ES2692166T3 - Péptidos que se unen específicamente al receptor de HGF (cMet) y usos de los mismos - Google Patents

Péptidos que se unen específicamente al receptor de HGF (cMet) y usos de los mismos Download PDF

Info

Publication number
ES2692166T3
ES2692166T3 ES15157779.8T ES15157779T ES2692166T3 ES 2692166 T3 ES2692166 T3 ES 2692166T3 ES 15157779 T ES15157779 T ES 15157779T ES 2692166 T3 ES2692166 T3 ES 2692166T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cmet
binding
hgf
polypeptide
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES15157779.8T
Other languages
English (en)
Inventor
Aaron K. Sato
Daniel T. Dransfield
Robert C. Ladner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bracco Suisse SA
Dyax Corp
Original Assignee
Bracco Suisse SA
Dyax Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bracco Suisse SA, Dyax Corp filed Critical Bracco Suisse SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2692166T3 publication Critical patent/ES2692166T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A61K47/665—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells the pre-targeting system, clearing therapy or rescue therapy involving biotin-(strept) avidin systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
    • A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Polipéptido aislado que se une a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta como GSX1X2X3CX4X5X6X7CX8X9X10APGGK (SEQ ID NO:525), en la que X1 es F, L, S, W, Y o M; X2 es I, Y, H, T o N; X3 es I, L, D, M, F o S, preferiblemente I; X4 es P, R, W, N o E, preferiblemente W o P; X5 es W, Y, E, P, L, T o G; X6 es S, T, D, F, E, W, G o Q; X7 es F, W, N, Q, E, R o A; X8 es G, N, H, R, M, I, D, V o T; X9 es S, K, F, M, T, D o L; y X10 es S, P, T, L, Y, N, H, Q o W;

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Peptidos que se unen espedficamente al receptor de HGF (cMet) y usos de los mismos Antecedentes de la invencion
El factor de crecimiento de hepatocitos (tambien conocido como factor de dispersion) es un factor de crecimiento multifuncional implicado en diversos procesos fisiologicos tales como embriogenesis, curacion de heridas y angiogenesis. Ha resultado evidente que HGF, a traves de interacciones con su receptor de alta afinidad (cMet), esta implicado en el crecimiento, la invasion y metastasis tumoral. De hecho, se ha demostrado la actividad y/o expresion de cMet desregulada (por ejemplo, la sobreexpresion de cMet en epitelio neoplasico de adenomas colorrectales y en otros carcinomas en comparacion con mucosa normal), asf como la hiperactividad del receptor cMet a traves de un bucle estimulador autocrino con HGF, en una variedad de tejidos tumorales e induce la transformacion oncogenica de lmeas celulares espedficas.
En general, se produce HGF por celulas estromales, que forman parte de muchos tumores epiteliales; sin embargo, se cree que la produccion de HGF por las propias celulas tumorales comprende la principal ruta que conduce a la hiperproliferacion de tumores espedficos. Se han detectado bucles estimuladores autocrinos de HGF/cMet en gliomas, osteosarcomas, y carcinomas de mama, prostata, mama y pulmon y otros.
La interrupcion de la interaccion de HGF con el receptor cMet ralentiza la progresion tumoral en modelos animales. Ademas de estimular la proliferacion de determinadas celulas cancerosas a traves de la activacion de cMet, HGF tambien protege frente a la toxicidad de agentes que danan el ADN en una variedad de lmeas celulares susceptibles de fenotipos hiperproliferativos (por ejemplo, cancer de mama). Por tanto, el impedir que HGF se una a cMet podna predisponer a determinadas celulas cancerosas a la citotoxicidad de determinados farmacos.
Ademas de trastornos hiperproliferativos, cMet tambien se ha vinculado con la angiogenesis. Por ejemplo, la estimulacion de cMet conduce a la produccion de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que estimula, a su vez, la angiogenesis. Adicionalmente, la estimulacion de cMet tambien se ha implicado en el fomento de la curacion de heridas.
Ademas de identificar el receptor cMet como diana terapeutica para trastornos hiperproliferativos, angiogenesis y curacion de heridas, la gran discrepancia entre los niveles de expresion de tejidos neoplasicos y normales correspondientes indica que cMet es una diana atractiva para aplicaciones de obtencion de imagenes dirigidas a trastornos hiperproliferativos.
El documento US 2002/136721 A1 divulga polipeptidos que se unen a cMet y que se establece que son utiles para la deteccion de cancer in vivo.
Sumario de la invencion
La presente invencion se define, entre otras cosas, por los siguientes puntos:
1. Un polipeptido aislado que se une a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF, en el que el polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos expuesta como GSX1X2X3CX4X5X6X7CX8X9X10APGGK (SEQ iD NO:525), en la que
X1 es F, L, S, W, Y o M;
X2 es I, Y, H, T o N;
X3 es I, L, D, M, F o S, preferiblemente I;
X4 es P, R, W, N o E, preferiblemente W o P;
X5 es W, Y, E, P, L, T o G;
Xa es S, T, D, F, E, W, G o Q;
X7 es F, W, N, Q, E, R o A;
X8 es G, N, H, R, M, I, D, V o T; X9 es S, K, F, M, T, D o L; y X10 es S, P, T, L, Y, N, H, Q o W;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
2. El polipeptido aislado del punto 1, en el que el polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-10.
3. El polipeptido aislado del punto 1 o el punto 2, en el que el polipeptido es multimerico.
4. El polipeptido aislado de uno cualquiera de los puntos 1-3, en el que el polipeptido se conjuga a un marcador apropiado para la deteccion de diagnostico, opcionalmente mediante un ligador, para formar un agente de contraste para obtencion de imagenes de diagnostico.
5. El polipeptido aislado del punto 4, en el que el marcador se selecciona del grupo que consiste en una enzima, un compuesto fluorescente, un agente de contraste para ultrasonidos, un liposoma y un colorante optico.
6. El polipeptido aislado del punto 4 o 5, en el que el marcador es:
(i) un marcador radiactivo, que opcionalmente se selecciona del grupo que consiste en 18F, 124I
"Tc, 51Cr, 67Ga,
68Ga, 47Sc, 167Tm,
141Ce, 111In, 168Yb, 175Yb, 140La,
90Y, 88Y, 153Sm, 166Ho, 165Dy
125I, 131I, 77Br, 76Br, 62Cu, 64Cu, 67Cu,
97Ru, 103Ru, 186Re, 188Re, 203Pb, 211Bi, 212Bi, 213Bi, 214Bi, 105Rh, 109Pd, 117mSn, 149Pm, 161Tb, 177Lu, 198Au y 199Au, o
Ox o+ o+ o+ o+ o+ o_l
(ii) un atomo de metal paramagnetico seleccionado del grupo que consiste en Gd , Mn Cu Fe Co , Ni , Eu ,
Dy3+, Pr3+, Cr3+, Co3+, Fe3+,Ti3+,Tb3+, Nd3+, Sm3+, Ho3+, Er3+, Pa1+ y Eu2+.
7. El polipeptido aislado de uno cualquiera de los puntos 4-6, en el que el polipeptido se incorpora en burbujas para ultrasonidos, micropartfculas, microesferas, emulsiones o liposomas.
8. Un polipeptido aislado tal como se define en uno cualquiera de los puntos 4-7, en el que el agente de contraste para obtencion de imagenes de diagnostico es para su uso en la obtencion de imagenes de diagnostico in vivo que implica detectar un trastorno hiperproliferativo, angiogenesis o neovascularizacion.
9. El polipeptido aislado del punto 8, en el que la obtencion de imagenes es obtencion de imagenes por resonancia magnetica, obtencion de imagenes por ultrasonidos, obtencion de imagenes opticas, obtencion de imagenes por sonoluminiscencia, obtencion de imagenes fotoacusticas, obtencion de imagenes por rayos X u obtencion de imagenes con radionuclidos.
10. Un procedimiento de purificacion de cMet o un complejo de cMet y HGF de una disolucion que lo contiene, comprendiendo el procedimiento:
(a) poner en contacto la disolucion con al menos un polipeptido expuesto en el punto 1, que se inmoviliza sobre un sustrato solido, y
(b) separar el polipeptido de la disolucion.
La presente invencion se refiere a peptidos, tal como se definen en las reivindicaciones, que tienen la capacidad para unirse a cMet y antagonizar la actividad del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). Ademas, esta invencion se refiere a tales peptidos, composiciones y complejos peptfdicos que tienen la capacidad para unirse a cMet con el proposito de detectar y seleccionar como diana este receptor, inhibir la actividad de cMet independiente de las propiedades antagonistas de HGF, y con el proposito de obtener imagenes de diagnostico. La implicacion del eje HGF/cMet en una variedad de funciones celulares incluyendo proliferacion celular, curacion de heridas y angiogenesis, que conducen a enfermedades hiperproliferativas tales como cancer, hacen que la presente invencion sea particularmente util para interrumpir eventos fisiologicos mediados por HGF, para dirigir sustancias, por ejemplo, agentes terapeuticos, incluyendo agentes radioterapicos, a tales sitios, y para la obtencion de imagenes de importantes sitios de hiperproliferacion celular.
En respuesta a la necesidad de materiales y procedimientos mejorados para detectar, localizar, obtener imagenes, medir y posiblemente inhibir o afectar, por ejemplo, la hiperproliferacion y/o angiogenesis, se ha descubierto sorprendentemente que se unen espedficamente doce clases de polipeptidos que se producen de manera no natural a cMet. El marcaje apropiado de tales polipeptidos proporciona agentes de obtencion de imagenes detectables que pueden unirse, por ejemplo, a alta concentracion, a celulas que expresan cMet o celulas que muestran complejos de HGF/cMet, proporcionando agentes de obtencion de imagenes espedficos para sitios de proliferacion celular y/o angiogenesis. Por tanto, pueden usarse los polipeptidos de union a cMet de la presente invencion en la deteccion y el diagnostico de tales trastornos relacionados con hiperproliferacion y/o relacionados con angiogenesis. La conjugacion o fusion de tales polipeptidos con agentes eficaces tales como inhibidores de cMet o agentes tumoricidas tambien pueden usarse para tratar tumores patogenicos, por ejemplo, haciendo que el conjugado o la fusion “resida” en el sitio de proliferacion y/o angiogenesis activa, proporcionando de ese modo un medio eficaz para tratar estados patogenicos asociados con hiperproliferacion y/o angiogenesis.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Esta invencion se refiere a polipeptidos de union a cMet, e incluye el uso de un unico polipeptido de union como monomero o en un constructo multimerico o polimerico as^ como el uso de mas de un polipeptido de union de la invencion en constructos multimericos o polimericos. Los polipeptidos de union segun esta invencion son utiles en cualquier aplicacion en la que sea ventajosa la union, inhibicion, deteccion o el aislamiento de cMet, o fragmentos del mismo que conservan el sitio de union al polipeptido. Un aspecto particularmente importante de tales polipeptidos de union es la inhibicion de la actividad de cMet, o bien a traves de competencia con HGF por la union a cMet, o bien inhibiendo directamente la actividad de cMet independientemente de si HGF esta unido o no. Por ejemplo, en algunos casos, puede producirse senalizacion de cMet en ausencia de union a HGF, en tales situaciones, un polipeptido de union que inhibe la actividad de senalizacion de cMet independientemente de si HGF esta unido, sena util en la inhibicion de la senalizacion de cMet.
Otro uso particularmente ventajoso de los polipeptidos de union divulgados en el presente documento es en un procedimiento de obtencion de imagenes de proliferacion celular y/o angiogenesis in vivo. El procedimiento conlleva el uso de polipeptidos de union espedficos segun la invencion para detectar un sitio de proliferacion celular y/o angiogenesis, en el que los polipeptidos de union se han marcado de manera detectable para su uso como agentes de obtencion de imagenes, incluyendo agentes de contraste para obtencion de imagenes por resonancia magnetica (IRM), agentes de obtencion de imagenes por rayos X, agentes de obtencion de imagenes radiofarmaceuticos, agentes de obtencion de imagenes por ultrasonidos y agentes de obtencion de imagenes opticas.
Aun otro uso ventajoso de los polipeptidos de union a cMet divulgados en el presente documento es dirigir agentes terapeuticos, (incluyendo compuestos capaces de proporcionar un efecto terapeutico, radioterapico o citotoxico) o veldculos de suministro para agentes terapeuticos (incluyendo farmacos, material genetico, etc.) a sitios de hiperproliferacion y/o angiogenesis u otro tejido que expresa cMet.
El receptor cMet forma parte de la familia de tirosina cinasas receptoras de moleculas de senalizacion. Con los propositos de la presente invencion, la funcion de tirosina cinasa receptora puede incluir uno cualquiera de: oligomerizacion del receptor, fosforilacion del receptor, actividad cinasa del receptor, reclutamiento de moleculas de senalizacion posteriores, induccion de genes, induccion de proliferacion celular, induccion de migracion celular, o una combinacion de los mismos. Las moleculas “heteromericas”, usadas en el presente documento para referirse a moleculas que contienen mas de un peptido de union a cMet tal como se describe en el presente documento, de tal manera que cada peptido de union de la molecula heteromerica se una a un sitio diferente, por ejemplo, “epftopo”, de cMet, tambien estan englobadas por la presente invencion. Por ejemplo, constructos heteromericos de los polipeptidos de union proporcionados en el presente documento podnan unirse, por ejemplo, mediante un peptido de union, a, por ejemplo, el sitio de union a HGF de cMet, mientras que otro peptido de union de la molecula heteromerica se une a un sitio de union de alta afinidad diferente de cMet. El direccionamiento de dos o mas epttopos distintos en cMet con un unico constructo de union puede mejorar enormemente la capacidad del constructo para inhibir la funcion de union a HGF y/o receptor (tal inhibicion puede producirse mediante inhibicion directa de cMet independientemente de la union a HGF). Incluso los peptidos de union con una capacidad debil para bloquear la actividad del receptor pueden usarse para generar constructos heteromericos que tienen una capacidad mejorada para bloquear la funcion del receptor dependiente de HGF e independiente de HGF.
Por tanto, la presente divulgacion se refiere a constructos que comprenden medios para producir moleculas multimericas que comprenden dos o mas polipeptidos de union, al menos uno de los cuales se une a cMet. En una realizacion, los constructos multimericos comprenden dos o mas copias de un unico polipeptido de union o secuencia de nucleotidos que codifican para dos o mas copias de un unico polipeptido de union. En otra realizacion, los constructos multimericos comprenden dos o mas polipeptidos de union o secuencias de nucleotidos que codifican dos o mas polipeptidos de union, de tal manera que al menos dos de los polipeptidos de union en el constructo sean espedficos para diferentes epttopos de cMet. Estos constructos tambien se denominan en el presente documento “constructos heteromericos”, “heteromultimeros”, etc. Los constructos tambien pueden incluir peptido no relacionado o de control. Los constructos pueden incluir dos o mas, tres o mas, o cuatro o mas polipeptidos de union o las secuencias de nucleotidos que codifican tales polipeptidos. Basandose en las ensenanzas proporcionadas en el presente documento, un experto habitual en la tecnica es capaz de ensamblar los polipeptidos de union proporcionados en el presente documento para dar constructos multimericos y seleccionar constructos multimericos que tienen propiedades mejoradas, tales como la capacidad mejorada para unirse a la molecula diana, o la capacidad mejorada para inhibir la funcion de tirosina cinasa receptora.
Las secuencias consenso del cribado de colecciones coleccionesde peptidos dclicos/lineales se han determinado basandose en las doce clases de polipeptidos de union a cMet espedficos mostrados en la tabla 6. En realizaciones espedficas, polipeptidos de union a cMet de la descripcion comprenden una o mas de estas secuencias. Tales polipeptidos de union a cMet preferidos incluyen polipeptidos con el potencial para formar una estructura dclica o de bucle entre los residuos de cistema invariantes que comprende.
Los polipeptidos descritos en el presente documento pueden tener aminoacidos adicionales unidos en cualquiera o ambos extremos N y C-terminales. En realizaciones preferidas, pueden prepararse polipeptidos de union segun la invencion que tienen peptidos flanqueantes N-terminales y/o C-terminales de uno o mas, preferiblemente dos, aminoacidos correspondientes a los peptidos flanqueantes del constructo de presentacion del selector de fago del
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
que se aislaron los polipeptidos de union. Los peptidos flanqueantes N-terminales preferidos incluyen Gly-Ser- (lo mas preferiblemente para secuencias de TN6), Ala-Gly- (lo mas preferiblemente para secuencias de TN8 y TN9), Gly-Ser- (lo mas preferiblemente para secuencias de TN10 y TN11), Gly-Asp- (lo mas preferiblemente para secuencias de TN12), Ala-Gln- (lo mas preferiblemente para secuencias lineales). Los peptidos flanqueantes C- terminales preferidos incluyen -Ala-Pro (lo mas preferiblemente para secuencias de TN6), -Gly-Thr (lo mas preferiblemente para secuencias de TN8 y TN9), -Ala-Pro (lo mas preferiblemente para secuencias de TN10 y TN11), -Asp-Pro (lo mas preferiblemente para secuencias de TN12), -Asp-Phe (lo mas preferiblemente para secuencias lineales). Tambien pueden anadirse aminoacidos terminales individuales a los polipeptidos de union de la invencion, y los aminoacidos terminales preferidos corresponderan al constructo de presentacion en fago parental, por ejemplo, lo mas preferiblemente, los aminoacidos N-terminales se seleccionaran de Gly- (lo mas preferiblemente para secuencias de TN6, TN8 y TN9), Ser- (lo mas preferiblemente para secuencias de TNlO y TNl1), Asp- (lo mas preferiblemente para secuencias de TN12) y Gln- (lo mas preferiblemente para secuencias lineales), y lo mas preferiblemente los aminoacidos C-terminales se seleccionaran de -Gly (lo mas preferiblemente para secuencias de TN6, TN8 y TN9 y lineales), -Ala (lo mas preferiblemente para secuencias de TN10 y TN11) y -Asp (lo mas preferiblemente para secuencias de TN12). Tambien se contemplan sustituciones conservativas (es decir, aminoacidos sustitutos seleccionados dentro de los siguientes grupos: {Arg, His, Lys}, {Glu, Asp}, {Asn, Cys, Glu, Gly, Ser, Thr, Tyr}, {Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val}) para tales aminoacidos flanqueantes.
El examen de la informacion de secuencia y los datos de union de los aislamientos de colecciones que contienen polipeptidos con el potencial para formar estructuras de bucle (por ejemplo, colecciones designadas como TN6, TN8, TN9, TN10, TN11 y TN12; el numero se refiere al numero de aminoacidos en la secuencia de cistema a cistema; adicionalmente, tambien se cribo la coleccion de presentacion lineal, LN20) identifica una serie adicional de polipeptidos de union a cMet. Se obtuvo un motivo consenso de este cribado inicial de una coleccion TN9 (CxGpPxFxC; SEQ ID NO:512). La secuencia consenso se derivo de las secuencias enumeradas en la tabla 6. Esta secuencia consenso junto con tendencias de secuencia en los peptidos de union a cMet identificados de la coleccion de peptidos lineales se uso para disenar una coleccion de segunda generacion que se uso en un cribado secundario. Se usaron secuencias de ambos cribados para identificar las doce clases de motivos de union a cMet enumerados en la tabla 6.
Otro aspecto de la presente invencion se refiere a modificaciones de los polipeptidos de la invencion para proporcionar agentes de obtencion de imagenes para proliferacion celular y/o angiogenesis espedficos marcando de manera detectable un polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico segun la presente invencion. Tal marcaje detectable puede implicar radiomarcaje, marcaje enzimatico o marcaje con micropartmulas o quelatos paramagneticos en RM; incorporacion en burbujas, micropartmulas, microesferas, emulsiones o liposomas para ultrasonidos; o conjugacion a colorantes opticos.
Se proporcionan procedimientos para aislar celulas que expresan cMet usando los presentes polipeptidos de union o constructo polipeptfdico multimerico.
Adicionalmente, los polipeptidos o constructos polipeptfdicos multimericos de union a cMet de la invencion pueden usarse como agentes terapeuticos, o bien solos en una composicion farmaceuticamente aceptable o bien conjugados a (o en combinacion con) otros agentes terapeuticos. Las composiciones pueden usarse para tratar enfermedades o estados que implican proliferacion celular, angiogenesis y/o curacion de heridas.
Cuando se usan como agentes terapeuticos, puede ser ventajoso potenciar el tiempo de residencia en suero de los peptidos. Esto puede lograrse: a) conjugando al peptido un resto, tal como maleimida, que reacciona con grupos sulfhidrilo libres en protemas sericas, tales como albumina serica, b) conjugando al peptido un resto, tal como un acido graso, que se une de manera no covalente a protemas sericas, especialmente albumina serica, c) conjugando al peptido un polfmero, tal como polietilenglicol (PEG), que se sabe que potencia el tiempo de residencia en suero, y d) fusionando ADN que codifica el peptido de union a cMet a aDn que codifica una protema serica tal como albumina serica humana o un anticuerpo y expresando la protema de fusion codificada.
Se proporcionan procedimientos de cribado de polipeptidos identificados mediante presentacion en fago por su capacidad para unirse a celulas que expresan la diana. Estos procedimientos permiten un cribado rapido de la capacidad de union de polipeptidos, incluyendo polipeptidos con afinidades monomericas que son demasiado bajas como para su evaluacion en ensayos de union celulares convencionales. Adicionalmente, estos procedimientos pueden usarse para evaluar rapidamente la estabilidad de los peptidos en presencia de suero.
En un caso, la presente divulgacion se refiere a un polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico que tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende Cys-Xi-Gly-X2-Pro-X3-Phe-X4-Cys, en la que X1, X2, X3 y X4 pueden ser cualquier aminoacido. En una realizacion particular, X2 es Pro.
En otra realizacion, los polipeptidos de la invencion comprenden ademas peptidos flanqueantes N-terminales y/o C- terminales de uno o mas aminoacidos. Por ejemplo, el polipeptido puede comprender una modificacion seleccionada del grupo que consiste en: una sustitucion de aminoacido y sustitucion de enlace amida, una sustitucion de D-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
aminoacido, un aminoacido glicosilado, una sustitucion de mimetico de disulfuro, una translocacion de aminoacido, un peptido retroinverso, un peptoide, un peptoide retroinverso y un peptido sintetico. En otra realizacion, cualquiera de los polipeptidos descritos en el presente documento puede conjugarse a un marcador detectable o un agente terapeutico, opcionalmente que comprende ademas un ligador o espaciador entre el polipeptido y el marcador detectable o el agente terapeutico. En una realizacion particular, el marcador detectable o el agente terapeutico se selecciona del grupo que consiste en: una enzima, un compuesto fluorescente, un liposoma, un colorante optico, un ion de metal paramagnetico, un agente de contraste para ultrasonidos y un radionuclido. En una realizacion particular, el agente terapeutico o marcador detectable comprende un radionuclido. Por ejemplo, el radionuclido puede ser uno o mas seleccionados del grupo que consiste en: 18F, 124I, 125I, 131I, 123I, 77Br, 76Br, 99mTc, 51Cr, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 51Cr, 167Tm, 141Ce, 111In, 168Yb, l75Yb, 140La, 90Y, 88Y, 153Sm, 166Ho, 165Dy, 166Dy, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 97Ru, 103Ru, 186Re, 188Re, 203Pb, 211Bi, 212Bi, 213Bi, 214Bi, 105Rh, 109Pd, 117mSn, 149Pm, 161Tb, 177Lu, 198Au y 199Au. En otra realizacion, el agente terapeutico o marcador detectable comprende ademas un quelante. Por ejemplo, el quelante puede comprender un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: las formulas 20, 21, 22, 23a, 23b, 24a, 24b y 25. En una realizacion particular, el radionuclido es 99mTc o 111In. En otra realizacion, el radionuclido se selecciona del grupo que consiste en: 177Lu, 90Y, 153Sm y 166Ho. En otra realizacion, el marcador detectable comprende un agente de contraste para ultrasonidos. Por ejemplo, el agente de contraste para ultrasonidos puede comprender una microburbuja estabilizada con fosfolfpido o un microglobo que comprende un gas, por ejemplo, un gas fluorado. En otra realizacion, el marcador detectable comprende un ion de metal paramagnetico y un quelante. Otro aspecto de la invencion se refiere a cualquiera de los polipeptidos de la invencion, en el que el agente terapeutico se selecciona del grupo que consiste en: un agente bioactivo, un agente citotoxico, un farmaco, un agente quimioterapico o un agente radioterapico. En otras realizaciones, el polipeptido tiene una Kd aparente para cMet del complejo cMet/HGF de menos de aproximadamente 10 pM, menos de aproximadamente 1,0 pM, menos de aproximadamente 0,1 pM o menos de aproximadamente 1 nM.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a un polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico que tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos de: clase 1: X1-X2-X3-Cys-X4-X5-X6-X7-Cys-X8-X9-X10 (TN6), en la que
X1 es Phe, Leu, Ser, Trp, Tyr o Met; X2 es Ile, Tyr, His, Thr o Asn;
X3 es Ile, Leu, Asp, Met, Phe o Ser; X4 es Arg, Asn, Glu, Pro o Trp;
X5 es Glu, Gly, Leu, Pro, Thr, Trp o Tyr;
X6 es Asp, Gln, Glu Gly, Phe, Ser, Thr o Trp;
X7 es Ala, Arg, Asn, Gln, Glu, Gly, Phe o Trp;
X8 es Gly, Asn, His, Arg, Met, Ile, Asp, Val o Thr;
X9 es Ser, Lys, Phe, Met, Thr, Asp o Leu; y X10 es Ser, Pro, Thr, Leu, Tyr, Asn, His, Gln o Trp.
En un caso, la presente divulgacion se refiere a un polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico que tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos de una de las siguientes clases:
clase II: X1-X2-X3-Cys-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Cys-X1Q-Xn-X12 (TN8), en la que
X1 es Gly, Val, Trp, Thr, Lys o Gln; X2 es Trp, Tyr, Leu, Phe o Thr;
X3 es Trp, Glu, Phe, Ile, Leu y Ser; X4 es Asn, Gln o Glu;
X5 es Leu, Glu o Trp;
X6 es Glu, Ser o Tyr;
X7 es Glu, Met o Pro;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Xg es Leu, Phe o Val;
X10 es Asp, Glu o Trp;
X11 es Met, Phe o Trp; y X12 es Gln, Leu o Trp; o
clase III: X1-X2-X3-Cys-X4-Gly-X5-Pro-X6-Phe-X7-Cys-X8-X9 (TN9), en la que X1 es Glu, Ser, Trp o Tyr;
X2 es Phe, Thr o Trp;
X3 es His, Phe o Trp;
X4 es Ala, Lys, Ser o Thr;
X5 es Pro o Trp;
X6 es Ser o Thr;
X7 es Glu o Ser;
X8 es Ile, Trp o Tyr; y X9 es Glu, Met, Trp o Tyr; o
clase IV-1: X1-X2-X3-Cys-X4-Gly-Pro-Pro-X5-Phe-X6-Cys-Trp-X7-X8-X9-X10-X11 (TN9), en la que X1 es Arg, Asp, Asn, Ile o Ser;
X2 es Leu, Ile, Phe, Trp o Val;
X3 es Asn, Gln, His, Leu, Tyr o Val;
X4 es Leu, Lys o Ser;
X5 es Ala, Ser, Thr o Trp;
X6 es Leu, Ser o Trp;
X7 es Leu, Ser o Trp;
X8 es Phe o Tyr;
X9 es Asp, Glu, Gly o Val;
X10 es Met, Pro, Thr o Ser; y X11 es Glu o Gly; o
clase IV-2: X1-X2-X3-X4-Trp-X5-Cys-Xg-Gly-Pro-Pro-Thr-Phe-Glu-Cys-Trp-X7-X8 (TN9), en la que X1 es Asp, Glu o Val;
X2 es Ala, Asp, Gly, Ser o Val;
X3 es Asp, Gly, Ser o Val;
X4 es Arg, Asn, Gly, Ser o Thr;
X5 es Gln o His;
X6 es Asn, Lys o Ser;
X7 es Ser o Trp; y X8 es Phe o Tyr; o
clase V: X1-X2-X3-Cys-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Xn-Cys-X12-X13-X14 (TN10), en la que
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
X2 es Ala, Arg, Glu, His, Lys o Phe;
X3 es Met, Phe, Pro, Thr o Val;
X4 es His, Leu, Met, Phe o Trp;
X5 es Arg, Asp, Glu, Gly, Met o Trp;
X6 es Glu, Gly, Ile, Lys, Phe o Pro;
X7 es Asp, Phe, Pro, Ser, Trp o Tyr;
X8 es Ala, Arg, Asn, Phe o Ser;
Xg es Ala, Gln, Gly, Leu o Phe;
X10 es Gln, Gly, Ile, Leu, Trp o Tyr;
X11 es Arg, Asp, Phe, Pro, Tyr o Val;
X12 es Asn, Gln, His, Ile o Thr;
X13 es Ala, Asn, Asp, Glu o His; y X14 es Asn, Gln, Glu, His o Val; o
clase VI: X1-X2-X3-Cys-X4-X5-X6-X7-X8-Xg-X10-X11-X12-Cys-X13-X14-X15, en la que
XI es Gln, Gly, Met, Phe o Ser;
X2 es Asn, Gln, Leu o Met;
X3 es Arg, Asn, Gly, His o Ile;
X4 es Asn, Asp, Leu, Thr o Trp;
X5 es Arg, Gln, Thr, Tyr o Val;
X6 es Glu, Gly, Leu, Met o Thr;
X7 es Ala, Asn, Asp, His, Ile, Leu o Ser;
X8 es Arg, Gln, Ser, Thr o Tyr;
Xg es Asp, Gly, Ile o Phe;
X10 es Gln, Phe o Thr;
XII es Gln, His, Phe, Pro, Ser o Tyr;
X12 es Asn, Asp, Phe, Pro o Ser;
X13 es Ala, Asn, Gly, Leu o Ser;
X14 es Arg, Pro, Ser o Val; y X15 es Asp, Glu, Leu o Met; o
clase VIII: X1-X2-X3-Cys-X4-X5-X6-X7-X8-Xg-X10-Xn-X12-X13-Cys-X14-X15-X16, en la que X1 es Ala, His, Leu, Phe o Tyr;
X2 es Arg, Asp, Leu, Ser o Tyr;
X3 es Glu, Met o Trp;
X4 es Asp, Gln, Glu, Phe o Ser;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
X6 es Asn, Asp o Ser;
X7 es Asn, Asp o Leu;
X8 es Asp, Glu o Lys;
Xg es Gly, Phe o Thr;
X10 es Gly, Phe, Trp o Tyr;
X11 es Glu, Ser o Trp;
X12 es Glu, Phe, Tyr o Val;
X13 es Glu, Lys, Thr o Val;
X14 es Glu o Trp;
X15 es Asp, Phe, Pro, Ser o Trp; y X16 es Ala, Asn o Ile; o
clase IX-1: Ser-Cys-X1-Cys-X2-Gly-Pro-Pro-Thr-Phe-Glu-Cys-Trp-Cys-Tyr-X3-X4-X5, en la que X1 es Asn, His o Tyr;
X2 es Gly o Ser;
X3 es Ala, Asp, Glu, Gly o Ser;
X4 es Ser o Thr; y X5 es Asp o Glu; o
clase IX-2: Glu-X1-Gly-Ser-Cys-His-Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Thr-Phe-Glu-Cys-X2-Cys-X3, en la que X1 es Ala, Glu, Gly o Ser;
X2 es Phe, Trp o Tyr; y X3 es Phe o Tyr.
En otra realizacion, la invencion se refiere a un polipeptido que tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos, en el que la secuencia de aminoacidos se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-10.
En otro caso, la divulgacion se refiere a un polipeptido o constructo polipeptidico multimerico que tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos, en el que la secuencia de aminoacidos comprende al menos seis aminoacidos de un tramo contiguo de nueve aminoacidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11-511. En un caso particular, el polipeptido, usado o bien como monomero o bien en un constructo multimerico, puede seleccionarse del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11-511, las SEQ ID NO: 11-47, las SEQ ID NO:48-101, las SEQ ID NO:102-364, las SEQ ID NO:365-370, las SEQ ID NO:371-387, SEQ ID NO:388 o SEQ ID NO:399, las SEQ ID NO:390-404, las SEQ ID NO:405-447, SEQ ID NO:448, las SEQ ID NO:449-496 y las SEQ ID NO:497-511.
En otro caso, la divulgacion se refiere a un procedimiento para aislar fagos que se unen a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF, que comprende las etapas de: inmovilizar cMet o un complejo que comprende cMet y HGF sobre un soporte solido; poner en contacto una coleccion de un posible fago de union a cMet o el complejo cMet/HGF con el soporte solido para unirse a cMet o fago de union a cMet/HGF en la coleccion; y retirar la parte no unida de la coleccion de fagos del soporte solido, aislando de ese modo fagos que se unen a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF.
