ES2396368T3 - Péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (CMET) y usos de los mismos - Google Patents

Péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (CMET) y usos de los mismos Download PDF

Info

Publication number
ES2396368T3
ES2396368T3 ES08008144T ES08008144T ES2396368T3 ES 2396368 T3 ES2396368 T3 ES 2396368T3 ES 08008144 T ES08008144 T ES 08008144T ES 08008144 T ES08008144 T ES 08008144T ES 2396368 T3 ES2396368 T3 ES 2396368T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cmet
binding
peptide
polypeptide
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES08008144T
Other languages
English (en)
Inventor
Aaron K. Sato
Daniel T. Dransfield
Robert C. Ladner
Palaniappa Nanjappan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bracco Suisse SA
Bracco International BV
Dyax Corp
Original Assignee
Bracco Suisse SA
Bracco International BV
Dyax Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bracco Suisse SA, Bracco International BV, Dyax Corp filed Critical Bracco Suisse SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2396368T3 publication Critical patent/ES2396368T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A61K47/665—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells the pre-targeting system, clearing therapy or rescue therapy involving biotin-(strept) avidin systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
    • A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Un polipéptido o polipéptido multimérico que comprende una secuencia de aminoácidos: Gly-X1-Cys-X2-Cys-X3-Gly-Pro-Pro-X4-Phe-XS-Cys-X6-Cys-X7-X8-X9-X10-Pro (SEQ ID NO: 1), en la que X1 es Ser, X2 es His, Tyr o Asn, X3 es Ser o Gly, X4 es cualquier aminoácido distinto de Cys, X5 es Glu, X6 es Trp, X7 es Tyr, X8 es Gly, Asp, Ala, Glu o Ser, X9 es Thr o Ser, y X10 es Glu o Asp

