CN110372776A - 一种提高蚕茧茧层量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高蚕茧茧层量的方法。依照序列pQLTFTSGWGa，从C端(羧基端)向N端(氨基端)进行家蚕脂动激素A多肽合成；采用荧光素酶报告基因法检测合成的家蚕脂动激素A多肽活性；将家蚕脂动激素A活性多肽液过滤膜除菌，注射入蚕腹部，桑叶饲养至成熟结茧，蚕茧的茧层量增加。本发明方法提高蚕茧茧层量，是没有增加蚕食桑量，通过新发现的活性多肽调控家蚕能量分配来实现的，这对于研究家蚕的能量分配机制、进一步提高家蚕产丝量等，具有积极作用。
Description
技术领域
本发明涉及了一种提高蚕茧茧层量的活性多肽合成，尤其是涉及了一种提高蚕茧茧层量的方法。
背景技术
家蚕(Bombyx mori)是当今地球上室内饲养量最大的经济资源昆虫，它从桑叶中摄取各种营养物质，并通过代谢生理过程供给蚕体内各个组织器官而进行生长、发育、繁殖等，其中将营养物质供给丝腺合成丝物质以吐丝结茧。蚕茧由内蚕蛹和外茧层组成，茧层由茧丝规则胶粘而成，通过煮茧缫丝将茧丝抽出以生产出被誉为“纤维皇后”的生丝，成为我国传统的珍贵纺织原料。为此，获取茧层量高的蚕茧是人们丝茧育蚕的追求目标。
神经肽在家蚕体内含量很低但活性很高，它由神经分泌细胞分泌后与靶细胞表面受体结合，参与了家蚕体的物质能量代谢等重要生理过程，是家蚕生命活动的重要调控因子。在家蚕中首个被发现的神经肽是家蚕素/胰岛素相关肽，目前已经从家蚕基因组中鉴定到了近30多种神经肽以及一些异构体。脂动激素多肽是家蚕神经肽的一种，在家蚕体的能量动态平衡与分配中起着重要的调控作用。但有关家蚕神经肽通过能量分配来调控蚕茧茧层量等，均缺乏研究。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的是提供了一种提高蚕茧茧层量的方法，是在我们从家蚕体中新发现的一种高活性的脂动激素多肽(取名家蚕脂动激素A多肽)的基础上，采用家蚕脂动激素A活性多肽的合成、活性分析检测、给5龄蚕腹部注射等的方法，通过家蚕脂动激素A活性多肽的调控作用，提高蚕茧茧层量。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一、一种能提高蚕茧茧层量的活性多肽：
所述活性多肽的氨基酸序列为pQLTFTSGWGa，如SEQ ID NO.1。
二、一种提高蚕茧茧层量的方法：
1)按照氨基酸序列的氨基酸顺序，从C端(羧基端)向N端(氨基端)进行多肽合成，得到家蚕脂动激素A多肽合成液，家蚕脂动激素A多肽合成液中不含游离氨基，多肽纯度在98％以上；
所述的氨基酸序列为pQLTFTSGWGa，如SEQ ID NO.1；
2)采用荧光素酶报告基因法检测家蚕脂动激素A多肽的活性，活性EC50值为2.87±0.37nM；
3)给五龄第2-3天蚕腹部注射100-150nM家蚕脂动激素A活性多肽，用桑叶继续饲养至成熟结茧，获得茧层量增加的蚕茧。
所述步骤1)具体为：
1.1)将氨基酸序列pQLTFTSGWGa中的每一个氨基酸预先用9-芴甲氧羰基(Fmoc)基团对α-氨基进行保护处理；
1.2)耦联反应：按氨基酸序列将一个已α-氨基保护的氨基酸通过对烷氧苄醇支臂共价连接到不溶性的对烷氧苄醇型树脂固相载体上，得到氨基酸--支臂--树脂；
1.3)脱保护：用90％质量分数的三氟乙酸(TFA)溶液对步骤1.2)获得的氨基酸--支臂--树脂进行处理，脱掉α-氨基上的9-芴甲氧羰基(Fmoc)基团，再用90％质量分数的三氟乙酸(TFA)溶液洗涤氨基酸--支臂--树脂；
1.4)然后用下一个已保护的氨基酸重复步骤1.2)进行耦联反应连接到对烷氧苄醇型树脂固相载体上，重复步骤1.2)～1.3)按照序列pQLTFTSGWGa的氨基酸顺序对其中的每一个氨基酸依次连接到对烷氧苄醇型树脂固相载体上，得到目的多肽；
1.5)用氟化氢(HF)对目的多肽进行处理，水解肽链和固相载体之间的酯键，得到多肽合成液。
所述步骤2)的具体过程为：