En otro caso, la divulgacion se refiere a un procedimiento de deteccion de cMet o un complejo que comprende cMet y HGF en un sujeto animal o humano y opcionalmente obtener imagenes de al menos una parte del sujeto animal o humano que comprende las etapas de: marcar de manera detectable un polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico que tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende Cys-X1-Gly-X2-Pro-X3-Phe-X4-Cys, en la que X1, X2, X3 y X4 puede ser cualquier aminoacido; administrar al sujeto el polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico marcado; y, detectar el polipeptido o constructo marcado en el sujeto, y, opcionalmente, construir una imagen, detectando de ese modo cMet o un complejo que comprende cMet y HGF.
g
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En casos particulares, los procedimientos de la divulgacion engloban procedimientos en los que el marcador se selecciona del grupo que consiste en: una enzima, un compuesto fluorescente, un agente de contraste para ultrasonidos, un liposoma y un colorante optico, en los que el marcador opcionalmente comprende ademas un ligador y/o un espaciador. En casos particulares, el agente de contraste para ultrasonidos es una microburbuja estabilizada con fosfolfpido o un microglobo que comprende un gas, por ejemplo, un gas fluorado. En otros casos, el marcador es un marcador radiactivo o un atomo de metal paramagnetico, y opcionalmente comprende ademas un ligador o un espaciador. En otro caso, el marcador radiactivo comprende un radionuclido seleccionado del grupo que consiste en: 18F, 124I, 125I, 131I, 123I, 77Br, 76Br, 99mTc, 51Cr, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 51Cr, 167Tm, 141Ce, 111In, 168Yb, 175Yb,
140La, 90Y, 88Y, 153Sm 166Ho, 165Dy, 166Dy, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 97Ru, 103Ru, 186Re, 188Re, 203Pb, 211Bi, 212Bi, 213Bi, 214Bi,
105Rh, 109Pd, 117mSn, l49Pm, 161Tb, 177Lu, l98Au y 199Au. En otro caso, el marcador radiactivo comprende ademas un quelante, por ejemplo, quelantes seleccionados del grupo que consiste en: las formulas 20, 21, 22, 23a, 23b, 24a, 24b y 25. En otro caso, el radionuclido es 99mTc o 111In. En un caso particular, el marcador paramagnetico comprende un atomo de metal paramagnetico seleccionado del grupo que consiste en: Mn , Cu , Fe , Co , Ni , Gd3+, Eu3+, Dy3+, Pr3+, Cr3+, Co3+, Fe3+, Ti3+, Tb3+ , Nd3+, Sm3+, Ho +, Er3+, Pa4+ y Eu2+. En otro caso, el marcador paramagnetico comprende ademas un quelante, por ejemplo, un quelante se selecciona del grupo que consiste en: DTPA, DO3A, DOTA, EDTA, TETA, EHPG, HBED, NOTA, DOTMA, TETMA, PDTA, TTHA, LICAM y MECAM. En casos particulares, la deteccion del polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico marcado es indicativa de un trastorno hiperproliferativo. En otros casos, la deteccion del polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico marcado es indicativa de angiogenesis o neovascularizacion. En casos particulares, el marcador es un agente de contraste para ultrasonidos que comprende un gas fluorado seleccionado del grupo de: freones SF6, CF4, C2F6, C3F8, C4F10, CBrF3, CCI2F2, C2CIF5, CBrCIF2 y perfluorocarbonos. En casos particulares, el agente de contraste para ultrasonidos comprende un gas perfluorocarbonado que tiene la formula CnFn+2 en la que n es desde 1 hasta 12.
En otro caso, la divulgacion se refiere a un procedimiento de deteccion de cMet o un complejo que comprende cMet y HGF en un sujeto animal o humano y opcionalmente obtener imagenes de al menos una parte del sujeto animal o humano que comprende las etapas de: marcar de manera detectable un polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico que tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos, en el que la secuencia de aminoacidos comprende al menos seis aminoacidos de un tramo contiguo de nueve aminoacidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1511; administrar al sujeto el polipeptido o constructo marcado; y detectar el polipeptido o constructo marcado en el sujeto, y, opcionalmente, construir una imagen, detectando de ese modo cMet o un complejo que comprende cMet y HGF.
En otro caso, la divulgacion se refiere a un procedimiento de tratamiento de una afeccion que implica activacion de cMet, que comprende administrar a un sujeto animal o humano que necesita tratamiento para tal afeccion una composicion que comprende un polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico que tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende Cys-X1-Gly-X2-Pro-X3-Phe-X4-Cys, en la que X1, X2, X3 y X4 puede ser cualquier aminoacido. En otro caso, la invencion se refiere a un procedimiento de tratamiento de una afeccion que implica activacion de cMet, que comprende administrar a un sujeto animal o humano que necesita tratamiento para tal afeccion una composicion que comprende un polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico que tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos, en el que la secuencia de aminoacidos comprende al menos seis aminoacidos de un tramo contiguo de nueve aminoacidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-511. En un caso particular, la afeccion es crecimiento de tumor solido, por ejemplo, en el que el tumor se selecciona del grupo que consiste en de mama, tiroides, glioblastoma, prostata, mesotelioma maligno, colorrectal, hepatocelular, hepatobiliar, renal, osteosarcoma y cervicouterino. En un caso particular, el polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico puede conjugarse a un agente tumoricida.
En otra realizacion, la invencion se refiere a un bacteriofago recombinante que presenta uno cualquiera o mas de los polipeptidos o constructo polipeptfdico multimerico descritos en el presente documento o que tiene una cualquiera o mas de las secuencias consenso descritas en el presente documento, de tal manera que el fago tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF, y en el que el polipeptido se presenta en la superficie del bacteriofago recombinante.
En otra realizacion, la invencion se refiere a un agente de contraste para obtencion de imagenes por resonancia magnetica que comprende una composicion que comprende un polipeptido que tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-10.
En otro caso, la divulgacion se refiere a un agente de contraste para obtencion de imagenes por resonancia magnetica que comprende una composicion que comprende un polipeptido que tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende Cys-X1-Gly-X2-Pro-X3-Phe-X4-Cys, en la que X1, X2, X3 y X4 puede ser cualquier aminoacido, o en el que la secuencia de aminoacidos comprende al menos seis aminoacidos de un tramo contiguo de nueve aminoacidos de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11-511.
En una realizacion particular, el agente de contraste para obtencion de imagenes por resonancia magnetica comprende ademas al menos un atomo de metal paramagnetico, por ejemplo, al menos un quelante seleccionado del grupo que consiste en: DTPA, DOTA, EDTA, TETA, EHPG, HBED, NOTA, DOTMA, TETMA, PDTA, TTHA, LICAM y MECAM. En realizaciones particulares, el quelante se selecciona del grupo que consiste en: dietilentriamina, tetraazaciclododecano y un derivado sustituido con carboximetilo del mismo. En otras realizaciones, el atomo de metal paramagnetico se selecciona del grupo que consiste en: Mn , Cu , Fe , Co , Ni , Gd , Eu , Dy3+, Pr3+, Cr3+, Co3+, Fe3+, Ti3+, Tb3+, Nd3+, Sm3+ , Ho3+, Er3+, Pa4+ y Eu2+. En una realizacion particular, el cation
multivalente es Gd3+.
En otro caso, la divulgacion se refiere a un procedimiento para identificar compuestos de union a cMet o el complejo cMet/HGF que comprende las etapas de: utilizar un polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico de union a cMet o el complejo cMet/HGF que tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende Cys-X-i-Gly-X2-Pro-X3-Phe-X4-Cys, en la que X1, X2, X3 y X4 pueden ser cualquier aminoacido, para formar un complejo con una diana de cMet o el complejo cMet/HGF; poner en contacto el complejo con uno o mas posibles compuestos de union a cMet o el complejo cMet/HGF; y determinar si el posible compuesto de union a cMet o el complejo cMet/HGF compite con el polipeptido de union a cMet o el complejo cMet/HGF para formar un complejo con la diana de cMet o el complejo cMet/HGF.
En una realizacion, la invencion se refiere a un agente de contraste para obtencion de imagenes de diagnostico que comprende un polipeptido que tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-10.
En un caso, la divulgacion se refiere a un agente de contraste para obtencion de imagenes de diagnostico que comprende un polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico que tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende Cys-X-i-Gly- X2-Pro-X3-Phe-X4-Cys, en la que X1, X2, X3 y X4 pueden ser cualquier aminoacido, o en el que la secuencia de aminoacidos comprende al menos seis aminoacidos de un tramo contiguo de nueve aminoacidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11-511.
En otro caso, la divulgacion se refiere a un procedimiento de obtencion de imagenes medicas que comprende las etapas de administrar a un sujeto animal o humano una preparacion farmaceutica de un agente de contraste que comprende al menos un polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico que tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende Cys-X-i- Gly-X2-Pro-X3-Phe-X4-Cys, en la que X1, X2, X3 y X4 puede ser cualquier aminoacido, y obtener imagenes del agente de contraste mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en: obtencion de imagenes por resonancia magnetica, obtencion de imagenes por ultrasonidos, obtencion de imagenes opticas, obtencion de imagenes por sonoluminiscencia, obtencion de imagenes fotoacusticas y obtencion de imagenes nucleares. En otro caso, la secuencia de aminoacidos comprende al menos seis aminoacidos de un tramo contiguo de nueve aminoacidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-511, y obtencion de imagenes el agente de contraste mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en: obtencion de imagenes por resonancia magnetica, obtencion de imagenes por ultrasonidos, obtencion de imagenes opticas, obtencion de imagenes por sonoluminiscencia, obtencion de imagenes fotoacusticas y obtencion de imagenes nucleares.
En otro caso, la divulgacion se refiere a un procedimiento de radioterapia que comprende administrar a un sujeto animal o humano que necesita tal terapia un compuesto que comprende al menos un polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico que tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende Cys-X1-Gly-X2-Pro-X3-Phe-X4-Cys, en la que X1, X2, X3 y X4 puede ser cualquier aminoacido, o en el que la secuencia de aminoacidos comprende al menos seis aminoacidos de un tramo contiguo de nueve aminoacidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-511, conjugada a un radionuclido util para radioterapia. En un caso particular, el compuesto comprende ademas un quelante, por ejemplo, un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: las formulas 20, 21, 22, 23a, 23b, 24a, 24b y 25. En otra realizacion, el compuesto comprende ademas un espaciador o ligador. En una realizacion particular, el radionuclido puede ser 186Re, 188Re, 177Lu, 90Y, 153Sm o 166Ho.
En otro caso, la divulgacion se refiere a un kit para la preparacion de un producto radiofarmaceutico que comprende un polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico que tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende Cys-X-i-Gly-X2-Pro-X3-Phe- X4-Cys, en la que X1, X2, X3 y X4 puede ser cualquier aminoacido, o en el que la secuencia de aminoacidos comprende al menos seis aminoacidos de un tramo contiguo de nueve aminoacidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-511, un quelante para un radionuclido, y un agente reductor.
En otro caso, la divulgacion se refiere a un procedimiento de dirigir material genetico a celulas que expresan cMet que comprende administrar a un animal o un humano que necesita tal material genetico un polipeptido o constructo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
polipeptidico multimerico que tiene la capacidad para unirse a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende Cys-X1-Gly-X2-Pro-X3-Phe-X4-Cys, en la que X1, X2, X3 y X4 puede ser cualquier aminoacido, o en el que la secuencia de aminoacidos comprende al menos seis aminoacidos de un tramo contiguo de nueve aminoacidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-511, conjugada a o asociada con el material genetico o un vetnculo de administracion que contiene tal material genetico.
En otro caso, la divulgacion se refiere a un procedimiento de cribado de polipeptidos de union identificados mediante presentacion en fago por su capacidad para unirse a celulas que expresan la diana de cMet o cMet/HGF que comprende las etapas de preparar constructos multimericos que incluyen uno o mas polipeptidos de union; poner en contacto los constructos multimericos con celulas que expresan la diana y evaluar la capacidad de los constructos multimericos para unirse a la diana. En un caso particular, las celulas pueden modificarse por ingeniena mediante tecnologfa de ADN recombinante para expresar la diana. En otro caso, los constructos multimericos pueden marcarse de manera detectable. En otro caso, la capacidad de los constructos multimericos para unirse a la diana se evalua en presencia de suero. En otro caso, el constructo multimerico puede comprender polipeptidos de union biotinilados complejados con avidina, estreptavidina o neutravidina.
Breve descripcion de los dibujos
Las figuras 1A-1C son representaciones de mimeticos, que pueden emplearse para imitar motivos estructurales y caractensticas de giro en un peptido y proporcionar simultaneamente estabilidad frente a proteolisis y potenciar otras propiedades (estructura 1A: Hart, S. y Etzkorn, F., 1999. J. Org. Chem., 64:2998-2999; estructura 1B: Hanessian, S. y McNaughton-Smith, G., “Synthesis of a Versatile Peptidomimetic Scaffold” en Methods in Molecular Medicine, Vol. 23: Peptidomimetics Protocols, W. Kazmierski, Ed. (Humana Press Inc., Totowa, N.J., 1999), Capttulo 10, pags. 161174; estructura 1C: WO 01/16135.
La figura 2 es una representacion de los aminoacidos (4), que contiene una funcion aminoalcohol, y (5) que contiene una funcion alcoxiamino.
La figura 3 es una representacion que muestra la ciclacion de cistema con una funcion bromoacetamida colgante (este procedimiento se denomina en el presente documento “esquema 1”).
La figura 4 es una representacion que muestra la ciclacion intramolecular de funciones aldehfdo y funciones aminomercaptano vecinales ubicadas adecuadamente para proporcionar tiazolidinas que dan como resultado la formacion de un peptido bidclico, del que un anillo esta formado por los residuos en la cadena principal, y siendo el segundo anillo, el anillo de tiazolidina (este procedimiento se denomina en el presente documento “esquema 2”).
La figura 5 es una representacion que muestra como puede actuar una funcion lactama, disponible mediante acoplamiento intramolecular a traves de reactivos de acoplamiento peptfdico convencionales (tales como HATU, PyBOP, etc.) como sustituto para el enlace disulfuro. Se muestra el enfoque de Dde/Dmab (y se denomina en el presente documento “esquema 3”).
La figura 6 es una representacion que muestra la reaccion de Grubbs (denominada en el presente documento “esquema 4”).
Las figuras 7A y 7B son estructuras qrnmicas de restos de fosfolfpido.
Las figuras 8A-F muestran estructuras de quelantes de metal preferidos.
La figura 9 es una representacion esquematica de la estrategia de seleccion que se empleo para identificar polipeptidos de union a cMet. TEA = trietilamina, infeccion con perlas = captura de fago no eluido que permanecio unido a las perlas de cMet-Fc/protema-A.
La figura 10 ilustra las propiedades inhibidoras del crecimiento del peptido de union a cMet, SEQ ID NO:365.
La figura 11 muestra un diagrama esquematico para la preparacion de SEQ ID NO:514 conjugada a un resto de 6- PnAO-Glut, (denominado en el presente documento “esquema 5”).
La figura 12 muestra un diagrama esquematico para la preparacion de un heterodfmero que contiene las SEQ ID NO: 514 y 515 unidas mediante un ligador K(PnAO6-Glut) (denominado en el presente documento “esquema 5”).
Las figuras 13A-13C muestran las estructuras qrnmicas de tres heterodfmeros siguientes: La figura 13A muestra la SEQ ID NO:514 unida a la SEQ ID NO:515 (Ac-GSPEMCMMFPFLYPCNHHAPGGGK {PnAO6-Glut-K[Ac- GSFFPCWRIDRFGYCHANAPGGGKJJ-Glut]-NH2}-NH2); la figura 13B muestra la SEQ ID NO:515 unida a la SEQ ID NO:516 (Ac-GSFFPCWRIDRFGYCHANAPGGGK{PnAO6-Glut-K[Ac-AQEWEREYFVDGFWGSWFGIPHGGGK(JJ- Glut)-NH2]}-NH2); y la figura 13C muestra SEQ ID NO:514 unida a SEQ ID NO:517 (Ac-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
GSPEMCMMFPFLYPCNHHAPGGGK{PnAO6-Glut-K[Ac-GDYSECFFEPDSFEVKCYDRDPGGGK(JJ-Glut)-NH2]}-
NH2).
La figura 14 es una representacion grafica de datos que muestran la union de derivados de SEQ ID NO:514 con diferente longitud de espaciador y biotina. Los derivados no tienen ningun espaciador, tienen un espaciador J y dos espaciadores J respectivamente entre la secuencia de direccionamiento y biotina.
Descripcion detallada de la invencion
Sigue una descripcion de realizaciones preferidas de la invencion.
La presente invencion proporciona nuevos restos de union que se unen al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (“HGFr” o “cMet”) tal como se define en las reivindicaciones. Tales restos de union hacen posible la deteccion, obtencion de imagenes y localizacion eficaces de celulas activadas que muestran la expresion de cMet regulada por incremento y la union de HGF a cMet. Tales celulas activadas son iniciadores de la proliferacion celular, y por tanto los polipeptidos descritos en el presente documento proporcionan un medio de deteccion, monitorizacion y localizacion de sitios de proliferacion. En particular, los restos de union de esta invencion, que incluyen polipeptidos y constructos polipeptfdicos multimericos, cuando se marcan apropiadamente, son utiles para la deteccion, obtencion de imagenes y localizacion de tumores u otros trastornos proliferativos que resultan de la proliferacion celular desregulada (por ejemplo, cancer). Por tanto, los polipeptidos de union y constructos polipeptfdicos multimericos de la invencion pueden usarse para formar una variedad de agentes de diagnostico y terapeuticos para diagnosticar y tratar el crecimiento de tumor neoplasico u otros trastornos proliferativos. Ademas, los polipeptidos de union y constructos polipeptfdicos multimericos pueden usarse en sf mismos como agentes terapeuticos.
Se aislaron polipeptidos de union a cMet espedficos segun la presente invencion inicialmente mediante el cribado de colecciones de presentacion en fago, es decir, poblaciones de bacteriofago recombinante transformadas para expresar un peptido exogeno en su superficie. Para aislar nuevos restos de union a polipeptido para una diana particular, tal como cMet, es especialmente ventajoso el cribado de grandes colecciones de peptidos, por ejemplo usando tecnicas de presentacion en fago, en la que pueden someterse a prueba numeros muy grandes (por ejemplo, 5 x 109) de posibles agentes de union y aislarse los agentes de union satisfactorios en un corto periodo de tiempo.
Para preparar una coleccion de fagos de presentacion de polipeptidos para cribar polipeptidos de union tales como polipeptidos de union a cMet y/o polipeptidos que se unen a un complejo que comprende HGF unido a cMet, se selecciona un dominio de union candidato para que sirva como molde estructural para los peptidos que van a presentarse en la coleccion. La coleccion de fagos esta compuesta por una multiplicidad de analogos del molde o dominio parental. El molde de dominio de union puede ser una protema que se produce de manera natural o sintetica, o una region o un dominio de una protema. El molde de dominio de union puede seleccionarse basandose en el conocimiento de una interaccion conocida entre el molde de dominio de union y la diana de union, pero esto no es cntico. De hecho, no es esencial que el dominio seleccionado actue como molde para la coleccion o tenga cualquier afinidad por la diana en absoluto; su proposito es proporcionar una estructura a partir de la que pueda generarse una multiplicidad (coleccion) de polipeptidos de estructura similar (analogos), multiplicidad de analogos que incluira uno o mas analogos que presentan las propiedades de union deseadas (y cualquier otra propiedad cribada).
Al seleccionar el molde o dominio de union parental en el que basar las secuencias de aminoacidos variadas de la coleccion, una importante consideracion es como se presentaran los dominios peptfdicos variados a la diana, es decir, en que conformacion entraran en contacto los analogos peptfdicos con la diana. En las metodologfas de presentacion en fago, por ejemplo, se generan los analogos mediante insercion de ADN sintetico que codifica los analogos en el fago, lo que da como resultado la presentacion del analogo en las superficies del fago. Tales colecciones de fagos, tales como fago M13, que presentan una amplia variedad de diferentes polipeptidos, puede prepararse usando tecnicas tal como se describe, por ejemplo, en Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual (Academic Press, Inc., San Diego, 1996) y el documento US 5.223.409 (Ladner et al.), incorporados en el presente documento como referencia.
Al aislar los polipeptidos espedficos segun esta invencion, se cribaron inicialmente siete colecciones de peptidos dclicos (o de “bucle”), designadas como TN6, TN7, TN8, TN9, TN10, TN11, TN12, y una coleccion lineal, designada como LN20. Cada coleccion se construyo para la expresion de polipeptidos diversificados en el fago M13. Las siete colecciones que tienen una designacion “TN” se disenaron para presentar un bucle de peptido exogeno variado, corto de 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 aminoacidos, respectivamente, en la superficie del fago M13, en el extremo aminoterminal de la protema III. Las colecciones se designan como TN6 (que tiene una posible diversidad de secuencia de aminoacidos de 3,3 x 1012), TN7 (que tiene una posible diversidad de secuencia de aminoacidos de 1,2 x 1014), TN8 (que tiene una posible diversidad de secuencia de aminoacidos de 2,2 x 1015), TN9 (que tiene una posible diversidad de secuencia de aminoacidos de 4,2 x 1016), TN10 (que tiene una posible diversidad de secuencia de aminoacidos de 3,0 x 1016), TN11 (que tiene una posible diversidad de secuencia de aminoacidos de 1,5 x 1019),
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
TN12 (que tiene una diversidad de secuencia de 4,6 x 1019) y LN20 (que tiene una posible diversidad de secuencia de aminoacidos de 3,8 x 1025).
La coleccion TN6 se construyo para presentar un unico bucle de union a microprotema contenido en un molde de 12 aminoacidos. La coleccion TN6 utilizo una secuencia de molde de Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Cys - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12. Los aminoacidos en las posiciones 2, 3, 5, 6, 7, 8, 10 y 11 del molde se variaron para permitir cualquier aminoacido excepto cistema (Cys). Los aminoacidos en las posiciones 1 y 12 del molde se variaron para permitir cualquier aminoacido excepto cistema (Cys), acido glutamico (Glu), isoleucina (Ile), lisina (Lys), metionina (Met) y treonina (Thr).
La coleccion TN7 se construyo para presentar un unico bucle de union a microprotema contenido en un molde de 13 aminoacidos. La coleccion TN7 utilizo una secuencia de molde de Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Cys - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13. Los aminoacidos en las posiciones de aminoacido 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 y 13 del molde se variaron para permitir cualquier aminoacido excepto cistema (Cys).
La coleccion TN8 se construyo para presentar un unico bucle de union a microprotema contenido en un molde de 14 aminoacidos. La coleccion TN8 utilizo una secuencia de molde de Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Cys - Xaa12 - Xaa13 - Xaa14. Los aminoacidos en las posiciones 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12,
13 y 14 en el molde se variaron para permitir cualquier aminoacido excepto cistema (Cys).
La coleccion TN9 se construyo para presentar un unico bucle de union a microprotema contenido en un molde de 15 aminoacidos. La coleccion TN9 utilizo una secuencia de molde Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Cys - Xaa13 - Xaa14 - Xaa15. Los aminoacidos en las posiciones 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14 y 15 en el molde se variaron para permitir cualquier aminoacido excepto cistema (Cys).
La coleccion TN10 se construyo para presentar un unico bucle de union a microprotema contenido en un molde de 16 aminoacidos. La coleccion TN10 utilizo una secuencia de molde Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 -Xaa9 -Xaa10 -Xaa11 -Xaa12 - Cys -Xaa14 -Xaa15 -Xaa16. Los aminoacidos en las posiciones 1, 2, 15 y
16 en el molde se variaron para permitir cualquier aminoacido seleccionado de un grupo de 10 aminoacidos: D, F, H, L, N, P, R, S, W o Y). Los aminoacidos en las posiciones 3 y 14 en el molde se variaron para permitir cualquier aminoacido seleccionado de un grupo de 14 aminoacidos: A, D, F, G, H, L, N, P, Q, R, S, V, W o Y). Los aminoacidos en las posiciones 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 en el molde se variaron para permitir cualquier aminoacido excepto cistema (Cys).
La coleccion TN11 se construyo para presentar un unico bucle de union a microprotema contenido en un molde de
17 aminoacidos. La coleccion TN11 utilizo una secuencia de molde Xaa1 -Xaa2 - Xaa3 - Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13-Cys -Xaal5 - Xaal6 - Xaa17. Los aminoacidos en las posiciones 1 a traves de 3, 5 a traves de 13 y 15 a traves de 17 en el molde se variaron para permitir cualquier aminoacido excepto cistema (Cys).
La coleccion TN12 se construyo para presentar un unico bucle de union a microprotema contenido en un molde de
18 aminoacidos. La coleccion TN12 utilizo una secuencia de molde Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Cys - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaa11 - Xaa12 - Xaa13 - Xaa14 - Cys-Xaa16 - Xaa17 - Xaa18. Los aminoacidos en las posiciones 1, 2, 17 y 18 en el molde se variaron para permitir cualquier aminoacido seleccionado de un grupo de 12 aminoacidos: A, D, F, G, H, L, N, P, R, S, W o y). Los aminoacidos en las posiciones 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14 y 16 se variaron para permitir cualquier aminoacido excepto cistema (Cys).
La coleccion LN20 se construyo para presentar multiples peptidos lineales en la superficie de un fago. Cada fago, sin embargo, presenta multiples copias de la misma secuencia. Por tanto, un unico fago presentara, por ejemplo, cinco copias de una secuencia particular, un fago diferente presentara, por ejemplo, cinco copias de una secuencia diferente, etc. Los peptidos lineales se proporcionan en un molde de 20 aminoacidos. Los aminoacidos en cada posicion en el molde se variaron para permitir cualquier aminoacido excepto cistema (Cys).
Los polipeptidos de union proporcionados en el presente documento pueden incluir adiciones o truncamientos en los extremos N y/o C-terminal. Se espera que tales polipeptidos de union modificados se unan a cMet. Por ejemplo, un ligador -GGGk (SEQ ID NO:513) puede estar presente en el extremo N-terminal de los polipeptidos de union proporcionados en el presente documento. Podnan usarse otros ligadores, tales como -GSGK(sEq ID NO:651), o - GSGSK(SEQ ID NO:652). Se espera que polipeptidos de union que comprenden la parte de bucle de los moldes y secuencias proporcionados en el presente documento se unan a cMet. La parte de bucle de los moldes y secuencias incluye las secuencias entre e incluyendo los dos residuos de cistema que se espera que formen un enlace disulfuro, generando de ese modo una estructura de bucle peptfdico. Ademas, los polipeptidos de union de la presente invencion pueden incluir residuos de aminoacido adicionales en los extremos N y/o C-terminal.
Las colecciones de presentacion en fago se crearon realizando una serie designada de mutaciones o variaciones dentro de una secuencia codificante del molde polipeptfdico, codificando cada secuencia mutante un analogo peptfdico correspondiente en estructura global al molde excepto porque tiene una o mas variaciones de aminoacido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
en la secuencia del molde. El ADN variado novedoso (mutado) proporciona diversidad de secuencia, y cada fago transformante presenta una variante de la secuencia de aminoacidos de molde inicial codificada por el ADN, que conduce a una poblacion de fagos (coleccion) que presenta un amplio numero de secuencias de aminoacidos diferentes pero estructuralmente relacionadas. Se espera que las variaciones de aminoacido alteren las propiedades de union del dominio o peptido de union sin alterar significativamente su estructura, al menos para la mayor parte de sustituciones. Se prefiere que las posiciones de aminoacido que se seleccionan para variacion (posiciones de aminoacido variables) sean posiciones de aminoacido de superficie, es decir, posiciones en la secuencia de aminoacidos de los dominios que, cuando el dominio esta en su conformacion mas estable, aparecen en la superficie exterior del dominio (es decir, la superficie expuesta a la disolucion). Lo mas preferiblemente, las posiciones de aminoacido que van a variarse seran adyacentes o proximas entre sf, de modo que se maximice el efecto de las sustituciones.
Tal como se indico previamente, las tecnicas comentadas en Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual (Academic Press, Inc., San Diego, 1996) y el documento US 5.223.409 son particularmente utiles en la preparacion de una coleccion de posibles agentes de union correspondientes al molde parental seleccionado. Se prepararon colecciones tal como se comento anteriormente segun tales tecnicas, y se seleccionaron polipeptidos de union a cMet frente a una diana inmovilizada, tal como se explica en los siguientes ejemplos.
En un cribado tfpico, se pone en contacto una coleccion de fagos con y se permite que se unan a la diana, o un subcomponente particular de la misma. Para facilitar la separacion de agentes de union y agentes sin union, es conveniente inmovilizar la diana sobre un soporte solido. Los fagos que portan un resto de union a la diana forman un complejo con la diana sobre el soporte solido, mientras que los fagos sin union permanecen en disolucion y pueden eliminarse por lavado con tampon en exceso. Entonces se liberan los fagos unidos de la diana cambiando el tampon a un pH extremo (pH 2 o pH 10), cambiando la fuerza ionica del tampon, anadiendo desnaturalizantes, u otros medios conocidos. Para aislar los fagos de union que muestran los polipeptidos de la presente invencion, se realiza una elucion de protema, es decir, se eluyen algunos fagos de la diana usando HGF en disolucion (elucion competitiva). Adicionalmente, por ejemplo, se capturaron fagos de muy alta afinidad que no pudieron desplazarse por competencia durante incubacion con HGF por la noche usando el fago todavfa unido a sustrato para infeccion de celulas de E. coli.
Los fagos recuperados pueden amplificarse entonces a traves de infeccion de celulas bacterianas y el proceso de cribado puede repetirse con la nueva combinacion que esta empobrecida ahora en agentes sin union y enriquecida en agentes de union. La recuperacion incluso de unos pocos fagos de union es suficiente para llevar el proceso a completarse. Despues de unas cuantas tandas de seleccion, las secuencias genicas que codifican los restos de union derivados de clones de fagos seleccionados en la combinacion de union se determinan mediante procedimientos convencionales, descritos a continuacion, que revelan la secuencia peptfdica que confiere afinidad de union del fago a la diana. Cuando funciona el proceso de seleccion, la diversidad de secuencia de la poblacion disminuye con cada tanda de seleccion hasta que quedan los agentes de union deseados. Las secuencias convergen en un pequeno numero de agentes de union relacionados, normalmente 10-50 de aproximadamente 109 a 1010 candidatos originales de cada coleccion. Un aumento del numero de fagos recuperados en cada tanda de seleccion, y naturalmente, la recuperacion de secuencias estrechamente relacionadas, son buenas indicaciones de que se ha producido convergencia de la coleccion en un cribado. Despues de identificarse un conjunto de polipeptidos de union, la informacion de secuencia puede usarse para disenar otras colecciones de fagos secundarias, sesgadas para miembros que tienen propiedades deseadas adicionales.
La formacion del bucle de union a disulfuro es ventajosa porque conduce a un aumento de afinidad y especificidad por tales peptidos. Sin embargo, en suero, el enlace disulfuro puede abrirse por cistemas libres u otras moleculas que contienen tiol. Por tanto, podna ser util modificar los residuos de cistema para reemplazar la reticulacion de disulfuro por otra union menos reactiva: la reticulacion -CH2-S-S-CH2- tiene una geometna preferida en la que el enlace diedrico entre azufres es proximo a 90 grados, pero la geometna exacta esta determinada por el contexto de otros grupos laterales y el estado de union de la molecula. Las modificaciones preferidas de la reticulacion de cierre del bucle de union conservaran en la medida de lo posible los angulos y las longitudes de enlace globales. Tales reticulaciones alternativas adecuadas incluyen uniones tioeter tales como -CH2-SCH2- CH2-, -CH2-CH2-S-CH2-, -CH2- CH2-S-CH2-CH2-; uniones lactama o amida tales como -CH2-NH-CO-CH2- y -CH2-CO-NH-CH2-; uniones eter tales como -CH2-CH2-O-CH2-CH2-; puentes de alquileno tales como -(CH2V (en el que n = 4, 5 o 6); la union -CH2-NH- CO-NH-CH2-, y grupos similares conocidos en la tecnica.
Aunque los polipeptidos que contienen un bucle de union con uniones disulfuro estable son los mas preferidos, pueden prepararse facilmente polipeptidos lineales derivados de las secuencias anteriores, por ejemplo, mediante sustitucion de uno o ambos residuos de cistema, que pueden conservar al menos parte de la actividad de union a cMet del polipeptido original que contiene la union disulfuro. Al realizar tales sustituciones por Cys, se prefieren los aminoacidos Gly, Ser y Ala, y tambien se prefiere sustituir ambos residuos de Cys, de modo que no se deje una unica Cys que podna provocar que dimerice el polipeptido o reaccione con otros grupos tiol libres en una disolucion.
La smtesis directa de los polipeptidos de la invencion puede lograrse usando tecnicas convencionales, incluyendo smtesis peptfdica en fase solida, smtesis en fase de disolucion, etc. Se prefiere la smtesis en fase solida (vease, por
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (W. H. Freeman Co., San Francisco, 1989); Merrifield, J., 1963, Am. Chem. Soc., 85:2149-2154; Bodanszky y Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, Nueva York, 1984)).
Tambien pueden prepararse polipeptidos segun la invencion comercialmente por empresas que proporcionan la smtesis peptidica como servicio (por ejemplo, BACHEM Bioscience, Inc., King of Prussia, PA; Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkinton, MA).