Description

Péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (CMET) y usos de los mismos
Antecedentes de la invención
El factor de crecimiento de hepatocitos (también conocido como factor de dispersión) es un factor de crecimiento multifuncional implicado en diversos procesos fisiológicos tales como la embriogénesis, la cicatrización de heridas y la angiogénesis. Se ha descubierto que el HGF, a través de interacciones con su receptor de alta afinidad (cMet), está implicado en el crecimiento, la invasión y la metástasis de tumores. De hecho, la desregulación de la expresión de cMet (por ejemplo, la sobreexpresión de cMet en epitelio neoplásico de adenomas colorrectales y en otros carcinomas en comparación con mucosa normal) y/o de su actividad, así como la hiperactividad del receptor de cMet a través de un bucle estimulador autocrino con HGF, se han demostrado en una variedad de tejidos tumorales e induce la transformación oncogénica de líneas celulares específicas.
En general, el HGF lo producen las células estromales, que forman parte de muchos tumores epiteliales; sin embargo, se cree que la producción de HFG por las propias células tumorales comprende la principal ruta que conduce a la hiperproliferación de tumores específicos. Los bucles estimuladores autocrinos de HGF/cMet se han detectado en gliomas, osteosarcomas y carcinomas mamarios, de próstata, de pecho, de pulmón y otros.
La interrupción de la interacción del HFG con el receptor cMet ralentiza la progresión tumoral en modelos animales. Además de estimular la proliferación de determinadas células cancerosas a través de la activación de cMet, el HGF también protege frente a la citotoxicidad inducida por agentes que dañan el ADN en una variedad de líneas celulares susceptibles a fenotipos hiperproliferativos (por ejemplo, cáncer de mama). Por lo tanto, evitar que el HGF se una a cMet podría predisponer determinadas células cancerosas a la citotoxicidad de determinados fármacos.
Además de los trastornos hiperproliferativos, cMet también se ha relacionado con la angiogénesis. Por ejemplo, la estimulación de cMet conduce a la producción de factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), que, a su vez, estimula la angiogénesis. Adicionalmente, la estimulación de cMet también se ha relacionado con la promoción de la cicatrización de heridas.
Además de identificar el receptor cMet como objetivo terapéutico para trastornos hiperproliferativos, angiogénesis y cicatrización de heridas, la gran discrepancia entre los niveles de expresión de tejidos neoplásicos y los correspondientes normales indica que cMet es un objetivo atractivo para aplicaciones de formación de imágenes dirigidas a trastornos hiperproliferativos.
Los documentos US 2002-136721, Parr y otros ("Hepatocyte growth factor activators, inhibitors and antagonists and their implication in cancer intervention." HISTOLOGY AND HISTOPATHOLOGY. ENE 2001, vol. 16, n.º 1, enero de 2001, págs. 251-268), Date y otros ("HGF/NK4 is a specific antagonist for pleiotrophic actions of hepatocyte growth factor". FEBS LETTERS., vol. 420, n.º 1, 22 de diciembre de 1997, págs. 1-6) y Bardelli y otros ("A peptide representing the carboxyl-terminal tail of the met receptor inhibits kinase activity and invasive growth" J. BIOL. CHEM., vol. 274, n.º 41, octubre de 1999, págs. 29274-29281) divulgan polipéptidos que se unen a cMet y que tienen una actividad antagonista. El asunto objeto de la presente invención difiere sustancialmente de dichos polipéptidos descritos.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a péptidos, complejos peptídicos y composiciones que tienen la capacidad de unirse a cMet y antagonizar la actividad del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) evitando que el HGF se una a cMet. Además, la presente invención se refiere a tales péptidos, complejos peptídicos y composiciones que tienen la capacidad de unirse a cMet con el propósito de detectar y dirigirse a este receptor, inhibiendo la actividad de cMet independiente de las propiedades antagonistas del HGF. La implicación del eje HGF/cMet en una variedad de funciones celulares que incluyen la proliferación celular, la cicatrización de heridas y la angiogénesis, que conducen a trastornos hiperproliferativos tales como el cáncer, hacen a la presente invención particularmente útil para interrumpir acontecimientos fisiológicos mediados por el HGF, para dirigir sustancias, por ejemplo, agentes terapéuticos, incluidos agentes radioterápicos, a dichos sitios.
Sorprendentemente, en respuesta a la necesidad de proporcionar materiales mejorados para, posiblemente, inhibir o afectar, por ejemplo, a la hiperproliferación y/o la angiogénesis, se ha descubierto que polipéptidos no naturales reivindicados en la reivindicación 1 se unen específicamente a cMet. La conjugación o la fusión de tales polipéptidos con agentes eficaces tales como inhibidores de cMet o agentes tumoricidas también pueden usarse para tratar tumores patógenos, por ejemplo, haciendo que el conjugado o la fusión "migren" al sitio de proliferación y/o angiogénesis activa, proporcionando así un medio eficaz para tratar afecciones patógenas asociadas con la hiperproliferación y/o la angiogénesis.
La presente invención se refiere a polipéptidos que se unen a cMet e incluye el uso de un único polipéptido de unión como un monómero o en una construcción multimérica, así como el uso de más de un polipéptido de unión de la invención en construcciones multiméricas. Los polipéptidos de unión de acuerdo con la presente invención son útiles en cualquier aplicación en la que sean ventajosos la unión, la unión o el aislamiento de cMet. Un aspecto particularmente importante de tales polipéptidos de unión es la inhibición de la actividad de cMet, bien por medio de la competición con el HGF por la unión a cMet o inhibiendo directamente la actividad de cMet independientemente de si el HGF está unido o no. Por ejemplo, en algunos casos, la señalización de cMet puede producirse en ausencia de unión del HGF. En tales situaciones, un polipéptido de unión que inhibe la actividad de señalización de cMet independientemente de si el HGF está unido, sería útil en la inhibición de la señalización de cMet.
Otro uso particularmente ventajoso de los polipéptidos de unión divulgados en el presente documento es en un procedimiento de formación de imágenes de proliferación celular y/o angiogénesis in vivo. El procedimiento implica el uso de polipéptidos de unión específicos de acuerdo con la invención para detectar un sitio de proliferación celular y/o angiogénesis, donde los polipéptidos de unión se han marcado de forma detectable para su uso como agentes de formación de imágenes, incluidos agentes de contraste de formación de imágenes de resonancia magnética (RMN), agentes de formación de imágenes de rayos X, agentes de formación de imágenes radiofarmacéuticos, agentes de formación de imágenes de ultrasonido y agentes de formación de imágenes ópticas.
Otro uso ventajoso más de los polipéptidos de unión a cMet divulgados en el presente documento es dirigir agentes terapéuticos (incluidos compuestos capaces de proporcionar un efecto terapéutico, radioterápico o citotóxico) o vehículos de administración para agentes terapéuticos (incluidos fármacos, material genético, etc.) a sitios de hiperproliferación y/o angiogénesis u otro tejido que exprese cMet.
El receptor de cMet forma parte de la familia de receptores tirosina cinasa de moléculas de señalización. Para los propósitos de la presente invención, la función del receptor tirosina cinasa puede incluir una cualquiera de: oligomerización del receptor, fosforilación de receptor, actividad cinasa del receptor, reclutamiento de moléculas de señalización posteriores, inducción de genes, inducción de proliferación celular, inducción de migración celular o sus combinaciones. En la presente invención también se engloban moléculas "heteroméricas", usado en el presente documento para referirse a moléculas que contienen más de un péptido de unión a cMet descrito en el presente documento, de forma que cada péptido de unión de la molécula heteromérica se une a un sitio diferente, por ejemplo, "epítopo", de cMet. Por ejemplo, las construcciones heteroméricas de polipéptidos de unión proporcionados en el presente documento, podrían, por ejemplo, unirse a través de un péptido de unión a, por ejemplo, el sitio de unión de HGF de cMet, al mismo tiempo que otro péptido de unión de la molécula heteromérica se une a un sitio de unión de alta afinidad de cMet diferente. Dirigirse a dos o más epítopos distintos de cMet con una única construcción de unión puede mejorar notablemente la capacidad de la construcción para inhibir la unión del HGF y/o la función del receptor (tal inhibición puede producirse por inhibición directa de cMet independientemente de la unión del HGF). Incluso los péptidos de unión con capacidad escasa para bloquear la actividad del receptor pueden usarse para generar las construcciones heteroméricas con capacidad mejorada para bloquear la función del receptor dependiente del HGF e independiente del HGF.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a construcciones que comprenden medios para producir moléculas multiméricas que comprenden dos o más polipéptidos de unión, al menos uno de los cuales de une a cMet. En una realización, las construcciones multiméricas comprenden dos o más copias de un único polipéptido de unión
o secuencia de nucleótidos que codifica dos o más copias de un único polipéptido de unión. En otra realización, las construcciones multiméricas de la presente invención comprenden dos o más polipéptidos o secuencias de nucleótidos de unión que codifican dos o más polipéptidos de unión, de forma que al menos dos de los polipéptidos de unión de la construcción son específicos para epítopos diferentes de cMet. Estas construcciones también se denominan en el presente documento "construcciones heteroméricas", "heteromultímeros", etc. Las construcciones de la presente invención también pueden incluir péptidos no relacionados o de control. Las construcciones pueden incluir dos o más, tres o más, o cuatro o más, polipéptidos de unión o las secuencias de nucleótidos que codifican tales polipéptidos. Con base en las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, un experto en la técnica puede ensamblar los polipéptidos de unión proporcionados en el presente documento en construcciones multiméricas y seleccionar construcciones multiméricas con propiedades mejoradas, tales como capacidad mejorada para unirse a la molécula objetivo o capacidad mejorada para inhibir la función del receptor tirosina cinasa. Tales construcciones multiméricas con propiedades mejoradas se incluyen en la presente invención.
Se han determinado secuencias consenso a partir del rastreo de las colecciones de péptidos cíclicos/lineales basándose en las doce clases de polipéptidos de unión a cMet específicos mostradas en la tabla 6. En realizaciones específicas, los polipéptidos de unión a cMet de la invención comprenden una o más de las secuencias de acuerdo con la SEQ ID No. 1. Tales polipéptidos de unión a cMet preferidos incluyen polipéptidos con el potencial de formar una estructura cíclica o de bucle comprendida entre residuos invariantes de cisteína.
Los polipéptidos descritos en el presente documento pueden tener aminoácidos adicionales unidos en cualquiera o en ambos extremos N- y C-terminal. En realizaciones preferidas, los polipéptidos de unión de acuerdo con la invención pueden prepararse con péptidos flanqueantes en N-terminal y/o C-terminal de uno o más, preferentemente dos, aminoácidos que corresponden a los péptidos flanqueantes de la construcción de presentación del fago seleccionado a partir del cual se aislaron los polipéptidos de unión.
El análisis de la información de la secuencia y los datos de unión de los aislados de las colecciones que contienen polipéptidos con el potencial de formar estructuras de bucle (por ejemplo, colecciones denominadas TN6, T8, TN9, TN10, TN11 y TN12; el número se refiere al número de aminoácidos de la secuencia de cisteína a cisteína; adicionalmente, también se rastreó la colección de presentación lineal LN20) identifica una serie adicional de polipéptidos de unión a cMet.
En otro aspecto de la presente divulgación, se proporcionan procedimientos para aislar células que expresan cMet usando los presentes polipéptidos o construcciones polipeptídicas multiméricas de unión.
Adicionalmente, los polipéptidos o construcciones polipeptídicas multiméricas de unión a cMet de la invención pueden usarse como agentes terapéuticos, bien solos en una composición farmacéuticamente aceptable o conjugados con (o en combinación con) otros agentes terapéuticos. Las composiciones pueden usarse para tratar enfermedades o afecciones que implican proliferación celular, angiogénesis y/o cicatrización de heridas.
Cuando se usan como agentes terapéuticos, puede ser ventajoso potenciar el tiempo de residencia en suero de los péptidos. Esto puede lograrse: a) conjugando al péptido un resto, tal como maleimida, que reacciona con grupos sulfhidrilo libres de proteínas séricas, tales como albúmina sérica, b) conjugando al péptido un resto, tal como un ácido graso, que se une de forma no covalente a proteínas séricas, especialmente albúmina sérica, c) conjugando al péptido un polímero, tal como polietilenglicol (PEG), que se sabe que potencia el tiempo de residencia en suero y d) fusionando ADN que codifica el péptido de unión a cMet a ADN que codifica una proteína sérica tal como albúmina sérica humana o un anticuerpo y expresando la proteína de fusión codificada.
La presente invención se refiere a un polipéptido o una construcción polipeptídica multimérica que tiene la capacidad de unirse a cMet o a un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoácidos como se reivindica en la reivindicación 1. En una realización en particular, el polipéptido, usado bien como un monómero o en una construcción multimérica, puede seleccionarse del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6 a 13.
En otra realización, se describe en el presente documento un procedimiento de tratamiento de una afección que implica la activación de cMet, que comprende administrar a un sujeto animal o humano que necesita tratamiento para tal afección una composición que comprende un polipéptido o construcción polipeptídica multimérica que tiene la capacidad de unirse a cMet o a un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoácidos como se reivindica en la reivindicación 1. En otra realización, se describe en el presente documento un procedimiento de tratamiento de una afección que implica la activación de cMet, que comprende administrar a un sujeto animal o humano que necesita tratamiento para tal afección una composición que comprende un polipéptido o una construcción polipeptídica multimérica que tiene la capacidad de unirse a cMet o a un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoácidos, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un tramo contiguo de aminoácidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6 a 13. En una realización en particular, la afección es el crecimiento de un tumor sólido, por ejemplo, en el que el tumor se selecciona del grupo que consiste en mama, tiroides, glioblastoma, próstata, mesiotelioma maligno, colorrectal, hepatocelular, hepatobiliar, renal, osteosarcoma y cervical. En una realización en particular, el polipéptido o la construcción polipeptídica multimérica puede conjugarse con un agente tumoricida.
Otra realización descrita en el presente documento es un bacteriófago recombinante que presenta uno cualquiera o más de los polipéptidos o construcciones polipeptídica multiméricas descritos en el presente documento o que tiene una cualquiera o más de las secuencias consenso descritas en el presente documento, de forma que el fago tiene la capacidad de unirse a cMet o a un complejo que comprende cMet y HGF, y en el que el polipéptido se presenta en la superficie del bacteriófago recombinante.
Breve descripción de los dibujos
Las figura 1A-1C son representaciones de miméticos, que pueden emplearse para imitar motivos estructurales y características de giro en un péptido y, simultáneamente, proporcionar estabilidad a la proteolisis y potenciar otras propiedades (estructura 1A: Hart, S. y Etzkom, F., 1999. J. Org. Chem., 64:2998-2999; estructura 1B: Hanessian, S. y McNaughton-Smith, G., "Synthesis of a Versatile Peptidomimetic Scaffold" en Methods in Molecular Medicine, vol.
23: Peptidomimetics Protocols, W. Kazmierski, Ed. (Humana Press Inc., Totowa, N.J., 1999), capítulo 10, pág. 161174; estructura 1C: documento WO 01/16135.
La figura 2 es una representación de los aminoácidos (4), que contienen una función aminoalcohol, y (5), que contienen una función alcoxiamino.
La figura 3 es una representación que ilustra la ciclación de la cisteína con una función bromoacetamida lateral (este procedimiento se denomina en el presente documento "esquema 1").
La figura 4 es una representación que muestra la ciclación intramolecular de funciones aminomercapto y funciones aldehído próximas situadas adecuadamente para proporcionar tiazolidinas que dan lugar a la formación de un péptido bicíclico, uno de cuyos anillos es el formado por los residuos de la cadena principal y siendo el segundo anillo el anillo tiazolidina (este procedimiento se denomina en el presente documento "esquema 2").
La figura 5 es una representación que muestra cómo una función lactama, disponible mediante acoplamiento intramolecular a través de reactivos de acoplamiento de péptidos estándar (tales como HATU, PyBOP, etc.), puede actuar como sustituta del enlace disulfuro. Se muestra el enfoque de Dde/Dmab (y se denomina en el presente documento "esquema 3").
La figura 6 es una representación que muestra la reacción de Grubbs (denominada en el presente documento "esquema 4").
Las figura 7A y 7B son estructuras químicas de restos fosfolípido.
Las figura 8A-F representan estructuras de quelantes de metales preferidos.
La figura 9 es una representación esquemática de la estrategia de selección que se empleó para identificar polipéptidos de unión de cMet. TEA = trietilamina, Infección con perlas = captura de fagos no eluidos que permanecían unidos a las perlas de cMet-Fc/proteína-A.
La figura 10 ilustra las propiedades inhibidoras del crecimiento del péptido de unión a cMet de SEQ ID NO: 2.
La figura 11 muestra un diagrama esquemático para la preparación de la SEQ ID NO: 16 conjugada con un resto 6-PnAO-Glut (denominado en el presente documento "esquema 5").
La figura 12 muestra un diagrama esquemático para la preparación de un heterodímero que contiene las SEQ ID NO: 16 y 17 unidas mediante un enlazador K(PnAO6-Glut) (denominado en el presente documento "esquema 5").
Las figura 13A-13C muestran las estructuras químicas de tres heterodímeros como sigue: la figura 13A muestra la SEQ ID NO:16 enlazada a la SEQ ID NO:17 (Ac-GSPEMCMMFPFLYPCNHHAPGGGK{PnAO6-Glut-K[Ac-GSFFPCWRIDRFGYCHAN-APGGGKJJ-Glut]-NH2}-NH2); la figura 13B muestra la SEQ ID NO: 17 enlazada a la SEQ ID NO:18 (Ac-GSFFPCWRIDRFGY-CHANAPGGGK{PnAO6-Glut-K[Ac-AQEWEREYFVDGFWGSWFGIPHGGGK(JJ-Glut)-NH2]}-NH2); y la figura 13C muestra la SEQ ID NO:16 enlazada a la SEQ ID NO:19 (Ac-GSPEMCMMFPFLYPCNHHAPGGGK{PnA06-Glut-K[Ac-GDYSECFFEPDSFEVKCYDRDPGGGK(JJ-Glut)-NH2]}-NH2).
La figura 14 es una representación gráfica de datos que muestran la unión de derivados de la SEQ ID NO: 16 con diferente longitud espaciadora y biotina. Los derivados tienen ninguno, uno y dos espaciadores J respectivamente entre la secuencia objetivo y la biotina.
Descripción detallada de la invención
Lo siguiente es una descripción de realizaciones preferidas de la invención.
La presente invención proporciona restos de unión novedosos que se unen al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos ("HGFr" o "cMet"). Los polipéptidos y construcciones polipeptídicas multiméricas de unión de la invención pueden usarse para formar una variedad de agentes terapéuticos para tratar el crecimiento de tumores neoplásicos u otros trastornos proliferativos. Los propios polipéptidos de unión y construcciones polipeptídicas multiméricas pueden usarse como agentes terapéuticos.
Inicialmente, se aislaron polipéptidos de unión a cMet específicos de acuerdo con la presente invención mediante rastreo de colecciones de presentación en fagos, es decir, poblaciones de bacteriófagos transformadas para que expresen un péptido exógeno en su superficie. Con el fin de aislar nuevos restos de unión polipeptídicos para un objetivo en particular, tal como cMet, el rastreo de grandes colecciones de péptidos, por ejemplo, usando técnicas de presentación en fago, es especialmente ventajoso, en cuanto que se pueden probar cantidades muy grandes (por ejemplo, 5 x 109) de agentes de unión potenciales y aislar agentes de unión satisfactorios en un periodo de tiempo corto.
Con el fin de preparar una colección de fagos de presentación de polipéptidos para rastrearla en busca de polipéptidos de unión tales como polipéptidos de unión a cMet y/o polipéptidos que se unen a un complejo que comprende HGF unido a cMet, se selecciona un dominio de unión candidato para que sirva de molde estructural para los péptidos que se quieren presentar en la colección. La colección de fagos se compone de una multiplicidad de análogos del dominio original o molde. El molde del dominio de unión puede ser una proteína natural o artificial, o una región o dominio de una proteína. El molde del dominio de unión puede seleccionarse basándose en el conocimiento de una interacción conocida entre el molde del dominio de unión y el objetivo de unión, pero esto no es crucial. De hecho, no es esencial que el dominio seleccionado actúe como molde para la colección o que tenga afinidad alguna por el objetivo; su propósito es proporcionar una estructura a partir de la cual puede generarse una multiplicidad (colección) de polipéptidos de estructura similar (análogos), multiplicidad de análogos que incluirá uno o más análogos que muestren las propiedades de unión deseadas (y cualquier otra propiedad que se haya buscado en el rastreo).
En la selección del dominio de unión original o molde sobre el que basar las secuencias de aminoácidos variegadas de la colección, una consideración importante es cómo se presentarán los dominios peptídicos variegados al objetivo, es decir, en qué conformación se pondrán en contacto los análogos peptídicos con el objetivo. En metodologías de presentación en fago, por ejemplo, los análogos se generan por inserción de ADN artificial que codifica los análogos en el fago, dando lugar a la presentación del análogo en la superficie del fago. Tales colecciones de fagos, tales como el fago M13, que presentan una amplia variedad de polipéptidos diferentes, pueden preparase usando técnicas como las descritas, por ejemplo, en Kay y otros, Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual (Academic Press, Inc., San Diego, 1996) y en el documento US 5223409 (Ladner y otros).
En el aislamiento de los polipéptidos específicos de acuerdo con la presente invención, se rastrearon inicialmente siete colecciones de péptidos cíclicos (o "de bucle"), denominadas TN6, TN7, TN8, TN9, TN10, TN11, TN12, y una colección lineal, denominada LN20. Cada colección se construyó para la expresión de polipéptidos diversificados en el fago M13. Las siete colecciones que tienen una denominación "TN" se diseñaron para que presentaran un bucle de péptido exógeno variegado de 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 aminoácidos, respectivamente, en la superficie del fago M13, en el extremo amino de la proteína III. Las colecciones se denominan TN6 (con una diversidad potencial de 3,3 x 1012 secuencias de aminoácidos), TN7 (con una diversidad potencial de 1,2 x 1014 secuencias de aminoácidos), TN8 (con una diversidad potencial de 2,2 x 1015 secuencias de aminoácidos), TN9 (con una diversidad potencial de 4,2 x 1016 secuencias de aminoácidos), TN10 (con una diversidad potencial de 3,0 x 1016 secuencias de aminoácidos), TN11 (con una diversidad potencial de 1,5 x 1019 secuencias de aminoácidos), TN12 (con una diversidad de secuencias de 4,6 x 1019) y LN20 (con una diversidad potencial de 3,8 x 1025 secuencias de aminoácidos).
La colección TN6 se construyó para presentar un único bucle de unión de microproteína contenido en un molde de 12 aminoácidos. La colección TN6 utilizó una secuencia molde de Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Cys - Xaa10 - Xaa11 -Xaa12. Los aminoácidos en las posiciones 2, 3, 5, 6, 7, 8, 10 y 11 del molde se variaron para permitir cualquier aminoácido excepto cisteína (Cys). Los aminoácidos de las posiciones 1 y 12 del molde se variaron para permitir cualquier aminoácido excepto cisteína (Cys), ácido glutámico (Glu), isoleucina (Ile), lisina (Lys), metionina (Met) y treonina (Thr).
La colección TN7 se construyó para presentar un único bucle de unión de microproteína contenido en un molde de 13 aminoácidos. La colección TN7 utilizó una secuencia molde de Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Cys - Xaa1 Xaa12 - Xaa13. Los aminoácidos en las posiciones 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 y 13 del molde se variaron para permitir cualquier aminoácido excepto cisteína (Cys).
La colección TN8 se construyó para presentar un único bucle de unión de microproteína contenido en un molde de 14 aminoácidos. La colección TN8 utilizó una secuencia molde de Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Cys - Xaa12 - Xaa 13 - Xaa 14. Los aminoácidos en las posiciones 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13 y 14 del molde se variaron para permitir cualquier aminoácido excepto cisteína (Cys).
La colección TN9 se construyó para presentar un único bucle de unión de microproteína contenido en un molde de 15 aminoácidos. La colección TN9 utilizó una secuencia molde de Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Cys - Xaa13 - Xaa 14 - Xaa 15. Los aminoácidos en las posiciones 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14 y 15 del molde se variaron para permitir cualquier aminoácido excepto cisteína (Cys).
La colección TN10 se construyó para presentar un único bucle de unión de microproteína contenido en un molde de 16 aminoácidos. La colección TN10 utilizó una secuencia molde de Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 -Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 -Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Cys - Xaa14 - Xaa15 - Xaa16. Los aminoácidos en las posiciones 1, 2, 15 y 16 del molde se variaron para permitir cualquier aminoácido seleccionado de un grupo de 10 aminoácidos: D, F, H, L, N, P, R, S, W o Y). Los aminoácidos en las posiciones 3 y 14 del molde se variaron para permitir cualquier aminoácido seleccionado de un grupo de 14 aminoácidos: A, D, F, G, H, L, N, P, Q, R, S, V, W o Y). Los aminoácidos en las posiciones 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 del molde se variaron para permitir cualquier aminoácido excepto cisteína (Cys).
La colección TN11 se construyó para presentar un único bucle de unión de microproteína contenido en un molde de 17 aminoácidos. La colección TN11 utilizó una secuencia molde de Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 -Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 -Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13 - Cys - Xaa15 - Xaa16 - Xaa17. Los aminoácidos en las posiciones de 1 a 3, de 5 a 13 y de 15 a 17 del molde se variaron para permitir cualquier aminoácido excepto cisteína (Cys).
La colección TN12 se construyó para presentar un único bucle de unión de microproteína contenido en un molde de 18 aminoácidos. La colección TN12 utilizó una secuencia molde de Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 -Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13 - Xaa14 - Cys - Xaa16 - Xaa17 - Xaa18. Los aminoácidos en las posiciones 1, 2, 17 y 18 del molde se variaron para permitir cualquier aminoácido seleccionado de un grupo de 12 aminoácidos: A, D, F, G, H, L, N, P, R, S, W o Y). Los aminoácidos en las posiciones 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 16 se variaron para permitir cualquier aminoácido excepto cisteína (Cys).
La colección LN20 se construyó para presentar múltiples péptidos lineales en la superficie de un fago. Sin embargo, cada fago presenta múltiples copias de la misma secuencia. Por lo tanto, un único fago presentará, por ejemplo, cinco copias de una secuencia en particular, un fago diferente presentará, por ejemplo, cinco copias de una secuencia diferente, etc. Los péptidos lineales se proporcionan en un molde de 20 aminoácidos. Los aminoácidos en cada posición del molde se variaron para permitir cualquier aminoácido excepto cisteína (Cys).
Los polipéptidos de unión proporcionados en el presente documento pueden incluir adiciones en los extremos N y/o
C. Se espera que tales polipéptidos de unión modificados se unan a cMet. Se espera que los polipéptidos de unión que comprenden la porción de bucle de los moldes y las secuencias proporcionadas en el presente documento se unan a cMet y también se engloban en la presente invención. La porción de bucle de los moldes y secuencias incluye las secuencias intermedias y que incluyen los dos residuos de cisteína que se espera que formen un enlace disulfuro, generando así una estructura de bucle peptídico. Además, los polipéptidos de unión de la presente invención pueden incluir residuos de aminoácido adicionales en los extremos N y/o C.
Las colecciones de presentación en fago se crearon preparando una serie determinada de mutaciones o variaciones dentro de una secuencia de codificación para el molde de polipéptido, codificando cada secuencia mutante un análogo peptídico de estructura general correspondiente al molde excepto porque tiene una o más variaciones de aminoácido en la secuencia del molde. El ADN variegado (mutado) novedoso proporciona diversidad de secuencia y cada fago transformante presenta una variante de la secuencia de aminoácidos molde inicial codificada por el ADN, dando lugar a una población de fagos (colección) que presentan un gran número de secuencias de aminoácidos diferentes pero estructuralmente relacionadas. Se espera que las variaciones de aminoácidos modifiquen las propiedades de unión del péptido o dominio de unión sin modificar significativamente su estructura, al menos para la mayoría de las sustituciones. Se prefiere que las posiciones de aminoácidos que se seleccionan para su variación (posiciones de aminoácido variables) sean posiciones de aminoácido de superficie, es decir, posiciones en la secuencia de aminoácidos de los dominios que, cuando el dominio se encuentra en su conformación más estable, aparecen en la superficie exterior del dominio (es decir, la superficie expuesta a la solución). Lo más preferentemente, las posiciones de aminoácido que se van a variar serán adyacentes o se encontrarán próximas, con el fin de maximizar el efecto de las sustituciones.
Como se indica anteriormente, las técnicas analizadas en Kay y otros, Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual (Academic Press, Inc., San Diego, 1996) y en el documento US 5223409 son particularmente útiles para preparar una colección de agentes de unión potenciales correspondientes al molde original seleccionado. Las colecciones analizadas anteriormente se prepararon de acuerdo con tales técnicas y se rastrearon en busca de polipéptidos de unión de cMet frente al objetivo inmovilizado, como se explica en los ejemplos siguientes.