2.1)将商品化的连接有cAMP反应元件(CRE)的pCRE-Luc荧光素酶报告基因质粒和家蚕脂动激素受体(BmAKHR)质粒瞬时转染到HEK293细胞系中，筛选得到能同时稳定表达两种质粒的细胞株；
2.2)将细胞株扩大培养后接种至多孔细胞培养板中生长培养，加入多肽合成液，多肽合成液以无血清的细胞培养基(DMEM)稀释成不同浓度(范围1×10-6摩尔～1×10-13摩尔)后，分别加入多孔细胞培养板中，在37℃培养箱中刺激细胞4-6h；
2.3)使用荧光素酶检测试剂盒检测：首先在每孔细胞培养板中加入40μL荧光素酶裂解液，裂解15min；再从每孔细胞培养板中取30μL细胞裂解产物到多孔检测板上，每孔检测板中再加入15μL荧光素酶检测液，混合后反应10min；最后用多孔闪烁发光计数仪检测每个孔的CRE荧光素酶活性，获得荧光值与其对应的多肽浓度作曲线，获得EC50活性值。
所述步骤3)的过程为：给五龄第2-3天家蚕腹部注射100-150nM所述的家蚕脂动激素A活性多肽，用桑叶继续置于24-25℃温度、70-80％湿度、昼明夜暗的环境中饲养至成熟结茧，并在23-24℃温度、70-75％湿度、光线均匀偏暗的环境条件下保护6-7d，获得茧层量增加的蚕茧。
本发明具有的有益效果是：
本发明提高蚕茧茧层量的方法，是没有增加蚕食桑量，通过新发现的脂动激素A活性多肽调控家蚕能量分配来实现的，这对于研究家蚕的能量分配机制、进一步提高家蚕产丝量等，具有积极作用。
本发明通过大量实验证实在不增加蚕食桑量的情况下，采用本发明方法后蚕茧茧层量较对照区的增加约18.9％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明的实施例如下：
实施例1：
依照氨基酸序列pQLTFTSGWGa，将一个用9-芴甲氧羰基(Fmoc)基团对α-氨基进行保护的氨基酸，通过一个对烷氧苄醇支臂共价连结到一个不溶性的固相载体(对烷氧苄醇型树脂)上；用90％质量分数的三氟乙酸(TFA)脱掉α-氨基上Fmoc保护基，用90％质量分数的TFA溶液洗涤氨基酸--支臂--树脂，将下一个预先活化的α-氨基保护的氨基酸通过耦联反应连接上去；反应完成后，用90％质量分数的TFA溶液洗涤，再重复进行脱保护、耦联反应，直到按序列将全部氨基酸从C端(羧基端)向N端(氨基端)连接，得到目的多肽；用氟化氢(HF)水解肽链和固相载体之间的酯键，得到家蚕脂动激素A多肽合成液。
用茚三酮显色法检测合成的家蚕脂动激素A多肽合成液，检测不到游离氨基，确保氨基酸之间连接完全；同时分别用高效液相色谱法(HPLC)和质谱法(MS)检测合成的家蚕脂动激素A多肽合成液的纯度，家蚕脂动激素A多肽合成液纯度为98.2％，并且HPLC和MS检测结果完全一致。
将商品化的连接有cAMP反应元件(CRE)的pCRE-Luc荧光素酶报告基因质粒和家蚕脂动激素受体(BmAKHR)质粒瞬时转染到HEK293细胞系中，筛选得到能同时稳定表达两种质粒的细胞株；将上述细胞株扩大培养后接种至96孔细胞培养板中，长至整个细胞培养板的90％后，加入上得到并以无血清的细胞培养基(DMEM)稀释成1×10-6摩尔浓度的家蚕脂动激素A多肽合成液，在37℃培养箱中刺激细胞4h；然后在96孔细胞培养板的每孔中加入40μL裂解液，裂解15min；再从每孔细胞培养板中取30μL细胞裂解产物到相对应的96孔干净的检测板上，每孔检测板中再加入15μL检测液，混合后反应10min；再用96孔闪烁发光计数仪检测每个孔的CRE荧光素酶活性，做出荧光值和对应家蚕脂动激素A多肽浓度的曲线，算出EC50值＝2.80nM，得到家蚕脂动激素A活性多肽。
将得到的120nM家蚕脂动激素A活性多肽液注射入五龄第2天蚕腹部，置于24℃温度、80％湿度、昼明夜暗的环境中继续用桑叶饲养至成熟结茧，并在24℃温度、73％湿度、光线均匀偏暗的环境条件下保护6d，获得蚕茧的茧层量较对照区蚕茧的茧层量增加18.5％。
实施例2：
依照氨基酸序列pQLTFTSGWGa，将一个用9-芴甲氧羰基(Fmoc)基团对α-氨基进行保护的氨基酸，通过一个对烷氧苄醇支臂共价连结到一个不溶性的固相载体(对烷氧苄醇型树脂)上；用90％质量分数的三氟乙酸(TFA)脱掉α-氨基上Fmoc保护基，用90％质量分数的TFA溶液洗涤氨基酸--支臂--树脂，将下一个预先活化的α-氨基保护的氨基酸通过耦联反应连接上去；反应完成后，用90％质量分数的TFA溶液洗涤，再重复进行脱保护、耦联反应，直到按序列将全部氨基酸从C端(羧基端)向N端(氨基端)连接，得到目的多肽；用氟化氢(HF)水解肽链和固相载体之间的酯键，得到家蚕脂动激素A多肽合成液。
用茚三酮显色法检测合成的家蚕脂动激素A多肽合成液，检测不到游离氨基，确保氨基酸之间连接完全；同时分别用高效液相色谱法(HPLC)和质谱法(MS)检测合成的家蚕脂动激素A多肽合成液的纯度，家蚕脂动激素A多肽合成液纯度为98.5％，并且HPLC和MS检测结果完全一致。
将商品化的连接有cAMP反应元件(CRE)的pCRE-Luc荧光素酶报告基因质粒和家蚕脂动激素受体(BmAKHR)质粒瞬时转染到HEK293细胞系中，筛选得到能同时稳定表达两种质粒的细胞株；将上述细胞株扩大培养后接种至96孔细胞培养板中，长至整个细胞培养板的90％后，加入上得到并以无血清的细胞培养基(DMEM)稀释成1×10-10摩尔浓度的家蚕脂动激素A多肽合成液，在37℃培养箱中刺激细胞5h；然后在96孔细胞培养板的每孔中加入40μL裂解液，裂解15min；再从每孔细胞培养板中取30μL细胞裂解产物到相对应的96孔干净的检测板上，每孔检测板中再加入15μL检测液，混合后反应10min；再用96孔闪烁发光计数仪检测每个孔的CRE荧光素酶活性，做出荧光值和对应家蚕脂动激素A多肽浓度的曲线，算出EC50值＝2.78nM，得到家蚕脂动激素A活性多肽。
将得到的100nM家蚕脂动激素A活性多肽注射入五龄第3天蚕腹部，置于25℃温度、75％湿度、昼明夜暗的环境中继续用桑叶饲养至成熟结茧，并在23℃温度、70％湿度、光线均匀偏暗的环境条件下保护7d，获得蚕茧的茧层量较对照区蚕茧的茧层量增加19.2％。
实施例3：
依照氨基酸序列pQLTFTSGWGa，将一个用9-芴甲氧羰基(Fmoc)基团对α-氨基进行保护的氨基酸，通过一个对烷氧苄醇支臂共价连结到一个不溶性的固相载体(对烷氧苄醇型树脂)上；用90％质量分数的三氟乙酸(TFA)脱掉α-氨基上Fmoc保护基，用90％质量分数的TFA溶液洗涤氨基酸--支臂--树脂，将下一个预先活化的α-氨基保护的氨基酸通过耦联反应连接上去；反应完成后，用90％质量分数的TFA溶液洗涤，再重复进行脱保护、耦联反应，直到按序列将全部氨基酸从C端(羧基端)向N端(氨基端)连接，得到目的多肽；用氟化氢(HF)水解肽链和固相载体之间的酯键，得到家蚕脂动激素A多肽合成液。
用茚三酮显色法检测合成的家蚕脂动激素A多肽合成液，检测不到游离氨基，确保氨基酸之间连接完全；同时分别用高效液相色谱法(HPLC)和质谱法(MS)检测合成的家蚕脂动激素A多肽合成液的纯度，家蚕脂动激素A多肽合成液纯度为98.4％，并且HPLC和MS检测结果完全一致。
将商品化的连接有cAMP反应元件(CRE)的pCRE-Luc荧光素酶报告基因质粒和家蚕脂动激素受体(BmAKHR)质粒瞬时转染到HEK293细胞系中，筛选得到能同时稳定表达两种质粒的细胞株；将上述细胞株扩大培养后接种至96孔细胞培养板中，长至整个细胞培养板的90％后，加入上得到并以无血清的细胞培养基(DMEM)稀释成1×10-13摩尔浓度的家蚕脂动激素A多肽合成液，在37℃培养箱中刺激细胞6h；然后在96孔细胞培养板的每孔中加入40μL裂解液，裂解15min；再从每孔细胞培养板中取30μL细胞裂解产物到相对应的96孔干净的检测板上，每孔检测板中再加入15μL检测液，混合后反应10min；再用96孔闪烁发光计数仪检测每个孔的CRE荧光素酶活性，做出荧光值和对应家蚕脂动激素A多肽浓度的曲线，算出EC50值＝2.89nM，得到家蚕脂动激素A活性多肽。
将得到的150nM家蚕脂动激素A活性多肽注射入五龄第3天蚕腹部，置于24.5℃温度、70％湿度、昼明夜暗的环境中继续用桑叶饲养至成熟结茧，并在23.5℃温度、75％湿度、光线均匀偏暗的环境条件下保护7d，获得蚕茧的茧层量较对照区蚕茧的茧层量增加19.0％。
由上述实施例可见，本发明通过脂动激素A活性多肽调控家蚕能量分配的方式，提高蚕茧的茧层量，技术效果显著，这对于研究家蚕的能量分配机制、进一步提高家蚕产丝量等，具有积极作用。
本发明涉及的序列如下：
SEQ ID NO.1：家蚕脂动激素A多肽的氨基酸序列
来源：人工合成
pQLTFTSGWGa。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种提高蚕茧茧层量的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Leu Thr Phe Thr Ser Gly Trp Gly
1 5
Claims (5)
1.一种能提高蚕茧茧层量的活性多肽，其特征在于：
所述活性多肽的氨基酸序列为pQLTFTSGWGa，如SEQ ID NO.1。
2.一种提高蚕茧茧层量的方法，其特征在于：
1)按照氨基酸序列的氨基酸顺序，从C端(羧基端)向N端(氨基端)进行多肽合成，得到家蚕脂动激素A多肽合成液，家蚕脂动激素A多肽合成液中不含游离氨基，多肽纯度在98％以上；所述的氨基酸序列为pQLTFTSGWGa，如SEQ ID NO.1；
2)采用荧光素酶报告基因法检测家蚕脂动激素A多肽的活性，活性EC50值为2.87±0.37nM；
3)给五龄第2-3天蚕腹部注射100-150nM家蚕脂动激素A活性多肽，用桑叶继续饲养至成熟结茧，获得茧层量增加的蚕茧。
3.根据权利要求2所述的一种提高蚕茧茧层量的方法，其特征在于：所述步骤1)具体为：
1.1)将氨基酸序列pQLTFTSGWGa中的每一个氨基酸预先用9-芴甲氧羰基(Fmoc)基团对α-氨基进行保护处理；
1.2)耦联反应：按氨基酸序列将一个已α-氨基保护的氨基酸通过对烷氧苄醇支臂共价连接到不溶性的对烷氧苄醇型树脂固相载体上，得到氨基酸--支臂--树脂；
1.3)脱保护：用90％质量分数的三氟乙酸(TFA)溶液对步骤1.2)获得的氨基酸--支臂--树脂进行处理，脱掉α-氨基上的9-芴甲氧羰基(Fmoc)基团，再用90％质量分数的三氟乙酸(TFA)溶液洗涤氨基酸--支臂--树脂；
1.4)重复步骤1.2)～1.3)按照序列pQLTFTSGWGa的氨基酸顺序对其中的每一个氨基酸依次连接到对烷氧苄醇型树脂固相载体上，得到目的多肽；
1.5)用氟化氢(HF)对目的多肽进行处理，水解肽链和固相载体之间的酯键，得到多肽合成液。
4.根据权利要求2所述的一种提高家蚕丝腺重量的技术方法，其特征在于：所述步骤2)的具体过程为：
2.1)将商品化的连接有cAMP反应元件(CRE)的pCRE-Luc荧光素酶报告基因质粒和家蚕脂动激素受体(BmAKHR)质粒瞬时转染到HEK293细胞系中，筛选得到能同时稳定表达两种质粒的细胞株；
2.2)将细胞株扩大培养后接种至多孔细胞培养板中生长培养，加入多肽合成液，多肽合成液以无血清的细胞培养基(DMEM)稀释成不同浓度(范围1×10-6摩尔～1×10-13摩尔)后，分别加入多孔细胞培养板中，在37℃培养箱中刺激细胞4-6h；
2.3)使用荧光素酶检测试剂盒检测：首先在每孔细胞培养板中加入40μL荧光素酶裂解液，裂解15min；再从每孔细胞培养板中取30μL细胞裂解产物到多孔检测板上，每孔检测板中再加入15μL荧光素酶检测液，混合后反应10min；最后用多孔闪烁发光计数仪检测每个孔的CRE荧光素酶活性，获得荧光值与其对应的多肽浓度作曲线，获得EC50活性值。
5.根据权利要求2所述的一种提高蚕茧茧层量的方法，其特征在于：
所述步骤3)的过程为：给五龄第2-3天家蚕腹部注射100-150nM所述的家蚕脂动激素A活性多肽，用桑叶继续置于24-25℃温度、70-80％湿度、昼明夜暗的环境中饲养至成熟结茧，并在23-24℃温度、70-75％湿度、光线均匀偏暗的环境条件下保护6-7d，获得茧层量增加的蚕茧。
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