Tambien estan disponibles maquinas de smtesis peptidica automatizada, tales como las fabricadas por Perkin-Elmer Applied Biosystems.
El compuesto polipeptfdico se purifica preferiblemente despues de haberse aislado o sintetizado mediante tecnicas o bien qmmicas o bien recombinantes. Con propositos de purificacion, hay muchos procedimientos convencionales que pueden emplearse, incluyendo cromatograffa de lfquidos de alta presion de fase inversa (RP-HPLC) usando una columna de sflice alquilada tal como sflice C4, Ca o C18. Generalmente se usa una fase movil en gradiente de contenido organico creciente para lograr la purificacion, por ejemplo, acetonitrilo en un tampon acuoso, que contiene habitualmente una pequena cantidad de acido trifluoroacetico. Tambien puede usarse cromatograffa de intercambio ionico para separar peptidos basandose en su carga. El grado de pureza del polipeptido puede determinarse mediante diversos procedimientos, incluyendo la identificacion de un gran pico principal en HPLC. Se prefiere un polipeptido que produce un unico pico que es al menos el 95 % del material de introduccion en una columna de HPLC. Se prefiere incluso mas un polipeptido que produce un unico pico que es al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o incluso el 99,5 % o mas del material de introduccion en una columna de HPLC.
Para garantizar que el peptido obtenido usando cualquiera de las tecnicas descritas anteriormente es el peptido deseado para su uso en composiciones de la presente invencion, puede llevarse a cabo el analisis de la composicion peptfdica. Tal analisis de composicion puede llevarse a cabo usando espectrometna de masas de alta resolucion para determinar el peso molecular del peptido. Alternativamente, el contenido de aminoacidos del peptido puede confirmarse hidrolizando el peptido en acido acuoso, y separando, identificando y cuantificando los componentes de la mezcla usando HPLC, o un analizador de aminoacidos. Tambien puede usarse secuenciadores de protemas que degradan secuencialmente el peptido e identifican los aminoacidos en orden, para determinar la secuencia del peptido.
Tambien pueden producirse polipeptidos de union a cMet segun la presente invencion usando tecnicas de ADN recombinante, que utilizan acidos nucleicos (polinucleotidos) que codifican los polipeptidos segun esta invencion y que los expresan luego de manera recombinante, es decir, manipulando celulas huesped mediante la introduccion de moleculas de acido nucleico exogeno de modos conocidos para hacer que tales celulas huesped produzcan los polipeptidos de union a cMet deseados. Tales procedimientos estan dentro de las capacidades de los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)). La produccion recombinante de peptidos cortos, tales como los descritos en el presente documento, podna no ser practica en comparacion con la smtesis directa, sin embargo pueden ser muy ventajosos medios de produccion recombinantes en los que se incorpora un resto de union a cMet de esta invencion en un polipeptido tnbrido o una protema de fusion.
En la practica de la presente invencion, una determinacion de la afinidad del resto de union a cMet para cMet con relacion a otra protema o diana es una medida util, y se denomina especificidad por cMet. Los ensayos convencionales para cuantificar la union y determinar la afinidad incluyen dialisis de equilibrio, union de equilibrio, filtracion en gel, o la monitorizacion de numerosos cambios espectroscopicos (tales como un cambio en la polarizacion de fluorescencia) que resultan de la interaccion del resto de union y su diana. Estas tecnicas miden la concentracion de ligando unido y libre en funcion de la concentracion de ligando (o protema). La concentracion de polipeptido unido ([Unido]) se refiere a la concentracion de polipeptido libre ([Libre]) y la concentracion de sitios de union para el polipeptido, es decir, en cMet, (N), tal como se describe en la siguiente ecuacion:
[Unido] = N x [Libre]/((1/Ka)+[Libre]).
Una solucion de los datos de esta ecuacion produce la constante de asociacion, Ka, una medida cuantitativa de la afinidad de union. La constante de asociacion, Ka es la inversa de la constante de disociacion, Kd. La Kd se notifica mas frecuentemente en mediciones de afinidad. Los polipeptidos de union a cMet preferidos tienen una Kd para cMet en el intervalo de, por ejemplo, menos de 1 nanomolar (nM), 1 nM a 100 micromolar (|iM), que incluye valores de Kd de menos de 10 nM, menos de 20 nM, menos de 40 nM, menos de 60 nM, menos de 80 nM, menos de 1 |iM, menos de 5 |iM, menos de 10 |iM, menos de 20 |iM, menos de 40 |iM, menos de 60 |iM y menos de 80 |iM.
Cuando se emplean restos de union a cMet como agentes de obtencion de imagenes, otros aspectos de especificidad de union se vuelven importantes; los agentes de obtencion de imagenes operan en un sistema dinamico en el que la union del agente de obtencion de imagenes a la diana (cMet, por ejemplo, en celulas activadas) podna no estar en un estado de equilibrio estable en la totalidad del procedimiento de obtencion de imagenes. Por ejemplo, cuando el agente de obtencion de imagenes se inyecta inicialmente, la concentracion de agente de obtencion de imagenes y de complejo agente-diana aumentan rapidamente. Poco despues de la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
inyeccion, sin embargo, el agente de obtencion de imagenes circulante (libre) comienza a eliminate a traves de los rinones o el hugado, y la concentracion plasmatica de agente de obtencion de imagenes comienza a disminuir. Esta disminucion de la concentracion de agente de obtencion de imagenes libre en el plasma provoca eventualmente que se disocie el complejo agente-diana. La utilidad de un agente de obtencion de imagenes depende de la diferencia en la velocidad de disociacion de agente-diana con relacion a la velocidad de eliminacion del agente. Idealmente, la velocidad de disociacion sera lenta en comparacion con la velocidad de eliminacion, lo que da como resultado un largo tiempo de obtencion de imagenes durante el cual hay una alta concentracion de complejo agente-diana y una baja concentracion de agente de obtencion de imagenes libre (senal de fondo) en el plasma.
La medicion cuantitativa de velocidades de disociacion puede realizarse usando varios procedimientos conocidos en la tecnica, tales como fluorimetna con fibra optica (vease, por ejemplo, Anderson y Miller, 1988, Clin. Chem., 34:1417-21), resonancia de plasmon superficial (veanse, por ejemplo, Malmborg et al., 1996, J. Immunol. Methods, 198:51-7; y Schuck, 1997, Curr. Op. Biotechnol., 8:498-502), espejo resonante y grnas de ondas planas acopladas a rejillas (vease, por ejemplo, Hutchinson, 1995, Molec. Biotechnol., 3:47-54). Estan disponibles comercialmente biosensores automatizados para medir la cinetica de union: sensor de resonancia de plasmon superficial de BIAcore (Biacore AB, Uppsala SE), sensor de espejo resonante de lAsys (Fisons Applied Sensor Technology, Cambridge GB), BIOS-1 sensor de grnas de ondas planas acopladas a rejillas (Artificial Sensor Instruments, Zurich CH).
Procedimientos de cribado de polipeptidos identificados mediante presentacion en fago por su capacidad para unirse a celulas que expresan la diana
Se proporcionan procedimientos de cribado de polipeptidos de union identificados mediante presentacion en fago por su capacidad para unirse a celulas que expresan la diana (y no a celulas que no expresan la diana). Estos procedimientos abordan un problema importante asociado con el cribado de peptidos identificados mediante presentacion en fago: frecuentemente los peptidos asf identificados no tienen suficiente afinidad por la diana como para cribarse frente a celulas que expresan la diana en ensayos convencionales. Sin embargo, determinar que un peptido identificado en fago particular se une a celulas que expresan la diana (y no se une a celulas que no lo hacen) es una informacion cntica en la identificacion de peptidos de union que son posibles restos de seleccion de diana in vivo, ya se usen como monomeros o como parte de un constructo multimerico. El procedimiento se aprovecha del aumento de afinidad y avidez asociado con la union multivalente y permite el cribado de polipeptidos con bajas afinidades frente a celulas que expresan la diana.
El procedimiento generalmente consiste en la preparacion y cribado de constructos multimericos que incluyen uno o mas polipeptidos de union. Por ejemplo, los polipeptidos identificados mediante presentacion en fago como que se unen a una diana se biotinilan y se complejan con avidina, estreptavidina o neutravidina para formar constructos tetramericos. Estos constructos tetramericos se incuban entonces con celulas que expresan la diana deseada y celulas que no lo hacen, y se detecta la union del constructo tetramerico. Puede detectarse la union usando cualquier procedimiento de deteccion conocido en la tecnica. Por ejemplo, para detectar la union, puede conjugarse la avidina, estreptavidina o neutravidina a un marcador detectable (por ejemplo, un marcador radiactivo, un marcador fluorescente o un marcador enzimatico que experimenta un cambio de color, tal como HRP (peroxidasa del rabano picante), TMB (tetrametilbencidina) o fosfatasa alcalina).
Los peptidos biotinilados se complejan preferiblemente con neutravidina-HRP. La neutravidina presenta menor union no espedfica a moleculas que las demas alternativas debido a la ausencia de restos de hidrato de carbono de union a lectina y dominio RYD de union a receptor de adhesion celular en neutravidina (Hiller, Y. et al., 1987. Biochem. J., 248:167-171; Alon, Ret al., 1990. Biochem. Biophys. Res. Commun., 170:1236-41).
Los constructos tetramericos pueden cribarse frente a celulas que expresan de manera natural la diana o celulas que se han modificado por ingeniena mediante tecnologfas de ADN recombinante para expresar la diana (por ejemplo, transfectantes, transformantes, etc.). Si se usan celulas que se han transfectado para expresar la diana, pueden usarse celulas transfectadas de manera simulada (es decir, celulas transfectadas sin el material genetico que codifica la diana) como control.
Los complejos tetramericos pueden cribarse opcionalmente en presencia de suero. Por tanto, tambien puede usarse el ensayo para evaluar rapidamente el efecto del suero sobre la union de peptidos a la diana.
Los procedimientos divulgados en el presente documento son particularmente utiles en la preparacion y evaluacion de combinaciones de distintos polipeptidos de union para su uso en constructos de direccionamiento dimericos o multimericos que contienen dos o mas polipeptidos de union. El uso de complejos de biotina/avidina permite la preparacion relativamente facil de constructos tetramericos que contienen de uno a cuatro peptidos de union diferentes. Ademas, se ha hallado ahora que la afinidad y avidez de un constructo de direccionamiento pueden aumentarse mediante la inclusion de dos o mas restos de direccionamiento que se unen a diferentes epftopos en la misma diana. Los procedimientos de cribado descritos en el presente documento son utiles en la identificacion de combinaciones de polipeptidos de union que podnan tener afinidad aumentada cuando se incluyen en tales constructos multimericos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Los procedimientos de cribado descritos en el presente documento pueden usarse para cribar polipeptidos de union a cMet identificados mediante presentacion en fago, tales como los descritos en el presente documento. Estos procedimientos pueden usarse para evaluar la union espedfica de polipeptidos de union a cMet a celulas que expresan cMet o se han modificado por ingeniena para expresar cMet. Los complejos tetramericos de polipeptidos de union a cMet biotinilados de la invencion y, por ejemplo, neutravidina-HRP pueden prepararse y cribarse frente a celulas transfectadas para expresar cMet asf como celulas transfectadas de manera simulada, que no expresan cMet.
El ensayo puede usarse para identificar polipeptidos de union a cMet que se unen a espedficamente a celulas que expresan cMet (y no se unen a celulas que no expresan cMet) incluso cuando la Kd monodentada del polipeptido es del orden de 200 nM-300 nM. El ensayo puede usarse para seleccionar constructos homotetramericos que contienen cuatro copias de un unico polipeptido de union a cMet de la invencion asf como heterotetramericos (constructos que contienen dos o mas polipeptidos de union a cMet diferentes). Los procedimientos descritos en el presente documento son particularmente utiles para evaluar combinaciones de polipeptidos de union a cMet para su uso en constructos multimericos, particularmente constructos que contienen dos o mas polipeptidos de union a cMet que se unen a diferentes epftopos de cMet.
El ensayo tambien puede usarse para evaluar el efecto del suero sobre los polipeptidos de union a cMet.
Modificacion u optimizacion de polipeptidos de union a cMet
Tal como se comenta, los polipeptidos modificados u optimizados estan incluidos dentro de la definicion de “polipeptidos de union a cMet”. Espedficamente, una secuencia de polipeptido identificada mediante presentacion en fago puede modificarse para optimizar su potencia, comportamiento farmacocinetico, estabilidad y/u otras propiedades biologicas, ffsicas y qdmicas.
Sustitucion de residuos de aminoacido
Por ejemplo, pueden realizarse los siguientes cambios de aminoacidos isostericos y/o conservativos en la secuencia de polipeptido parental con la esperanza de que los polipeptidos resultantes tendran un perfil similar o mejorado de las propiedades descritas anteriormente:
Sustitucion de aminoacidos hidrofobos sustituidos con alquilo: incluyendo alanina, leucina, isoleucina, valina, norleucina, acido S-2-aminobutmco, S-ciclohexilalanina u otros alfa-aminoacidos simples sustituidos con una cadena lateral alifatica de carbonos C1-10 incluyendo sustituciones alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena ramificada, dclica y lineal.
Sustitucion de aminoacidos hidrofobos con sustitucion aromatica: incluyendo fenilalanina, triptofano, tirosina, bifenilalanina, 1-naftilalanina, 2-naftilalanina, 2-benzotienilalanina, 3-benzotienilalanina, histidina, formas sustituidas con amino, alquilamino, dialquilamino, aza, halogenadas (fluoro, cloro, bromo o yodo) o con alcoxilo (de C1-C4) de los aminoacidos aromaticos enumerados previamente, de los que son ejemplos ilustrativos: 2-, 3- o 4- aminofenilalanina, 2-, 3- o 4- clorofenilalanina, 2-, 3- o 4-metilfenilalanina, 2-, 3- o 4-metoxifenilalanina, 5-amino-, 5- cloro-, 5-metil o 5-metoxitriptofano, 2'-, 3'-, o 4'-amino-, 2'-, 3'-, o 4'-cloro-, 2, 3 o 4-bifenilalanina, 2', -3', o 4'-metil-2, 3 o 4-bifenilalanina y 2- o 3-piridilalanina.
Sustitucion de aminoacidos que contienen funciones basicas: incluyendo arginina, lisina, histidina, ornitina, acido 2,3-diaminopropionico, homoarginina, derivados sustituidos con alquilo, alquenilo o arilo (de C1-C10 ramificados, lineales o dclicos) de los aminoacidos anteriores, ya este el sustituyente en los heteroatomos (tales como el nitrogeno alfa, o el nitrogeno o nitrogenos distales, o en el carbono alfa, en la posicion pro-R por ejemplo. Los compuestos que sirven como ejemplos ilustrativos incluyen: N-epsilon-isopropil-lisina, 3-(4-tetrahidropiridil)glicina, 3- (4-tetrahidropiridil)alanina, N,N-gamma,gamma'-dietilhomoarginina. Tambien estan incluidos compuestos tales como alfa-metilarginina, acido alfa-metil-2,3-diaminopropionico, alfa-metilhistidina, alfa-metilornitina en los que el grupo alquilo ocupa la posicion pro-R del carbono alfa. Tambien estan incluidas las amidas formadas a partir de acidos carboxflicos alqmlicos, aromaticos, heteroaromaticos (en los que el grupo heteroaromatico tiene uno o mas nitrogenos, oxfgenos o atomos de azufre individualmente o en combinacion) o cualquiera de los muchos derivados activados bien conocidos tales como cloruros de acido, esteres activos, azolidas activas y derivados relacionados) y lisina, ornitina o acido 2,3-diaminopropionico.
Sustitucion de aminoacidos acidos: incluyendo acido aspartico, acido glutamico, acido homoglutamico, tirosina, alquil-, aril-, arilalquil- y heteroarilsulfonamidas del acido 2,4-diaminopropionico, ornitina o lisina y alquilaminoacidos sustituidos con tetrazol.
Sustitucion de residuos de amida de cadena lateral: incluyendo asparagina, glutamina, y derivados sustituidos con alquilo o grupo aromatico de asparagina o glutamina.
Sustitucion de aminoacidos que contienen hidroxilo: incluyendo serina, treonina, homoserina, acido 2,3-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
diaminopropionico, y derivados sustituidos con alquilo o grupo aromatico de serina o treonina. Tambien se entiende que los aminoacidos dentro de cada una de las categonas enumeradas anteriormente pueden sustituirse por otro del mismo grupo.
Sustitucion de enlaces amida
Otro tipo de modificacion dentro del alcance de la invencion es sustituir los enlaces amida dentro de la estructura principal del polipeptido. Por ejemplo, para reducir o eliminar proteolisis no deseada, u otras rutas de degradacion que disminuyen la estabilidad en suero, lo que da como resultado bioactividad reducida o suprimida, o para restringir o aumentar la flexibilidad conformacional, pueden sustituirse enlaces amida dentro de la estructura principal de los peptidos por una funcionalidad que imita la conformacion existente o altera la conformacion de la manera deseada. Tales modificaciones pueden producir afinidad de union aumentada o comportamiento farmacocinetico mejorado. Se entiende que aquellos con conocimientos en la tecnica de la smtesis peptfdica pueden realizar los siguientes cambios de enlace amida para cualquier enlace amida que conecte dos aminoacidos con la esperanza de que los peptidos resultantes pudieran tener la misma actividad o mejorada: insercion de alfa-N-metilamidas o tioamidas de estructura principal de amida de peptido, retirada del carbonilo para producir las aminas secundarias relacionadas, reemplazo de un aminoacido por un aza-aminoacido para producir derivados de semicarbazona, y uso de E-olefinas y E-olefinas sustituidas como sustitutos de enlace amida.
Introduccion de D-aminoacidos
Otro enfoque dentro del alcance de la invencion es la introduccion de D-alanina, u otro D-aminoacido, distal o proximal al enlace peptfdico labil. En este caso, tambien se entiende por los expertos en la tecnica que tales sustituciones de D-aminoacido pueden, y a veces, deben realizarse, por D-aminoacidos cuyas cadenas laterales no son reemplazos conservativos de las del L-aminoacido que esta reemplazandose. Esto se debe a la diferencia de quiralidad, y por tanto, de orientacion de cadena lateral, que podna dar como resultado el acceso a una region previamente inexplorada del sitio de union de la diana que tiene restos de diferente carga, hidrofobicidad, requisitos estericos etc. que aquellos a los que da servicio la cadena lateral del L-aminoacido reemplazado.
Modificaciones para mejorar las propiedades farmacocineticas o farmacodinamicas
Tambien se entiende que el uso de uno o mas polipeptidos de union a cMet en una aplicacion particular podna beneficiarse mediante modificaciones del peptido o formulaciones del peptido para mejorar el comportamiento farmacocinetico y farmacodinamico. Se espera que las propiedades del peptido puedan cambiarse mediante la union de restos que se preve que provocaran las propiedades ffsicas o qrnmicas deseadas. Tales restos pueden colgarse del peptido usando acidos o aminas, mediante enlaces amida o enlaces urea, respectivamente, al extremo N o C- terminal del peptido, o al grupo amino colgante de una lisina o un derivado de lisina ubicado adecuadamente, acido 2,3-diaminopropionico, ornitina, u otro aminoacido en el peptido que posee un grupo amina colgante o un grupo hidrazina o alcoxiamina colgante. A la inversa, pueden desenmascararse selectivamente cadenas laterales de aminoacidos acidos tales como las de Asp o Glu y amidarse con aminas que portan la funcionalidad de modificacion deseada, o pueden modificarse de esta manera antes de la incorporacion en la cadena peptfdica. Los restos introducidos pueden ser grupos que son grupos alquilo o aromaticos hidrofilos, basicos o apolares dependiendo del peptido de interes y los requisitos exactos para la modificacion de sus propiedades.
Glicosilacion de residuos de aminoacido
Aun otra modificacion dentro del alcance de la invencion es la glicosilacion de uno o mas residuos de aminoacido (por ejemplo, residuos de serina o treonina) en el polipeptido de union a cMet. La glicosilacion, que puede llevarse a cabo usando condiciones convencionales, puede usarse para potenciar la solubilidad, alterar la farmacocinetica y farmacodinamia o para potenciar la union mediante una interaccion espedfica o no espedfica que implica el resto glicosfdico.
Formacion de sales
Tambien esta dentro del alcance de la invencion formar diferentes sales que podnan aumentar o disminuir la solubilidad en agua o la facilidad de formulacion de estos peptidos. Estos pueden incluir, pero no se restringen a, N- metilglucamina (meglumina), acetato, oxalatos, ascorbatos, etc.
Modificaciones estructurales que conservan caractensticas estructurales
Aun otra modificacion dentro del alcance de la invencion es un truncamiento de polipeptidos dclicos. La naturaleza dclica de muchos polipeptidos de la invencion limita el espacio conformacional disponible para la secuencia peptfdica, particularmente dentro del ciclo. Por tanto un truncamiento del peptido en uno o mas residuos distales o incluso proximales al ciclo, en la region o bien N-terminal o bien C-terminal, podna proporcionar peptidos truncados con actividad biologica similar o mejorada. Puede identificarse una secuencia de aminoacidos unica, incluso de tan solo tres aminoacidos, que es responsable de la actividad de union, tal como se indica para peptidos RGD (Plow, E.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
et al., 1987. Blood, 70: 110-5; Oldberg, A. et al., 1988. J. Biol. Chem., 263:19433-19436; Taub, Ret al., 1989. J. Biol. Chem., 264:259-65; Andrieux, A. et al., 1989. J. Biol. Chem., 264:9258-65; y patentes estadounidenses n.os 5.773.412 y 5.759.996).
Tambien se ha mostrado en la bibliograffa que pueden acortarse sustancialmente grandes ciclos peptidicos, eliminando aminoacidos foraneos, pero incluyendo sustancialmente los residuos de union cnticos. Vease la patente estadounidense n° 5.556.939.
Los peptidos dclicos acortados pueden formarse usando enlaces disulfuro o enlaces amida de grupos amino y grupos acido carboxflico ubicados adecuadamente.
Ademas, pueden anadirse D-aminoacidos a la secuencia peptidica para estabilizar caractensticas de giro (especialmente en el caso de glicina). En otro enfoque, pueden emplearse mimeticos de giro o dipeptido alfa, beta, gamma o delta (tales como mimeticos de giro a, p, y o 8), algunos de los cuales se muestran en las figuras 1A-1C, para imitar motivos estructurales y caractensticas de giro en un peptido y proporcionar simultaneamente estabilidad frente a la proteolisis y potenciar otras propiedades tales como, por ejemplo, estabilidad conformacional y solubilidad (estructura 1A: Hart et al., J. Org. Chem., 64, 2998-2999(1999); estructura 1B: Hanessian et al., “Synthesis of a Versatile Peptidomimetic Scaffold” en Methods in Molecular Medicine, Vol. 23: Peptidomimetics Protocols, W. Kazmierski, Ed. (Humana Press Inc., Totowa, N.J., 1999), Capftulo 10, pags. 161-174; estructura 1C: WO 01/16135.
Sustitucion de mimeticos de disulfuro
Tambien dentro del alcance de la invencion esta la sustitucion de mimeticos de disulfuro para enlaces disulfuro dentro de los peptidos de union a cMet de la invencion.
Cuando se emplean peptidos que contienen disulfuro en la generacion de productos radiofarmaceuticos basados en 99mTc, u otros productos radiofarmaceuticos utiles basados en otros isotopos, un problema importante es la presencia del enlace disulfuro. Por ejemplo, la integridad del enlace disulfuro es diffcil de mantener durante procedimientos disenados para incorporar 99mTc mediante rutas que se basan en la reduccion de ion pertecnetato y la posterior incorporacion de la especie de Tc reducida en sustancias que portan grupos de quelacion espedficos de Tc. Este se debe a que el enlace disulfuro se reduce bastante facilmente por los agentes reductores usados habitualmente en kits concebidos para la preparacion en una sola etapa de productos radiofarmaceuticos. Por tanto, la facilidad con la que puede reducirse el enlace disulfuro durante la quelacion de Tc puede requerir la sustitucion por mimeticos de enlaces disulfuro. Por consiguiente, otra modificacion dentro del alcance de la invencion es sustituir el resto disulfuro por mimeticos utilizando los procedimientos divulgados en el presente documento o conocidos por los expertos en la tecnica, mientras se conserva la actividad y otras propiedades deseadas de los polipeptidos de union a cMet de la invencion.
1. ) Ligador de oxima
Se ha empleado el resto de oxima como ligador por investigadores en varios contextos (Wahl, F. y Mutter, M., 1996. Tetrahedron Lett., 37:6861-6864). Tal como se muestra en la figura 2, los aminoacidos 4, que contienen una funcion aminoalcohol, y 5 que contienen una funcion alcoxiamino, pueden incorporarse en la cadena peptfdica, no necesariamente en el extremo de la cadena peptfdica. Despues de la formacion del peptido, pueden eliminarse los grupos protectores de la cadena lateral. Entonces se desenmascara el grupo aldehfdo y se forma una union oxima.
2. ) Ligador de lantionina
Las lantioninas son sulfuros dclicos, en los que la union disulfuro (S-S) se reemplaza por una union carbono-azufre (C-S). Por tanto, la labilidad frente a la reduccion es bastante menor. Pueden prepararse lantioninas mediante varios procedimientos incluyendo los comentados a continuacion.
1) Preparacion de lantioninas, usando peptidos bromoacetilados
Pueden prepararse facilmente lantioninas usando procedimientos conocidos (Robey, F. y Fields, R., 1989. Anal. Biochem., 177:373-377; Inman, J. et al., 1991. Bioconjug. Chem., 2:458-463; Ploinsky, A. et al., 1992. J. Med. Chem., 35:4185-4194; Mayer et al., “Peptides, Frontiers of Peptide Science”, en Proceedings of the 15th American Peptide Symposium, Tam y Kaumaya (Eds.), 14-19 de junio de 1995, Nashville, Tenn. (Klumer Academic Pub., Boston), pag. 291-292; Wakao et al., Jpn. Kokai Tokyo Koho, documento JP 07300452 A2 (1995)). La preparacion de peptidos usando smtesis peptfdica automatizada con Boc seguida por el acoplamiento del extremo terminal del peptido con acido bromoacetico proporciona peptidos bromoacetilados con buen rendimiento. La escision y desproteccion de los peptidos puede lograrse usando HF/anisol. Si el peptido contiene un grupo cistema, puede controlarse su reactividad con bajo pH. Si se eleva el pH del medio hasta 6-7, entonces puede tener lugar o bien polimerizacion o bien ciclacion del peptido. La polimerizacion se favorece a una concentracion alta (100 mg/ml) mientras que la ciclacion se favorece a concentraciones menores (1 mg/ml), por ejemplo, 6 se cicla para dar 7 (denominado en el presente documento “esquema 1” tal como se muestra en la figura 3). Inman et al. demostraron
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
el uso de Na-(Boc)-Ne-[N-(bromoacetil)-p-alanil]-L-lisina como portador del grupo bromoacetilo que podna emplearse en la smtesis peptidica con Boc, permitiendo por tanto la colocacion de un resto que porta bromoacetilo en cualquier lugar en una secuencia. En experimented preliminares, hallaron que peptidos con 4-6 aminoacidos que separan el derivado de bromoacetil-lisina de una cistema tienden a ciclar, indicando la posible utilidad de esta estrategia.
2) Preparacion de lantioninas mediante la adicion de tiol de cistema a acrilamidas
Pueden implementarse varias variantes de esta estrategia. Puede emplearse serina unida a resina para preparar el anillo de lantionina en resina usando una secuencia de bromacion-deshidrobromacion-adicion de tiol o mediante deshidratacion con carbonato de disuccinimidilo seguido por la adicion de tiol. La adicion conjugada de tioles a acrilamidas tambien se ha demostrado ampliamente y se proporciona una referencia para la adicion de 2- mercaptoetanol a acrilamida (Wakao et al., Jpn. Kokai Tokyo Koho, documento JP 07300452 A2, 1995).
3) Union de diarilamina o diarileter a partir de la ciclacion intramolecular de acidos arilboronicos y tirosina
Se ha notificado la reaccion de acidos arilboronicos con fenoles, aminas y aminas heteroctelicas en presencia de acetato cuprico, al aire, a temperatura ambiente, en diclorometano usando o bien piridina o bien trietilamina como base para proporcionar diarileteres asimetricos y las aminas relacionadas con buenos rendimientos (de hasta el 98 %) (Evans, D. et al., 1998. Tetrahedron Lett., 39:2937-2940; Chan, D. et al., 1998. Tetrahedron Lett., 39:2933-2936; Lam, P. et al., 1998. Tetrahedron Lett., 39:2941-2944). En el caso de derivados de tirosina protegidos en N como componente fenolico, los rendimientos tambien fueron de hasta el 98 %. Esto demuestra que se espera que las amidas de aminoacido (peptidos) sean estables frente a la transformacion y que los rendimientos sean altos. Existe un precedente para una reaccion intramolecular en vista de las ciclaciones intramoleculares faciles de peptidos para dar lactamas, formacion de biarileter intramolecular basandose en la reaccion SNAr y la generalidad de reacciones de ciclacion intramolecular en condiciones de alta dilucion o en resina, en las que el efecto de pseudodilucion imita las condiciones de alta dilucion.
4) Formacion de peptidos ctelicos con una union de tiazolidina mediante reaccion intramolecular de aldehfdos de peptido con restos de cistema
Otro enfoque que puede emplearse implica ciclacion intramolecular de funciones amino-mercaptano vecinales ubicadas adecuadamente (derivadas habitualmente de la colocacion de una cistema en un extremo terminal de una secuencia lineal o anclada a la secuencia mediante un nitrogeno de cadena lateral de una lisina, por ejemplo) y funciones aldehfdo para proporcionar tiazolidinas que dan como resultado la formacion de un peptido bictelico, del que un anillo esta formado por los residuos en la cadena principal, y siendo el segundo anillo el anillo de tiazolidina. El esquema 2 (figura 4) proporciona un ejemplo. La funcion aldehfdo requerida puede generarse mediante escision con metaperyodato de sodio de una funcion aminoalcohol vecinal ubicada adecuadamente, que puede estar presente como serina no protegida anclada a la cadena mediante adicion a un grupo amino de cadena lateral de un resto de lisina. En algunos casos, la funcion aldehfdo requerida se genera desenmascarando un derivado de aldehfdo protegido en el extremo C-terminal o el extremo N-terminal de la cadena (Botti, P. et al., 1996. J. Am. Chem. Soc., 118:10018-10034).
5) Lactamas basadas en la ciclacion intramolecular de grupos amino colgantes con grupos carboxilo en resina.
Pueden prepararse peptidos macroctelicos mediante la formacion de lactama o bien mediante ciclacion de cabeza con cola o bien de grupo colgante. La estrategia basica es preparar un peptido totalmente protegido en el que es posible eliminar selectivamente un grupo protector de amina y un grupo protector de carboxilo. Se han desarrollado esquemas de proteccion ortogonales. De los que se han desarrollado, los mas empleados han sido los procedimientos de alilo, tritilo y Dde (Mellor et al., “Synthesis of Modified Peptides”, en Fmoc Solid Phase Synthesis: A Practical Approach, White y Chan (eds) (Oxford University Press, Nueva York, 2000), Cap. 6, pags. 169-178). El enfoque de Dde es de interes porque utiliza grupos protectores similares tanto para la funcion acido carboxflico (ester Dmab) como para el grupo amino (grupo Dde). Se eliminan ambos con hidrazina al 2-10% en DMF a temperatura ambiental. Alternativamente, puede usarse el Dde para el grupo amino y el grupo alilo puede usarse para el carboxilo.
Una funcion lactama, disponible mediante acoplamiento intramolecular mediante reactivos de acoplamiento peptfdico convencionales (tales como HATU, PyBOP, etc.) puede actuar como sustituto para el enlace disulfuro. El enfoque de Dde/Dmab se muestra en el esquema 3 (figura 5).
Por tanto, puede prepararse una secuencia lineal que contiene, por ejemplo, la lisina protegida con Dde y ester Dmab en una resina de amida Rink basada en Tentagel a baja carga (~0,1 -0,2 mmol/g). La desproteccion de ambas funciones con hidrazina va seguida entonces por la ciclacion en resina para dar los productos deseados. Posteriormente tambien pueden llevarse a cabo la escision de la resina y purificacion. Para la funcionalizacion del extremo N-terminal del peptido, se entiende que se requerinan diaminoacidos tales como acido trans-4-(iv- Dde)metilaminociclohexanocarboxflico o acido 4-(iv-Dde)metilaminobenzoico. Un escenario alternativo es emplear el procedimiento de cierre de seguridad para la formacion de lactama intramolecular durante la escision de la resina.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
6) Peptidos dclicos basados en metatesis de olefinas
La reaccion de Grubbs (Esquema 4, la figura 6) implica la metatesis/ciclacion de enlaces olefrnicos (Schuster et al., 1997. Angew. Chem. Int. Edn Engl., 36:2036-2056; Miller et al., 1996. J. Am. Chem. Soc., 118:9606-9614). Se observa facilmente que, si el material de partida es una diolefina 16, el producto resultante sera el compuesto dclico 17. La reaccion se ha aplicado a la creacion de ciclos a partir de peptidos funcionalizados con olefina (Pernerstorfer et al., 1997. Chem. Commun., 20:1949-50; Clark et al., 1999. chem. Eur. J., 5:782-792; Blackwell et al., 1998 Angew. Chem. Int. Ed., 37:3281-3284; Ripka, A. et al., 1998. Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:357-360; Miller et al., 1996. J. Am. Chem. Soc., 118:9606-9614; Clark et al., 1995. J. Am. Chem. Soc., 117:12364-, 12365; Miller et al., 1995. J. Am. Chem. Soc., 117:5855-5856). Pueden prepararse o bien aminoacidos C-alilados o bien posiblemente aminoacidos N-alilados y emplearlos en esta reaccion para preparar peptidos dclicos con puente de tipo carba como sustitutos para peptidos que contienen enlace disulfuro.