En un rastreo típico, se pone en contacto una colección de fagos y se deja que se una al objetivo o a uno de sus subcomponentes en particular. Para facilitar la separación de agentes de unión y de no unión, conviene inmovilizar el objetivo sobre un soporte sólido. Los fagos que portan un resto de unión a objetivo forman un complejo con el objetivo sobre el soporte sólido, mientras que el fago que no se une permanece en la solución y puede eliminarse por lavado con tampón en exceso. Después, los fagos unidos se liberan del objetivo cambiando el tampón a un pH extremo (pH 2 o pH 10), cambiando la fuerza iónica del tampón, añadiendo desnaturalizantes o por otros medios conocidos. Para aislar el fago de unión que muestra los polipéptidos de la presente invención, se realiza una elución de proteínas, es decir, se eluyen algunos fagos del objetivo usando HGF en solución (elución competitiva). Adicionalmente, por ejemplo, los fagos de unión con afinidad muy alta que no pudieron eliminarse por competición durante la incubación con HGF de una noche se capturaron usando los fagos unidos todavía al sustrato para la infección de células de E. coli.
Los fagos recuperados pueden amplificarse después por medio de infección de células bacterianas y puede repetirse el procedimiento de rastreo con el nuevo conjunto que ahora carece de agentes de no unión y está enriquecido en agentes de unión. La recuperación de incluso unos pocos fagos de unión es suficiente para llevar a cabo el procedimiento. Tras unos pocos ciclos de selección, las secuencias génicas que codifican los restos de unión derivados de clones de fagos seleccionados del conjunto de unión se determinan mediante procedimientos convencionales, descritos a continuación, revelando la secuencia peptídica que confiere afinidad de unión del fago al objetivo. Cuando funciona el procedimiento de selección, la diversidad de secuencia de la población disminuye con cada ciclo de selección hasta que quedan los agentes de unión deseables. Las secuencias convergen en un número pequeño de agentes de unión relacionados, normalmente 10-50 de aproximadamente 109 a 1010 candidatos originales de cada colección. Un aumento del número de fagos recuperados en cada ciclo de selección y, por supuesto, la recuperación de secuencias estrechamente relacionadas, son buenos indicadores de que se ha producido la convergencia de la colección en un rastreo. Después de identificar un juego de polipéptidos de unión, puede usarse la información de secuencia para diseñar otras colecciones de fagos secundarias, sesgadas hacia miembros que tienen propiedades deseadas adicionales La formación del bucle de enlace disulfuro es ventajosa porque da lugar a una afinidad y especificidad aumentadas por tales péptidos. Sin embargo, en el suero, el enlace disulfuro puede abrirse por cisteínas libres u otras moléculas que contienen tioles. Por tanto, podría ser útil modificar los residuos de cisteína para reemplazar el entrecruzamiento disulfuro con otro enlace menos reactivo. El entrecruzamiento -CH2-S-S-CH2 tiene una geometría preferida en la que el enlace diédrico entre los azufres es de casi 90 grados, pero la geometría exacta se determina por el contexto de otros grupos laterales y el estado de unión de la molécula. Las modificaciones preferidas del entrecruzamiento de cierre del bucle de unión conservarán las longitudes y ángulos de enlace generales en la medida de lo posible. Entrecruzamientos alternativos de este tipo incluyen enlaces tioéter tales como -CH2-S-CH2-CH2-, -CH2-CH2-S-CH2-, -CH2-CH2-S-CH2-CH2-; enlaces lactama o amida tales como -CH2-NH-CO-CH2- y -CH2-CO-NH-CH2-; enlaces éter tales como -CH2-CH2-O-CH2-CH2-; puentes alquileno tales como -(CH2)n- (donde n = 4, 5 o 6); el enlace -CH2-NH-CO-NH-CH2- y grupos similares conocidos en la técnica.
La síntesis directa de los polipéptidos de la invención puede lograrse usando técnicas convencionales, incluidas la síntesis peptídica en fase sólida, la síntesis en fase de solución, etc. Se prefiere la síntesis en fase sólida (véanse, por ejemplo, Stewart y otros, Solid-Phase Peptide Synthesis (W. H. Freeman Co., San Francisco, 1989); Merrifield, J., 1963, Am. Chem. Soc., 85:2149-2154; Bodanszky y Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, Nueva York, 1984)).
Los polipéptidos de acuerdo con la invención también pueden prepararse comercialmente por empresas que proporcionan servicios de síntesis (por ejemplo, BACHEM Bioscience, Inc., King of Prussia, PA; Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkinton, MA).
También están disponibles máquinas de síntesis peptídica automatizada, tales como las fabricadas por Perkin-Elmer Applied Biosystems.
Preferentemente, el compuesto de polipéptido se purifica después de haberlo aislado o sintetizado mediante técnicas químicas o recombinantes. Para fines de purificación, existen muchos procedimientos estándar que pueden emplearse, incluida la cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) usando una columna de sílice alquilada tal como sílice C4, C8 o C18. En general, se usa una fase móvil en gradiente de contenido orgánico creciente para lograr la purificación, por ejemplo, acetonitrilo en un tampón acuoso, conteniendo habitualmente una pequeña cantidad de ácido trifluoroacético. También puede usarse cromatografía de intercambio iónico para separar péptidos basándose en su carga. El grado de pureza del polipéptido puede determinarse mediante diversos procedimientos, incluida la identificación de un pico grande principal en la HPLC. Se prefiere un polipéptido que produzca un único pico que sea al menos el 95 % del material de entrada en una columna de HPLC. Es incluso más preferible un polipéptido que produzca un único pico que sea al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %
o incluso el 99,5 % o más del material de entrada en una columna de HPLC.
Para garantizar que el péptido obtenido usando cualquiera de las técnicas descritas anteriormente es el péptido deseado para su uso en composiciones de la presente invención, puede llevarse a cabo el análisis de la composición del péptido. Tal análisis de composición puede realizarse usando espectrometría de masas de alta resolución para determinar el peso molecular del péptido. De forma alternativa, puede confirmarse el contenido en aminoácidos del péptido hidrolizando el péptido en ácido acuoso y separando, identificando y cuantificando los componentes de la mezcla usando HPLC o un analizador de aminoácidos. También pueden usarse para determinar la secuencia de péptido secuenciadores de proteínas, que degradan secuencialmente el péptido e identifican los aminoácidos en orden.
Los polipéptidos de unión a cMet de acuerdo con la presente invención también pueden producirse usando técnicas de ADN recombinante, utilizando ácido nucleicos (polinucleótidos) que codifican los polipéptidos de acuerdo con la presente invención y expresándolos después de forma recombinante, es decir, manipulando células huésped mediante la introducción de moléculas de ácido nucleico exógeno de formas conocidas para hacer que las células huésped produzcan los polipéptidos de unión a cMet deseados. Tales procedimientos se encuentran dentro de las capacidades de los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, David, y otros, Basic Methods in Molecular Biology (1986)). La producción recombinante de péptidos cortos, tales como los descritos en el presente documento, podría no ser práctica en comparación con la síntesis directa, aunque los medios recombinantes de producción pueden ser muy ventajosos cuando se incorpora un resto de unión a cMet de la presente invención en un polipéptido híbrido o proteína de fusión.
En la puesta en práctica de la presente invención, una determinación de la afinidad del resto de unión a cMet por cMet con relación a otras proteínas u objetivos es una medida útil y se denomina especificidad por cMet. Los ensayos estándar para cuantificar la unión y determinar la afinidad incluyen diálisis en el equilibrio, unión en el equilibrio, filtración en gel o la monitorización de numerosos cambios espectroscópicos (tales como un cambio en la polarización de la fluorescencia) que son consecuencia de la interacción del resto de unión y su objetivo. Estas técnicas miden la concentración de ligando unido y libre como una función de la concentración de ligando (o proteína). La concentración de polipéptido unido ([Unido]) se refiere a la concentración de polipéptido libre ([Libre]) y la concentración de sitios de unión para el polipéptido, es decir, en cMet, (N), como se describe en la ecuación siguiente:
[Unido] = N x [Libre]/((1/Ka)+(Libre]).
Una solución de los datos para esta ecuación proporciona la constante de asociación Ka, una medida cuantitativa de la afinidad de unión. La constante de asociación, Ka es la inversa de la constante de disociación, KD. La KD se registra más frecuentemente en medidas de afinidad. Los polipéptidos de unión a cMet pueden tener una K D para cMet en el intervalo de, por ejemplo, menos de 1 nanomolar (nM), de 1 nM a 100 micromolar ( M), lo que incluye valores de KD de menos de 10 nM, menos de 20 nM, menos de 40 nM, menos de 60 nM, menos de 80 nM, menos de 1 M, menos de 5 M, menos de 10 M, menos de 20 M, menos de 40 M, menos de 60 M y menos de 80
M.
La medida cuantitativa de las velocidades de disociación puede realizarse usando varios procedimientos conocidos en la técnica, tales como fluorimetría de fibra óptica (véase, por ejemplo, Anderson y Miller, 1988, Clin. Chem., 34:1417-21), resonancia de plasmón superficial (véanse, por ejemplo, Malmborg y otros, 1996, J. Immunol. Methods, 198:51-7; y Schuck, 1997, Curr. Op. Biotechnol., 8:498-502), espejo de resonancia y guía de ondas plana acoplada a rejilla (véase, por ejemplo, Hutchinson, 1995, Molec. Biotechnol., 3:47-54). Existen biosensores automáticos comercialmente disponibles para medir cinéticas de unión: sensor de resonancia de plasmón superficial BIAcore (Biacore AB, Uppsala SE), sensor de espejo de resonancia IAsys (Fisons Applied Sensor Technology, Cambridge GB), sensor de guía de ondas plana acoplada a rejilla BIOS-1 (Artificial Sensor Instruments, Zurich CH).
Construcciones multiméricas de polipéptidos de unión a cMet
También se contemplan construcciones que emplean dímeros o multímeros de uno o más polipéptidos de unión a cMet de la invención. De hecho, existen gran cantidad de pruebas en la literatura de que la unión de péptidos de baja potencia o moléculas pequeñas puede aumentarse sustancialmente mediante la formación de dímeros y multímeros. Por tanto, las construcciones diméricas y multiméricas (tanto homogéneas como heterogéneas) están dentro del alcance de la presente invención. Las secuencias polipeptídicas de las construcciones diméricas pueden unirse en sus extremos N o C o en el nitrógeno N-épsilon de un resto de lisina situado de forma adecuada (u otra función que porte un grupo derivatizable de forma selectiva tal como un oxiamino u otro grupo nucleófilo lateral) o pueden unirse entre sí por medio de uno o más enlazadores (por ejemplo, los analizados en el presente documento) empleando la química de unión adecuada. Esta química de acoplamiento puede incluir amida, urea, tiourea, oxima o aminoacetilamida (de derivados de cloro o bromoacetamida, pero sin limitarse a ellos). Por ejemplo, los procedimientos para preparar construcciones diméricas o multiméricas de polipéptidos de unión a cMet de la invención incluyen al menos los analizados a continuación.
Procedimiento A
Los péptidos de unión a cMet totalmente protegidos pueden construirse sobre resina de captura de seguridad de tipo Ellman usando protocolos de síntesis peptídica Fmoc automáticos o manuales (Backes y otros, 1996. J. Am. Chem. Soc, 118:3055-56). Por separado, puede construirse un derivado de dilisina en resina de 2-clorotritilo usando procedimientos estándar conocidos en la técnica de la síntesis peptídica (Fields y otros, "Principles and Practice of Solid Phase Synthesis" en Synthetic Peptides, A Users Guide, Grant, Ed. (W.H. Freeman Co., Nueva York, 1992), cap. 3, pág. 77-183; Barlos y otros, "Convergent Peptide Synthesis" en Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Chan,
W.C. y White, P.D., Ed. (Oxford University Press, Nueva York, 2000), cap. 9, pág. 215-228). Su liberación de la resina de 2-clorotritilo sin la eliminación de los grupos protectores de la cadena lateral, la activación del grupo carboxilo y el acoplamiento a cualquier grupo marcador funcionalizado con amina proporciona un derivado de dilisina cuyos átomos de nitrógeno laterales protegidos pueden desenmascararse para dar dos grupos amino libres. La resina de captura de seguridad mencionada anteriormente se activa y el derivado de dilisina funcionalizado con un grupo marcador con el N desprotegido deseado se añade a la resina de captura de seguridad activada. Los grupos amino laterales se acilan por medio del extremo carboxilo del péptido unido a la resina de captura de seguridad, que se separa ahora de la resina y representa una parte integral de la estructura de dilisina. Puede emplearse un exceso del péptido unido a la resina de captura de seguridad para asegurar la reacción completa de los grupos amino de la construcción de dilisina. La optimización de la proporción de los compañeros de reacción en este esquema optimiza el rendimiento. Los grupos protectores de los péptidos de unión a cMet se eliminan empleando protocolos de escisión a base de ácido trifluoroacético.
La síntesis de construcciones diméricas y multiméricas en las que dos o más péptidos de unión a cMet están presentes en una construcción se logra fácilmente. Pueden emplearse esquemas de protección ortogonal (tales como un grupo aliloxicarbonilo en un nitrógeno y un grupo Fmoc en el otro, o emplear el grupo Fmoc conjuntamente con el grupo protector iV-Dde en el otro, por ejemplo) para distinguir los átomos de nitrógeno laterales de los derivados de dilisina descritos anteriormente. El desenmascaramiento de uno de los grupos amino, seguido por la reacción del producto resultante con un péptido de unión a cMet unido a una resina de captura de seguridad activada como se describe anteriormente proporciona una construcción de dilisina con un único péptido de unión a cMet unido. La eliminación del segundo grupo protector desenmascara el nitrógeno que queda (Mellor y otros, "Synthesis of Modified Peptides" en Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Chan, W.C. y White, P.D., Ed. (Oxford University Press, Nueva York, 2000), cap. 6, pág. 169-176). El producto resultante puede hacerse reaccionar con una segunda resina de captura de seguridad que porta otro péptido de unión a cMet para proporcionar una construcción homodimérica totalmente protegida, que después de la eliminación de los grupos protectores con ácido trifluoroacético proporciona el material deseado.
Procedimiento B
Se ensambla un péptido de unión a cMet en una resina de amida Rink mediante procedimientos de acoplamiento de péptidos automáticos o manuales, habitualmente empleando protocolos de síntesis peptídica Fmoc. El péptido puede poseer un extremo C o un extremo N funcionalizado con un enlazador o una construcción de enlazador-grupo marcador que puede poseer un grupo nucleófilo adicional tal como el grupo -amino de un resto de lisina, por ejemplo. La escisión de los grupos protectores se logra empleando ácido trifluoroacético con modificadores adecuados en función de la naturaleza del péptido. El péptido totalmente desprotegido se hace reaccionar entonces con un gran exceso de un electrófilo bifuncional tal como el éster de bis-N-hidroxisuccinimida del ácido glutárico comercialmente disponible (Tyger Scientific, Inc., Princeton, NJ). El éster de mono-N-hidroxisuccinimidilo del ácido glutárico monoamidado resultante se trata después con un equivalente adicional del mismo péptido o un equivalente de un péptido de unión a cMet diferente. La purificación del material resultante por HPLC proporciona la construcción homodimérica deseada que porta un grupo marcador adecuado.
Procedimiento C
Puede emplearse un esquema modular para preparar construcciones diméricas o multiméricas superiores que portan grupos marcadores adecuados como se definen anteriormente. En una ilustración sencilla, la resina de amida Rink de fmoc-lisina(iV-Dde) se trata con piperidina para eliminar el resto fmoc. Después, se acopla una función marcadora, tal como biotina, 5-carboxifluoresceína o N,N-dimetil-Gly-Ser(O-t-Bu)-Cys(Acm)-Gly-OH, al átomo de nitrógeno. A continuación, la resina se trata con hidrazina para eliminar el grupo iV-Dde. Después de lavarla exhaustivamente, la resina se trata con cloruro cianúrico y se une a la resina una base impedida tal como diisopropiletilamina en un disolvente adecuado tal como DMF, NMP o diclorometano para proporcionar una diclorotriazina monofuncionalizada unida a la resina. El desplazamiento sucesivo subsiguiente de los átomos de cloro restantes mediante dos equivalentes de un péptido de unión a cMet proporciona una construcción homodimérica funcionalizada con un grupo marcador unida a la resina (Falorni, M. y otros, 1998. Tetrahedron Lett., 39:7607-7610; Johnson, C. y otros, 1998. Tetrahedron, 54:4097-4106; Stankova, M. y Lebl, M., 1996. Mol. Divers., 2:75-80). Los péptidos de entrada pueden estar protegidos o desprotegidos, según requiera la situación. La escisión de grupos protectores se logra empleando reactivos de desprotección a base de ácido trifluoroacético como se describe anteriormente y los materiales deseados se purifican mediante cromatografía líquida de alto rendimiento.
Se entiende que en cada uno de estos procedimientos pueden emplearse los derivados de lisina en serie para aumentar la multiplicidad de los multímeros. El uso de moléculas más rígidas, relacionadas, que portan el número necesario de átomos de nitrógeno ortogonalmente protegidos o enmascarados para que actúen como armazones para variar la distancia entre los péptidos de unión a cMet, para aumentar la rigidez de la construcción (restringiendo el movimiento y las posiciones relativas de los péptidos de unión a cMet unos con respecto a otros y al marcador) está totalmente dentro del alcance de los procedimientos A-C y todos los demás procedimientos descritos en el presente documento.
Usos para polipéptidos y construcciones peptídicas multiméricas de unión a cMet
Los restos de unión a cMet de la invención también tienen utilidad en el tratamiento de una variedad de estados de enfermedad, incluidos aquellos asociados con la proliferación celular (por ejemplo, hiperproliferación, por ejemplo, cáncer). Los propios restos de unión a cMet de la invención (por ejemplo, polipéptidos y construcciones polipeptídicas multiméricas) pueden usarse como agentes terapéuticos o podrían usarse para localizar uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, un agente quimioterápico, un agente radioterápico, material genético, etc.) en células que expresan cMet, incluidos sitios de proliferación celular.
Para la purificación de cMet o complejo de HGF/cMet solubles en o a partir de una solución, pueden inmovilizarse polipéptidos o construcciones polipeptídicas multiméricas de unión de la invención sobre un sustrato sólido tal como un suporte cromatográfico u otro material de matriz, después puede cargarse el agente de unión inmovilizado o ponerse en contacto con la solución bajo condiciones adecuadas para la formación de un complejo de polipéptido de unión/cMet. Puede eliminarse la porción de no unión de la solución y detectarse el complejo, por ejemplo, usando un anticuerpo anti-HGF o anti-complejo de HGF/cMet, o un anticuerpo anti-polipéptido de unión, o el objetivo de cMet o complejo de HGF/cMet puede liberarse del resto de unión en condiciones de elución apropiadas.
La biología de la proliferación celular y las funciones del HGF y cMet en su inicio y mantenimiento se han investigado por muchos investigadores y sigue siendo un campo de investigación y desarrollo activo. Para el avance de tales investigación y desarrollo, es deseable un procedimiento de purificación de cantidades voluminosas de cMet o complejo de HGF/cMet en forma pura, y los polipéptidos de unión y construcciones polipeptídicas multiméricas de acuerdo con la presente invención son especialmente útiles para ese propósito, usando la metodología de purificación general descrita anteriormente.
Los expertos en la técnica conocen las pautas de dosificación adecuadas para los compuestos radioterápicos de la presente invención. Los compuestos pueden administrarse usando muchos procedimientos que incluyen, pero no se limitan a, una única o varias inyecciones IV o IP, usando una cantidad de radioactividad que sea suficiente como para provocar daño o ablación del tejido que expresa cMet al que se dirige, pero no tanta como para provocar un daño sustancial en tejido al que no se dirige (tejido normal). La cantidad y la dosis necesaria es diferente para las diferentes construcciones, dependiendo de la energía y el periodo de semidesintegración del isótopo usado, el grado de incorporación y eliminación del agente del organismo y la masa del tumor. En general, la dosis pueden variar de una dosis única de aproximadamente 30-50 mCi a una dosis acumulada de hasta aproximadamente 3 Ci.
Las composiciones radioterápicas de la invención puede incluir tampones fisiológicamente aceptables y pueden requerir estabilizantes de radiación para evitar daños radiolíticos en el compuesto antes de su inyección. Los estabilizadores de radiación son conocidos por los expertos en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, ácido paraaminobenzoico, ácido ascórbico, ácido gentísico y similares.
Se describe un kit de un único vial o varios viales que contiene todos los componentes necesarios para preparar los complejos de la presente invención, excluyendo el radionúclido.
Un kit de vial único contiene preferentemente un ligando quelante, una fuente de sal estannosa, u otro agente reductor farmacéuticamente aceptable, y está tamponado apropiadamente con un ácido o base farmacéuticamente aceptable para ajusta el pH a un valor de aproximadamente 3 a aproximadamente 9. La cantidad y el tipo de agente reductor usado dependen de la naturaleza del complejo de intercambio que se quiera formar. Las condiciones adecuadas son bien conocidas por los expertos en la técnica. Se prefiere que los contenidos del kit estén en forma liofilizada. Un kit de vial único de este tipo puede contener opcionalmente ligandos lábiles o de intercambio tales como glucoheptonato, gluconato, manitol, malato, ácido cítrico o tartárico y también puede contener modificadores
como ácido dietilentriamino pentaacético (DPTA), ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) o ciclodextrina o γ que sirven para mejorar la pureza y la estabilidad radioquímica del producto final. El kit puede contener también estabilizantes, agentes voluminizadores tales como manitol, que están diseñados para ayudar en el procedimiento de liofilización, y otros aditivos conocidos por los expertos en la técnica.
Un kit de varios viales contiene preferentemente los mismos componentes generales, pero emplea más de un vial para reconstituir el radiofármaco. Por ejemplo, un vial puede contener todos los ingredientes necesarios para formar un complejo de Tc(V) lábil tras la adición de pertecnetato (por ejemplo, la fuente estannosa u otro agente reductor). El pertecnetato se añade a este vial y, después de esperar un periodo de tiempo apropiado, el contenido de este vial se añade a un segundo vial que contiene el ligando, así como tampones apropiados para ajustar el pH a su valor óptimo. Después de un tiempo de reacción de aproximadamente 5 a 60 minutos, se forman los complejos de la presente invención. Es ventajoso que el contenido de ambos viales de este kit de varios viales esté liofilizado. Como anteriormente, modificadores de reacción, ligandos de intercambio, estabilizantes, agentes voluminizadores, etc., pueden estar presentes en cualquiera de los viales o en ambos.
Aplicaciones terapéuticas
Los polipéptidos y construcciones polipeptídicas multiméricas de unión a cMet de la presente invención pueden usarse para presentar, tratar o mejorar la actividad de agentes terapéuticos tales como agentes antiproliferativos o tumoricidas contra la proliferación celular no deseada (tal como ocurre en tumores neoplásicos, por ejemplo, en el cáncer, proporcionando o mejorando su afinidad por cMet y su tiempo de residencia en un complejo de HGF/cMet en células proliferantes, tales como, por ejemplo, células epiteliales) para enfermedades asociadas con cMet, incluidas, entre otras, enfermedades relacionadas con la actividad de cMet. En este aspecto de la invención, se proporcionan agentes híbridos por conjugación de un polipéptido o construcción polipeptídica multimérica de unión a cMet de acuerdo con la invención con un agente terapéutico. El agente terapéutico puede ser un agente radioterápico, analizado anteriormente, fármaco, agente quimioterápico o tumoricida, material genético o un vehículo de administración génica, etc. La porción de resto de polipéptido de unión a cMet del conjugado hace que el agente terapéutico "migre" a los sitios de cMet o complejo de HGF/cMet (es decir, células epiteliales activadas) y que mejore la afinidad del conjugado por el endotelio, de forma que la actividad terapéutica del conjugado está más localizada y concentrada en los sitios de proliferación celular. Además, estos restos de unión a cMet pueden inhibir los acontecimientos de señalización mediados por el HGF evitando que el HGF se una a cMet. Tales conjugados serán útiles en el tratamiento de trastornos hiperproliferativos, especialmente el crecimiento tumoral neoplásico y la metástasis, en mamíferos, incluidos seres humanos. El procedimiento comprende administrar a un mamífero que lo necesite una cantidad eficaz de un polipéptido o construcción polipeptídica multimérica de unión a cMet de acuerdo con la invención conjugado con un agente terapéutico. La divulgación también proporciona el uso de tales conjugados en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas con la angiogénesis en mamíferos, incluidos seres humanos.
Los agentes terapéuticos adecuados para su uso en este aspecto de la invención incluyen, pero no se limitan a: agentes antineoplásicos, tales como compuestos de platino (por ejemplo, espiroplatino, cisplatino, carboplatino), metotrexato, adriamicina, mitomicina, ansamitocina, bleomicina, citosina, arabinósido, arabinosil adenina, mercaptopolilisina, vincristina, busulfano, clorambucilo, melfalán (por ejemplo, PAM, L-PAM o mostaza de fenilalanina), mercaptopurina, mitotano, clorhidrato de procarbazina, dactinomicina (actinomicina D), clorhidrato de daunorrubcina, clorhidrato de doxorrubicina, taxol, mitomicina, plicamicina (mitramicina), aminoglutetimida, fosfato sódico de estramustina, flutamida, acetato de leuprolida, acetato de megestrol, citrato de tamoxifeno, testolactona, trilostano, amsacrina (m-AMSA), aparaginasa (L-aparaginasa), asparaginasa de Erwinia, etopósido (VP-16), interferón CX-2a, interferón CX-2b, tenipósido (VM-26), sulfato de vinblastina (VLB), sulfato de vincristina, sulfato de bleomicina, adriamicina y arabinosilo; agentes antiangiogénicos tales como inhibidores de tirosina cinasas con actividad hacia moléculas de señalización importantes en la angiogénesis y/o el crecimiento tumoral tales como SU5416 y SU6668 (Sugen/Pharmacia y Upjohn), endostatina (EntreMed), angiostatina (EntreMed), combrestatina (Oxigene), ciclosporina, 5-fluorouracilo, vinblastina, doxorrubicina, paclitaxel, daunorrubcin, inmunotoxinas; factores de coagulación; antivíricos tales como aciclovir, amantadina azidotimidina (AZT o zidovudina), ribavirina y monohidrato de vidarabina (arabinósido adenina, ara-A); antibióticos, antipalúdicos, antiprotozoicos tales como cloroquina, hidroxicloroquina, metroidazol, quinina y antimoniato de meglumina; antiinflamatorios tales como diflunisal, ibuprofeno, indometacina, meclofenamato, ácido mefenámico, naproxeno, oxyfenbutazona, fenilbutazona, piroxicam, sulindaco, tolmetina, aspirina y salicilatos.
En una realización descrita en el presente documento, el agente terapéutico puede estar asociado con una composición de agente de contraste de ultrasonidos en la que los restos de unión a cMet de la invención están unidos al material empleado para formar las vesículas descritas en el presente documento. Después de la administración del agente de contraste de ultrasonidos y la formación de imágenes opcional del agente de contraste unido al tejido que expresa cMet o complejo de HGF/cMet, puede irradiarse el tejido con un haz de energía (preferentemente ultrasónica, por ejemplo, con una frecuencia de 0,3 hasta 3 MHz), para romper o hacer explotar las microvesículas. De este modo, puede potenciarse el efecto terapéutico del agente terapéutico mediante la energía liberada por la ruptura de las microvesículas, en particular, provocando una administración eficaz del agente terapéutico al tejido objetivo. Por ejemplo, puede asociarse el agente terapéutico con el agente de contraste de ultrasonidos y administrarse como se describe en el documento US 6258378.
Los polipéptidos y construcciones polipeptídicas multiméricas de unión a cMet de la presente invención también pueden usarse para dirigir material genético a células que expresan cMet. Por tanto, pueden ser útiles en el tratamiento génico, en particular para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos. En esta realización, puede conjugarse material genético o uno o más vehículos de administración que contienen material genético útil para tratar un trastorno hiperproliferativo, con uno o más restos de unión a cMet de la invención y administrarse a un paciente. El material genético pueden incluir ácidos nucleicos, tales como ARN o ADN, tanto de origen natural como sintético, incluidos ARN y ADN recombinantes y ARN y ADN antisentido. Los tipos de material genético que pueden usarse incluyen, por ejemplo, genes portados en vectores de expresión tales como plásmidos, fagémidos, cósmidos, cromosomas artificiales de levaduras (YAC) y virus defectuosos o "cooperadores", ácidos nucleicos de antígeno, ARN y ADN tanto mono como bicatenario y sus análogos, tales como oligodesoxinucleótidos de fosforotioato y fosforoditioato. Adicionalmente, puede combinarse el material genético, por ejemplo, con lípidos, proteínas u otros polímeros. Los vehículos de administración para material genético pueden incluir, por ejemplo, una partícula vírica, un vector retrovírico u otro de tratamiento génico, un liposoma, un complejo de lípidos (especialmente lípidos catiónicos) y material genético, un complejo de derivados de dextrano y material genético, etc.
En una realización preferida las construcciones de la invención pueden utilizarse en tratamiento génico para tratar trastornos hiperproliferativos. En esta realización, puede conjugarse material genético o uno o más vehículos de administración que contienen material genético, por ejemplo, útil para tratar un trastorno hiperproliferativo, con uno o más polipéptidos o construcciones polipeptídicas multiméricas de unión a cMet de la invención y administrarse a un paciente.
Las construcciones que incluyen material genético y los restos de unión a cMet de la invención pueden usarse, en particular, para introducir selectivamente genes en células cancerosas proliferantes (por ejemplo, células epiteliales), lo que puede ser útil para tratar el cáncer.
