CN109400683B - 抗肿瘤环肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤环肽及其制备方法和应用，该肿瘤环肽的结构如式（I‑1）、式（I‑2）、式（I‑3）、式（I‑4）、式（I‑5）、式（I‑6）、式（I‑7）、式（I‑8）中任意一项所示；该抗肿瘤环肽具有更优异的抗肿瘤效果，同时该制备方法具有工序简单和产率高的优点，进而使得该抗肿瘤环肽能够具有广泛的应用前景。

Description

抗肿瘤环肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及环肽，具体地，涉及一种抗肿瘤环肽及其制备方法和应用。
背景技术
环肽Samoamide A是从海洋蓝藻细菌属Symploca spp中提取的一种多肽，由Phe-Pro-Ile-Phe-Pro-Pro-Leu-Val组成的八环肽(05Jan 2017,80(3):625-633)，Samoamide A对癌细胞的变构结合位点处酶二肽基肽酶(CD26，DPP4)有抑制作用，其显示在传统细胞培养和区域抑制生物测定中在几种人癌细胞系中具有体外细胞毒活性。
目前，国内外对环肽Samoamide A功能性方面的研究处于上升趋势，但关于环肽Samoamide A的具体改造方向还处于初级的探索阶段，并未能够探索出如何提高环肽Samoamide A的抗肿瘤效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗肿瘤环肽及其制备方法和应用，该抗肿瘤环肽具有更优异的抗肿瘤效果，同时该制备方法具有工序简单和产率高的优点，进而使得该抗肿瘤环肽能够具有广泛的应用前景。
为了实现上述目的，本发明提供了一种抗肿瘤环肽，该抗肿瘤环肽的结构如式(I-1)、式(I-2)、式(I-3)、式(I-4)、式(I-5)、式(I-6)、式(I-7)、式(I-8)中任意一项所示，在本发明中，该抗肿瘤环肽的结构可以在上述八种选择，但是为了进一步提高环肽的抗肿瘤效果，优选地，抗肿瘤环肽的结构可以在式(I-1)、式(I-2)、式(I-3)、式(I-4)、式(I-5)、式(I-6)、式(I-7)、式(I-8)中任意一项所示，更选地，该抗肿瘤环肽的结构如式(I-8)所示。
本发明还提供了一种如上述的抗肿瘤环肽的制备方法，包括：
1)将基体树脂浸泡于有机溶剂中，然后去除有机溶剂；接着将基体树脂依次与多种氨基酸进行多次分步处理得到第二树脂；所述分步处理为：将基体树脂、氨基酸、N,N-二异丙基乙胺、有机溶剂进行接触反应，然后进行封闭处理、洗涤、脱除Fmoc保护基、洗涤；
2)将步骤1)得到的第二树脂、切割液进行振荡反应，然后去除有机溶剂得到直链肽链；
3)在保护气的存在下，将所述直链肽链、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸盐、N-甲基吗啉、有机溶剂进行环合反应；接着去除有机溶剂，后处理，将经后处理的反应体系进行离心沉降、干燥以制得所述抗肿瘤环肽。
Figure BDA0001836096010000021
其中，在所述抗肿瘤环肽如式(I-1)所示的情形下，步骤2)中分步处理的氨基酸依次独立为Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH；在所述抗肿瘤环肽如式(I-2)所示的情形下，步骤2)中分步处理的氨基酸依次独立为Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH；在所述抗肿瘤环肽如式(I-3)所示的情形下，步骤2)中分步处理的氨基酸依次独立为Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH；在所述抗肿瘤环肽如式(I-4)所示的情形下，步骤2)中分步处理的氨基酸依次独立为Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH；在所述抗肿瘤环肽如式(I-5)所示的情形下，步骤2)中分步处理的氨基酸依次独立为Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH；在所述抗肿瘤环肽如式(I-6)所示的情形下，步骤2)中分步处理的氨基酸依次独立为Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH；在所述抗肿瘤环肽如式(I-7)所示的情形下，步骤2)中分步处理的氨基酸依次独立为Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH；在所述抗肿瘤环肽如式(I-8)所示的情形下，步骤2)中分步处理的氨基酸依次独立为Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH。
在上述制备方法的步骤1)中，分步处理中的各原料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了产率，优选地，步骤1)中，以1g所述基体树脂为基准，在每步分步处理中，所述N,N-二异丙基乙胺的用量为0.6-0.8g、所述有机溶剂的用量为10-20mL；
所述Fmoc-Ala-OH的用量为300-320mg，所述Fmoc-Phe-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Ile-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Phe-OH的用量为300-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Leu-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Val-OH的用量为330-1000mg；
具体的，在所述抗肿瘤环肽如式(I-1)所示的情形下，所述Fmoc-Ala-OH的用量为300-320mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Ile-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Phe-OH的用量为300-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Leu-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Val-OH的用量为330-1000mg；