Tambien pueden prepararse compuestos novedosos con grupos olefrnicos. La funcionalizacion del hidroxilo de tirosina con un anclaje que contiene olefina es una opcion. El grupo e-amino de lisina es otra opcion con adicion de la unidad que contiene olefina como parte de un resto de acilacion, por ejemplo. Si en cambio se alquila el grupo amino de cadena lateral de lisina con un anclaje que contiene olefina, todavfa puede funcionar como punto de conexion para un indicador tambien. El uso de acido 5-pentenoico como agente de acilacion para los grupos amino de cadena lateral de lisina, ornitina o diaminopropionico es otra posibilidad. La longitud del anclaje que contiene olefina tambien puede variarse para examinar relaciones de estructura-actividad.
Manipulacion de secuencias peptfdicas
Otras modificaciones incluyen manipulaciones de secuencias peptfdicas, que puede esperase que produzcan peptidos con propiedades biologicas similares o mejoradas. Estas incluyen translocaciones de aminoacido (intercambiar aminoacidos en la secuencia), uso de peptidos retroinversos en lugar de la secuencia original o una secuencia original modificada, peptoides y secuencias de peptoide retroinverso. Tambien se preven estructuras en las que residuos espedficos son peptoides en vez de peptfdicos, dando como resultado moleculas tnbridas, ni completamente peptfdicas ni completamente peptoides.
Ligadores
Adicionalmente, las modificaciones dentro de la invencion incluyen la introduccion de ligadores o espaciadores entre la secuencia de direccionamiento del resto de union o polipeptido de union y el marcador detectable o agente terapeutico. Por ejemplo, el uso de tales ligadores/espaciadores puede mejorar las propiedades relevantes de los peptidos de union (por ejemplo, aumento de la estabilidad en suero, etc.). Estos ligadores pueden incluir, pero no se restringen a, cadenas alquilo sustituido o no sustituido, derivados de polietilenglicol, espaciadores de aminoacido, azucares, o espaciadores alifaticos o aromaticos habituales en la tecnica.
Por ejemplo, los ligadores adecuados incluyen moleculas de reticulacion homobifuncionales y heterobifuncionales. Las moleculas homobifuncionales tienen al menos dos grupos funcionales reactivos, que son iguales. Los grupos funcionales reactivos en una molecula homobifuncional incluyen, por ejemplo, grupos aldehfdo y grupos ester activos. Las moleculas homobifuncionales que tienen grupos aldehfdo incluyen, por ejemplo, giutaraldetndo y subaraldehfdo.
Las moleculas ligadoras homobifuncionales que tienen al menos dos unidades ester activas incluyen esteres de acidos dicarboxflicos y N-hidroxisuccinimida. Algunos ejemplos de tales esteres de N-succinimidilo incluyen suberato de disuccinimidilo y ditiobis(propionato de succinimidilo), y su acido bis-sulfonico soluble y sales de bis-sulfonato tales como sus sales de sodio y potasio.
Las moleculas ligadoras heterobifuncionales tienen al menos dos grupos reactivos diferentes. Algunos ejemplos de reactivos heterobifuncionales que contienen enlaces disulfuro reactivos incluyen 3-(2-piridil-ditio)propionato de N- succinimidilo (Carlsson et al., 1978. Biochem. J., 173:723-737), S-4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metilbenciltiosulfato de sodio y 4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-(2-piridilditio)tolueno. Se prefiere el 3-(2-piridilditio)propionato de N- succinimidilo. Algunos ejemplos de reactivos heterobifuncionales que comprenden grupos reactivos que tienen un doble enlace que reacciona con un grupo tiol incluyen 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo y m-maleimidobenzoato de succinimidilo. Otras moleculas heterobifuncionales incluyen 3- (maleimido)propionato de succinimidilo, 4-(p-maleimidofenil)butirato de sulfosuccinimidilo, 4-(N- maleimidometilciclohexano)-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo, ester de maleimidobenzoil-5N-hidroxisuccinimida.
Ademas, tambien pueden emplearse ligadores que son combinaciones de las moleculas y/o los restos descritos anteriormente, para conferir una ventaja especial a las propiedades del peptido. Pueden unirse moleculas lipfdicas con ligadores para permitir la formulacion de burbujas para ultrasonidos, liposomas u otros constructos basados en agregacion. Tales constructos podnan emplearse como agentes para direccionamiento y suministro de un indicador de diagnostico, un agente terapeutico (por ejemplo, una “ojiva” qmmica para terapia), o una combinacion de estos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Constructos multimericos de polipeptidos de union a cMet
Tambien se contemplan constructos que emplean d^eros, multimeros o poKmeros de uno o mas polipeptidos de union a cMet de la invencion. En efecto, existen amplias evidencias bibliograficas de que la union de pequenas moleculas o peptidos de baja potencia puede aumentarse sustancialmente mediante la formacion de d^eros y multimeros. Por tanto, constructos dimericos y multimericos (tanto homogeneos como heterogeneos) estan dentro del alcance de la presente invencion. Las secuencias de polipeptido en los constructos dimericos pueden unirse en sus extremos N o C-terminal o el nitrogeno N-epsilon de un resto de lisina situado adecuadamente (u otra funcion que porta un grupo derivatizable selectivamente tal como un grupo oxiamino colgante u otro grupo nucleofilo), o pueden unirse entre sf mediante uno o mas ligadores (por ejemplo, los comentados en el presente documento) empleando la qmmica de union apropiada. Esta qmmica de acoplamiento puede incluir amida, urea, tiourea, oxima, o aminoacetilamida (a partir de derivados de cloro- o bromoacetamida, pero sin limitarse a eso). Por ejemplo, los procedimientos para preparar constructos dimericos o multimericos de polipeptidos de union a cMet incluyen al menos los comentados a continuacion.
Procedimiento A
Pueden construirse peptidos de union a cMet totalmente protegidos en resina de cierre de seguridad de tipo Ellman usando protocolos de smtesis peptfdica con Fmoc automatizados o manuales (Backes et al., 1996. J. Am. Chem. Soc., 118:3055-56). Por separado, usando procedimientos convencionales conocidos en la tecnica de la smtesis peptfdica, puede construirse un derivado de dilisina en resina de 2-clorotritilo (Fields et al., “Principles and Practice of Solid Phase Synthesis” en Synthetic Peptides, A Users Guide, Grant, Ed. (W.H. Freeman Co., Nueva York, 1992), Cap. 3, pags. 77-183; Barlos et al., “Convergent Peptide Synthesis” en Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Chan, W.C. y White, P.D., Eds. (Oxford University Press, Nueva York, 2000), Cap. 9, pag. 215-228). La liberacion de este de la resina de 2-clorotritilo sin la eliminacion de los grupos protectores de cadena lateral, la activacion del grupo carboxilo y el acoplamiento a cualquier grupo de marcaje funcionalizado con amina proporciona un derivado de dilisina cuyos atomos de nitrogeno colgantes protegidos pueden desenmascararse para dar dos grupos amino libres. Se activa la resina de cierre de seguridad mencionada previamente y se anade el derivado de dilisina funcionalizado con grupo de marcaje desprotegido en N deseado a la resina de cierre de seguridad activada. Los grupos amino colgantes se acilan mediante el extremo carboxiterminal del peptido unido a la resina de cierre de seguridad, que se separa ahora de la resina y representa una parte integral de la estructura de dilisina. Puede emplearse un exceso del peptido unido a la resina de cierre de seguridad para garantizar la reaccion completa de los grupos amino del constructo de dilisina. La optimizacion de la razon de las parejas de reaccion en este esquema optimiza el rendimiento. Los grupos protectores en los peptidos de union a cMet se eliminan empleando protocolos de escision basados en acido trifluoroacetico.
La smtesis de constructos dimericos y multimericos en los que estan presentes dos o mas peptidos de union a cMet en un constructo se logra facilmente. Pueden emplearse esquemas de proteccion ortogonales (tales como un grupo aliloxicarbonilo en un nitrogeno y un grupo Fmoc en el otro, o empleando el grupo Fmoc junto con el grupo protector iV-Dde en el otro, por ejemplo) para distinguir los atomos de nitrogeno colgantes de los derivados de dilisina descritos anteriormente. El desenmascaramiento de uno de los grupos amino, seguido por la reaccion del producto resultante con un peptido de union a cMet unido a resina de cierre de seguridad activada tal como se describio anteriormente, proporciona un constructo de dilisina que tiene un unico peptido de union a cMet unido. La eliminacion del segundo grupo protector desenmascara el nitrogeno restante (Mellor et al., “Synthesis of Modified Peptides” en Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Chan, W.C. y White, P.D., Eds. (Oxford University Press, Nueva York, 2000), Cap. 6, pag. 169-176). El producto resultante puede hacerse reaccionar con una segunda resina de cierre de seguridad que porta otro peptido de union a cMet para proporcionar un constructo homodimerico totalmente protegido, que despues de la eliminacion de grupos protectores con acido trifluoroacetico, proporciona el material deseado.
Procedimiento B
Se ensambla un peptido de union a cMet en una resina de Rink-amida mediante procedimientos de acoplamiento de peptidos automatizados o manuales, que emplean habitualmente protocolos de smtesis peptfdica con Fmoc. El peptido puede poseer un extremo C-terminal o extremo N-terminal funcionalizado con un ligador o un constructo ligador-grupo de marcaje que puede poseer un grupo nucleofilo adicional tal como el grupo e-amino de un resto de lisina, por ejemplo. Se logra la escision de los grupos protectores empleando acido trifluoroacetico con modificadores apropiados dependiendo de la naturaleza del peptido. El peptido totalmente desprotegido se hace reaccionar entonces con un gran exceso de un electrofilo bifuncional tal como el ester de bis-N-hidroxisuccinimida del acido glutarico disponible comercialmente (Tyger Scientific, Inc., Princeton, NJ). El ester de mono-N-hidroxisuccinimidilo monoamidado resultante del acido glutarico se trata entonces con un equivalente adicional del mismo peptido, o un equivalente de un peptido de union a cMet diferente. La purificacion del material resultante mediante HPLC proporciona el constructo homodimerico deseado que porta un grupo de marcaje adecuado.
Procedimiento C
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Puede emplearse un esquema modular para preparar constructos dimericos o multimericos superiores que portan grupos de marcaje adecuados tal como se definieron anteriormente. En una ilustracion sencilla, se trata resina de fmoc-lisina(iV-Dde)-Rink-amida con piperidina para eliminar el resto fmoc. Entonces una funcion de marcaje, tal como biotina, 5-carboxifluorescema o N,N-dimetil-Gly-Ser(O-t-Bu)-Cys(Acm)-Gly-OH se acopla al atomo de nitrogeno. A continuacion se trata la resina con hidrazina para eliminar el grupo iV-Dde. Despues de un lavado meticuloso, se trata la resina con cloruro cianurico y una base impedida tal como diisopropiletilamina en un disolvente adecuado tal como DMF, NMP o diclorometano para proporcionar una diclorotriazina monofuncionalizada unida a la resina. El posterior desplazamiento sucesivo de los atomos de cloro restantes por dos equivalentes de un peptido de union a cMet proporciona un constructo funcionalizado con grupo de marcaje homodimerico unido a resina (Falomi, M. et al., 1998. Tetrahedron Lett., 39:7607-7610; Johnson, C. et al., 1998. Tetrahedron, 54:40974106; Stankova, M. y Lebl, M., 1996. Mol. Divers., 2:75-80). Los peptidos entrantes pueden protegerse o desprotegerse segun lo justifique la situacion. Se logra la escision de grupos protectores empleando reactivos de desproteccion basados en acido trifluoroacetico tal como se describio anteriormente, y se purifican los materiales deseados mediante cromatograffa lfquida de alta resolucion.
Se entiende que en cada uno de estos procedimientos pueden emplearse derivados de lisina en serie para aumentar la multiplicidad de los multfmeros. El uso de moleculas relacionadas mas ngidas que portan el numero requerido de atomos de nitrogeno enmascarados o protegidos de manera ortogonal para que actuen como andamiajes para variar la distancia entre los peptidos de union a cMet, para aumentar la rigidez del constructo (mediante la constriccion del movimiento y las posiciones relativas de los peptidos de union a cMet unos con relacion a otros y el indicador) esta completamente dentro del alcance de los procedimientos A-C y todos los demas procedimientos descritos en el presente documento.
Usos para polipeptidos de union a cMet y constructos peptfdicos multimericos
Los restos de union a cMet de la invencion tambien tienen utilidad en el tratamiento de una variedad de estados patologicos, incluyendo los asociados con proliferacion celular (por ejemplo, hiperproliferacion, por ejemplo, cancer). Los restos de union a cMet de la invencion (por ejemplo, polipeptidos y constructos polipeptfdicos multimericos) pueden usarse en sf mismos como agentes terapeuticos o podnan usarse para localizar uno o mas agentes terapeuticos (por ejemplo, un agente quimioterapico, un agente radioterapico, material genetico, etc.) en celulas que expresan cMet, incluyendo sitios de proliferacion celular. Tambien puede emplearse cualquier procedimiento adecuado de ensayo u obtencion de imagenes de cMet. Los restos de union a cMet segun esta invencion son utiles para la deteccion y/u obtencion de imagenes de cMet in vitro o in vivo, y particularmente para la deteccion y/u obtencion de imagenes de sitios de angiogenesis, en los que HGF y cMet estan implicados de manera mtima, tal como se explica en el presente documento.
In vitro
Para la deteccion de HGF o cMet en disolucion, un polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico de union segun la invencion puede marcarse de manera detectable, por ejemplo, marcarse de manera fluorescente, marcarse de manera enzimatica, o marcarse con un metal radiactivo o paramagnetico, entonces ponerse en contacto con la disolucion, y despues de eso puede detectarse la formacion de un complejo entre el polipeptido de union y la diana cMet. Como ejemplo, puede usarse un peptido de union a cMet marcado de manera fluorescente para ensayos de deteccion in vitro de cMet o el complejo HGF/cMet, en los que el peptido se anade a una disolucion que va a someterse a prueba para detectar cMet o el complejo HGF/cMet en condiciones que permitan que se produzca la union. El complejo entre el peptido de union a cMet marcado de manera fluorescente y cMet o el complejo HGF/cMet diana puede detectarse y cuantificarse, por ejemplo, midiendo la polarizacion de fluorescencia aumentada que surge del peptido unido a cMet o el complejo HGF/cMet con relacion a la del peptido libre.
Alternativamente, puede usarse un ensayo “ELISA” de tipo sandwich, en el que un polipeptido de union a cMet se inmoviliza sobre un soporte solido tal como un pocillo o tubo de plastico, entonces la disolucion que se sospecha que contiene la diana de cMet o el complejo HGF/cMet se pone en contacto con el resto de union inmovilizado, se eliminan por lavado los materiales sin union, y se detecta el polipeptido complejado usando un reactivo de deteccion adecuado, tal como un anticuerpo monoclonal que reconoce cMet o el complejo HGF/cMet. El anticuerpo monoclonal es detectable mediante medios convencionales conocidos en la tecnica, incluyendo marcarse de manera detectable, por ejemplo, radiomarcarse, conjugarse con una enzima tal como peroxidasa de rabano picante y similares, o marcarse de manera fluorescente, etc.
Para la deteccion o purificacion de cMet o el complejo HGF/cMet soluble en o a partir de una disolucion, los polipeptidos o constructos polipeptfdicos multimericos de union de la invencion pueden inmovilizarse sobre un sustrato solido tal como un soporte cromatografico u otro material de matriz, entonces el agente de union inmovilizado puede cargarse o ponerse en contacto con la disolucion en condiciones adecuadas para la formacion de un complejo polipeptido de union/cMet. La parte sin union de la disolucion puede eliminarse y el complejo puede detectarse, por ejemplo, usando un anticuerpo anti-HGF o anti-complejo HGF/cMet, o un anticuerpo anti-polipeptido de union, o la diana cMet o complejo HGF/cMet puede liberarse del resto de union en condiciones de elucion
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
apropiadas.
La biolog^a de proliferacion celular y los papeles de HGF y cMet en su iniciacion y mantenimiento se han investigado por muchos investigadores y sigue siendo un campo activo para investigacion y desarrollo. En apoyo de tal investigacion y desarrollo, se desea disponer de un procedimiento de purificacion de cantidades a granel de cMet o el complejo HGF/cMet en forma pura, y los polipeptidos de union y constructos polipeptfdicos multimericos segun esta invencion son especialmente utiles para ese proposito, usando la metodolog^a de purificacion general descrita anteriormente.
In vivo
Obtencion de imagenes de diagnostico
Un uso particularmente preferido para los polipeptidos y constructos polipeptfdicos multimericos segun la presente invencion es para crear imagenes legibles visualmente de tejido que expresa cMet, tal como, por ejemplo, tumores neoplasicos, que presentan hiperproliferacion. Los polipeptidos y constructos polipeptfdicos multimericos de union a cMet divulgados en el presente documento pueden convertirse en reactivos para obtencion de imagenes mediante la conjugacion de los polipeptidos con un marcador apropiado para la deteccion de diagnostico, opcionalmente mediante un ligador. Preferiblemente, un peptido o constructo polipeptfdico multimerico que muestra una especificidad mucho mayor por cMet o HGF/cMet que por otras protemas sericas se conjuga o se une a un marcador apropiado para la metodologfa de deteccion que vaya a emplearse. Por ejemplo, el polipeptido de union a cMet o el complejo HGF/cMet puede conjugarse con o sin un ligador a un quelato paramagnetico adecuado para la obtencion de imagenes por resonancia magnetica (IRM), con un radiomarcador adecuado para obtencion de imagenes por rayos X, por tomograffa de emision de positrones (PET) o gammagraficas (incluyendo un quelante para un metal radiactivo), con un agente de contraste para ultrasonidos (por ejemplo, una microburbuja estabilizada, un microglobo, una microesfera o lo se ha denominado “liposoma” lleno de gas) adecuado para deteccion por ultrasonidos, o con un colorante para obtencion de imagenes opticas.
Los ligadores adecuados pueden incluir los comentados en el presente documento, incluyendo cadenas de alquilo sustituido o no sustituido, cadenas de aminoacido (por ejemplo, poliglicina), polietilenglicoles, poliamidas, y otros ligadores conocidos en la tecnica.
En general, la tecnica de usar un resto de union a cMet marcado de manera detectable se basa en la premisa de que el marcador genera una senal que es detectable fuera del cuerpo del paciente. Por ejemplo, cuando el resto de union a cMet marcado de manera detectable se administra al paciente en el que se desea detectar, por ejemplo, hiperproliferacion, la alta afinidad del resto de union a cMet por cMet hace que el resto de union se una al sitio de hiperproliferacion y se acumule marcador en el sitio. Se permite tiempo suficiente para que el resto de union marcado se localice en el sitio de proliferacion. La senal generada por el peptido marcado se detecta mediante un dispositivo de exploracion que variara segun el tipo de marcador usado, y la senal se convierte entonces en una imagen del sitio de proliferacion.
En otra realizacion, en vez de marcar directamente un polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico de union a cMet con un marcador detectable o constructo radioterapico, uno o mas peptidos o constructos de la invencion pueden conjugarse con, por ejemplo, avidina, biotina o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se unira al marcador detectable o agente radioterapico. Por ejemplo, uno o mas peptidos de union a cMet pueden conjugarse a estreptavidina (que genera posiblemente union multivalente) para la union in vivo a celulas que expresan cMet. Despues de eliminarse el constructo de direccionamiento no unido del organismo, puede infundirse un marcador detectable o constructo radioterapico biotinilado (por ejemplo, una molecula de quelato complejada con un metal radiactivo) y se concentrara rapidamente en el sitio en el que se une el constructo de direccionamiento. Este enfoque en algunas situaciones puede reducir el tiempo requerido despues de la administracion del marcador detectable hasta que puede tener lugar la obtencion de imagenes. Tambien puede aumentar la relacion senal/ruido en el sitio de la diana, y disminuir la dosis del marcador detectable o constructo radioterapico requerida. Esto es particularmente util cuando se usa un marcador radiactivo o agente radioterapico ya que se reduce la dosis de radiacion que se suministra a sitios normales pero sensibles a la radiacion en el organismo, tales como la medula osea, los rinones y el tugado. Este enfoque, algunas veces denominado predireccionamiento o de dos etapas, o enfoques de tres etapas se reviso por S.F. Rosebrough en Q. J. Nucl. Med., 40:234-251 (1996).
A. Obtencion de imagenes por resonancia magnetica
Los restos de union a cMet de la presente invencion pueden conjugarse ventajosamente con un quelato de metal paramagnetico para formar un agente de contraste para su uso en IRM. Los iones de metal paramagnetico preferidos tienen numeros atomicos de 21-29, 42, 44 o 57-83. Esto incluye iones de las series de metales de transicion o los lantanidos que tienen uno, y mas preferiblemente cinco o mas, electrones desapareados y un momento magnetico de al menos 1,7 magnetones de Bohr. Los metales paramagneticos preferidos incluyen, pero no se limitan a, cromo (III), manganeso (II), manganeso (III), hierro (II), hierro (III), cobalto (II), mquel (II), cobre (II), praseodimio (III), neodimio (III), samario (III), gadolinio (III), terbio (III), disprosio (III), holmio (III), erbio (III), europio
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
(III) e iterbio (III), cromo (III), hierro (III) y gadolinio (III). El cation trivalente, Gd3+, se prefiere particularmente para los agentes de contraste para IRM, debido a su alta capacidad de relajacion y baja toxicidad, con la ventaja adicional de que existe solamente en un estado de oxidacion accesible biologicamente, lo que minimiza la metabolisis no deseada del metal por un paciente. Otro metal util es Cr3+, que es relativamente economico. Se han usado quelatos de Gd(III) para aplicaciones de RM clmicas y radiologicas desde 1988, y aproximadamente el 30% de los examenes por RM emplean actualmente un agente de contraste basado en gadolinio.
El medico seleccionara un metal segun la dosis requerida para detectar proliferacion celular y considerando otros factores tales como la toxicidad del metal para el sujeto. Vease, Tweedle et al., Magnetic Resonance Imaging (2a ed.), vol. 1, Partain et al., Eds. (W.B. Saunders Co. 1988), pags. 796-797. Generalmente, la dosis deseada para un metal individual sera proporcional a su capacidad de relajacion, modificada por la biodistribucion, farmacocinetica y metabolismo del metal.
El quelante de metal paramagnetico es una molecula que tiene uno o mas grupos polares que actuan como ligando para, y se complejan con, un metal paramagnetico. Se conocen quelantes adecuados en la tecnica e incluyen acidos con grupos acido metilenfosfonico, grupos acido metilencarbohidroxammicos, grupos carboxietilideno o grupos carboximetileno. Los ejemplos de quelantes incluyen, pero no se limitan a, acido dietilentriaminapentaacetico (DTPA), acido 1,4,7,10-tetraazaciclotetradecano-1,4,7,10-tetraacetico (DOTA), 1,4,7,-tricarboximetil-1,4,7,10- teraazaciclododecano 1 -sustituido (DO3A), acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) y acido 1,4,8,11-tetra- azaciclotetradecano-1,4,8,11-tetraacetico (TETA). Son ligandos de quelacion adicionales etilenbis-(2-hidroxi- fenilglicina) (EHPG), y derivados de la misma, incluyendo 5-Cl-EHPG, 5-Br-EHPG, 5-Me-EHPG, 5-t-Bu-EHPG y 5- sec-Bu-EHPG; acido benzodietilentriaminapentaacetico (benzo-DTPA) y derivados del mismo, incluyendo dibenzo- DTPA, fenil-DTPA, difenil-DTPA, bencil-DTPA y dibencil-DTPA; acido bis-2(hidroxibencil)etilendiaminodiacetico (HBED) y derivados del mismo; la clase de compuestos macrodclicos que contienen al menos 3 atomos de carbono, mas preferiblemente al menos 6, y al menos dos heteroatomos (O y/o N), compuestos macrodclicos que pueden consistir en un anillo, o dos o tres anillos unidos entre sf en los elementos de heteroanillo, por ejemplo, benzo-DOTA, dibenzo-DOTA y benzo-NOTA, en el que NOTA es acido 1,4,7-triazaciclononano-N,N',N”-triacetico, benzo-TETA, benzo-DOTMA, en el que DOTMA es acido 1,4,7,10-tetraazacidotetradecano-1,4,7,10-tetra(metiltetraacetico) y benzo-TETMA, en el que TETMA es acido 1,4,8,11-tetraazadclotetradecano-1,4,8,11-(metiltetraacetico); derivados de acido 1,3-propilendiaminatetraacetico (PDTA) y acido trietilentetraaminahexaacetico (TTHA); derivados de 1,5,10?N,N',N”-tris(2,3-dihidroxibenzoil)tricatecolato (LICAM); y 1,3,5-N,N',N”-tris(2,3-
dihidroxibenzoil)aminometilbenceno (MECAM). Un quelante preferido para su uso en la presente invencion es DTPA y se prefiere particularmente el uso de DO3A. Se describen ejemplos de quelantes y grupos de quelacion representativos contemplados por mediante la presente invencion en los documentos WO 98/18496, WO 86/06605, WO 91/03200, WO95/28179, WO 96/23526, WO 97/36619, PCT/US98/01473, PCT/US98/20182 y US 4.899.755, US 5.474.756, US 5.846.519 y US 6.143.274.
Segun la presente invencion, el quelante del agente de contraste para IRM se acopla al polipeptido de union a cMet. La colocacion del quelato debe seleccionarse de modo que no interfiera en la afinidad de union o especificidad del polipeptido de union a cMet. Preferiblemente, el quelato se adicionara o bien al extremo N-terminal o bien al extremo C-terminal, sin embargo el quelato tambien puede unirse en cualquier lugar dentro de la secuencia. En realizaciones preferidas, un quelante que tiene un grupo acido carboxflico central libre (por ejemplo, DTPA-Asp(P-COOH)-)OtBu) facilita unirlo en el extremo N-terminal del peptido mediante la formacion de un enlace amida. El quelato tambien puede unirse en el extremo C-terminal con la ayuda de un ligador. Alternativamente, puede emplearse qmmica de conjugacion de isotiocianato como modo de unir el grupo isotiocianato apropiado que porta DTPA a un grupo amino libre en cualquier lugar dentro de la secuencia peptfdica.
En general, el resto de union a cMet puede unirse directamente o de manera covalente al quelante de metal (u otro marcador detectable), o puede acoplarse o conjugarse al quelante de metal usando un ligador, que puede ser, sin limitacion, uniones amida, urea, acetal, cetal, ester doble, carbonilo, carbamato, tiourea, sulfona, tioester, ester, eter, disulfuro, lactona, imina, fosforilo o fosfodiester; cadenas de alquilo sustituido o no sustituido saturado o insaturado; cadenas de aminoacido lineal, ramificado o dclico de un unico aminoacido o diferentes aminoacidos (por ejemplo, extensiones del extremo N o C-terminal del resto de union a cMet); polietilenglicoles derivatizados o no derivatizados (PEG), cadenas de polioxietileno o polivinilpiridina; cadenas de poliamida sustituida o no sustituida; cadenas de poliamina derivatizada o no derivatizada, poliester, polietilenimina, poliacrilato, poli(alcohol vimlico), poliglicerol u oligosacarido (por ejemplo, dextrano); copolfmeros de bloques alternos; acidos malonico, sucdnico, glutarico, adfpico y pimelico; acido caproico; diaminas y dialcoholes simples; cualquiera de los demas ligadores divulgados en el presente documento; o cualquier otro ligador polimerico simple conocido en la tecnica (veanse, por ejemplo, los documentos WO 98/18497 y Wo 98/18496). Preferiblemente, el peso molecular del ligador puede controlarse estrechamente. Los pesos moleculares pueden oscilar en magnitud desde menos de 100 hasta mas de 1000. Preferiblemente, el peso molecular del ligador es de menos de 100. Ademas, puede desearse utilizar un ligador que sea biodegradable in vivo para proporcionar rutas de excrecion eficaces para los reactivos de obtencion de imagenes de la presente invencion. Dependiendo de su ubicacion dentro del ligador, tales funcionalidades biodegradables pueden incluir funcionalidades ester, ester doble, amida, fosfoester, eter, acetal y cetal.
En general, pueden usarse procedimientos conocidos para acoplar el quelato de metal y el resto de union a cMet
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
usando tales ligadores (documentos WO 95/28967, WO 98/18496, WO 98/18497 y los comentarios en los mismos). El resto de union a cMet puede unirse a traves de un extremo N o C-terminal mediante un enlace amida, por ejemplo, a un nitrogeno de estructura principal de coordinacion a metal de un quelato de metal o a un brazo de acetato del propio quelato de metal. La presente invencion contempla la union del quelato en cualquier posicion, siempre que el quelato de metal conserve la capacidad para unirse al metal estrechamente para minimizar la toxicidad. De manera similar, el resto de union a cMet puede modificarse o alargarse para generar un locus para la union a un quelato de metal, siempre que tal modificacion o alargamiento no elimine su capacidad para unirse a cMet.
Los reactivos de contraste para IRM preparados segun las divulgaciones en el presente documento pueden usarse de la misma manera que los reactivos de contraste para IRM convencionales. Cuando se obtienen imagenes de un sitio de hiperproliferacion, por ejemplo, pueden preferirse determinadas tecnicas de RM y secuencias de impulsos para potenciar el contraste del sitio con respecto a la sangre y los tejidos de fondo. Estas tecnicas incluyen (pero no se limitan a), por ejemplo, secuencias de angiograffa de sangre negra que tratan de hacer que la sangre se vea oscura, tal como secuencias de eco de espm rapido (Alexander, A. et al., 1998. Magn. Reson. Med., 40: 298-310) y secuencias de eco en gradiente de flujo incoherente (Edelman, Ret al., 1990. Radiology, 177: 45-50). Estos procedimientos tambien incluyen tecnicas independientes de flujo que potencian la diferencia en contraste, tales como secuencias preparadas de inversion-recuperacion o secuencias preparadas de saturacion-recuperacion que aumentaran el contraste entre tumor angiogenico y tejidos de fondo. Finalmente, preparaciones de transferencia de magnetizacion tambien pueden mejorar el contraste con estos agentes (Goodrich, K. et al., 1996. Invest. Radiol., 31: 323-32).
Se administra el reactivo marcado al paciente en forma de una composicion inyectable. El procedimiento de administracion del agente de contraste para IRM es preferiblemente por via parenteral, lo que significa por via intravenosa, por via intraarterial, por via intratecal, por via intersticial o por via intracavitaria. Para la obtencion de imagenes de angiogenesis activa, se prefiere administracion intravenosa o intraarterial. Para IRM, se contempla que el sujeto reciba una dosificacion de agente de contraste suficiente como para potenciar la senal de RM en el sitio de angiogenesis en al menos el 10 %. Despues de la inyeccion con el resto de union a cMet-que contiene el reactivo para IRM, se explora al paciente en la maquina de IRM para determinar la ubicacion de cualquier sitio de hiperproliferacion. En practicas terapeuticas, tras la identificacion de un sitio de hiperproliferacion (por ejemplo, tumor), puede administrarse inmediatamente un agente tumoricida o agente antihiperproliferativo (por ejemplo, inhibidores de HGF), si es necesario, y posteriormente puede explorarse al paciente para visualizar regresion tumoral o detencion de la angiogenesis.
B. Obtencion de imagenes por ultrasonidos
Cuando se transmiten ultrasonidos a traves de una sustancia, las propiedades acusticas de la sustancia dependeran de la velocidad de las transmisiones y la densidad de la sustancia. Los cambios en las propiedades acusticas seran mas prominentes en la interfase de diferentes sustancias (solidos, lfquidos, gases). Los agentes de contraste para ultrasonidos son intensos reflectores de ondas sonoras debido a las diferencias acusticas entre el agente y el tejido circundante. Los agentes de contraste para ultrasonidos que contienen gas o que generan gas son particularmente utiles debido a la diferencia acustica entre lfquido (por ejemplo, sangre) y el agente de contraste para ultrasonidos que contiene gas o que genera gas. Debido a su tamano, los agentes de contraste para ultrasonidos que comprenden microburbujas, microglobos, y similares pueden permanecer durante un tiempo mas prolongado en el torrente sangumeo despues de inyeccion que otros restos detectables; por tanto un agente para ultrasonidos espedfico de cMet dirigido podra demostrar una obtencion de imagenes superior de sitios de hiperproliferacion (por ejemplo, cancer) y angiogenesis.