Los agentes terapéuticos y los restos de unión a cMet de la invención pueden enlazarse o fusionarse de maneras conocidas, opcionalmente usando el mismo tipo de enlazadores analizados en otros puntos de esta solicitud. Los enlazadores preferidos serán cadenas de alquilo sustituidas o no sustituidas, cadenas de aminoácidos, cadenas de polientileglicoles y otros enlazadores poliméricos sencillos conocidos en la técnica. Más preferentemente, si el propio agente terapéutico es una proteína, para la cual se conoce la secuencia del ADN codificante, la proteína terapéutica y el polipéptido de unión a cMet pueden expresarse conjuntamente a partir del mismo gen artificial, creado usando técnicas de ADN recombinante, descritas anteriormente. La secuencia codificante para el polipéptido de unión a cMet puede fusionarse en un marco con la de la proteína terapéutica, de forma que el péptido se expresa en el extremo carboxilo o amino de la proteína terapéutica, o en un lugar entre los extremos, si se determina que dicha ubicación no destruiría la función biológica necesaria ni de la proteína terapéutica ni del polipéptido de unión a cMet. Una ventaja en particular de este enfoque general es que puede darse la concatenación de varios polipéptidos de unión a cMet colocados en tándem, aumentando de este modo el número y la concentración de sitios de unión a cMet asociados con cada proteína terapéutica. De esta manera aumenta la avidez de unión por cMet, lo que cabría esperar que mejorara la eficacia terapéutica de la proteína de fusión terapéutica recombinante.
Adicionalmente, las propias construcciones que incluyen polipéptidos de unión a cMet de la presente invención pueden usarse como agentes terapéuticos para tratar una serie de enfermedades asociadas con la actividad de cMet. Por ejemplo, cuando la unión de una proteína u otra molécula (por ejemplo, un factor de crecimiento, una hormona, etc.) es necesaria para o contribuye a un proceso de enfermedad y un resto de unión inhibe tal unión, las construcciones que incluyen tales restos de unión podrían ser útiles como agentes terapéuticos. De forma similar, cuando la unión de un resto de unión en sí inhibe un proceso de enfermedad, las construcciones que contienen dichos restos de unión también podrían ser útiles como agentes terapéuticos.
La unión del HGF a cMet da lugar a la activación de numerosas rutas de transducción de señales intracelulares que conducen a la hiperproliferación de diversas células. Como tal, en una realización, pueden usarse construcciones que incluyen polipéptidos de unión a cMet que inhiben la unión del HGF a cMet (o inhiben de otro modo la activación de cMet) como agentes antineoplásicos. Además, como la unión del HGF y la activación de cMet están implicadas en la actividad angiogénica, en otra realización, pueden usarse construcciones que incluyen polipéptidos de unión a cMet que inhiben la unión del HGF a cMet, o inhiben de otro modo la activación de cMet, como agentes antiangiogénicos. Determinadas construcciones de la invención que incluyen monómeros, multímeros y heteromultímeros que inhiben la activación de cMet también se analizan en los ejemplos, e incluyen, por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 (figura 10). Los polipéptidos de unión y sus construcciones de la presente invención son útiles como agentes terapéuticos para tratar afecciones que implican células endoteliales y/o células epiteliales que expresan cMet. Debido a que una función importante del endotelio es la angiogénesis, o la formación de vasos sanguíneos, los polipéptidos y sus construcciones son particularmente útiles para tratar afecciones que implican angiogénesis y/o hiperproliferación. Las afecciones que implican angiogénesis incluyen, por ejemplo, tumores sólidos, metástasis tumorales y tumores benignos. Los tumores provocados por la activación de cMet o a través de la angiogénesis son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, de mama, tiroides, glioblastoma, próstata, mesotelioma maligno, colorrectal, hepatocelular, hepatobiliar, renal, osteosarcoma y cervical. En la tabla 1 de la patente de EE.UU. n.º 6025331, concedida el 15 de febrero de 2000 a Moses, y otros, se enumeran tumores adicionales y trastornos relacionados. Los tumores benignos incluyen, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas y granulomas piógenos. Otras enfermedades relevantes que implican angiogénesis y/o hiperproliferación incluyen, por ejemplo, artritis reumatoide, psoriasis y enfermedades oculares, tales como retinopatía diabética, retinopatía de la prematuridad, degeneración macular, rechazo de trasplante de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, síndrome de Osler-Weber, angiogénesis miocárdica, neovascularización de la placa, telangiectasia, articulaciones hemofílicas, angiofibroma y granulación de heridas. Otras enfermedades o afecciones relevantes que implican crecimiento de vasos sanguíneos incluyen adhesiones intestinales, ateroesclerosis, esclerodermia y cicatrices hipertróficas y úlceras. Además, los polipéptidos de unión y sus construcciones de la presente invención pueden usarse para disminuir o evitar la neovascularización uterina necesaria para la implantación del embrión, por ejemplo, como un agente anticonceptivo.
Los polipéptidos de unión, construcciones polipeptídicas multiméricas y sus conjugados de construcciones pueden administrarse a un individuo a lo largo de un periodo de tiempo adecuado en función de la naturaleza de la afección y de los resultados deseados. Los polipéptidos de unión y sus construcciones pueden administrarse de forma profiláctica, por ejemplo, antes de que se diagnostique la afección o a un individuo con predisposición a una afección. Las construcciones polipeptídicas multiméricas de polipéptidos de unión y sus conjugados y construcciones pueden administrarse mientras que el individuo presenta síntomas de la afección o después de que los síntomas desaparezcan o se alivien de otro modo (tal como después de extirpar un tumor). Además, los polipéptidos de unión y sus construcciones de la presente invención pueden administrarse como parte de un régimen de mantenimiento, por ejemplo, para evitar o reducir la recurrencia o los síntomas o la afección. Como se describe a continuación, las construcciones polipeptídicas multiméricas de polipéptidos de unión y sus conjugados y construcciones de la presente invención pueden administrarse de forma sistémica o local.
La cantidad de material administrada dependerá de la gravedad de la afección. Por ejemplo, para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo, por ejemplo, en el caso de crecimiento tumoral neoplásico, la posición y el tamaño del tumor afectarán a la cantidad de material que se debe administrar. La dosis precisa que debe emplearse y el modo de administración deben, por fuerza, en vista de la naturaleza de la dolencia, decidirse de acuerdo con las circunstancias por el médico que supervisa el tratamiento. En general, las dosificaciones de los polipéptidos, construcciones polipeptídicas multiméricas y conjugados de la presente invención conjugados con el agente seguirán las dosificaciones que son habituales para el agente terapéutico solo, a pesar de que la afinidad mejorada de un polipéptido o construcción polipeptídica multimérica de unión de la invención por su objetivo puede permitir una disminución de la dosificación estándar.
Preferentemente, tales composiciones farmacéuticas de conjugado se formulan para su administración parenteral y, lo más preferentemente, para su administración intravenosa o intraarterial. En general, y en particular cuando la administración es intravenosa o intraarterial, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse como una inyección intravenosa rápida, como dos o más dosis separadas en el tiempo o como una infusión de flujo constante
o no lineal.
Tal como se usa en el presente documento el término "terapéutico" incluye al menos el alivio parcial de síntomas de una afección dada. Los polipéptidos de unión, construcciones multiméricas y sus conjugados de construcciones de la presente invención no tienen que producir un alivio total de los síntomas para ser útiles. Por ejemplo, el tratamiento de un individuo puede dar lugar a una disminución del tamaño de un tumor o área enferma, o a evitar el aumento del tamaño del tumor o área enferma. El tratamiento también puede evitar o reducir el número o el tamaño de las excrecencias metastásicas del/de los tumor(es) principal(es).
Los síntomas que pueden aliviarse incluyen características fisiológicas tales como la actividad de cMet. Las construcciones polipeptídicas multiméricas de polipéptidos de unión y sus conjugados y construcciones de la presente invención pueden inhibir la actividad de cMet y sus homólogos uniéndose a cMet e inhibiendo su actividad
o uniéndose a cMet e inhibiendo la activación de este receptor por el HGF. Tal inhibición puede detectarse, por ejemplo, midiendo el estado de fosforilación del receptor en presencia de o después del tratamiento con los polipéptidos de unión o sus construcciones. Con base en las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, un experto en la técnica sabría cómo y podría administrar una dosis adecuada de polipéptido de unión, construcciones polipeptídicas multiméricas y sus conjugados o construcciones proporcionadas en el presente documento y medir el efecto del tratamiento sobre el parámetro de interés. Por ejemplo, puede medirse el tamaño del área de interés (por ejemplo, el tumor o lesión) antes y después del tratamiento. Las células o el propio cMet pueden aislarse de la muestra y usarse en ensayos descritos en el presente documento.
La dosificación de las construcciones polipeptídicas multiméricas de polipéptidos y sus conjugados y construcciones pueden depender de la edad, sexo, salud y peso del individuo, así como de la naturaleza de la afección y el régimen de tratamiento general. Los efectos biológicos de las construcciones polipeptídicas multiméricas de polipéptidos y sus conjugados y construcciones se describen en el presente documento. Por lo tanto, basándose en los efectos biológicos de las construcciones polipeptídicas multiméricas de polipéptidos de unión y sus conjugados y construcciones proporcionados en el presente documento y en el resultado del tratamiento deseado, un experto en la técnica puede determinar la dosificación preferida mediante procedimientos de optimización rutinarios. Normalmente, el régimen diario se encuentra en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg.
Los restos de polipéptidos de unión y sus conjugados de construcciones proporcionados en el presente documento pueden administrarse como el único principio activo, opcionalmente junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, o pueden administrase junto con (por ejemplo, simultáneamente o secuencialmente) otros polipéptidos de unión y sus construcciones, otros agentes terapéuticos o sus combinaciones. Además, los restos de polipéptidos de unión y sus construcciones de conjugados pueden conjugarse con agentes terapéuticos, por ejemplo, para mejorar su especificidad, tiempo de residencia en el organismo o efecto terapéutico. Tales agentes terapéuticos adicionales incluyen, por ejemplo, otros compuestos antiproliferativos y compuestos tumoricidas. El agente terapéutico también pueden incluir anticuerpos. Además, las construcciones polipeptídicas multiméricas de polipéptidos de unión y sus construcciones de la presente invención pueden usarse como dispositivo de migración de células cancerosas. Por lo tanto, los polipéptidos de unión o sus construcciones pueden conjugarse con ácidos nucleicos que codifican, por ejemplo, un polipéptido terapéutico, con el fin de dirigir el ácido nucleico a células estromales. Una vez expuesto al resto de polipéptido de unión conjugado con ácido nucleico o a uno de sus conjugados, las células estromales pueden internalizar y expresar el ácido nucleico conjugado, administrando de este modo el péptido terapéutico a las células objetivo.
Los polipéptidos de unión, construcciones polipeptídicas multiméricas y sus conjugados y construcciones pueden administrarse de forma local o sistémica mediante cualquier vía adecuada. Las vías de administración adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aplicación tópica, transdérmica, parenteral, gastrointestinal, intravaginal y transalveolar. Las composiciones para la vía de administración deseada pueden prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en las técnicas farmacéuticas, por ejemplo, los descritos en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ª ed., Lippincott, Williams y Wilkins, 2000.
Para aplicación tópica, los polipéptidos de unión, construcciones polipeptídicas multiméricas y sus conjugados pueden suspenderse, por ejemplo, en una crema, gel o enjuague que permite que los polipéptidos o construcciones atraviesen la piel y entren en el torrente circulatorio, para su administración sistémica, o que entren en contacto con el área de interés, para su administración localizada. Las composiciones adecuadas para su administración tópica incluyen cualquier base farmacéuticamente aceptable en la que los polipéptidos o construcciones sean al menos mínimamente solubles.
Para administración transdérmica, los polipéptidos, construcciones polipeptídicas multiméricas y sus conjugados pueden aplicarse en una suspensión farmacéuticamente aceptable junto con un dispositivo transdérmico o "parche" adecuado. Se describen ejemplos de dispositivos transdérmicos adecuados para la administración de los polipéptidos o construcciones de la presente invención, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.º 6165458, concedida el 26 de diciembre de 2000 a Foldvari y otros y en la patente de EE.UU. n.º 6274166B1, concedida el 4 de agosto de 2001 a Sintov y otros
Para administración parenteral, los polipéptidos, construcciones polipeptídicas multiméricas y sus conjugados pueden inyectarse por vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Otros vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, agua estéril, solución salina y solución salina tamponada (incluidos tampones como fosfato o acetato), alcohol, aceites vegetales, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina, etc. En caso necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lidocaína para aliviar el dolor en el sitio de inyección, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales, lubricantes, etc., siempre que no reaccionen de manera perjudicial con los compuestos activos. De forma similar, la composición puede comprender excipientes convencionales, es decir, sustancias vehículo orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables adecuadas para aplicación parenteral, entérica o intranasal que no reaccionen de forma perjudicial con los compuestos activos. En general, los ingredientes se suministrarán bien por separado o bien mezclados juntos en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado sin agua en un recipiente cerrado herméticamente, tal como una ampolla o una bolsita que indique la cantidad de agente activo en unidades de actividad. Cuando la composición ha de administrarse por infusión, puede dispensarse con una botella de infusión que contenga solución salina o "agua para inyectables" estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición se ha de administrar por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua para inyectables o solución salina estéril, de manera que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.
Para administración gastrointestinal e intravaginal, los polipéptidos, construcciones polipeptídicas multiméricas y sus conjugados pueden incorporarse en polvos, píldoras o líquidos farmacéuticamente aceptables, y en supositorios para administración rectal o vaginal.
Para administración transalveolar, bucal o pulmonar, los polipéptidos, construcciones polipeptídicas multiméricas y sus conjugados pueden suspenderse en un excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para aerosolización e inhalación o como un colutorio. También se incluyen en el alcance de la invención dispositivos adecuados para administración transalveolar tales como atomizadores y vaporizadores. En la patente de EE.UU. n.º 6312665B1, concedida el 6 de noviembre de 2001 a Pankaj Modi, pueden encontrarse formulaciones adecuadas para administración por aerosol de polipéptidos, etc. usando vías bucales o pulmonares.
Además, los polipéptidos, construcciones polipeptídicas multiméricas y sus conjugados de la presente invención pueden administrarse por vía nasal u ocular, donde el polipéptido o construcción se suspende en un agente líquido farmacéuticamente aceptable adecuado para administración en gotas.
Los polipéptidos, construcciones polipeptídicas multiméricas y sus conjugados de la presente invención pueden administrarse de forma que el polipéptido, etc., se libera en el individuo durante un periodo de tiempo prolongado (liberación controlada o mantenida). Por ejemplo, el polipéptido, construcciones polipeptídicas multiméricas y sus conjugados pueden formularse en una composición tal que una única administración proporcione la administración del polipéptido, etc., durante al menos una semana o durante el período de un año o más. Los sistemas de liberación controlada incluyen microcápsulas monolíticas o de tipo reservorio, implantes de liberación lenta, bombas osmóticas, vesículas, micelas, liposomas, parches transdérmicos y dispositivos iontoforéticos. En una realización, los polipéptidos, construcciones polipéptidicas multiméricas y sus conjugados de la presente invención se encapsulan o se mezclan en un polímero no tóxico de degradación lenta. En la patente de EE.UU. n.º 4391797, concedida el 5 de julio de 1983 a Folkman y otros, se describen formulaciones adicionales adecuadas para la liberación controlada de los polipéptidos, construcciones polipeptídicas multiméricas y sus conjugados proporcionados en el presente documento.
Otro procedimiento adecuado para administrar los polipéptidos de la presente invención a un individuo es por medio de la producción in vivo del polipéptido. Puede administrarse un gen que codifica el polipéptido al individuo de forma que se exprese el polipéptido codificado. El gen puede expresarse de forma transitoria. El gen que codifica el polipéptido se transfecta en células que se han obtenido del paciente, un procedimiento denominado tratamiento génico ex vivo. Después, las células que expresan el polipéptido se devuelven al organismo del paciente. Los procedimientos de tratamiento génico ex vivo se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.º 4391797, concedida el 21 de marzo de 1998 a Anderson y otros
El aislamiento de polipéptidos de restos de unión a cMet y la preparación y el uso de restos de unión a cMet y sus conjugados de acuerdo con la presente invención se ilustrará con más detalle en los ejemplos siguientes. Se pretende que los parámetros específicos incluidos en los ejemplos siguientes ilustren la puesta en práctica de la invención y no se presentan para limitar en modo alguno el alcance de la invención.
Ejemplos
Los polipéptidos que no se reivindican están presentes con fines de referencia.
Ejemplo 1: Procedimiento para la identificación de polipéptidos de unión a cMet
Se utilizó una estrategia de selección de cuatro frentes usando una variedad de colecciones de fagos presentadores de péptidos para rastrear los polipéptidos de unión a cMet. Como herramientas para las selecciones se usaron tanto el dominio extracelular del receptor cMet (expresado como una proteína de fusión de Fc) como la línea celular de cáncer colorrectal, DLD-1, que expresa niveles altos de cMet en su superficie celular.
Brevemente, las selecciones implicaron el uso como objetivo bien de la proteína de fusión de cMet-Fc o bien de las células DLD-1. Se realizaron eluciones específicas con el HGF (en primer lugar durante 1 hora y después durante una noche para identificar los agentes de unión a cMet tanto de baja como de alta afinidad). Adicionalmente, aunque se usó el receptor de cMet soluble, se recogieron todos los fagos presentadores de péptidos que permanecían unidos al receptor para identificar péptidos que no se unieron al sitio de unión de ligando, pero que, no obstante, podrían desarrollarse potencialmente en agentes de formación de imágenes. La figura 9 ilustra la estrategia de selección que se empleó. Brevemente, se realizaron 21 combinaciones diferentes de campaña de selección/elución con el conjunto de cada colección. También se realizaron 10 campañas de selección adicionales, que supusieron los ciclos 3 y 4, usando la proteína de fusión de cMet-Fc. Las eluciones con el HGF fueron a una concentración de 100 ng/ml.
Ejemplo 2: "ELISA de fagos de proteína" para la determinación de la unión de fagos presentadores de péptidos a la proteína de fusión de cMet-Fc soluble
Se realizaron ELISA de fagos de proteína usando aislados de fagos presentadores de péptidos de las diversas campañas de selección para determinar la especificidad de los péptidos por cMet frente a una proteína de fusión de Fc no relacionada (TRAIL-Fc). Brevemente, se recubrieron placas de 384 pocillos durante una noche a 4 ºC con 0,5
g/ml de proteína de fusión de cMet-Fc o proteína de fusión TRAIL-Fc (antecedentes). Las placas se bloquearon durante 2 horas a 37 ºC con BSA en PBS al 3 % (p/v) que contenía Tween-20 al 0,05 % (v/v) (PBST). Las placas se lavaron con PBST y se añadieron 100 l de fago presentador de péptidos a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente y se lavaron con PBST. Los fagos presentadores de péptidos de unión a cMet se detectaron usando un anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP.
Los fagos presentadores de péptidos que demostraron una unión de > 3 veces a la proteína de fusión de cMet-Fc frente a la proteína de fusión Fc-TRAIL se denominan en el presente documento "impactos positivos". Los impactos positivos identificados en el rastreo anterior se sometieron a secuenciación del ADN. A partir del análisis de secuencia subsiguiente, se identificaron 187 secuencias peptídicas únicas.
Ejemplo 3: Determinación de unión a cMet en un modelo celular
Se realizaron ELISA de células completas para evaluar si los impactos positivos demostraban unión específica a cMet humano expresado en la superficie celular.
Los ELISA de células completas se realizaron usando células 3T3 que sobreexpresan cMet humano. Como línea celular de control se usaron células 3T3 que no expresan cMet ("células que no expresan"). Brevemente, se sembraron placas de 96 pocillos con 105 células por pocillo. Las placas se centrifugaron durante 5 minutos a 1600 rpm para sedimentar las células. La capa de células resultante se fijó con glutaraldehído al 0,1 % (v/v) durante 12 minutos a 37 ºC. Las células se lavaron con PBS y posteriormente se bloquearon con BSA en PBST al 3 % durante 1 hora a 37 ºC. También se bloquearon fagos presentadores de péptidos en la solución anterior durante 1 hora a 37 ºC. Después se añadieron 100 l de fagos bloqueados a cada pocillo y se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBST. Los fagos presentadores de péptidos de unión a cMet se detectaron usando un anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP.
Ejemplo 4: ELISA de proteínas de competencia por HGF
Se realizaron ELISA de proteínas de competencia con HGF en un intento de determinar si alguno de los péptidos de unión a cMet compite con el HGF por un sitio de unión similar en cMet. Este ELISA de competencia identifica péptidos que sirven como "péptidos antagonistas de HGF", péptidos que bloquean acontecimientos de señalización mediados por HGF (por ejemplo, proliferación). Estos ensayos se realizaron usando los fagos presentadores de péptidos descubiertos en la selección y las campañas de rastreo iniciales usando las colecciones de péptidos de primera generación. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos durante una noche a 4 ºC con 0,5 g/ml de proteína de fusión de cMet-Fc o proteína de fusión TRAIL-Fc (antecedentes). Las placas se bloquearon durante 2
lavaron con PBST y se detectaron los fagos presentadores de péptidos de unión a cMet usando un anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP.
Ejemplo 5: Síntesis peptídica y marcaje con fluoresceína
Se sintetizaron un número selecto de péptidos de unión a cMet correspondientes a aislados de fagos positivos en una matriz de fase sólida usando protocolos de 9-fluorenilmetoxicarbonilo. Estos péptidos se purificaron con
cromatografía de fase inversa. Las masas de los péptidos se confirmaron mediante espectrometría de masas por electropulverización y los péptidos se cuantificaron midiendo la absorbancia a 280 nm. Para la síntesis, se retuvieron dos aminoácidos N-terminales y dos C-terminales de la secuencia del vector de fago a partir del cual se escindió el péptido y se añadió un enlazador, por ejemplo, -Gly-Gly-Gly-Lys-NH2 en el extremo C de cada péptido. Se acetiló cada péptido en el extremo N. Se protegieron residuos de lisina seleccionados con 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex1-iliden)-3-metilbutil (ivDde) donde fue apropiado. El grupo protector permite el acoplamiento selectivo a la lisina Cterminal, no se elimina durante la escisión del péptido, pero puede eliminarse después del acoplamiento con hidrazina en DMF al 2 % o hidroxilamina 0,5 M, pH 8, en agua.
Cada péptido se marcó con fluoresceína en la lisina C-terminal usando fluoresceína (derivado de éster de Nhidroxisuccinimida) o isotiocianato de fluoresceína (FITC) en DMF con diisopropiletilamina (DIPEA) al 2 %. En el caso en que el péptido contenía una lisina protegida con ivDde, la reacción se desactivó mediante la adición de hidrazina al 2 %, que reacciona con toda la NHS-fluoresceína libre y elimina el grupo protector interno. Para todos los demás péptidos, la reacción se desactivó mediante la adición de un volumen equivalente de hidroxilamina 0,5 M, pH 8. Las reacciones desactivadas se diluyeron después con agua hasta menos del 10 % de DMF y después se purificaron usando cromatografía de fase inversa C18. Los péptidos se verificaron analizándolos para evaluar las masas esperadas usando un sistema de CL-EM (HPLC HP1100 con espectrómetro de masas cuadrupolar sencillo AP150 de SCIEX en línea) y se determinó la pureza de los péptidos.
Ejemplo 6: Medidas de anisotropía de fluorescencia
Se realizaron medidas de anisotropía de fluorescencia en microplacas de 384 pocillos en un volumen de 10 l de tampón de unión (PBS, Tween-20 al 0,01%, pH 7,5) usando un lector de placas de polarización de fluorescencia Polarion de Tecan (Caracas, Venezuela). La concentración de péptido marcado con fluoresceína se mantuvo constante (20 nM) y se varió la concentración de proteína de fusión de cMet-Fc (o un objetivo similar). Las mezclas de unión se equilibraron durante 10 minutos en la microplaca a 30 ºC antes de la medida. El cambio observado en la anisotropía se ajustó a la ecuación que figuraura a continuación mediante regresión no lineal para obtener la KD aparente. Esta ecuación (1) supone que los péptidos sintéticos y cMet forman un complejo reversible en solución con estequiometría 1:1.
donde robs es la anisotropía observada, rlibre es la anisotropía del péptido libre, runido es la anisotropía del péptido unido, KD es la constante de disociación aparente, cMet es la concentración total de cMet y P es la concentración total de péptido marcado con fluoresceína. La KD se calculó en un ensayo de unión directa (KD,U) y, por lo tanto, estos valores representan la unión de cMet al péptido marcado con fluoresceína.
Ejemplo 7: Ensayos de polarización de fluorescencia de competencia de péptidos
Se realizaron ensayos de polarización de fluorescencia de competencia de péptidos para determinar qué péptidos compiten entre sí por la unión a cMet. Esto identificaría complejos peptídicos heteroméricos potenciales que presentan una afinidad mayor por el receptor cMet que un péptido individual solo.
Brevemente, la competencia cruzada de péptidos de unión a cMet se realizó en un manipulador de líquidos cartesiano (Irvine, CA) en un volumen total de reacción de 3 l. Los péptidos marcados con fluoresceína se diluyeron hasta una concentración final de 20 nM y los péptidos competidores no marcados se diluyeron hasta una concentración final de 10 M. La proteína de fusión de cMet-Fc se diluyó hasta la KD para cada péptido marcado con fluoresceína en la reacción. Las mezclas de unión se equilibraron durante 10 minutos en la microplaca a 30 ºC antes de medir ningún cambio en la anisotropía. A partir de estos estudios, se identificaron como no competidores tres pares de péptidos de unión a cMet y representan candidatos ideales para complejos de péptidos de unión a cMet (véase la tabla 9).
Ejemplo 8: Procedimiento general para la preparación de complejos heteroméricos de péptidos de unión a cMet
Cada uno de los dímeros consiste en una secuencia que soporta el ligando 6-PnAO quelante de Tc (generalmente denominada A) y una porción espaciadora funcionalizada (espaciador = JJ, J = ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico) (denominada genéricamente B). El compuesto B se trató con un exceso de 10 veces de éster de bis NHS de ácido glutárico (Tyger Scientific, Princeton, NJ) y un exceso de ~20 veces de diisopropiletilamina a temperatura ambiente en DMF durante 30 minutos. La mezcla de reacción se diluyó con éter (15 veces en volumen) lo que dio lugar a la precipitación del éster de mono-NHS del péptido glutarilado. El éter se decantó y el sólido se lavó tres veces más con éter, lo que eliminó cualquier traza de éster de bis NHS de ácido glutárico sin reaccionar. El sólido resultante se resuspendió en DMF seco y se añadió el compuesto A (1 equiv.) seguido por diisopropiletilamina (20 equiv) y la mezcla se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente. Se diluyó la mezcla con agua (50 veces) y se cargó la mezcla directamente en una columna de HPLC de fase inversa, que se eluyó con un gradiente de acetonitrilo (TFA al 0,1 %) en agua (TFA al 0,1 %). Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y liofilizaron para proporcionar los materiales deseados.
Ejemplo específico: Preparación de complejos heterodiméricos de péptidos de unión a cMet
1) Preparación de un péptido de secuencia SEQ ID NO: 16 modificado con PnAOG-Glut (un compuesto de tipo A)
A una solución de 6-Glutaril-PnAO (40 mg, 0,1 mmol) en DMF seco (0,2 ml) se le añadieron N-hidroxisuccinimida (NHS, 14 mg, 0,12 mmol) y diisopropilcarbodiimida (DIC, 15 mg, 0,12 mmol) y se agitó durante 4 h a temperatura ambiente. Se añadió éter:hexano (5 ml, 1:1) a la mezcla de reacción. Se agitó la mezcla y se eliminó la solución sobrenadante por decantación, dejando atrás la pasta en el matraz. La pasta se lavó con éter:hexano (1:1) (3x5 ml) y se disolvió en DMF seco (0,2 ml). A esta solución se le añadieron la SEQ ID NO: 20 modificada con K-(ivDde) (50 mg, 0,017 mmol) y diisopropiletilamina (DIEA, 10 mg, 0,08 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante 18 horas. Se añadió hidrazina (10 l) y la solución se agitó durante 30 min. La mezcla de reacción se diluyó con agua (20 ml), se cargó en una columna de HPLC de fase inversa (C18) y se eluyó con un sistema de agua (TFA al 0,1 %)acetonitrilo (TFA al 0,1 %). Las fracciones que contenían el producto requerido (pureza > 95 %) se recogieron y se liofilizaron para proporcionar la SEQ ID NO: 20-(6-PnAO-Glut)) (véase el esquema 5 mostrado en la figura 11) como un sólido esponjoso incoloro. El rendimiento fue de 25,1 mg (47,4 %).
