレームにおいて連続的である（例えば翻訳的に融合されたＯＲＦ。）しかしながら、核酸は、操作可能に連結されるために必ずしも連続ではない。
調節性遺伝子エレメント及びコードポリヌクレオチドに関し使用される場合、「操作可能に連結される」という用語は、当該調節性エレメントが、連結されたコードポリヌクレオチドの発現に作用することを意味する。「調節エレメント」又は「制御エレメント」とは、関連するコードポリヌクレオチドの転写、ＲＮＡのプロセッシングもしくは安定性、又は翻訳のタイミング、及びレベル／量に影響を与えるポリヌクレオチドを指す。調節性エレメントとしては、プロモーター、翻訳リーダー、イントロン、エンハンサー、ステムループ構造、リプレッサー結合ポリヌクレオチド、終結配列を伴うポリヌクレオチド、ポリアデニル化認識配列を伴うポリヌクレオチドなどが挙げられる。特定の調節性エレメントは、自身に操作可能に連結されたコードポリヌクレオチドの上流及び／又は下流に位置している場合がある。また、コードポリヌクレオチドに操作可能に連結された特定の調節性エレメントは、二本鎖核酸分子の関連する相補鎖上に位置する場合もある。
プロモーター：本明細書において使用される場合、「プロモーター」という用語は、転写の開始部分から上流にある場合があるDNAの領域、ならびにRNAポリメラーゼ及び転写を開始させる他のタンパク質の認識及び結合に関与する場合があるDNAの領域を指す。プロモーターは、細胞における発現のためにコードポリヌクレオチドに操作可能に連結されてもよく、又はプロモーターは、細胞における発現のためにコードポリヌクレオチドに操作可能に連結され得るシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されてもよい。「植物プロモーター」は、植物細胞において転写を開始させることができるプロモーターであってもよい。発生制御下のプロモーターの例としては、例えば葉、根、種、繊維、導管、仮道管、又は厚膜組織などの特定の組織において転写を優先的に開始させるプロモーターが挙げられる。かかるプロモーターは、「組織優先的」と呼称される。特定の組織においてのみ転写を開始させるプロモーターは、「組織特異的」と呼称される。「細胞型特異的」プロモーターは主に、例えば根又は葉の管細胞などの１つ以上の器官の特定の細胞型における発現を誘導する。「誘導性」プロモーターは、環境制御下にあるプロモーターである場合がある。誘導性プロモーターによる転写を開始させることができる環境条件の例としては、嫌気的条件、及び光の存在が挙げられる。組織特異的、組織優先的、細胞型特異的、及び誘導性のプロモーターは、「非構造性」プロモーターに分類を構成する。「構造性」プロモーターは、ほとんどの環境条件下で活性であり得、又はほとんどの組織もしくは細胞型で活性であり得るプロモーターである。
任意の誘導性プロモーターを本発明の一部の実施形態に使用することができる。誘導性プロモーターに関しては、Ward ら(1993) Plant Mol. Biol．22:361-366.を参照のこと。転写率は、誘導剤に応じて増加する。例示的な誘導性プロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：銅に反応するACEI系由来のプロモーター；ベンゼンスルホンアミド除草剤緩和剤に反応する、トウモロコシ由来のIn2遺伝子；Tn10由来のTetリプレッサー；及びステロイドホルモン遺伝子由来の誘導性プロモーター。その転写活性は、グルココルチコステロイドホルモンによる誘導され得る（Schena ら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421）。
例示的な構造性プロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV:Cauliflower Mosaic Virus)由来の35Sプロモーターなどの植物ウイルス由来のプロモーター；イネのアクチン遺伝子由来のプロモーター；ユビキチンプロモーター；pEMU；MAS；トウモロコシH3ヒストンプロモーター；及びALSプロモーター、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ALS3構造遺伝子に対して５’のXba1/NcoI断片(又は前記Xba1/NcoI断片に類似のポリヌクレオチド)（国際PCT出願公開WO96/30530)。
さらに、任意の組織特異的プロモーター、又は組織優先的プロモーターを、本発明の一部の実施形態に使用することができる。組織特異的プロモーターに操作可能に連結されたコードポリヌクレオチドを含有する核酸分子で形質転換された植物は、特定の組織において限局的に、又は優先的にコードポリヌクレオチドの産物を産生することができる。例示的な組織特異的プロモーター又は組織優先的プロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えばファセオリン（phaseolin）遺伝子由来のプロモーターなどの種子優先的プロモーター；例えばcab又はrubisco由来のプロモーターなどの、葉特異的プロモーター及び光誘導性プロモーター；例えばLAT52由来のプロモーターなどの葯特異的プロモーター；例えばZm13由来のプロモーターなどの花粉特異的プロモーター；及び例えばapg由来のプロモーターなどの小胞子優先的プロモーター。
形質転換：本明細書において使用される場合、「形質転換（transformation）」又は「形質導入(transduction)」という用語は、１つ以上の核酸分子を細胞内へと移送させることを指す。細胞ゲノムへの核酸分子の組み込み、又はエピソーム複製のいずれかによって、核酸分子が細胞により安定的に複製されるようになったとき、細胞内に導入された核酸分子により細胞は「形質転換」されている。本明細書において使用される場合、「形質転換」という用語は、かかる細胞内に核酸分子を導入することができる全ての技術を包含している。例としては限定されないが、以下が挙げられる：ウイルスベクターを用いたトランスフェクション法；エレクトロポレーション法(Fromm ら (1986) Nature 319:791-3)；リポフェクション法(Felgner ら (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7)；マイクロインジェクション法(Mueller ら (1978) Cell 15:579-85)；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介導入(Fraley ら (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7)；直接的なDNA取り込み；及び微粒子銃(Klein ら (1987) Nature 327:70)。
導入遺伝子：外因性核酸。一部の例において、導入遺伝子は、鞘翅目害虫に存在する核酸分子に相補的なポリヌクレオチドを含有するdsRNAを形成することができるRNAの一方の鎖又は両方の鎖をコードするDNAであってもよい。さらなる例において、導入遺伝子はアンチセンスポリヌクレオチドであってもよく、この場合において当該アンチセンスポリヌクレオチドの発現は、標的核酸の発現を阻害し、それによってRNAiの表現型が現れる。さらなる例において、導入遺伝子は、遺伝子（例えば除草剤耐性遺伝子、産業的又は薬学的に有用な化合物をコードする遺伝子、又は所望される農学的形質をコードする遺伝子）であってもよい。これら、及び他の例において、導入遺伝子は、当該導入遺伝子のコードポリヌクレオチドに操作可能に連結されている制御エレメントを含有してもよい（例えば、プロモーター）。
ベクター：核酸分子が細胞に導入されると、例えば形質転換細胞が生成される。ベクターは、例えば複製起源などの、宿主細胞で自身を複製することができるようになる遺伝子エレメントを含有してもよい。ベクターの例としては、細胞内に外因性DNAを運ぶプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、又はウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。ベクターは、アンチセンス分子を産生する遺伝子、及び／又は選択マーカー遺伝子、ならびに当分野に公知の他の遺伝子エレメントをはじめとする１つ以上の遺伝子を含んでもよい。ベクターが、細胞に形質導入し、形質転換し、又は感染することにより、当該細胞が、ベクターにコードされた核酸分子及び／又は蛋白質を発現してもよい。ベクターは任意で、細胞内への核酸の侵入の実現を補助するための物質を含む（例えば、リポソーム、タンパク質、コーティングなど）。
収率：同条件下、同じ増殖場所で同じ時間で増殖した基準型の収率と比較した、約100％以上の安定した収率。特定の実施形態において、「改善された収率」又は「収率を改善する」とは、同条件下、同じ時間で増殖した作物に対して、有害であるために充分な鞘翅目害虫の密度を含有する、同じ増殖場所での基準型の収率に対し、105％以上の安定化した収率を有する栽培品種を意味し、それらは本明細書の組成物及び方法の目的とされる。
具体的に指示、又は暗示されたことを除き、「a」、「an」、及び「the」は、本明細書において使用される場合、「少なくとも１つ」を示す。
具体的に別段の説明がなされない限り、本明細書において使用されるすべての技術的用語及び科学的用語は、本開示が属する分野の当業者により普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。分子生物学の普遍的な用語の定義については、例えば、以下に見出される：Lewin’s Genes X, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs ら編、 The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 及びMeyers R.A. 編、 Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). 全ての割合は重量によるものであり、すべての溶媒混合物の比率は、別段の記載がない限り体積によるものである。全ての温度はセ氏である。
IV. 害虫の配列を含有する核酸分子
A. 概要
本明細書において、害虫の制御に有用な核酸分子が開示される。一部の例において、害虫は、鞘翅目害虫（例えば、ジアブロティカ（Diabrotica）属の種）である。記載される核酸分子は、標的ポリヌクレオチド（例えば、天然遺伝子、及び非コードポリヌクレオチド）、dsRNA、siRNA、shRNA、hpRNA、及びmiRNAを含む。例えば、一部の実施形態において、鞘翅目害虫の天然核酸の１つ以上のすべて、又は一部に対し特異的に相補的であり得るdsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、及び／又はhpRNA分子が記載される。これら、及びさらなる例において、天然核酸は、１つ以上の標的遺伝子であってもよく、その産物は例えば限定されないが、代謝プロセスに関与してもよく、又は幼虫の発達に関与してもよい。本明細書に記載される核酸分子は、当該核酸分子が特異的に相補的である天然核酸を少なくとも１つ含有する細胞へと導入される場合、当該細胞においてRNAiを開始させ、その後に当該天然核酸の発現を低下又は消失させることができる。一部の例において、特異的に相補的な核酸分子による標的遺伝子の発現低下又は発現消失は、害虫の成長、発達、及び／もしくは摂食の低下又は停止を生じさせ得る。
一部の実施形態において、害虫において少なくとも１つの標的遺伝子が選択されてもよく、この場合において当該標的遺伝子は、snap25ポリヌクレオチドを含有する。一部の例において、鞘翅目害虫の標的遺伝子が選択され、この場合において当該標的遺伝子は、配列番号１、３、及び５〜８から選択されるポリヌクレオチドを含有する。特定の例において、ジアブロティカ（Diabrotica）属の鞘翅目害虫の標的遺伝子が選択され、この場合において当該標的遺伝子は、配列番号１、３、及び５〜８から選択されるポリヌクレオチドを含有する。
一部の実施形態において、標的遺伝子は、snap25ポリヌクレオチドのタンパク質産物のアミノ酸配列に対し、少なくとも約85％同一（例えば、少なくとも84％、85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％、又は100％同一）である連続したアミノ酸配列を含有するポリペプチドへとin silicoで逆翻訳されることができるポリヌクレオチドを含む核酸分子であってもよい。標的遺伝子は、害虫のいずれかのsnap25ポリヌクレオチドであってもよく、その転写後阻害は、害虫の成長、生存、及び／又は活性に有害な影響を与え、例えば植物に対し、害虫に対する防御利益をもたらす。特定の例において、標的遺伝子は、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列に対し、少なくとも約85％同一、約90％同一、約95％同一、約96％同一、約97％同一、約98％同一、約99％同一、約100％同一、又は100％同一である連続したアミノ酸配列を含有するポリペプチドに、in silicoで逆翻訳され得るポリヌクレオチドを含有する核酸分子である。
本発明によりDNAが提供され、その発現は、害虫（例えば、鞘翅目害虫）のコードポリヌクレオチドによりコードされる天然RNA分子のすべて又は一部に対し特異的に相補的なポリヌクレオチドを含有するRNA分子を生じさせる。一部の実施形態において、害虫による発現RNA分子の摂取後、当該害虫の細胞内において、コードポリヌクレオチドの下方制御を得ることができる。特定の実施形態において、害虫の細胞内において、コードポリヌクレオチドの下方制御を得ることができる。特定の実施形態において、害虫の細胞におけるコードポリヌクレオチドの下方制御により、当該害虫の成長及び／又は発達に対し有害な作用が生じる。
一部の実施形態において、標的ポリヌクレオチドとしては、例えば５’UTR、３’UTR、スプライスリーダー、イントロン、アウトロン（例えば、トランススプライシングにおいてその後に改変される５’UTR RNA）、ドナトロン（donatrons）（例えば、トランススプライシングにドナー配列を提供するために必要とされる非コードRNA）、及び標的害虫遺伝子の他の非コード転写RNAなどの転写非コードRNAが挙げられる。かかるポリヌクレオチドは、モノシストロニックな遺伝子、及びポリシストロニックな遺伝子の両方から誘導することができる。
したがって、本明細書において、一部の実施形態に関連し、害虫（例えば鞘翅目害虫）の標的核酸のすべて又は一部に対し特異的に相補的なポリヌクレオチドを少なくとも１つ含有するiRNA分子（例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、及びhpRNA）が記載される。一部の実施形態において、iRNA分子は、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、10個又はそれ以上の標的核酸などの複数の標的核酸のすべて又は一部に相補的なポリヌクレオチドを含有してもよい。特定の実施形態において、iRNA分子は、例えば植物又は細菌などの遺伝子改変生物体によって、in vitro又はin vivoで生成されてもよい。害虫の標的核酸のすべて又は一部に特異的に相補的な、dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子、及び／又はhpRNA分子の生成に有用であり得るcDNAが開示される。さらに、特定の宿主標的の安定な形質転換の実現における使用のための組み換えDNA構築物が開示される。形質転換された宿主標的は、組み換えDNA構築物から、有効レベルのdsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子、及び／又はhpRNA分子を発現することができる。したがって、植物細胞において機能する異種プロモーターに操作可能に連結されているポリヌクレオチドを少なくとも１つ含有する植物形質転換ベクターが記載され、この場合において当該ポリヌクレオチドの発現により、害虫の標的核酸のすべて又は一部に対し特異的に相補的な連続した一連の核酸塩基を含有するRNA分子が生じる。
特定の例において、鞘翅目害虫の制御に有用な核酸分子としては、以下が挙げられる：snap25ポリヌクレオチド (例えば、配列番号１、３、及び５〜８のいずれか)を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体から単離された天然核酸のすべて又は一部；発現されたときに、snap25によりコードされる天然RNA分子のすべて又は一部に対し特異的に相補的なポリヌクレオチドを含有するRNA分子を生成するDNA；snap25のすべて又は一部に対し特異的に相補的なポリヌクレオチドを少なくとも1つ含有するiRNA分子（例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、及びhpRNA）；snap25のすべて又は一部に対し特異的に相補的なdsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子、及び／又はhpRNA分子の生成に使用され得るcDNA；及び特定の宿主標的の安定的な形質転換の実現における使用のための組み換えDNA構築物であって、形質転換された宿主標的が前述の核酸分子のうちの１つ以上を含有する組み換えDNA構築物。
B. 核酸分子
本発明は、害虫（例えば、鞘翅目の害虫）の細胞、組織、又は器官において標的遺伝子の発現を阻害するiRNA分子（例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、及びhpRNA）を特に提供するものであり；及び害虫の細胞、組織、又は器官において標的遺伝子の発現を阻害する、細胞又は微生物においてiRNA分子として発現されることができるDNA分子を提供するものである。
本発明の一部の実施形態は、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドを少なくとも１つ（例えば、１、２、３、又はそれ以上）含有する単離された核酸分子を提供するものである。配列番号１又は３；配列番号１又は３の相補配列；配列番号１又は３の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片（例えば、配列番号５〜８のいずれか）；配列番号１又は３の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体（例えば、WCR）の天然コードポリヌクレオチド；配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの相補配列；配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；及び配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列。
特定の実施形態において、単離ポリヌクレオチドから転写されたiRNAの、害虫（例えば、鞘翅目の害虫）との接触、又は害虫による取り込みは、当該害虫の成長、発達、及び／又は摂食を阻害する。一部の実施形態において、iRNAを含有する植物物質又は餌の摂食を介して、昆虫との接触又は取り込みが発生する。一部の実施形態において、iRNAを含有する組成物を用いて、昆虫を含む植物に散布することを介して、昆虫との接触又は取り込みが発生する。
一部の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドを少なくとも１つ（例えば、１、２、３、又はそれ以上）含有してもよい：配列番号８３；配列番号８３の相補配列；配列番号８４；配列番号８４の相補配列；配列番号８５；配列番号８５の相補配列；配列番号８６；配列番号８６の相補配列；配列番号８７；配列番号８７の相補配列；配列番号８８；配列番号８８の相補配列；配列番号８３〜８８のいずれかの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号８３〜８８のいずれかの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号８３〜８８のいずれかを含有する、ジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチド；配列番号８３〜８８のいずれかを含有する、ジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの相補配列；配列番号８３〜８８のいずれかを含有する、ジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；及び配列番号８３〜８８のいずれかを含有する、ジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列。
特定の実施形態において、単離ポリヌクレオチドの、鞘翅目の害虫との接触、又は鞘翅目の害虫による取り込みは、当該害虫の成長、発達、及び／又は摂食を阻害する。
ある実施形態において、本発明により提供されるdsRNA分子は、配列番号１、３、及びそれらの断片の内のいずれかを含有する標的遺伝子からの転写物に相補的なポリヌクレオチドを含有し、害虫においてその標的遺伝子を阻害することにより、当該害虫の成長、発達、又は他の生物学的機能に必須なポリペプチド又はポリヌクレオチド物質の減少又は除去が生じる。選択されたポリヌクレオチドは、配列番号１、及び３のいずれか；配列番号１、及び３のいずれかの連続した断片；ならびに前述のいずれかの相補配列に対し、約80％〜約100％の配列同一性を示してもよい。例えば、選択されたポリヌクレオチドは、配列番号１、及び３のいずれか；配列番号１、及び３のいずれかの連続した断片（例えば、配列番号５〜８）；ならびに前述のいずれかの相補配列のいずれかに対し、79％、80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約98.5％、約99％、約99.5％、又は約100％の配列同一性を示してもよい。
一部の実施形態において、標的遺伝子の発現を阻害する、細胞又は微生物中でiRNA分子として発現されることができるDNA分子は、１つ以上の標的害虫種（例えば、鞘翅目の害虫）に存在する天然ポリヌクレオチドのすべて又は一部に対し特異的に相補的な単一のポリヌクレオチドを含有してもよく、又は当該DNA分子は、複数のかかる特異的に相補的なポリヌクレオチドからキメラとして構築されることができる。
他の実施形態において、核酸分子は、「スペーサー」により分離された第一及び第二のポリヌクレオチドを含有してもよい。スペーサーは、それが望ましい場合に、第一及び第二のポリヌクレオチドの間の二次構造の形成を促進する任意のヌクレオチド配列を含有する領域であってもよい。１つの実施形態において、スペーサーは、mRNAに対するセンス、又はアンチセンスのコードポリヌクレオチドの一部である。あるいはスペーサーは、核酸分子に共有結合されることができるヌクレオチド又はそのホモログの任意の組み合わせを含有してもよい。一部の例において、スペーサーは、（例えば、ST-LS1イントロンのような）イントロンであってもよい。