En este aspecto de la invencion, el resto de union a cMet puede unirse a un material que es util para la obtencion de imagenes por ultrasonidos. Por ejemplo, uno o mas polipeptidos o constructos polipeptfdicos multimericos de union a cMet pueden unirse a materiales empleados para formar vesfculas (por ejemplo, microburbujas, microglobos, microesferas, etc.), o emulsiones que contienen un lfquido o gas, que funciona como marcador detectable (por ejemplo, un gas ecogenico o material que puede generar un gas ecogenico). Los materiales para la preparacion de tales vesfculas incluyen tensioactivos, lfpidos, esfingolfpidos, oligolfpidos, fosfolfpidos, protemas, polipeptidos, hidratos de carbono, y materiales polimericos sinteticos o naturales (documentos WO 98/53857, WO 98/18498, WO 98/18495, WO 98/18497, WO 98/18496 y WO 98/18501).
Para los agentes de contraste que comprenden suspensiones de microburbujas estabilizadas (una realizacion preferida), se prefieren fosfolfpidos, y particularmente fosfolfpidos saturados. Los ejemplos de fosfolfpidos adecuados incluyen esteres de glicerol con una o dos moleculas de acidos grasos (iguales o diferentes) y con acido fosforico, en el que el residuo de acido fosforico se une a su vez a un grupo hidrofilo, tal como colina, serina, inositol, glicerol, etanolamina, y grupos similares. Los acidos grasos presentes en los fosfolfpidos son, en general, acidos alifaticos de cadena larga, que contienen normalmente desde 12 hasta 24 atomos de carbono, preferiblemente desde 14 hasta 22, que pueden ser saturados o pueden contener una o mas insaturaciones. Son ejemplos de acidos grasos adecuados acido laurico, acido minstico, acido palmftico, acido estearico, acido araquidonico, acido behenico, acido oleico, acido linoleico y acido linolenico. Tambien se conocen monoesteres de fosfolfpido en la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
tecnica como las formas “liso” de los fosfoKpidos. Son ejemplos adicionales de fosfoKpido acidos fosfatfdicos, es dedr, los diesteres del acido glicerolfosforico con acidos grasos, esfingomielinas, es decir, aquellos analogos de fosfatidilcolina en los que el residuo de diester de glicerol con acidos grasos se reemplaza por una cadena de ceramida, cardiolipinas, es decir, los esteres de 1,3-difosfatidilglicerol con un acido graso, gangliosidos, cerebrosidos, etc.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “fosfoUpidos” incluye productos que se producen de manera natural, semisinteticos o preparados de manera sintetica que pueden emplearse o bien individualmente o bien como mezclas.
Son ejemplos de fosfolfpidos que se producen de manera natural las lecitinas naturales (derivados de fosfatidilcolina (PC)) tales como, normalmente, lecitinas de soja y de yema de huevo. Son ejemplos de fosfolfpidos semisinteticos los derivados parcial o totalmente hidrogenados de las lecitinas que se producen de manera natural.
Son ejemplos de fosfolfpidos sinteticos, por ejemplo, dilauriloilfosfatidilcolina, (“DLPC”), dimiristoilfosfatidilcolina (“DMPC”), dipalmitoilfosfatidilcolina (“DpPC”), diaraquidoilfosfatidilcolina (“DAPC”), diestearoilfosfatidilcolina (“DSPC”), 1 -miristoil-2-palmitoilfosfatidilcolina (“MPPC”), 1 -palmitoil-2-miristoilfosfatidilcolina (“PMPC”), 1 -palmitoil-2- estearoilfosfatidilcolina (“PSPC”). 1 -estearoil-2-palmitoilfosfatidilcolina (“SPPC”), dioleoilfosfatidilcolina ('dOpC”), 1,2- diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (etil-DSPC), dilauriloilfosfatidilglicerol (“DLPG”) y sus sales de metal alcalino, diaraquidoilfosfatidilglicerol (“DAPG”) y sus sales de metal alcalino, dimiristoilfosfatidilglicerol (“DMPG”) y sus sales de metal alcalino, dipalmitoilfosfatidilglicerol (“DPPG”) y sus sales de metal alcalino, diestearolifosfatidilglicerol (“DSPG”) y sus sales de metal alcalino, dioleoilfosfatidilglicerol (“DOPG”) y sus sales de metal alcalino, acido dimiristoilfosfatidico (“DMPA”) y sus sales de metal alcalino, acido dipalmitoilfosfatfdico (“DPPA”) y sus sales de metal alcalino, acido diestearoilfosfatfdico (“DSPA”), acido diaraquidoilfosfatfdico (“DAPA”) y sus sales de metal alcalino, dimiristoilfosfatidiletanolamina (“DMPE”), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (“DPPE”), diestearoilfosfatidiletanolamina (“DSPE”), dimiristoilfosfatidilserina (“DMPS”), diaraquidoilfosfatidilserina (“DAPS”), dipalmitoilfosfatidilserina (“DPPS”), diestearoilfosfatidilserina (“DSPS”), dioleoilfosfatidilserina (“DOPS”), dipalmitoilesfingomielina (“DPSP”) y diestearoilesfingomielina (“DSSP”). En una realizacion preferida, al menos uno de los restos de fosfolfpido tiene la estructura mostrada en las figuras 7A o 7B, y descrita en el documento US 5.686.060.
Otros fosfolfpidos preferidos incluyen dipalmitoilfosfatidilcolina, acido dipalmitoilfosfatidico y dipalmitoilfosfatidilserina. Las composiciones tambien pueden contener PEG-4000 y/o acido palmftico. Puede emplearse cualquiera de los gases divulgados en el presente documento o conocidos por el experto en la tecnica; sin embargo, se prefieren gases inertes, tales como SF6 o fluorocarbonos como CF4, C3F8 y C4F10.
Las microburbujas llenas de gas preferidas pueden prepararse mediante medios conocidos en la tecnica, tales como, por ejemplo, mediante un procedimiento descrito en una cualquiera de las siguientes patentes: EP 554213, US 5.413.774, US 5.578.292, EP 744962, EP 682530, US 5.556.610, US 5.846.518, US 6.183.725, EP 474833, US 5.271.928, US 5.380.519, US 5.531.980, US 5.567.414, US 5.658.551, US 5.643.553, US 5.911.972, US 6.110.443, US 6.136.293, EP 619743, US 5.445.813, US 5.597.549, US 5.686.060, US 6.187.288 y US 5.908.610.
Las suspensiones de microburbuja preferidas pueden prepararse a partir de fosfolfpidos usando procedimientos conocidos tales como deshidrocongelacion o secado por pulverizacion de disoluciones de los fosfolfpidos en bruto en un disolvente adecuado o usando los processos expuestos en los documentos EP 554213; US 5.413.774; US 5.578.292; EP 744962; EP 682530; US 5.556.610; US 5.846.518; US 6.183.725; EP 474833; US 5.271.928; US 5.380.519; US 5.531.980; US 5.567.414;US 5;658.551; US 5.643.553; US 5.911.972; US 6.110.443; US 6.136.293; EP 619743; US5.445.813; US 5.597.549; US 5.686.060; US 6.187.288; y US 5.908.610. Lo mas preferiblemente, los fosfolfpidos se disuelven en un disolvente organico y la disolucion se seca sin pasar a traves de una fase de formacion de liposomas. Esto puede realizarse disolviendo los fosfolfpidos en un disolvente organico adecuado junto con una sustancia estabilizadora hidrofila o un compuesto soluble tanto en el disolvente organico como en agua y deshidrocongelando o secando por pulverizacion la disolucion. En esta realizacion, los criterios usados para la seleccion del estabilizador hidrofilo es su solubilidad en el disolvente organico de eleccion. Son ejemplos de compuestos estabilizadores hidrofilos solubles en agua y el disolvente organico, por ejemplo, un polfmero como polivinilpirrolidona (PVP), poli(alcohol vimlico) (PVA), polietilenglicol (PEG), etc., acido malico, acido glicolico, maltol, y similares. Tales compuestos hidrofilos tambien ayudan en la homogeneizacion de la distribucion de tamano de las microburbujas y potencian la estabilidad en almacenamiento. Puede usarse cualquier disolvente organico adecuado siempre que su punto de ebullicion sea lo suficientemente bajo y su punto de fusion sea lo suficientemente alto como para facilitar el secado posterior. Los disolventes organicos tfpicos incluyen, por ejemplo, dioxano, ciclohexanol, terc- butanol, tetraclorodifluoroetileno (C2CUF2) o 2-metil-2-butanol. Se prefieren 2-metil-2-butanol y C2CUF2.
Antes de la formacion de la suspension de microburbujas mediante dispersion en un portador acuoso, los polvos deshidrocongelados o secados por pulverizacion se ponen en contacto con aire u otro gas. Cuando se ponen en contacto con el portador acuoso, los fosfolfpidos pulverizados cuya estructura se ha perturbado formaran segmentos lamelarizados o laminarizados que estabilizaran las microburbujas del gas dispersado en ellas. Este procedimiento permite la produccion de suspensiones de microburbujas que son estables incluso cuando se almacenan durante
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
periodos prolongados, y se obtienen mediante simple disolucion de los fosfoUpidos laminarizados secados, que se han almacenado bajo un gas deseado, sin sacudidas ni una agitacion violenta.
A menos que contenga un gas hiperpolarizado, que se sabe que requiere condiciones de almacenamiento especiales, el residuo liofilizado o deshidrocongelado puede almacenarse y transportarse sin necesidad de control de temperature de su entorno y en particular puede suministrarse a hospitales y medicos para formulacion in situ en una suspension administrable lista para usar sin requerir que tales usuarios dispongan de instalaciones de almacenamiento especiales.
Preferiblemente en tal caso puede suministrarse en forma de un kit de dos componentes. El kit de dos componentes puede incluir dos recipientes independientes o un recipiente de doble camara. En el primer caso, preferiblemente el recipiente es un vial sellado con septo convencional, en el que el vial que contiene el residuo liofilizado de la etapa b) se sella con un septo a traves del que puede inyectarse el lfquido portador usando una jeringa opcionalmente precargada. En tal caso, la jeringa usada como recipiente del segundo componente tambien se usa entonces para inyectar el agente de contraste. En el ultimo caso, preferiblemente el recipiente de doble camara es una jeringa de doble camara y una vez que se ha reconstituido el residuoliofilizado/deshidrocongelado y entonces se ha mezclado adecuadamente o agitado suavemente, el recipiente puede usarse directamente para inyectar el agente de contraste. En ambos casos, se proporcionan medios para dirigir o permitir la aplicacion de suficiente energfa de formacion de burbuja al contenido del recipiente. Sin embargo, tal como se indico anteriormente, en los agentes de contraste estabilizados, el tamano de las microburbujas de gas es sustancialmente independiente de la cantidad de energfa de agitacion aplicada al producto secado reconstituido. Por consiguiente no se requiere mas que agitacion manual suave generalmente para dar productos reproducibles con tamano de microburbuja sistematico.
Un experto habitual en la tecnica puede apreciar que otros sistemas de reconstitucion de dos camaras capaces de combinar el polvo secado con la disolucion acuosa de manera esteril tambien estan dentro del alcance de la presente invencion. En tales sistemas, es particularmente ventajoso que la fase acuosa pueda interponerse entre el gas insoluble en agua y el entorno, para aumentar la vida util en almacenamiento del producto. Cuando un material necesario para formar el agente de contraste no esta ya presente en el recipiente (por ejemplo, un resto de union a cMet de la invencion que va a unirse al fosfolfpido durante la reconstitucion), puede envasarse con los demas componentes del kit, preferiblemente en una forma o un recipiente adaptado para facilitar una rapida combinacion con los demas componentes del kit.
No se requieren recipientes, viales o sistemas de conexion espedficos; la presente invencion puede usar recipientes, viales y adaptadores convencionales. El unico requisito es un buen sello entre el tapon y el recipiente. La calidad del sello se vuelve, por tanto, un asunto de preocupacion primordial; cualquier degradacion de la integridad del sello podna permitir que entrasen en el vial sustancias no deseadas. Ademas de garantizar la esterilidad, la retencion de vado es esencial para productos taponados a presion ambiental o presion reducida para garantizar una reconstitucion segura y apropiada. En cuanto al tapon, puede ser de un compuesto o formulacion multicomponente basada en un elastomero, tal como poli(isobutileno) o caucho de butilo.
Alternativamente, pueden prepararse microburbujas suspendiendo un gas en una disolucion acuosa a alta velocidad de agitacion tal como se divulga, por ejemplo, en el documento WO 97/29783. Un procedimiento adicional para preparar microburbujas se divulga en la solicitud de patente europea en tramitacion junto con la presente n° 03002373, que comprende preparar una emulsion de un disolvente organico en un medio acuoso en presencia de un fosfolfpido y posteriormente liofilizar dicha emulsion, despues de etapas opcionales de lavado y/o filtracion.
Pueden incluirse aditivos conocidos por los expertos habituales en la tecnica en las suspensiones de microburbujas estabilizadas. Por ejemplo, pueden anadirse tensioactivos no formadores de pelfcula, incluyendo polioxipropilenglicol y polioxietilenglicol y compuestos similares, asf como diversos copolfmeros de los mismos; acidos grasos tales como acido minstico, acido palmttico, acido estearico, acido araquidonico o sus derivados, ergosterol, fitosterol, sitosterol, lanosterol, tocoferol, galato de propilo, palmitato de ascorbilo e hidroxitolueno butilado. La cantidad de estos tensioactivos no formadores de pelfcula es habitualmente de hasta el 50 % en peso de la cantidad total de tensioactivos pero preferiblemente de entre el 0 y el 30 %.
En aplicaciones con ultrasonidos, los agentes de contraste formados por microburbujas estabilizadas con fosfolfpido pueden administrarse, por ejemplo, en dosis de tal manera que la cantidad de fosfolfpido inyectada este en el intervalo de 0,1 a 200 |ig/kg de peso corporal, preferiblemente desde aproximadamente 0,1 hasta 30 |ig/kg.
Otras suspensiones que contienen gas incluyen las divulgadas, por ejemplo, en los documentos US 5.798.091, WO 97/29783, tambien EP 881 915. Estos agentes pueden prepararse tal como se describe en los documentos US 5.798.091 o WO97/29783.
Otro agente de contraste para ultrasonidos preferido comprende microglobos. El termino “microglobo” se refiere a cuerpos llenos de gas con una envuelta o lfmite material. Puede hallarse mas informacion sobre formulaciones y procedimientos de preparacion de microglobos en los documentos EP 324 938 (US 4.844.882); US 5.711.933; uS 5.840.275; US 5.863.520; US 6.123.922; US 6.200.548; US 4.900.540; US 5.123.414; US 5.230.882; US 5.469.854;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
US 5.585.112; US 4.718.433; US 4.774.958; WO 95/01187; US 5.529.766; US 5.536.490; y US 5.990.263.
Los microglobos preferidos tienen una envuelta que incluye un polfmero compatible fisiologicamente biodegradable o un lfpido solido biodegradable. Los polfmeros utiles para la preparacion de los microglobos pueden seleccionarse de los poKmeros compatibles fisiologicamente biodegradables, tales como cualquiera de los descritos en cualquiera de las siguientes patentes: EP 458745; US 5.711.933; US 5.840.275; EP 554213; US 5.413.774; y US 5.578.292. En particular, el polfmero puede seleccionarse de polfmeros compatibles fisiologicamente biodegradables, tales como polisacaridos de baja solubilidad en agua, polilactidas y poliglicolidas y sus copolfmeros, copolfmeros de lactidas y lactonas tales como e-caprolactona, y-valerolactona y polipeptidos. Otros polfmeros adecuados incluyen poli(orto)esteres (veanse por ejemplo los documentos US 4.093.709; US 4.131.648; US 4.138.344; US 4.180.646); acido polilactico y poliglicolico y sus copolfmeros, por ejemplo DEXON (Heller, J., 1980. Biomaterials, 1:51-57); poli(DL-lactida-co-e-caprolactona), poli(DL-lactida-co-y-valerolactona), poli(DL-lactida-co-y-butirolactona),
polialquilcianoacrilatos; poliamidas, polihidroxibutirato; polidioxanona; poli-p-aminocetonas (Polymer, 23:1693 (1982)); polifosfazenos (Allcock, H., 1976. Science, 193:1214-1219); y polianfudridos. Los microglobos tambien pueden prepararse segun los procedimientos del documento WO 96/15815, en los que los microglobos se preparan a partir de una membrana biodegradable que comprende lfpidos biodegradables, preferiblemente seleccionados de mono-, di-, trigliceridos, acidos grasos, esteroles, ceras y mezclas de los mismos. Son lfpidos preferidos di- o trigliceridos, por ejemplo di- o tri-miristina, -palmitina o - estearina, en particular tripalmitina o triestearina.
Los microglobos pueden emplear cualquiera de los gases divulgados en el presente documento conocidos por el experto en la tecnica; sin embargo, se prefieren gases inertes tales como gases fluorados. Los microglobos pueden suspenderse en un portador lfquido farmaceuticamente aceptable con aditivos opcionales conocidos por los expertos habituales en la tecnica y estabilizadores.
Los agentes de contraste que contienen microglobos se administran normalmente en dosis de tal manera que la cantidad de lfpido o polfmero formador de pared es desde aproximadamente 10 |ig/kg hasta aproximadamente 20 |ig/kg de peso corporal.
Otras formulaciones de agente de contraste que contiene gas incluyen micropartfculas (especialmente agregados de micropartfculas) que tienen gas contenido en las mismas o asociado de otro modo con las mismas (por ejemplo adsorbiendose sobre la superficie de las mismas y/o contenido dentro de huecos, cavidades o poros en las mismas). Los procedimientos para la preparacion de estos agentes son tal como se describen en los documentos EP 0122624; EP 0123235; EP 0365467; US 5.558.857; US 5.607.661; US 5.637.289; US 5.558.856; US 5.137.928; WO 95/21631 o WO 93/13809.
Cualquiera de estas composiciones para ultrasonidos tambien debe ser, en la medida de lo posible, isotonica con la sangre. Asf, antes de la inyeccion, pueden anadirse pequenas cantidades de agentes isotonicos a cualquiera de las suspensiones de agente de contraste para ultrasonidos anteriores. Los agentes isotonicos son disoluciones fisiologicas usadas habitualmente en medicina y comprenden solucion salina acuosa (NaCl al 0,9 %), disolucion de glicerol al 2,6 %, disolucion de dextrosa al 5 %, etc. Adicionalmente, las composiciones para ultrasonidos pueden incluir aditivos farmaceuticamente aceptables convencionales, incluyendo, por ejemplo, agentes emulsionantes, modificadores de viscosidad, crioprotectores, lioprotectores, agentes de carga, etc.
Puede usarse cualquier gas biocompatible en los agentes de contraste para ultrasonidos utiles en la invencion. El termino “gas” tal como se usa en el presente documento incluye cualquier sustancia (incluyendo mezclas) sustancialmente en forma gaseosa a la temperatura corporal humana normal. Por tanto, el gas puede incluir, por ejemplo, aire, nitrogeno, oxfgeno, CO2, argon, xenon o kripton, gases fluorados (incluyendo por ejemplo, perfluorocarbonos, SF6, SeF6) un hidrocarburo de bajo peso molecular (por ejemplo, que contiene desde 1 hasta 7 atomos de carbono), por ejemplo, un alcano tal como metano, etano, un propano, un butano o un pentano, un cicloalcano tal como ciclopropano, ciclobutano o ciclopenteno, un alqueno tal como etileno, propeno, propadieno o un buteno, o un alquino tal como acetileno o propino y/o mezclas de los mismos. Sin embargo, se prefieren gases fluorados. Los gases fluorados incluyen materiales que contienen al menos un atomo de fluor tal como SF6, freones (compuestos organicos que contienen uno o mas atomos de carbono y fluor, es decir, CF4, C2F6, C3F8, C4F8, C4F10, CBrF3, CCI2F2, C2CIF5 y CBrClF2) y perfluorocarbonos. El termino perfluorocarbono se refiere a compuestos que contienen solamente atomos de carbono y fluor e incluye, en particular, perfluorocarbonos saturados, insaturados y dclicos. Los perfluorocarbonos saturados, que se prefieren habitualmente, tienen la formula CnFn+2, donde n es desde 1 hasta 12, preferiblemente desde 2 hasta 10, lo mas preferiblemente desde 3 hasta 8 e incluso mas preferiblemente desde 3 hasta 6. Los perfluorocarbonos adecuados incluyen, por ejemplo, CF4, C2F6, C3F8 C4F8, C4F10, C5F12, C6F12, C7F14, C8F18 y C9F20. Lo mas preferiblemente, el gas o la mezcla gaseosa comprende SF6 o un perfluorocarbono seleccionado del grupo que consiste en C3F8, C4F8, C4F10, C5F12, C6F12, C7F14, C8F18, prefiriendose particularmente C4F10. Veanse tambien los documentos WO 97/29783, WO 98/53857, WO 98/18498, WO 98/18495, WO 98/18496, WO 98/18497, WO 98/18501, WO 98/05364, WO 98/17324.
En determinadas circunstancias puede desearse incluir un precursor de una sustancia gaseosa (por ejemplo, un material que es capaz de convertirse en un gas in vivo, denominado a menudo “precursor de gas”). Preferiblemente
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
el precursor de gas y el gas que produce son fisiologicamente aceptables. El precursor de gas puede activarse por pH, fotoactivarse, activarse por temperatura, etc. Por ejemplo, determinados perfluorocarbonos pueden usarse como precursores de gas activados por temperatura. Estos perfluorocarbonos, tales como perfluoropentano, tienen una temperatura de transicion de fase lfquido/gas por encima de la temperatura ambiente (o la temperatura a la que se producen y/o almacenan los agentes) pero por debajo de la temperatura corporal; por tanto experimentan un cambio de fase y se convierten en un gas dentro del cuerpo humano.
El gas puede comprender una mezcla de gases. Las siguientes combinaciones son mezclas de gases preferidas particularmente: una mezcla de gases (A) y (B) en la que, al menos uno de los gases (B), presente en una cantidad de entre el 0,5 - 41% en vol., tiene un peso molecular mayor de 80 daltons y es un gas fluorado y (A) se selecciona del grupo que consiste en aire, oxfgeno, nitrogeno, dioxido de carbono y mezclas de los mismos, siendo el resto de la mezcla el gas A.
Puesto que las vesreulas para ultrasonidos puede ser mas grandes que otros marcadores detectables descritos en el presente documento, pueden unirse o conjugarse a una pluralidad de polipeptidos o constructos polipeptfdicos multimericos de union a cMet para aumentar la eficiencia de direccionamiento del agente. La union a los agentes de contraste para ultrasonidos descritos anteriormente (o conocidos por los expertos en la tecnica) puede ser mediante enlace covalente directo entre el polipeptido de union a cMet y el material usado para producir la vesreula o mediante un ligador, tal como se describio previamente. Por ejemplo, vease el documento WO 98/53857 generalmente para una descripcion de la union de un peptido a un ligador de PEG bifuncional, que se hace reaccionar entonces con una composicion de liposoma (Lanza, G. et al., 1997. Ultrasound Med. Biol., 23:863-870)). La estructura de estos compuestos comprende normalmente:
a) una parte hidrofoba, compatible con el material que forma la envuelta de la microburbuja o del microglobo, para permitir una incorporacion eficaz del compuesto en la envuelta de la vesreula; dicha parte es normalmente un resto iipfdico (por ejemplo, dipalmitina, diestearoflo);
b) un espaciador (normalmente PEG de diferentes pesos moleculares), que puede ser opcional en algunos casos (las microburbujas pueden demostrar ser, por ejemplo, diffciles de deshidrocongelarsecar si el espaciador es demasiado largo) o preferido en otros (por ejemplo, los peptidos pueden ser menos activos cuando se conjugan a un microglobo con un espaciador corto);
c) un grupo reactivo capaz de reaccionar con un resto reactivo correspondiente en el peptido que va a conjugarse (por ejemplo, maleimido con el grupo -SH de cistema).
Pueden usarse varios procedimientos para preparar suspensiones de microburbujas conjugadas con polipeptidos de union a cMet. Por ejemplo, pueden prepararse microburbujas derivatizadas con maleimida incorporando el 5 % (p/p) de N-MPB-PE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-4-(p-maleimido-fenilbutiramida), (Avanti Polar-Lipids, Inc., Alabaster, AL) en la formulacion de fosfolfpido. Entonces, se anaden disoluciones de peptidos de union a cMet mercaptoacetilados (10 mg/ml en DMF), que se han incubado en disolucion de desacetilacion (fosfato de sodio 50 mM, EDTA 25 mM, hidroxilamina 0,5 M. HCl, pH 7,5) a la suspension de microburbujas derivatizadas con maleimida. Despues de incubacion en la oscuridad, con agitacion suave, las microburbujas conjugadas con peptido pueden purificarse mediante centrifugacion.
Alternativamente, pueden prepararse microburbujas conjugadas con polipeptido de union a cMet usando biotina/avidina. Por ejemplo, pueden prepararse microburbujas conjugadas con avidina usando una suspension de microburbujas de fosfolfpido activado con maleimida, preparada tal como se describio anteriormente, que se anade a avidina mercaptoacetilada (que se ha incubado con disolucion de desacetilacion). Entonces se anaden peptidos de union a cMet biotinilados (preparados tal como se describe en el presente documento) a la suspension de microburbujas conjugadas con avidina, produciendo una suspension de microburbujas conjugadas con peptidos de union a cMet.
Las tecnicas de obtencion de imagenes por ultrasonidos, que pueden usarse segun la presente invencion, incluyen tecnicas conocidas, tales como tecnicas de obtencion de imagenes Doppler de color, Doppler de potencia, Doppler de amplitud, acusticas estimuladas y bi- o tridimensionales. La obtencion de imagenes puede realizarse en modos armonicos (frecuencia resonante) o modos fundamentales, prefiriendose el segundo armonico.
C. Obtencion de imagenes opticas, obtencion de imagenes por sonoluminiscencia o fotoacusticas
Segun la presente invencion, pueden emplearse varios parametros opticos para determinar la ubicacion de cMet o el complejo HGF/cMet con obtencion de imagenes con luz in vivo despues de inyectar al sujeto polipeptidos de union a cMet marcados opticamente. Los parametros opticos que van a detectarse en la preparacion de una imagen pueden incluir radiacion transmitida, absorcion, emision fluorescente o fosforescente, reflexion de luz, cambios en absorbancia, amplitud o maximos, y radiacion dispersada elasticamente. Por ejemplo, el tejido biologico es relativamente translucido a la luz en el intervalo de longitud de onda del infrarrojo cercano (NIR) de 650-1000 nm. La radiacion NIR puede penetrar en el tejido hasta varios centimetres, permitiendo el uso de los polipeptidos o
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
constructos polipeptidicos multimericos de union a cMet de la presente invencion para la obtencion de imagenes opticas de cMet o el complejo HGF/cMet in vivo.
Los polipeptidos o constructos polipeptidicos multimericos de union a cMet pueden conjugarse con fotomarcadores, tales como, por ejemplo, colorantes opticos, incluyendo fluoroforos o cromoforos organicos, que tienen sistemas de anillos deslocalizados extensos y que tienen maximos de absorcion o emision en el intervalo de 400-1500 nm. El polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico de union a cMet puede derivatizarse alternativamente con una molecula bioluminiscente. El intervalo preferido de maximos de absorcion para fotomarcadores es de entre 600 y 1000 nm para minimizar la interferencia con la senal de hemoglobina. Preferiblemente, los marcadores de fotoabsorcion tienen grandes absortividades molares, por ejemplo, mayores de 105 cm"1M"1, mientras que los colorantes opticos fluorescentes tendran altos rendimientos cuanticos. Los ejemplos de colorantes opticos incluyen, pero no se limitan a los descritos en los documentos WO 98/18497, WO 98/18496, WO 98/18495, WO 98/18498, WO 98/53857, WO 96/17628, WO 97/18841, WO 96/23524, WO 98/47538, y las referencias citadas en los mismos. Los fotomarcadores pueden unirse de manera covalente directamente al peptido de union a cMet o unirse al peptido de union a cMet o constructo polipeptfdico multimerico mediante un ligador, tal como se describio previamente.
Despues de inyectarle el resto de union a cMet marcado opticamente, se explora al paciente con una o mas fuentes de luz (por ejemplo, un laser) en el intervalo de longitud de onda apropiado para el fotomarcador empleado en el agente. La luz usada puede ser monocromatica o policromatica y continua o pulsada. Se detecta la luz transmitida, dispersada o reflejada mediante un fotodetector sintonizado a una o multiples longitudes de onda para determinar la ubicacion de cMet o el complejo HGF/cMet en el sujeto. Pueden monitorizarse los cambios en el parametro optico a lo largo del tiempo para detectar la acumulacion del reactivo marcado opticamente en el sitio de hiperproliferacion. Pueden usarse dispositivos de deteccion y procesamiento de imagenes convencionales junto con los reactivos de obtencion de imagenes opticas de la presente divulgacion.
Los reactivos de obtencion de imagenes opticas descritos anteriormente tambien pueden usarse para la obtencion de imagenes acustico-opticas o sonoluminiscentes realizada con agentes de obtencion de imagenes marcados opticamente (veanse los documentos US 5.171.298, WO 98/57666, y las referencias citadas en los mismos). En la obtencion de imagenes acustico-opticas, se aplica radiacion de ultrasonidos al sujeto y afecta a los parametros opticos de la luz transmitida, emitida o reflejada. En la obtencion de imagenes sonoluminiscentes, los ultrasonidos aplicados generan realmente la luz detectada. Se describen procedimientos de obtencion de imagenes adecuados que usan tales tecnicas en el documento WO 98/57666.
D. Obtencion de imagenes nucleares (obtencion de imagenes con radionuclidos) y radioterapia
Los restos de union a cMet pueden conjugarse con un indicador de radionuclido apropiado para obtencion de imagenes de gammagraffa, SpECT o PET y/o con un radionuclido apropiado para radioterapia. Los constructos en los que los restos de union a cMet se conjugan tanto con un quelante para un radionuclido util para obtencion de imagenes de diagnostico como con un quelante util para radioterapia estan dentro del alcance de la invencion.
Para su uso como agente para PET, se compleja un peptido o constructo polipeptfdico multimerico con uno de los diversos iones de metal emisores de positrones, tales como 51Mn, 52Fe, 60Cu, 68Ga, 72As, 94mTc o 110In. Los restos de union de la invencion tambien pueden marcarse mediante halogenacion usando radionuclidos tales como 18F, 124I, 125I, 131I, 123I, 77Br y 76Br. Los radionuclidos de metal preferidos para gammagraffa o radioterapia incluyen 99mTc, 51Cr, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 51Cr, 167Tm, 141Ce, 111In, 168Yb, 175Yb, 140La, 90Y, 88Y. 153Sm, 166Ho, 65Dy, 166Dy, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 97Ru, 103Ru, 186Re, 188Re, 203Pb, 211Bi, 212Bi, 213Bi, 214Bi, 105Rh, 109Pd, 117mSn, 149Pm, 161Tb, 177Lu, 198Au y 199Au. La eleccion del metal se determinara basandose en la aplicacion terapeutica o de diagnostico deseada. Por ejemplo, con propositos de diagnostico, los radionuclidos preferidos incluyen 64Cu, 67Ga, 68Ga, 99mTc y 111In. Con propositos terapeuticos, los radionuclidos preferidos incluyen 64Cu, 90Y, 105Rh, 111In, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 175Yb, 177Lu, 186/188Re y 199Au. 99mTc, se prefiere particularmente para aplicaciones de diagnostico debido a su bajo coste, disponibilidad, propiedades de obtencion de imagenes y alta actividad espedfica. Las propiedades nucleares y radiactivas de 99mTc hacen que este isotopo sea un agente de obtencion de imagenes para gammagraffa ideal. Este isotopo tiene una unica energfa fotonica de 140 keV y una semivida radiactiva de aproximadamente 6 horas, y esta facilmente disponible a partir de un generador de 99Mo-99mTc.
Los radionuclidos de metal pueden quelarse mediante, por ejemplo, quelantes lineales, macrodclicos, de terpiridina, y N3S, N2S2 o N4 (veanse tambien, los documentos US 5.367.080, US 5.364.613, US 5.021.556, US 5.075.099, US 5.886.142), y otros quelantes conocidos en la tecnica incluyendo, pero sin limitarse a, los quelantes HYNIC, DTPA, EDTA, DOTA, DO3A, TETA, y bisaminobistiol (BAT) (vease tambien US 5.720.934). Por ejemplo, los quelantes de N4 se describen en los documentos US 6.143.274; US 6.093.382; US 5.608.110; US 5.665.329; US 5.656.254; y US 5.688.487. Determinados quelantes de N3S se describen en los documentos PCT/CA94/00395, PCT/CA94/00479, PCT/CA95/00249 y en los documentos US5.662.885; US 5.976.495; y US 5.780.006. El quelante tambien puede incluir derivados del ligando de quelacion mercaptoacetilacetilglicilglicina (MAG3), que contiene sistemas de N3S y N2S2 tales como MAMA (monoamidomonoaminoditioles), DADS (diaminaditioles N2S), CODADS y similares. Estos sistemas de ligando y una variedad de otros se describen, por ejemplo, en Liu, S. y Edwards, D., 1999. Chem Rev., 99:2235-2268, y referencias citadas en los mismos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
El quelante tambien puede incluir complejos que contienen atomos de ligando que no se donan al metal en una configuracion tetradentada. Estos incluyen los aductos de acido boronico de dioximas de tecnecio y renio, tales como se describen en los documentos US 5.183.653; US 5.387.409; y US 5.118.797.