2) Preparación de un dímero que contiene la SEQ ID NO: 16 enlazada a la SEQ ID NO: 17
A una solución del péptido que contenía la SEQ ID NO: 17 (un compuesto de tipo B) (10 mg, 0,0034 mmol) y diisopropiletilamina (10 mg, 0,08 mmol) en DMF seco (0,2 ml) se le añadió glutarato de disuccinimidilo (10 mg, 0,031 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. La mezcla de reacción se diluyó con éter (3 ml) y se agitó. Se decantó el sobrenadante, dejando atrás el semisólido en el matraz. Este procedimiento de lavado del producto de reacción se repitió con éter (3x5 ml). El semisólido así obtenido se disolvió en DMF seco (0,2 ml) y se añadieron el péptido de SEQ ID NO: 16-(6-PnAO-Glut)) (10 mg, 0,0032 mmol) y diisopropiletilamina (10 mg, 0,08 mmol) y se agitó la mezcla de reacción durante 24 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con agua (10 ml), se cargó en una columna de HPLC de fase inversa (C18) y se eluyó con un sistema de agua (TFA al 0,1 %)acetonitrilo (TFA al 0,1 %). Las fracciones que contenían el producto requerido (pureza > 95 %) se recogieron y se liofilizaron para proporcionar el heterodímero con la SEQ ID NO: 16 enlazada a la SEQ ID NO: 17 por medio de un enlace 6-PnAO-Glut (véase el esquema 6 mostrado en la figura 12) como un sólido esponjoso incoloro. Rendimiento: 6,7 mg (33 %). Las estructuras para este y otros heterodímeros se muestran en las figura 13A-13C.
Ejemplo 9: Ensayo de proliferación celular
Se realizaron ensayos de proliferación celular para identificar péptidos de unión a cMet que antagonizan la proliferación estimulada por HGF. Estos estudios in vitro utilizaron una línea celular de leiomiosarcoma, SK-LMS-1, en la que las células proliferan en respuesta a HGF. Se sembraron células SK-LMS-1 en placas de 96 pocillos a una densidad de 2000 células/pocillo. Después de una incubación de 24 horas a 37 ºC, se privó a las células de nutrientes en medio de cultivo que contenía BSA al 0,1 % en lugar de suero bovino fetal al 10 % durante 36 horas a 37 ºC. Se añadieron medios de privación de nutrientes recién preparados con o sin un péptido de unión a cMet (10
M) a los pocillos correspondientes y las células se incubaron durante 2 horas a 37 ºC. Se usó DMF como el vehículo de control y no recibió un péptido de unión a cMet. Después se añadió HGF a una concentración de 50 ng/ml o 100 ng/ml y las células se incubaron durante otras 12 horas a 37 ºC. La proliferación se sometió a ensayo midiendo la incorporación de BrdU (Calbiochem, San Diego, CA) como se describe por el fabricante. Se muestran resultados para la SEQ ID NO: 2 (figura 10).
Ejemplo 10: Medida de la unión de dímeros peptídicos a cMet
Usando una máquina BIAcore, se determinaron las constantes de unión de los dímeros peptídicos (mostrado en las figura 13A-13C) unidos a cMet-Fc inmovilizado.
Se entrecruzaron tres densidades de cMet-Fc (R&D Systems) con la superficie de dextrano de un chip sensor CM5 mediante el procedimiento de acoplamiento de aminas estándar (solución 3 :M diluida 1:100, 1:50 o 1:20 con acetato 50 mM, pH 5,5). La célula de flujo I se activó y después se bloqueó para que sirviera como sustracción de referencia. Niveles de inmovilización finales alcanzados:
RL Fc 2 cMet-Fc = 2582
RL Fc 3 cMet-Fc = 5048
RL Fc 4 cMet-Fe = 9721 Se realizaron experimentos en tampón de PBST (fosfato 5,5 mM, pH 7,65, NaCl 0,15 M) + Tween-20 al 0,05 % (v/v)). Se disolvieron dímeros peptídicos en soluciones de H2O desionizada a 1 mg/ml. Los dímeros se diluyeron hasta 50 nM en PBS. Se realizaron diluciones seriadas para producir soluciones 25, 12,5, 6,25 y 3,125 nM. Todas las muestras se inyectaron por duplicado. Por asociación, los dímeros se inyectaron a 30 :l/minuto durante 3 minutos usando el programa kinject. Tras una disociación de 10 minutos, se separó todo el péptido restante de la superficie de cMet con dos quickinject de MgCl2 4 M durante 2 minutos a 50 :l/minuto. Se analizaron los sensogramas usando el programa informático BIAevaluation 3.1. El heterodímero, Ac-GSPEMCMMFP-FLYPCNHHAPGGGK{PnAO6-GlutK[Ac-GSFFPCWRIDRFGYCHANAPGGGKJJ-Glut]-NH2}-NH2 (la SEQ ID NO: 16 enlazada a la SEQ ID NO: 17), presenta una KD de 0,79 nM.
Ejemplo 11: Potenciación de la residencia en suero de péptidos de unión a cMet: conjugación con maleimida
En la técnica se sabe que los compuestos que contienen maleimida y otros grupos que pueden reaccionar con tioles reaccionan con tioles de proteínas séricas, especialmente albúmina sérica, cuando se inyectan los compuestos. Los aductos tienen tiempos de vida en suero similares al de la albúmina sérica, más de 14 días en seres humanos, por ejemplo.
Se dispone de procedimientos que permiten la síntesis directa de péptidos lineales marcados con maleimida que se engloban en la presente invención (Holmes, D y otros, 2000. Bioconjug. Chem., 11:439-444).
Los péptidos que incluyen disulfuros pueden derivatizarse con maleimida de una de varias maneras. Por ejemplo, puede añadirse una tercera cisteína en el extremo carboxilo. La cisteína añadida se protege con un grupo protector que es ortogonal al tipo de grupos usados para las cisteínas que van a formar el disulfuro. El disulfuro se forma desprotegiendo selectivamente las cisteínas indicadas y oxidando el péptido. Después, se desprotege la cisteína final y se hace reaccionar el péptido con un gran exceso molar de una bismaleimida. El compuesto resultante tiene una de las maleimidas libre para reaccionar con la albúmina sérica u otra proteína sérica que contenga tiol.
De forma alternativa, se sintetiza un péptido cíclico de la presente invención con una extensión C-terminal que contiene lisina, tal como -GGGK (SEQ ID NO: 15). Las lisinas del motivo de unión a cMet se protegen con ivDde y la lisina C-terminal se desprotege. Esta lisina se hace reaccionar con un compuesto que contiene maleimida, tal como éster de N-[e-maleimidocaproiloxi]succinimida (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) o éster de N-[amaleimidoacetoxi]succinimida (Pierce Biotechnology).
Ejemplo 12: Potenciación de la residencia en suero de péptidos de unión a cMet: conjugación con un resto que se une a albúmina sérica de forma no covalente
Los polipéptidos que tienen un peso molecular inferior a 50-60 kDa se excretan rápidamente. Muchas moléculas pequeñas, tales como ácidos grasos, se unen a la albúmina sérica. La unión de un ácido graso u otro resto de unión a albúmina sérica a un péptido hace que éste se una de forma no covalente a la albúmina sérica y puede prolongar enormemente la residencia en suero. Los ácidos grasos unidos a péptidos de la presente invención deberían contener al menos 12 carbonos, preferentemente al menos 14 carbonos y, más preferentemente al menos 16 carbonos. Los ácidos grasos podrían ser de cadena lineal o ramificada. Los ácidos grasos podrían ser saturados o insaturados. El palmato (CH3-(CH2)14-CO- es un ácido graso preferido. Esta unión en suero puede reducir la velocidad de excreción (Knudsen, L. y otros, 2000. J. Med. Chem., 43:1664-1669). Usando procedimientos conocidos en la técnica, pueden conjugarse restos de unión a albúmina sérica con uno cualquiera de los péptidos o construcciones polipeptídicas multiméricas de unión divulgadas en el presente documento. El resto de unión a albúmina sérica puede unirse al péptido de unión a cMet a través de un enlazador. El enlazador puede ser peptídico
o de otro tipo, tal como PEG. Se prefieren enlazadores de cero a aproximadamente treinta átomos. Se prefiere que el enlazador sea hidrófilo. El resto de unión a albúmina sérica puede conjugarse con el péptido o construcción de unión a cMet en cualquiera de sus extremos a través de un grupo lateral de un aminoácido unido. Los grupos laterales adecuados incluyen lisina y cisteína. Tales compuestos también pueden comprender, por ejemplo, quelantes para radionúclidos u otras marcas o construcciones terapéuticas detectables, como se analiza en el presente documento. Un péptido o construcción de cMet unido a un resto de unión a albúmina sérica se unirá a cMet.
Ejemplo 13: Potenciación de la residencia en suero de péptidos de unión a cMet: conjugación con PEG
La unión de PEG a proteínas y péptidos potencia la residencia en suero de estas moléculas. Se espera que la unión de PEG (lineal o ramificado) a un péptido o construcción polipeptídica multimérica de unión a cMet proporcione una potenciación sustancial del tiempo de residencia en suero. El peso molecular del PEG debe ser de al menos 10 kDa, más preferentemente de al menos 20 kDa y, lo más preferentemente, de 30 kDa o más. El PEG puede unirse en los extremos N o C. Los procedimientos de unión de PEG a péptidos son bien conocidos en la técnica. El PEG puede unirse a grupos laterales reactivos tales como lisina o cisteína.
Ejemplo 14: Potenciación de la residencia en suero de péptidos de unión a cMet: fusión a proteínas séricas
Proteínas que comprenden albúmina sérica (AS) y otras proteínas tienen tiempos de residencia potenciados. La secuencia de aminoácidos de la AS humana (ASh) se muestra en la tabla 10. La tabla 11 1 muestra una proteína de fusión que comprende la (SEQ ID NO: 21), ASh madura y la SEQ ID NO: 22. Los péptidos de unión a cMet están separados de la ASh mediante enlazadores que son ricos en glicina para permitir un espaciamiento flexible. No es necesario usar toda la ASh para obtener una proteína inyectable que tendrá un tiempo de residencia en suero potenciado. Grupos químicos, tales como la maleimida y los alfa bromo carboxilatos, reaccionan con la cisteína desapareada (residuo 34) para formar aductos estables. Por tanto, puede unirse un solo quelante a la proteína de fusión de ASh de forma que el aducto se unirá a un radionúclido. Se puede preparar un quelante con un grupo maleimida y acoplarlo a la ASh o a un derivado de ASh. De forma alternativa, puede hacer reaccionar la ASh o el derivado de ASh con una bismaleimida y podría hacerse reaccionar un quelante que porte un grupo tiol reactivo con la ASh derivatizada con bismaleimida.
La construcción de genes que codifican una secuencia de aminoácidos dada se conoce en la técnica. La expresión de fusiones de ASH en Saccharomyces cerevisiae se conoce en la técnica.
Ejemplo 15: Dirección preliminar al objetivo de radioactividad o toxinas a tumores que expresan cMet
El tratamiento radioinmunitario convencional para el cáncer presenta dos problemas. La proporción de dirección al objetivo (proporción de dosis administrada que se localiza en el tumor frente a dosis administrada en la sangre o proporción de dosis administrada que se localiza en el tumor frente a dosis que migra a la médula ósea) que se alcanza de forma general es baja. Asimismo, la dosis absoluta de radiación o agente terapéutico administrada al tumor es insuficiente en muchos casos para provocar una respuesta tumoral significativa. La mejora de la proporción de dirección al objetivo o dosis absoluta al tumor es de gran importancia para el tratamiento del cáncer.
La presente invención proporciona procedimientos de aumento de la localización de agente activo en un sitio de células objetivo de un mamífero receptor. Los procedimientos incluyen, por ejemplo, a) administrar a un receptor una proteína de fusión que comprende un resto de dirección al objetivo y un miembro de un par de unión ligandoantiligando; b) administrar posteriormente al receptor un agente de eliminación capaz de dirigir la eliminación de proteína de fusión circulante por medio de receptores de hepatocitos del receptor, en el que el agente de eliminación incorpora un miembro de un par de unión ligando-antiligando; y c) administrar subsiguientemente al receptor un agente activo que comprende un miembro de un par de unión ligando-antiligando.
En la técnica se sabe que las hexosas, en particular las hexosas galactosa, glucosa, manosa, manosa-6-fosfato, Nacetilglucosamina, fosfato de pentamanosilo, N-acetilgalactosamina, tioglicósidos de galactosa y sus mezclas, son eficaces para provocar la eliminación hepática. Sin embargo, la unión de azúcares a receptores hepáticos no es el único medio para dirigir una molécula al hígado.
La eliminación de antígeno carcinoembrionario (ACE) de la circulación se produce por unión a células de Kupffer del hígado. Se ha demostrado que la unión de ACE a células de Kupffer se produce a través de una secuencia peptídica YPELPK que representa los aminoácidos 107-112 de la secuencia de ACE. Esta secuencia peptídica se sitúa en la región entre el extremo N y el primer dominio de bucle de tipo inmunoglobulina. Usando ACE nativo y péptidos que contenían esta secuencia complejada con un agente de reticulación heterobifuncional y realizando un análisis de bandas de ligando con ACE biotinilado y NCA se ha demostrado la unión a una proteína de 80kD en la superficie de células de Kupffer. Esta proteína de unión puede ser importante en el desarrollo de metástasis hepáticas. (Thomas,
P. y otros, 1992. Biochem. Biophys. Res. Commun., 188:671-677).
Para usar YPELPK como un agente de eliminación, se fusiona esta secuencia mediante un enlazador con un resto que se une a la proteína de fusión (Ac). Por ejemplo, si el Ac tiene afinidad por DOTA/Re, se prepararía un derivado
con YPELPK unido a DOTA/Re; por ejemplo, rvYPELPKpsGGGDOTA. ’rvYPELPKps’ es un fragmento de ACE que
incluye la secuencia YPELPK identificada por Thomas y otros (supra). Puede usarse cualquier punto conveniente de DOTA para la unión. Después, se usaría RVYPELP-KPSGGG-DOTA/cold Re como agente de eliminación. Los Fab correspondientes al Ac de fusión tendrían afinidad por el agente de eliminación de Kd < 100 nM, preferentemente de Kd < 10 nM y, lo más preferentemente, de Kd < 1 nM.
El agente terapéutico contendría DOTA/185Re. En una realización preferida, el agente terapéutico contendría dos o más restos DOTA de forma que el Ac inmovilizado en el tumor se uniría al compuesto de bis-DOTA con avidez elevada. Los dos restos DOTA ser conectarían, preferentemente, con un enlazador hidrófilo de diez a treinta unidades de PEG. El PEG es un enlazador preferido debido a que no se degrada, favorece la solubilidad. De diez a treinta unidades de PEG no son suficientes para proporcionar al compuesto de bis DOTA un tiempo de residencia en suero muy prolongado. Una semivida de 30 minutos a 10 horas, es aceptable. La semivida en suero debería ser más larga que el periodo de semidesintegración radioactiva del radionúclido usado, de forma que la mayor parte de la radiación se administre al tumor o al entorno exterior.
En una realización, una "proteína de fusión" de la presente invención comprende al menos un péptido de unión a cMet fusionado al extremo amino o al extremo carboxilo de la cadena ligera (LC) o la cadena pesada (HC) de un anticuerpo humano. Opcionalmente y preferentemente, se fusionan dos o más péptidos de unión a cMet al anticuerpo. Se elige el anticuerpo que tenga una afinidad alta por una molécula pequeña que puede hacerse radioactiva o tener una toxina unida. Preferentemente, la afinidad del Fab correspondiente al Ac tiene afinidad por la molécula pequeña con una Kd menor de 100 nM, más preferentemente menor de 10 nM y, lo más preferentemente, menor de 1 nM. La molécula pequeña podría ser un quelante capaz de unirse a un átomo radioactivo útil, muchos de los cuales se enumeran en el presente documento. La molécula pequeña podría ser un péptido que tenga una o más tirosinas a las que puede unirse yodo radioactivo sin afectar en exceso a la propiedad de unión del péptido.
Puede fusionarse cualquier péptido de unión a cMet (CMBP) de la presente invención a cualquiera de los extremos de cualquiera de las cadenas de un anticuerpo que puede unirse a compuesto radioactivo pequeño. Las realizaciones útiles incluyen:
1) CMBP#1::enlace::LC / HC,
2) LC::enlace::CMBP#1 / HC,
3) LC / CMBP#1::enlace::HC,
4) LC / HC::enlace::CMBP# 1,
5) CMBP#1::enlace1::LC::enlace2::CMBP#2/ HC,
6) LC/CMBP#1::enlace1::HC::enlace2::CMBP#2,
7) CMBP#1 ::enlace1::LC / CMBP#2::enlace2::HC,
8) CMBP#1::enlace1::LC / HC::enlace2:: CMBP#2,
9) LC::enlace1::CMBP#1 / CMBP#2::enlace2::HC,
10) LC::enlace1::CMBP#1 / H.C::enlace2:: CMBP#2,
11) CMBP#1::enlace1::LC::enlace2::CMBP#2 / CMBP#3::enlace3::HC,
12) CMBP#1::enlace1::LC::enlace2::CMBP#2 / HC::enlace3::CMBP#3,
13) CMBP#3::enlace3::LC / CMBP#1::enlace1::HC::enlace2::CMBP#2,
14) LC::enlace3::CMBP#3/ CMBP#1 ::enlace1::HC::enlace2::CMBP#2 y
15) CMBP#1::enlace1::LC::enlace2::CMBP#2 / CMBP#3::enlace3::HC::enlace4::CMBP#4.
En los casos (5)-(15), los enlazadores (mostrados como "enlace1", "enlace2", "enlace3" y "enlace4") pueden ser iguales o diferentes o estar ausentes. Preferentemente, estos enlazadores, si están presentes, son hidrófilos, resistentes a proteasas, no tóxicos, no inmunogénicos y flexibles. Preferentemente, los enlazadores no contienen sitios de glucosilación o secuencias que se sabe que provocan eliminación hepática. Se prefiere una longitud de cero a quince aminoácidos. Los péptidos de unión a cMet (CMBP# 1, #2, #3 y #4) podrían ser iguales o diferentes. Si las secuencias de aminoácidos codificadas son iguales, se prefiere que el ADN que codifica estas secuencias sea diferente.
Dado que los anticuerpos son diméricos, cada proteína de fusión presentará dos copias de cada uno de los péptidos fusionados. En el caso (15), habrá ocho CMBP presentes y la unión a células que presentan cMet debería ser muy ávida. Es posible que la penetración del tumor se vea favorecida por una afinidad moderada por cMet en cada uno de los CMBP en lugar de una afinidad máxima.
La proteína de fusión se produce en células eucariotas para que las partes constantes de la HC se glucosilen. Preferentemente, las células son células de mamíferos, tales como células CHO.
Las proteínas de fusión se inyectan en un paciente y se deja un tiempo para que la proteína de fusión se acumule en el tumor. Se inyecta un agente de eliminación para que la proteína de fusión que no se ha inmovilizado en el tumor se elimine. En procedimientos anteriores de dirección preliminar al objetivo, se ha usado el sitio de combinación del anticuerpo para dirigirse al tumor y se ha usado biotina/avidina o biotina/estreptavidina para unir el agente radioactivo o tóxico al anticuerpo inmovilizado. La unión de biotina/avidina o estreptavidina es esencialmente irreversible. En este caso, se fusiona un péptido de unión al objetivo al anticuerpo, que se escoge para que se una a
un agente radioactivo o tóxico. Debido a que la proteína de fusión contiene 2, 4, 6 o 8 CMBP, la unión de la proteína de fusión al tumor es muy ávida. Puede administrarse un agente de eliminación que haga que no se inmovilice la proteína de fusión en el tumor que se quiere eliminar, entre 2 y 48 horas tras la inyección de la proteína de fusión. Debido a que el agente de eliminación es monomérico con respecto al resto que se une al anticuerpo, los complejos de agente de eliminación y proteína de fusión inmovilizada no tendrán tiempos de vida muy largos. En un plazo de 4 a 48 horas tras la inyección del agente de eliminación, el anticuerpo inmovilizado habrá perdido todo el agente de eliminación que se una allí. Preferentemente, el agente activo es dimérico con respecto al resto que se une a la proteína de fusión. El agente activo se inyecta entre 2 y 48 horas tras la inyección del agente de eliminación.
Ejemplo 16: Unión de péptidos de unión a cMet/complejo de avidina HRP a células MDA-MB-231
Se determinaron los requisitos de longitud del espaciador para la unión de un derivado biotinilado de un péptido de unión a cMet, SEQ ID NO: 16, a células MDA-MB-231 que expresan cMet. Con el fin de decidir la longitud del espaciador que se debe situar entre el péptido y la biotina, se sintetizaron derivados sin espaciador, con un único espaciador, J, y con dos espaciadores, JJ. Estos tres derivados diferentes del péptido de unión a cMet de SEQ ID NO: 16 y un péptido de control que no se une a cMet, se probaron como complejos tetraméricos con neutravidina HRP para evaluar su capacidad para unirse a células MB-231 que expresan cMet. Los tres complejos tetraméricos de péptidos de unión a cMet se unieron a las células MB231 en comparación con el péptido de control; sin embargo, el péptido con el espaciador JJ presentó la mejor KD (12,62 nM). Esto indica que la inclusión de dos espaciadores (JJ) entre el péptido de unión a cMet y la biotina es mejor que un espaciador o ninguno.
Cultivo Celular: se obtuvieron células MDA-MB231 de la ATCC y se hicieron crecer como un cultivo monocapa en su medio recomendado más 1 ml/l de pen/step (InVitrogen, Carlsbad, CA). Las células se dividieron el día antes del ensayo, se añadieron 35000 células a cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
Unión de péptido/neutravidina HRP a células MDA-MB-23 1
Se prepararon como se describe anteriormente complejos de péptido de control, y los derivados de SEQ ID NO: 16 descritos anteriormente, con neutravidina-HRP, y se probaron para evaluar su capacidad de unirse a células MDAMB-231. Durante la preparación del complejo de péptido/neutravidina-HRP, se usó un exceso de 7,5 veces de péptidos biotinilados con respecto a neutravidina-HRP para garantizar que se ocupaban los cuatro sitios de unión de biotina de la neutravidina. Después de la formación del complejo, se eliminó el exceso de péptidos biotinilados libres usando sefarosa-avidina de liberación suave para evitar cualquier competición entre los péptidos biotinilados libres y los péptidos biotinilados complejados con neutravidina-HRP. El experimento se realizó a varias concentraciones diferentes de péptido/neutravidina-HRP, desde 0,28 nM hasta 33,33 nM, para generar curvas de saturación de unión para derivados sin un espaciador J y con un único espaciador J (figura 14), y de 0,28 nM a 16,65 nM para generar una curva de saturación de unión para el derivado con el espaciador JJ (figura 14). Con el fin de deducir la curva de saturación de unión, se restó la unión de fondo del control de péptido/complejo de neutravidina HRP de la unión de los derivados de SEQ ID NO: 16 complejados con neutravidina-HRP para cada concentración probada. Por lo tanto, la absorbancia en el eje Y de la figura 14 es la absorbancia diferencial (péptido de unión a cMet menos péptido de control) y no la absorbancia absoluta. El análisis de los datos de saturación de unión de la figura usando el programa informático Graphic Pad Prism (versión 3.0) proporcionó una KD de 12,62 nM (+/-3,16) para el derivado tetramérico con el espaciador JJ, de 155,4 nM (+/- 86,56) para el derivado tetramérico con el espaciador J y de 123,8 nM (+/37,71) para el derivado tetramérico sin un espaciador complejos peptídicos. Tal como se esperaba, estas constantes de unión son más baja que las medidas por PF para el péptido de SEQ ID NO: 16 monodentado relacionado (880 nM).
Resultados: resulta evidente a partir de la figura 14 que el derivado con el espaciador JJ mostró una unión a cMet sobre células MDA-MB-231 mucho mejor que cualquiera de los otros dos derivados, con una KD de 12,62 nM después de restar la unión del péptido de control como unión de fondo (n = 1). Esto indica que puede ser necesaria una determinada longitud mínima de espaciador para alcanzar varios sitios de unión diferentes en células lograr así la unión multimérica. Esta longitud mínima de espaciador podría depender del espaciado entre diferentes moléculas objetivo en células. Como en el caso donde el objetivo de unión era el KDR, el ensayo de neutravidina-HRP con péptidos biotinilados identificados con presentación en fagos fue útil para identificar péptidos que pueden unirse a un objetivo inmovilizado incluso cuando la afinidad de la secuencia de unión monomérica es demasiado baja para que funcione bien un ensayo de tipo ELISA (con etapas de lavado después de la unión).
Tabla 6. Secuencias de péptidos de unión a cMet
CLASE IX
TN9 n.º 3:
SEQ ID NO: Aislado Secuencia
SEQ ID NO:6 602-G12, SETRPTEAGSCHCSGPPTFECWCYGTEPTE SEQ ID NO:7 604-G01, SETRPTEAGSCYCSGPPRFECWCYETEPTE SEQ ID NO:8 610-G02, SETRPTEAGSCYCGGPPSFECWCYGTEPTE SEQ ID NO:9 627-G06, SETRPTESGSCHCSGPPTFECWCYGTEPTE SEQ ID NO:10 630-C03, SETRPTEGGSCYCGGPPTFECWCYGTEPTE SEQ ID NO:11 633-G08, SETRPTEEGSCHCSGPPAFECWCYGTEPTE SEQ ID NO:12 631-D03, SETRPTEDGSCHCSGPPRFECWCYGTEPTE SEQ ID NO:13 633-G12, SETRPTEAGSCHCSGPPTFECWCYSTEPTE
Motivo 13-1 G-X1-C-X2-C-X3-G-P-P-X4-F-X5-C-X6-C-X7-X8-X9-X10-P, donde X1 es cualquier aminoácido distinto de C, preferentemente S,
X2 es cualquier aminoácido distinto de C, preferentemente H, Y o N, X3 es cualquier aminoácido distinto de C, preferentemente S o G,
10 X4 es cualquier aminoácido distinto de C, preferentemente T, X5 es cualquier aminoácido distinto de C, preferentemente E, X6 es cualquier aminoácido distinto de C, preferentemente W,
X7 es cualquier aminoácido distinto de C, preferentemente Y, X8 es cualquier aminoácido distinto de C, preferentemente G, D, A, E o S,
20 X9 es cualquier aminoácido distinto de C, preferentemente T o S, y X10 es cualquier aminoácido distinto de C, preferentemente E o D. Tabla 9: complejos heteroméricos de péptidos de unión a cMet
PAR I SEQ ID NO: Aislado CLASE SEQ ID NO:14 130-E10 XI SEQ ID NO:4 551-H10 V
PAR II SEQ ID NO: Aislado CLASE SEQ ID NO:3 548-F07 V SEQ ID NO:4 551-H10 V
PAR III SEQ ID NO: Aislado CLASE SEQ ID NO:4 551-H10 V SEQ ID NO:5 545-H12 VIII
Tabla 10: Secuencia de aminoácidos de la SAH madura de la entrada de GenBank AAN17825
DAHKSEVAHR
FKDLGEENFK ALVLIAFAQY LQQCPFEDHV KLVNEVTEFA
KTCVADESAE
NCDKSLHTLF GDKLCTVATL RETYGEMADC CAKQEPERNE
CFLQHKDDNP
NLPRLVRPEV DVMCTAFHDN EETFLKKYLY EIARRHPYFY
APELLFFAKR
YKAAFTECCQ AADKAACLLP KLDELRDEGK ASSAKQRLKC
ASLQKFGERA
FKAWAVARLS QRFPKAEFAE VSKLVTDLTK VHTECCHGDL
LECADDRADL AKYICENQDS ISSKLKECCE KPLLEKSHCI AEVENDEMPA DLPSLAADFV ESKDVCKNYA EAKDVFLGMF LYEYARRHPD YSWLLLRLA KTYKTTLEKC CAAADPHECY AKVFDEFKPL VEEPQNLIKQ NCELFEQLGE YKFQNALLVR YTKKVPQVST PTLVEVSRNL GKVGSKCCKH PEAKRMPCAE DYLSVVLNQL CVLHEKTPVS DRVTKCCTES LVNRRPCFSA LEVDETYVPK EFNAETFTFH ADICTLSEKE RQIKKQTALV ELVKHKPKAT KEQLKAVMDD FAAFVEKCCK ADDKETCFAE EGKKLVAASR AALGL
Tabla 11: Secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21::ASH::SEQ ID NO:22
GSFFPCWRIDRFGYCHANAP GSGGSGG (SEC ID n.º: 23) DAHKSEVAHR FKDLGEENFK ALVLIAFAQY LQQCPFEDHV KLVNEVTEFA KTCVADESAE NCDKSLHTLF GDKLCTVATL RETYGEMADC CAKQEPERNE CFLQHKDDNP NLPRLVRPEV DVMCTAFHDN EETFLKKYLY EIARRHPYFY APELLFFAKR YKAAFTECCQ AADKAACLLP KLDELRDEGK ASSAKQRLKC ASLQKFGERA FKAWAVARLS QRFPKAEFAE VSKLVTDLTK VHTECCHGDL LECADDRADL AKYICENQDS ISSKLKECCE KPLLEKSHCI AEVENDEMPA DLPSLAADFV ESKDVCKNYA EAKDVFLGMF LYEYARRHPD YSWLLLRLA KTYKTTLEKC CAAADPHECY AKVFDEFKPL VEEPQNLIKQ NCELFEQLGE YKFQNALLVR YTKKVPQVST PTLVEVSRNL GKVGSKCCKH PEAKRMPCAE DYLSVVLNQL CVLHEKTPVS DRVTKCCTES LVNRRPCFSA LEVDETYVPK EFNAETFTFH ADICTLSEKE RQIKKQTALV ELVKHKPKAT KEQLKAVMDD FAAFVEKCCK ADDKETCFAE EGKKLVAASR AALGL GSGGEGGSG GSWIICWWDNCGSSAP
5 LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Dyax Corp. BRACCO International B.v.
<120> PÉPTIDOS QUE SE UNEN ESPECÍFICAMENTE AL RECEPTOR DEL HGF (CMET) Y SUS USOS
<130> FB15798/A
<140> Documento EP08008144.1 15 <141> 2004-03-03
<150> Documento US 60/451588
<151> 2003-03-03
20 <160> 26
<170> FastSEQ para Windows versión 4.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Motivo ejemplar
<220>
<221> VARIANTE
<222> 2
<223> Xaa = cualquier aminoácido distinto de Cys, preferentemente Ser
<220>
<221> VARIANTE
<222> 4
<223> Xaa = cualquier aminoácido distinto de Cys, preferentemente His, Tyr o Asn
<220>
<221> VARIANTE
<222> 6
<223> Xaa = cualquier aminoácido distinto de Cys, preferentemente Ser o Gly
<220>
<221> VARIANTE
<222> 10
<223> Xaa = cualquier aminoácido distinto de Cys, preferentemente Thr
<220>
<221> VARIANTE
<222> 12
<223> Xaa = cualquier aminoácido distinto de Cys, preferentemente Glu
<220>
<221> VARIANTE
<222> 14
<223> Xaa = cualquier aminoácido distinto de Cys, preferentemente Trp
<220> <221> VARIANTE
<222> 16 5 <223> Xaa = cualquier aminoácido distinto de Cys, preferentemente Tyr
<220>
<221> VARIANTE
<222> 17
<223> Xaa = cualquier aminoácido distinto de Cys, preferentemente Gly, Asp, Ala, Glu o Ser 15 <220>
<221> VARIANTE
<222> 18
<223> Xaa = cualquier aminoácido distinto de Cys, preferentemente Thr o Ser
<220> 25 <221> VARIANTE
<222> 19
<223> Xaa = cualquier aminoácido distinto de Cys, preferentemente Glu o Asp
<400> 1
35 <210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 45 <223> Secuencia de péptido de unión a cMet generado sintéticamente
<400> 2
<210> 3
<211> 20 55 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de péptido de unión a cMet generado sintéticamente
<400> 3
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de péptido de unión a cMet generado sintéticamente
<400> 4
<210> 5
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de péptido de unión a cMet generado sintéticamente
<400> 5
<210> 6
<211> 30
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de péptido de unión a cMet generado sintéticamente
<400> 6
<210> 7 5 <211> 30
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de péptido de unión a cMet generado sintéticamente 15 <400> 7
<210> 8
<211> 30
<212> PRT 25 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de péptido de unión a cMet generado sintéticamente
<400> 8
35 <210> 9
<211> 30
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
45 <223> Secuencia de péptido de unión a cMet generado sintéticamente
<400> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de péptido de unión a cMet generado sintéticamente 15 <400> 10
<210> 11
<211> 30
<212> PRT 25 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de péptido de unión a cMet generado sintéticamente
<400> 11
35 <210> 12
<211> 30
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 45 <223> Secuencia de péptido de unión a cMet generado sintéticamente
<400> 12 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de péptido de unión a cMet generado sintéticamente 15 <400> 13
<210> 14
<211> 22
<212> PRT 25 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de péptido de unión a cMet generado sintéticamente
<400> 14
35 <210> 15
<211> 4
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 45 <223> Enlazador
<400> 15
<210> 16
<211> 24
<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido generado sintéticamente
<400> 16
15 <210> 17
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 25 <223> Péptido generado sintéticamente
<400> 17
30
<210> 18
<211> 26
35
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
40
<220> <223> Péptido generado sintéticamente
<400> 18
<210> 19
<211> 26
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido generado sintéticamente
<400> 19
<210> 20 15 <211> 142
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> construcción sintética 25 <220>
<221> CDS
<222> (18)...(123)
<220>
<221> característica_misc 35 <222> 45,47, 48, 51, 52, 55, 58, 59, 67, 80, 84, 85, 91, 92, 94 95
<223> n = j = 0,12a + 0,12c + 0,64g + 0,12t
<220>
<221> característica_misc
<222> 46, 54, 61, 66, 78, 85, 97 45 <223> n = e = 0,64a + 0,12c + 0,12g + 0,12t
<220>
<221> característica_misc
<222> 50, 53, 56, 57, 62, 68, 90, 93, 96, 98
<223> n = z = 0,12a + 0,12c + 0,12g + 0,64t 55 <220>
<221> característica_misc
<222> 49, 60, 69, 70, 79
<223> n = q = 0,12a + 0,64c + 0,12g + 0,12t
<400> 20
5 <210> 21
<211> 27
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Péptido generado sintéticamente
<400> 21
<210> 22
<211> 25 25 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido generado sintéticamente
<400> 22
<210> 23
<211> 637
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 45 <220>
<223> Péptido generado sintéticamente
<400> 23
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido generado sintéticamente 15 <400> 24