例えば、一部の実施形態において、DNA分子は、１つ以上の異なるiRNA分子をコードするポリヌクレオチドを含有してもよく、この場合において当該異なるiRNA分子の各々は、第一のポリヌクレオチドと第二のポリヌクレオチドを含有し、この場合において当該第一及び第二のポリヌクレオチドは互いに相補的である。第一及び第二のポリヌクレオチドは、スペーサーによりRNA分子内で繋がれていてもよい。スペーサーは、第一のポリヌクレオチド、又は第二のポリヌクレオチドの一部を構成してもよい。第一及び第二のヌクレオチドポリヌクレオチドを含有するRNA分子の発現は、第一と第二のヌクレオチドポリヌクレオチドの特異的な分子内塩基対形成により、dsRNA分子の形成を誘導してもよい。第一のポリヌクレオチド又は第二のポリヌクレオチドは、害虫（例えば、鞘翅目の害虫）に由来するポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子又は転写された非コードポリヌクレオチド）、その誘導体、又はその相補的ポリヌクレオチドに対し、実質的に同一であってもよい。
dsRNA核酸分子は、多量体化リボヌクレオチドの二本鎖を含有し、及びリン酸−糖の主鎖又はヌクレオシドのいずれかに対し修飾を含んでもよい。RNA構造における修飾を調節し、特異的阻害を可能にしてもよい。１つの実施形態において、dsRNA分子は、siRNA分子が生成されるよう、ユビキタスな酵素プロセスを経て修飾されてもよい。この酵素プロセスは、例えば真核生物のDICERなどのRNaseIII酵素を、in vitro又はin vivoのいずれかで利用してもよい。Elbashir ら (2001) Nature 411:494-8; 並びに Hamilton 及び Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-2を参照のこと。DICER又は機能的に同等のRNaseIII酵素は、大きなdsRNA鎖及び／又はhpRNA分子を、小さなオリゴヌクレオチド（例えば、siRNA）へと開裂し、小さな各ヌクレオチドは約19〜25ヌクレオチドの長さである。これらの酵素により生成されたsiRNA分子は、２〜３個のヌクレオチド３’オーバーハング、ならびに５’リン酸末端、及び３’ヒドロキシル末端を有している。RNaseIII酵素により生成されたsiRNA分子はほどかれ、細胞中で一本鎖RNAへと分離される。次いでsiRNA分子は、標的遺伝子から転写されたRNAに特異的にハイブリダイズし、両RNA分子はその後、固有の細胞性RNA分解メカニズムにより分解される。このプロセスによって、標的生物において、標的遺伝子によりコードされたRNAの効果的な分解又は除去がもたらされ得る。この結末は、標的遺伝子の転写後サイレンシングである。一部の実施形態において、異種核酸分子から内因性RNaseIII酵素により生成されたsiRNA分子は、害虫において標的分子の下方制御を効率的に調節することができる。
一部の実施形態において、核酸分子は、in vivoで、分子間ハイブリダイゼーションを介したdsRNA分子を形成することができる一本鎖RNA分子へと転写されることができる非天然型ポリヌクレオチドを少なくとも１つ含有してもよい。かかるdsRNAは多くの場合、自己アセンブリし、害虫（例えば、鞘翅目）の栄養源中で提供され、標的遺伝子の転写後阻害を実現することができる。これら、及びさらなる実施形態において、核酸分子は、２つの異なる非天然型ポリヌクレオチドを含有してもよく、それら各々は、害虫中の異なる標的遺伝子に対し特異的に相補的である。かかる核酸分子がdsRNA分子として、例えば鞘翅目害虫にもたらされる場合、当該dsRNA分子は、害虫中の少なくとも２つの異なる標的遺伝子の発現を阻害する。
C. 核酸分子の取得
害虫（例えば、鞘翅目）の様々なポリヌクレオチドを、例えばiRNA及びiRNAをコードするDNA分子などの核酸分子の設計に対する標的として使用してもよい。しかしながら天然ポリヌクレオチドの選択は、容易な道ではない。例えば、鞘翅目害虫において、ごく少数の天然ポリヌクレオチドのみが有効な標的である。特定の天然ポリヌクレオチドが本発明の核酸分子により有効に下方制御され得るか否かを確信をもって予測することはできず、又は特定の天然ポリヌクレオチドの下方制御が害虫の成長、活性、摂食、及び／又は生存に対し有害な作用を有しているか否かを確信をもって予測することはできない。鞘翅目害虫の天然ポリヌクレオチドの大部分、例えばそれらから単離されたEST（例えば、米国特許第7,612,194号に列記される鞘翅目害虫のポリヌクレオチド）は、当該害虫の成長及び／又は活性に有害な作用を有していない。害虫に対し有害な作用を有する天然ポリヌクレオチドであって、宿主植物中でかかる天然ポリヌクレオチドに対し相補的な核酸分子を発現させ、当該宿主植物に対し害を及ぼすことなく摂食で害虫に対し有害作用をもたらすための組み換え技術に使用することができることが予測可能なものはない。
一部の実施形態において、核酸分子（害虫（例えば、鞘翅目）の宿主植物に提供される例えばdsRNA分子）は、害虫の発達に必須なタンパク質又はタンパク質部分、例えば代謝又は触媒の生化学的経路、細胞分割、エネルギー代謝、消化、宿主植物認識などに関与するポリペプチドなどをコードするcDNAを標的化するために選択される。本明細書に記載されるように、標的害虫生物体による、１つ以上のdsRNAを含有する組成物の摂取によって、当該標的の死又は他の阻害がもたらされ得、当該dsRNAの少なくとも１つのセグメントは、標的害虫生物体の細胞中で産生される少なくとも実質的に同一のセグメントに対し特異的に相補的である。害虫由来の、DNA又はRNAいずれかのポリヌクレオチドを使用し、当該害虫の蔓延に対し防御される植物細胞を構築するために使用されることができる。鞘翅目害虫の宿主植物（例えば、トウモロコシ（Z. mays）を例えば形質転換して、本明細書に提示される鞘翅目の害虫に由来する１つ以上のポリヌクレオチドを含有させることができる。宿主へと形質転換されるポリヌクレオチドは、形質転換宿主内の細胞又は生物学的液体中でdsRNA構造を形成するRNAを１つ以上コードしてもよく、それによって、害虫がトランスジェニック宿主と栄養学的関係性を形成するとき／形成した場合に、dsRNAを利用可能な状態とすることができる。これによって、害虫の細胞内で１つ以上の遺伝子の発現の抑制が生じ、最終的には死、又はその成長もしくは発達の阻害がもたらされ得る。
特定の実施形態において、害虫（例えば、鞘翅目）の成長及び発達に本質的に関与する遺伝子が標的とされる。本発明の使用に対する他の標的遺伝子としては、例えば、害虫の活性、動作、移動、成長、発達、感染性、及び餌場の確立に重要な役割を果たす遺伝子が挙げられる。ゆえに標的遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子又は転写因子であってもよい。さらに、本発明の使用に対する害虫の天然ポリヌクレオチドはまた、植物、ウイスル、細菌、又は昆虫の遺伝子のホモログ（例えば、オルソログ）から誘導されてもよく、その機能は当分野の当業者に公知であり、そのポリヌクレオチドは標的害虫のゲノム中の標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションによって、既知のヌクレオチド配列を有する遺伝子のホモログを特定する方法は、当分野の当業者に公知である。
一部の実施形態において、本発明は、iRNA（例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、及びhpRNA）分子を生成するためのポリヌクレオチドを含有する核酸分子を取得する方法を提供するものである。かかる実施形態の１つは以下を含有する：（a）害虫（例えば、鞘翅目）におけるdsRNA介在性遺伝子抑制で、その発現、機能、及び表現型に関し、１つ以上の標的遺伝子を解析すること；（b）dsRNA介在性抑制解析において、成長又は発達の表現型の改変（例えば、低下）を示す、標的害虫に由来するポリヌクレオチドもしくはそのホモログのすべて又は一部を含有するプローブを用いて、cDNA又はgDNAライブラリーをプロービングすること；（c）プローブと特異的にハイブリダイズするDNAクローンを特定すること；（d）工程（b）で特定されたDNAクローンを単離すること；（e）工程（d）で単離されたクローンを含有するcDNA断片又はgDNA断片を配列解析することであって、配列解析された核酸分子が当該RNA又はそのホモログのすべて又は実質的な部分を含有していること；及び（f）遺伝子、又はsiRNA、miRNA、hpRNA、mRNA、shRNA、もしくはdsRNAのすべて又は実質的な部分を化学合成すること。
さらなる実施形態において、iRNA（例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、及びhpRNA）分子の実質的な部分を生成するためのポリヌクレオチドを含有する核酸断片を取得する方法は以下を含む：（a）標的害虫（例えば、鞘翅目）由来の天然ポリヌクレオチドの部分に特異的に相補的な第一及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを合成すること；及び（b）工程（a）の第一及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、クローニングベクター中に存在するcDNA挿入又はgDNA挿入を増幅させることであって、当該増幅された核酸分子は、siRNA、miRNA、hpRNA、mRNA、shRNA、又はdsRNA分子の実質的な部分を含有すること。
核酸は、多くの方法により単離、増幅、又は生成することができる。例えば、iRNA（例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、及びhpRNA）分子は、gDNAライブラリー又はcDNAライブラリーから誘導された標的ポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子、又は標的転写非コードポリヌクレオチド）、又はその一部のPCR増幅により取得されてもよい。DNA又はRNAは、標的生物体から抽出されてもよく、及び核酸ライブラリーは、当分野の当業者に公知の方法を使用して、DNA又はRNAから調製されてもよい。標的生物体から作製されたgDNA又はcDNAのライブラリーは、標的遺伝子のPCR増幅及び配列解析に使用されてもよい。確認されたPCR産物は、最小プロモーターを用いてセンスRNA及びアンチセンスRNAを生成するためのin vitro転写のための鋳型として使用されてもよい。あるいは、核酸分子は、例えばホスホラミダイト化学などの標準的化学法を使用するなどの多くの技術のうちのいずれかにより合成されてもよい（例えばOzaki ら (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214; 並びに Agrawal ら (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423)、自動DNA合成装置（例えばP.E. Biosystems, Inc. （カリフォルニア州フォスターシティ）のモデル392又は394 DNA/RNA合成装置）の使用を含む、を参照のこと）。例えば、Beaucageら (1992) Tetrahedron, 48:2223-2311；米国特許第4,980,460号、第4,725,677号、第4,415,732号、第4,458,066号、及び第4,973,679号を参照のこと。例えばホスホロチオアート、ホスホラミダートなどの非天然主鎖基を生じさせる別の化学法を使用することもできる。
本発明のRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、又はhpRNA分子は、手動又は自動化された反応を介して、又は当該RNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、又はhpRNA分子をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸分子を含有する細胞においてin vivoで、当分野の当業者により化学的に又は酵素的に作製することができる。RNAはまた、部分的に、又はすべて有機合成により作製することもでき、任意の修飾リボヌクレオチドをin vitro酵素合成法又は有機合成法により導入することができる。RNA分子は、細胞性RNAポリメラーゼ又はバクテリオファージRNAポリメラーゼ（例えば、T3 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、及びSP6 RNAポリメラーゼ）により合成することができる。ポリヌクレオチドのクローニング及び発現に有用な発現構築物は当分野に公知である。例えば、国際特許PCT出願公開WO97/32016；及び米国特許第5,593,874号、第5,698,425号、第5,712,135号、第5,789,214号、及び第5,804,693号を参照のこと。化学的に合成されたRNA分子、又はin vitro酵素合成により合成されたRNA分子は、精製された後に細胞に導入されてもよい。例えば、RNA分子は溶媒又は樹脂を用いた抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせにより、混合物から精製されることができる。あるいは、化学的に合成されたRNA分子、又はin vitro酵素合成により合成されたRNA分子は、サンプル処理を原因とするロスを回避するために、精製無しで、又は最低限の精製で使用されてもよい。RNA分子は、保管のために乾燥されてもよく、又は水溶液に溶解されてもよい。溶液は、dsRNA分子の二重鎖のアニーリング、及び／又は安定化を促進させる緩衝液又は塩を含有してもよい。
複数の実施形態において、dsRNA分子は、単一の自己相補的RNA鎖により形成されてもよく、又は２つの相補的RNA鎖から形成されてもよい。dsRNA分子は、in vivo又はin vitroのいずれかで合成されてもよい。細胞の内因性RNAポリメラーゼは、in vivoで１つ又は２つのRNA鎖の転写を調節することができ、又はクローン化RNAポリメラーゼを使用して、in vivo又はin vitroで転写を調節することができる。害虫の標的遺伝子の転写後阻害は、宿主の器官、組織、又は細胞における特異的転写により（例えば組織特異的プロモーターにより）；宿主の環境条件の刺激により（例えば、感染、ストレス、温度、及び／又は化学的誘導物質に反応性の誘導性プロモーターを使用することにより）；及び／又は宿主の発達段階又は齢で転写を操作することにより（例えば、発達段階特異的プロモーターを使用することにより）、宿主−標的化されてもよい。dsRNA分子を形成するRNA鎖は、in vitro又はin vivoのいずれで転写されていてもよく、ポリアデニル化されても、されなくてもよく、及び細胞の翻訳機構によりポリペプチドへと翻訳されることができても、できなくてもよい。
D. 組み換えベクター及び宿主細胞の形質転換
一部の実施形態において、本発明はまた、細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、又は植物細胞）への導入のためのDNA分子を提供するものであり、当該DNA分子はRNAへと発現され、害虫（例えば、鞘翅目の害虫又）により摂取されることで当該害虫の細胞、組織、又は器官において標的遺伝子の抑制を実現させるポリヌクレオチドを含有する。したがって、一部の実施形態は、植物細胞においてiRNA（例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、及びhpRNA）分子として発現されることができ、害虫の標的遺伝子発現を阻害するポリヌクレオチドを含有する組み換え核酸分子を提供するものである。発現を開始させ、又は増強させるために、かかる組み換え核酸分子は、１つ以上の制御エレメントを含有してもよく、その制御エレメントはiRNAとして発現されることができるポリペプチドに操作可能に連結されていてもよい。植物において遺伝子抑制分子を発現させる方法は公知であり、その方法を用いて本発明のポリヌクレオチドを発現させることができる。例えば、国際特許PCT出願公開WO06/073727、及び米国特許出願公開2006/0200878 Alを参照のこと。
特定の実施形態において、本発明の組み換えDNA分子は、dsRNA分子を形成することができるRNAをコードするポリヌクレオチドを含有することができる。かかる組み換えDNA分子は、摂食することで、害虫（例えば、鞘翅目の害虫）の細胞において内因性標的遺伝子の発現を阻害することができるdsRNA分子を形成し得るRNAをコードしてもよい。多くの実施形態において、転写されたRNAは、安定化した形態、例えば、ヘアピンアンドステムアンドループ構造として提供され得るdsRNA分子を形成してもよい。
一部の実施形態において、dsRNA分子の１つの鎖は、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドに対し実質的に相同なポリヌクレオチドからの転写により形成されることができる：配列番号１及び３；配列番号１及び３の相補配列；配列番号１及び３の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片（例えば、配列番号５〜８）；配列番号１及び３の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体（例えば、WCR）の天然コードポリヌクレオチド；配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの相補配列；配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；及び配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列。
一部の実施形態において、dsRNA分子の１つの鎖は、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドに対し実質的に相同なポリヌクレオチドからの転写により形成されることができる：配列番号５〜８；配列番号５〜８のいずれかの相補配列；配列番号１及び３のいずれかの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；ならびに配列番号１及び３のいずれかの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列。
特定の実施形態において、dsRNA分子を形成し得るRNAをコードする組み換えDNA分子は、コード領域を含有してもよく、この場合において少なくとも２つのポリヌクレオチドは、少なくとも１つのプロモーターに対して、１つのポリヌクレオチドはセンス方向に、他方のポリヌクレオチドがアンチセンス方向になるよう配置され、この場合においてセンスポリヌクレオチド及びアンチセンスポリヌクレオチドは、例えば約５（〜５）〜約1000（〜1000）のヌクレオチドのスペーサーにより連結され、又は繋がれる。スペーサーは、センスポリヌクレオチドとアンチセンスポリヌクレオチドの間にループを形成してもよい。センスポリヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドは、標的遺伝子（例えば、配列番号１、３及び５〜８のいずれかを含有するsnap25遺伝子）、又はその断片に対して実質的に相同であってもよい。しかしながら一部の実施形態において、組み換えDNA分子は、スペーサー無しでdsRNA分子を形成し得るRNAをコードしてもよい。複数の実施形態において、センスコードポリヌクレオチド、及びアンチセンスコードポリヌクレオチドは異なる長さであってもよい。
害虫に対し有害な作用を有するとして特定されたポリヌクレオチド、又は害虫に関し植物防御的効果を有するとして特定されたポリヌクレオチドは、本発明の組み換え核酸分子中の適切な発現カセットの生成を通して、容易に発現dsRNA分子へと組み込まれ得る。例えば、かかるポリヌクレオチドは、標的遺伝子ポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、３及び５〜８、ならびに前述のいずれかの断片のいずれかを含有するsnap25遺伝子）に対応する第一のセグメントを取り込むことにより；このポリヌクレオチドを、第一のセグメントに対し相同ではない、又は相補的ではない第二のセグメントのスペーサー領域に連結させることにより；及び第三のセグメントにこれを連結させることであって、第三のセグメントの少なくとも一部は第一のセグメントに対し実質的に相補的である、ことにより、ステムアンドループ構造を伴うヘアピン構造として発現され得る。かかる構築物は、第一のセグメントと第三のセグメントの分子内塩基対形成によってステムアンドループ構造を形成し、当該ループ構造は第二のセグメントを含有して形成される。例えば、米国特許出願公開2002/0048814及び2003/0018993、ならびに国際特許PCT出願公開WO94/01550及びWO98/05770を参照のこと。dsRNA分子は、例えばステム−ループ構造（例えば、ヘアピン）などの二本鎖構造の形態で生成されてもよく、それによって、例えばsiRNA生成の増強をもたらす、又はdsRNAヘアピンプロモーターの転写後遺伝子サイレンシングを阻むメチル化を低下させる、追加の植物発現可能なカセット上での、害虫（例えば、鞘翅目の害虫）の天然ポリヌクレオチドに対し標的化されたsiRNAの作製が、当該標的化遺伝子断片の共発現により増強される。
本発明のある実施形態は、１つ以上のiRNA分子の害虫（例えば、鞘翅目の害虫）阻害性レベルの発現を実現させるための、植物への本発明の組み換え核酸分子の導入（すなわち、形質転換）を含む。組み換えDNA分子は、例えば直線状プラスミド又は閉環状プラスミドなどのベクターであってもよい。ベクターシステムは、単一のベクターもしくはプラスミド、又は宿主ゲノムへと導入される総DNAを共に含有している２以上のベクターもしくはプラスミドであってもよい。さらに、ベクターは、発現ベクターであってもよい。本発明の核酸は例えば、１つ以上の宿主において、連結されたコードポリヌクレオチド又は他のDNAエレメントの発現を誘導するよう機能する適切なプロモーターの制御下で、ベクターへと適切に挿入されてもよい。この目的に対して多くのベクターが利用可能であり、適切なベクターの選択は主に、ベクターへと挿入される核酸のサイズ、及びベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存している。各ベクターは、その機能（例えば、DNA増幅又はDNA発現）、及び適合性のある特定の宿主細胞に依存して、様々な構成要素を含有している。