En otra realizacion, se usan los enlaces disulfuro de un polipeptido de union a cMet de la invencion como dos ligandos para la quelacion de un radionuclido tal como 99mTc. De este modo, se expande el bucle peptfdico mediante la introduccion de Tc (peptido-S-S-peptido se cambia a peptido-S-Tc-S-peptido). Esto tambien se ha usado en otros peptidos que contienen disulfuro en la bibliograffa (Chen, J. et al., 2001. J. Nucl. Med., 42:1847-1855) mientras se mantiene la actividad biologica. Los demas grupos de quelacion para Tc pueden suministrarse mediante nitrogenos de amida de la estructura principal, otro aminoacido de cistina u otras modificaciones de aminoacidos.
Los quelantes de metal particularmente preferidos incluyen los de las formulas 20, 21, 22, 23a, 23b, 24a, 24b y 25, expuestas en las figuras 8A-8F. Las formulas 20-22 son particularmente utiles para lantanidos tales como Gd3+ paramagnetico y lantanidos radiactivos tales como 177Lu, 90Y, 153Sm, 111In o 166Ho. Las formulas 23a-24b son particularmente utiles para radionuclidos 99mTc, 186Re o 188Re. La formula 25 es particularmente util para 99mTc. Estos y otros grupos de quelacion de metal se describen en los documentos US 6.093.382 y US 5.608.110. Adicionalmente, el grupo de quelacion de formula 22 se describe, por ejemplo, en el documento US 6.143.274; el grupo de quelacion de formula 24 se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.627.286 y US 6.093.382, y el grupo de quelacion de formula 25 se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.662.885; US 5.780.006; y US 5.976.495.
Para las formulas 24a y 24b de la figura 8E, X es o bien CH2 o bien O; Y es alquilo ramificado o no ramificado C1- C10, arilo, ariloxilo, arilamino, arilaminoacilo o arilalquilo que comprende grupos alquilo ramificados o no ramificados C1-C10, hidroxilo o grupos polihidroxialquilo ramificados o no ramificados C1-C10, hidroxilo ramificado o no ramificado C1-C10 o grupos polialcoxialquilo o polihidroxi-polialcoxialquilo; J es C(=O)-, OC(=O)-, SO2-, NC(=O)-, NC(=S)-, N(Y), NC(=NCH3)-, NC(=NH)-, N=N-, homopoliamidas o heteropoliaminas derivadas de aminoacidos sinteticos o que se producen de manera natural; y n es 1-100. Otras variantes de estas estructuras se describen, por ejemplo, en el documento US 6.093.382.
Los quelantes pueden unirse de manera covalente directamente al resto de union a cMet o constructo polipeptfdico multimerico o unirse al polipeptido de union a cMet mediante un ligador, tal como se describio previamente, y entonces marcarse directamente con el metal radiactivo de eleccion (veanse, los documentos WO 98/52618, US 5.879.658 y US 5.849.261).
Los complejos de tecnecio radiactivo son particularmente utiles para la obtencion de imagenes de diagnostico y los complejos de renio radiactivo son particularmente utiles para radioterapia. En la formacion de un complejo de tecnecio radiactivo con los reactivos de esta invencion, el complejo de tecnecio, preferiblemente una sal de pertecnetato de 99mTc, se hace reaccionar con el reactivo en presencia de un agente reductor. Son agentes reductores preferidos los iones ditionito, estannosos y ferrosos; el agente reductor mas preferido es cloruro estannoso. Se proporcionan convenientemente medios para preparar tales complejos en forma de kit que comprende un vial sellado que contiene una cantidad predeterminada de un reactivo de la invencion que va a marcarse y una cantidad suficiente de agente reductor para marcar el reactivo con 99mTc. Alternativamente, el complejo puede formarse haciendo reaccionar un peptido de esta invencion conjugado con un quelante apropiado con un complejo de tecnecio labil formado previamente y otro compuesto conocido como ligando de transferencia. Este proceso se conoce como intercambio de ligando y lo conocen bien los expertos en la tecnica. El complejo labil puede formarse usando ligandos de transferencia tales como tartrato, citrato, gluconato o manitol, por ejemplo. Entre las sales de pertecnetato de 99mTc utiles con la presente invencion estan incluidas las sales de metal alcalino tales como la sal de sodio o las sales de amonio o sales de alquilamonio inferior.
Puede lograrse la preparacion de complejos de la presente invencion en los que el metal es renio radiactivo usando materiales de partida de renio en el estado de oxidacion +5 o +7. Son ejemplos de compuestos en los que el renio esta en el estado de Re(VII) NH4ReO4 o KReO4. Re(V) esta disponible como, por ejemplo, [ReOCl4](NBu4), (ReOCUKAsPhu), ReOCl3(PPh3)2 y como ReO2(piridina)4+, en los que Ph es fenilo y Bu es n-butilo. Tambien pueden usarse otros reactivos de renio capaces de formar un complejo de renio.
Estan englobados agentes de obtencion de imagenes para gammagraffa marcados de manera radiactiva proporcionados por la presente invencion que tienen una cantidad adecuada de radiactividad. Generalmente, la dosis unitaria que ha de administrarse tiene una radiactividad de aproximadamente 0,01 mCi a aproximadamente 100 mCi, preferiblemente de 1 mCi a 20 mCi. La disolucion que va a inyectarse a la dosificacion unitaria es de desde aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 10 ml. En la formacion de complejos radiactivos de 99mTc, se prefiere generalmente formar complejos radiactivos en disoluciones que contienen radiactividad a concentraciones de desde aproximadamente 0,01 mCi hasta 100 mCi por ml.
Las dosis tfpicas de un agente de obtencion de imagenes de union a cMet marcado con radionuclido segun la invencion proporcionan 10-20 mCi. Despues de inyectarse el agente de obtencion de imagenes con radionuclido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
espedfico de cMet al paciente, se usa una camara gamma calibrada para la energfa de rayos gamma del nuclido incorporado en el agente de obtencion de imagenes para obtener imagenes de areas de captacion del agente y cuantificar la cantidad de radiactividad presente en el sitio. La obtencion de imagenes del sitio in vivo puede tener lugar en cuestion de unos pocos minutos. Sin embargo, la obtencion de imagenes puede tener lugar, si se desea, en horas o incluso mas tiempo, despues de inyectarse el peptido radiomarcado a un paciente. En la mayor parte de los casos, se acumulara una cantidad suficiente de la dosis administrada en el area de la que van a obtenerse imagenes en el plazo de aproximadamente 0,1 hora para permitir que se tomen gammagraffas.
Los expertos en la tecnica conocen pautas posologicas apropiadas para los compuestos radioterapicos. Los compuestos pueden administrarse usando muchos procedimientos incluyendo, pero sin limitarse a, una unica o multiples inyecciones i.v. o i.p., usando una cantidad de radiactividad que es suficiente para provocar dano o ablacion del tejido que expresa cMet seleccionado como diana, pero no tanto como para provocar un dano sustancial al tejido no diana (normal). La cantidad y dosis requeridas es diferente para diferentes constructos, dependiendo de la energfa y semivida del isotopo usado, el grado de captacion y aclaramiento del agente del organismo y la masa del tumor. En general, las dosis pueden oscilar entre una unica dosis de aproximadamente 3050 mCi hasta una dosis acumulada de hasta aproximadamente 3 Ci.
Las composiciones radioterapicas pueden incluir tampones fisiologicamente aceptables, y pueden requerir estabilizadores frente a la radiacion para impedir el dano radiolftico al compuesto antes de la inyeccion. Los expertos en la tecnica conocen estabilizadores frente a la radiacion, y pueden incluir, por ejemplo, acido para-aminobenzoico, acido ascorbico, acido gentfsico y similares.
Se contempla un kit de un unico vial o de multiples viales que contiene todos los componentes necesarios para preparar los complejos de esta invencion, distintos del radionuclido.
Un kit de un unico vial contiene preferiblemente un ligando de quelacion, una fuente de sal estannosa, u otro agente reductor farmaceuticamente aceptable, y se tampona apropiadamente con acido o base farmaceuticamente aceptable para ajustar el pH a un valor de aproximadamente 3 a aproximadamente 9. La cantidad y el tipo de agente reductor usado dependeran de la naturaleza del complejo de intercambio que vaya a formarse. Las condiciones apropiadas las conocen bien los expertos en la tecnica. Se prefiere que el contenido del kit este en forma liofilizada. Tal kit de un unico vial puede contener opcionalmente ligandos labiles o de intercambio tales como glucoheptonato, gluconato, manitol, malato, acido cttrico o tartarico y tambien puede contener modificadores de reaccion tales como acido dietilentriaminapentaacetico (DPTA), acido etilendiaminatetraacetico (EDTA), o a, p o y-ciclodextrina que sirvan para mejorar la estabilidad y pureza radioqmmica del producto final. El kit tambien puede contener estabilizadores, agentes de carga tales como manitol, que estan disenados para ayudar en el proceso de deshidrocongelacion, y otros aditivos conocidos por los expertos en la tecnica.
Un kit de multiples viales contiene preferiblemente los mismos componentes generales pero emplea mas de un vial en la reconstitucion del producto radiofarmaceutico. Por ejemplo, un vial puede contener todos los componentes que se requieren para formar un complejo de Tc(V) labil con la adicion de pertecnetato (por ejemplo, la fuente estannosa u otro agente reductor). Se anade pertecnetato a este vial, y despues de esperar un periodo de tiempo apropiado, se anade el contenido de este vial a un segundo vial que contiene el ligando, asf como tampones apropiados para ajustar el pH a su valor optimo. Despues de un tiempo de reaccion de aproximadamente 5 a 60 minutos, se forman los complejos de la presente invencion. Es ventajoso que el contenido de ambos viales de este kit de multiples viales se liofilice. Como anteriormente, pueden estar presentes modificadores de reaccion, ligandos de intercambio, estabilizadores, agentes de carga, etc. en cualquiera o en ambos viales.
Aplicaciones terapeuticas
Los polipeptidos y constructos polipeptfdicos multimericos de union a cMet de la presente invencion pueden usarse para presentar, tratar o mejorar la actividad de agentes terapeuticos tales como agentes antiproliferativos o tumoricidas frente a la proliferacion celular no deseada (tal como sucede en tumores neoplasicos, por ejemplo, cancer, proporcionando o mejorando su afinidad por cMet y su tiempo de residencia en un complejo HGF/cMet en celulas en proliferacion, tales como, por ejemplo, celulas epiteliales) para enfermedades asociadas con cMet, incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades relacionadas con la actividad de cMet. En este aspecto, se proporcionan agentes hubridos conjugando un polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico de union a cMet segun la invencion con un agente terapeutico. El agente terapeutico puede ser un agente radioterapico, comentado anteriormente, un farmaco, agente quimioterapico o tumoricida, material genetico o un vetuculo de suministro genico, etc. La parte del resto de polipeptido de union a cMet del conjugado hace que el agente terapeutico “resida” en los sitios de cMet o el complejo HGF/cMet (es decir, celulas epiteliales activadas), y mejore la afinidad del conjugado por el endotelio, de modo que la actividad terapeutica del conjugado esta mas localizada y concentrada en los sitios de proliferacion celular. Ademas, estos restos de union a cMet pueden inhibir eventos de senalizacion mediados por HGF previniendo que se una HGF a cMet. Tales conjugados seran utiles en el tratamiento de trastornos hiperproliferativos, especialmente el crecimiento y la metastasis de tumor neoplasico, en mairnferos, incluyendo seres humanos. El procedimiento comprende administrar a un mamffero que lo necesita una cantidad eficaz de un polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico de union a cMet segun la invencion conjugado con un
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
agente terapeutico. La divulgacion tambien proporciona el uso de tales conjugados en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas con angiogenesis en mairnferos, incluyendo seres humanos.
Los agentes terapeuticos adecuados para su uso en este aspecto incluyen, pero no se limitan a: agentes antineoplasicos, tales como compuestos de platino (por ejemplo, espiroplatino, cisplatino y carboplatino), metotrexato, adriamicina, mitomicina, ansamitocina, bleomicina, citosina, arabinosido, arabinosiladenina, mercaptopolilisina, vincristina, busulfano, clorambucilo, melfalan (por ejemplo, PAM, L-PAM o mostaza de fenilalanina), mercaptopurina, mitotano, clorhidrato de procarbazina, dactinomicina (actinomicina D), clorhidrato de daunorrubicina, clorhidrato de doxorrubicina, taxol, mitomicina, plicamicina (mitramicina), aminoglutetimida, fosfato sodico de estramustina, flutamida, acetato de leuprolida, acetato de megestrol, citrato de tamoxifeno, testolactona, trilostano, amsacrina (m-AMSA), asparaginasa (L-asparaginasa), asparaginasa de Erwinia, etoposido (VP-16), interferon CX-2a, interferon CX-2b, teniposido (VM-26, sulfato de vinblastina (VLB), sulfato de vincristina, sulfato de bleomicina, adriamicina y arabinosilo; agentes antiangiogenicos tales como inhibidores de tirosina cinasa con actividad hacia moleculas de senalizacion importantes en angiogenesis y/o crecimiento tumoral tales como SU5416 y SU6668 (Sugen/Pharmacia y Upjohn), endostatina (EntreMed), angiostatina (EntreMed), combrestatina (Oxigene), ciclosporina, 5-fluorouracilo, vinblastina, doxorrubicina, paclitaxel, daunorrubicina, inmunotoxinas; factores de coagulacion; antivirales tales como aciclovir, amantadina azidotimidina (AZT o zidovudina), ribavirina y vidarabina monohidratada (arabinosido de adenina, ara-A); antibioticos, antipaludicos, antiprotozoarios tales como cloroquina, hidroxicloroquina, metroidazol, quinina y antimoniato de meglumina; antiinflamatorios tales como diflunisal, ibuprofeno, indometacina, meclofenamato, acido mefenamico, naproxeno, oxifenbutazona, fenilbutazona, piroxicam, sulindaco, tolmetina, aspirina y salicilatos.
El agente terapeutico puede asociarse con una composicion de agente de contraste para ultrasonidos en la que restos de union a cMet de la invencion se unen al material empleado para formar las vesmulas tal como se describe en el presente documento. Despues de la administracion del agente de contraste para ultrasonidos y la obtencion de imagenes opcional del agente de contraste unido al tejido que expresa cMet o el complejo HGF/cMet, puede irradiarse el tejido con un haz de energfa (preferiblemente ultrasonico, por ejemplo, con una frecuencia de desde 0,3 hasta 3 MHz), para romper o estallar las microvesmulas. El efecto terapeutico del agente terapeutico puede potenciarse, por tanto, mediante la energfa liberada por la ruptura de las microvesfculas, en particular provocando un suministro eficaz del agente terapeutico al tejido seleccionado como diana. Por ejemplo, el agente terapeutico puede asociarse con el agente de contraste para ultrasonidos de direccionamiento y suministrarse tal como se describe en el documento US 6.258.378.
Los polipeptidos y constructos polipeptfdicos multimericos de union a cMet de la presente invencion tambien pueden usarse para direccionar material genetico a celulas que expresan cMet. Por tanto, pueden ser utiles en terapia genica, particularmente para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos. En esta realizacion, puede conjugarse material genetico o uno o mas vehmulos de suministroque contienen material genetico util en el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo a uno o mas restos de union a cMet de la invencion y administrarse a un paciente. El material genetico puede incluir acidos nucleicos, tales como ARN o ADN, de origen o bien natural o bien sintetico, incluyendo ARN y ADN recombinantes y ARN y ADN antisentido. Los tipos de material genetico que pueden usarse incluyen, por ejemplo, genes portados en vectores de expresion tales como plasmidos, fagomidos, cosmidos, cromosomas artificiales de levadura (YAC) y virus defectivos o “auxiliares”, acidos nucleicos antigenicos, ARN y ADN tanto monocatenarios como bicatenarios y analogos de los mismos, tales como oligodesoxinucleotidos de fosforotioato y fosforoditioato. Adicionalmente, el material genetico puede combinarse, por ejemplo, con lfpidos, protemas u otros polfmeros. Los vehmulos de suministro para material genetico pueden incluir, por ejemplo, una partfcula vmca, un vector retrovmco u otro de terapia genica, un liposoma, un complejo de lfpidos (especialmente ifpidos cationicos) y material genetico, un complejo de derivados de dextrano y material genetico, etc.
En una realizacion preferida, los constructos se utilizan en terapia genica para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos. En esta realizacion, puede conjugarse material genetico, o uno o mas vehfculos de suministro que contienen material genetico, por ejemplo, util en el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo, a uno o mas polipeptidos o constructos polipeptfdicos multimericos de union a cMet de la invencion y administrarse a un paciente.
Pueden usarse constructos que incluyen material genetico y los restos de union a cMet de la invencion, en particular, para introducir selectivamente genes en celulas cancerosas en proliferacion (por ejemplo, celulas epiteliales), que puede ser utiles para tratar cancer.
Los agentes terapeuticos y los restos de union a cMet de la invencion pueden unirse o fusionarse de modos conocidos, opcionalmente usando el mismo tipo de ligadores comentados en otra parte de esta solicitud. Seran ligadores preferidos cadenas de alquilo sustituido o no sustituido, cadenas de aminoacido, cadenas de polietilenglicol, y otros ligadores polimericos simples conocidos en la tecnica. Mas preferiblemente, si el propio agente terapeutico es una protema, para la que la secuencia de ADN codificante es conocida, la protema terapeutica y el polipeptido de union a cMet pueden coexpresarse a partir del mismo gen sintetico, creado usando tecnicas de ADN recombinante, tal como se describio anteriormente. La secuencia codificante del polipeptido de union a cMet puede fusionarse en fase con la de la protema terapeutica, de tal manera que el peptido se exprese en el extremo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
amino o carboxiterminal de la protema terapeutica, o en un lugar entre los extremos terminales, si se determina que tal situacion no destruira la funcion biologica requerida o bien de protema terapeutica o bien del polipeptido de union a cMet. Una ventaja particular de este enfoque general es que la concatamerizacion de multiples polipeptidos de union a cMet dispuestos en tandem es posible, aumentando de ese modo el numero y la concentracion de sitios de union a cMet asociados con cada protema terapeutica. De esta manera, se aumenta la avidez de union a cMet, que se esperana que mejorase la eficacia de la protema de fusion terapeutica recombinante.
Adicionalmente, pueden usarse los propios constructos que incluyen polipeptidos de union a cMet de la presente invencion como agentes terapeuticos para tratar varias enfermedades asociadas con la actividad de cMet. Por ejemplo, cuando la union de una protema u otra molecula (por ejemplo, un factor de crecimiento, hormona etc.) es necesaria para o contribuye a un proceso patologico y un resto de union inhibe tal union, los constructos que incluyen tales restos de union podnan ser utiles como agentes terapeuticos. De manera similar, cuando la union de un propio resto de union inhibe un proceso patologico, los constructos que contienen tales restos de union tambien podnan ser utiles como agentes terapeuticos.
La union de HGF a cMet da como resultado la activacion de numerosas rutas de transduccion de senales intracelulares que conducen a hiperproliferacion de diversas celulas. Como tal, en una realizacion, los constructos que incluyen polipeptidos de union a cMet que inhiben la union de HGF a cMet (o inhiben de otro modo la activacion de cMet) pueden usarse como agentes antineoplasicos. Ademas, como la union de HGF y activacion de cMet estan implicadas en la actividad angiogenica, en otra realizacion, los constructos que incluyen polipeptidos de union a cMet que inhiben la union de HGF a cMet, o inhiben de otro modo la activacion de cMet, pueden usarse como agentes antiangiogenicos. Determinados constructos de la divulgacion incluyendo monomeros, multimeros y heteromultimeros que inhiben la activacion de cMet tambien se comentan en los ejemplos, e incluyen, por ejemplo, la SEQ ID NO:365 (figura 10). Los polipeptidos de union y constructos de los mismos son utiles como agentes terapeuticos para tratar afecciones que implican celulas endoteliales y/o epiteliales que expresan cMet. Dado que una funcion importante del endotelio es la angiogenesis, o la formacion de vasos sangumeos, los polipeptidos y constructos de los mismos son particularmente utiles para tratar afecciones que implican angiogenesis y/o hiperproliferacion. Las afecciones que implican angiogenesis incluyen, por ejemplo, tumores solidos, metastasis tumorales y tumores benignos. Los tumores provocados por la activacion de cMet o a traves de angiogenesis se conocen bien en la tecnica e incluyen, por ejemplo, de mama, tiroides, glioblastoma, prostata, mesotelioma maligno, colorrectal, hepatocelular, hepatobiliar, renal, osteosarcoma y cervicouterino. Se enumeran tumores adicionales y trastornos relacionados en la tabla I de la patente estadounidense n° 6.025.331, emitida el 15 de febrero de 2000 a Moses, et al. Los tumores benignos incluyen, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acusticos, neurofibromas, tracomas y granulomas piogenicos. Otras enfermedades relevantes que implican angiogenesis y/o hiperproliferacion incluyen por ejemplo, artritis reumatoide, psoriasis y enfermedades oculares, tales como retinopatfa diabetica, retinopatfa del prematuro, degeneracion macular, rechazo de injerto corneal, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, smdrome de Osler-Webber, angiogenesis miocardica, neovascularizacion de placas, telangiectasia, articulaciones del hemofflico, angiofibroma y granulacion de heridas. Otras enfermedades o afecciones relevantes que implican crecimiento de vasos sangumeos incluyen adherencias intestinales, aterosclerosis, esclerodermia y cicatrices hipertroficas, y ulceras. Ademas, los polipeptidos de union y constructos de los mismos de la presente invencion pueden usarse para reducir o prevenir la neovascularizacion uterina requerida para la implantacion de embriones, por ejemplo, como agente anticonceptivo.
Los polipeptidos de union, constructos polipeptfdicos multimericos y constructos conjugados de los mismos pueden administrarse a un individuo a lo largo de un periodo de tiempo adecuado dependiendo de la naturaleza de la afeccion y el resultado clmico deseado. Los polipeptidos de union y constructos de los mismos pueden administrarse de manera profilactica, por ejemplo, antes de diagnosticarse la afeccion o a un individuo predispuesto a una afeccion. Los constructos polipeptfdicos multimericos de polipeptidos de union y conjugados y constructos de los mismos pueden administrarse mientras el individuo presenta smtomas del estado o despues de haber pasado los smtomas o haberse aliviado de otro modo (tal como despues de la extirpacion de un tumor). Ademas, los polipeptidos de union y constructos de los mismos de la presente invencion pueden administrarse como parte de un regimen de mantenimiento, por ejemplo para prevenir o disminuir la recurrencia o los smtomas o la afeccion. Tal como se describe a continuacion, los constructos polipeptfdicos multimericos de polipeptidos de union y conjugados y constructos de los mismos de la presente invencion pueden administrarse de manera sistemica o local.
La cantidad de material administrado dependera de la gravedad de la afeccion. Por ejemplo, para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo, por ejemplo, en el caso del crecimiento de tumor neoplasico, la posicion y el tamano del tumor afectaran a la cantidad de material que ha de administrarse. La dosis precisa que ha de emplearse y el modo de administracion debe decidirse logicamente, en vista de la naturaleza de la dolencia, segun las circunstancias, por el medico que supervisa el tratamiento. En general, las dosificaciones de los polipeptidos de conjugado de agente, constructos polipeptfdicos multimericos y conjugados de la presente invencion seguiran las dosificaciones que son rutinarias para el agente terapeutico solo, aunque la afinidad mejorada de un polipeptido o constructo polipeptfdico multimerico de union de la invencion por su diana puede permitir una disminucion de la dosificacion convencional.
Tales composiciones farmaceuticas de conjugado se formulan preferiblemente para administracion parenteral, y lo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
mas preferiblemente para administracion intravenosa o intraarterial. Generalmente, y en particular cuando la administracion es intravenosa o intraarterial, las composiciones farmaceuticas pueden administrarse como bolo, como dos o mas dosis separadas en el tiempo, o como infusion constante o de flujo no lineal.
Tal como se usa en el presente documento el termino “terapeutico” incluye al menos el alivio parcial de los smtomas de una afeccion dada. Los polipeptidos de union, constructos multimericos y constructos conjugados de los mismos de la presente invencion no tienen que producir un alivio completo de los smtomas para ser utiles. Por ejemplo, el tratamiento de un individuo puede dar como resultado una disminucion del tamano de un tumor o area enferma, o la prevencion del aumento del tamano del tumor o area enferma. El tratamiento tambien puede prevenir o reducir el numero o tamano de crecimientos metastasicos del/de los tumor(es) principal(es).
Los smtomas que pueden aliviarse incluyen caractensticas fisiologicas tales como la actividad de cMet. Los constructos polipeptfdicos multimericos de polipeptidos de union y conjugados y constructos de los mismos de la presente invencion pueden inhibir la actividad de cMet y sus homologos mediante la union a cMet e inhibiendo su actividad o mediante union a cMet e inhibiendo que HGF active este receptor. Tal inhibicion puede detectarse, por ejemplo, midiendo el estado de fosforilacion del receptor en presencia de o despues del tratamiento con los polipeptidos de union o constructos de los mismos. Basandose en las ensenanzas proporcionadas en el presente documento, un experto habitual en la tecnica sabna como y sena capaz de administrar una dosis adecuada de polipeptido de union, constructos polipeptfdicos multimericos y conjugados o constructos de los mismos proporcionados en el presente documento, y medir el efecto del tratamiento sobre el parametro de interes. Por ejemplo, puede medirse el tamano del area de interes (por ejemplo, el tumor o la lesion) antes y despues del tratamiento. Pueden aislarse celulas o el propio cMet de la muestra y usarse en ensayos descritos en el presente documento.
La dosificacion de los constructos polipeptfdicos multimericos de polipeptidos, y conjugados y constructos de los mismos puede depender de la edad el sexo, la salud y el peso del individuo, asf como la naturaleza de la afeccion y el regimen de tratamiento global. Los efectos biologicos de los constructos polipeptfdicos multimericos de polipeptidos y conjugados y constructos de los mismos se describen en el presente documento. Por tanto, basandose en los efectos biologicos de los constructos polipeptfdicos multimericos de polipeptidos de union y conjugados y constructos proporcionados en el presente documento, y el resultado clmico deseado del tratamiento, un experto habitual en la tecnica puede determinar la dosificacion preferida mediante procedimientos de optimizacion rutinarios. Normalmente, el regimen diario esta en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg.
Los restos de polipeptidos de union y conjugados de constructos de los mismos proporcionados en el presente documento pueden administrarse como unico principio activo, opcionalmente junto con un excipiente farmaceuticamente aceptable, o pueden administrarse conjuntamente (por ejemplo, de manera simultanea o secuencial) con otros polipeptidos de union y constructos de los mismos, otros agentes terapeuticos, o combinacion de los mismos. Ademas, los restos de polipeptidos de union y constructos de conjugado de los mismos pueden conjugarse a agentes terapeuticos, por ejemplo, para mejorar la especificidad, el tiempo de residencia en el organismo o el efecto terapeutico. Tales otros agentes terapeuticos incluyen, por ejemplo, otros compuestos antiproliferativos y compuestos tumoricidas. El agente terapeutico tambien puede incluir anticuerpos. Ademas, los constructos polipeptfdicos multimericos de polipeptido de union y constructos de los mismos de la presente invencion pueden usarse como dispositivo de residencia de celulas cancerosas. Por tanto, el polipeptido de union o constructos del mismo pueden conjugase a acido nucleico que codifica, por ejemplo, un polipeptido terapeutico, para dirigir el acido nucleico a celulas estromales. Una vez expuestas al resto de polipeptido de union conjugado con acido nucleico o conjugado del mismo, las celulas estromales pueden internalizarse y expresar el acido nucleico conjugado, suministrando de ese modo el peptido terapeutico a las celulas diana.
Los polipeptidos de union, constructos polipeptfdicos multimericos y conjugados y constructos de los mismos pueden administrarse de manera local o sistemica mediante cualquier via adecuada. Las vfas de administracion adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aplicacion topica, transdermica, parenteral, gastrointestinal, intravaginal y transalveolar. Pueden prepararse composiciones para la via de administracion deseada mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en las tecnicas farmaceuticas, por ejemplo, tal como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Lippincott, Williams y Wilkins, 2000.
Para aplicacion topica, los polipeptidos de union, constructos polipeptfdicos multimericos y conjugados de los mismos pueden suspenderse, por ejemplo, en una crema, un gel o enjuague que permite que los polipeptidos o constructos penetren en la piel y entren en el torrente sangumeo, para suministro sistemico, o entren en contacto con el area de interes, para suministro localizado. Las composiciones adecuadas para aplicacion topica incluyen cualquier base farmaceuticamente aceptable en la que los polipeptidos o constructos sean al menos mmimamente solubles.
Para administracion transdermica, pueden aplicarse los polipeptidos, constructos polipeptfdicos multimericos y conjugados de los mismos en una suspension farmaceuticamente aceptable junto con un dispositivo transdermico adecuado o “parche”. Se describen ejemplos de dispositivos transdermicos adecuados para la administracion de los
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
polipeptidos o constructos de la presente invencion, por ejemplo, en la patente estadounidense n° 6.165.458, expedida el 26 de diciembre de 2000 a Foldvari et al., y la patente estadounidense n° 6.274.166B1, expedida el 4 de agosto de 2001 a Sintov et al..
Para administracion parenteral, los polipeptidos, constructos polipeptfdicos multimericos y conjugados de los mismos pueden inyectarse por via intravenosa, por via intramuscular, por via intraperitoneal o por via subcutanea. Normalmente, las composiciones para administracion intravenosa son disoluciones en tampon acuoso isotonico esteril. Otros portadores farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, agua, esteril solucion salina y solucion salina tamponada (incluyendo tampones como fosfato o acetato), alcohol, aceites vegetales, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, acido silfcico, parafina, etc. Cuando es necesario, la composicion tambien puede incluir un agente solubilizante y un anestesico local tal como lidocama para calmar el dolor en el sitio de la inyeccion, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales, lubricantes, etc. siempre que no reaccionen de manera perjudicial con los compuestos activos. De manera similar, la composicion puede comprender excipientes convencionales, es decir sustancias portadoras organicas o inorganicas farmaceuticamente aceptables adecuadas para aplicacion parenteral, enteral o intranasal que no reaccionen de manera perjudicial con los compuestos activos. Generalmente, se suministraran los componentes o bien por separado o bien se mezclaran entre sf en forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, como polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente sellado hermeticamente tal como una ampolla o un sobre que indica la cantidad de principio activo en unidades de actividad. Cuando la composicion va a administrarse mediante infusion, puede dispensarse con un frasco de infusion que contiene solucion salina o “agua para inyeccion” de calidad farmaceutica esteril. Cuando la composicion va a administrarse mediante inyeccion, puede proporcionarse una ampolla de solucion salina o agua para inyeccion esteril de modo que los componentes puedan mezclarse antes de la administracion.
Para administracion gastrointestinal e intravaginal, los polipeptidos, constructos polipeptfdicos multimericos y conjugados de los mismos pueden incorporarse en polvos, pastillas o lfquidos farmaceuticamente aceptables, y supositorios para administracion rectal o vaginal.
Para administracion transalveolar, bucal o pulmonar, los polipeptidos, constructos polipeptfdicos multimericos y conjugados de los mismos pueden suspenderse en un excipiente farmaceuticamente aceptable adecuado para aerosolizacion e inhalacion o como colutorio. Tambien se contemplan dispositivos adecuados para administracion transalveolar tales como atomizadores y vaporizadores. Pueden hallarse formulaciones adecuadas para la administracion en aerosol de polipeptidos, etc. usando las vfas bucal o pulmonar, por ejemplo en la patente estadounidense n° 6.312.665B1, expedida el 6 de noviembre de 2001 a Pankaj Modi.
Ademas, los polipeptidos, constructos polipeptfdicos multimericos y conjugados de los mismos de la presente invencion pueden administrarse por via nasal o por via ocular, cuando el polipeptido o constructo se suspende en un agente lfquido farmaceuticamente aceptable adecuado para la dosificacion por goteo.
Los polipeptidos, constructos polipeptfdicos multimericos y conjugados de los mismos de la presente invencion pueden administrarse de tal manera que el polipeptido, etc. se libere en el individuo a lo largo de un periodo de tiempo extenso (liberacion sostenida o controlada). Por ejemplo, el polipeptido, los constructos polipeptfdicos multimericos y conjugados del mismo pueden formularse en una composicion de tal manera que una unica administracion proporciona el suministro del polipeptido, etc. durante al menos una semana, o a lo largo del periodo de un ano o mas. Los sistemas de liberacion controlada incluyen microcapsulas monolfticas o de tipo deposito, implantes de deposito, bombas osmoticas, vesfculas, micelas, liposomas, parches transdermicos y dispositivos iontoforeticos. En una realizacion, los polipeptidos, constructos polipeptfdicos multimericos y conjugados de los mismos de la presente invencion se encapsulan o mezclan en un polfmero no toxico, lentamente degradable. Se describen formulaciones adicionales adecuadas para la liberacion controlada de los polipeptidos, constructos polipeptfdicos multimericos y conjugados de los mismos proporcionados en el presente documento en la patente estadounidense n° 4.391.797, expedida el 5 de julio de 1983, a Folkman et al.