在所述抗肿瘤环肽如式(I-2)所示的情形下，所述Fmoc-Ala-OH的用量为300-320mg，所述Fmoc-Phe-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Ile-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Phe-OH的用量为300-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Leu-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Val-OH的用量为330-1000mg；
在所述抗肿瘤环肽如式(I-3)所示的情形下，所述Fmoc-Ala-OH的用量为300-320mg，所述Fmoc-Phe-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Phe-OH的用量为300-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Leu-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Val-OH的用量为330-1000mg；
在所述抗肿瘤环肽如式(I-4)所示的情形下，所述Fmoc-Ala-OH的用量为300-320mg，所述Fmoc-Phe-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Ile-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Leu-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Val-OH的用量为330-1000mg；
在所述抗肿瘤环肽如式(I-5)所示的情形下，所述Fmoc-Ala-OH的用量为300-320mg，所述Fmoc-Phe-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Ile-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Phe-OH的用量为300-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Leu-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Val-OH的用量为330-1000mg；
在所述抗肿瘤环肽如式(I-6)所示的情形下，所述Fmoc-Ala-OH的用量为300-320mg，所述Fmoc-Phe-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Ile-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Phe-OH的用量为300-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Leu-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Val-OH的用量为330-1000mg；
在所述抗肿瘤环肽如式(I-7)所示的情形下，所述Fmoc-Ala-OH的用量为300-320mg，所述Fmoc-Phe-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Ile-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Phe-OH的用量为300-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Val-OH的用量为330-1000mg；
在所述抗肿瘤环肽如式(I-8)所示的情形下，所述Fmoc-Ala-OH的用量为300-320mg，所述Fmoc-Phe-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Ile-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Phe-OH的用量为300-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Pro-OH的用量为330-1000mg，所述Fmoc-Leu-OH的用量为330-1000mg。
在上述制备方法的步骤1)中，浸泡过程中各原料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了浸泡效果，优选地，在步骤1)中，在浸泡过程中，基体树脂、有机溶剂的用量比为1g：10-20mL。
在上述制备方法的步骤1)中，浸泡条件可以在宽的范围内选择，但是为了浸泡效果，优选地，浸泡满足以下条件：浸泡温度为30-35℃，浸泡时间为30-50min。
在上述制备方法的步骤1)中，分步处理中的各原料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了产率，优选地，在步骤1)中，以1g基体树脂为基准，在每步分步处理中，N,N-二异丙基乙胺的用量为0.6-0.8g、有机溶剂的用量为10-20mL；
在上述制备方法的步骤1)中，分步处理中的接触反应的条件可以在宽的范围内选择，但是为了氨基酸连接的产率，优选地，在每步分步处理中，接触反应满足以下条件：反应温度为15-35℃，反应时间为1-1.5h。
在上述制备方法的步骤1)中，封闭处理的条件可以在宽的范围内选择，但是为了将树脂上未参与反应的位点及时地封闭，优选地，封闭处理满足以下条件：处理温度为30-35℃，处理时间为30-50min；