害虫（例えば、鞘翅目の害虫）からの防御をトランスジェニック植物に付与するために、組み換えDNAは、例えば、組み換え植物の組織又は体液内でiRNA分子（例えばdsRNA分子を形成するRNA分子）へと転写されてもよい。iRNA分子は、宿主植物種に対し損害を与え得る害虫内で、対応する転写ポリヌクレオチドに対し実質的に相同であり、特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有してもよい。害虫は、トランスジェニック宿主植物の細胞において転写されるiRNA分子と、iRNA分子を含有するトランスジェニック宿主植物の細胞又は体積を摂取することにより、接触してもよい。したがって特定の例において、トランスジェニック宿主植物に寄生する鞘翅目の害虫内で、標的遺伝子の発現は、iRNA分子により抑制される。一部の実施形態において、標的の鞘翅目害虫における標的遺伝子発現の抑制は、当該害虫による攻撃に対し防御される植物をもたらし得る。
本発明の組み換え核酸を形質転換された植物細胞と栄養学的関係性にある害虫へのiRNA分子の送達を可能とするためには、植物細胞中でのiRNA分子の発現（すなわち、転写）が必要とされる。したがって、組み換え核酸分子は、例えば細菌細胞などの宿主細胞中で機能する異種プロモーターエレメントなどの１つ以上の制御エレメントに操作可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含有してもよく、細菌細胞は当該核酸分子が増幅される場所であり、植物分子は核酸分子が発現される場所である。
本発明の核酸分子における使用に適したプロモーターとしては、誘導性、ウイルス性、合成、又は構造性のプロモーターが挙げられ、それらはすべて当分野に公知である。かかるプロモーターを記載している非限定的な例としては、米国特許第6,437,217号（トウモロコシRS81プロモーター）；米国特許第5,641,876号（イネアクチンプロモーター）；米国特許第6,426,446号（トウモロコシRS324プロモーター）；米国特許第6,429,362号（トウモロコシPR-1プロモーター）；米国特許第6,232,526号（トウモロコシA3プロモーター）；米国特許第6,177,611号（構造性トウモロコシプロモーター）；米国特許第5,322,938号、第5,352,605号、第5,359,142号、及び第5,530,196号（CaMV 35Sプロモーター）；米国特許第6,433,252号（トウモロコシL3オレオシンプロモーター）；米国特許第6,429,357号（イネアクチン2プロモーター、及びイネアクチン2イントロン）；米国特許第6,294,714号（光誘導性プロモーター）；米国特許第6,140,078号（塩誘導性プロモーター）；米国特許第6,252,138号（病原体誘導性プロモーター）；米国特許第6,175,060号（リン欠乏誘導性プロモーター）；米国特許第6,388,170号（二方向性プロモーター）；米国特許第6,635,806号（ガンマ−コイキシン（coixin）プロモーター）；及び米国特許出願公開第2009/757,089号（トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター）が挙げられる。追加のプロモーターとしては、ノパリンシンターゼ（NOS）プロモーター（Ebert ら （1987） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84（16）:5745-9）；オクトピンシンターゼ（OCS）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍誘導性プラスミド上に担持されている）；カリフラワーモザイクウイルス （CaMV）19Sプロモーターなどのカリモウイルスプロモーター（Lawton ら （1987）Plant Mol. Biol. 9:315-24）；CaMV 35Sプロモーター（Odell ら （1985）Nature 313:810-2）；ゴマノハグサモザイクウイルス35Sプロモーター（Walker ら （1987）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84（19）:6624-8）；スクロースシンターゼプロモーター（Yang 及び Russell （1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8）；R遺伝子複合体プロモーター（Chandler ら （1989）Plant Cell 1:1175-83）；CaMV35S （米国特許出願第5,322,938号、第5,352,605号、第5,359,142号、及び第5,530,196号）；FMV35S （米国特許出願第6,051,753号、及び第5,378,619号）；PC1SVプロモーター（米国特許出願第5,850,019号）；SCP1 プロモーター（米国特許出願第6,677,503号）；及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス（AGRtu.）Nosプロモーター（GenBank（商標）アクセッション番号V00087； Depicker ら （1982） J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73； Bevan ら （1983） Nature 304:184-7）などが挙げられる。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、例えば根特異的なプロモーターなどの組織特異的プロモーターを含有する。根特異的プロモーターは、根組織で限局的又は優先的に、操作可能に連結されたコードポリヌクレオチドの発現を誘導する。根特異的プロモーターの例は、当分野に公知である。例えば、米国特許第5,110,732号、第5,459,252号、及び第5,837,848号、ならびにOpperman ら (1994) Science 263:221-3、及びHirel ら (1992) Plant Mol.Ｂｉｏｌ．20:207-18を参照のこと。一部の実施形態において、本発明に従う鞘翅目害虫の制御のためのポリヌクレオチド又は断片は、当該ポリヌクレオチド又は断片に対し反対の転写方向を向いた２つの根特異的プロモーターの間でクローニングされてもよく、及びそれらはトランスジェニック植物細胞において操作可能であり、その中で発現され、トランスジェニック植物細胞中でRNA分子を産生し、その後、上記に記載されるようにdsRNA分子を形成してもよい。植物組織中で発現されるiRNA分子は、害虫に接触されてもよく、それにより標的遺伝子発現の抑制が実現される。
核酸に操作可能に任意で連結され得る追加の制御エレメントとしては、翻訳リーダーエレメントとして機能する、プロモーターエレメントとコードポリヌクレオチドの間に位置する５’UTRが挙げられる。翻訳リーダーエレメントは、完全にプロセッシングされたmRNAで存在し、一次転写物のプロセッシング、及び／又はRNAの安定性に影響を与えうる。翻訳リーダーエレメントの例としては、トウモロコシ及びペチュニアのヒートショックプロテインリーダー（米国特許第5,362,865号）、植物ウイルスコートタンパク質リーダー、植物ルビスコリーダー、及びその他が挙げられる。例えば、Turner 及び Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36、5'UTRの非限定的な例としては、GmHsp（米国特許第5,659,122号）、PhDnaK（米国特許第5,362,865号）、AtAnt1、TEV (Carrington 及び Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7)、及びAGRtunos (GenBank（商標）アクセッション番号V00087、及びBevan ら (1983) Nature 304:184-7）が挙げられる。
核酸に操作可能に任意で連結され得る追加の制御エレメントとしては、３’非翻訳エレメント、３’転写終結領域、又はポリアデニル化領域が挙げられる。これらはポリヌクレオチドの下流に位置する遺伝的エレメントであり、ポリアデニル化シグナル、及び／又は転写もしくはmRNAのプロセッシングに影響を与え得る他の制御シグナルをもたらすポリヌクレオチドを含む。ポリアデニル化シグナルは植物においいて機能し、mRNA前駆体の３’末端にポリアデニル酸ヌクレオチドの付加をもたらす。ポリアデニル化エレメントは、様々な植物遺伝子から誘導することができ、又はT-DNA遺伝子から誘導することができる。３’翻訳終結領域の非限定的な例は、ノパリンシンターゼ３’領域（nos 3'；Fraley ら(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）である。異なる３’非翻訳領域の使用の例は、Ingelbrecht ら (1989) Plant Cell 1:671-80に提示されている。ポリアデニル化シグナルの非限定的な例としては、エンドウマメ（Pisum sativum）RbcS2遺伝子(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi ら (1984) EMBO J. 3:1671-9)及びAGRtu.nos(GenBank（商標）アクセッション番号E01312)からのものが挙げられる。
一部の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドの１つ以上に操作可能に連結された、上記の制御エレメントのうちの少なくとも１つを含有する、単離され、生成されたDNA分子を含有する植物形質転換ベクターを含み得る。発現されたとき、１つ以上のポリヌクレオチドは、害虫（例えば、鞘翅目の害虫）の天然RNA分子のすべて又は一部に対し特異的に相補的なポリヌクレオチドを含有するiRNA分子を１つ以上生じさせる。したがって、ポリヌクレオチドは、標的とされた鞘翅目害虫のRNA転写物内に存在するポリリボヌクレオチドのすべて又は一部をコードするセグメントを含有してもよく、及び標的とされた害虫転写物のすべて又は一部の反転されたリピートを含有してもよい。植物形質転換ベクターは、２つ以上の標的ポリヌクレオチドに対し特異的に相補的なポリヌクレオチドを含有してもよく、それによって、標的害虫の１つ以上の群れ、又は種の細胞中の２つ以上の遺伝子の発現を阻害する２つ以上のdsRNAの生成が可能となる。異なる遺伝子中に存在するポリヌクレオチドに対し特異的に相補的なポリヌクレオチドのセグメントは、トランスジェニック植物における発現のための単一混成核酸分子へと組み合わされることができる。かかるセグメントは連続的であってもよく、又はスペーサーにより分離されていてもよい。
他の実施形態において、すでに本発明のポリヌクレオチドを少なくとも１つ含有している本発明のプラスミドは、同じプラスミドにおける追加ポリヌクレオチドの連続挿入により改変されていてもよく、当該追加のポリヌクレオチドは、当該少なくとも１つのポリヌクレオチドと同じ制御エレメントに操作可能に連結されている。一部の実施形態において、核酸分子は、複数の標的遺伝子の阻害用に設計されていてもよい。一部の実施形態において、阻害される複数の遺伝子は、同じ害虫種（例えば、鞘翅目）から取得されてもよく、それらは核酸分子の有効性を高めるものであってもよい。他の実施形態において、遺伝子は異なる害虫から誘導されてもよく、それによって、その剤が有効である害虫の範囲を広げることができる。複数の遺伝子が、抑制の標的とされた場合、又は発現と抑制の組み合わせの標的とされた場合、ポリシストロニックなDNAエレメントが操作されてもよい。
本発明の組み換え核酸又はベクターは、例えば植物細胞などの形質転換細胞に選択可能な表現型を寄与する選択マーカーを含んでもよい。選択マーカーを使用し、本発明の組み換え核酸分子を含有する植物又は植物細胞を選択してもよい。マーカーは、殺生物剤抵抗性、抗生物質抵抗性（例えば、カナマイシン、Geneticin（G418）、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、など）又は除草剤抵抗性（例えばグリホサートなど）をコードしてもよい。選択マーカーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない： カナマイシン抵抗性をコードし、カナマイシン、G418などを使用し選択されることができるneo遺伝子；ビアラホス抵抗性をコードするbar遺伝子；グリホサート抵抗性をコードする変異EPSPシンターゼ遺伝子；ブロモキシニルに対する抵抗性を付与するnitrilase遺伝子；イミダゾリノン又はスルホニルウレアの抵抗性を寄与する変異アセト乳酸シンターゼ（ALS）遺伝子；及びメトトレキサート抵抗性DHFR遺伝子。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、スペクチノマイシン、リファンピシン、ストレプトマイシン、及びテトラサイクリンなどに対する抵抗性を寄与する選択マーカーが複数、利用可能である。かかる選択マーカーの例は、例えば、米国特許第5,550,318号、第5,633,435号、第5,780,708号、及び第6,118,047号に解説されている。
本発明の組み換え核酸分子又はベクターは、スクリーンマーカーを含有してもよい。スクリーンマーカーを使用し、発現を監視してもよい。例示的なスクリーンマーカーとしては、様々な発色性基質が公知である酵素をコードするβ−グルクロニダーゼ又はuidA遺伝子（GUS) (Jefferson ら (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405)；植物組織においてアントシアニン色素（赤色）の産生を制御する産物をコードするR‐locus遺伝子(Dellaporta ら (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18 th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson 及び R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82)；β−ラクタマーゼ遺伝子(Sutcliffe ら (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41)；様々な発色性基質が公知である酵素をコードする遺伝子（例えば、PADAC、発色性セファロスポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子(Ow ら (1986) Science 234:856-9)；発色性カテコール類を転換することができるカテコールジオキシゲナーゼをコードするxylE遺伝子(Zukowski ら (1983) Gene 46(2-3):247-55)；アミラーゼ遺伝子(Ikatu ら (1990) Bio/Technol. 8:241-2)；チロシンをDOPA及びドーパキノン（次にメラニンへと濃縮される）へと酸化することができる酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子(Katz ら (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14)；及びa-ガラクトシダーゼ、が挙げられる。
一部の実施形態において、上記に記載される組み換え核酸分子は、トランスジェニック植物の作製方法、及び植物中で異種核酸を発現させ、害虫（例えば鞘翅目の害虫）に対する感受性の低下を示すトランスジェニック植物を調製する方法において使用されてもよい。植物形質転換ベクターは、例えばiRNA分子をコードする核酸分子を植物形質転換ベクターへと挿入し、これらを植物へと導入することにより調製することができる。
宿主細胞の適切な形質転換方法としては、細胞へDNAを導入することができる任意の方法が挙げられるが、例えばプロトプラストの形質転換による方法 (例えば米国特許第5,508,184号を参照のこと)、乾燥／阻害介在性DNA取り込みによる方法（例えば、Potrykus ら (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8を参照のこと)、エレクトロポレーションによる方法（例えば、米国特許第5,384,253号を参照のこと）、炭化ケイ素繊維を用いた攪拌による方法（例えば、米国特許第5,302,523号及び第5,464,765号を参照のこと）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性形質転換による方法（例えば、米国特許第5,563,055号、第5,591,616号、第5,693,512号、第5,824,877号、第5,981,840号、及び第6,384,301号を参照のこと）、及びDNAコート化粒子の加速による方法（例えば、米国特許第5,015,580号、第5,550,318号、第5,538,880号、第6,160,208号、第6,399,861号、及び第6,403,865号を参照のこと）などが挙げられる。トウモロコシの形質転換に特に有用な技術は、例えば米国特許第7,060,876号及び第5,591,616号、ならびに国際特許PCT出願公開WO95/06722に記載されている。例えばこれらの技術を適用することにより、事実上すべての種の細胞を安定的に形質転換することができる。一部の実施形態において、形質転換DNAは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。多細胞の種の場合には、トランスジェニック細胞を、トランスジェニック生物体へと再生することができる。これらの技術のいずれかを使用して、例えばトランスジェニック植物のゲノム中に、１つ以上のiRNA分子をコードする１つ以上の核酸を含有するトランスジェニック植物を作製してもよい。
植物への発現ベクターの導入に最も広く利用されている方法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）の天然形質転換系に基づく方法である。A.ツメファシエンス（A. tumefaciens）及びA.リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換する植物病原性土壌細菌である。A.ツメファシエンス（A. tumefaciens）及びA.リゾゲネス（A. rhizogenes）のそれぞれTiプラスミドとRiプラスミドは、植物の遺伝的形質転換の原因となる遺伝子を担持している。Ti（腫瘍誘導性）プラスミドは、T-DNAとして知られる大きなセグメントを含有しており、形質転換植物へと移送される。Tiプラスミドの他のセグメントであるVir領域は、T-DNAの移送に寄与している。T-DNA領域は、末端リピートに隣接している。改変バイナリーベクターにおいて、腫瘍誘導性遺伝子は削除され、Vir領域の機能が利用され、T-DNA境界エレメントに隣接する外来性DNAが移送される。T-領域はまた、トランスジェニック細胞及び植物の効率的な回収のための選択マーカーを含有してもよく、及び例えばdsRNAコード核酸などの移送のためのポリヌクレオチド挿入のためのマルチプルクローニングサイトを含有してもよい。
特定の実施形態において、植物形質転換ベクターは、A.ツメファシエンス（A. tumefaciens）のTiプラスミドから誘導され（例えば、米国特許第4,536,475号、第4,693,977号、第4,886,937号、及び第5,501,967号、ならびに欧州特許第EP 0 122 791号を参照のこと）、又はA.リゾゲネス（A. rhizogenes）のRiプラスミドから誘導される。追加の植物形質転換ベクターとしては、例えば限定されないが、Herrera-Estrella ら (1983) Nature 303:209-13；Bevan ら (1983) Nature 304:184-7；Klee ら (1985) Bio/Technol.3:637-42、及び欧州特許第EP 0 120 516号に記載されるもの、ならびに前述のいずれかから誘導されるものが挙げられる。例えばシノリゾビウム（Sinorhizobium）、リゾビウム（Rhizobium）、及びメソリゾビウム（Mesorhizobium）などの植物と自然に相互作用する他の細菌を改変し、多くの多様な植物への遺伝子移送を介在してもよい。これらの植物関連共生細菌は、不活性化Tiプラスミド及び適切なバイナリーベクターの両方を獲得することにより、遺伝子移送の能力を有することができる。
レシピエント細胞に外因性DNAをもたらした後、形質転換細胞は多くの場合、さらなる培養及び植物再生に関して特定される。形質転換細胞を特定する能力を改善するために、形質転換体を作製するために使用された形質転換ベクターと共に、前述の選択マーカー又はスクリーンマーカーを利用することを所望してもよい。選択マーカーが使用された場合、形質転換細胞は、当該細胞を選択剤へと曝露させることにより、形質転換された可能性のある細胞群内で特定される。スクリーンマーカーが使用された場合、細胞は、所望のマーカー遺伝子の形質に対しスクリーニングされてもよい。
選択剤への曝露を生き残った細胞、又はスクリーニングアッセイにおいて陽性を記録した細胞を、植物再生を支持する培地中で培養してもよい。一部の実施形態において、任意の適切な植物組織培養培地（例えば、MS及びN6培地）を、例えば成長調節因子などのさらなる物質を含ませることにより改変してもよい。組織は、植物再生の試みを開始するのに充分な組織が利用可能となるまで、成長調節因子を有する基礎培地上で維持されてもよく、又は組織の形態が再生に適するまで（例えば、少なくとも２週間）、手動選択ラウンドを反復した後、発芽形成に寄与する培地へ組織を移送してもよい。培養物は、充分な発芽形成が発生するまで、定期的に移送される。発芽が形成されたら、それらを、根形成に寄与する培地へと移送する。充分な根が形成されたら、さらなる成長と成熟のために植物を土壌へと移してもよい。
対象の核酸分子（例えば、鞘翅目害虫において標的遺伝子の発現を阻害するiRNA分子を１つ以上コードするDNAなど）が再生植物中に存在していることを確認するために、様々なアッセイを行ってもよい。かかるアッセイとしては、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、PCRならびに核酸配列解析などの分子生物学的アッセイ；例えばタンパク質産物の存在を検出するための、例えば免疫学的手法（ELISA及び／又はウェスタンブロット）による、又は酵素機能による生化学的アッセイ；例えば葉又は根のアッセイなどの植物部分のアッセイ；及び再生植物全体の表現型の解析などが挙げられる。