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un polipéptido o polipéptido multimérico que comprende una secuencia de aminoácidos: Gly-X1-Cys-X2-Cys-X3- Gly-Pro-Pro-X4-Phe-XS-Cys-X6-Cys-X7-X8-X9-X10-Pro (SEQ ID NO: 1), en la que X1 es Ser, X2 es His, Tyr o Asn, X3 es Ser o Gly, X4 es cualquier aminoácido distinto de Cys, X5 es Glu, X6 es Trp, X7 es Tyr, X8 es Gly, Asp, Ala, Glu o Ser,
    X9 es Thr o Ser, y X10 es Glu o Asp.
  2. 2.
    El polipéptido o polipéptido multimérico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13.
  3. 3.
    El polipéptido o polipéptido multimérico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7.
  4. 4.
    El polipéptido o polipéptido multimérico de acuerdo con la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7.
  5. 5.
    Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una afección que implica la activación de cMet, que comprende un polipéptido o polipéptido multimérico de acuerdo con la reivindicación 1.
  6. 6.
    La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la afección es un tumor sólido.
  7. 7.
    La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en la que se selecciona el tumor del grupo que consiste en: tumores de mama, tiroides, glioblastoma, próstata, mesotelioma maligno, colorrectal, hepatocelular, hepatobiliar, renal, osteosarcoma y cervical.
  8. 8.
    Un procedimiento de purificación de cMet o un complejo de cMet y HGF a partir de una solución que lo contenga, que comprende:
    poner en contacto la solución con al menos un polipéptido o polipéptido multimérico de acuerdo con la reivindicación 1, y
    separar el polipéptido o polipéptido multimérico de la solución.
ES08008144T 2003-03-03 2004-03-03 Péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (CMET) y usos de los mismos Expired - Lifetime ES2396368T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US45158803P 2003-03-03 2003-03-03
US451588P 2003-03-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2396368T3 true ES2396368T3 (es) 2013-02-21

Family

ID=32962606

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10185426.3T Expired - Lifetime ES2557286T3 (es) 2003-03-03 2004-03-03 Usos de péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (cMet)
ES08008144T Expired - Lifetime ES2396368T3 (es) 2003-03-03 2004-03-03 Péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (CMET) y usos de los mismos
ES15157779.8T Expired - Lifetime ES2692166T3 (es) 2003-03-03 2004-03-03 Péptidos que se unen específicamente al receptor de HGF (cMet) y usos de los mismos

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10185426.3T Expired - Lifetime ES2557286T3 (es) 2003-03-03 2004-03-03 Usos de péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (cMet)

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15157779.8T Expired - Lifetime ES2692166T3 (es) 2003-03-03 2004-03-03 Péptidos que se unen específicamente al receptor de HGF (cMet) y usos de los mismos

Country Status (13)

Country Link
US (6) US20050214859A1 (es)
EP (4) EP1603935A4 (es)
JP (4) JP5466350B2 (es)
AU (2) AU2004217894B2 (es)
CA (1) CA2517939C (es)
CY (1) CY1120683T1 (es)
DK (2) DK2284180T3 (es)
ES (3) ES2557286T3 (es)
HU (1) HUE039154T2 (es)
PL (2) PL1944312T3 (es)
PT (1) PT2949658T (es)
SI (1) SI2949658T1 (es)
WO (1) WO2004078778A2 (es)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1587944A4 (en) 2002-03-01 2007-03-21 Dyax Corp KDR AND VEGF / KDR BINDING PEPTIDES AND THEIR USE FOR DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC PURPOSES
US7261876B2 (en) 2002-03-01 2007-08-28 Bracco International Bv Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications
US8623822B2 (en) 2002-03-01 2014-01-07 Bracco Suisse Sa KDR and VEGF/KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy
US7794693B2 (en) 2002-03-01 2010-09-14 Bracco International B.V. Targeting vector-phospholipid conjugates
US7211240B2 (en) 2002-03-01 2007-05-01 Bracco International B.V. Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications
DK2284180T3 (en) * 2003-03-03 2015-12-21 Dyax Corp Uses of peptides that specifically bind to the HGF receptor (cMET)
NO20034350D0 (no) * 2003-09-29 2003-09-29 Amersham Health As Optisk avbilding av kolorektal kreft
US20060008844A1 (en) * 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
WO2006043892A1 (en) 2004-10-20 2006-04-27 Peas Institut Ab Assessment of biological activity of hepatocyte growth factor (hgf)
US8236761B2 (en) 2006-07-07 2012-08-07 Washington State University Research Foundation C-Met receptor regulation by angiotensin IV (AT4) receptor ligands
WO2008005531A2 (en) * 2006-07-07 2008-01-10 Washington State University Research Foundation C-met receptor regulation by angiotensin iv (at4) receptor ligands
WO2008094275A1 (en) * 2007-01-30 2008-08-07 New York University Peptides for treatment of conditions associated with nitric oxide
ES2385066T3 (es) * 2007-05-16 2012-07-17 Ge Healthcare As Péptidos de unión a HGF marcados para la formación de imágenes
GB0718957D0 (en) * 2007-09-28 2007-11-07 Ge Healthcare Ltd Optical imaging agents
GB0718967D0 (en) 2007-09-28 2007-11-07 Ge Healthcare Ltd Peptide imaging agents
US20100196272A1 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Neoprobe Corporation Compositions for radiolabeling diethylenetriaminepentaacetic acid (dtpa)-dextran
GB0918321D0 (en) 2009-10-20 2009-12-02 Ge Healthcare As Cyclic peptide synthesis
EP2496948B1 (en) 2009-11-05 2018-01-10 University of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for detecting plectin-1 as a biomarker for cancer
GB201013808D0 (en) 2010-08-18 2010-09-29 Ge Healthcare Ltd Peptide radiotracer compositions
GB201103696D0 (en) * 2011-03-04 2011-04-20 Ge Healthcare Ltd Technetium labelled peptides
GB201116733D0 (en) 2011-09-28 2011-11-09 Ge Healthcare As Peptide margin imaging agents
GB201116862D0 (en) 2011-09-30 2011-11-09 Ge Healthcare As Infusion imaging method
GB201121914D0 (en) 2011-12-20 2012-02-01 Ge Healthcare Ltd Method for patient selection
WO2014074907A1 (en) * 2012-11-09 2014-05-15 Indi Molecular, Inc. C-met-specific capture agents, compositions, and methods of using and making
WO2014172392A1 (en) 2013-04-18 2014-10-23 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
ES2688206T3 (es) 2013-06-17 2018-10-31 Armo Biosciences, Inc. Procedimiento de evaluación de la identidad y la estabilidad de proteínas
US9393177B2 (en) 2013-08-20 2016-07-19 Anutra Medical, Inc. Cassette assembly for syringe fill system
GB201314936D0 (en) 2013-08-21 2013-10-02 Ge Healthcare Ltd Radiolabelling method
US10010588B2 (en) 2013-08-30 2018-07-03 Armo Biosciences, Inc. Methods of using pegylated interleukin-10 for treating hyperlipidemia
CA2927592C (en) 2013-10-28 2020-08-18 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Fgf-19 variants for treating a fgf-19 dependent cancer or tumor
RU2016122957A (ru) 2013-11-11 2017-12-19 Армо Байосайенсиз, Инк. Способы применения интерлейкина-10 для лечения заболеваний и расстройств
GB201322456D0 (en) 2013-12-18 2014-02-05 Ge Healthcare Ltd Radiotracer compositions and methods
US10293043B2 (en) 2014-06-02 2019-05-21 Armo Biosciences, Inc. Methods of lowering serum cholesterol
USD763433S1 (en) 2014-06-06 2016-08-09 Anutra Medical, Inc. Delivery system cassette
USD774182S1 (en) 2014-06-06 2016-12-13 Anutra Medical, Inc. Anesthetic delivery device
USD750768S1 (en) 2014-06-06 2016-03-01 Anutra Medical, Inc. Fluid administration syringe
US10806803B2 (en) 2014-07-17 2020-10-20 Ohio State Innovation Foundation Compositions for targeting macrophages and other CD206 high expressing cells and methods of treating and diagnosis
EP3180431A1 (en) * 2014-08-11 2017-06-21 Miti Biosystems GmbH Cyclic peptides expressed by a genetic package
EP3197346B1 (en) * 2014-09-22 2020-02-26 National Health Research Institutes Use of 5-methoxytryptophan as diagnostic agent of inflammatory diseases
US10350270B2 (en) 2014-10-14 2019-07-16 Armo Biosciences, Inc. Interleukin-15 compositions and uses thereof
CA2963995A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
WO2016126615A1 (en) 2015-02-03 2016-08-11 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
CN107847583A (zh) 2015-05-28 2018-03-27 阿尔莫生物科技股份有限公司 用于治疗癌症的聚乙二醇化白细胞介素‑10
EP3302528A1 (en) 2015-05-29 2018-04-11 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
EA201890020A1 (ru) 2015-06-15 2018-05-31 Зе Боард Оф Трастиз Оф Зе Леланд Стэнфорд Джуниор Юниверсити Способы и композиции для лечения ассоциированных со старением состояний
CN108025040A (zh) 2015-08-25 2018-05-11 阿尔莫生物科技股份有限公司 使用白介素-10治疗疾病和病症的方法
RS63143B1 (sr) * 2016-06-01 2022-05-31 Athira Pharma Inc Jedinjenja
US20190151483A1 (en) 2016-07-25 2019-05-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Serv Methods of making 18f-labeled precursors and peptides, labeled c-met binding peptides, and methods of use thereof
CN109689679A (zh) * 2016-09-13 2019-04-26 第一三共株式会社 血小板反应蛋白1结合肽
CN109789183A (zh) * 2016-09-29 2019-05-21 Aebi有限公司 治疗性多靶向构建体及其用途
MX2019004029A (es) 2016-10-07 2019-09-27 Navidea Biopharmaceuticals Inc Compuestos y metodos para diagnosis y tratamiento de infecciones virales.
GB201804835D0 (en) * 2018-03-26 2018-05-09 Ge Healthcare As Formulation and method of preparation
JP2022537946A (ja) 2019-06-14 2022-08-31 エディンバラ モレキュラー イメージング リミテッド 化合物及びそれらの使用方法
MX2022005676A (es) 2019-11-13 2022-10-27 Amunix Pharmaceuticals Inc Polipéptidos xten con código de barras y composiciones de estos, y métodos para preparar y usar los mismos.
JP7162853B1 (ja) 2021-07-02 2022-10-31 ペプチスター株式会社 液相ペプチド合成用担体結合ペプチドの分析方法
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023193015A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
WO2023225273A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Navidea Biopharmaceuticals, Inc. Cd206 targeted drug delivery vehicles carrying novel bisphosphonate drug payloads via a degradable linker