Otro procedimiento adecuado para suministrar los polipeptidos del presente documento a un individuo es mediante produccion in vivo del polipeptido. Puede administrarse un gen que codifica el polipeptido al individuo de tal manera que se exprese el polipeptido codificado. El gen puede expresarse de manera transitoria. En una realizacion particular, el gen que codifica el polipeptido se transfecta en celulas que se han obtenido del paciente, un procedimiento denominado terapia genica ex vivo. Las celulas que expresan el polipeptido se devuelven entonces al cuerpo del paciente. Se conocen bien procedimientos de terapia genica ex vivo en la tecnica y se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense n° 4.391.797, expedida el 21 de marzo de 1998 a Anderson et al..
El aislamiento de polipeptidos de restos de union a cMet y la preparacion y el uso de restos de union a cMet y conjugados de los mismos segun esta invencion se ilustraran adicionalmente en los siguientes ejemplos. Los parametros espedficos incluidos en los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la practica de la invencion, y no se presentan para limitar en modo alguno el alcance de la invencion.
Ejemplos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ejemplo 1: Procedimiento para la identificacion de polipeptidos de union a cMet
Se utilizo una estrategia de seleccion de cuatro elementos usando una variedad de colecciones de fagos de presentacion de peptidos para cribar polipeptidos de union a cMet. Se usaron como herramientas para las selecciones tanto el dominio extracelular del receptor cMet (expresado como protema de fusion de Fc) como la lmea celular de cancer colorrectal, DLD-1, que expresa altos niveles de cMet en su superficie celular.
En resumen, las selecciones implicaban o bien usar la protema de fusion cMet-Fc soluble o bien celulas DLD-1 como la diana. Se realizaron eluciones espedficas con HGF (en primer lugar durante 1 hora y luego durante la noche para identificar agentes de union a cMet tanto de baja como de alta afinidad). Adicionalmente, mientras se usa el receptor de cMet soluble, se recogieron todos los fagos de presentacion de peptidos que permanecieron unidos al receptor para identificar peptidos que no se unieron al sitio de union a ligando, pero no obstante pudieron desarrollarse posiblemente para dar agentes de obtencion de imagenes. La figura 9 ilustra la estrategia de seleccion que se empleo. En resumen, se realizaron 21 combinaciones de elucion/campana de seleccion diferentes con cada combinacion de coleccion. Tambien se realizaron 10 campanas de seleccion adicionales que representan las tandas 3 y 4 usando la protema de fusion Met-Fc soluble. Las eluciones de HGF fueron a una concentracion de 100 ng/ml.
Ejemplo 2: Determinacion de la union de fagos de presentacion de peptidos a protema de fusion cMet-Fc soluble “ELISA de fago-prote^na’’
Se realizaron ELISA de fago-protema usando aislamientos de fagos de presentacion de peptidos de las diversas campanas de seleccion para determinar la especificidad de los peptidos por cMet frente a una protema de fusion de Fc no relacionada (TRAlL-Fc). En resumen, se recubrieron placas de 384 pocillos durante la noche a 4 °C con 0,5 mg/ml de protema de fusion cMet-Fc o protema de fusion TRAIL-Fc (fondo). Se bloquearon las placas durante 2 horas a 37 °C con BSA al 3 % (p/v) en PBS que contema Tween-20 al 0,05 % (v/v) (PbST). Se lavaron las placas con PBST y se anadieron 100 |il de fagos de presentacion de peptidos a cada pocillo. Se incubaron las placas durante 2 horas a temperatura ambiente y se lavaron con PBST. Se detectaron fagos de presentacion de peptidos de union a cMet usando un anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP.
Los fagos de presentacion de peptidos que demostraron una union > 3 veces a la protema de fusion cMet-Fc frente a la protema de fusion TRAlL-Fc se denominan en el presente documento “coincidencias positivas”. Las coincidencias positivas identificadas en el cribado anterior se sometieron a secuenciacion de ADN. A partir del analisis de secuencia posterior, se identificaron 187 secuencias peptfdicas unicas. Las secuencias de aminoacidos correspondientes segun las reivindicaciones de los peptidos presentados en fago de union a cMet se enumeran en la tabla 1 (SEQ ID NO: 001-10).
Ejemplo 3: Determinacion de la union a cMet en un modelo celular
Se realizaron ELISA de celulas completas para evaluar si las coincidencias positivas demostraban union espedfica a cMet humano expresado en la superficie celular.
Se realizaron ELISA de celulas completas usando celulas 3T3 que sobreexpresan cMet humano. Se usaron celulas 3T3 que no expresan cMet (“celulas sin expresion”) como lmea celular de control. En resumen, se sembraron placas de 96 pocillos con 105 celulas por pocillo. Se centrifugaron las placas durante 5 minutos a 1600 rpm para sedimentar las celulas. Se fijo la capa celular resultante con glutaraldeddo al 0,1 % (v/v) durante 12 minutos a 37 °C. Se lavaron las celulas con PBS y posteriormente se bloquearon con BSA al 3 % en PBST durante 1 hora a 37 °C. Tambien se bloquearon fagos de presentacion de peptidos en la disolucion anterior durante 1 hora a 37 °C. Se anadieron entonces 100 |il de fago bloqueado a cada pocillo y se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron las placas con PBST. Se detectaron fagos de presentacion de peptidos de union a cMet usando un anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP.
Ejemplo 4: ELISA de protenas de competencia con HGF
Se realizaron ELISA de protemas de competencia con HGF en un intento por determinar si cualquiera de los peptidos de union a cMet compite con HGF por un sitio de union similar en cMet. Este ELISA de competencia identifica peptidos que sirven como “peptidos antagonistas de HGF”, peptidos que bloquean eventos de senalizacion mediados por HGF (por ejemplo, proliferacion). Estos ensayos se llevaron a cabo usando los fagos de presentacion de peptidos descubiertos a partir de la seleccion inicial y campanas de cribado usando las colecciones de peptidos de primera generacion. En resumen, se recubrieron placas de 96 pocillos durante la noche a 4 °C con 0,5 |ig/ml de protema de fusion cMet-Fc o protema de fusion TRAIL-Fc (fondo). Se bloquearon las placas durante 2 horas a 37 °C con BSA al 3 % en PBST. Se lavaron las placas con PBST, y se anadieron 100 |il de HGF (o bien a 100 ng/ml o bien a 500 ng/ml en PBST) a cada pocillo. Se incubaron las placas durante 30 minutos a temperatura ambiente despues de lo cual se lavaron las placas con PBST y se anadieron 70 |il de HGF (143 ng/ml o 714 ng/ml) o 70 |il de PBST a los pocillos respectivos. Esto estuvo seguido por una adicion de 30 |il de cultivo durante la noche de fagos de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
presentacion de peptidos a cada pociMo. Se incubaron las placas durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavaron con PBST y se detectaron fagos de presentacion de peptidos de union a cMet usando un anticuerpo anti- M13 conjugado a HRP.
Se presentan los datos para los ELISA de protemas, ELISA de celulas completas y los experimentos de competencia con HGF en la tabla 7.
Ejemplo 5: Smtesis pept^dica y marcaje con fluorescema
Se sintetizaron varios peptidos de union a cMet seleccionados correspondientes a aislamientos positivos de fago en una matriz de fase solida usando protocolos con 9-fluorenilmetoxicarbonilo. Se purificaron estos peptidos con cromatograffa de fase inversa. Se confirmaron las masas peptfdicas mediante espectrometna de masas con electropulverizacion, y se cuantificaron los peptidos midiendo la absorbancia a 280 nm. Para la smtesis, se conservaron dos aminoacidos N-terminales y dos C-terminales de la secuencia de vector de fago vector de la que se corto el peptido, y se anadio un ligador, por ejemplo, -Gly-Gly-Gly-Lys-NH2 (SEQ ID NO:513) al extremo C-terminal de cada peptido. Cada peptido se acetilo de manera N-terminal. Se protegieron residuos de lisina seleccionados con 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)-3-metilbutilo (ivDde) cuando fue apropiado. El grupo protector permite el acoplamiento selectivo a la lisina C-terminal, no se elimina durante la escision del peptido, pero puede eliminarse despues del acoplamiento con hidrazina al 2 % en DMF o hidroxilamina 0,5 M, pH 8, en agua.
Se marco cada peptido con fluorescema en la lisina C-terminal usando fluorescema (derivado de ester de N- hidroxisuccinimida) o isotiocianato de fluorescema (FITC) en DMF con diisopropiletilamina (DIPEA) al 2 %. En el caso en el que el peptido contema una lisina protegida con ivDde, se extinguio la reaccion mediante la adicion de hidrazina al 2 %, que reacciona con toda la NHS-fluorescema libre y elimina el grupo protector interno. Para todos los demas peptidos, se extinguio la reaccion mediante la adicion de un volumen igual de hidroxilamina 0,5 M, pH 8. Entonces se diluyen las reacciones extinguidas con agua hasta menos del 10 % de DMF y luego se purifican usando cromatograffa de fase inversa C18. Se verificaron los peptidos analizandolos para determinar la masa esperada usando un sistema CL-EM (HPLC HP1100 con espectrometro de masas de un solo cuadrupolo SCIEX AP150 en lmea), y se determino la pureza de los peptidos.
Ejemplo 6: Mediciones de anisotrop^a de fluorescencia
Se realizaron mediciones de anisotropfa de fluorescencia en microplacas de 384 pocillos en un volumen de 10 |il en tampon de union (PBS, Tween-20 al 0,01 %, pH 7,5) usando un lector de placas de polarizacion de fluorescencia Tecan Polarion (Caracas, Venezuela). La concentracion de peptido marcado con fluorescema se mantuvo constante (20 nM) y se vario la concentracion de protema de fusion cMet-Fc (o diana similar). Se equilibraron mezclas de union durante 10 minutos en la microplaca a 30 °C antes de la medicion. Se ajusto el cambio observado en la anisotropfa a la ecuacion a continuacion mediante regresion no lineal para obtener la Kd aparente. Esta ecuacion (1) supone que el peptido sintetico y cMet forman un complejo reversible en disolucion con estequiometna 1:1.
imagen1
donde robs es la anisotropfa observada, rlibre es la anisotropfa del peptido libre, runido es la anisotropfa del peptido unido, Kd es la constante de disociacion aparente, cMet es la concentracion de cMet total, y P es la concentracion de peptido marcado con fluorescema total. Se calculo Kd en un ensayo de union directa (Kd,b) y por tanto estos valores representan la union de cMet al peptido marcado con fluorescema.
Ejemplo 7: Ensayos de polarizacion de fluorescencia de competencia de peptido
Se realizaron ensayos de polarizacion de fluorescencia de competencia de peptido para determinar que peptidos compiten entre sf por la union a cMet. Esto identificana posibles complejos peptfdicos heteromericos que presentan mayor afinidad por el receptor cMet que un peptido individual solo.
En resumen, se realizo competencia cruzada de peptidos de union a cMet en un manipulador de lfquido Cartesian (Irvine, CA) en un volumen de reaccion total de 3 |il. Se diluyeron los peptidos marcados con fluorescema hasta una concentracion final de 20 nM y se diluyeron peptidos competidores no marcados hasta una concentracion final de 10 |iM. Se diluyo la protema de fusion cMet-Fc hasta la Kd para cada peptido marcado con fluorescema en la reaccion. Se equilibraron mezclas de union durante 10 minutos en la microplaca a 30 °C antes de medir cualquier cambio en la anisotropfa. A partir de estos estudios, se identificaron tres pares de peptidos de union a cMet como no competidores y representan candidatos ideales para complejos peptfdicos de union a cMet heteromericos (vease la tabla 9). (Los polipeptidos mostrados en la tabla 9 no se reivindican).
Ejemplo 8: Procedimiento general para la preparacion de complejos pepddicos de union a cMet heteromericos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Cada uno de los dfmeros consiste en una secuencia que porta el ligando 6-PnAO de quelacion a Tc (denominado generalmente A) y una parte funcionalizada con espaciador (espaciador = JJ; J= acido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico) (denominado genericamente B). Se trato el compuesto B con un exceso de 10 veces de bisester de NHS del acido glutarico (Tyger Scientific, Princeton, NJ) y un exceso de ~20 veces de diisopropiletilamina a la temperatura ambiental en DMF durante 30 minutos. Se diluyo la mezcla de reaccion con eter (15 veces en volumen) lo que condujo a la precipitacion del monoester de NHS del peptido glutarilado. Se decanto el eter y se lavo el solido tres veces mas con eter, que elimino cualquier traza de bisester de NHS del acido glutarico sin reaccionar. Se resuspendio el solido resultante en DMF seca y se anadio el compuesto A (1 equiv.) seguido por diisopropiletilamina (20 equiv.) y se agito la mezcla durante 24 horas a la temperatura ambiental. Se diluyo la mezcla con agua (50 veces) y la mezcla se cargo directamente sobre una columna de HPLC de fase inversa, que se eluyo con un gradiente de acetonitrilo (TFA al 0,1%) en agua (TFA al 0,1%). Se combinaron las fracciones que conteman el producto deseado y se liofilizaron para proporcionar los materiales deseados.
Ejemplo espedfico: Preparacion de complejos de peptidos de union a cMet heterodimericos
1) Preparacion de un peptido de SEQ ID NO:514 modificado con PnAOG-Glut (un compuesto de tipo A) (Referencia)
A una disolucion de 6-glutaril-PnAO (40 mg, 0,1 mmol) en DMF seca (0,2 ml) se le anadieron N-hidroxisuccinimida (NHS, 14 mg, 0,12 mmol) y diisopropilcarbodiimida (DIC, 15 mg, 0,12 mmol) y se agito durante 4 h a temperatura ambiente. Se anadio eter:hexano (5 ml, 1:1) a la mezcla de reaccion. Se agito la mezcla y se retiro la disolucion de sobrenadante mediante decantacion, dejando la pasta en el matraz. Se lavo la pasta con eter:hexano (1:1) (3 x 5 ml) y se disolvio en DMF seca (0,2 ml). A esta disolucion se le anadieron la SEQ ID NO:518 modificada con K-(ivDde) (50 mg, 0,017 mmol) y diisopropiletilamina (DIEA, 10 mg, 0,08 mmol) y se agito la mezcla resultante durante 18 horas. Se anadio hidrazina (10 |il) y se agito la disolucion durante 30 min. Se diluyo la mezcla de reaccion con agua (20 ml), se cargo en una columna de HPLC de fase inversa (C18), y se eluyo con un sistema de agua (TFA al 0,1 %)-acetonitrilo (TFA al 0,1 %). Se recogieron las fracciones que conteman el producto requerido (>95 % de pureza) y se deshidrocongelaron para proporcionar la SEQ ID NO:518-(6-PnAO-Glut)) (vease el esquema 5 tal como se muestra en la figura 11) como un solido esponjoso incoloro. El rendimiento fue de 25,1 mg (47,4 %).
2) Preparacion de dfmero que contiene SEQ ID NO:514 unida a SEQ ID NO:515 (Referencia)
A una disolucion del peptido que contema la SEQ ID NO:515 (un compuesto de tipo B) (10 mg, 0,0034 mmol) y diisopropiletilamina (10 mg, 0,08 mmol) en DMF seca (0,2 ml) se le anadio glutarato de disuccinimidilo (10 mg, 0,031 mmol) y se agito a temperatura ambiente durante 30 min. Se diluyo la mezcla de reaccion con eter (3 ml) y se agito. Se decanto el sobrenadante, dejando un producto semisolido en el matraz. Se repitio este proceso de lavado del producto de reaccion con eter (3 x 5 ml). Se disolvio el producto semisolido asf obtenido en DMF seca (0,2 ml) y se anadieron el peptido de SEQ ID NO:514-(6-PnAO-Glut)) (10 mg, 0,0032 mmol) y diisopropiletilamina (10 mg, 0,08 mmol) y se agito la mezcla de reaccion durante 24 h a temperatura ambiente. Se diluyo la mezcla de reaccion con agua (10 ml), se cargo en una columna de HPLC de fase inversa (C18), y se eluyo con el sistema de agua (TFA al 0,1 %)-acetonitrilo (TFA al 0,1 %). Se recogieron las fracciones que conteman el producto requerido (>95 % de pureza) y se deshidrocongelaron para proporcionar el heterodfmero que tiene SEQ ID NO:514 unida a SEQ ID NO:515 mediante una union 6-PnAO-Glut (vease el esquema 6 tal como se muestra en la figura 12) como un solido esponjoso incoloro. Rendimiento: 6,7 mg (33 %). Se muestran las estructuras para este y otros heterodfmeros en las figuras 13A-13C.
Ejemplo 9: Ensayo de proliferacion celular
Se realizaron ensayos de proliferacion celular para identificar peptidos de union a cMet que antagonizan la proliferacion estimulada por HGF. Estos estudios in vitro utilizaron una lmea celular de leomiosarcoma, SK-LMS-1, en la que proliferan celulas en respuesta a HGF. Se sembraron celulas SK-LMS-1 en placas de 96 pocillos a una densidad de 2000 celulas/pocillo. Despues de una incubacion durante 24 horas a 37 °C, se privaron de alimento las celulas en medios de cultivo que conteman BSA al 0,1 % en vez de suero bovino fetal al 10 % durante 36 horas a 37 °C. Se anadieron medios de privacion de alimento nuevos con o sin un peptido de union a cMet (10 |iM) a los pocillos respectivos y se incubaron las celulas durante 2 horas a 37 °C. Se uso DMF como vehnculo de control y no recibio un peptido de union a cMet. Entonces se anadio HGF a una concentracion de o bien 50 ng/ml o bien 100 ng/ml y se incubaron las celulas durante unas 12 horas adicionales a 37 °C. Se evaluo la proliferacion midiendo la incorporacion de BrdU (Calbiochem, San Diego, CA) tal como se describe por el fabricante. Se muestran los resultados para la SEQ ID NO:365 (no reivindicado) (figura 10).
Ejemplo 10: Diseno de una coleccion de peptidos de union a cMet de segunda generacion (Referenda)
La seleccion inicial de colecciones de peptidos lineales y dclicos identifico varias coincidencias positivas para cMet. Las coincidencias de TN9 conteman un motivo altamente conservado (CxGpPxFxC, SEQ ID NO:512, la 'p' se selecciona menos fuertemente que los aminoacidos en mayusculas). Se construyo una coleccion que tema miembros tanto dclicos como lineales y se incorporo en fago que tema una presentacion acortada de gen III.
Tabla 1: TN9 y componentes lineales en la coleccion de segunda generacion:
Colecciones de TN9s para cMet (2a col. n° 1 de TN9 de cMet)
5
E = 0,64A + 0,12C + 0,12G + 0,12T Q = 0,12A + 0,64C + 0,12G + 0,12T J = 0,12A + 0,12C + 0,64G + 0,12T Z = 0,12A + 0,12C + 0,12G + 0,64T 10 Nota: (0,64)36 = 1. E -7 (0,64)39 = 2,5 E -8
Componente 1: Secuencia consenso de TN9 con extension izquierda de 3 AA
s m g
cteagcagtcactgtet tCC ATG Ggt Ncol........
S E T R P T tct gaa act cgc cct aca
15
imagen2
2a col. n° 2 de TN9 de cMet: Secuencia consenso de TN9 con extension derecha de 3 AA.
SMG SETKPT
□tcagcagtcactgtct tcc atggyt tct gAa act cgc cct AcA
Uco I.........
EAGswhCs GPPtFeCwwy GAG GOT GGT ejz zjj qez tgt ejz ggt cct cct eqj ttc jej tgc zjj zjj zez
gtePTERPSAS jjz eqj jej ccg AcT gAA cgt cct agt GCT AGC Gtga ctctgacagtctctgt
NheI. . .
(SEQ ID NO:519)
20
2a col. n° 3 de TN9 de cMet SIQCKGPPWFSCAMY (SEQ ID NO:537) con extension de 3 AA a la izquierda
SMG SETRPT .
ctcagcagtcactgtct tcc atg ggt tct gaa act cgc cct AcA
Wool.........
e a g s i q C k G P P w P s C a n y jej O'?2 jjz ejz ezz <?ej tgc eej ggt cct cct zjj ttc ejz tgt jqj ezj zez
TEAS
AcT gAA GCT AGC Gtga ctetgacagtctctgt NheI...
G T E P ggA Acg gAg ccg
(SEQ ID NO:520)
2a col. n° 4 deTN9 de cMet SIQCKGPPWFSCAMY (SEQ ID NO:537) con extension de 3 AA a la derecha
SKG SETRPT
ctcagcagtcactgtct tcc atg ggt tct gaa act cgc cct AcA
Ncol.........
E A G s i qCkGPPwFsCamy gag gcc ggt ejz ezz qej tgc eej ggt cct cct zjj ttc ejz tgt jqj ezj zez
gtePTERPSAS jjz egj jej ccg AcT gAA cgt cct agt GCT AGC Gtga ctetgacagtctctgt
Nhel...
(SEQ ID NO:521)
5
5a col. de TN9 de cMet 330-F05 YYGCKGPPTFECQWM (SEQ ID NO:531) con extension de 3 AA a la derecha tres peptidos tienen la secuencia central CKGPPTFEC (SEQ ID NO:548)
10
SMG SETRPT
ctcagcagtcactgtct tcc atg ggt tct gAa act cgc cct AcA
Ncol........
EAGyygCkGPPtFeCqwm GAG GCT GGT zez zez jjz tgc eej ggt cct cct eqz ttc jej tgt qee zjj ezj
gtePTERP SAS jjz eqj jej ccg AcT gAA cgt cct agt GCT AGC Gtga ctetgacagtctctgt
Nhel...
(SEQ ID NO:522)
6a col. de TN9 de cMet: 550-G12 AFFCSGPPTFMCSLY (SEQ ID NO:536) con extension de 3 AA a la derecha
dos peptidos tienen la secuencia central CSGPPTFMC (SEQ ID NO:549)
5MG SETRPT
ctcagcagtcactgtct tcu atg ggt, tct gAa act cgc cct AcA Wcol.........
E A G a f f CsGp PtFmCsly GAG GCT GGT jqz zzq zzq tgt zqz ggt qqj cct eqz ttc ezj tgc ejq qzz zez
gtePTERPSAS jjz eqj jej ccg Act gAA cgt cct agt GCT AGC Gtga ctctgacagtctctgt
Wiel...
(SEQ ID NO:523)
5 7a col. de TN9 de cMet, tres AA a la izquierda y se deja que vane la primera P de gPP.
S M G
ctcagcagtcactgtct tCC ATG Ggt Wool........
S E T R P T tct gaa act cgc cct aca
eagqfkCaG p.PsFaCwint
jej jqz jjz gej zzq eej tgt jqz ggt qqj ccg ejz ttc jqq tgt zjj ezj eqq
GTE PTEAS gga acg gag ccg act gaa GCT AGC Gtga ctctgacagtctctgt
Nhel...
(SEQ ID NO:524)
10 Ejemplo 11: Analisis de 94-E08 y otros peptidos lineales seleccionados para la union a cMet. (Referencia)
El aislamiento lineal 94-E08 (SEQ ID NO:454) tiene alta afinidad por cMet aunque habfa pocos otros peptidos aislados que tuvieran cierta homologfa con 94-E08 y, los que la teman, tienen una similitud muy limitada a lo largo de regiones muy cortas. Por tanto, se produjeron tres oligonucleotidos variables basados en 94-E08: (1) se vanan 15 los primeros 13 codones, manteniendo constantes los ultimos 7; (2) se vanan 13 de los primeros 18, manteniendo fijos 5 que mostraron cierta similitud con otros aislamientos y (3) se vanan los ultimos 13 codones, manteniendo fijos los primeros 5, vease la tabla 4 a continuacion.
Tabla 4.
20
Componente n° 8 con variacion en las primeras 13 posiciones (SEQ ID NO:594).
S M G S E
5'-tcactgtct tcc ATG Ggt tct gaa-
Scab.............| Ncol |
y d t w v f q £ i h
zez jez eqz zj j jzj zzz qej zzz ezz qez -
evpG ELVAMQ jej jzj qqj ggt gag ctg gtt get atg cag -
GGSGTEAS ggt 9St agt ggt act gaa GCT AGC Gtga ctctgac-3'
| NheI |Scab, , , ..,
Componente n° 9 Se fijan cinco AA y se extiende la variedad hasta la posicion 18 (SEQ ID NO:595). 5
S M G s E
5 1 -tcactgtct tCC ATG Ggt tct gaa-
Scab| Ncol |
yDTwvFq-f ih zez gat act zjj jzj ttt qej zzz ezz qez -
EVpgelvaMQ gag gtt qqj jjz jej qzj jzj jqj atg caa!
GGSGTEAS ggt ggt agt ggt act gaa GCT AGC Gtga ctctgac-31
J Nftei | scab.....
Componente n° 10 Se fijan los primeros siete AA y se vanan los ultimos 13 (SEQ ID NO:596).
S M G
5 ' -tcactgtct tCC ATG Ggt Scab..............| Ncol |
S E tct gaa-
Y D T W V F Q F i h tat gat act tgg gtt ttt caa ttt ezz qez -
evpgelvamq. jej jzz qqj jjs jej qzj jzj jqj ezj qzzl
GG SGT EAS ggt ggt agt ggt act gaa GOT AGC Gtga ctctgac-31
| NheI | Scab............. .
Diseno de oligonucleotidos para la construccion de la coleccion de peptidos de segunda generacion (las SEQ ID 5 NO:597-646; N.B. los oligonucleotidos marcados con “[RC]” consisten en el complemento inverso de la secuencia
mostrada):

Claims (7)

10
15
20
25
Polipeptido aislado que se une a cMet o un complejo que comprende cMet y HGF, en el que el polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos expuesta como GSX1X2X3CX4X5X6X7CX8X9X10APGGK (SEQ ID NO:525), en la que
X1 es F, L, S, W, Y o M;
X2 es I, Y, H, T o N;
X3 es I, L, D, M, F o S, preferiblemente I;
X4 es P, R, W, N o E, preferiblemente W o P;
X5 es W, Y, E, P, L, T o G;
Xa es S, T, D, F, E, W, G o Q;
X7 es F, W, N, Q, E, R o A;
X8 es G, N, H, R, M, I, D, V o T; X9 es S, K, F, M, T, D o L; y X10 es S, P, T, L, Y, N, H, Q o W;
2.
30 3.
4.
35
5.
40 6.
45
50 7.
8.
55
Polipeptido aislado segun la reivindicacion 1, en el que el polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1-10.
Polipeptido aislado segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el polipeptido es multimerico.
Polipeptido aislado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el polipeptido se conjuga a un marcador apropiado para la deteccion de diagnostico, opcionalmente mediante un ligador, para formar un agente de contraste para obtencion de imagenes de diagnostico.
Polipeptido aislado segun la reivindicacion 4, en el que el marcador se selecciona del grupo que consiste en una enzima, un compuesto fluorescente, un agente de contraste para ultrasonidos, un liposoma y un colorante optico.
Polipeptido aislado segun la reivindicacion 4 o 5, en el que el marcador es:
iQ 1 SJA i OR 1 01
(i) un marcador radiactivo, que opcionalmente se selecciona del grupo que consiste en F, I, I, I,
77Br, 76Br, 99mTc, 51Cr, 67Ga, ®8Ga, 47Sc, 167Tm, 141Ce, 111In, 168Yb, ™Vb, 1\a, 90Y, 88Y, 153Sm, 166Ho, 165Dy, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 97Ru, 103Ru, 186Re, 188Re, 203Pb, 211Bi, 212Bi, 213Bi, 214Bi, 105Rh, 109Pd, 117mSn, 149Pm, 161Tb, 177Lu, 198Au y 199 Au, o
(ii) un atomo de metal paramagnetico seleccionado del grupo que consiste en Gd
Ni2+, Eu3+, Dy3+, Pr3+, Cr3+, Co3+, Fe3+, Ti3+, Tb3+, Nd3+, Sm3+, Ho'3+, Er3+, Pa4+ y Eu2+
3+ Mn2+ Cu2+ Fe2+ Co2+,
Polipeptido aislado segun una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en el que el polipeptido se incorpora en burbujas para ultrasonidos, micropartfculas, microesferas, emulsiones o liposomas.
Polipeptido aislado segun una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en el que el agente de contraste para obtencion de imagenes de diagnostico es para su uso en la obtencion de imagenes de diagnostico in vivo que implica detectar un trastorno hiperproliferativo, angiogenesis o neovascularizacion.
9. Polipeptido aislado segun la reivindicacion 8, en el que la obtencion de imagenes es obtencion de imagenes por resonancia magnetica, obtencion de imagenes por ultrasonidos, obtencion de imagenes opticas, obtencion de imagenes por sonoluminiscencia, obtencion de imagenes fotoacusticas, obtencion de 60 imagenes por rayos X u obtencion de imagenes con radionuclidos.
10. Procedimiento de purificacion de cMet o un complejo de cMet y HGF de una disolucion que lo contiene, comprendiendo el procedimiento:
(a) poner en contacto la disolucion con al menos un polipeptido expuesto en la reivindicacion 1, que se inmoviliza sobre un sustrato solido, y
(b) separar el polipeptido de la disolucion.
312
imagen1
imagen2
313
FIG. IB
imagen3
imagen4
315
imagen5
m
i
o
/Trt
NH
Fmoc-NH-^CGOH
Fmoc-Dap(Boc-Ser(t-Bu))-OH
Fmoc-Dap(Trt-Aoa)-QH
316
R4
\
imagen6
imagen7
imagen8
imagen9
319
imagen10
FIG. 6
ffr,
f|p
imagen11
=Anclaje opcional
imagen12
imagen13
322
imagen14
R R
imagen15
323
imagen16
imagen17
324
imagen18
imagen19
325
FIG. 8D
imagen20
imagen21
imagen22
OH
imagen23
327
FIG. 8F
OH
imagen24
328
FIG. 9
imagen25
TANDA 1 celul&s DLD-1 O pratefna de fusion cMet-Fc
con perlas o TEA
TANDA 2 c^fulas DLO-1 O prate in a de fusion cMet-Fc
imagen26
Hah 1 h HGF durante Irrectidn la nothe con per:as oTEA
HGf 1 h rt(5F durante InfeceJrJn la nocr.e con pertas oTEA
HGF1 h HSF durante Jnfecdrin
la nache con perl 35
otEA
329
imagen27
FIG. 10
imagen28
PBS DMF OX-1322
Tratamiento
B HGF 0 ng/ml E3 HGF 50 ng/ml □ HGF 100 ng/m!
330
imagen29
331
SEQ IDNO-Jfs
Ac-GSFFPCWRJDRFGYCHAMAPGGG *^CHj)4HHCO
CONH, J , J
1 J ■ acido &-amino-3,6-dioxaoctanoico
1
NH1
COOKES
. Glutarato de disuccinimidilo (CH^S
COTOTNS
{ester de dl-N-sucdnidimilo adquirido .
de una fuente comercial) "
Ac-GSFFPCWRlDftfGYCHANAPGGG
EONH,
COHN
un producto intermedio no aislado sino que se hace *
reaccionar directamente con el siguiente componerte j
. COWMj M
COONKS
(BRU-130fl-{K{-6-PnAO-Glu!})
Ji0*0
m
up
M
■i* OHt
imagen30
SEQ ID NO: 514
imagen31
HH
P*H .