例えば、対象の核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用したPCR増幅により、組み込みイベントを解析してもよい。PCR遺伝子型決定は、限定されないが、ゲノム内に組み込まれた対象核酸分子を含有することが予測されている単離宿主植物カルス組織由来のgDNAのポリメラーゼ鎖反応（PCR）増幅を行った後、PCR増幅産物の標準的なクローニングと配列解析を含むものと理解されている。PCR遺伝子型決定法は詳細に記載されており（例えば、Rios, G. ら (2002) Plant J. 32:243-53)、細胞培養物を含む、任意の植物種（例えば、トウモロコシ（Z. mays）又は組織型由来のgDNAへと適用することができる。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）依存性形質転換法を使用して形成されたトランスジェニック植物は通常、１つの染色体に挿入された単一組み換えDNAを含有する。単一組み換えDNAのポリヌクレオチドは、「トランスジェニックイベント」又は「組み込みイベント」と呼称される。かかるトランスジェニック植物は、挿入された外因性ポリヌクレオチドに関し、ヘテロ接合体である。一部の実施形態において、導入遺伝子に関してホモ接合体のトランスジェニック植物は、単一外因性遺伝子を含有する、独立分離トランスジェニック植物、例えばT0植物を、自身と性的交配（自殖）させ、T1種子を産生することにより取得することができる。産生されたT1種子のうちの４分の１が、導入遺伝子に関しホモ接合体である。T1種子を発芽させることにより、ヘテロ接合体とホモ接合体の区別を可能とするSNPアッセイ又はサーマル増幅アッセイを通常は使用して、ヘテロ接合性に関し検証することができる植物が生じる（すなわち、接合性アッセイ）。
特定の実施形態において、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０以上の異なるiRNA分子が、害虫（例えば鞘翅目）阻害効果を有する植物細胞において産生されている。iRNA分子（例えば、dsRNA分子）は、異なる形質転換イベントで導入された複数の核酸から発現されてもよく、又は１つの形質転換イベントで導入された１つの核酸から発現されてもよい。一部の実施形態において、複数のiRNA分子は、単一のプロモーターの制御下で発現される。他の実施形態において、複数のiRNA分子は、複数のプロモーターの制御下で発現される。１つ以上の害虫内の異なる座位（例えば、配列番号１、及び３により規定される座位）に対し各々相同な複数のポリヌクレオチドを含有する単一のiRNA分子が、同一種の害虫の異なる群において、又は別種の害虫においての両方で発現されてもよい。
組み換え核酸分子を用いた植物の直接的な形質転換に加え、トランスジェニック植物は、少なくとも１つのトランスジェニックイベントを有する第一の植物と、かかるイベントを欠く第二の植物を交配させることにより作製することもできる。例えば、iRNA分子をコードするポリヌクレオチドを含有する組み換え核酸分子を、トランスジェニック植物を産生するための形質転換を受入可能な第一の植物系統へと導入し、そのトランスジェニック植物を第二の植物系統と交配させ、iRNA分子コードするポリヌクレオチドを第二の植物系統に遺伝子移入してもよい。
一部の態様において、形質転換植物細胞に由来するトランスジェニック植物から産生された種子及び商品生産物が含まれ、当該種子及び商品生産物は、検出可能な量の本発明核酸を含有している。一部の実施形態において、かかる商品生産物は、トランスジェニック植物を取得し、それらから食物又は餌を作製することにより製造されてもよい。本発明のポリヌクレオチドを１つ以上含有する商品生産物としては、例えば限定されないが、以下が挙げられる：植物種子の粗挽き粉末、油、又は破砕粒子もしくは全粒子、及び本発明核酸を１つ以上含有する組み換え植物又は種子の任意の粗挽き粉末、油、又は破砕粒子もしくは全粒子を含有する任意の食品。１つ以上の農産物又は商品生産物中において、本発明ポリヌクレオチドを１つ以上検出することは、当該一次産品又は商品生産物が、害虫（例えば鞘翅目の害虫）の制御を目的とした本発明iRNA分子を１つ以上発現するよう設計されたトランスジェニック植物から作製されたことの事実上の証拠である。
一部の実施形態において、本発明の核酸分子を含有するトランスジェニック植物又は種子はまた、そのゲノム中に以下をはじめとする少なくとも１つの他のトランスジェニックイベントを含有し得るが、これらに限定されない：配列番号１及び３により規定されるもの以外の鞘翅目害虫の座位、たとえばCaf1-180 (米国特許出願公開2012/0174258)、VatpaseC (米国特許出願公開2012/0174259)、Rho1 (米国特許出願公開2012/0174260)、VatpaseH (米国特許出願公開2012/0198586)、PPI-87B (米国特許出願公開2013/0091600)、RPA70 (米国特許出願公開2013/0091601)、RPS6 (米国特許出願公開2013/0097730)、ROP (米国特許出願14/577,811)、RNAポリメラーゼI1 (米国特許出願公開62/133,214)、RNAポリメラーゼII140 (米国特許出願公開14/577,854)、RNAポリメラーゼII215 (米国特許出願公開62/133,202)、RNAポリメラーゼII33 (米国特許出願公開62/133,210)、ncm (米国特許出願62/095487)、Dre4 (米国特許出願14/705,807)、COPIアルファ(米国特許出願62/063,199)、COPIベータ(米国特許出願62/063,203)、COPIガンマ(米国特許出願62/063,192)、COPIデルタ(米国特許出願62/063,216)、prp8 (米国特許出願62/193505)、spt5 (米国特許出願62/168,613)、及びspt6 (米国特許出願62/168,606)からなる群から選択される１つ以上の座位などを標的とするiRNA分子が転写されるトランスジェニックイベント；鞘翅目害虫以外の生物体（例えば、植物寄生線虫）の遺伝子を標的とするiRNA分子が転写されるトランスジェニックイベント；殺虫タンパク質（例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫タンパク質、及びPIP-1ポリペプチドなど）をコードする遺伝子；除草剤耐性遺伝子（例えば、グリホサート耐性をもたらす遺伝子）；及びトランスジェニック植物に所望される表現型、例えば収率の上昇、脂肪酸代謝の改変、又は細胞質雄性不稔の回復などを付与する遺伝子。特定の実施形態において、本発明のiRNA分子をコードするポリヌクレオチドは、植物における他の昆虫制御及び疾病の形質と組み合わされて、植物疾病及び昆虫ダメージの制御を増強するための所望される形質を得てもよい。異なる作用機序を用いる昆虫制御形質を組み合わせることによって、単一の制御形質を有する植物よりも優れた耐久性を有する防御トランスジェニック植物がもたらされ得、例えばその理由は、当該形質に対する抵抗性が野外で発現する可能性が低下するためである。
V. 害虫における標的遺伝子抑制
A. 概要
本発明の一部の実施形態において、害虫（例えば鞘翅目の害虫）の制御に有用な少なくとも１つの核酸分子が害虫にもたらされ、当該核酸分子は、当該害虫においてRNAi介在性遺伝子サイレンシングをもたらす。特定の実施形態において、iRNA分子（例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、及びhpRNA）が、鞘翅目害虫にもたらされてもよい。一部の実施形態において、害虫の制御に有用な核酸分子は、当該核酸分子と害虫が接触することにより、害虫へともたらされてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、害虫の制御に有用な核酸分子は、例えば栄養性組成物などの害虫の給餌基質中に提供されてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、害虫の制御に有用な核酸分子は、害虫により摂食される、核酸分子を含有する植物性物質の摂食を介して提供されてもよい。ある実施形態において、核酸分子は、例えば組み換え核酸を含有するベクターを用いた植物細胞の形質転換ならびに形質転換された植物細胞からの植物物質及び植物全体の再生により、植物物質へと導入された組み換え核酸の発現を介して植物物質中に存在する。
B. RNAi介在性標的遺伝子の抑制
ある実施形態において、本発明は、例えば標的ポリヌクレオチドに特異的に相補的なポリヌクレオチドを含有する鎖を少なくとも１つ含有するiRNA分子を設計することにより、害虫（例えば、鞘翅目（例えば、WCR、NCR、及びSCR）の害虫）のトランスクリプトームにおいて必須の天然ポリヌクレオチド（例えば、必須遺伝子）を標的とするよう設計され得るiRNA分子（例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、及びhpRNA）を提供するものである。そのように設計されたiRNA分子の配列は、標的ポリヌクレオチドの配列と同一であってもよく、又はiRNA分子とその標的ポリヌクレオチドの間の特異的ハイブリダイゼーションを阻害しないミスマッチを組み込んでもよい。
本発明のiRNA分子は、害虫（例えば鞘翅目の害虫）において遺伝子抑制を行うための方法に使用されてもよく、それによって、害虫により生じる植物（例えば、iRNA分子を含有する防御された形質転換植物）への損害のレベル又は発生率を低下させてもよい。本明細書において使用される場合、「遺伝子抑制」という用語は、mRNAへの遺伝子転写及び引き続くmRNAの翻訳の結果として生成されるタンパク質のレベルを低下させるための公知の方法のいずれかを指し、遺伝子又はコードポリヌクレオチドからタンパク質発現の低下を含み、発現の転写後阻害及び転写抑制を含む。転写後阻害は、抑制の標的とされた遺伝子から転写されたmRNAのすべて、又は一部と、抑制に使用される対応するiRNA分子の間の特異的相同性により介在される。さらに、転写後阻害とは、リボソームによる結合に関して細胞内で利用可能なmRNAの量の実質的な低下、及び計測可能な低下を指す。
iRNA分子がdsRNA分子である一部の実施形態において、dsRNA分子は、酵素のDICERにより短いsiRNA分子（およそ20ヌクレオチドの長さ）へと開裂されてもよい。dsRNA分子に対するDICERの活性により生成された二本鎖siRNA分子は、２つの一本鎖siRNA；「パッセンジャーストランド」と「ガイドストランド」へと分離され得る。パッセンジャーストランドは分解されてもよく、ガイドストランドはRISCへと組み込まれてもよい。ガイドストランドが特異的に相補的なmRNA分子のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイゼーションし、引き続き酵素のアルゴノート（RISC複合体の触媒要素）により開裂されることによって、転写後阻害が発生する。
本発明の他の実施形態において、いずれの形態のiRNA分子を使用してもよい。当分野の当業者であれば、dsRNA分子は、通常、一本鎖RNA分子よりも、調製の間、及びiRNA分子を細胞に提供する工程の間でさらに安定しており、及び通常、細胞内においてもさらに安定である。したがって、siRNA分子及びmiRNA分子がたとえば一部の実施形態においては等しく効果的である場合がある一方で、安定性を理由としてdsRNA分子が選択される場合もある。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドを含有する核酸分子が提供され、当該ポリヌクレオチドはin vitroで発現され、害虫（例えば、鞘翅目の害虫）のゲノム内のポリヌクレオチドによりコードされる核酸分子に対して実質的に相同なiRNA分子を産生してもよい。ある実施形態において、in vitroで転写されたiRNA分子は、ステムループ構造を有する安定化dsRNA分子であってもよい。害虫が、in vitro転写されたiRNA分子と接触した後、害虫の標的遺伝子（例えば必須遺伝子）の転写後阻害が発生してもよい。
本発明の一部の実施形態において、ポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続したヌクレオチド（例えば少なくとも19個の連続したヌクレオチド）を含有する核酸分子の発現は、害虫（例えば鞘翅目の害虫）の標的遺伝子の転写後阻害のための方法において使用され、当該ポリヌクレオチドは、以下からなる群から選択される：配列番号１；配列番号１の相補配列；配列番号３；配列番号３の相補配列；配列番号５；配列番号５の相補配列；配列番号６；配列番号６の相補配列；配列番号７；配列番号７の相補配列；配列番号８；配列番号８の相補配列；配列番号１及び３のいずれかの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１及び３のいずれかの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチド；配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの相補配列；配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；及び配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列。ある実施形態において、前述のいずれかと少なくとも約80％同一（例えば、79％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％及び100％）である核酸分子の発現が使用されてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、害虫（例えば、鞘翅目の害虫）の少なくとも１つの細胞に存在するRNA分子に対し特異的にハイブリダイズする核酸分子が発現されてもよい。
RNAi転写後阻害系は、遺伝子変異、系統ポリモルフィズム、又は進化的多様性によるものと予測され得る標的遺伝子間の配列変動を許容することができるという点が、本明細書の一部の実施形態の重要な特性である。導入された核酸分子が、標的遺伝子の一次転写産物、又は完全にプロセッシングされたmRNAのいずれかに対し、特異的にハイブリダイズ可能である限りは、当該導入された核酸分子が、標的遺伝子の一次転写産物、又は完全にプロセッシングされたmRNAのいずれかに対し完全に相同性である必要性はない。さらに、導入された核酸分子は、標的遺伝子の一次転写産物、又は完全にプロセッシングされたmRNAのいずれかに対し、完全超である必要はない。
本発明のiRNA技術を使用した標的遺伝子の阻害は、配列特異的である。すなわち、iRNA分子に対し実質的に相同的なポリヌクレオチドが、遺伝子阻害の標的となる。一部の実施形態において、標的遺伝子の一部の配列に対して同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含有するRNA分子が、阻害に使用されてもよい。これら、及びさらなる実施形態において、標的ポリヌクレオチドに対し、１つ以上の挿入、欠失、及び／又は点変異を有するポリヌクレオチドを含有するRNA分子を使用してもよい。特定の実施形態において、iRNA分子と標的遺伝子の一部は、例えば少なくとも約80％〜、少なくとも約81％〜、少なくとも約82％〜、少なくとも約83％〜、少なくとも約84％〜、少なくとも約85％〜、少なくとも約86％〜、少なくとも約87％〜、少なくとも約88％〜、少なくとも約89％〜、少なくとも約90％〜、少なくとも約91％〜、少なくとも約92％〜、少なくとも約93％〜、少なくとも約94％〜、少なくとも約95％〜、少なくとも約96％〜、少なくとも約97％〜、少なくとも約98％〜、少なくとも約99％〜、少なくとも約100％〜、及び100％の配列同一性を共有してもよい。あるいは、dsRNA分子の二重鎖領域が、標的遺伝子転写物の一部と特異的にハイブリダイズしてもよい。特異的にハイブリダイズ可能な分子において、高い相同性を示す全長未満の長さのポリヌクレオチドが、より長いが相同性は低いポリヌクレオチドを相殺する。標的遺伝子転写物の一部と同一であるdsRNA分子の二重鎖領域のポリヌクレオチドの長さは、少なくとも約25、50塩基、100塩基、200塩基、300塩基、400塩基、500塩基又は少なくとも約1000塩基であってもよい。一部の実施形態において、20〜100ヌクレオチドよりも長いポリヌクレオチドが使用されてもよい。特定の実施形態において、約200〜300ヌクレオチドよりも長いポリヌクレオチドが使用されてもよい。特定の実施形態において、標的遺伝子のサイズにより、約500〜1000ヌクレオチドよりも長いポリヌクレオチドが使用されてもよい。
ある実施形態において、害虫（例えば、鞘翅目）の標的遺伝子の発現は、重大な阻害が発生するよう、当該害虫の細胞内で少なくとも10％、少なくとも33％、少なくとも50％、又は少なくとも80％まで阻害されてもよい。 重大な阻害とは、検出可能な表現型（例えば、成長の停止、摂食の停止、発達の停止、死の誘導など）、又は阻害される標的遺伝子に対応するRNA及び／又は遺伝子産物の検出可能な低下を生じさせる閾値を超える阻害を指す。本発明のある実施形態においては、害虫の実質的に全ての細胞で阻害が発生するが、他の実施形態では、標的遺伝子を発現する細胞のサブセットでのみ阻害が発生する。
一部の実施形態において、転写抑制は、プロモーターDNA、又はその相補配列に対して実質的な配列同一性を示すdsRNA分子が細胞中に存在することにより調節され、「プロモータートランス抑制」と呼ばれる効果をもたらす。遺伝子抑制は、例えばdsRNA分子を含有する植物物質を摂取又は接触することにより、かかるdsRNA分子を摂取又は接触し得る害虫の標的遺伝子に対して有効であってもよい。プロモータートランス抑制における使用のためのdsRNA分子は、害虫の細胞における、１つ以上の相同な、又は相補的なポリヌクレオチドの発現を阻害又は抑制するよう特異的に設計されてもよい。植物細胞で遺伝子発現を制御する、アンチセンス方向又はセンス方向のRNAによる転写後遺伝子抑制は、米国特許第5,107,065号、第5,759,829号、第5,283,184号、及び第5,231,020号に開示されている。
C. 害虫にもたらされたiRNA分子の発現
害虫（例えば、鞘翅目の害虫）におけるRNAi介在性遺伝子阻害のためのiRNA分子の発現は、多くのin vitro又はin vivo様式のうちのいずれか１つで行うことができる。次いで、例えば害虫とiRNA分子を接触させることにより、又は害虫に摂取させることにより、もしくはさもなければ、iRNA分子を内在化させることにより、害虫にiRNA分子がもたらされてもよい。一部の実施形態は、鞘翅目害虫の形質転換された宿主植物、形質転換された植物細胞、及び形質転換植物の子孫を含む。形質転換された植物細胞、及び形質転換された植物を、たとえば異種プロモーターの制御下でiRNA分子のうちの１つ以上を発現するよう操作し、害虫防御効果をもたらしてもよい。したがって、トランスジェニック植物又は植物細胞が、摂食の間に害虫により摂取された場合、当該害虫は、当該トランスジェニック植物又は細胞に発現されたiRNA分子を摂取し得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、iRNA分子を産生する広範な種類の原核細胞微生物宿主及び真核細胞微生物宿主へと導入されてもよい。「微生物」という用語は、例えば細菌及び真菌などの原核細胞種及び真核細胞種を含む。
遺伝子発現の調節は、かかる発現の部分抑制又は完全抑制を含み得る。他の実施形態において、害虫（例えば、鞘翅目）における遺伝子発現の抑制方法は、害虫の宿主の組織に、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの転写後に形成されたdsRNA分子の少なくとも１つの遺伝子抑制量をもたらすこと、を含み、その少なくとも１つのセグメントは、害虫細胞内のmRNAに相補的である。害虫により摂取される、例えばsiRNA、miRNA、shRNA、又はhpRNA分子などの、その改変型を含むdsRNA分子は、例えば配列番号１、３、及び５〜８からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、snap25DNA分子から転写されたRNA分子に対し、少なくとも約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は約100％同一であってもよい。したがって限定されないが、非天然型ポリヌクレオチド、及びdsRNA分子を提供するための組み換えDNA構築物を含む、単離され、実質的に精製された核酸分子が提供され、当該核酸分子は導入されたとき、害虫の内因性コードポリヌクレオチド又は標的コードポリヌクレオチドの発現を抑制又は阻害する。
特定の実施形態は、植物害虫（例えば鞘翅目の害虫）の１つ以上の標的遺伝子の転写後阻害、及び植物害虫群の制御のためのiRNA分子の送達のための送達システムを提供するものである。一部の実施形態において、送達システムは、トランスジェニック宿主植物細胞、又は宿主細胞中で転写されたRNA分子を含有する宿主細胞の内容物の摂取を含む。これら、及びさらなる実施形態において、本発明の安定化dsRNA分子をもたらす組み換えDNA構築物を含有するトランスジェニック植物細胞、又はトランスジェニック植物が作製される。特定のiRNA分子をコードする核酸を含有するトランスジェニック植物細胞及びトランスジェニック植物は、本発明のiRNA分子（例えば、安定化dsRNA分子）をコードするポリヌクレオチドを含有する植物形質転換ベクターを構築する；植物細胞又は植物を形質転換する；及び転写されたiRNA分子を含有するトランスジェニック植物細胞又はトランスジェニック植物を生成する、組み換えDNA技術（その基礎技術は当分野に公知である）を用いることにより作製されることができる。
トランスジェニック植物に害虫（例えば、鞘翅目の害虫）防御を与えるため、組み換えDNA分子は例えばiRNA分子、例えばdsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子、又はhpRNA分子に転写されてもよい。一部の実施形態において、組み換えDNA分子から転写されたRNA分子は、組み換え植物の組織又は体液内でdsRNA分子を形成してもよい。かかるdsRNA分子は、宿主植物に寄生し得るタイプの害虫内でDNAから転写された対応するポリヌクレオチドに対し同一なポリヌクレオチドの一部に含まれてもよい。害虫内の標的遺伝子の発現は、dsRNA分子により抑制され、害虫の標的遺伝子の発現抑制によって、トランスジェニック植物が、害虫に対し防御される。dsRNA分子の修飾効果は、例えばハウスキーピング遺伝子をはじめとする細胞代謝又は細胞形質転換に寄与する内因性遺伝子；転写因子；脱皮関連遺伝子；及び細胞代謝又は正常な成長と発達に関与するポリペプチドをコードする他の遺伝子を含む、害虫で発現されている様々な遺伝子に適用可能であることが示されている。
in vivoでの導入遺伝子からの転写、又は発現構築物からの転写のために、一部の実施形態において、RNA鎖を転写するための制御領域（例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、及びポリアデニル化シグナル）を使用してもよい。したがって、一部の実施形態において、上記に説明されるように、iRNA分子作製における使用のためのポリヌクレオチドは、植物宿主細胞において機能する１つ以上のプロモーターエレメントに操作可能に連結されていてもよい。プロモーターは、宿主ゲノム中に通常に内在する内因性プロモーターであってもよい。操作可能に連結されたプロモーターエレメントの制御下にある本発明のポリヌクレオチドは、その転写及び／又は得られた転写物の安定性に有益な影響を与える追加のエレメントにさらに隣接していてもよい。かかるエレメントは、操作可能に連結されたプロモーターの上流、発現構築物の３’末端の下流に位置してもよく、及びプロモーターの上流と発現構築物の３’末端の下流の両方にあってもよい。
一部の実施形態は、植物を餌とする害虫（例えば、鞘翅目の害虫）により引き起こされた宿主植物（例えば、トウモロコシ植物）に対する損害を減少させるための方法を提供するものであり、当該方法は、宿主植物に、本発明の核酸分子を少なくとも１つ発現する形質転換植物細胞を提供することを含み、当該核酸分子は、害虫に取り込まれると機能し、当該害虫内の標的ポリヌクレオチドの発現を阻害し、その発現阻害により、害虫の死、及び／又は成長の低下がもたらされ、それによって、害虫により引き起こされた宿主植物の損害が減少する。一部の実施形態において、核酸分子は、dsRNA分子を含有する。これら、及びさらなる実施形態において、核酸分子は、鞘翅目害虫細胞において発現される核酸分子に特異的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを各々２つ以上含有するdsRNA分子を含有する。一部の実施形態において、核酸分子は、害虫の細胞で発現される核酸分子に特異的にハイブリダイズする１つのポリヌクレオチドからなる。
一部の実施形態において、トウモロコシ作物の収率を増加させる方法が提供され、当該方法は、本発明の核酸分子を少なくとも１つ、トウモロコシ植物に導入すること；当該トウモロコシ植物を栽培し、当該核酸を含有するiRNA分子を発現させること、を含み、当該核酸を含むiRNA分子の発現が、害虫（例えば鞘翅目）の損害及び／又は成長を阻害し、それによって、害虫寄生による生産量の減少が低下し、又は無くなる。一部の実施形態において、iRNA分子は、dsRNA分子である。これら、及びさらなる実施形態において、核酸分子は、dsRNA分子を含有し、そのdsRNA分子は各々、害虫の細胞で発現される核酸分子に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを２つ以上含有する。一部の実施形態において、核酸分子は、ポリヌクレオチドを含有し、そのポリヌクレオチドは、鞘翅目害虫の細胞で発現される核酸分子に特異的にハイブリダイズ可能である。
一部の実施形態において、害虫（例えば鞘翅目の害虫）の標的遺伝子の発現を調節する方法が提供され、当該方法は、本発明のiRNA分子を少なくとも１つコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを用いて植物細胞を形質転換することであって、当該ポリヌクレオチドは、プロモーター及び転写終結エレメントに操作可能に連結されていること；複数の形質転換植物細胞を含有する植物細胞培養の発展が充分に可能な条件下で、形質転換植物細胞を培養すること；そのゲノム内にポリヌクレオチドが組み込まれている形質転換植物細胞を選択すること；組み込まれてポリヌクレオチドによりコードされるiRNA分子の発現に関し、形質転換植物細胞をスクリーニングすること；iRNA分子を発現しているトランスジェニック植物細胞を選択すること；及び害虫に、選択されたトランスジェニック植物細胞を飼料として与えること、を含む。また、組み込まれた核酸分子によりコードされるiRNA分子を発現する形質転換植物細胞から植物が再生されてもよい。一部の実施形態において、iRNA分子は、dsRNA分子である。これら、及びさらなる実施形態において、核酸分子は、dsRNA分子を含有し、そのdsRNA分子は各々、害虫の細胞で発現される核酸分子に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを２つ以上含有する。一部の実施形態において、核酸分子は、ポリヌクレオチドを含有し、そのポリヌクレオチドは、鞘翅目害虫の細胞で発現される核酸分子に特異的にハイブリダイズ可能である。
本発明のiRNA分子は、植物細胞のゲノム内に組み込まれた組み換え遺伝子からの発現産物として、又は植え付け前に種子に適用されるコーティング処理又は種子処理への組み込みとして、のいずれかで、植物種（例えば、トウモロコシ）の種子内に組み込まれることができる。組み換え遺伝子を含有する植物細胞は、トランスジェニックイベントであるとみなされる。また、本発明の複数の実施形態に、害虫（例えば鞘翅目の害虫）へiRNA分子を送達するための送達システムが含まれる。例えば、本発明のiRNA分子は、害虫の細胞内に直接導入されてもよい。導入方法には、iRNAと、害虫の宿主由来の植物組織を直接混合すること、ならびに本発明のiRNA分子を含有する組成物を宿主植物組織に適用すること、が含まれる。例えば、iRNA分子は、植物表面上に噴霧されてもよい。あるいは、iRNA分子は、微生物により発現されてもよく、当該微生物は植物表面上に適用されてもよく、又は例えば注入などの物理的手段により根又は茎に導入されてもよい。上記に検討されているように、トランスジェニック植物は遺伝子操作して、植物に寄生することが知られている害虫を殺傷するために充分な量のiRNA分子を少なくとも１つ発現させてもよい。化学合成又は酵素合成により作製されたiRNA分子を、一般的な農学的実務に合致する方法で製剤化してもよく、及び害虫による植物損害を制御するためのスプレー式製品又はおとり製品として使用してもよい。製剤は、iRNA分子（例えばdsRNA分子）をUVダメージから守るための効果的な葉の覆い、ならびにUV保護剤に必要とされる適切なステッカー及び湿潤剤を含んでもよい。かかる添加物はバイオ殺虫剤産業において普遍的に使用されており、当分野の当業者に公知である。かかるアプリケーションは、害虫からの植物防御を増強させるために、他のスプレー式殺虫アプリケーション（生物ベース又はそれ以外）と組み合わされてもよい。
本明細に引用される、公表文献、特許、及び特許出願を含むすべての参照文献は、本開示の明白な詳細と一致する範囲で参照により本明細書に援用され、各参照文献が個々に、及び具体的に、参照により援用されると示され、本明細書にその全体が明記された場合と同程度に援用される。本明細書において検討された参照文献は、本出願の出願日の前のその開示内容に対してのみ提供される。本明細書はいずれも、先行発明を理由としたかかる開示の先行のために本発明者らが権利付与されないことの同意とはみなされない。
以下の実施例は、ある特定の特性及び／又は態様の解説のために提供される。これらの実施例によって、記載される特定の特性又は態様に本開示が限定されるとみなされるべきではない。
実施例１：材料及び方法
サンプル調製及びバイオアッセイ
多くのdsRNA分子（snap25-1 reg1 （配列番号５）、snap25-2 reg1 （配列番号６）、snap25-1 v1 (配列番号７)、及びsnap25-2v1 (配列番号８)に相当する分子を含む）が、MEGAscript（登録商標）T7 RNAi キット（カリフォルニア州カールスバッド LIFE TECHNOLOGIES社、）又はT7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit （オンタリオ州ウィットビー NEW ENGLAND BIOLABS社、）を使用して合成及び精製された。精製されたdsRNA分子はTE緩衝液中で調製され、すべてのバイオアッセイは、この緩衝液からなる対照処理を含み、対照はWCR（Diabrotica virgifera virgifera LeConte）の死又は成長阻害に対するバックグラウンド検証として供された。バイオアッセイ緩衝液中のdsRNA分子の濃度は、NANODROP（商標）8000分光光度計(デラウェア州ウィルミントン Thermo Scientific社、)を使用して測定された。
サンプルは、生まれたばかりの幼虫を用いて行われた人工昆虫飼料に対するバイオアッセイにおける昆虫の活性に関し検証された。WCRの卵は、Crop Characteristics, Inc. (ミネソタ州ファーミントン)から取得された。
バイオアッセイは、昆虫バイオアッセイ用に特別に設計された１２８ウェルのプラスチックトレイ(ニュージャージー州ピットマン C-D International社、)中で行われた。各ウェルは、鞘翅目昆虫の成長用に設計された人工飼料をおよそ1.0mL含有した。dsRNAサンプルの60μLのアリコートを、ピペットにより各ウェルの飼料の表面上に運んだ（40μL/cm2）。dsRNAサンプルの濃度は、ウェル中の表面積（1.5cm２）の平方センチメートル当たりのdsRNAの量（ng/cm２）として算出された。処置されたトレイは、飼料の表面上の液体が蒸発するか、又は飼料の中に吸収されるまでドラフト内に保持された。
孵化の数時間以内に、個々の幼虫を、湿ったラクダ毛のブラシを用いてピックアップし、処置済みの飼料の上に置いた（ウェル当たり、１〜２匹の幼虫）。128ウェルのプラスチックトレイのうち、寄生ウェルを、透明プラスチックの接着シートで密封し、通気口をつけてガス交換を行わせた。バイオアッセイトレイは、９日間、制御された環境条件（28℃、約40％相対湿度、16：8（明：暗））下に置かれ、その後、各サンプルに曝露された昆虫の総数、死亡した昆虫の数、生き残った害虫の重量を記録した。平均死亡率及び平均成長阻害率が、各処置に対して算出された。成長阻害（GI：Growth inhibition）は以下のように算出された：
GI = [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]、
TWITは、処置における、生きている昆虫の総重量である；
TNITは、処置における、昆虫の総数である；
TWIBCは、バックグラウンド検証（緩衝液対照）における、生きている昆虫の総重量である；及び
TNIBCは、バックグラウンド検証（緩衝液対照）における、生きている昆虫の総数である。
統計解析は、JMP（商標）ソフトウェア(ノースカロライナ州ケーリー SAS)を使用して行われた。
The LC50 (致死濃度)は、検証昆虫の50％が殺された投与量と定義される。The GI50 (成長阻害)は、検証昆虫の平均成長（例えば生重量）が、バックグラウンド検証サンプルで認められた平均値の50％である投与量と定義される。
バイオアッセイを繰り返すことにより、特定のサンプルの摂取によって、コーンルートワームの幼虫に驚くべき予想外の死亡及び成長阻害がもたらされたことが示された。
実施例２：候補標的遺伝子の特定
WCR (Diabrotica virgifera virgiferaLeConte) の複数の発達段階にある昆虫を、RNAiトランスジェニック植物昆虫防御技術による制御の候補標的遺伝子配列を提供するための、統合トランスクリプトーム解析に選択した。
１つの例において、約0.9gmの初齢WCR全幼虫（孵化後４〜５日、16℃で保持）から、総RNAが単離され、以下のフェノール／TRI REAGENT（商標）をベースとした方法(オハイオ州シンシナティ Molecular Research Center)を使用して精製した。
幼虫を室温、15mLのホモジナイザー中、10mLのTRI REAGENT（登録商標）を使用してホモジナイズし、ホモジナイズ懸濁液を得た。５分間、室温でインキュベーションした後、ホモジネートを1.5mLの微量遠心管（１管当たり１mL）に分注し、200μLのクロロホルムを加え、混合物を15秒間しっかりと振とうした。10分間、室温において抽出させた後、４℃、12,000xgで遠心することにより層を分離させた。上層（約0.6mL含有）を注意深く、別の滅菌1.5mLチューブへと移し、等量の室温のイソプロパノールを加えた。室温で５〜10分間インキュベーションした後、混合物を８分間、12,000xg（４℃又は25℃）で遠心した。
上清を注意深く取り除いて捨て、RNAペレットを、75％エタノールを用いてボルテックスすることにより２回洗浄し、各洗浄後、7,500xg（４℃又は２５℃）で５分間遠心することにより回収した。エタノールを注意深く取り除き、ペレットを３〜５分間空気乾燥させ、その後、ヌクレアーゼフリーの滅菌水中に溶解させた。RNA濃度は、260nmと280nmで吸光度（A)を測定することにより決定した。約0.9gmの幼虫からの典型的な抽出で、1mgを超える総RNAが得られ、A260/A280の比率は1.9であった。その後、抽出されたRNAは、さらなる処置が行われるまで-80℃で保存された。
RNAの質は、１％アガロースゲルでアリコートを泳動することにより決定した。アガロースゲル溶液は、DEPC（ピロ炭酸ジエチル）処置水を用いてオートクレーブ処理された容器内で希釈された、オートクレーブ処理された10xTAE緩衝液（トリス酢酸EDTA；１ｘ濃度は、0.04Mトリス酢酸、１ｍM EDTA（エチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩）、ｐH8.0）を使用して作製された。１ｘTAEは、ランニング緩衝液として使用された。使用前に、電気泳動タンク及びウェル形成コームは、RNaseAway（商標）Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)で洗浄された。2μLのRNAサンプルを、8μLのTE緩衝液（10mM Tris HCl pH 7.0；1mM EDTA）及び10μLのRNAサンプル緩衝液(Novagen（登録商標）カタログ番号70606；EMD4 ニュージャージー州ギブスタウン Bioscience社)と混合した。サンプルを３分間、70℃で加熱し、室温まで冷却して、ウェル当たり５μL（１μｇ〜２μgのRNAを含有）をロードした。分子サイズ比較のために、別のウェルで市販のRNA分子量マーカーを同時に泳動した。２時間、60ボルトでゲルを泳動した。
標準化cDNAライブラリーは、市販のサービスプロバイダー (アラバマ州ハンツビル Eurofins MWG Operon)により、ランダムプライミングを使用して、幼虫総RNAから調製された。標準化幼虫cDNAライブラリーは、Eurofins MWG Operonで、GS FLX 454 Titanium（商標）シリーズ化学法により、１／２プレートのスケールで配列解析され、その結果、平均リード長は348bpで、600,000を超えるリードが得られた。350,000リードが、50,000超のコンティグへとアセンブリされた。アセンブリされなかったリードとコンティグの両方が、公的に利用可能なプログラムのFORMATDB(NCBIから利用可能）を使用し、BLASTableデータベースへと転換された。
他のWCR発達段階で採取された物質から、総RNA及び標準化cDNAライブラリーが同様に調製された。標的遺伝子スクリーニング用の統合トランスクリプトームライブラリーは、様々な発達段階を表すcDNAライブラリーのメンバーを組み合わせることにより構築された。
RNAi標的の候補遺伝子は、害虫の生存及び成長に必須であると仮定された。選択された標的遺伝子のホモログは、以下に記載されるようにトランスクリプトーム配列データベース中で特定された。標的遺伝子の全長配列又は部分配列はPCRによって増幅され、二本鎖RNA（dsRNA）産生のための鋳型を作製した。
候補タンパク質コード配列を使用したTBLASTNサーチを、未アセンブリ化ジアブロティカ（Diabrotica）配列リード、又はアセンブリ化コンティグを含有するBLASTableデータベースに対して行った。ジアブロティカ（Diabrotica）配列に対する重大ヒット（コンティグホモロジーに関しては、e-20よりも良いと定義され、未アセンブリ化配列リードのホモロジーに関しては、e-10よりも良いと定義される）は、NCBIの非冗長データベースに対するBLASTXを使用して確認された。このBLASTXサーチの結果から、TBLASTNサーチで特定されたジアブロティカ（Diabrotica）ホモログ候補遺伝子配列が、実際にジアブロティカ（Diabrotica）遺伝子を含有していたこと、又はジアブロティカ（Diabrotica）中に存在する非−ジアブロティカ（Diabrotica）候補遺伝子配列に対するベストヒットであったことが確認された。ほとんどの場合において、タンパク質をコードしているとしてアノテーションされたトリボリウム（Tribolium）の候補遺伝子は、ジアブロティカ（Diabrotica）トランスクリプトーム配列の配列に対し、明白な配列相同性を示した。数例で、一部のジアブロティカ（Diabrotica）コンティグ、又は非−ジアブロティカ（Diabrotica）候補遺伝子に対する相同性により選択された非アセンブリ化配列リードが重複していたこと、及びコンティグのアセンブリは、これら重複を結びつけることに失敗したことが明らかとなった。それらの例では、Sequencher（商標）v4.9 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI)を使用して、その配列を、より長いコンティグへとアセンブリした。
ジアブロティカ（Diabrotica）のsnap25（配列番号１、及び配列番号３）をコードする候補標的遺伝子は、鞘翅目害虫の死、WCRにおける成長阻害、発達阻害、及び／又は摂食阻害をもたらし得る遺伝子として特定された。
ショウジョウバエ（Drosophila）のsnap25遺伝子は、標的位置への小胞の結合に関与する細胞膜のSNAREタンパク質である。機能的に、Snap25は、小胞よりもむしろ標的区画と関連したt-SNAREである。Snap25は、シンタキシンタンパク質と相互作用し、小胞融合のためのヘテロ二量体を形成する。Snap25は２つのドメインを含有し、そのSNAREドメインは、タンパク質‐タンパク質の相互作用に関与し(Weimbs, T.ら(1997) Proc Natl Acad Sci., 94: 3046-3051)、そのSnap25ドメインは、膜への付着に関与する(Risinger, C. ら(1993) J Biol Chem. 268: 24408-24414)。
配列番号１、及び配列番号３の配列が新規である。この配列は公共のデータベースで提供されておらず、PCT国際特許出願公開WO/2011/025860、米国特許出願20070124836、米国特許出願20090306189、米国特許出願US20070050860、米国特許出願20100192265、米国特許第7,612,194号又は米国特許出願2013192256においても開示されていない。WCR snap25-1（配列番号１）は、メタセイウルス オッシデンタリス（Metaseiulus occidentalis ）(GENBANKアクセッション番号XM_003738747.1)由来の配列断片と何らかの関連性がある。WCR snap25-2（配列番号３）は、コクヌストモドキ（Tribolium castaneum ）(GENBANKアクセッション番号XM_969628.2)由来の配列の断片に対し、何らかの関連性がある。WCR SNAP25-1のアミノ酸配列（配列番号２）に最も近いホモログは、GENBANKアクセッション番号XP_008196404.1を有するコクヌストモドキ（Tribolium castaneum ）のタンパク質である（98％類似性；相同領域全体で95％同一性）。WCR SNAP25-2のアミノ酸配列（配列番号４）に最も近いホモログは、GENBANKアクセッション番号XP_974721.1を有するコクヌストモドキ（Tribolium castaneum ）のタンパク質である（98％類似性；相同領域全体で96％同一性）。
Snap25dsRNAの導入遺伝子は、他のdsRNA分子と組み合わせることができる。snap25を標的とするdsRNAを発現するトランスジェニックトウモロコシイベントは、コーンルートワームによる根食害の防御に有用である。Snap25 dsRNA導入遺伝子は、昆虫抵抗性管理遺伝子ピラミッドにおけるバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫タンパク質技術との組み合わせに対し、新たな作用機序を提示し、これらルートワーム制御技術のいずれかに対し抵抗性のルートワーム群の発生を軽減する。
実施例３：dsRNAを産生する標的遺伝子の増幅
ジアブロティカ（Diabrotica）候補遺伝子、本明細書においてsnap25と呼称される遺伝子の配列の全長クローン又は部分クローンを使用して、dsRNA合成のためのPCRアンプリコンを作製した。プライマーは、各標的遺伝子のコード領域の一部がPCRにより増幅されるよう設計された。表１を参照のこと。適切である場合には、T7ファージプロモーター配列（TTAATACGACTCACTATAGGGAGA；配列番号９）を、増幅されたセンス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端に組み込んだ。表１を参照のこと。総RNAは、TRIzol（登録商標） (ニューヨーク州グランドアイランド Life Technologies社)を使用してWCRから抽出され、その後、それを使用し、SuperScriptIII（登録商標） First-Strand Synthesis System、及びOligo dTプライム化製品の説明書(ニューヨーク州グランドアイランド Life Technologies社)を用いて第一鎖cDNAを作製した。第一鎖cDNAは、天然標的遺伝子配列のすべて又は一部を増幅するよう位置づけられた反対プライマーを使用したPCR反応の鋳型として使用した。黄色蛍光タンパク質（YFP）（配列番号１０；Shagin ら (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-50）のコード領域を含有するDNAクローンからもdsRNAを増幅させた。
表１ 例示的なsnap25標的遺伝子、及びYFP陰性対照遺伝子のコード領域の一部を増幅するために使用されたプライマー、及びプライマー対。
実施例４：RNAi構築物
PCRによる鋳型調製及びdsRNA合成
snap25及びYFPのdsRNA作製のための特異的鋳型を提供するために使用された戦略を図１に示す。snap25dsRNA合成における使用を意図された鋳型DNAは、表１のプライマー対、及びWCRの卵、初齢幼虫、又は成虫から単離された総RNAから調製された第一鎖cDNAを（PCR鋳型として）使用したPCRにより調製された。各選択されたsnap25及びYFPの標的遺伝子領域に対し、PCR増幅によって、増幅センス鎖及びアンチセンス鎖の５’末端にT7プロモーター配列が導入された（YFPセグメントは、YFPコード領域のDNAクローンから増幅された）。次いで、標的遺伝子の各領域に対する２つのPCR増幅断片を、およそ等量で混合し、その混合物をdsRNA作製のための転写鋳型として使用した。図１を参照のこと。特定のプライマー対で増幅されたdsRNA鋳型の配列は、以下であった：配列番号５ (snap25-1reg1)、配列番号６(snap25-2 reg1)、配列番号７(snap25-1 v1)、配列番号８ (snap25-2v1)、及び配列番号１０（YFP)。昆虫バイオアッセイ用の二本鎖RNAは、メーカーの説明書に従い、Ambion（登録商標） MEGAscript（登録商標） RNAiキット(Invitrogen社)を使用して、又はメーカーの説明書に従い、HiScribe（登録商標）T7 In Vitro Transcription Kit(マサチューセッツ州イプスウィッチ New England Biolabs社)を使用して合成及び精製された。dsRNA分子の濃度は、NanoDrop（商標）8000分光光度計(デラウェア州ウィルミントン Thermo Scientific社)を使用して測定された。
植物形質転換ベクターの構築
snap25（配列番号１、及び配列番号３）のセグメントを含有するヘアピン構造のための標的遺伝子構築物を有するエントリーベクターは、化学合成された断片(カリフォルニア州メンロパーク DNA2.0)の組み合わせと、標準的な分子クローニング法を使用してアセンブリされる。RNA一次転写物による分子内ヘアピン構造は、snap25標的遺伝子セグメントの２つのコピーを（１つの転写単位内で）互いに反対方向に配置することにより促進され、この２つのセグメントはリンカーポリヌクレオチド（例えば、ループ（配列番号８２）、又はST-LS1イントロン、Vancanneyt ら (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50)により分離される。したがって、一次mRNA転写物は、リンカー配列により分離され、互いの大きな反転リピートとして、２つのsnap25遺伝子セグメント配列を含有している。プロモーター（例えば、トウモロコシユビキチン１、米国特許第5,510,474号；カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）由来の35S；サトウキビ桿状型バドナウイルス（Sugarcane bacilliform badnavirus （ScBV））プロモーター；イネアクチン遺伝子由来のプロモーター；ユビキチンプロモーター；pEMU；MAS；トウモロコシH3ヒストンプロモーター；ALSプロモーター：ファセオリン遺伝子プロモーター；cab；rubisco；LAT52；Zm13；及び／又はapg）のコピーを使用して、一次mRNAヘアピン転写物の産生を誘導し、３’非翻訳領域を含有する断片（例えば、トウモロコシペルオキシダーゼ5遺伝子（ZmPer5 3'UTR v2；米国特許第6,699,984号）、AtUbi10、AtEf1、又はStPinII）を使用して、ヘアピンRNA発現遺伝子の転写を終了させる。
エントリーベクターは、典型的なバイナリーデスティネーションベクターとの標準的なGATEWAY（登録商標）組み換え反応において使用され、アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性トウモロコシ胚形質転換のためのsnap25ヘアピンRNA発現形質転換ベクターを生成する。
このバイナリーデスティネーションベクターは、植物操作可能プロモーター（例えば、サトウキビ桿状型バドナウイルス（ScBV）プロモーター（Schenk ら(1999) Plant Mol. Biol. 39:1221-30）又はZmUbi1(米国特許第5,510,474号)）の制御下にある除草剤耐性遺伝子（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；AAD-1 v3)（米国特許第7,838,733(B2)号、及びWright ら (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-5）を含有している。５’UTR及びリンカーは、プロモーターセグメントの３’末端と、AAD-1コード領域の開始コドンの間に位置付けられる。トウモロコシのリパーゼ遺伝子（ZmLip 3'UTR；米国特許第7,179,902号）由来の３’非翻訳領域を含有する断片を使用し、AAD-1mRNAの転写を終結させる。
YFPタンパク質を発現する遺伝子を含有する陰性対照のバイナリーベクターは、典型的なバイナリーデスティネーションベクターとエントリーベクターを用いた標準的なGATEWAY（登録商標）組み換え反応によって構築される。バイナリーデスティネーションベクターは、トウモロコシユビキチン1プロモーター（上述）の発現制御下にある除草剤耐性遺伝子（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；AAD-1 v3）、及びトウモロコシリパーゼ遺伝子（ZmLip 3'UTR；上述）由来の３’非翻訳領域を含有する断片を含有する。エントリーベクターは、トウモロコシユビキチン1プロモーター（上述）の発現制御下にあるYFPコード領域（配列番号１９）、及びトウモロコシペルオキシダーゼ5遺伝子（上述）由来の３’非翻訳領域を含有する断片を含有する。
実施例５：候補標的遺伝子のスクリーニング
実施例２で特定された標的遺伝子の発現を阻害するよう設計された合成dsRNAは、飼料ベースのアッセイにおいて、WCRに投与された際に、死亡、及び成長阻害をもたらした。
バイオアッセイを繰り返すことにより、snap25-1 reg1、snap25-1 v1、snap25-2reg1、及びsnap25-2 v1由来のdsRNA調製物の摂取が、ウェスタンコーンルートワームの幼虫の死亡及び成長阻害をもたらすことが示された。表２は、snap25-1 reg1、snap25-1 v1、snap25-2 reg1、及びsnap25-2 v1のdsRNAへの９日の曝露を行った後のWCRの幼虫の飼料ベースの摂食バイオアッセイの結果、ならびに黄色蛍光タンパク質（YFP）コード領域（配列番号１９）から調製された陰性対照dsRNAサンプルを用いて得られた結果を示す。表３は、snap25-1 v1、及びsnap25-2 v1 dsRNAへの曝露による、LC50及びGI50の結果を示す。
表２ ９日の摂食後、ウェスタンコーンルートワームの幼虫を用いて得られたsnap25dsRNA飼料の摂食アッセイの結果。ANOVA解析により、平均死亡率％と平均成長阻害率（GI）％の間に有意差が見いだされた。テューキー−クレーマー検定を使用して平均値を分離した。
表３ WCR幼虫に対する、snap25 dsRNAの経口有効性の要約(ng/cm2)。
ジアブロティカ（Diabrotica）種のある遺伝子は、RNAi介在性昆虫制御に活用できることが従前から提唱されている。米国特許公開2007/0124836は、906個の配列を開示しており、 及び米国特許第7,612,194号は、9,112個の配列を開示している。それらを参照のこと。しかしながら、RNAi介在性昆虫制御に対する有用性を有すると提唱されている多くの遺伝子が、ジアブロティカ（Diabrotica）の制御には有効ではないことが究明されている。また、snap25-1 reg1、snap25-1 v1、snap25-2reg1、及びsnap25-2 v1 dsRNAの配列は、RNAi介在性昆虫制御に関する有用性を有すると提唱されている他の遺伝子と比較し、ジアブロティカ（Diabrotica）に関し、驚くべき、予想外の優れた制御をもたらすことも明らかとなった。
例えば、アネキシン、ベータ スペクトリン2、及びmtRP-L4はそれぞれ、米国特許第7,612,194号において、RNAi介在性昆虫制御に有効であると提唱されていた。配列番号２０は、アネキシン領域１（Reg1）のDNA配列であり、配列番号２１は、アネキシン領域２（Reg2）のDNA配列である。配列番号２２は、ベータ スペクトリン２領域１（Reg1）のDNA配列であり、配列番号２３は、ベータ スペクトリン２領域２（Reg2）のDNA配列である。配列番号２４は、mtRP-L4領域１（Reg1）のDNA配列であり、配列番号２５ は、mtRP-L4領域２（Reg2）のDNA配列である。YFP配列（配列番号１0）を使用して、陰性対照としてのdsRNAも作製した。
前述の配列をそれぞれ使用して、実施例３の方法によりdsRNAを製造した。dsRNA作製のための特異的鋳型を提供するために使用された戦略を図２に示す。dsRNA合成における使用を意図された鋳型DNAは、表４のプライマー対、及びWCRの初齢幼虫から単離された総RNAから調製された第一鎖cDNAを（PCR鋳型として）使用したPCRにより調製された。（YFPは、DNAクローンから増幅された。）選択された各標的遺伝子領域に対し、２つの別々のPCR増幅が行われた。第一のPCR増幅で、増幅されたセンス鎖の５’末端にT7プロモーター配列が導入された。第二の反応で、アンチセンス鎖の５’末端にT7プロモーター配列が組み込まれた。次いで、標的遺伝子の各領域に対する２つのPCR増幅断片を、およそ等量で混合し、その混合物をdsRNA作製のための転写鋳型として使用した。図２を参照のこと。二本鎖RNAを合成し、メーカーの説明書に従いAmbion（登録商標）MEGAscript（登録商標）RNAiキット（Invitrogen）を使用して合成及び精製した。dsRNAの濃度は、NanoDrop（商標）8000分光光度計(デラウェア州ウィルミントン Thermo Scientific社)を使用して測定し、dsRNAは各々、上述と同じ食餌ベースのバイオアッセイ法により検証された。表４は、アネキシン Reg1、アネキシン Reg2、ベータ スペクトリン 2 Reg1、ベータ スペクトリン 2 Reg2、mtRP-L4 Reg1、mtRP-L4 Reg2、及びYFPのdsRNA分子を作製するために使用されたプライマーの配列を列記する。表５は、これらdsRNA分子への９日の曝露後のWCR幼虫の飼料ベースの摂食バイオアッセイの結果を示す。バイオアッセイを繰り返すことにより、これらdsRNAの摂取によるウェスタンコーンルートワームの幼虫の死亡又は成長阻害は、対照サンプルのTE緩衝液、水、又はYFPタンパク質で観察された結果を上回っていなかったことが示された。
表４ 遺伝子のコード領域の一部を増幅するために使用されたプライマー、及びプライマー対。
表５ ９日後、ウェスタンコーンルートワームの幼虫を用いて得られた、飼料の摂食アッセイの結果
実施例６：殺虫性dsRNAを含有するトランスジェニックトウモロコシ組織の作製
アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性形質転換。植物ゲノムへ安定的に組み込まれたキメラ遺伝子の発現を介して、１つ以上の殺虫性dsRNA分子（snap25（例えば、配列番号１、及び配列番号３）を含有する遺伝子を標的とするdsRNA分子を含む、少なくとも１つのdsRNA分子）を産生するトランスジェニックトウモロコシの細胞、組織、及び植物が、アグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性形質転換後に作製される。スーパーバイナリー形質転換ベクター、又はバイナリー形質転換ベクターを利用する、トウモロコシの形質転換方法は当分野に公知であり、例えば、その全体で参照より本明細書に援用される米国特許第8,304,604号に記載されている。形質転換された組織は、ハロキシホップ含有培地上での増殖能力により選択され、適切な場合には、dsRNA産生に対しスクリーニングされる。かかる形質転換された組織培養の一部は、原則的に実施例１に記載されるバイオアッセイのように、生まれたばかりのコーンルートワーム幼虫に提示されてもよい。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養の開始 上述（実施例４）のバイナリー形質転換ベクターを有するアグロバクテリウム（Agrobacterium株のDAt13192細胞(PCT国際特許出願公開2012/016222A2）のグリセロールストックを、適切な抗生物質を含有するAB最小培地プレート(Watson, (1975) J. Bacteriol. 123:255-264)上に画線培養し、３日間、20℃で増殖させる。次いで、培養物を、同じ抗生物質を含有するYEPプレート(gm/L：酵母抽出物、10；ペプトン、10；NaCl、5)上に画線培養し、1日間、20℃でインキュベートする。
アグロバクテリウム（Agrobacterium ）培養. 実験当日、接種培地のストック溶液、及びアセトシリンゴンを、実験における構築物数に対して適切な量で調製し、滅菌されたディスポーザブルの250mLフラスコへとピペッティングで入れる。接種培地(Frame ら (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe 及び E. C. Yeung 編, Springer Science and Business Media, LLC. pp 327-341)は、以下を含有している：2.2gm/L MS塩；1X ISU改変MSビタミン類(Frame ら, 前記) 68.4gm/L スクロース；36gm/L グルコース；115mg/L L-プロリン、及び100mg/L myo-イノシトール；pH 5.4。接種培地を含有するフラスコにアセトシリンゴンを加え、100％ジメチルスルホキシド中の１Ｍストック溶液から最終濃度200μMとし、この溶液を完全に混和した。
各構築物に対し、YEPプレートからアグロバクテリウム（Agrobacterium）の１つ又は２つの接種ループ−フルを、滅菌ディスポーザブルの50mL遠心管中で15mLの接種培地／アセトシリンゴンのストック溶液に懸濁させ、550nm(OD550)での溶液の光学密度を分光光度計で計測する。その後、懸濁液を、0.3〜0.4のOD550にまで、追加の接種培地／アセトシリンゴン混合液を使用して希釈する。その後、アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液の管を、75rpm、室温に設定されたプラットフォーム型振とう器上に水平に置き、胚を解体させながら、１〜４時間、振とうさせる。
穂の滅菌及び胚の単離 トウモロコシの未熟胚を、トウモロコシ（Zea mays）近交系B104(Hallauer ら (1997) Crop Science 37:1405-1406)の植物から得て、温室で成長させ、自己受粉又は同胞受粉させ、穂を作らせる。受粉後およそ10〜12日後に穂を収穫する。実験当日、皮をむいた穂を、市販の漂白剤(Ultra Clorox（登録商標）Germicidal Bleach、6.15%次亜塩素酸ナトリウム；TWEEN20を２滴）の20％溶液の中にひたすことにより表面を滅菌し、20〜30分間振とうさせた後、Laminarフローフード内で滅菌脱イオン水で３回リンスする。未成熟な接合胚（1.8〜2.2mmの長さ）を、各穂から無菌で分け、適切なアグロバクテリウム（Agrobacterium ）細胞の、200μMアセトシリンゴンを有する接種培地液の懸濁液2.0mLを含有する微小遠心管に無作為に分配し、そこに2μLの10%BREAK-THRU（登録商標）S233界面活性剤 (ドイツエッセンEvonik Industries社； )を加える。実験の所与の設定に対し、プールされた穂からの胚を各形質転換に使用する。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）共培養 単離後、胚を５分間、ロッカープラットフォーム上に置く。その後、管の中身を共培養培地のプレート上に流しいれる。当該培地は、4.33gm/L MS塩；1X ISU改変MSビタミン類；30gm/L スクロース；700mg/L L-プロリン；3.3mg/L DicambaのKOH(3,6-ジクロロ-o-アニス酸又は3,6-ジクロロ-2-メトキシ安息香酸)溶液；100mg/L myo-イノシトール；100mg/L カゼイン酵素加水分解物；15mg/L AgNO3；200μM アセトシリンゴンのDMSO溶液；及び3gm/L GELZAN（商標）、pH 5.8を含有する。アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液を、滅菌ディスポーザブルの移送ピペットを使用して除去する。次いで、胚を、顕微鏡下で滅菌ハサミを使用し、胚盤を仰向けにさせながら置く。プレートを閉じ、3M（商標）MICROPORE（商標）医療用テープで密封し、２５℃のインキュベーター内に置き、60μモル m-2s-1で光合成有効放射（PAR)の連続光を当てた。
カルス選択、及びトランスジェニックイベントの再生 共培養期間後、胚を休眠培地へと移す。当該培地は、4.33gm/L MS塩；1X ISU改変MSビタミン類；30gm/L スクロース；700mg/L L-プロリン；3.3mg/L DicambaのKOH溶液；100mg/L myo-イノシトール；100mg/L カゼイン酵素加水分解物；15mg/L AgNO3；0.5gm/L MES(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸一水和物；PhytoTechnologies Labr、；Lenexa, KS)；250mg/L カルベニシリン；及び2.3gm/L Gelzan（商標）；pH 5.8から構成される。36個以下の胚を各プレートへと移動させる。このプレートを透明なプラスチックボックス内に置き、27℃で７〜10日間、およそ50μモル m-2s-1 PARの連続光と共にインキュベートする。次いで、カルス化した胚を選択培地I上に移す（＜１８／プレート）。当該培地は、休眠培地（上述）と、100nM R-ハロキシホップ酸(0.0362mg/L；AAD-1を保有するカルスの選択用）から構成される。このプレートを透明なプラスチックボックス内に戻し、27℃で７日間、およそ50μモル m-2s-1 PARの連続光と共にインキュベートする。次いで、カルス化した胚を選択培地II上に移す（＜１２／プレート）。当該培地は、休眠培地（上述）と、500nM R-ハロキシホップ酸(0.181mg/L）から構成される。このプレートを透明なプラスチックボックス内に戻し、27℃で14日間、およそ50μモル m-2s-1 PARの連続光と共にインキュベートする。この選択工程により、トランスジェニックカルスをさらに増殖させ、分化させることが可能となる。
増殖胚発生カルスを、再生前培地へと移す（＜９／プレート）。再生前培地は、4.33gm/L MS塩；1X ISU改変MSビタミン類；45gm/L スクロース；350mg/L L-プロリン；100mg/L myo-イノシトール；50mg/L カゼイン酵素加水分解物；1.0mg/L AgNO3；0.25gm/L MES；0.5mg/L ナフタレン酢酸のNaOH溶液；2.5mg/L アブシジン酸のエタノール溶液；1mg/L 6-ベンジルアミノプリン；250mg/L カルベニシリン；2.5gm/L Gelzan（商標）；及び0.181mg/L ハロキシホップ酸；pH 5.8を含有する。このプレートを透明なプラスチックボックス内で保存し、27℃で７日間、およそ50μモル m-2s-1 PARの連続光と共にインキュベートする。その後、再生カルスを、Phytatrays（商標）(sigma-aldrich社)中の再生培地へと移し（＜６／プレート）、28℃で１日当たり、16時間の明／８時間の暗（およそ160μモル m-2s-1 PAR）で１４日間、根と茎が発生するまでインキュベートする。再生培地は、4.33gm/L MS塩；1X ISU改変MSビタミン類；60gm/L スクロース；100mg/L myo-イノシトール；125mg/L カルベニシリン；3gm/L Gellan（商標）ガム；及び0.181mg/L R-ハロキシホップ酸；pH 5.8を含有する。その後、一次根とともに小さい根を単離し、選択せずに伸長培地へと移す。伸長培地は、4.33gm/L MS塩；1X ISU改変MSビタミン類；30gm/L スクロース；及び3.5gm/L Gelrite（商標）、pH 5.8を含有する。
形質転換された植物の根は、ハロキシホップを含有する培地上で増殖する能力により選択され、増殖培地(ProMix BX；Premier Tech Horticulture)で満たされた小さなポットへと、Phytatrays（商標）から移植され、カップ又はHUMI-DOMES (ARCO PLASTICS)で覆われ、その後、Conviron 増殖チャンバー（27℃昼間／24℃夜間、１６時間の光周期、 50〜70% RH、200μモル m-2s-1 PAR)内で寒冷馴化させる。一部の例において、トウモロコシゲノム内に組み込まれたAAD1除草剤耐性遺伝子を検出するよう設計されたプライマーを使用した定量リアルタイムPCRアッセイにより、導入遺伝子の相対コピー数に対し、推定トランスジェニック未発達植物を解析する。さらに、qPCRアッセイを使用して、推定形質転換体中のリンカー配列及び／又は標的配列の存在を検出する。次いで、選択された形質転換未発達植物を温室内に移動させ、さらに成長させて検証する。
バイオアッセイ及び種子形成を目的とした、温室内の移送、及びT 0 植物の確立 植物がV3〜V4段階に達したとき、IE Custom Blend (PROFILE/METRO MIX 160)土壌混合物へと移植させ、温室内で成長させて開花させる（光露出型；フォト又は同化；ハイライト限界：1200PAR；16時間の昼の長さ；27℃昼間／24℃夜間）。
昆虫バイオアッセイに使用される植物は、小さなポットからTinus（商標）350-4 Rootrainers（登録商標）(カナダアルバータ州アチソン Spencer-Lemaire Industries)へと移植する(１本の植物／イベント／Rootrainer（登録商標）)。Rootrainers（登録商標）へと移植したおよそ４日後、バイオアッセイを行うために植物に寄生させる。
T1世代の植物は、非トランスジェニック近交系B104の植物から採取された花粉、又は他の適切な花粉ドナーから採取された花粉と、T0のトランスジェニック植物の毛を受粉させ、得られた種子を植えることにより取得される。可能な場合には、逆交雑も行われる。
実施例７：トランスジェニックトウモロコシ組織の分子学的解析
トウモロコシ組織の分子学的解析（例えば、RT-qPCR）は、根食害が分析される前日、又は当日に、温室で育った植物から採取された葉からのサンプルに対して行われる。
Per5 3'UTRに対するRT-qPCRアッセイの結果を使用し、導入遺伝子発現を確認する。発現されたRNA中のリピート配列の間の介在配列（dsRNAヘアピン分子の形成に不可欠である）に関するRT-qPCRアッセイの結果を使用して、ヘアピン転写物の存在を確認する。導入遺伝子のRNA発現レベルは、内因性トウモロコシ遺伝子のRNAレベルと比較して測定される。
gDNA中のAAD1コード領域の一部を検出するDNA qPCR解析を使用して、導入遺伝子の挿入コピー数を推定する。これらの解析のためのサンプルは、環境チャンバーで成長した植物から採取される。結果を、単一コピーの天然遺伝子の一部を検出するよう設計されたアッセイのDNA qPCRの結果と比較し、シンプルなイベント（snap25導入遺伝子を１コピー又は２コピー有する）を、温室内でのさらなる実験へと進める。
さらに、スペクチノマイシン耐性遺伝子（SpecR）；T-DNAの外側のバイナリーベクタープラスミド上に保有されている）の一部を検出するよう設計されたqPCRを使用して、トランスジェニック植物が、外来性に取込まれたプラスミドの主鎖配列を含有しているか否かを決定する。
RNA転写物発現レベル：標的qPCR。カルス細胞イベント、又はトランスジェニック植物を、標的配列のリアルタイム定量PCR（qPCR）により解析し、固有トウモロコシ遺伝子（例えば、GENBANKアクセッション番号BT069734）の転写レベルに対する、全長ヘアピン転写物の相対発現レベルを決定する。当該配列は、TIP41様タンパク質（すなわち、GENBANKアクセッション番号AT4G34270のトウモロコシホモログであり、74%同一性のtBLASTXスコアを有する。配列番号５４）をコードする。RNAは、Norgen BioTek総RNA単離キット(オンタリオ州ソロルド Norgen社)を使用して単離される。総RNAを、キット推奨プロトコールに従い、on-Column DNase1処置に供する。次いで、RNAを、NanoDrop 8000分光光度計(Thermo Scientific社)上で定量し、濃度を50ng/μLに標準化する。第一鎖cDNAは、High Capacity cDNA合成キット(INVITROGEN社)を使用し、実質的にメーカー推奨プロトコールに従い、５μLの変性RNAを用いて10μLの反応量で調製する。プロトコールを若干改変し、100μM T20VNオリゴヌクレオチド(IDT) (TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN、式中、VはA、C、又はGであり、及びNはA、C、G、又はTである。配列番号５５）を10μL、ランダムプライマーストックミックスの１ｍL管へと加え、ランダムプライマーとオリゴdTが混合されたワーキングストックを作製する。
cDNA合成後、サンプルを、ヌクレアーゼフリーの水を用いて１：３に希釈し、解析を行うまで-20℃で保存する。
標的遺伝子及びTIP41様転写物に対し、別々のリアルタイムPCRアッセイを、10μLの反応量で、LightCycler（商標） 480 (インディアナ州インディアナポリス Roche diagnostics社)上で行った。標的遺伝子のアッセイに関し、プライマーのsnap25 FWD（配列番号５８) とsnap25 REV (配列番号５９)、及びFAMで標識されたIDTカスタムオリゴプローブspt5-1 v1 PRB セット1（配列番号６０）を用いて反応を行い、Zen and Iowa Blackクエンチャーを用いて二重クエンチを行う。TIP41様参照遺伝子のアッセイに関しては、プライマーのTIPmxF (配列番号６１)とTIPmxR(配列番号６２)、及びHEX（ヘキサクロロフルオレセイン）で標識されたプローブHXTIP（配列番号６３）を使用する。
すべてのアッセイに、鋳型無しの陰性対照が含まれる（ミックスのみ）。標準曲線のために、ブランク（ソースウェルに水）も、ソースプレートに含ませ、サンプルのクロスコンタミネーションをチェックする。プライマーとプローブの配列は、表６に記載される。様々な転写物の検出のための反応成分のレシピは、表７に開示されており、PCRの反応条件は、表８に要約されている。FAM（6-カルボキシフルオレセインアミダイト）蛍光部分は465nmで励起し、蛍光は510nmで測定される。HEX（ヘキサクロロフルオレセイン）蛍光部分の対応する値は、533nmと580nmである。
表６ トランスジェニックトウモロコシ中の転写物レベルの分子学的解析に使用されたオリゴヌクレオチド配列。
表７ 転写物検出のためのPCR反応レシピ
表８ RNA qPCRのサーモサイクラー条件
データは、メーカーの推奨に従い、Cq値算出のための二次導関数maxアルゴリズムを使用した相対定量により、LightCycler（商標）ソフトウェア v1.5を使用して解析される。発現解析に関し、発現レベルは、ΔΔCt法（すなわち、2-(Cq TARGET - Cq REF)）を使用して算出される。当該方法は、２つのターゲットの間のCq値の差の比較に依っており、最適化PCR反応に関し、産物はサイクルごとに２倍になるという仮定のもと、基準値２が選択される。
転写物のサイズと完全性 ノーザンブロットアッセイ 一部の例において、トランスジェニック植物の追加の分子学的特徴解析が、ノーザンブロット（RNAブロット）解析の使用により行われ、snap25ヘアピンdsRNAを発現するトランスジェニック植物における、snap25ヘアピンdsRNAの分子量が決定される。
すべての材料と装置は、RNaseZAP (AMBION/INVITROGEN社)を用いて使用前に処置される。組織サンプル（100mg〜500mg）は、2mLのsafelock Eppendorf管で採取され、Klecko（商標）組織粉砕機(カリフォルニア州バイセイリア Garcia Manufacturing)で、1mLのTRIzol (INVITROGEN社)中、３個のタングステンビーズを用いて５分間破壊され、その後、室温（RT）で10分間インキュベートされる。任意で、サンプルを10分間、４℃、11,000ｒｐｍで遠心し、上清を新しい2mL safelock Eppendorf管へと移す。ホモジネートに200μLのクロロホルムを加えた後、管を２〜５分間、転倒混和し、RTで10分間インキュベートして、４℃で15分間、12，000xgで遠心する。上層を滅菌1.5mLEppendorf管へと移し、600μLの100%イソプロパノールを加え、その後、10分〜２時間、RTでインキュベートし、次いで、４℃〜25℃で10分間、12,000xgで遠心する。上清を捨て、RNAペレットを２回、1mLの70%エタノールで洗浄し、洗浄と洗浄の間に、10分間、４℃〜25℃、7,500xgで遠心する。エタノールを捨て、ペレットを３〜５分間、簡単に空気乾燥させ、その後、ヌクレアーゼフリーの水50μL中に再懸濁する。
総RNAを、Nanodrop 8000（登録商標）(Thermo-Fisher社)を使用して定量し、サンプルを5μg／10μLに標準化する。次いで、10μLのグリオキサル（AMBION/INVITROGEN社）を各サンプルに加える。5〜14ngのDIG RNA標準マーカーミックス（インディアナ州インディアナポリス Roche Applied Science社）を調製し、等量のグリオキサルに加える。サンプルとマーカーRNAを45分間、50℃で変性させ、NorthernMax 10 X グリオキサル泳動緩衝液(AMBION/INVITROGEN社)中、1.25% SeaKem ゴールドアガロース (ニュージャージー州アレンデール Lonza社)ゲルにローディングするまで氷上で保管する。２時間15分間、65ボルト／30mAでの電気泳動によりRNAを分離させる。
電気泳動後、ゲルを５分間、2xSSC中でリンスし、gel docステーション(カリフォルニア州ハーキュリーズ BioRad社)上で画像化し、その後、RNAを、トランスファー緩衝液として10xSSCを使用して、RTで一晩、ナイロン膜（Millipore社）へ受動的にトランスファーする（20xSSCは、3M 塩化ナトリウムと300mM クエン酸三ナトリウム、pH7.0からなる）。トランスファー後、膜を2xSSCで５分間リンスして、RNAを膜（Agilent/Stratagene社）にUV架橋し、その膜を室温で最大２日乾燥させる。
膜を１〜2時間、UltraHyb（商標）緩衝液(AMBION/INVITROGEN社)中でプレ−ハイブリダイズする。プローブは、Roche Applied ScienceのDIG法によりジゴキシゲニンで標識された、対象配列を含有するPCR増幅産物（例えば、必要に応じて、配列番号５〜８のアンチセンス配列部分）からなる。推奨緩衝液中でのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション管中、60℃の温度で一晩である。ハイブリダイゼーション後、ブロットをDIG洗浄に供し、ラップして、１〜30分間、フィルムに曝露し、その後、そのフィルムを現像させる。すべてDIGキットのサプライヤーの推奨する方法によるものである。
導入遺伝子のコピー数決定 おおよそ２葉パンチ分と等しいトウモロコシの葉片を96ウェルコレクションプレート（Qiagen社）に集める。組織破壊は、１つのステンレススチールビーズを用いて、Biosprint96 AP1溶解緩衝液（Biosprint96 PLANT KITと共に提供される；Qiagen) 中、Klecko（商標）組織粉砕機(カリフォルニア州バイセイリア Garcia Manufacturing)を使用して行われる。組織を浸軟させた後、gDNAを、Biosprint96 PLANT KIT 及びBiosprint96抽出ロボットを使用し、ハイスループットフォーマット中で単離する。gDNAは、qPCR反応をセットアップする前に、１：３のDNA：水に希釈される。
qPCR解析 加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子の検出は、LightCycler（登録商標）480システムを使用したリアルタイムPCRにより行われる。標的遺伝子（例えば、snap25）、リンカー配列（例えば、ループ）を検出するための、及び／又はSpecR遺伝子（すなわち、バイナリーベクタープラスミド上に担持されているスペクチノマイシン抵抗性遺伝子；配列番号６４；表９のSPC1オリゴヌクレオチド）の一部を検出するための加水分解プローブアッセイに使用されるオリゴヌクレオチドは、LightCycler（登録商標）プローブ設計ソフトウェア 2.0を使用して設計される。さらに、AAD-1除草剤耐性遺伝子（配列番号６５；表９のGAAD1オリゴヌクレオチド）のセグメントを検出するための加水分解プローブアッセイに使用されるオリゴヌクレオチドは、Primer Expressソフトウェア(Applied Biosystems社)を使用して設計される。表９は、プライマーとプローブの配列を示す。アッセイは、固有トウモロコシ染色体遺伝子（インベルターゼ（配列番号６６）；GENBANKアクセッション番号U16123；本明細書においてIVR1と呼称される）に対する試薬を用いてマルチプレックス化され、それを各アッセイ中にgDNAが存在していることを確認するための内部標準配列として使用する。増幅のために、LightCycler（登録商標）480 Probes Masterミックス(Roche Applied Science社)を、各プライマーを0.4μM、各プローブを0.2μM含有する、10μL量のマルチプレックス反応液中、１ｘの最終濃度で調製する（表１０）。表１１に概要されるように、２工程の増幅反応を行う。FAM標識プローブとHEX標識プローブに対する蛍光活性化と発光は上述のとおりであり、CY5結合体は650nmで最大励起し、670nmで最大蛍光発光する。
Cpスコア（蛍光シグナルがバックグラウンド閾値と交差するポイント）は、適合点アルゴリズム（LightCycler（登録商標）ソフトウェアリリース1.5）と相対Quantモジュール（DDCt法に基づく）を使用したリアルタイムPCRデータから決定されるデータは、前述のように（上記；RNA qPCR）扱われる。
表９ 遺伝子コピー数決定とバイナリーベクタープラスミド主鎖検出に使用されるプライマーとプローブの配列。
表１０ 遺伝子コピー数解析及びプラスミド主鎖検出のための反応成分
表１１ DNA qPCRのサーモサイクラー条件
実施例８：トランスジェニックトウモロコシのバイオアッセイ
昆虫バイオアッセイ 植物細胞中で産生された対象発明dsRNAの生物活性は、バイオアッセイ法により示される。例えば、Baum ら (2007) Nat.Biotechnol.25(11):1322-1326を参照のこと。制御された給餌環境下、殺虫性dsRNAを産生する植物から誘導された様々な植物組織又は組織片を、標的昆虫に給餌することにより、有効性を示すことができる。あるいは、殺虫性dsRNAを産生する植物から誘導された様々な植物組織から抽出物を調製し、抽出された核酸を、本明細書に前述されるように、バイオアッセイ用の人工飼料の上に施す。かかる給餌アッセイの結果は、殺虫性dsRNAを産生しない宿主植物由来の適切な対照組織、又は他の対照サンプルを使用し、同様に行われたバイオアッセイに対して比較される。標的昆虫の検証飼料上での成長と生存は、対照群と比較して低下する。
トランスジェニックトウモロコシイベントを用いた昆虫バイオアッセイ 洗浄された卵から孵化した２匹のウェスタンコーンルートワームの幼虫（１〜３日齢）を選択し、バイオアッセイトレイの各ウェル内に置く。次いで、ウェルを「PULL N' PEEL」タブカバー(BIO-CV-16、BIO-SERV) を用いて覆い、18時間／６時間の明暗サイクルで28℃のインキュベーター内に置く。最初の寄生から９日後、幼虫を死亡に関して評価する。各処置の昆虫の総数に対する死亡した昆虫の割合として算出される。昆虫サンプルは２日間、-20℃で凍結され、その後、各処置の幼虫をプールし、重量計測する。成長阻害の割合は、実験処置の平均重量を２つの対照ウェル処置の平均重量の平均により割ることにより算出される。データは、（陰性対照の）成長阻害割合として表される。対照平均重量を上回る平均重量は、ゼロと標準化される。
温室内の昆虫バイオアッセイ ウェスタンコーンルートワーム（WCR、Diabrotica virgifera virgifera LeConte）の卵は、CROP CHARACTERISTICS (ミネソタ州ファーミントン)の土壌から受領する。WCRの卵を、10〜11日間、28℃でインキュベートする。土壌から卵を洗い出し、0.15％のアガー溶液内に置き、濃度をおよそ75〜100個の卵／0.25mLアリコートに調節する。孵化プレートは、ペトリ皿にて卵懸濁液のアリコートと共にセットアップし、孵化率を監視する。
ROOTRANERS（登録商標）で成長するトウモロコシ植物の周囲の土壌に、150〜200個のWCRの卵を寄生させる。昆虫を２週間飼育し、その後、「根評価（Root Rating）」を各植物に与える。Oleson ら (2005) J. Econ.Entomol.98:1-8.に原則的に従い、結節-損傷スケールを等級付けに利用する。 このバイオアッセイを経た植物は損傷の低下を示しており、種子形成のために５ガロンのポットへと移植される。移植物を殺虫剤で処置し、さらなるルートワームのダメージを予防し、昆虫を温室内に放出する。種子形成のために植物を手で受粉させる。これら植物から産生された種子は、T1及び次世代の植物の評価のために保存される。
トランスジェニック陰性対照植物は、黄色蛍光タンパク質（YFP）を産生するよう設計された遺伝子を有するベクターを用いた形質転換により作製される。非形質転換陰性対照植物は、トランスジェニック植物が作製された親トウモロコシ種の種子から成長させる。バイオアッセイは、各設定の植物材料に含ませた陰性対照と共に行われる。
実施例９：鞘翅目害虫配列を含有するトランスジェニックトウモロコシ（Zea mays）
10〜20のトランスジェニックT0トウモロコシ（Zea mays）植物を、実施例６に記載されるように作製する。さらに、RNAi構築物用のヘアピンdsRNAを発現する、10〜20のT1トウモロコシ（Zea mays）独立系統を、コーンルートワームチャレンジのために取得する。ヘアピンdsRNAは、配列番号１及び／又は配列番号３の一部を含有する。追加のヘアピンdsRNAは、例えばCaf1-180 (米国特許出願公開2012/0174258)、VatpaseC (米国特許出願公開2012/0174259)、 Rho1 (米国特許出願公開2012/0174260)、 VatpaseH (米国特許出願公開2012/0198586)、 PPI-87B (米国特許出願公開2013/0091600)、 RPA70 (米国特許出願公開2013/0091601)、RPS6（米国特許出願公開2013/0097730)、 ROP (米国特許出願14/577,811)、 RNAポリメラーゼII140 (米国特許出願14/577,854)、RNAポリメラーゼI1 (米国特許出願62/133,214)、RNAポリメラーゼII-215(米国特許出願62/133,202)、RNAポリメラーゼ33（米国特許出願62/133,210)、ncm(米国特許出願62/095487)、Dre4(米国特許出願14/705,807)、COPIアルファ(米国特許出願62/063,199)、COPIベータ(米国特許出願62/063,203)、COPIガンマ(米国特許出願62/063,192)、COPIデルタ(米国特許出願62/063,216)、prp8（米国特許出願62/193505)、spt5(米国特許出願62/168,613)、及びspt6（米国特許出願62/168,606)などの鞘翅目害虫の配列から誘導される。これらは、RT-PCR又は他の分子学的解析法を介して確認される。
選択された独立T1系統からの総RNA調製物を任意で、各RNAi構築物においてヘアピン発現カセットのリンカーに結合するよう設計されたプライマーを用いたRT-PCRに使用する。さらに、RNAi構築物中の各標的遺伝子に対する特異的プライマーを任意で使用して、in plantaでのsiRNAの産生に必要とされるプロセッシング前mRNAを増幅させ、その産生を確認する。各標的遺伝子に対し所望されるバンドの増幅は、各トランスジェニックトウモロコシ（Zea Mays）植物におけるヘアピンRNAの発現を裏付けるものである。引き続き、標的遺伝子のdsRNAヘアピンのsiRNAへのプロセッシングは、任意で、RNAブロットハイブリダイゼーションを使用した独立したトランスジェニック系統において裏付けられる。
さらに、標的遺伝子に対し80％を超える配列同一性を伴うミスマッチ配列を有するRNAi分子は、標的遺伝子に対し100％の配列同一性を有するRNAi分子で見られるものとある程度類似した影響をコーンルートワームに与える。同じRNAi構築物中でヘアピンdsRNAを形成するミスマッチ配列と天然配列の対形成は、摂食している鞘翅目害虫の成長、発達、及び活性に影響を与えることができる、植物−処理化siRNAを送達する。
標的遺伝子に対応するdsRNA、siRNA、又はmiRNAのin planta送達、及び摂食を介した鞘翅目害虫による取込は、RNA介在性遺伝子サイレンシングを介した鞘翅目害虫における標的遺伝子の下方制御を生じさせる。標的遺伝子の機能が１つ以上の発達段階で重要なものであった場合、鞘翅目害虫の成長及び／又は発達は影響を受け、WCR、NCR、SCR、MCR、D.バルテアタ ルコンテ（D. balteata LeConte）、D.スペシオサ ゲルマール（D. speciosa Germar）、D.u.テネラ（D. u. tenella）、及びジュウイチホシウリハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）のうちの少なくとも１つの場合において、鞘翅目害虫の寄生、摂食、及び／又は発達が失敗に導かれ、又は鞘翅目害虫の死がもたらされる。ひいては、標的遺伝子の選択、及びRNAi適用の成功で、鞘翅目害虫が制御される。
トランスジェニックRNAi系統及び非形質転換トウモロコシ（Zea mays)の表現型比較 ヘアピンdsRNA生成を目的として選択された標的鞘翅目害虫遺伝子又は配列は、いずれの公知の植物遺伝子配列に対しても類似性を有していない。したがって、これら鞘翅目害虫遺伝子又は配列を標的とする構築物による（全身性の）RNAiの産生又は活性化は、トランスジェニック植物に対し何らかの有害な影響を与えるとは予測されない。しかしながら、トランスジェニック系統の発達及び形態学的特徴を、非形質転換植物、ならびにヘアピン発現遺伝子を有していない「空の」ベクターを用いて形質転換されたトランスジェニック系統の植物と比較する。植物の根、芽、葉、及び繁殖の特徴が比較される。例えば高さ、葉の数、及びサイズなどの植物の芽の特徴、開花時期、花柄のサイズ及び外観が記録される。概して、in vitro及び温室の土壌において栽培された際、トランスジェニック系統と、標的iRNA分子の発現を伴わない系統の間に観察可能な形態学的差異はない。
実施例１０：鞘翅目害虫配列、及び追加のRNAi構築物を含有するトランスジェニックトウモロコシ（Zea mays）
鞘翅目害虫以外の生物体を標的とするiRNA分子へと転写される異種コード配列をそのゲノム中に含有するトランスジェニックトウモロコシ（Zea mays）植物を、アグロバクテリウム（Agrobacterium）又はWHISKERS（商標））技術を介して二次的に形質転換させ（Petolino 及び Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67を参照のこと）、１つ以上の殺虫性dsRNA分子（例えば、配列番号１、及び／又は配列番号３を含有する遺伝子を標的とするdsRNA分子を含む、少なくとも１つのdsRNA分子）を産生させる。原則的に実施例４に記載されるように調製された植物形質転換プラスミドベクターを、アグロバクテリウム（Agrobacterium）又はWHISKERS（商標）介在性形質転換法を介して、鞘翅目害虫以外の生物体を標的とするiRNA分子へと転写される異種コード配列をそのゲノム中に含有するHi II又はB104のトウモロコシ（Zea mays）植物から取得されたトウモロコシ懸濁細胞又は未成熟トウモロコシ胚へと送達させる。
実施例１１：RNAi構築物、及び追加の鞘翅目害虫制御配列を含有するトランスジェニックトウモロコシ（Zea mays）

鞘翅目害虫生物体を標的とするiRNA分子（例えば、配列番号１及び／又は配列番号３を含有する遺伝子を標的とするdsRNA分子をはじめとする少なくとも１つのdsRNA分子）へと転写される異種コード配列をそのゲノム中に含有するトランスジェニックトウモロコシ（Zea mays）植物を、アグロバクテリウム（Agrobacterium）又はWHISKERS（商標）技術を介して二次的に形質転換させ（Petolino 及び Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67を参照のこと）、例えばCry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A、及びCyt2Cの殺虫性タンパク質などの殺虫性タンパク質分子を１つ以上産生させる（van Frankenhuyzen (2009) J. Invertebr. Pathol. 101(1): 1-16を参照のこと）。原則的に実施例４に記載されるように調製された植物形質転換プラスミドベクターを、アグロバクテリウム（Agrobacterium）又はWHISKERS（商標）介在性形質転換法を介して、鞘翅目害虫生物体を標的とするiRNA分子へと転写される異種コード配列をそのゲノム中に含有するトランスジェニックB104トウモロコシ（Zea mays）植物から取得されたトウモロコシ懸濁細胞又は未成熟トウモロコシ胚へと送達させる。鞘翅目害虫の制御を目的としたiRNA分子及び殺虫性タンパク質を産生する、二重に形質転換された植物が取得される。
実施例１２：昆虫管理におけるsnap25dsRNA
snap25 dsRNA導入遺伝子を、トランスジェニック植物において他のdsRNA分子と組み合わせて、冗長なRNAi標的化及び相乗的なRNAi効果をもたらす。たとえば限定されないが、snap25を標的とするdsRNAを発現するトウモロコシをはじめとするトランスジェニック植物は、鞘翅目害虫による食害の防御に有用である。また、植物において、snap25 dsRNA導入遺伝子をバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫タンパク質技術と組み合わせることにより、昆虫抵抗性管理遺伝子ピラミッドに新たな作用機序が提示される。トランスジェニック植物において、害虫を標的とする他のdsRNA分子、及び／又は殺虫性タンパク質と組み合わせる場合、抵抗性昆虫群の発現もまた軽減するという相乗的な殺虫効果が観察される。
本開示は、様々な改変及び別形態を受容可能であるが、本明細書においては、詳細な例示を目的として特定の実施形態を記載する。しかしながら、本開示は、開示される特定の形態に限定されることを意図していないことを理解されたい。さらに、本開示は、以下に添付される請求項により定義される本開示の範囲内にある全ての改変、均等、及び代替、ならびにそれらの法的均等を含有するものである。

Claims (55)

  1. 異種プロモーターに操作可能に連結されたポリヌクレオチドを少なくとも１つ含有する単離核酸であって、前記ポリヌクレオチドが、
    配列番号１；配列番号１の相補配列；配列番号１の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号５、６、７及び８を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列；配列番号５、６、７及び８を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の相補配列；配列番号５、６、７及び８を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；ならびに配列番号５、６、７及び８を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；
    配列番号３；配列番号３の相補配列；配列番号３の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号３の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号５、６、７及び８を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列；配列番号５、６、７及び８を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の相補配列；配列番号５、６、７及び８を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；ならびに配列番号５、６、７及び８を含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列。
  2. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号1、配列番号1の相補配列、配列番号３、配列番号３の相補配列、配列番号1の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片、配列番号1の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列、配列番号３の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片、配列番号３の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列、配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列、配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の相補配列、配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片、配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列、からなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び前述のいずれかの相補配列からなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記生物体が、ウェスタンコーンルートワーム（D. v. virgifera LeConte）；ノーザンコーンルートワーム（D. barberi Smith 及び Lawrence）；サザンコーンルートワーム（D. u. howardi）；メキシカンコーンルートワーム（D. v. zeae）；D.バルテアタ ルコンテ（D. balteata LeConte）；D.u.テネラ（D. u. tenella）；D.スペシオサ（D. speciosa）；及びジュウイチウリホシハムシ（D. u. undecimpunctata Mannerheim）からなる群から選択される、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
  5. 請求項１に記載のポリヌクレオチドを含有する植物形質転換ベクター。
  6. 請求項１に記載のポリヌクレオチドから転写されたリボ核酸（RNA）分子。
  7. 請求項１に記載のポリヌクレオチドの発現から産生された二本鎖リボ核酸分子。
  8. 前記ポリヌクレオチド配列と、鞘翅目昆虫との接触が、前記ポリヌクレオチドに特異的に相補的な内因性核酸配列の発現を阻害する、請求項７に記載の二本鎖リボ核酸分子。
  9. 前記リボヌクレオチド分子と、鞘翅目昆虫との接触が、前記昆虫を殺す、又は前記昆虫の成長、活性、及び／もしくは摂食を阻害する、請求項８に記載の二本鎖リボ核酸分子。
  10. 第一、第二、及び第三のRNAセグメントを含有する請求項７に記載の二本鎖RNAであって、前記第一のRNAセグメントが前記ポリヌクレオチドを含有し、前記第三のRNAセグメントが、第二のポリヌクレオチド配列により前記第一のRNAセグメントに連結され、及び前記第三のRNAセグメントが、前記第一のRNAセグメントの実質的に逆相補配列であり、それによって、前記第一及び前記第三のRNAセグメントがリボ核酸に転写されたときにハイブリダイズし、前記二本鎖RNAを形成する、前記二本鎖RNA。
  11. 約15ヌクレオチド〜約30ヌクレオチドの長さの、二本鎖リボ核酸分子及び一本鎖リボ核酸分子からなる群から選択される、請求項６に記載のRNA。
  12. 前記異種プロモーターが、植物細胞内で機能する、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含有する植物形質転換ベクター。
  13. 請求項１に記載のポリヌクレオチドを用いて形質転換された細胞。
  14. 前記細胞が原核細胞である、請求項１３に記載の細胞。
  15. 前記細胞が真核細胞である、請求項１３に記載の細胞。
  16. 前記細胞が植物細胞である、請求項１５に記載の細胞。
  17. 請求項１に記載のポリヌクレオチドを用いて形質転換された植物。
  18. 種子が、前記ポリヌクレオチドを含有する、請求項１７に記載の植物の種子。
  19. 商品生産物が、検出可能な量の前記ポリヌクレオチドを含有する、請求項１７に記載の植物から製造された商品生産物。
  20. 前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、二本鎖リボ核酸分子として前記植物において発現される、請求項１７に記載の植物。
  21. 前記細胞が、トウモロコシ（Zea mays）の細胞である、請求項１６に記載の細胞。
  22. 前記植物は、トウモロコシ（Zea mays）である、請求項１７に記載の植物。
  23. 前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、リボ核酸分子として前記植物中で発現され、及び前記リボ核酸分子は、鞘翅目昆虫が前記植物の一部を摂取したときに、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドに特異的に相補的な内因性ポリヌクレオチドの発現を阻害する、請求項１７に記載の植物。
  24. 内因性昆虫遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする追加のポリヌクレオチドを少なくとも１つ、さらに含有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  25. 前記追加のポリヌクレオチドが、植物細胞内で機能する異種プロモーターに各々操作可能に連結されている、請求項２４に記載のポリヌクレオチドを含有する植物形質転換ベクター。
  26. 鞘翅目害虫群を制御する方法であって、前記方法が、前記害虫との接触で機能し、前記害虫内の生物学的機能を阻害するリボ核酸（RNA）分子を含有する剤を提供することであって、前記RNAは、配列番号８３〜８８のいずれか；配列番号８３〜８８のいずれかの相補配列；配列番号８３〜８８のいずれかの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号８３〜８８のいずれかの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１、３及び５〜８のいずれかの転写物；配列番号１、３及び５〜８のいずれかの転写物の相補配列；配列番号１及び３のいずれかの転写物の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；ならびに配列番号１及び３のいずれかの転写物の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列、からなる群から選択されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能であること、を含む、前記方法。
  27. 前記剤の前記RNAが、配列番号８３及び８４のいずれか；配列番号８３及び８４のいずれかの相補配列；配列番号８３及び８４のいずれかの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号８３及び８４のいずれかの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号１及び３のいずれかの転写物；配列番号１及び３のいずれかの転写物の相補配列；配列番号１及び３のいずれかの転写物の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；ならびに配列番号１及び３のいずれかの転写物の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列、からなる群から選択されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記剤が、二本鎖RNA分子である、請求項２６に記載の方法。
  29. 鞘翅目害虫群を制御する方法であって、以下を含有する、前記方法：
    前記鞘翅目害虫との接触で機能し、前記鞘翅目害虫内の生物学的機能を阻害する第一及び第二のポリヌクレオチド配列を含有する剤を提供することであって、前記第一のポリヌクレオチド配列が、配列番号８３〜８８のいずれかの約15個〜約30個の連続したヌクレオチドに対し、約90％〜約100％の配列同一性を示す領域を含有し、及び前記第一のポリヌクレオチド配列が、前記第二のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズすること。
  30. 鞘翅目害虫群を制御する方法であって、以下を含有する、前記方法：
    鞘翅目害虫の宿主植物において、請求項２に記載のポリヌクレオチドを含有する形質転換植物細胞を提供することであって、前記ポリヌクレオチドが発現され、前記群に含まれる鞘翅目害虫との接触で機能するリボ核酸分子を生成し、前記鞘翅目害虫内の標的配列の発現を阻害し、その結果、前記ポリヌクレオチドを含有しない同一宿主植物種の植物上の同一害虫種の繁殖と比較し、前記鞘翅目害虫又は害虫群の成長及び／又は生存の低下がもたらされること。
  31. 前記リボ核酸分子が、二本鎖リボ核酸分子である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記鞘翅目害虫群が、前記形質転換植物細胞が無い同一宿主植物種の宿主植物に寄生する同一害虫種の群と比較し、減少している、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記鞘翅目害虫群が、前記形質転換植物細胞が無い同一種の宿主植物に寄生する鞘翅目害虫群と比較して減少している、請求項３０に記載の方法。
  34. 植物において鞘翅目害虫の寄生を制御する方法であって、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能であるリボ核酸（RNA）を鞘翅目害虫の飼料中に提供することを含む、前記方法：
    配列番号８３〜８８；
    配列番号８３〜８８のいずれかの相補配列；
    配列番号８３及び配列番号８４のいずれかの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；
    配列番号８３及び配列番号８４のいずれかの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；
    配列番号１及び配列番号３のいずれかの転写物；
    配列番号１及び配列番号３のいずれかの転写物の相補配列；
    配列番号１及び配列番号３のいずれかの転写物の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；
    配列番号１及び配列番号３のいずれかの転写物の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；
  35. 前記飼料が、前記ポリヌクレオチドを発現するよう形質転換された植物細胞を含有する、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記特異的にハイブリダイズ可能なRNAが、二本鎖RNA分子中に含有されている。請求項３４に記載の方法。
  37. 前記特異的にハイブリダイズ可能であるRNAが、二本鎖RNA分子中に含有されている。請求項３５に記載の方法。
  38. トウモロコシ作物の生産量を改善する方法であって、前記方法が、
    請求項１に記載の前記核酸を、トウモロコシ植物内に導入し、トランスジェニックトウモロコシ植物を作製すること、及び
    前記トウモロコシ植物を栽培し、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させることであって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現が、害虫の繁殖又は成長を阻害する、及び害虫寄生による生産量の減少を阻害すること、を含む、前記方法。
  39. 前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現が、前記トウモロコシ植物の一部に接触した害虫において少なくとも第一の標的遺伝子を抑制するRNA分子を生成する、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び前述のいずれかの相補配列からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
  41. 前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現が、前記トウモロコシ植物の一部に接触した鞘翅目害虫において少なくとも第一の標的遺伝子を抑制するRNA分子を生成する、請求項４０に記載の方法。
  42. トランスジェニック植物細胞を作製する方法であって、前記方法が、
    植物細胞を、請求項１に記載の核酸を含有するベクターを用いて形質転換すること、
    前記形質転換された植物細胞を、複数の形質転換された植物細胞を含有する植物細胞培養の進展を可能とさせるために充分な条件下で培養すること、
    少なくとも１つのポリヌクレオチドをそのゲノム中に組み込んだ形質転換植物細胞を選択すること、
    前記少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコードされたリボ核酸（RNA）分子の発現に関し、前記形質転換植物細胞をスクリーニングすること、及び
    前記RNAを発現する植物細胞を選択すること、を含む方法。
  43. 前記ベクターが、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有する、請求項４２に記載の方法。配列番号１；配列番号１の相補配列；配列番号３；配列番号３の相補配列；配列番号１及び配列番号３のいずれかの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１及び配列番号３のいずれかの少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列；配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列；配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の相補配列；配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片；及び配列番号５〜８のいずれかを含有するジアブロティカ（Diabrotica）生物体の天然コード配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドの断片の相補配列。
  44. 前記RNA分子が、二本鎖RNA分子である、請求項４２に記載の方法。
  45. 鞘翅目害虫に対し防御されるトランスジェニック植物を作製する方法であって、以下を含む前記方法：
    請求項４３に記載の方法により作製された前記トランスジェニック植物細胞を提供すること、及び
    前記トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を再生させることであって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコードされるリボ核酸分子の発現が、前記形質転換された植物に接触する鞘翅目害虫の標的遺伝子の前記発現を調節するために充分であること。
  46. トランスジェニック植物細胞を作製する方法であって、前記方法が、
    鞘翅目害虫の防御を植物に提供するための手段を含有するベクターを用いて植物細胞を形質転換すること、
    前記形質転換された植物細胞を、複数の形質転換された植物細胞を含有する植物細胞培養の進展を可能とさせるために充分な条件下で培養すること、
    鞘翅目害虫の防御を植物に提供するための前記手段をそのゲノム中に組み込まれている形質転換植物細胞を選択すること、
    鞘翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための手段の発現に関し、前記形質転換植物細胞をスクリーニングすること、及び
    鞘翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための前記手段を発現する植物細胞を選択すること。
  47. 鞘翅目害虫に対し防御されるトランスジェニック植物を作製する方法であって、以下を含む前記方法：
    請求項４６の方法により作製された前記トランスジェニック植物細胞を提供すること、及び
    前記トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を再生させることであって、鞘翅目害虫の必須遺伝子の発現を阻害するための前記手段の発現が、前記形質転換された植物に接触する鞘翅目害虫の標的遺伝子の発現を調節するために充分であること。
  48. バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）に由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含有する、請求項１に記載の核酸。
  49. 前記ポリヌクレオチドが、Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A、及びCyt2Cを含有する群から選択される、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）に由来するポリペプチドをコードする、請求項４８に記載の核酸。
  50. 前記細胞が、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）に由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、請求項１６に記載の細胞。
  51. 前記ポリヌクレオチドが、Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A、及びCyt2Cを含有する群から選択される、Ｂ．チューリンゲンシス（B．thuringiensis）に由来するポリペプチドをコードする、請求項５０に記載の細胞。
  52. 前記植物が、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）ポリペプチドに由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、請求項１７に記載の植物。
  53. 前記ポリヌクレオチドが、Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A、及びCyt2Cを含有する群から選択される、Ｂ．チューリンゲンシス（B．thuringiensis）に由来するポリペプチドをコードする、請求項５２に記載の植物。
  54. 前記形質転換植物細胞が、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）に由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、請求項４２に記載の方法。
  55. 前記ポリヌクレオチドが、Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A、及びCyt2Cを含有する群から選択される、Ｂ．チューリンゲンシス（B．thuringiensis）に由来するポリペプチドをコードする、請求項５４に記載の方法。
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