在上述制备方法的步骤1)中，封闭处理的中封闭试剂的组成以及用量可以在宽的范围内选择，但是为了将树脂上未参与反应的位点及时地封闭，优选地，以1g基体树脂为基准，封闭处理采用添加10-20mL的体积比为1：4-5的甲醇和二氯甲烷混合溶液进行；
在上述制备方法的步骤1)中，Fmoc保护基脱除试剂的组成以及用量可以在宽的范围内选择，但是为了提高Fmoc保护基的脱除效果，优选地，以1g基体树脂为基准，脱除Fmoc保护基的步骤中采用添加10-20mL的体积比为1：3-4的哌啶和N,N-二甲基甲酰胺混合溶液进行。
在上述制备方法的步骤2)中，切割液的用量可以在宽的范围内选择，但是为了提高树脂的切割效果，优选地，在步骤2)中，以1g基体树脂制得的第二树脂为基准，切割液的用量为15-20mL。
在上述制备方法的步骤2)中，振荡反应的条件可以在宽的范围内选择，但是为了提高树脂的切割效率，优选地，振荡反应满足以下条件：反应温度为-5～0℃，反应时间为2-4h。
在上述制备方法的步骤2)中，切割液的组分可以在宽的范围内选择，但是为了提高树脂的切割效率，更优选地，所述切割液为95％三氟乙酸。
在上述制备方法的步骤3)中，各物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了提高环合反应的产率，优选地，在步骤3)中，以100mg的所述直链肽链为基准，所述1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑的用量为70-75mg，所述(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸盐的用量为275-285mg，所述N-甲基吗啉的用量为180-190uL，所述有机溶剂的用量为200-300mL。
在上述制备方法的步骤3)中，环合反应的条件可以在宽的范围内选择，但是为了提高环合反应的产率，优选地，在步骤3)中，环合反应满足以下条件：反应温度为15-35℃，反应时间为12-24h。
在上述制备方法的步骤3)中，后处理的条件可以在宽的范围内选择，但是为了提高环合反应的产率，更优选地，后处理为：以甲醇为洗脱剂，通过葡聚糖凝胶柱分离，最后去除洗脱剂。
在上述制备方法的步骤3)中，保护气的种类可以在宽的范围内选择，但是为了提高环合反应的产率，优选地，保护气选自氮气、氦气和氩气中的至少一者；
在上述制备方法的步骤3)中，物料的添加环境可以在宽的范围内选择，但是为了提高环合反应的产率，优选地，在环合反应之前，物料的添加于-5～0℃的环境中进行。
在上述制备方法中，有机溶剂的具体种类可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高其分散效果，优选地，有机溶剂选自二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和N-甲基吡咯烷酮中的至少一者。
在上述制备方法中，洗涤使用的溶剂以及洗涤次数可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高其分散效果，优选地，洗涤使用的试剂为二氯甲烷和/或N,N-二甲基甲酰胺，每次洗涤操作中的洗涤次数为3-5遍。
在上述制备方法中，基体树脂的具体种类可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高其分散效果，优选地，所述基体树脂选自2-氯三苯甲基氯树脂、Wang树脂、MBHA树脂和rink树脂中的至少一者。
本发明进一步提供了一种如上述的抗肿瘤环肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
在上述技术方案中，如图1所示，本发明通过多肽固相合成与丙氨酸扫描相结合的方法，采用体积小，无其他官能团的氨基酸替换Samoamide A上的每一个氨基酸，以消除特殊位点上氨基酸侧链对抗肿瘤活性的影响，结果表明环肽Samoamide A的最特殊位点在氨基酸Pro(脯氨酸)位置，进而使得该环肽具有更优异的抗肿瘤效果，同时该制备方法具有工序简单和产率高的优点，进而使得该抗肿瘤环肽能够具有广泛的应用前景。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明提供的Samoamide A-1的制备原理图；
图2是本发明提供的实施例1的产物MS谱图；
图3是本发明提供的实施例1的产物1H谱图；
图4是本发明提供的实施例1的产物13C谱图；
图5是本发明提供的实施例2的产物MS谱图；
图6是本发明提供的实施例2的产物1H谱图；
图7是本发明提供的实施例2的产物13C谱图；
图8是本发明提供的实施例3的产物MS谱图；
图9是本发明提供的实施例3的产物1H谱图；
图10是本发明提供的实施例3的产物13C谱图；
图11是本发明提供的实施例4的产物MS谱图；
图12是本发明提供的实施例4的产物1H谱图；
图13是本发明提供的实施例4的产物13C谱图；
图14是本发明提供的实施例5的产物MS谱图；
图15是本发明提供的实施例5的产物1H谱图；
图16是本发明提供的实施例5的产物13C谱图；
图17是本发明提供的实施例6的产物MS谱图；
图18是本发明提供的实施例6的产物1H谱图；
图19是本发明提供的实施例6的产物13C谱图；
图20是本发明提供的实施例7的产物MS谱图；
图21是本发明提供的实施例7的产物1H谱图；
图22是本发明提供的实施例7的产物13C谱图；
图23是本发明提供的实施例8的产物MS谱图；
图24是本发明提供的实施例8的产物1H谱图；
图25是本发明提供的实施例8的产物13C谱图；
图26是本发明提供的应用例1的细胞毒性实验图；
图27是本发明提供的应用例2的DPP4酶活抑制实验图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，部分的英文缩写解释如下：Fmoc：芴甲氧羰基、DMF：N,N-二甲基甲酰胺、DCM：二氯甲烷、DIPEA：N,N-二异丙基乙胺、HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、HOAt：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、NMM：N-甲基吗啉、PyAop：(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸盐、
Fmoc-Phe-OH：N-芴甲氧羰基苯丙氨酸，Fmoc-Pro-OH：N-芴甲氧羰基脯氨酸，Fmoc-Ile-OH：N-芴甲氧羰基异亮氨酸，Fmoc-Pro-OH：N-芴甲氧羰基脯氨酸，Fmoc-Leu-OH：N-芴甲氧羰基亮氨酸，Fmoc-Val-OH：N-芴甲氧羰基缬氨酸、piperidine：哌啶、TFE：三氟乙醇、Acetic：乙酸、TFA：三氟乙酸。
制备例1
切割液：配制95％三氟乙酸。
实施例1(如图1所示)
1)先用15mL的DCM在30-35℃下浸泡2-氯三苯甲基氯树脂1000mg(取代度1.03mmol/g)0.5h，抽去DCM。
单个氨基酸的连接反应：接第一个氨基酸前，称取311.3mg的Fmoc-Ala-OH氨基酸，用977μL的DIPEA和10mL DCM浸泡1h进行活化，再接树脂于30-35℃下反应1-1.5h得到化合物1；然后用15mL 20％甲醇体积比的二氯甲烷溶液，30-35℃下反应30min，对树脂上未参与反应的位点进行封闭，反应结束后，分别用DCM和DMF洗涤3遍，抽去洗涤液。向反应管中加入15mL 25％哌啶体积比的DMF溶液，反应30min，脱除Fmoc保护基，反应结束后，分别用DCM和DMF洗涤5遍，抽去洗涤液。
重复上述连接氨基酸然后脱除末端的Fmoc保护基然后检测的步骤，依次接入1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Ile-OH、1000mgFmoc-Phe-OH、1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Leu-OH、1000mgFmoc-Val-OH，得到化合物5。
2)将化合物5转移至50mL离心管中，加入15mL的切割液，0℃的条件下，振荡反应2.5h，再将滤液过滤至茄型瓶中。用旋转蒸发仪去除滤液中的DCM，油泵抽干剩余液体，加入2mL甲苯，再抽干，即得到淡黄色粉末状化合物6,产率为85％。
3)称取HOAT 79.8mg溶于2mL DMF后转移至茄型瓶中，再称取PyAOP305.8mg溶于100mL的DCM，转移至茄型瓶中，再加入NMM 131.1μL。将茄型瓶置于0℃的冰水中，用恒压滴液漏斗将溶有100mg化合物6的100mL DCM缓慢的滴加到茄型瓶中，氮气保护，滴加完毕后，从冰水中取出茄型瓶，25℃反应过夜(12h)。用旋转蒸发仪将反应液抽出，油泵抽干多余的DMF。以甲醇为洗脱剂(GE Healthcare Sephadex LH-20)，收集含有多肽的溶液部分，旋干后得到化合物7。用3倍体积的乙醚进行离心沉降3次，氮气吹干，得到的白色粉末状化合物，用高效液相色谱进一步纯化，获取终产物Samoamide A-1(如式(I-1)所示)，步骤1)-3)的总产率为45％。
实施例2
1)先用15mL的DCM在30-35℃下浸泡2-氯三苯甲基氯树脂1000mg(取代度1.03mmol/g)0.5h，抽去DCM。
单个氨基酸的连接反应：接第一个氨基酸前，称取387.0mg的Fmoc-Phe-OH氨基酸，用977μL的DIPEA和10mL DCM浸泡1h进行活化，再接树脂于30-35℃下反应1-1.5h得到Fmoc-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂；然后用15mL 20％甲醇体积比的二氯甲烷溶液，30-35℃下反应30min，对树脂上未参与反应的位点进行封闭，反应结束后，分别用DCM和DMF洗涤3遍，抽去洗涤液。向反应管中加入15mL 25％哌啶体积比的DMF溶液，反应30min，脱除Fmoc保护基，反应结束后，分别用DCM和DMF洗涤5遍，抽去洗涤液。
重复上述连接氨基酸然后脱除末端的Fmoc保护基然后检测的步骤，依次接入1000mgFmoc-Ala-OH、1000mgFmoc-Ile-OH、1000mgFmoc-Phe-OH、1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Leu-OH、1000mgFmoc-Val-OH，得到Val-Leu-Pro-Pro-Phe-Ile-Ala-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂。
2)将化合物Val-Leu-Pro-Pro-Phe-Ile-Ala-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂转移至50mL离心管中，加入15mL的切割液，0℃的条件下，振荡反应2.5h，再将滤液过滤至茄型瓶中。用旋转蒸发仪去除滤液中的DCM，油泵抽干剩余液体，加入2mL甲苯，再抽干，即得到淡黄色粉末状化合物Val-Leu-Pro-Pro-Phe-Ile-Ala-Phe，产率为82％。
3)称取HOAT 75.4mg溶于2mL DMF后转移至茄型瓶中，再称取PyAOP288.8mg溶于100mL的DCM，转移至茄型瓶中，再加入NMM 123.8μL。将茄型瓶置于0℃的冰水中，用恒压滴液漏斗将溶有100mg化合物Val-Leu-Pro-Pro-Phe-Ile-Ala-Phe的100mL DCM缓慢的滴加到茄型瓶中，氮气保护，滴加完毕后，从冰水中取出茄型瓶，25℃反应过夜(12h)。用旋转蒸发仪将反应液抽出，油泵抽干多余的DMF。以甲醇为洗脱剂(GE Healthcare Sephadex LH-20)，收集含有多肽的溶液部分，旋干后得到化合物环[-Val-Leu-Pro-Pro-Phe-Ile-Ala-Phe-]。用3倍体积的乙醚进行离心沉降3次，氮气吹干，得到的白色粉末状化合物，用高效液相色谱进一步纯化，获取终产物Samoamide A-2(如式(I-2)所示)，步骤1)-3)的总产率为55％。
实施例3
1)先用15mL的DCM在30-35℃下浸泡2-氯三苯甲基氯树脂1000mg(取代度1.03mmol/g)0.5h，抽去DCM。
单个氨基酸的连接反应：接第一个氨基酸前，称取387.0mg的Fmoc-Phe-OH氨基酸，用977μL的DIPEA和10mL DCM浸泡1h进行活化，再接树脂于30-35℃下反应1-1.5h得到Fmoc-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂；然后用15mL 20％甲醇体积比的二氯甲烷溶液，30-35℃下反应30min，对树脂上未参与反应的位点进行封闭，反应结束后，分别用DCM和DMF洗涤3遍，抽去洗涤液。向反应管中加入15mL 25％哌啶体积比的DMF溶液，反应30min，脱除Fmoc保护基，反应结束后，分别用DCM和DMF洗涤5遍，抽去洗涤液。
重复上述连接氨基酸然后脱除末端的Fmoc保护基然后检测的步骤，依次接入1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Ala-OH、1000mgFmoc-Phe-OH、1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Leu-OH、1000mgFmoc-Val-OH，得到Val-Leu-Pro-Pro-Phe-Ala-Pro-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂。
2)将化合物Val-Leu-Pro-Pro-Phe-Ala-Pro-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂转移至50mL离心管中，加入15mL的切割液，0℃的条件下，振荡反应2.5h，再将滤液过滤至茄型瓶中。用旋转蒸发仪去除滤液中的DCM，油泵抽干剩余液体，加入2mL甲苯，再抽干，即得到淡黄色粉末状化合物Val-Leu-Pro-Pro-Phe-Ala-Pro-Phe，产率为89％。
3)称取HOAT 76.8mg溶于2mL DMF后转移至茄型瓶中，再称取PyAOP294.1mg溶于100mL的DCM，转移至茄型瓶中，再加入NMM 126.1μL。将茄型瓶置于0℃的冰水中，用恒压滴液漏斗将溶有100mg化合物Val-Leu-Pro-Pro-Phe-Ala-Pro-Phe的100mL DCM缓慢的滴加到茄型瓶中，氮气保护，滴加完毕后，从冰水中取出茄型瓶，25℃反应过夜(12h)。用旋转蒸发仪将反应液抽出，油泵抽干多余的DMF。以甲醇为洗脱剂(GE Healthcare Sephadex LH-20)，收集含有多肽的溶液部分，旋干后得到化合物环[-Val-Leu-Pro-Pro-Phe-Ala-Pro-Phe-]。用3倍体积的乙醚进行离心沉降3次，氮气吹干，得到的白色粉末状化合物，用高效液相色谱进一步纯化，获取终产物Samoamide A-3(如式(I-3)所示)，步骤1)-3)的总产率为52％。
实施例4
1)先用15mL的DCM在30-35℃下浸泡2-氯三苯甲基氯树脂1000mg(取代度1.03mmol/g)0.5h，抽去DCM。
单个氨基酸的连接反应：接第一个氨基酸前，称取387.0mg的Fmoc-Phe-OH氨基酸，用977μL的DIPEA和10mL DCM浸泡1h进行活化，再接树脂于30-35℃下反应1-1.5h得到Fmoc-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂；然后用15mL 20％甲醇体积比的二氯甲烷溶液，30-35℃下反应30min，对树脂上未参与反应的位点进行封闭，反应结束后，分别用DCM和DMF洗涤3遍，抽去洗涤液。向反应管中加入15mL 25％哌啶体积比的DMF溶液，反应30min，脱除Fmoc保护基，反应结束后，分别用DCM和DMF洗涤5遍，抽去洗涤液。
重复上述连接氨基酸然后脱除末端的Fmoc保护基然后检测的步骤，依次接入1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Ile-OH、1000mgFmoc-Ala-OH、1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Leu-OH、1000mgFmoc-Val-OH，得到Val-Leu-Pro-Pro-Ala-Ile-Pro-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂。
2)将化合物Val-Leu-Pro-Pro-Ala-Ile-Pro-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂转移至50mL离心管中，加入15mL的切割液，0℃的条件下，振荡反应2.5h，再将滤液过滤至茄型瓶中。用旋转蒸发仪去除滤液中的DCM，油泵抽干剩余液体，加入2mL甲苯，再抽干，即得到淡黄色粉末状化合物Val-Leu-Pro-Pro-Ala-Ile-Pro-Phe,产率为79％。
3)称取HOAT 79.8mg溶于2mL DMF后转移至茄型瓶中，再称取PyAOP305.8mg溶于100mL的DCM，转移至茄型瓶中，再加入NMM131.1μL。将茄型瓶置于0℃的冰水中，用恒压滴液漏斗将溶有100mg化合物Val-Leu-Pro-Pro-Ala-Ile-Pro-Phe的100mL DCM缓慢的滴加到茄型瓶中，氮气保护，滴加完毕后，从冰水中取出茄型瓶，25℃反应过夜(12h)。用旋转蒸发仪将反应液抽出，油泵抽干多余的DMF。以甲醇为洗脱剂(GE Healthcare Sephadex LH-20)，收集含有多肽的溶液部分，旋干后得到化合物环[-Val-Leu-Pro-Pro-Ala-Ile-Pro-Phe-]。用3倍体积的乙醚进行离心沉降3次，氮气吹干，得到的白色粉末状化合物，用高效液相色谱进一步纯化，获取终产物Samoamide A-4(如式(I-4)所示)，步骤1)-3)的总产率为49％。
实施例5
1)先用15mL的DCM在30-35℃下浸泡2-氯三苯甲基氯树脂1000mg(取代度1.03mmol/g)0.5h，抽去DCM。
单个氨基酸的连接反应：接第一个氨基酸前，称取387.0mg的Fmoc-Phe-OH氨基酸，用977μL的DIPEA和10mL DCM浸泡1h进行活化，再接树脂于30-35℃下反应1-1.5h得到Fmoc-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂；然后用15mL 20％甲醇体积比的二氯甲烷溶液，30-35℃下反应30min，对树脂上未参与反应的位点进行封闭，反应结束后，分别用DCM和DMF洗涤3遍，抽去洗涤液。向反应管中加入15mL 25％哌啶体积比的DMF溶液，反应30min，脱除Fmoc保护基，反应结束后，分别用DCM和DMF洗涤5遍，抽去洗涤液。
重复上述连接氨基酸然后脱除末端的Fmoc保护基然后检测的步骤，依次接入1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Ile-OH、1000mgFmoc-Phe-OH、1000mgFmoc-Ala-OH、1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Leu-OH、1000mgFmoc-Val-OH，得到Val-Leu-Pro-Ala-Phe-Ile-Pro-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂。
2)将化合物Val-Leu-Pro-Ala-Phe-Ile-Pro-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂转移至50mL离心管中，加入15mL的切割液，0℃的条件下，振荡反应2.5h，再将滤液过滤至茄型瓶中。用旋转蒸发仪去除滤液中的DCM，油泵抽干剩余液体，加入2mL甲苯，再抽干，即得到淡黄色粉末状化合物Val-Leu-Pro-Ala-Phe-Ile-Pro-Phe，产率为88％。
3)称取HOAT 75.4mg溶于2mL DMF后转移至茄型瓶中，再称取PyAOP288.8mg溶于100mL的DCM，转移至茄型瓶中，再加入NMM 123.8μL。将茄型瓶置于0℃的冰水中，用恒压滴液漏斗将溶有100mg化合物Val-Leu-Pro-Ala-Phe-Ile-Pro-Phe的100mL DCM缓慢的滴加到茄型瓶中，氮气保护，滴加完毕后，从冰水中取出茄型瓶，25℃反应过夜(12h)。用旋转蒸发仪将反应液抽出，油泵抽干多余的DMF。以甲醇为洗脱剂(GE Healthcare Sephadex LH-20)，收集含有多肽的溶液部分，旋干后得到化合物环[-Val-Leu-Pro-Ala-Phe-Ile-Pro-Phe-]。用3倍体积的乙醚进行离心沉降3次，氮气吹干，得到的白色粉末状化合物，用高效液相色谱进一步纯化，获取终产物Samoamide A-5(如式(I-5)所示)，步骤1)-3)的总产率为56％。
实施例6
1)先用15mL的DCM在30-35℃下浸泡2-氯三苯甲基氯树脂1000mg(取代度1.03mmol/g)0.5h，抽去DCM。
单个氨基酸的连接反应：接第一个氨基酸前，称取387.0mg的Fmoc-Phe-OH氨基酸，用977μL的DIPEA和10mL DCM浸泡1h进行活化，再接树脂于30-35℃下反应1-1.5h得到Fmoc-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂；然后用15mL 20％甲醇体积比的二氯甲烷溶液，30-35℃下反应30min，对树脂上未参与反应的位点进行封闭，反应结束后，分别用DCM和DMF洗涤3遍，抽去洗涤液。向反应管中加入15mL 25％哌啶体积比的DMF溶液，反应30min，脱除Fmoc保护基，反应结束后，分别用DCM和DMF洗涤5遍，抽去洗涤液。
重复上述连接氨基酸然后脱除末端的Fmoc保护基然后检测的步骤，依次接入1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Ile-OH、1000mgFmoc-Phe-OH、1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Ala-OH、1000mgFmoc-Leu-OH、1000mgFmoc-Val-OH，得到Val-Leu-Ala-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂。
2)将化合物Val-Leu-Ala-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂转移至50mL离心管中，加入15mL的切割液，0℃的条件下，振荡反应2.5h，再将滤液过滤至茄型瓶中。用旋转蒸发仪去除滤液中的DCM，油泵抽干剩余液体，加入2mL甲苯，再抽干，即得到淡黄色粉末状化合物Val-Leu-Ala-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe，产率为84％。
3)称取HOAT 75.4mg溶于2mL DMF后转移至茄型瓶中，再称取PyAOP288.8mg溶于100mL的DCM，转移至茄型瓶中，再加入NMM 123.8μL。将茄型瓶置于0℃的冰水中，用恒压滴液漏斗将溶有100mg化合物Val-Leu-Ala-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe的100mL DCM缓慢的滴加到茄型瓶中，氮气保护，滴加完毕后，从冰水中取出茄型瓶，25℃反应过夜(12h)。用旋转蒸发仪将反应液抽出，油泵抽干多余的DMF。以甲醇为洗脱剂(GE Healthcare Sephadex LH-20)，收集含有多肽的溶液部分，旋干后得到化合物环[-Val-Leu-Ala-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe-]。用3倍体积的乙醚进行离心沉降3次，氮气吹干，得到的白色粉末状化合物，用高效液相色谱进一步纯化，获取终产物Samoamide A-6(如式(I-6)所示)，步骤1)-3)的总产率为58％。
实施例7
1)先用15mL的DCM在30-35℃下浸泡2-氯三苯甲基氯树脂1000mg(取代度1.03mmol/g)0.5h，抽去DCM。
单个氨基酸的连接反应：接第一个氨基酸前，称取387.0mg的Fmoc-Phe-OH氨基酸，用977μL的DIPEA和10mL DCM浸泡1h进行活化，再接树脂于30-35℃下反应1-1.5h得到Fmoc-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂；然后用15mL 20％甲醇体积比的二氯甲烷溶液，30-35℃下反应30min，对树脂上未参与反应的位点进行封闭，反应结束后，分别用DCM和DMF洗涤3遍，抽去洗涤液。向反应管中加入15mL 25％哌啶体积比的DMF溶液，反应30min，脱除Fmoc保护基，反应结束后，分别用DCM和DMF洗涤5遍，抽去洗涤液。
重复上述连接氨基酸然后脱除末端的Fmoc保护基然后检测的步骤，依次接入1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Ile-OH、1000mgFmoc-Phe-OH、1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Ala-OH、1000mgFmoc-Val-OH，得到Val-Ala-Pro-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂。
2)将化合物Val-Ala-Pro-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂转移至50mL离心管中，加入15mL的切割液，0℃的条件下，振荡反应2.5h，再将滤液过滤至茄型瓶中。用旋转蒸发仪去除滤液中的DCM，油泵抽干剩余液体，加入2mL甲苯，再抽干，即得到淡黄色粉末状化合物Val-Ala-Pro-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe，产率为91％。
3)称取HOAT 76.8mg溶于2mL DMF后转移至茄型瓶中，再称取PyAOP294.1mg溶于100mL的DCM，转移至茄型瓶中，再加入NMM 126.1μL。将茄型瓶置于0℃的冰水中，用恒压滴液漏斗将溶有100mg化合物Val-Ala-Pro-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe的100mL DCM缓慢的滴加到茄型瓶中，氮气保护，滴加完毕后，从冰水中取出茄型瓶，25℃反应过夜(12h)。用旋转蒸发仪将反应液抽出，油泵抽干多余的DMF。以甲醇为洗脱剂(GE Healthcare Sephadex LH-20)，收集含有多肽的溶液部分，旋干后得到化合物环[-Val-Ala-Pro-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe-]。用3倍体积的乙醚进行离心沉降3次，氮气吹干，得到的白色粉末状化合物，用高效液相色谱进一步纯化，获取终产物Samoamide A-7(如式(I-7)所示)，步骤1)-3)的总产率为55％。
实施例8
1)先用15mL的DCM在30-35℃下浸泡2-氯三苯甲基氯树脂1000mg(取代度1.03mmol/g)0.5h，抽去DCM。
单个氨基酸的连接反应：接第一个氨基酸前，称取387.0mg的Fmoc-Phe-OH氨基酸，用977μL的DIPEA和10mL DCM浸泡1h进行活化，再接树脂于30-35℃下反应1-1.5h得到Fmoc-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂；然后用15mL 20％甲醇体积比的二氯甲烷溶液，30-35℃下反应30min，对树脂上未参与反应的位点进行封闭，反应结束后，分别用DCM和DMF洗涤3遍，抽去洗涤液。向反应管中加入15mL 25％哌啶体积比的DMF溶液，反应30min，脱除Fmoc保护基，反应结束后，分别用DCM和DMF洗涤5遍，抽去洗涤液。
重复上述连接氨基酸然后脱除末端的Fmoc保护基然后检测的步骤，依次接入1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Ile-OH、1000mgFmoc-Phe-OH、1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Leu-OH、1000mgFmoc-Ala-OH，得到Ala-Leu-Pro-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂。
2)将化合物Ala-Leu-Pro-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂转移至50mL离心管中，加入15mL的切割液，0℃的条件下，振荡反应2.5h，再将滤液过滤至茄型瓶中。用旋转蒸发仪去除滤液中的DCM，油泵抽干剩余液体，加入2mL甲苯，再抽干，即得到淡黄色粉末状化合物Ala-Leu-Pro-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe，产率为88％。
3)称取HOAT 75.6mg溶于2mL DMF后转移至茄型瓶中，再称取PyAOP289.5mg溶于100mL的DCM，转移至茄型瓶中，再加入NMM 124.1μL。将茄型瓶置于0℃的冰水中，用恒压滴液漏斗将溶有100mg化合物Ala-Leu-Pro-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe的100mL DCM缓慢的滴加到茄型瓶中，氮气保护，滴加完毕后，从冰水中取出茄型瓶，25℃反应过夜(12h)。用旋转蒸发仪将反应液抽出，油泵抽干多余的DMF。以甲醇为洗脱剂(GE Healthcare Sephadex LH-20)，收集含有多肽的溶液部分，旋干后得到化合物环[-Ala-Leu-Pro-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe-]。用3倍体积的乙醚进行离心沉降3次，氮气吹干，得到的白色粉末状化合物，用高效液相色谱进一步纯化，获取终产物Samoamide A-8(如式(I-8)所示)，步骤1)-3)的总产率为52％。
检测例1
将实施例1-8的产物进行质谱以及核磁的检测，检测结果见图2-25，由图可知，实施例1-6的产物的结构与式(I-1)、式(I-2)、式(I-3)、式(I-4)、式(I-5)、式(I-6)、式(I-7)、式(I-8)是一致的。
应用例1
采用MTT比色法检测样品对细胞的生存影响。将4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞)孵育至90％的细胞呈贴壁状态，然后用1mL的0.25％胰蛋白酶在培养箱消化2min，800rpm离心5min，完全培养基重悬4T1细胞后，用血球计数板确定4T1细胞数量，完全培养基稀释重悬4T1细胞浓度为8×104/mL。用排枪吸取100细胞悬液，依次加入96孔板中，即大约含8000个细胞/孔，放入恒温二氧化碳培养箱孵育至4T1细胞贴壁后，加入0、3.125、6.25、12.5、25、50ug/mL等不同浓度梯度的多肽溶液，设8个复孔。在二氧化碳培养箱培养24h后，倒置显微镜下观察。然后吸去原培养液，每孔加入100μL含0.09％CCK-8细胞培养液，再放入二氧化碳培养箱中，培育2h，用全功能酶标仪在OD450nm处测定各孔的吸光度。
Figure BDA0001836096010000151
(OD值取平均值)。
结果如图26所示，a、b、c、d、e、f、g、h分别对应于式(I-1)、式(I-2)、式(I-3)、式(I-4)、式(I-5)、式(I-6)、式(I-7)、式(I-8)，化合物a、c、h对4T1细胞完全没有毒性，而化合物d、e、g的细胞存活率达到70％以上，对4T1细胞的毒性较小，化合物b的细胞存活率为46.98％，化合物f的细胞存活率为25.35％，其中化合物f的抗肿瘤活性最好，有可能成为抗肿瘤药物的先导化合物。
应用例2
使用市售的DPP4inhibitor和其提供的的实验方案测试样品在溶液中对抗DPP4酶的抑制活性。在黑色96孔酶标板每个孔上加入49ul测试缓冲液1ul DPP4酶液；然后分别设空白孔、待测样品孔、抑制剂对照组。空白对照孔：不添加任何物质；抑制剂对照孔：将试剂盒提供的抑制剂西他列汀母液取2ul用测试缓冲液稀释100倍做成工作液，加25ul工作液；待检样品孔：加入25ul梯度稀释成100ug/mL、10ug/mL、1ug/mL、0.1ug/mL、0.01ug/mL的多肽样品溶液；37℃孵育10min；每个孔加入23ul测试缓冲液2ul DPP4底物，用移液器吹打均匀，再37℃孵育10min；使用全功能酶标仪在37℃避光条件下，设定机器参数为激发光360nm，吸收光460nm条件下读取样品的OD值，读数控制在15min内完成。
化合物抑制率＝(空白组-样本组)/空白*100％。
结果如图27所示，a、b、c、d、e、f、g、h分别对应于式(I-1)、式(I-2)、式(I-3)、式(I-4)、式(I-5)、式(I-6)、式(I-7)、式(I-8)，化合物a、c、h的DPP4酶活抑制率很低，化合物d、e、g的酶活抑制率达到40％以下，对DPP4的酶活抑制较小，化合物b的酶活抑制率为81.97％，化合物f的酶活抑制率为82.44％，因此，化合物b、f抗肿瘤效果最好，有可能成为抗肿瘤药物的先导化合物。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (1)

1.一种抗肿瘤环肽的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤环肽的结构如式I-6所示，
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；
所述方法包括如下步骤：
1）先用15mL的DCM在30-35℃下浸泡2-氯三苯甲基氯树脂1000mg 0.5h，抽去DCM；
单个氨基酸的连接反应：接第一个氨基酸前，称取387.0mg的Fmoc-Phe-OH氨基酸，用977μL的DIPEA和10mL DCM浸泡1h进行活化，再接树脂于30-35℃下反应1-1.5h得到Fmoc-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂；然后用15 mL 20%甲醇体积比的二氯甲烷溶液，30-35℃下反应30min，对树脂上未参与反应的位点进行封闭，反应结束后，分别用DCM和DMF洗涤3遍，抽去洗涤液；向反应管中加入15 mL 25% 哌啶体积比的DMF溶液，反应30 min，脱除Fmoc保护基，反应结束后，分别用DCM和DMF洗涤5遍，抽去洗涤液；
重复上述连接氨基酸然后脱除末端的Fmoc保护基然后检测的步骤，依次接入1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Ile-OH 、1000mgFmoc-Phe-OH、1000mgFmoc-Pro-OH、1000mgFmoc-Ala-OH、1000mgFmoc-Leu-OH 、1000mgFmoc-Val-OH，得到Val-Leu-Ala-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂；
2）将化合物Val-Leu-Ala-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe-2-氯三苯甲基氯树脂转移至50 mL离心管中，加入15 mL的切割液，0 ℃的条件下，振荡反应2.5 h，再将滤液过滤至茄型瓶中；用旋转蒸发仪去除滤液中的DCM，油泵抽干剩余液体，加入2 mL甲苯，再抽干，即得到淡黄色粉末状化合物Val-Leu-Ala-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe，产率为84%；
3）称取HOAT 75.4 mg溶于2 mL DMF后转移至茄型瓶中，再称取PyAOP288.8 mg溶于100mL的DCM，转移至茄型瓶中，再加入NMM 123.8 μL；将茄型瓶置于0 ℃的冰水中，用恒压滴液漏斗将溶有100 mg化合物Val-Leu-Ala-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe的100 mL DCM缓慢的滴加到茄型瓶中，氮气保护，滴加完毕后，从冰水中取出茄型瓶，25℃反应过夜；用旋转蒸发仪将反应液抽出，油泵抽干多余的DMF；以甲醇为洗脱剂，收集含有多肽的溶液部分，旋干后得到化合物环[-Val-Leu-Ala-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe-]；用3倍体积的乙醚进行离心沉降3次，氮气吹干，得到的白色粉末状化合物，用高效液相色谱进一步纯化，获取终产物，步骤1)-3)的总产率为58%。
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