Family Cites Families (163)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4093709A (en) 1975-01-28 1978-06-06 Alza Corporation Drug delivery devices manufactured from poly(orthoesters) and poly(orthocarbonates)
US4131648A (en) 1975-01-28 1978-12-26 Alza Corporation Structured orthoester and orthocarbonate drug delivery devices
US4180646A (en) 1975-01-28 1979-12-25 Alza Corporation Novel orthoester polymers and orthocarbonate polymers
US4391797A (en) 1977-01-05 1983-07-05 The Children's Hospital Medical Center Systems for the controlled release of macromolecules
US4718433A (en) 1983-01-27 1988-01-12 Feinstein Steven B Contrast agents for ultrasonic imaging
DE3313947A1 (de) 1983-04-15 1984-10-18 Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen Mikropartikel und gasblaeschen enthaltende ultraschall-kontrastmittel
DE3834705A1 (de) 1988-10-07 1990-04-12 Schering Ag Ultraschallkontrastmittel aus gasblaeschen und fettsaeure enthaltenden mikropartikeln
DE3313946A1 (de) 1983-04-15 1984-10-18 Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen Mikropartikel und gasblaeschen enthaltende ultraschall-kontrastmittel
US4900540A (en) 1983-06-20 1990-02-13 Trustees Of The University Of Massachusetts Lipisomes containing gas for ultrasound detection
US4899755A (en) 1985-05-08 1990-02-13 The General Hospital Corporation Hepatobiliary NMR contrast agents
MX174467B (es) 1986-01-23 1994-05-17 Squibb & Sons Inc 1,4,7-triscarboximetil-1,4,7,10-tetraazaciclodo decano substituido en 1 y compuestos analogos
US5021556A (en) 1987-07-22 1991-06-04 Neorx Corporation Method of radiolabeling chelating compounds comprising sulfur atoms with metal radionuclides
IE61591B1 (en) 1987-12-29 1994-11-16 Molecular Biosystems Inc Concentrated stabilized microbubble-type ultrasonic imaging agent and method of production
US4844882A (en) 1987-12-29 1989-07-04 Molecular Biosystems, Inc. Concentrated stabilized microbubble-type ultrasonic imaging agent
US5075099A (en) 1988-05-31 1991-12-24 Neorx Corporation Metal radionuclide chelating compounds for improved chelation kinetics
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5364613A (en) 1989-04-07 1994-11-15 Sieving Paul F Polychelants containing macrocyclic chelant moieties
US5118797A (en) 1989-08-28 1992-06-02 E. R. Squibb & Sons, Inc. Rhenium tris dioxime complexes
WO1991003200A1 (en) 1989-08-28 1991-03-21 The General Hospital Corporation Hydroxy-aryl metal chelates for diagnostic nmr imaging
US5230882A (en) 1989-12-22 1993-07-27 Unger Evan C Liposomes as contrast agents for ultrasonic imaging and methods for preparing the same
US5773024A (en) * 1989-12-22 1998-06-30 Imarx Pharmaceutical Corp. Container with multi-phase composition for use in diagnostic and therapeutic applications
US6146657A (en) * 1989-12-22 2000-11-14 Imarx Pharmaceutical Corp. Gas-filled lipid spheres for use in diagnostic and therapeutic applications
US5585112A (en) * 1989-12-22 1996-12-17 Imarx Pharmaceutical Corp. Method of preparing gas and gaseous precursor-filled microspheres
US5469854A (en) 1989-12-22 1995-11-28 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods of preparing gas-filled liposomes
US5305757A (en) 1989-12-22 1994-04-26 Unger Evan C Gas filled liposomes and their use as ultrasonic contrast agents
US5123414A (en) 1989-12-22 1992-06-23 Unger Evan C Liposomes as contrast agents for ultrasonic imaging and methods for preparing the same
US5871959A (en) * 1989-12-27 1999-02-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of producing hepatocycte growth factor/scatter factor and related cell lines
CA2034042C (en) 1990-01-18 1999-08-17 Adrian D. Nunn Boronic acid adducts of rhenium dioxime and technetium-99m dioxime complexes containing a biochemically active group
US5556610A (en) 1992-01-24 1996-09-17 Bracco Research S.A. Gas mixtures useful as ultrasound contrast media, contrast agents containing the media and method
IN172208B (es) 1990-04-02 1993-05-01 Sint Sa
US5578292A (en) 1991-11-20 1996-11-26 Bracco International B.V. Long-lasting aqueous dispersions or suspensions of pressure-resistant gas-filled microvesicles and methods for the preparation thereof
US5445813A (en) 1992-11-02 1995-08-29 Bracco International B.V. Stable microbubble suspensions as enhancement agents for ultrasound echography
US5183653A (en) 1990-04-13 1993-02-02 E. R. Squibb & Sons, Inc. Boronic acid adducts of metal dioxime complexes useful in labelling proteins and other amine-containing compounds
US5137928A (en) 1990-04-26 1992-08-11 Hoechst Aktiengesellschaft Ultrasonic contrast agents, processes for their preparation and the use thereof as diagnostic and therapeutic agents
AU636481B2 (en) 1990-05-18 1993-04-29 Bracco International B.V. Polymeric gas or air filled microballoons usable as suspensions in liquid carriers for ultrasonic echography
US5173298A (en) 1990-09-27 1992-12-22 Allergan, Inc. Nonaqueous fluorinated drug delivery vehicle suspensions
US5367080A (en) 1990-11-08 1994-11-22 Sterling Winthrop Inc. Complexing agents and targeting radioactive immunoreagents useful in therapeutic and diagnostic imaging compositions and methods
DE69230525T2 (de) 1991-02-08 2000-06-21 Diatide, Inc. Technetium-99m markierte Polypeptide zur Bildformung
US5849261A (en) 1991-02-08 1998-12-15 Diatide, Inc. Radiolabeled vasoactive intestinal peptides for diagnosis and therapy
US5965107A (en) 1992-03-13 1999-10-12 Diatide, Inc. Technetium-99m labeled peptides for imaging
DE69232718T2 (de) 1991-02-22 2003-04-03 American Cyanamid Co., Madison Identifizierung eines menschlichen rezeptor-tyrosinkinasegens
GB9106686D0 (en) 1991-03-28 1991-05-15 Hafslund Nycomed As Improvements in or relating to contrast agents
GB9106673D0 (en) 1991-03-28 1991-05-15 Hafslund Nycomed As Improvements in or relating to contrast agents
DK0586524T3 (es) 1991-06-03 1997-05-20 Nycomed Imaging As
CA2112109A1 (en) 1991-07-05 1993-01-21 Arne Berg Improvements in or relating to contrast agents
US5808091A (en) 1991-10-29 1998-09-15 Bracco International B.V. Rhenium and technetium complexes containing a hypoxia localizing moiety
GB9200388D0 (en) 1992-01-09 1992-02-26 Nycomed As Improvements in or relating to contrast agents
GB9200387D0 (en) 1992-01-09 1992-02-26 Nycomed As Improvements in or relating to contrast agents
GB9200391D0 (en) 1992-01-09 1992-02-26 Nycomed As Improvements in or relating to contrast agents
IL104084A (en) 1992-01-24 1996-09-12 Bracco Int Bv Sustainable aqueous suspensions of pressure-resistant and gas-filled blisters, their preparation, and contrast agents containing them
US5861301A (en) 1992-02-20 1999-01-19 American Cayanamid Company Recombinant kinase insert domain containing receptor and gene encoding same
US5965132A (en) * 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US5877289A (en) 1992-03-05 1999-03-02 The Scripps Research Institute Tissue factor compositions and ligands for the specific coagulation of vasculature
DK0642580T3 (da) * 1992-05-18 2002-12-23 Genentech Inc Hepactocytvækstfaktorvarianter
US5316921A (en) * 1992-05-18 1994-05-31 Genentech, Inc. Single-chain hepatocyte growth factor variants
AU693767B2 (en) * 1992-08-10 1998-07-09 Cambridge Neuroscience, Inc. Inhibitors of cell proliferation, their preparation and use
DE69233803D1 (de) 1992-10-28 2011-03-31 Genentech Inc Verwendung von vaskulären Endothelwachstumsfaktor-Antagonisten
US5608110A (en) 1993-06-15 1997-03-04 Bracco International B.V. Heteroatom-bearing ligands and metal complexes thereof
IL110185A (en) 1993-07-02 1999-05-09 Molecular Biosystems Inc Method for making encapsulated gas microspheres from heat denatured protein in the absence of oxygen gas
WO1995003280A1 (en) 1993-07-19 1995-02-02 Resolution Pharmaceuticals Inc. Hydrazino-type radionuclide chelators having an n3s configuration
US5798091A (en) 1993-07-30 1998-08-25 Alliance Pharmaceutical Corp. Stabilized gas emulsion containing phospholipid for ultrasound contrast enhancement
US5574140A (en) 1993-09-03 1996-11-12 Resolution Pharmaceutical Inc. Hydrazino-type N2 S2 chelators
ES2192572T3 (es) 1993-12-15 2003-10-16 Bracco Research Sa Medios de contraste de ultrasonidos, agentes de contraste que contienen los medios, y metodo.
GB9402867D0 (en) 1994-02-15 1994-04-06 Nycomed Imaging As Improvements in or relating to contrast agents
ES2249762T3 (es) * 1994-03-08 2006-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Factor de crecimiento del endotelio vascular 2.
JP2891647B2 (ja) 1994-03-11 1999-05-17 株式会社日本触媒 有機スルフィド化合物及びその製造方法
US5770565A (en) 1994-04-13 1998-06-23 La Jolla Cancer Research Center Peptides for reducing or inhibiting bone resorption
US5582814A (en) 1994-04-15 1996-12-10 Metasyn, Inc. 1-(p-n-butylbenzyl) DTPA for magnetic resonance imaging
CA2188292A1 (en) 1994-04-20 1995-11-02 Larry Margerum Contrast agents
US5707624A (en) * 1994-06-03 1998-01-13 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of Kaposi's sarcoma by inhibition of scatter factor
US5650135A (en) 1994-07-01 1997-07-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Non-invasive localization of a light-emitting conjugate in a mammal
US5662885A (en) 1994-07-22 1997-09-02 Resolution Pharmaceuticals Inc. Peptide derived radionuclide chelators
GB9417941D0 (en) 1994-09-06 1994-10-26 Nycomed Imaging As Improvements in or relating to contrast agents
US5556939A (en) 1994-10-13 1996-09-17 Merck Frosst Canada, Inc. TC or RE radionuclide labelled chelate, hexapeptide complexes useful for diagnostic or therapeutic applications
US6403088B1 (en) * 1995-08-01 2002-06-11 Helsinki University Licensing, Ltd. Antibodies reactive with VEGF-C, a ligand for the Flt4 receptor tyrosine kinase (VEGFR-3)
US6645933B1 (en) * 1995-08-01 2003-11-11 Helsinki University Licensing Ltd. Oy Receptor ligand VEGF-C
US6221839B1 (en) * 1994-11-14 2001-04-24 Helsinki University Licensing Ltd. Oy FIt4 ligand and methods of use
US6245530B1 (en) * 1995-08-01 2001-06-12 Ludwig Institute For Cancer Research Receptor ligand
US6333021B1 (en) 1994-11-22 2001-12-25 Bracco Research S.A. Microcapsules, method of making and their use
DE4445065A1 (de) 1994-12-07 1996-06-13 Diagnostikforschung Inst Verfahren zur In-vivo-Diagnostik mittels NIR-Strahlung
IL116328A (en) 1994-12-16 1999-09-22 Bracco Research Sa Frozen suspension of gas microbubbles in frozen aqueous carrier for use as contrast agent in ultrasonic imaging
TW319763B (es) 1995-02-01 1997-11-11 Epix Medical Inc
GB9502065D0 (en) 1995-02-02 1995-03-22 Nycomed Imaging As Contrast media
US5686292A (en) 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
US6521211B1 (en) 1995-06-07 2003-02-18 Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Inc. Methods of imaging and treatment with targeted compositions
DE69632401T2 (de) 1995-06-07 2005-05-19 Imarx Pharmaceutical Corp., Tucson Neue zielgerichtete mittel zur diagnostischen und therapeutischen verwendung
US6361946B1 (en) * 1997-02-05 2002-03-26 Licentia Ltd Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof
PT848755E (pt) * 1995-09-08 2003-12-31 Genentech Inc Proteina relacionada com o vegf
AU1116297A (en) 1995-11-08 1997-05-29 Immunex Corporation Flk-1 binding protein
US5837680A (en) 1996-02-16 1998-11-17 Children's Medical Center Corporation Pharmaceutical compositions comprising troponin subunits, fragments and analogs thereof and methods of their use to inhibit angiogenesis
ES2197986T3 (es) 1996-02-19 2004-01-16 Amersham Health As Mejoras introducidas en o relacionadas con agentes de contraste.
CA2247620A1 (en) 1996-04-01 1997-10-09 Epix Medical, Inc. Bioactivated diagnostic imaging contrast agents
ATE411055T1 (de) 1996-08-02 2008-10-15 Ge Healthcare As Verbesserungen für oder in bezug auf kontrastmittel
TW320761B (en) * 1996-10-03 1997-11-21 Mos Electronics Taiwan Inc Manufacturing method of high density DRAM with cylindrical stack capacitor
CZ140999A3 (cs) 1996-10-21 1999-09-15 Nycomed Imaging As Směsný prostředek pro použití jako kontrastní činidlo
US6331289B1 (en) * 1996-10-28 2001-12-18 Nycomed Imaging As Targeted diagnostic/therapeutic agents having more than one different vectors
WO1998018495A2 (en) 1996-10-28 1998-05-07 Marsden, John, Christopher Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents
EP0973552B1 (en) 1996-10-28 2006-03-01 Amersham Health AS Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents
US6261537B1 (en) * 1996-10-28 2001-07-17 Nycomed Imaging As Diagnostic/therapeutic agents having microbubbles coupled to one or more vectors
WO1998018498A2 (en) 1996-10-28 1998-05-07 Marsden, John, Christopher Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents
ES2206689T3 (es) 1996-10-28 2004-05-16 Amersham Health As Agentes de contraste.
US6264917B1 (en) * 1996-10-28 2001-07-24 Nycomed Imaging As Targeted ultrasound contrast agents
GB9708265D0 (en) 1997-04-24 1997-06-18 Nycomed Imaging As Contrast agents
WO1998018496A2 (en) 1996-10-28 1998-05-07 Nycomed Imaging As Contrast agents
US7125714B2 (en) * 1997-02-05 2006-10-24 Licentia Ltd. Progenitor cell materials and methods
US5919967A (en) 1997-04-11 1999-07-06 Epix Medical, Inc. Process for synthesizing phosphodiesters
DE19717904A1 (de) 1997-04-23 1998-10-29 Diagnostikforschung Inst Säurelabile und enzymatisch spaltbare Farbstoffkonstrukte zur Diagnostik mit Nahinfrarotlicht und zur Therapie
US5886142A (en) 1997-05-20 1999-03-23 Thomas Jefferson University Radiolabeled thrombus imaging agents
US6245318B1 (en) 1997-05-27 2001-06-12 Mallinckrodt Inc. Selectively binding ultrasound contrast agents
IL120943A (en) 1997-05-29 2004-03-28 Univ Ben Gurion A system for administering drugs through the skin
GB9712525D0 (en) 1997-06-16 1997-08-20 Nycomed Imaging As Method
ATE371727T1 (de) * 1997-06-18 2007-09-15 Merck & Co Inc Kdr, ein menschlicher tyrosin kinase rezeptor
IL134985A0 (en) 1997-10-02 2001-05-20 Epix Medical Inc A method for contrast enhanced diagnostic imaging
CA2313390A1 (en) 1997-12-09 1999-06-17 Children's Medical Center Corporation Peptide antagonists of vascular endothelial growth factor
US6165458A (en) 1997-12-26 2000-12-26 Pharmaderm Laboratories Ltd. Composition and method for dermal and transdermal administration of a cytokine
AU753196B2 (en) 1998-02-09 2002-10-10 Bracco Research S.A. Targeted delivery of biologically active media
EP1056773A2 (en) 1998-02-11 2000-12-06 Resolution Pharmaceuticals Inc. Angiogenesis targeting molecules
US20020136721A1 (en) * 1998-02-17 2002-09-26 Schwall Ralph H. Hepatocyte growth factor receptor antagonists and uses thereof
EA200001007A1 (ru) 1998-03-31 2001-04-23 Дюпон Фармасьютикалз Компани Фармацевтические препараты для визуализации ангиогенных расстройств
US6093382A (en) 1998-05-16 2000-07-25 Bracco Research Usa Inc. Metal complexes derivatized with folate for use in diagnostic and therapeutic applications
BR9915139A (pt) 1998-11-06 2001-08-07 Basf Ag Método de inibir a hiperpermeabilidade vascular, e de inibir um processo ou estado fisiológico em um indivìduo
US6312665B1 (en) 1998-12-21 2001-11-06 Generex Pharmaceuticals Incorporated Aerosol formulations for buccal and pulmonary application
CA2364630A1 (en) * 1999-03-12 2000-09-21 Human Genome Sciences, Inc. 50 human secreted proteins
JP2002542767A (ja) * 1999-03-12 2002-12-17 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ４７個のヒト分泌タンパク質
US20090087878A9 (en) * 1999-05-06 2009-04-02 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules associated with plants
US6294525B1 (en) 1999-09-01 2001-09-25 Molecumetics Ltd. Reverse-turn mimetics and methods relating thereto
GB9928950D0 (en) 1999-12-07 2000-02-02 Metris Therapeutics Limited Binding protein
US7045133B2 (en) * 2000-01-18 2006-05-16 Ludwig Institute For Cancer Research VEGF-D/VEGF-C/VEGF peptidomimetic inhibitor
US7740841B1 (en) 2000-01-28 2010-06-22 Sunnybrook Health Science Center Therapeutic method for reducing angiogenesis
US6733755B2 (en) * 2000-02-04 2004-05-11 Supratek Pharma, Inc. Ligand for vascular endothelial growth factor receptor
JP4981229B2 (ja) 2000-02-25 2012-07-18 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ ハイブリッド血管内皮成長因子ＤＮＡｓおよびタンパク質に関与する物質および方法
ATE533056T1 (de) 2000-03-02 2011-11-15 Vegenics Pty Ltd Verfahren zum auffinden von tumoren welche den vaskulären endothelialen wachstumsfaktor d exprimieren
US20020102260A1 (en) * 2000-03-02 2002-08-01 Marc Achen Methods for treating neoplastic disease characterized by vascular endothelial growth factor D expression, for screening for neoplastic disease or metastatic risk, and for maintaining vascularization of tissue
US6769080B2 (en) * 2000-03-09 2004-07-27 Texas Instruments Incorporated Scan circuit low power adapter with counter
JP2003527441A (ja) 2000-03-22 2003-09-16 グラクソ グループ リミテッド 細胞周期を阻止する薬剤及び抗体を含む医薬
US20010031485A1 (en) 2000-03-22 2001-10-18 Sibtech, Inc. Recombinant proteins containing Shiga-like toxin and vascular endothelial growth factor fragments
US20050019826A1 (en) * 2000-03-31 2005-01-27 Roselyne Tournaire Peptides blocking vascular endothelial growth factor(vegf)-mediated angiogenesis, polynucleotides encoding said pepetides and methods of use thereof
US20050100991A1 (en) * 2001-04-12 2005-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AU2001259195A1 (en) 2000-04-28 2001-11-12 Glaxo Group Limited Compounds having affinity for the vascular endothelial growth factor receptor-2 (vegfr-2) and associated uses
CA2407970A1 (en) 2000-05-03 2001-11-08 Ludwig Institute For Cancer Research A method for activating only the vascular endothelial growth factor receptor-3 and uses thereof
KR100457350B1 (ko) * 2000-06-01 2004-11-16 이경림 ＩｇＥ-의존적 히스타민 방출인자(ＨＲＦ)의 수용체,ＨＲＦ 결합 펩타이드 및 그들을 코딩하는 핵산, 및그들의 용도
BR0111861A (pt) 2000-06-23 2003-12-23 Schering Ag Combinações e composições que interferem com função receptora vegf/vegf e angiopoietina/tie e seu uso(ii)
EP1166799A1 (en) 2000-06-28 2002-01-02 Schering Aktiengesellschaft Combinations and compositions which interfere with VEGF/VEGF and angiopoietin/Tie receptor function and their use (II)
EP1166798A1 (en) 2000-06-23 2002-01-02 Schering Aktiengesellschaft Combinations and compositions which interfere with VEGF/VEGF and angiopoietin/ Tie receptor function and their use
AU2001276934A1 (en) * 2000-07-18 2002-02-05 Joslin Diabetes Center Inc. Methods of modulating fibrosis
US20020091082A1 (en) * 2000-09-13 2002-07-11 Aiello Lloyd P. Methods of modulating symptoms of hypertension
FR2814744B1 (fr) 2000-10-04 2002-11-29 Commissariat Energie Atomique Cyclopeptides, leur procede de preparation et leur utilisation comme inhibiteur ou activateur de l'angiogenese
US20030082103A1 (en) * 2000-10-11 2003-05-01 Targesome, Inc. Targeted therapeutic lipid constructs having cell surface targets
US7611711B2 (en) 2001-01-17 2009-11-03 Vegenics Limited VEGFR-3 inhibitor materials and methods
AU2002248372B8 (en) 2001-01-19 2008-03-20 Vegenics Limited FLT4(VEGFR-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy
US20030176674A1 (en) 2001-04-13 2003-09-18 Rosen Craig A. Vascular endothelial growth factor 2
WO2003000842A2 (en) * 2001-06-04 2003-01-03 Curagen Corporation Novel proteins and nucleic acids encoding same
AU2002318356A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-08 Incyte Genomics, Inc. Protein modification and maintenance molecules
AU2002362461A1 (en) 2001-10-01 2003-04-14 Targesome, Inc. Targeted therapeutic lipid constructs having cell surface targets
US6766860B2 (en) * 2002-02-22 2004-07-27 Globalsantafe Corporation Multi-activity offshore drilling facility having a support for tubular string
US7794693B2 (en) * 2002-03-01 2010-09-14 Bracco International B.V. Targeting vector-phospholipid conjugates
US7211240B2 (en) * 2002-03-01 2007-05-01 Bracco International B.V. Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications
EP1501357A4 (en) 2002-05-06 2009-10-21 Genentech Inc USE OF VEGF FOR THE TREATMENT OF BONE DEFECTS
DK2284180T3 (en) * 2003-03-03 2015-12-21 Dyax Corp Uses of peptides that specifically bind to the HGF receptor (cMET)
CA2826960A1 (en) * 2005-12-09 2007-06-14 Bracco Suisse Sa Targeting vector-phospholipid conjugates
CA2716826C (en) * 2008-02-25 2017-05-09 Prometheus Laboratories Inc. Drug selection for breast cancer therapy using antibody-based arrays
US9801473B2 (en) 2012-09-13 2017-10-31 Kids Ii, Inc. Play yard with removable liner
WO2015005839A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Telefonaktiebolaget L M Ericsson (Publ) Method for enabling control of data packet flows belonging to different access technologies

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004078778A3 (en) 2004-11-18
EP2284180B1 (en) 2015-09-09
EP1944312A1 (en) 2008-07-16
PT2949658T (pt) 2018-10-18
US9000124B2 (en) 2015-04-07
US20050214859A1 (en) 2005-09-29
US8044175B2 (en) 2011-10-25
SI2949658T1 (sl) 2018-10-30
CA2517939C (en) 2015-11-24
EP1603935A4 (en) 2007-03-21
EP1603935A2 (en) 2005-12-14
EP2949658B1 (en) 2018-08-08
JP2014159434A (ja) 2014-09-04
HUE039154T2 (hu) 2018-12-28
JP6216280B2 (ja) 2017-10-18
DK2949658T3 (en) 2018-10-01
JP2007524598A (ja) 2007-08-30
US20120039802A1 (en) 2012-02-16
AU2010235865B2 (en) 2012-11-15
US20100260672A1 (en) 2010-10-14
CA2517939A1 (en) 2004-09-16
AU2004217894A1 (en) 2004-09-16
JP2017019787A (ja) 2017-01-26
EP1944312B1 (en) 2012-06-27
WO2004078778A2 (en) 2004-09-16
JP5876644B2 (ja) 2016-03-02
JP6374913B2 (ja) 2018-08-15
EP2284180A2 (en) 2011-02-16
US9845340B2 (en) 2017-12-19
PL2949658T3 (pl) 2018-11-30
ES2557286T3 (es) 2016-01-25
CY1120683T1 (el) 2019-12-11
EP2949658A3 (en) 2016-01-13
EP2949658A2 (en) 2015-12-02
EP2284180A3 (en) 2011-10-05
AU2004217894B2 (en) 2010-07-15
ES2692166T3 (es) 2018-11-30
JP5466350B2 (ja) 2014-04-09
US20110311446A1 (en) 2011-12-22
US20150218218A1 (en) 2015-08-06
PL1944312T3 (pl) 2012-12-31
JP2011037872A (ja) 2011-02-24
DK2284180T3 (en) 2015-12-21
US20100261875A1 (en) 2010-10-14
AU2010235865A1 (en) 2010-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2396368T3 (es) Péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (CMET) y usos de los mismos
US7666979B2 (en) Methods for preparing multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications and methods of preparing the same
ES2506142T3 (es) Péptidos de unión a KDR y a VEGF/KDR y su uso en diagnóstico
BR112020012246A2 (pt) ligantes peptídicos bicíclicos específicos para epha2
KR20230133938A (ko) Mt1-mmp에 특이적인 바이사이클릭 펩타이드 리간드
ES2523654T3 (es) Constructos multivalentes para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico
JP2022521353A (ja) Ｖｅｇｆのためのｄ－ペプチド性化合物
AU2012241087B2 (en) Peptides that specifically bind HGF receptor (cMet) and uses thereof
AU2015201413B2 (en) Peptides that specifically bind HGF receptor (cMet) and uses thereof