5EQ ID N0;515
imagen32
Ac-AQEWSRB'VFVDOrWOSWFOffHOOG'
SEQ ID NO;SW
imagen33
d
i—i &H' •
FIG. 14
imagen34
imagen35
o
imagen36
ES15157779.8T 2003-03-03 2004-03-03 Péptidos que se unen específicamente al receptor de HGF (cMet) y usos de los mismos Expired - Lifetime ES2692166T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US45158803P 2003-03-03 2003-03-03
US451588P 2003-03-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2692166T3 true ES2692166T3 (es) 2018-11-30

Family

ID=32962606

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10185426.3T Expired - Lifetime ES2557286T3 (es) 2003-03-03 2004-03-03 Usos de péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (cMet)
ES08008144T Expired - Lifetime ES2396368T3 (es) 2003-03-03 2004-03-03 Péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (CMET) y usos de los mismos
ES15157779.8T Expired - Lifetime ES2692166T3 (es) 2003-03-03 2004-03-03 Péptidos que se unen específicamente al receptor de HGF (cMet) y usos de los mismos

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10185426.3T Expired - Lifetime ES2557286T3 (es) 2003-03-03 2004-03-03 Usos de péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (cMet)
ES08008144T Expired - Lifetime ES2396368T3 (es) 2003-03-03 2004-03-03 Péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (CMET) y usos de los mismos

Country Status (13)

Country Link
US (6) US20050214859A1 (es)
EP (4) EP1603935A4 (es)
JP (4) JP5466350B2 (es)
AU (2) AU2004217894B2 (es)
CA (1) CA2517939C (es)
CY (1) CY1120683T1 (es)
DK (2) DK2284180T3 (es)
ES (3) ES2557286T3 (es)
HU (1) HUE039154T2 (es)
PL (2) PL1944312T3 (es)
PT (1) PT2949658T (es)
SI (1) SI2949658T1 (es)
WO (1) WO2004078778A2 (es)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1587944A4 (en) 2002-03-01 2007-03-21 Dyax Corp KDR AND VEGF / KDR BINDING PEPTIDES AND THEIR USE FOR DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC PURPOSES
US7261876B2 (en) 2002-03-01 2007-08-28 Bracco International Bv Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications
US8623822B2 (en) 2002-03-01 2014-01-07 Bracco Suisse Sa KDR and VEGF/KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy
US7794693B2 (en) 2002-03-01 2010-09-14 Bracco International B.V. Targeting vector-phospholipid conjugates
US7211240B2 (en) 2002-03-01 2007-05-01 Bracco International B.V. Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications
DK2284180T3 (en) * 2003-03-03 2015-12-21 Dyax Corp Uses of peptides that specifically bind to the HGF receptor (cMET)
NO20034350D0 (no) * 2003-09-29 2003-09-29 Amersham Health As Optisk avbilding av kolorektal kreft
US20060008844A1 (en) * 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
WO2006043892A1 (en) 2004-10-20 2006-04-27 Peas Institut Ab Assessment of biological activity of hepatocyte growth factor (hgf)
US8236761B2 (en) 2006-07-07 2012-08-07 Washington State University Research Foundation C-Met receptor regulation by angiotensin IV (AT4) receptor ligands
WO2008005531A2 (en) * 2006-07-07 2008-01-10 Washington State University Research Foundation C-met receptor regulation by angiotensin iv (at4) receptor ligands
WO2008094275A1 (en) * 2007-01-30 2008-08-07 New York University Peptides for treatment of conditions associated with nitric oxide
ES2385066T3 (es) * 2007-05-16 2012-07-17 Ge Healthcare As Péptidos de unión a HGF marcados para la formación de imágenes
GB0718957D0 (en) * 2007-09-28 2007-11-07 Ge Healthcare Ltd Optical imaging agents
GB0718967D0 (en) 2007-09-28 2007-11-07 Ge Healthcare Ltd Peptide imaging agents
US20100196272A1 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Neoprobe Corporation Compositions for radiolabeling diethylenetriaminepentaacetic acid (dtpa)-dextran
GB0918321D0 (en) 2009-10-20 2009-12-02 Ge Healthcare As Cyclic peptide synthesis
EP2496948B1 (en) 2009-11-05 2018-01-10 University of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for detecting plectin-1 as a biomarker for cancer
GB201013808D0 (en) 2010-08-18 2010-09-29 Ge Healthcare Ltd Peptide radiotracer compositions
GB201103696D0 (en) * 2011-03-04 2011-04-20 Ge Healthcare Ltd Technetium labelled peptides
GB201116733D0 (en) 2011-09-28 2011-11-09 Ge Healthcare As Peptide margin imaging agents
GB201116862D0 (en) 2011-09-30 2011-11-09 Ge Healthcare As Infusion imaging method
GB201121914D0 (en) 2011-12-20 2012-02-01 Ge Healthcare Ltd Method for patient selection
WO2014074907A1 (en) * 2012-11-09 2014-05-15 Indi Molecular, Inc. C-met-specific capture agents, compositions, and methods of using and making
WO2014172392A1 (en) 2013-04-18 2014-10-23 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
ES2688206T3 (es) 2013-06-17 2018-10-31 Armo Biosciences, Inc. Procedimiento de evaluación de la identidad y la estabilidad de proteínas
US9393177B2 (en) 2013-08-20 2016-07-19 Anutra Medical, Inc. Cassette assembly for syringe fill system
GB201314936D0 (en) 2013-08-21 2013-10-02 Ge Healthcare Ltd Radiolabelling method
US10010588B2 (en) 2013-08-30 2018-07-03 Armo Biosciences, Inc. Methods of using pegylated interleukin-10 for treating hyperlipidemia
CA2927592C (en) 2013-10-28 2020-08-18 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Fgf-19 variants for treating a fgf-19 dependent cancer or tumor
RU2016122957A (ru) 2013-11-11 2017-12-19 Армо Байосайенсиз, Инк. Способы применения интерлейкина-10 для лечения заболеваний и расстройств
GB201322456D0 (en) 2013-12-18 2014-02-05 Ge Healthcare Ltd Radiotracer compositions and methods
US10293043B2 (en) 2014-06-02 2019-05-21 Armo Biosciences, Inc. Methods of lowering serum cholesterol
USD763433S1 (en) 2014-06-06 2016-08-09 Anutra Medical, Inc. Delivery system cassette
USD774182S1 (en) 2014-06-06 2016-12-13 Anutra Medical, Inc. Anesthetic delivery device
USD750768S1 (en) 2014-06-06 2016-03-01 Anutra Medical, Inc. Fluid administration syringe
US10806803B2 (en) 2014-07-17 2020-10-20 Ohio State Innovation Foundation Compositions for targeting macrophages and other CD206 high expressing cells and methods of treating and diagnosis
EP3180431A1 (en) * 2014-08-11 2017-06-21 Miti Biosystems GmbH Cyclic peptides expressed by a genetic package
EP3197346B1 (en) * 2014-09-22 2020-02-26 National Health Research Institutes Use of 5-methoxytryptophan as diagnostic agent of inflammatory diseases
US10350270B2 (en) 2014-10-14 2019-07-16 Armo Biosciences, Inc. Interleukin-15 compositions and uses thereof
CA2963995A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
WO2016126615A1 (en) 2015-02-03 2016-08-11 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
CN107847583A (zh) 2015-05-28 2018-03-27 阿尔莫生物科技股份有限公司 用于治疗癌症的聚乙二醇化白细胞介素‑10
EP3302528A1 (en) 2015-05-29 2018-04-11 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
EA201890020A1 (ru) 2015-06-15 2018-05-31 Зе Боард Оф Трастиз Оф Зе Леланд Стэнфорд Джуниор Юниверсити Способы и композиции для лечения ассоциированных со старением состояний
CN108025040A (zh) 2015-08-25 2018-05-11 阿尔莫生物科技股份有限公司 使用白介素-10治疗疾病和病症的方法
RS63143B1 (sr) * 2016-06-01 2022-05-31 Athira Pharma Inc Jedinjenja
US20190151483A1 (en) 2016-07-25 2019-05-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Serv Methods of making 18f-labeled precursors and peptides, labeled c-met binding peptides, and methods of use thereof
CN109689679A (zh) * 2016-09-13 2019-04-26 第一三共株式会社 血小板反应蛋白1结合肽
CN109789183A (zh) * 2016-09-29 2019-05-21 Aebi有限公司 治疗性多靶向构建体及其用途
MX2019004029A (es) 2016-10-07 2019-09-27 Navidea Biopharmaceuticals Inc Compuestos y metodos para diagnosis y tratamiento de infecciones virales.
GB201804835D0 (en) * 2018-03-26 2018-05-09 Ge Healthcare As Formulation and method of preparation
JP2022537946A (ja) 2019-06-14 2022-08-31 エディンバラ モレキュラー イメージング リミテッド 化合物及びそれらの使用方法
MX2022005676A (es) 2019-11-13 2022-10-27 Amunix Pharmaceuticals Inc Polipéptidos xten con código de barras y composiciones de estos, y métodos para preparar y usar los mismos.
JP7162853B1 (ja) 2021-07-02 2022-10-31 ペプチスター株式会社 液相ペプチド合成用担体結合ペプチドの分析方法
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023193015A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
WO2023225273A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Navidea Biopharmaceuticals, Inc. Cd206 targeted drug delivery vehicles carrying novel bisphosphonate drug payloads via a degradable linker

Family Cites Families (163)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4093709A (en) 1975-01-28 1978-06-06 Alza Corporation Drug delivery devices manufactured from poly(orthoesters) and poly(orthocarbonates)
US4131648A (en) 1975-01-28 1978-12-26 Alza Corporation Structured orthoester and orthocarbonate drug delivery devices
US4180646A (en) 1975-01-28 1979-12-25 Alza Corporation Novel orthoester polymers and orthocarbonate polymers
US4391797A (en) 1977-01-05 1983-07-05 The Children's Hospital Medical Center Systems for the controlled release of macromolecules
US4718433A (en) 1983-01-27 1988-01-12 Feinstein Steven B Contrast agents for ultrasonic imaging
DE3313947A1 (de) 1983-04-15 1984-10-18 Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen Mikropartikel und gasblaeschen enthaltende ultraschall-kontrastmittel
DE3834705A1 (de) 1988-10-07 1990-04-12 Schering Ag Ultraschallkontrastmittel aus gasblaeschen und fettsaeure enthaltenden mikropartikeln
DE3313946A1 (de) 1983-04-15 1984-10-18 Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen Mikropartikel und gasblaeschen enthaltende ultraschall-kontrastmittel
US4900540A (en) 1983-06-20 1990-02-13 Trustees Of The University Of Massachusetts Lipisomes containing gas for ultrasound detection
US4899755A (en) 1985-05-08 1990-02-13 The General Hospital Corporation Hepatobiliary NMR contrast agents
MX174467B (es) 1986-01-23 1994-05-17 Squibb & Sons Inc 1,4,7-triscarboximetil-1,4,7,10-tetraazaciclodo decano substituido en 1 y compuestos analogos
US5021556A (en) 1987-07-22 1991-06-04 Neorx Corporation Method of radiolabeling chelating compounds comprising sulfur atoms with metal radionuclides
IE61591B1 (en) 1987-12-29 1994-11-16 Molecular Biosystems Inc Concentrated stabilized microbubble-type ultrasonic imaging agent and method of production
US4844882A (en) 1987-12-29 1989-07-04 Molecular Biosystems, Inc. Concentrated stabilized microbubble-type ultrasonic imaging agent
US5075099A (en) 1988-05-31 1991-12-24 Neorx Corporation Metal radionuclide chelating compounds for improved chelation kinetics
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5364613A (en) 1989-04-07 1994-11-15 Sieving Paul F Polychelants containing macrocyclic chelant moieties
US5118797A (en) 1989-08-28 1992-06-02 E. R. Squibb & Sons, Inc. Rhenium tris dioxime complexes
WO1991003200A1 (en) 1989-08-28 1991-03-21 The General Hospital Corporation Hydroxy-aryl metal chelates for diagnostic nmr imaging
US5230882A (en) 1989-12-22 1993-07-27 Unger Evan C Liposomes as contrast agents for ultrasonic imaging and methods for preparing the same
US5773024A (en) * 1989-12-22 1998-06-30 Imarx Pharmaceutical Corp. Container with multi-phase composition for use in diagnostic and therapeutic applications
US6146657A (en) * 1989-12-22 2000-11-14 Imarx Pharmaceutical Corp. Gas-filled lipid spheres for use in diagnostic and therapeutic applications
US5585112A (en) * 1989-12-22 1996-12-17 Imarx Pharmaceutical Corp. Method of preparing gas and gaseous precursor-filled microspheres
US5469854A (en) 1989-12-22 1995-11-28 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods of preparing gas-filled liposomes
US5305757A (en) 1989-12-22 1994-04-26 Unger Evan C Gas filled liposomes and their use as ultrasonic contrast agents
US5123414A (en) 1989-12-22 1992-06-23 Unger Evan C Liposomes as contrast agents for ultrasonic imaging and methods for preparing the same
US5871959A (en) * 1989-12-27 1999-02-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of producing hepatocycte growth factor/scatter factor and related cell lines
CA2034042C (en) 1990-01-18 1999-08-17 Adrian D. Nunn Boronic acid adducts of rhenium dioxime and technetium-99m dioxime complexes containing a biochemically active group
US5556610A (en) 1992-01-24 1996-09-17 Bracco Research S.A. Gas mixtures useful as ultrasound contrast media, contrast agents containing the media and method
IN172208B (es) 1990-04-02 1993-05-01 Sint Sa
US5578292A (en) 1991-11-20 1996-11-26 Bracco International B.V. Long-lasting aqueous dispersions or suspensions of pressure-resistant gas-filled microvesicles and methods for the preparation thereof
US5445813A (en) 1992-11-02 1995-08-29 Bracco International B.V. Stable microbubble suspensions as enhancement agents for ultrasound echography
US5183653A (en) 1990-04-13 1993-02-02 E. R. Squibb & Sons, Inc. Boronic acid adducts of metal dioxime complexes useful in labelling proteins and other amine-containing compounds
US5137928A (en) 1990-04-26 1992-08-11 Hoechst Aktiengesellschaft Ultrasonic contrast agents, processes for their preparation and the use thereof as diagnostic and therapeutic agents
AU636481B2 (en) 1990-05-18 1993-04-29 Bracco International B.V. Polymeric gas or air filled microballoons usable as suspensions in liquid carriers for ultrasonic echography
US5173298A (en) 1990-09-27 1992-12-22 Allergan, Inc. Nonaqueous fluorinated drug delivery vehicle suspensions
US5367080A (en) 1990-11-08 1994-11-22 Sterling Winthrop Inc. Complexing agents and targeting radioactive immunoreagents useful in therapeutic and diagnostic imaging compositions and methods
DE69230525T2 (de) 1991-02-08 2000-06-21 Diatide, Inc. Technetium-99m markierte Polypeptide zur Bildformung
US5849261A (en) 1991-02-08 1998-12-15 Diatide, Inc. Radiolabeled vasoactive intestinal peptides for diagnosis and therapy
US5965107A (en) 1992-03-13 1999-10-12 Diatide, Inc. Technetium-99m labeled peptides for imaging
DE69232718T2 (de) 1991-02-22 2003-04-03 American Cyanamid Co., Madison Identifizierung eines menschlichen rezeptor-tyrosinkinasegens
GB9106686D0 (en) 1991-03-28 1991-05-15 Hafslund Nycomed As Improvements in or relating to contrast agents
GB9106673D0 (en) 1991-03-28 1991-05-15 Hafslund Nycomed As Improvements in or relating to contrast agents
DK0586524T3 (es) 1991-06-03 1997-05-20 Nycomed Imaging As
CA2112109A1 (en) 1991-07-05 1993-01-21 Arne Berg Improvements in or relating to contrast agents
US5808091A (en) 1991-10-29 1998-09-15 Bracco International B.V. Rhenium and technetium complexes containing a hypoxia localizing moiety
GB9200388D0 (en) 1992-01-09 1992-02-26 Nycomed As Improvements in or relating to contrast agents
GB9200387D0 (en) 1992-01-09 1992-02-26 Nycomed As Improvements in or relating to contrast agents
GB9200391D0 (en) 1992-01-09 1992-02-26 Nycomed As Improvements in or relating to contrast agents
IL104084A (en) 1992-01-24 1996-09-12 Bracco Int Bv Sustainable aqueous suspensions of pressure-resistant and gas-filled blisters, their preparation, and contrast agents containing them
US5861301A (en) 1992-02-20 1999-01-19 American Cayanamid Company Recombinant kinase insert domain containing receptor and gene encoding same
US5965132A (en) * 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US5877289A (en) 1992-03-05 1999-03-02 The Scripps Research Institute Tissue factor compositions and ligands for the specific coagulation of vasculature
DK0642580T3 (da) * 1992-05-18 2002-12-23 Genentech Inc Hepactocytvækstfaktorvarianter
US5316921A (en) * 1992-05-18 1994-05-31 Genentech, Inc. Single-chain hepatocyte growth factor variants
AU693767B2 (en) * 1992-08-10 1998-07-09 Cambridge Neuroscience, Inc. Inhibitors of cell proliferation, their preparation and use
DE69233803D1 (de) 1992-10-28 2011-03-31 Genentech Inc Verwendung von vaskulären Endothelwachstumsfaktor-Antagonisten
US5608110A (en) 1993-06-15 1997-03-04 Bracco International B.V. Heteroatom-bearing ligands and metal complexes thereof
IL110185A (en) 1993-07-02 1999-05-09 Molecular Biosystems Inc Method for making encapsulated gas microspheres from heat denatured protein in the absence of oxygen gas
WO1995003280A1 (en) 1993-07-19 1995-02-02 Resolution Pharmaceuticals Inc. Hydrazino-type radionuclide chelators having an n3s configuration
US5798091A (en) 1993-07-30 1998-08-25 Alliance Pharmaceutical Corp. Stabilized gas emulsion containing phospholipid for ultrasound contrast enhancement
US5574140A (en) 1993-09-03 1996-11-12 Resolution Pharmaceutical Inc. Hydrazino-type N2 S2 chelators
ES2192572T3 (es) 1993-12-15 2003-10-16 Bracco Research Sa Medios de contraste de ultrasonidos, agentes de contraste que contienen los medios, y metodo.
GB9402867D0 (en) 1994-02-15 1994-04-06 Nycomed Imaging As Improvements in or relating to contrast agents
ES2249762T3 (es) * 1994-03-08 2006-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Factor de crecimiento del endotelio vascular 2.
JP2891647B2 (ja) 1994-03-11 1999-05-17 株式会社日本触媒 有機スルフィド化合物及びその製造方法
US5770565A (en) 1994-04-13 1998-06-23 La Jolla Cancer Research Center Peptides for reducing or inhibiting bone resorption
US5582814A (en) 1994-04-15 1996-12-10 Metasyn, Inc. 1-(p-n-butylbenzyl) DTPA for magnetic resonance imaging
CA2188292A1 (en) 1994-04-20 1995-11-02 Larry Margerum Contrast agents
US5707624A (en) * 1994-06-03 1998-01-13 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of Kaposi's sarcoma by inhibition of scatter factor
US5650135A (en) 1994-07-01 1997-07-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Non-invasive localization of a light-emitting conjugate in a mammal
US5662885A (en) 1994-07-22 1997-09-02 Resolution Pharmaceuticals Inc. Peptide derived radionuclide chelators
GB9417941D0 (en) 1994-09-06 1994-10-26 Nycomed Imaging As Improvements in or relating to contrast agents
US5556939A (en) 1994-10-13 1996-09-17 Merck Frosst Canada, Inc. TC or RE radionuclide labelled chelate, hexapeptide complexes useful for diagnostic or therapeutic applications
US6403088B1 (en) * 1995-08-01 2002-06-11 Helsinki University Licensing, Ltd. Antibodies reactive with VEGF-C, a ligand for the Flt4 receptor tyrosine kinase (VEGFR-3)
US6645933B1 (en) * 1995-08-01 2003-11-11 Helsinki University Licensing Ltd. Oy Receptor ligand VEGF-C
US6221839B1 (en) * 1994-11-14 2001-04-24 Helsinki University Licensing Ltd. Oy FIt4 ligand and methods of use
US6245530B1 (en) * 1995-08-01 2001-06-12 Ludwig Institute For Cancer Research Receptor ligand
US6333021B1 (en) 1994-11-22 2001-12-25 Bracco Research S.A. Microcapsules, method of making and their use
DE4445065A1 (de) 1994-12-07 1996-06-13 Diagnostikforschung Inst Verfahren zur In-vivo-Diagnostik mittels NIR-Strahlung
IL116328A (en) 1994-12-16 1999-09-22 Bracco Research Sa Frozen suspension of gas microbubbles in frozen aqueous carrier for use as contrast agent in ultrasonic imaging
TW319763B (es) 1995-02-01 1997-11-11 Epix Medical Inc
GB9502065D0 (en) 1995-02-02 1995-03-22 Nycomed Imaging As Contrast media
US5686292A (en) 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
US6521211B1 (en) 1995-06-07 2003-02-18 Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Inc. Methods of imaging and treatment with targeted compositions
DE69632401T2 (de) 1995-06-07 2005-05-19 Imarx Pharmaceutical Corp., Tucson Neue zielgerichtete mittel zur diagnostischen und therapeutischen verwendung
US6361946B1 (en) * 1997-02-05 2002-03-26 Licentia Ltd Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof
PT848755E (pt) * 1995-09-08 2003-12-31 Genentech Inc Proteina relacionada com o vegf
AU1116297A (en) 1995-11-08 1997-05-29 Immunex Corporation Flk-1 binding protein
US5837680A (en) 1996-02-16 1998-11-17 Children's Medical Center Corporation Pharmaceutical compositions comprising troponin subunits, fragments and analogs thereof and methods of their use to inhibit angiogenesis
ES2197986T3 (es) 1996-02-19 2004-01-16 Amersham Health As Mejoras introducidas en o relacionadas con agentes de contraste.
CA2247620A1 (en) 1996-04-01 1997-10-09 Epix Medical, Inc. Bioactivated diagnostic imaging contrast agents
ATE411055T1 (de) 1996-08-02 2008-10-15 Ge Healthcare As Verbesserungen für oder in bezug auf kontrastmittel
TW320761B (en) * 1996-10-03 1997-11-21 Mos Electronics Taiwan Inc Manufacturing method of high density DRAM with cylindrical stack capacitor
CZ140999A3 (cs) 1996-10-21 1999-09-15 Nycomed Imaging As Směsný prostředek pro použití jako kontrastní činidlo
US6331289B1 (en) * 1996-10-28 2001-12-18 Nycomed Imaging As Targeted diagnostic/therapeutic agents having more than one different vectors
WO1998018495A2 (en) 1996-10-28 1998-05-07 Marsden, John, Christopher Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents
EP0973552B1 (en) 1996-10-28 2006-03-01 Amersham Health AS Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents
US6261537B1 (en) * 1996-10-28 2001-07-17 Nycomed Imaging As Diagnostic/therapeutic agents having microbubbles coupled to one or more vectors
WO1998018498A2 (en) 1996-10-28 1998-05-07 Marsden, John, Christopher Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents
ES2206689T3 (es) 1996-10-28 2004-05-16 Amersham Health As Agentes de contraste.
US6264917B1 (en) * 1996-10-28 2001-07-24 Nycomed Imaging As Targeted ultrasound contrast agents
GB9708265D0 (en) 1997-04-24 1997-06-18 Nycomed Imaging As Contrast agents
WO1998018496A2 (en) 1996-10-28 1998-05-07 Nycomed Imaging As Contrast agents
US7125714B2 (en) * 1997-02-05 2006-10-24 Licentia Ltd. Progenitor cell materials and methods
US5919967A (en) 1997-04-11 1999-07-06 Epix Medical, Inc. Process for synthesizing phosphodiesters
DE19717904A1 (de) 1997-04-23 1998-10-29 Diagnostikforschung Inst Säurelabile und enzymatisch spaltbare Farbstoffkonstrukte zur Diagnostik mit Nahinfrarotlicht und zur Therapie
US5886142A (en) 1997-05-20 1999-03-23 Thomas Jefferson University Radiolabeled thrombus imaging agents
US6245318B1 (en) 1997-05-27 2001-06-12 Mallinckrodt Inc. Selectively binding ultrasound contrast agents
IL120943A (en) 1997-05-29 2004-03-28 Univ Ben Gurion A system for administering drugs through the skin
GB9712525D0 (en) 1997-06-16 1997-08-20 Nycomed Imaging As Method
ATE371727T1 (de) * 1997-06-18 2007-09-15 Merck & Co Inc Kdr, ein menschlicher tyrosin kinase rezeptor
IL134985A0 (en) 1997-10-02 2001-05-20 Epix Medical Inc A method for contrast enhanced diagnostic imaging
CA2313390A1 (en) 1997-12-09 1999-06-17 Children's Medical Center Corporation Peptide antagonists of vascular endothelial growth factor
US6165458A (en) 1997-12-26 2000-12-26 Pharmaderm Laboratories Ltd. Composition and method for dermal and transdermal administration of a cytokine
AU753196B2 (en) 1998-02-09 2002-10-10 Bracco Research S.A. Targeted delivery of biologically active media
EP1056773A2 (en) 1998-02-11 2000-12-06 Resolution Pharmaceuticals Inc. Angiogenesis targeting molecules
US20020136721A1 (en) * 1998-02-17 2002-09-26 Schwall Ralph H. Hepatocyte growth factor receptor antagonists and uses thereof
EA200001007A1 (ru) 1998-03-31 2001-04-23 Дюпон Фармасьютикалз Компани Фармацевтические препараты для визуализации ангиогенных расстройств
US6093382A (en) 1998-05-16 2000-07-25 Bracco Research Usa Inc. Metal complexes derivatized with folate for use in diagnostic and therapeutic applications
BR9915139A (pt) 1998-11-06 2001-08-07 Basf Ag Método de inibir a hiperpermeabilidade vascular, e de inibir um processo ou estado fisiológico em um indivìduo
US6312665B1 (en) 1998-12-21 2001-11-06 Generex Pharmaceuticals Incorporated Aerosol formulations for buccal and pulmonary application
CA2364630A1 (en) * 1999-03-12 2000-09-21 Human Genome Sciences, Inc. 50 human secreted proteins
JP2002542767A (ja) * 1999-03-12 2002-12-17 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ４７個のヒト分泌タンパク質
US20090087878A9 (en) * 1999-05-06 2009-04-02 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules associated with plants
US6294525B1 (en) 1999-09-01 2001-09-25 Molecumetics Ltd. Reverse-turn mimetics and methods relating thereto
GB9928950D0 (en) 1999-12-07 2000-02-02 Metris Therapeutics Limited Binding protein
US7045133B2 (en) * 2000-01-18 2006-05-16 Ludwig Institute For Cancer Research VEGF-D/VEGF-C/VEGF peptidomimetic inhibitor
US7740841B1 (en) 2000-01-28 2010-06-22 Sunnybrook Health Science Center Therapeutic method for reducing angiogenesis
US6733755B2 (en) * 2000-02-04 2004-05-11 Supratek Pharma, Inc. Ligand for vascular endothelial growth factor receptor
JP4981229B2 (ja) 2000-02-25 2012-07-18 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ ハイブリッド血管内皮成長因子ＤＮＡｓおよびタンパク質に関与する物質および方法
ATE533056T1 (de) 2000-03-02 2011-11-15 Vegenics Pty Ltd Verfahren zum auffinden von tumoren welche den vaskulären endothelialen wachstumsfaktor d exprimieren
US20020102260A1 (en) * 2000-03-02 2002-08-01 Marc Achen Methods for treating neoplastic disease characterized by vascular endothelial growth factor D expression, for screening for neoplastic disease or metastatic risk, and for maintaining vascularization of tissue
US6769080B2 (en) * 2000-03-09 2004-07-27 Texas Instruments Incorporated Scan circuit low power adapter with counter
JP2003527441A (ja) 2000-03-22 2003-09-16 グラクソ グループ リミテッド 細胞周期を阻止する薬剤及び抗体を含む医薬
US20010031485A1 (en) 2000-03-22 2001-10-18 Sibtech, Inc. Recombinant proteins containing Shiga-like toxin and vascular endothelial growth factor fragments
US20050019826A1 (en) * 2000-03-31 2005-01-27 Roselyne Tournaire Peptides blocking vascular endothelial growth factor(vegf)-mediated angiogenesis, polynucleotides encoding said pepetides and methods of use thereof
US20050100991A1 (en) * 2001-04-12 2005-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AU2001259195A1 (en) 2000-04-28 2001-11-12 Glaxo Group Limited Compounds having affinity for the vascular endothelial growth factor receptor-2 (vegfr-2) and associated uses
CA2407970A1 (en) 2000-05-03 2001-11-08 Ludwig Institute For Cancer Research A method for activating only the vascular endothelial growth factor receptor-3 and uses thereof
KR100457350B1 (ko) * 2000-06-01 2004-11-16 이경림 ＩｇＥ-의존적 히스타민 방출인자(ＨＲＦ)의 수용체,ＨＲＦ 결합 펩타이드 및 그들을 코딩하는 핵산, 및그들의 용도
BR0111861A (pt) 2000-06-23 2003-12-23 Schering Ag Combinações e composições que interferem com função receptora vegf/vegf e angiopoietina/tie e seu uso(ii)
EP1166799A1 (en) 2000-06-28 2002-01-02 Schering Aktiengesellschaft Combinations and compositions which interfere with VEGF/VEGF and angiopoietin/Tie receptor function and their use (II)
EP1166798A1 (en) 2000-06-23 2002-01-02 Schering Aktiengesellschaft Combinations and compositions which interfere with VEGF/VEGF and angiopoietin/ Tie receptor function and their use
AU2001276934A1 (en) * 2000-07-18 2002-02-05 Joslin Diabetes Center Inc. Methods of modulating fibrosis
US20020091082A1 (en) * 2000-09-13 2002-07-11 Aiello Lloyd P. Methods of modulating symptoms of hypertension
FR2814744B1 (fr) 2000-10-04 2002-11-29 Commissariat Energie Atomique Cyclopeptides, leur procede de preparation et leur utilisation comme inhibiteur ou activateur de l'angiogenese
US20030082103A1 (en) * 2000-10-11 2003-05-01 Targesome, Inc. Targeted therapeutic lipid constructs having cell surface targets
US7611711B2 (en) 2001-01-17 2009-11-03 Vegenics Limited VEGFR-3 inhibitor materials and methods
AU2002248372B8 (en) 2001-01-19 2008-03-20 Vegenics Limited FLT4(VEGFR-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy
US20030176674A1 (en) 2001-04-13 2003-09-18 Rosen Craig A. Vascular endothelial growth factor 2
WO2003000842A2 (en) * 2001-06-04 2003-01-03 Curagen Corporation Novel proteins and nucleic acids encoding same
AU2002318356A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-08 Incyte Genomics, Inc. Protein modification and maintenance molecules
AU2002362461A1 (en) 2001-10-01 2003-04-14 Targesome, Inc. Targeted therapeutic lipid constructs having cell surface targets
US6766860B2 (en) * 2002-02-22 2004-07-27 Globalsantafe Corporation Multi-activity offshore drilling facility having a support for tubular string
US7794693B2 (en) * 2002-03-01 2010-09-14 Bracco International B.V. Targeting vector-phospholipid conjugates
US7211240B2 (en) * 2002-03-01 2007-05-01 Bracco International B.V. Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications
EP1501357A4 (en) 2002-05-06 2009-10-21 Genentech Inc USE OF VEGF FOR THE TREATMENT OF BONE DEFECTS
DK2284180T3 (en) * 2003-03-03 2015-12-21 Dyax Corp Uses of peptides that specifically bind to the HGF receptor (cMET)
CA2826960A1 (en) * 2005-12-09 2007-06-14 Bracco Suisse Sa Targeting vector-phospholipid conjugates
CA2716826C (en) * 2008-02-25 2017-05-09 Prometheus Laboratories Inc. Drug selection for breast cancer therapy using antibody-based arrays
US9801473B2 (en) 2012-09-13 2017-10-31 Kids Ii, Inc. Play yard with removable liner
WO2015005839A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Telefonaktiebolaget L M Ericsson (Publ) Method for enabling control of data packet flows belonging to different access technologies

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004078778A3 (en) 2004-11-18
EP2284180B1 (en) 2015-09-09
EP1944312A1 (en) 2008-07-16
PT2949658T (pt) 2018-10-18
US9000124B2 (en) 2015-04-07
US20050214859A1 (en) 2005-09-29
US8044175B2 (en) 2011-10-25
SI2949658T1 (sl) 2018-10-30
CA2517939C (en) 2015-11-24
EP1603935A4 (en) 2007-03-21
EP1603935A2 (en) 2005-12-14
EP2949658B1 (en) 2018-08-08
JP2014159434A (ja) 2014-09-04
HUE039154T2 (hu) 2018-12-28
JP6216280B2 (ja) 2017-10-18
DK2949658T3 (en) 2018-10-01
ES2396368T3 (es) 2013-02-21
JP2007524598A (ja) 2007-08-30
US20120039802A1 (en) 2012-02-16
AU2010235865B2 (en) 2012-11-15
US20100260672A1 (en) 2010-10-14
CA2517939A1 (en) 2004-09-16
AU2004217894A1 (en) 2004-09-16
JP2017019787A (ja) 2017-01-26
EP1944312B1 (en) 2012-06-27
WO2004078778A2 (en) 2004-09-16
JP5876644B2 (ja) 2016-03-02
JP6374913B2 (ja) 2018-08-15
EP2284180A2 (en) 2011-02-16
US9845340B2 (en) 2017-12-19
PL2949658T3 (pl) 2018-11-30
ES2557286T3 (es) 2016-01-25
CY1120683T1 (el) 2019-12-11
EP2949658A3 (en) 2016-01-13
EP2949658A2 (en) 2015-12-02
EP2284180A3 (en) 2011-10-05
AU2004217894B2 (en) 2010-07-15
JP5466350B2 (ja) 2014-04-09
US20110311446A1 (en) 2011-12-22
US20150218218A1 (en) 2015-08-06
PL1944312T3 (pl) 2012-12-31
JP2011037872A (ja) 2011-02-24
DK2284180T3 (en) 2015-12-21
US20100261875A1 (en) 2010-10-14
AU2010235865A1 (en) 2010-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2692166T3 (es) Péptidos que se unen específicamente al receptor de HGF (cMet) y usos de los mismos
CA2512780C (en) Multivalent constructs that bind the vegf receptor-2 kdr for therapeutic and diagnostic applications
US7666979B2 (en) Methods for preparing multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications and methods of preparing the same
AU2003228276B2 (en) Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications
AU2012241087B2 (en) Peptides that specifically bind HGF receptor (cMet) and uses thereof
AU2015201413B2 (en) Peptides that specifically bind HGF receptor (cMet) and uses thereof
CA2779639A1 (en) Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications