KR100457350B1

KR100457350B1 - ＩｇＥ-의존적 히스타민 방출인자(ＨＲＦ)의 수용체,ＨＲＦ 결합 펩타이드 및 그들을 코딩하는 핵산, 및그들의 용도

Info

Publication number: KR100457350B1
Application number: KR10-2001-0027896A
Authority: KR
Inventors: 이경림; 정준호; 김미영; 정재훈
Original assignee: 이경림
Priority date: 2000-06-01
Filing date: 2001-05-22
Publication date: 2004-11-16
Also published as: US20020095023A1; DE60110683D1; EP1167526A1; KR20010109481A; EP1167526B1; CA2347276A1; US6710165B2; ATE295418T1; JP4295449B2; JP2002330772A

Abstract

본 발명은 IgE-의존적 히스타민 방출인자(IgE-dependent histamine-releasing factor; HRF)의 신규한 수용체, HRF 결합 펩타이드, 그들을 코딩하는 핵산, 재조합 벡터 및 형질전환체, 및 그들의 의약 분야에 있어서의 용도에 관한 것으로서, 세포내에서 히스타민 분비를 저해함으로써, 동물은 물론 인간의 천식; 비염; 담마진; 아나필락시스; 알러지성 기관지확장증; 음식, 약물, 화분 또는 벌레로 인한 알러지; 헤이 피버; 한냉두드러기; 또는 아토피성 피부염 등과 같은 알러지 질환, 또는 말라리아의 진단, 예방 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 HRF 결합 펩타이드를 선도물질로 하여 여러 비펩타이드(non-peptide) 유도물질을 제조할 수 있다.

Description

ＩｇＥ-의존적 히스타민 방출인자(ＨＲＦ)의 수용체, ＨＲＦ 결합 펩타이드 및 그들을 코딩하는 핵산, 및 그들의 용도{IgE-dependent histamine-releasing factor(HRF) receptor, HRF-binding peptides and nucleic acids encoding the same, and uses thereof}

본 발명은 IgE-의존적 히스타민 방출인자(IgE-dependent histamine-releasing factor, 이하 "HRF"라 함)의 수용체(receptor), HRF 결합 펩타이드 및 그들을 코딩하는 핵산, 및 그들의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 천식; 비염; 담마진; 아나필락시스; 알러지성 기관지확장증; 음식, 약물, 화분 또는 벌레로 인한 알러지; 헤이 피버(hay fever); 한냉두드러기; 또는 아토피성 피부염 등과 같은 알러지(allergy) 질환을 유발하는 HRF의 신규한 수용체, HRF 결합 펩타이드 및 그들을 코딩하는 핵산, 및 그들의 의약 분야에 있어서의 용도에 관한 것이다.

알러지는 유전적으로 알러젠(allergen)에 대해 과민하게 IgE를 생성하거나, IgE의 분비를 증가시키는 IL-4(Interleukin-4)와 IgE의 분비를 감소시키는 γ-인터페론(γ-interferon)간의 균형이 파괴된 것으로부터 기인한다고 알려져 있다. 일단 알러젠에 노출되면, 즉시 반응(immediate reaction)이 일어나고, 염증에 관련된 여러 세포들이 모이게 되며, 수 시간후에는 호염기구(basophil), 호산구(eosinophil)와 림프구(lymphocyte)로부터 분비되는 히스타민에 의해 후기 반응(late-phase reaction, 이하 "LPR"이라 함)이 일어나게 된다. LPR에서는 호염기구로부터 히스타민이 분비되는데, 이 때에는 처음에 반응을 시작하게 했던 알러젠이 없으므로, 무엇이 호염기구에서 히스타민을 분비하게 하는지와, 알러지 환자의 약 절반만이 LPR로 진전되는데, 그 원인 물질이 무엇인지가 큰 관심 대상이었다. 그 동안 MCP-3, MCP-1 또는 RANTES와 같은 사이토카인(cytokine)이 히스타민을 분비하는 것으로 알려져 있었으나, IgE-의존적 LPR에서는 "HRF"라고 불리우는 물질만이 호염기구에서 히스타민을 분비시킬 수 있음이 밝혀졌다[맥도날드(MacDonald) 등, 1995]. 그러나, HRF가 어떠한 작용기전에 의해서 호염기구로부터 히스타민의 분비를 유도하는지에 대해서는 알려진 바 없었다.

HRF는 모든 세포질에 존재하는, 172 개의 아미노산으로 구성되어 있는 공지의 단백질이다[봄(Bohm) 등, 1989]. 그 중 C-말단의 45 개 아미노산은 염기성 도메인(basic domain)을 형성하고 있으며, 이 부위는 미소관-결합 단백질(microtubule-associated protein)인 MAP-1B와 약 46%의 상동성을 나타내므로, 미소관 결합 단백질인 것으로 추정되고 있다. 고쉐(Gachet) 등(1997)은 공촛점 현미경(confocal microscope)을 이용하여 HRF의 분포와 세포골격망 분포가 어느 정도 일치함을 관찰하였는데, 이것은 HRF가 세포골격과 결합되어 있음을 시사하는 것이다. 한편, 산체스(Sanchez) 등(1997)은 HRF가 일반적인 칼슘-결합 단백질 훼밀리에 속하지 않음에도 불구하고, Ca²⁺과 결합함을 발표하였다. 또한, 사카로마이세스 세레비지에(Saccaromyces cerevisiae)에서 HRF 유전자를 결실시켜도 효모가 생존할 수 있음도 확인하였다. 이 결과는 HRF가 중복 경로(redundant pathway)를 갖고 있는 유전자 훼밀리에 속한다는 사실을 암시해주는 것이다.

이와 같이, HRF는 세포질내에 존재하는 단백질임에도 불구하고, 맥도날드 등(1995)은 HRF를 세포밖에서 발견하였다. 또한, HRF가 세포밖에 존재하면서 IgE-감작된(sensitized) 호염기구를 자극하여 히스타민을 유리하게 하는 것으로 알려졌다. 그러나, 확실한 IgE와 HRF의 상호작용은 아직 규명되지 않았다[슈뢰더(Schroeder) 등, 1996]. 슈뢰더 등(1997)은 IgE가 존재하지 않을 때에도 특이한 항원이나 항-IgE 항체에 의해 호염기구의 반응이 조절되는 것을 관찰함으로써, HRF가 IgE와 결합하여 작용하는 것이 아니라, 특이한 세포막 수용체에 결합하여 작용함을 제시하였다. 따라서, 중요한 의문은 세포질 단백질인 HRF가 어떻게 세포밖으로 나올 수 있는가와, 어떤 작용기전으로 IgE-감작된 호염기구를 자극하여 히스타민을 분비하게 하는가였다.

HRF는 친수성이고 세포질내에 존재하는 단백질이나, LPR 알러지 환자의 혈장에서 다량으로 검출되는 점으로 미루어 보아, 세포사멸(apoptosis)이나 다른 작용기전에 의해 세포외로 분비되며, 호염기구 세포막에 존재하는 HRF 수용체를 통해히스타민을 유리시키는 것으로 추정되고 있었다.

그런데, 본 발명자는 ⅰ) HRF가 친수성 단백질임에도 불구하고, 세포막을 건너갈 수 있다는 사실과, ⅱ) 효모 2-하이브리드 분석(yeast two-hybrid assay)에 의해 HRF 수용체가 (Na,K)ATPase의 제3 세포질 도메인(CD3)이라는 새롭고도 놀라운 사실을 밝혀내었다. 아울러, 세포외로 분비된 HRF가 호염기구 세포내에서 히스타민 분비를 촉진하는 정확한 작용기전도 본 발명자에 의해 최초로 규명되었다.

나아가, 이러한 연구결과들을 바탕으로, 본 발명자는 ⅰ) HRF가 세포내로 들어가는 단계를 차단하고/거나, ⅱ) HRF가 (Na, K)ATPase에 결합하는 단계를 차단하여, HRF의 히스타민 분비를 저해함으로써, 알러지 질환을 예방 또는 치료할 수 있을 것이라는 사실에 착안하였다. 그 일환으로, 도데카머 및 헵타머 파아지 디스플레이 라이브러리(12mer and 7mer phage display library)를 검색하여 HRF에 결합하는 펩타이드를 연구하던 중, 특정 서열을 갖는 펩타이드가 히스타민 분비 저해율이 탁월함을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 HRF의 신규 수용체, HRF 결합 펩타이드 및 그들의 용도를 제공하기 위한 것이다.

도 1은 HRF의 수용체가 (Na,K)ATPase의 대형 세포질 루프임을 효모 2-하이브리드 방법으로 확인한 결과를 나타내는 도면;

도 2는 HRF와 (Na,K)ATPase의 대형 세포질 루프가 상호작용함을 효모 세포에서 공면역침전법으로 확인한 결과를 나타내는 도면;

도 3은 HRF와 (Na,K)ATPase의 대형 세포질 루프가 상호작용함을 COS-7 세포에서 공면역침전법으로 확인한 결과를 나타내는 도면;

도 4는 HRF와 (Na,K)ATPase의 대형 세포질 루프의 친화도를 바이아코어법으로 측정한 결과를 나타내는 그래프;

도 5는 HRF의 수용체가 (Na,K)ATPase의 대형 세포질 루프임을 공촛점 현미경으로 확인한 결과를 나타내는 사진;

도 6a 및 6b는 수용성 단백질인 HRF가 세포내로 들어갈 수 있음을 공촛점 현미경과 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과를 나타내는 사진;

도 7은 HRF가 세포내 Na⁺의 농도를 증가시키는 것을 나타내는 그래프;

도 8은 HRF가 (Na,K)ATPase의 활성도를 감소시키는 것을 나타내는 그래프;

도 9a 내지 9c는 HRF에 의해 세포내 Ca²⁺이 증가하고, Na/Ca 교환체에 의해 세포외 Ca²⁺원을 소비하며, IgE 존재시 ROS 생성으로 인해 세포내 Ca²⁺이 더욱 증가함을 나타내는 그래프;

도 10은 IgE 존재하에 세포내 Ca²⁺의 농도가 높아지면 HRF에 의해 히스타민이 분비되는 것을 나타내는 그래프;

도 11은 HRF 결합 펩타이드를 코딩하는 유전자의 분리과정을 개략적으로 도시한 도면;

도 12는 본 발명에 따른 파아지가 코딩하는 펩타이드가 HRF에 특이적으로 결합하는 것을 나타내는 그래프;

도 13은 본 발명에 따른 파아지가 코딩하는 펩타이드와 HRF 단백질의 결합 친화도를 나타내는 그래프;

도 14a 내지 14c는 HRF 결합 파아지가 갖는 펩타이드와, 그와 아미노산 서열이 동일한 합성 펩타이드가 상호 경쟁하는 것을 나타내는 그래프;

도 15는 본 발명에 따른 펩타이드의 HRF 결합능을 비교하는 그래프;

도 16은 RBL-2H3 세포주에서 본 발명에 따른 펩타이드가 히스타민 분비를 억제하는데 필요한 양을 측정한 용량-반응 결과를 나타내는 그래프;

도 17은 RBL-2H3 세포주에서 본 발명에 따른 펩타이드의 HRF에 의한 히스타민 분비 억제를 비교하는 그래프;

도 18a 및 18b는 래트 HRF 수용체의 아미노산 서열간 서열 보존성을 나타내는 도면;

도 19a 내지 19d는 래트 HRF 수용체를 코딩하는 DNA 서열간의 서열 보존성을 나타내는 도면;

도 20a 및 20b는 인간 HRF 수용체의 아미노산 서열간 서열 보존성을 나타내는 도면;

도 21a 내지 21d는 인간 HRF 수용체를 코딩하는 DNA 서열간의 서열 보존성을 나타내는 도면; 및,

도 22는 다양한 알러지 환자의 혈액에서 HRF의 검출을 나타내는 도면.

본 발명의 제1면은 서열번호(SEQ ID Nos.) 1, 2 및 3으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 래트 HRF 수용체에 관한 것이다.

본 발명의 제2면은 서열번호 4, 5 및 6으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 인간 HRF 수용체에 관한 것이다.

본 발명의 제3면은 상기 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 HRF 수용체에 관한 것이다.

본 발명의 HRF 수용체는 (Na,K)ATPase α1, α2 또는 α3 서브유닛의 대형 세포질 루프(large cytoplasmic loop; CD(cytoplasmic domain) 3)일 수 있다.

본 발명의 제4면은 HRF 수용체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 핵산은 서열번호 7, 8 및 9로 구성된 그룹으로부터 선택된 염기 서열(래트 HRF), 또는 서열번호 10, 11 및 12로 구성된 그룹으로부터 선택된 염기 서열(인간 HRF)을 가질 수 있다.

본 발명의 제5면은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 제6면은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

본 발명의 제7면은 상기 형질전환체를 시험 화합물 및 상기 수용체와 상호작용하는 것으로 알려져 있는 화합물과 접촉시키고, 상기 시험 화합물중에서 상기 수용체와 상호작용하는 것으로 알려져 있는 화합물의 상호작용을 감소시키는 화합물을 선별하는 것을 포함하는, HRF 수용체와 상호작용하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다[경쟁 결합 분석(competition binding assay)].

본 발명의 제8면은 하기 아미노산 서열을 갖는 HRF 결합 펩타이드에 관한 것이다:

(A, L 또는 W)-X-X-X-X-(A, L, S 또는 W)-(A, P 또는 M)

여기서, X는 임의의 아미노산을 나타낸다.

본 발명에 따른 HRF 결합 펩타이드는 바람직하게는 아미노산 서열 (A, L 또는 W)-X-X-(Y, P 또는 A)-(P, G 또는 K)-(A, L, S 또는 W)-(A, P 또는 M)을 갖는 것이다

보다 바람직하게는, 아미노산 서열 (A, L 또는 W)-(V, Y, E 또는 A)-(T, V, F 또는 A)-(Y, P 또는 A)-(P, G 또는 K)-(A, L, S 또는 W)-(A, P 또는 M), 예를 들어, 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이다.

보다 더 바람직하게는, 아미노산 서열 (A 또는 W)-(Y 또는 A)-(V 또는 A)-(Y 또는 A)-(P 또는 K)-(S 또는 A)-(M 또는 A), 예를 들어, 서열번호 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이다.

가장 바람직하게는, 아미노산 서열 W-(Y 또는 A)-(V 또는 A)-(Y 또는 A)-(P 또는 K)-(S 또는 A)-M, 예를 들어, 서열번호 14, 17, 18, 19, 20 및 21로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이다.

본 발명에 따른 HRF 결합 펩타이드는 L-, D-, 또는 L- 및 D-아미노산으로 구성될 수 있으며, 하나 이상의 변형(modified) 아미노산, 예를 들어, 아미노산 유도체 또는 알킬화, 특히 메틸화된 아미노산을 가질 수 있다.

본 발명의 제9면은 상기 HRF 결합 펩타이드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명의 제10면은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 제11면은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

본 발명의 제12면은 유효성분으로서 상기 HRF 결합 펩타이드 또는 그를 코딩하는 핵산을 함유하는 알러지, 특히, 천식; 비염; 담마진; 아나필락시스; 알러지성 기관지확장증; 음식, 약물, 화분 또는 벌레로 인한 알러지; 헤이 피버; 한냉두드러기; 또는 아토피성 피부염의 진단, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제13면은 유효성분으로서 상기 HRF 결합 펩타이드 또는 그를 코딩하는 핵산을 함유하는 말라리아 진단, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자는 먼저 효모 2-하이브리드 방법을 이용하여, HRF가 (Na,K)ATPase α 서브유닛중 대형 세포질 루프(CD3)에 결합하는 것을 최초로 확인하였다. 또한, 공면역침전법(coimmunoprecipitation)으로 효모 세포 및 포유 세포에서 HRF와 (Na,K)ATPase α 서브유닛의 CD3가 상호작용한다는 사실을 확인하고, 그 결합 친화도를 측정하였다. 나아가, HRF의 수용체가 (Na,K)ATPase α 서브유닛의 CD3임을 공촛점 현미경(confocal microscope)으로 확인하였다.

또한, HRF가 수용성 단백질임에도 불구하고, 세포내로 들어갈 수 있음을 공촛점 현미경과 웨스턴 블랏팅으로 입증하고, 세포내 Na⁺및 Ca²⁺농도를 증가시키며, 이 때 Na/Ca 교환체(exchanger)에 의해 세포외 Ca²⁺원이 소모됨을 밝혔다. 또한, HRF가 IgE 존재시 ROS(reactive oxygen species)를 생성하며, 이로 인해 세포내로 더욱 많은 Ca²⁺이 유입됨을 밝혔다.

이상 언급한 결과들로부터, HRF가 호염기구에서 히스타민 분비를 촉진하는 정확한 작용기전이 규명되었다. 즉, 세포외로 분비된 HRF가 호염기구내로 들어와 (Na,K)ATPase α 서브유닛중 제3세포질 도메인(CD3)과 결합하고, 우아바인(ouabain)과 같이 (Na,K)ATPase 작용을 저해하며, 이로써 세포내 Na⁺의 농도는 증가하고 Na/Ca 교환체가 활성화됨에 따라 세포내 Ca²⁺의 농도도 증가한다. 또한, IgE 존재시 ROS 생성으로 인해 세포내 Ca²⁺이 더욱 증가하므로, 결국 히스타민 분비가 촉진되는 것이다. 이것은 HRF의 수용체가 바로 (Na,K)ATPase의 CD3이며, HRF가 (Na,K)ATPase의 세포질 리프레서(repressor)임을 의미하는 것이다.

따라서, 본 발명자에 의해 HRF 수용체의 실체가 최초로 규명된 바, 본 발명에서는 서열번호 1, 2 및 3으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HRF 수용체가 제공된다. 이 수용체는 각각 래트로부터 분리된 (Na,K)ATPase α1, α2, α3 서브유닛의 CD3에 해당하는 것이다. 그러나, 본 발명에 의해 HRF의 수용체가 (Na,K)ATPase α 서브유닛의 CD3에 해당한다는 사실이 밝혀진 이상, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 인간 HRF 수용체를 용이하게 동정할 수 있다. 따라서, 인간 HRF 수용체 또한 본 발명의 범위내에 속하는 것이며, 이는 서열번호 4(α1), 5(α2) 또는 6(α3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는다.

래트의 (Na,K)ATPase α1과 α2 CD3의 서열간 상동성은 87.6%, α2와 α3 CD 3의 서열간 상동성은 89.4%로 각각 나타났으며, 래트와 인간 (Na,K)ATPase α CD3 서열간의 상동성은 α1의 경우 97.5%, α2의 경우 99.3%, α3의 경우 98.8%로 각각나타났다(도 18 내지 21 참조). 따라서, 본 발명은 상기 서열번호에 기재된 아미노산 서열들과 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 HRF 수용체를 제공한다.

본 발명은 또한 HRF 수용체를 코딩하는 핵산, 예를들어, 서열번호 7(래트 α1), 8(래트 α2) 및 9(래트 α3)중의 어느 하나, 또는 서열번호 10(인간 α1), 11(인간 α2) 및 12(인간 α3)중의 어느 하나에 기재된 염기 서열을 갖는 핵산을 제공한다. 아울러, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터 및 그러한 벡터로 형질전환된 형질전환체도 제공한다.

본 발명은 또한 상기 세포를 경쟁 결합 분석에 사용하는 것을 포함하는, HRF 수용체와 상호작용하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 경쟁 결합 분석에서는, HRF 수용체 코딩 핵산을 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 시험 화합물 및 상기 수용체와 상호작용하는 것으로 알려져 있는 화합물과 접촉시키고, 상기 시험 화합물중에서 상기 수용체와 상호작용하는 것으로 알려져 있는 화합물의 상호작용을 감소시키는 화합물을 선별하게 된다. 이로써, 최종적으로 세포내에서 히스타민 분비를 효과적으로 조절할 수 있는 새로운 화합물을 스크리닝(screening)해낼 수 있다.

또한, 본 발명은 HRF에 특이적으로 높은 친화도로 결합하여 히스타민 분비를 저해하는 펩타이드를 제공한다. 일례로, 본 발명의 HRF 결합 펩타이드는 아미노산 서열

(A, L 또는 W)-X-X-X-X-(A, L, S 또는 W)-(A, P 또는 M)

[여기서, X는 임의의 아미노산을 나타낸다]

을 갖는 것이다.

HRF 결합 펩타이드의 아미노산 서열의 예는 하기의 것을 포함한다:

(A, L 또는 W)-X-X-(Y, P 또는 A)-(P, G 또는 K)-(A, L, S 또는 W)-(A, P 또는 M);

특히, (A, L 또는 W)-(V, Y, E 또는 A)-(T, V, F 또는 A)-(Y, P 또는 A)-(P, G 또는 K)-(A, L, S 또는 W)-(A, P 또는 M), 예를 들어, 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22;

보다 특히, (A 또는 W)-(Y 또는 A)-(V 또는 A)-(Y 또는 A)-(P 또는 K)-(S 또는 A)-(M 또는 A), 예를 들어, 서열번호 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22;

가장 특히, W-(Y 또는 A)-(V 또는 A)-(Y 또는 A)-(P 또는 K)-(S 또는 A)-M, 예를 들어, 서열번호 14, 17, 18, 19, 20 또는 21.

본 발명자는 상기 펩타이드를 파아지 디스플레이 라이브러리 스크리닝을 통해 얻고 합성 펩타이드로 다시 확인하였다. 본 발명의 펩타이드는 화학적으로 합성되거나 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드를 구성하는 도메인을 생체내에 존재하는 단백질이나 그 일부로부터 제조할 수 있다. 또 다른 방법으로, 본 발명의 펩타이드는 그를 코딩하는 염기 서열을 갖는 DNA가 삽입된 발현 벡터를 이용하는 재조합 DNA 기술로 제조될 수 있다. 상기 벡터는 생체내에 존재하도록 제조되며, 샘브룩(Sambrook) 등(Molecular Cloning, 1989, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press)의 방법에 따라 적당한 숙주세포로 형질전환되고 적당한 조건하에서 발현되도록 제조된다. 또한, 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 이용하여 본 발명의 펩타이드를 제조할 수도 있다.

한편, 본 발명에 따른 펩타이드의 아미노산 서열은 당업계에 공지된 통상의 기술에 따라 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드는 아미노산 수를 증가시키거나 감소시킴으로써 변형될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 펩타이드의 활성을 감소시키지 않는 범위내에서, 결합에 직접적으로 관여하거나 보존되어야 하는 잔기를 제외한 특정 잔기 성분이나 그 순서를 바꿈으로써 변형될 수도 있다. 변형가능한 아미노산은 자연적으로 존재하는 L-α-아미노산 뿐만 아니라, β, γ, δ 아미노산은 물론 D-α-아미노산의 유도체로도 변형가능하다.

전형적으로, 하나의 아미노산이 치환된 펩타이드를 이용하여 정전기력이나 친수성이 결합에 미치는 영향을 조사한 결과, 양전하를 띄는 아미노산(예: Lys, Arg, His)이나 음전하를 띄는 아미노산(예: Glu, Asp, Asn, Gln)이 치환되면 민감도가 변화함을 알 수 있다. 이와 같이, 치환되거나 부가되는 잔기의 수나 형태는 필수적인 결합점 사이에 필요한 공간과 친수성 또는 소수성과 같이 요구되는 기능에 의해 결정된다. 이러한 치환에 의해 본 발명에 따른 펩타이드의 목적 단백질에 대한 친화도를 더 증가시킬 수 있다.

치환으로 인해 기능에 있어서 중요한 변화가 나타나기도 한다. 변화되는 잔기의 선택은 목적 위치에 존재하는 분자의 전기도, 소수성, 측쇄의 변화 또는 나선구조의 변화 등과 같이 펩타이드의 기본 골격을 유지하는데 큰 영향을 미치기도 한다. 일반적으로, 펩타이드의 성질에 중대한 변화를 일으키는 것은 세린과 같은 친수성 잔기가 루이신, 이소루이신, 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌과 같은 소수성 잔기로 치환되거나, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘과 같이 전기적으로 양성인 잔기가 글루탐산이나 아스파르트산과 같은 전기적으로 음성인 잔기로 치환되거나, 글리신과 같이 측쇄를 갖지 않는 아미노산이 부피가 큰 측쇄를 갖는 잔기로 치환되는 경우이다.

이상 언급한 바와 같은 사실을 고려하여, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 상기 특정 펩타이드를 그의 HRF에 대한 결합력 및 그에 따른 히스타민 분비 저해 활성을 유지 내지 증가시키거나 손상시키지 않는 범위내에서 통상의 기술을 이용하여 변형시킬 수 있으며, 이는 본 발명의 범위내에 속하는 것이다.

본 발명의 펩타이드는 HRF가 관여하는 모든 알러지 질환, 예를 들어, 천식; 비염; 담마진; 아나필락시스; 알러지성 기관지확장증; 음식, 약물, 화분 또는 벌레로 인한 알러지; 헤이 피버; 한냉두드러기; 또는 아토피성 피부염의 진단, 예방 또는 치료에 유용하다. 상기와 같은 알러지 질환을 앓고 있는 환자의 혈액에서는 모두 HRF가 검출되는 바(도 22 참조), 상기 알러지 질환의 진단, 예방 또는 치료에 본 발명에 따른 펩타이드가 유효하다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

따라서, 본 발명은 유효성분으로서 상기 펩타이드를 함유하는 알러지 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 펩타이드의 유효량은 체중 1 kg당 약 0.1∼5 ㎎일 수 있다. 본 발명의 조성물은 용액 또는 미셀 형태로 직접 주입되거나 제제화하여 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 비경구 또는 국소투여에 의해 인체에 적용될 수 있는데, 정맥주사, 피하주사, 내피주사, 근육주사 등 주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해, 본 발명의 펩타이드를 약제학적으로 허용가능한 담체에 현탁시키거나 용해시키는데, 이 때 특히 수용성 담체를 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 알러지 진단 키트에도 효과적으로 사용될 수 있는 바, 본 발명에 따른 HRF 결합 펩타이드와 항-HRF 모노클로날 항체를 포함하는 진단 키트를 이용하는 시험에서, 혈액 반응시 양성으로 판정되면 알러젠이 없어도 알러지를 일으킬 수 있는 질환을 갖고 있는 것으로 판단할 수 있다. 즉, LPR 알러지 환자의 혈액에는 HRF가 부유하고 있으므로, 혈액 검사시 본 키트를 사용하면 HRF가 혈액에 존재하는지 여부를 알 수 있고 이로써 LPR 환자인지 여부를 확인할 수 있다. 본 발명에서는, 바닥에 HRF-결합 펩타이드를 부착시킨 후 혈액과 반응시키고, 여기에 컨쥬게이트된(conjugated) 항-HRF 모노클로날 항체를 가하는 방법을 사용할 수 있다.

한편, HRF는 번역에 의해 조절되는 종양 단백질(translationally controlled tumor protein)이라고도 불리우는데, 1998 년 비수티반(Bhisutthibhan) 등에 의해 항말라리아제인 아르테미시닌(Artemisinin)이 말라리아 단백질인 HRF에 결합하여 작용하는 것이 밝혀진 바 있다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드도 HRF에 결합하는 활성을 가지므로, 아르테미시닌과 마찬가지로 말라리아의 예방 및 치료에 사용될 수 있다. 이 경우, 상기한 바 있는 투여경로와 투여량이 적용될 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하지만, 이것은본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 효모 2-하이브리드 방법을 이용한 HRF의 (Na,K)ATPase 대형 세포질 루프에 대한 결합 실험

래트 골격근으로부터 총 세포질 RNA를 추출한 후 pJG4-5 벡터를 이용하여 효모 2-하이브리드 분석을 위한 cDNA 라이브러리를 제작하였다. (Na,K)ATPase의 α2 서브유닛을 이용하여 CD3 부위를 LexA DNA 결합 도메인(pEG202 벡터)에 삽입한 후 이것을 스크리닝을 위한 바이트(bait)로 사용하였다. 리포터 유전자를 활성화시킨 양성 클론을 선택하여 염기 서열분석(sequencing), 제한효소 맵핑과 BLAST 서치를 통한 서열분석을 행하였다. 이들 중 하나의 클론이 IgE-의존적 HRF의 서열과 완전 일치하였다.

(Na,K)ATPase의 α1 및 α2 서브유닛중 CD3 부위를 pEG202 벡터에 삽입한 후 이소폼(isoform)을 통한 상호작용을 조사하였다. 위에서 제조한 모든 작제물(constructs)을 LexAop-LEU2 및 LexAop-LacZ 리포터 유전자를 가진 효모 세포(EGY48/pSH18-34)에 형질전환시킨 후 선별 배지 플레이트에서 증식시켰다.

그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1로부터, HRF의 수용체가 (Na,K)ATPase의 대형 세포질 루프(CD3)임을 확인할 수 있다.

실시예 2: 공면역침전법을 이용한 효모 및 COS-7 세포에서 HRF와(Na,K)ATPase의 상호작용 실험

글루코실 Ura-His-Trp- 및 갈락토실 Ura-His-Trp- 배지에서 실시예 1의 작제물로 형질전환된 효모 세포를 증식시킨 후, 3,000×g에서 5 분동안 원심분리하여 세포를 모았다. 모은 세포들을 다시 효모 용균 완충액(yeast lysis buffer; YLB)(50 mM Tris pH 8.0, 5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 2 mM ZnCl₂, 프로테아제 저해제 칵테일)에 재현탁시킨 후, 글래스 비드에 가하고 볼텍싱하였다. 여기에 RIPA 완충액(10 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP₄O, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS)을 가한 후, 10,000×g, 4 ℃에서 30 분동안 원심분리하였다.

위에서 제조된 세포 추출물에 IgG sorb(The Enzyme Center, Inc)을 가한 후, 4 ℃에서 30 분동안 인큐베이션한 후, 10,000×g에서 5 분동안 원심분리하였다. 여기에 다시 친화성-정제된 항-HA 12CA5 모노클로날 항체를 가한 후, 4 ℃에서 3 시간동안 또는 밤새 인큐베이션하였다. 위 면역 복합체에 50%의 단백질 A 아가로스 용액(Roche, USA)을 가하고 4 ℃에서 4 시간동안 인큐베이션하였다. 5 초동안 원심분리한 후, 펠렛을 RIPA 완충액과 세척 완충액(1 M NaCl, 10 mM Tris pH 8.0, 0.1% NP₄O)으로 각각 세척하였다. 펠렛을 2×SDS 샘플 완충액에 재현탁한 후, SDS-PAGE 겔상에 로딩하였다. 상호작용하는 단백질을 조사하기 위하여 래빗 폴리클로날 LexA 항체를 사용하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었으며, 이로부터 HRF와 (Na,K)ATPase의 대형 세포질 루프가 상호작용함을 확인하였다.

이어서, 포유세포에서의 상호작용을 조사하기 위하여, COS-7 세포를 DMEM+ 배지[10% 우태아 혈청, 100 유닛/㎖ 페니실린 및 100 유닛/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 둘베코스 변형 이글즈 배지(Dulbeccos modified Eagles medium)]에서 증식시켰다. pCDNAneo 벡터(Invitrogen)에 삽입한 N-말단 HA-태그된 HRF 작제물을 형질감염시켰다. COS-7 세포 추출물의 면역침전을 플로르키에비쯔(Florkiewicz) 등 (1998)의 방법에 따라 실행하였으며, 상호작용하는 단백질을 알아보기 위하여 래빗 폴리클로날 (Na,K)ATPase 항체를 사용하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었으며, 이로부터 포유세포인 COS-7 세포에서도 HRF와 (Na,K)ATPase의 대형 세포질 루프가 상호작용함을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 바이아코어(Biacore) 분석을 이용한 (Na,K)ATPase와 HRF의 결합 친화도 측정 실험

CM5 센서 칩에 재조합 래트 HRF를 pH 4.0 10 mM 아세테이트에 10 mg/㎖의 농도로 고정시킨 후, HBS 완충액(0.01 M Hepes, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)을 흘려 보정하였다. 여기에 50 mM NHS(N-하이드록시석신이미드)와 200 mM EDC(N-에틸-N-(3-디에틸아미노프로필)카보디이미드)를 흘려 활성화시킨 후 (Na,K)ATPase를 흘려 결합 친화도를 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었으며, K_d값은 8.5×10^-7M이다.

실시예 4: 공촛점 현미경을 이용한 (Na,K)ATPase와 HRF의 상호작용 실험

COS-7 세포를 Ca²⁺과 Mg²⁺을 함유하는 3.7% 포름알데하이드로 10 분동안 고정시킨 후, 0.1% 사포닌을 함유하는 항-HRF 마우스 모노클로날 항체(1:100)(이화여자대학교 항체 센터로부터 제공받음) 및/또는 래빗 폴리클로날 (Na,K)ATPase 항체(1:100)를 1 시간동안 실온에서 가하여 염색하였다. 계속해서 항-마우스-FITC (1:100)와 항-래빗-로다민(1:100) 2 차 항체로 30 분동안 인큐베이션하였다. 항-표백제 용액을 가하고 레이저 공촛점 현미경(Leica TCSNT 시스템)으로 관찰하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

실시예 5: HRF의 세포막을 건너갈 수 있는 능력 측정 실험

pRSET-A 벡터에 PCR(polymerase chain reaction)로 클로닝한 래트 HRF 전장 서열[치트파티마(Chitpatima) 등, 1988]을 클로닝한 후,E. coli에서 과발현(overexpression)시켰다. 발현된 재조합 단백질을 His-결합 Ni 칼럼(Novagen)을 이용하여 정제하고 COS-7 세포 배양액에 가한 후, COS-7 세포를 Ca²⁺과 Mg²⁺을 함유하는 3.7% 포름알데하이드로 10 분동안 고정시켰다. 그 후, 0.1% 사포닌을 함유하는 항-His 모노클로날 항체(1:100)를 1 시간동안 실온에서 가하여 염색하였다. 계속해서 항-마우스-FITC(1:100) 2 차 항체로 30 분동안 인큐베이션하였다. 항-표백제 용액을 가하고 레이저 공촛점 현미경(Leica TCSNT 시스템)으로관찰하였다.

또한, 100 mm 배양 플레이트에서 배양된 COS-7 세포를 상기 방법으로 처리한 후, 각각 세포질과 세포막 부분으로 분리하고 10 % SDS-PAGE 겔에 로딩하여 항-His 모노클로날 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.

그 결과를 도 6a 및 6b에 나타내었으며, 이로부터 HRF를 가한지 1 분 후에 HRF가 세포내에서 검출됨을 확인할 수 있다.

실시예 6: HRF가 세포내 Na ⁺ 농도에 미치는 영향 측정 실험

RBL-2H3 세포를 3.0×10⁵∼1×10⁶세포/㎖로 24 웰에 로딩한 후 37 ℃에서 18 시간동안 배양하였다. 여기에 최종농도가 8 M이 되도록 Hams F-12 배지(페놀레드 또는 혈청 결핍 2 mM 중탄산나트륨 및 10 mM HEPES pH 7.3)와 소듐 그린 테트라아세테이트(Molecular Probes, Eugene, OR) 염료를 혼합하고 세포에 로딩하였다(Amorino and Fox, 1995). 래트 IgE(Serotec)를 0.2 g/㎖로 45∼60 분동안 감작시킨 후, 약 20∼60 분동안 실온에서 배양하고 F-12 배지로 3 회 세척하였다. 계속해서 히스타민 방출 완충액에 포함된 HRF(10∼20 g/㎖)를 가한 후, 485/530 nm에서 15 분동안 마이크로타이터 리더(FL600, Bio-tek Instruments, Inc., Winooski, VT)로 형광 강도를 측정하였다. 이때, 캘리브레이션(Calibration)으로 그라미시딘(gramicidin) D(Sigma)를 이용하여 Na⁺와K⁺을 적정 농도로 혼합한 용액을 측정하였다(Amorino and Fox, 1995). 그 결과를 도 7에 나타내었으며, 이로부터 HRF가 세포내 Na⁺의 농도를 증가시킴을 알 수 있다.

실시예 7: HRF의 (Na,K)ATPase 활성 저해 실험

RBL-2H3 세포를 실시예 6에 기재된 방법으로 배양 및 감작시킨 후, 크렙스-링거 완충액(Krebs-Ringer buffer)(KRP, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1 mM MgSO₄, 1.4 mM CaCl₂, 2.5 mM 글루코스, pH 7.4)으로 3 회 세척하였다. 계속해서 세포를 37 ℃에서 15 분동안 인큐베이션한 후, 1 mM 우아바인(ouabain)을 포함한 0.1% 소 혈청 알부민(BSA) 함유 KRP 완충액을 가하였다.⁸⁶Rb⁺(0.5 Ci/㎖, NEN)을 트래이서로 사용하여 5∼10 분동안 배양하고 10∼20 g/㎖ HRF을 가한 후 각각 5, 10, 15 분동안 K⁺-소비를 측정하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8로부터 HRF가 (Na,K)ATPase의 활성도를 10.8%, 40.4% 및 50.7%로 감소시킴을 알 수 있다.

실시예 8: HRF가 세포내 Ca ²⁺ 농도에 미치는 영향 측정 실험

RBL-2H3 세포를 실시예 6에 기재된 방법으로 배양한 후, 크렙스-링거 완충액(KRH, 125 mM NaCl, 1.2 mM KH₂PO₄, 1.2 mM MgSO₄, 6 mM 글루코스, 2 mMCaCl₂, 25 mM Hepes, pH 7.4)으로 세척하였다. 이어서 2 μM Fluo-3-AM(Molecular Probes, Eugene, OR)과 0.2% BSA를 포함한 KRH 완충액으로 30 분동안 인큐베이션시킨 후, DMEM 완전 배지로 10∼30 분동안 보정하였다. 계속해서 KRH 완충액으로 세척하고 실시예 6에 기재된 방법으로 감작시켰다. 감작 후 HRF, 항-IgE(Serotec), 각각의 저해제를 히스타민 방출 완충액(100 mM NaCl, 0.4 mM MgCl₂, 5 mM KCl, 5.6 mM 글루코스, 0.1% BSA, 25 mM Hepes, pH 7.4)과 함께 칼슘의 유/무에 따라 처리하였다. 488/515 nm에서 fluo-3AM의 형광 강도를 레이저 스캐닝 공촛점 현미경으로 측정하였다. 그 결과를 도 9a에 나타내었다.

또한, 세포내 ROS를 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트(2',7'-dichlorofluorescein diacetate; DCFH-DA)를 사용하여 레이저 스캐닝 공촛점 현미경으로 측정하였다. 즉, RBL-2H3 세포를 IgE의 존재 또는 부재하에 완전 DMEM 배지에서 1 시간 배양하였다. 이어서, 크렙스-링거 용액으로 세척한 후, 5 μM DCFH-DA를 함유한 크렙스-링거 용액중에서 5 분간 배양하였다. 그 후, 488/515 nm에서 형광을 스캐닝하며 관찰하였다. 그 결과를 도 9b 및 9c에 나타내었다.

이상으로부터, HRF에 의해 세포내 Ca²⁺가 증가하고, 이때 Na/Ca 교환체에 의해 세포외 Ca²⁺이 소비되며(도 9a), IgE 존재시에는 ROS가 생성되고, 이로 인해 세포내 Ca²⁺이 더욱 증가함(도 9b 및 9c)을 확인할 수 있다.

실시예 9: HRF에 의한 Ca ²⁺ 증가와 히스타민 분비의 관계 확인 실험

pRSET-A 벡터에 PCR로 클로닝한 래트 HRF 전장 서열[치트파티마 등, 1988]을 클로닝한 후,E. coli에서 과발현시켰다. 발현된 재조합 단백질을 His-결합 Ni 칼럼(Novagen)을 이용하여 정제하고 RBL-2H3 세포를 자극하기 위해 사용하였다. RBL-2H3을 1×10⁶세포로 24-웰에서 증식시킨 후, 래트 IgE 항체(0.2 ㎍/㎖, Serotec)로 45∼60 분간 감작시키고 재조합 HRF 단백질을 20 ㎍/㎖과 상기에서 사용한 저해제로 각각 처리하였다. 상기에서 얻은 샘플을 RIA-분석 키트(Immunotech, 프랑스)를 이용하여 아실화된 히스타민으로 제조한 후¹²⁵I-아실화된 히스타민과 모노클로날 항체에 경쟁 결합시켰다. 이 샘플을 다시 γ-계수기에서 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. 이로부터 IgE 존재하에 세포내 Ca²⁺농도가 높아지면 HRF에 의해 히스타민이 분비됨을 알 수 있다.

실시예 10: HRF에 결합하는 파아지 디스플레이 펩타이드 클론의 분리

HRF를 플라스틱 웰에 고정화(immobilization)시킨 후 헵타머 랜덤 리피트 펩타이드 라이브러리(7-mer random peptide library; New England Biolabs, USA)의 친화성 선별을 통해 HRF에 결합할 수 있는 펩타이드를 분리하였다.

약술하면, 코팅 완충액(0.1 M NaHCO₃, pH8.6)에 20 ㎍/㎖ 농도로 용해시킨 HRF를 50 ㎕씩 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트에 가하고, 4 ℃에서 밤새 코팅한 후 BSA로 비특이적 결합을 차단하였다. 0.1 % Tween/TBS(TBST)로 6 회 세척한 후 파아지-디스플레이 펩타이드 라이브러리(phage-displayed peptide library) 원액 10 ㎕를 3 % BSA/TBS 40 ㎕에 희석한 용액을 가하고 실온에서 1 시간동안 정치하였다. TBST를 사용하여 5 분간 방치한 후 세척하되, 1 회 패닝(panning)시에는 한 번, 2 회와 3 회 패닝시에는 다섯 번, 4 회 패닝시에는 열 번 실시하였다. 글리신/HCl 완충액(pH 2.2) 50 ㎕를 가하고 5 분간 방치한 후 파아지를 용출하고 1 M Tris-HCl(pH 9.1) 8 ㎕로 중화하였다.

용출한 파아지 용액을 20 ㎖의 ER2537 배양액(OD₆₀₀=0.5∼1)에 첨가하고 37 ℃ 쉐이킹 인큐베이터(shaking incubator; rpm=200)에서 2 시간 배양한 후 100 ㎖ SB 배지를 가하고 250 rpm에서 밤새 배양하였다. 배양액을 10,000 rpm(4 ℃)에서 15 분간 원심분리하여 얻은 상청액 100 ㎖에 30 ㎖의 5×PEG/NaCl(20% PEG(w/v), 15% NaCl(w/v))를 가하여 5 분동안 용해시키고 얼음에 30 분간 정치하였다. 10,000 rpm(4 ℃)에서 20 분간 원심분리한 후 상청액을 모두 제거하고 펠렛을 1 ㎖의 3% BSA/TBS에 부유시켰다. 그 후, 14,000 rpm에서 5 분간 원심분리한 상청액을 다음 패닝에 사용하였다. 친화성 정제와 파아지 복제를 4 회 반복한 후 얻은 용출 파아지의 적정 플레이트로부터 각각의 파아지 클론을 얻고 ELISA 분석을 통해 특이적인 친화도를 나타내는 파아지 클론만을 서열분석하여 펩타이드 서열을 확인하였다. 도 11에 상기 HRF 결합 펩타이드를 코딩하는 유전자의 분리과정을 개략적으로 도시하였다. 또한, HRF에 대해 우세한 결합을 나타내는 파아지 디스플레이 펩타이드를 하기 표 1에 나타내었다.

파아지	펩타이드	아미노산 서열	빈도
ph1	p1	LVTYPLP	1
ph2	p2	WYVYPSM	18
ph3	p3	SYLPYPY	1
ph4	p4	WEFPGWM	5

실시예 11: 파아지 ELISA 분석

하기와 같이, 실시예 10에서 얻은 파아지의 결합 친화도를 ELISA로 비교하였다.

즉, SB 배지에서 배양한 ER2537 배양액(OD₆₀₀=0.5∼1) 1 ㎖씩에 각각의 파아지 플라크를 옮기고 37 ℃ 인큐베이터(rpm=250)에서 5 시간 배양하였다. 각각의 배양액 100 ㎕씩을 900 ㎕의 SB 배지에 가하고 밤새 배양한 후, 14,000 rpm에서 5 분씩 2 회 원심분리한 상청액을 ELISA 분석에 사용하였다.

HRF 또는 BSA(대조)를 코팅한 플라스틱 웰에, 분리해낸 각각의 파아지 용액을 동량의 6% BSA/PBS에 희석한 용액 50 ㎕씩을 가하고 2 시간동안 정치하였다. PBST로 5 회 세척한 후 3 % BSA/PBS에 1:5000으로 희석한 HRP-컨쥬게이트된 항-M13 항체(Pharmacia) 100 ㎕씩을 가하고 1 시간동안 정치하였다. PBST로 6 회, PBS로 1 회 세척한 후 퍼옥시다아제(peroxydase) 기질 용액 100 ㎕씩을 가하여 발색 정도를 ELISA 리더를 사용하여 405 nm에서 측정하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다. 이로부터, 본 발명의 파아지 ph1, ph2 및 ph4, 특히 ph2 및 ph4가 HRF에 특이적으로 결합함을 알 수 있다.

실시예 12: 농도에 따른 HRF와 파아지 클론의 결합력 측정

HRF를 20㎍/㎖ 농도에서부터 1/5로 연속적으로 희석한 후(각각 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032 ㎍/㎖) 50㎕ 씩 플라스틱 웰에 고정화하였다. 여기에 역시 1/5 씩 연속적으로 희석한(원액의 1/2, 1/10, 1/50, 1/250, 1/1250) 파아지 ph2 용액을 가하여 ELISA 분석를 실시하고 405 nm에서 발색정도를 측정하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13으로부터, 본 발명에 따른 파아지 ph2 클론이 HRF를 0.4, 0.08, 0.016 및 0.032 ㎍/㎖까지 희석한 경우에도 HRF와의 특이적 결합력을 유지하고 있음을 확인하였다.

실시예 13: 경쟁 결합 분석

a) ELISA 분석을 통해 특이적인 친화도를 나타내는 파아지 클론(ph2 및 ph4)만을 서열분석하여 디스플레이된 펩타이드 서열을 확인한 후, 헵타머 펩타이드(p2 및 p4)를 제작하였다. 또한, 음성 대조군으로서 랜덤 펩타이드(ran, 아미노산 서열: LMEGCRA)를 합성하였다. HRF를 코팅한 웰에 1000 nM에서부터 연속적으로 6% BSA/PBS에 희석한(1000, 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 nM) 펩타이드 용액 30 ㎕씩을 가하고 실온에서 30 분간 정치한 후, 여기에 파아지 원액을 1/25로 희석한 것을 가하여 2 시간 더 정치하였다. PBST로 5 회 세척한 후 HRP-컨쥬게이트된 항-M13 항체를 100 ㎕씩 가하고 1 시간 정치하였다. PBST로 6 회, PBS로 1 회 세척한 후, 퍼옥시다아제 기질 용액 100 ㎕씩을 가하여 발색 정도를 통해 경쟁 여부를 확인하였다. 그 결과를 도 14a 및 14b에 나타내었다. 이로부터, 합성 펩타이드 p2 및 p4가 모두 파아지 클론 ph2 및 ph4와 경쟁적으로 HRF에 결합함을 알 수 있다.

b) p1, p2 및 p4가 HRF의 동일한 부위에 결합하는지 여부를 시험하기 위하여, 상기 a)와 실질적으로 동일한 방법에 따라 HRF를 코팅하고 ph2에 대한 p1, p2 및 p4의 경쟁결합 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 14c에 나타내었다. 이로부터, p1, p2 및 p4가 모두 HRF의 동일 부위에 결합함을 알 수 있다.

실시예 14: HRF 결합 펩타이드의 아미노산 서열 변이

본 발명에 따른 헵타머 펩타이드의 HRF 결합 친화도에 관여하는 잔기를 확인하기 위하여, p2의 아미노산 서열을 하나씩 알라닌(A)으로 치환하고, 단 m5의 경우에만 라이신(K)으로 치환하였다(표 2 참조).

헵타펩타이드	아미노산 서열
p2	WYVYPSM
m1	AYVYPSM
m2	WAVYPSM
m3	WYAYPSM
m4	WYVAPSM
m5	WYVYKSM
m6	WYVYPAM
m7	WYVYPSA

상기 펩타이드의 HRF 결합능을 실시예 11과 실질적으로 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다. 이로부터, HRF 결합능이 p2, m6>m7>m3>m2>m5>m1>m4임을 알 수 있다.

실시예 15: 히스타민 분비 측정

pRSET-A 벡터에 PCR로 클로닝된 래트 HRF 전장 서열(Chitpatima 등, 1988)을 클로닝한 후,E. coli에서 과발현시켰다. 발현된 재조합 단백질을 His-결합 Ni 칼럼(Novagen)을 이용하여 정제하고 RBL-2H3 세포를 자극하기 위해 사용하였다. RBL-2H3을 1×10⁶세포로 24-웰에서 증식시킨 후, 래트 IgE 항체(0.2 ㎍/㎖, Serotec)로 45∼60 분간 감작시키고 재조합 HRF 단백질을 20 ㎍/㎖로 처리하였다(양성 대조군). 상기에서 준비한 세포에 헵타머 펩타이드 p1 및 p2를 용량-의존적 방법으로 처리하였다. 또한, 재조합 HRF 단백질과 펩타이드 p1, p2, p4 및 m1 내지 m7을 20 ㎍/㎖로 HRF와 동일한 농도로 처리하였다.

상기에서 얻은 샘플을 RIA-분석 키트(Immunotech, 프랑스)를 이용하여 아실화된 히스타민으로 제조한 후¹²⁵I-아실화된 히스타민과 모노클로날 항체에 경쟁 결합시켰다. 이 샘플을 다시 γ-계수기에서 측정하였다. 그 결과를 도 16 및 17에 나타내었다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 서열번호 14의 펩타이드(p2)를 RBL-2H3 세포에 가한 경우, 0.01 ㎍/㎖에서부터 HRF에 의한 히스타민 분비를 저해하였다. 또한, 도 17에 나타낸 바와 같이, p1, p2, p4 및 m1 내지 m7을 20 ㎍/㎖를 가하였을 때, m2>m5>m4>p2>m3>p1=p4>m1>m7>의 순서로 HRF에 의한 히스타민 분비를 저해하며, m6의 경우 히스타민 분비를 오히려 증가시킴을 관찰하였다.

본 발명에 의해 HRF 수용체의 실체와 HRF가 호염기구내에서 히스타민 분비를촉진하는 기전이 최초로 규명되었다. 따라서, 본 발명에 따른 HRF의 수용체, HRF의 작용기전과 양호한 약물동태학과 안정성을 나타내는 HRF 결합 펩타이드를 이용하여 세포내에서 히스타민 분비를 효과적으로 저해함으로써, 동물은 물론 인간의 천식; 비염; 담마진; 아나필락시스; 알러지성 기관지확장증; 음식, 약물, 화분 또는 벌레로 인한 알러지; 헤이 피버; 한냉두드러기; 또는 아토피성 피부염 등과 같은 알러지 질환을 예방·치료 및 진단할 수 있을 뿐 아니라, HRF 수용체나 HRF 결합 펩타이드를 선도물질로 하여 여러 비펩타이드(non-peptide) 유도물질을 제조할 수 있다. 아울러, HRF 수용체나 HRF 결합 펩타이드를 말라리아의 진단, 예방 및 치료에도 사용할 수 있다.

<110> LEE, kyunglim <120> IgE-dependent histamine-releasing factor(HRF) receptor, HRF- binding peptides, nucleic acids encoding the same, and uses thereof <130> PC01-0144-LKR <150> KR10-2000-0030130 <151> 2000-06-01 <160> 22 <170> KOPATIN 1.71 <210> 1 <211> 446 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 1 Val Ala Asn Val Pro Glu Val Leu Leu Ala Thr Val Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ala Lys Arg Met Ala Arg Lys Asn Cys Leu Val Lys Asn 20 25 30 Leu Glu Ala Val Glu Thr Leu Gly Ser Thr Ser Thr Ile Cys Ser Asp 35 40 45 Lys Thr Gly Thr Leu Thr Gln Asn Arg Met Thr Val Ala His Met Trp 50 55 60 Phe Asp Asn Gln Ile His Glu Ala Asp Thr Thr Glu Asn Gln Ser Gly 65 70 75 80 Val Ser Phe Asp Lys Thr Ser Ala Thr Trp Phe Ala Leu Ser Arg Ile 85 90 95 Ala Gly Leu Cys Asn Arg Ala Val Phe Gln Ala Asn Gln Glu Asn Leu 100 105 110 Pro Ile Leu Lys Arg Ala Val Ala Gly Asp Ala Ser Glu Ser Ala Leu 115 120 125 Leu Lys Cys Ile Glu Val Cys Cys Gly Ser Val Met Glu Met Arg Glu 130 135 140 Lys Tyr Thr Lys Ile Val Glu Ile Pro Phe Asn Ser Thr Asn Lys Tyr 145 150 155 160 Gln Leu Ser Ile His Lys Asn Pro Asn Ala Ser Glu Pro Lys His Leu 165 170 175 Leu Val Met Lys Gly Ala Pro Glu Arg Ile Leu Asp Arg Cys Ser Ser 180 185 190 Ile Leu Leu His Gly Lys Glu Gln Pro Leu Asp Glu Glu Leu Lys Asp 195 200 205 Ala Phe Gln Asn Ala Tyr Leu Glu Leu Gly Gly Leu Gly Glu Arg Val 210 215 220 Leu Gly Phe Cys His Leu Leu Leu Pro Asp Glu Gln Phe Pro Glu Gly 225 230 235 240 Phe Gln Phe Asp Thr Asp Glu Val Asn Phe Pro Val Asp Asn Leu Cys 245 250 255 Phe Val Gly Leu Ile Ser Met Ile Asp Pro Pro Arg Ala Ala Val Pro 260 265 270 Asp Ala Val Gly Lys Cys Arg Ser Ala Gly Ile Lys Val Ile Met Val 275 280 285 Thr Gly Asp His Pro Ile Thr Ala Lys Ala Ile Ala Lys Gly Val Gly 290 295 300 Ile Ile Ser Glu Gly Asn Glu Thr Val Glu Asp Ile Ala Ala Arg Leu 305 310 315 320 Asn Ile Pro Val Asn Gln Val Asn Pro Arg Asp Ala Lys Ala Cys Val 325 330 335 Val His Gly Ser Asp Leu Lys Asp Met Thr Ser Glu Glu Leu Asp Asp 340 345 350 Ile Leu Arg Tyr His Thr Glu Ile Val Phe Ala Arg Thr Ser Pro Gln 355 360 365 Gln Lys Leu Ile Ile Val Glu Gly Cys Gln Arg Gln Gly Ala Ile Val 370 375 380 Ala Val Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Lys Lys Ala 385 390 395 400 Asp Ile Gly Val Ala Met Gly Ile Val Gly Ser Asp Val Ser Lys Gln 405 410 415 Ala Ala Asp Met Ile Leu Leu Asp Asp Asn Phe Ala Ser Ile Val Thr 420 425 430 Gly Val Glu Glu Gly Arg Leu Ile Phe Asp Asn Leu Lys Lys 435 440 445 <210> 2 <211> 446 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 2 Val Ala Asn Val Pro Glu Gly Leu Leu Ala Thr Val Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ala Lys Arg Met Ala Arg Lys Asn Cys Leu Val Lys Asn 20 25 30 Leu Glu Ala Val Glu Thr Leu Gly Ser Thr Ser Thr Ile Cys Ser Asp 35 40 45 Lys Thr Gly Thr Leu Thr Gln Asn Arg Met Thr Val Ala His Met Trp 50 55 60 Phe Asp Asn Gln Ile His Glu Ala Asp Thr Thr Glu Asp Gln Ser Gly 65 70 75 80 Ala Thr Phe Asp Lys Arg Ser Pro Thr Trp Thr Ala Leu Ser Arg Ile 85 90 95 Ala Gly Leu Cys Asn Arg Ala Val Phe Lys Ala Gly Gln Glu Asn Ile 100 105 110 Ser Val Ser Lys Arg Asp Thr Ala Gly Asp Ala Ser Glu Ser Ala Leu 115 120 125 Leu Lys Cys Ile Glu Leu Ser Cys Gly Ser Val Arg Lys Met Arg Asp 130 135 140 Arg Asn Pro Lys Val Ala Glu Ile Pro Phe Asn Ser Thr Asn Lys Tyr 145 150 155 160 Gln Leu Ser Ile His Glu Arg Glu Asp Xaa Ser Pro Gln Ser His Val 165 170 175 Leu Val Met Lys Gly Ala Pro Glu Arg Ile Leu Asp Arg Cys Ser Thr 180 185 190 Ile Leu Val Gln Gly Lys Glu Ile Pro Leu Asp Lys Glu Met Gln Asp 195 200 205 Ala Phe Gln Asn Ala Tyr Met Glu Leu Gly Gly Leu Gly Glu Arg Val 210 215 220 Leu Gly Phe Cys Gln Leu Asn Leu Pro Ser Gly Lys Phe Pro Arg Gly 225 230 235 240 Phe Lys Phe Asp Thr Asp Glu Leu Asn Phe Pro Thr Glu Lys Leu Cys 245 250 255 Phe Val Gly Leu Met Ser Met Ile Asp Pro Pro Arg Ala Ala Val Pro 260 265 270 Asp Ala Val Gly Lys Cys Arg Ser Ala Gly Ile Lys Val Ile Met Val 275 280 285 Thr Gly Asp His Pro Ile Thr Ala Lys Ala Ile Ala Lys Gly Val Gly 290 295 300 Ile Ile Ser Glu Gly Asn Glu Thr Val Glu Asp Ile Ala Ala Arg Leu 305 310 315 320 Asn Ile Pro Val Ser Gln Val Asn Pro Arg Glu Ala Lys Ala Cys Val 325 330 335 Val His Gly Ser Asp Leu Lys Asp Met Thr Ser Glu Gln Leu Asp Glu 340 345 350 Ile Leu Arg Asp His Thr Glu Ile Val Phe Ala Arg Thr Ser Pro Gln 355 360 365 Gln Lys Leu Ile Ile Val Glu Gly Cys Gln Arg Gln Gly Ala Ile Val 370 375 380 Ala Val Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Lys Lys Ala 385 390 395 400 Asp Ile Gly Ile Ala Met Gly Ile Ser Gly Ser Asp Val Ser Lys Gln 405 410 415 Ala Ala Asp Met Ile Leu Leu Asp Asp Asn Phe Ala Ser Ile Val Thr 420 425 430 Gly Val Glu Glu Gly Arg Leu Ile Phe Asp Asn Leu Lys Lys 435 440 445 <210> 3 <211> 446 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 3 Val Ala Asn Val Pro Glu Gly Leu Leu Ala Thr Val Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ala Lys Arg Met Ala Arg Lys Asn Cys Leu Val Lys Asn 20 25 30 Leu Glu Ala Val Glu Thr Leu Gly Ser Thr Ser Thr Ile Cys Ser Asp 35 40 45 Lys Thr Gly Thr Leu Thr Gln Asn Arg Met Thr Val Ala His Met Trp 50 55 60 Phe Asp Asn Gln Ile His Glu Ala Asp Thr Thr Glu Asp Gln Ser Gly 65 70 75 80 Thr Ser Phe Asp Lys Ser Ser His Thr Trp Val Ala Leu Ser His Ile 85 90 95 Ala Gly Leu Cys Asn Arg Ala Val Phe Lys Gly Gly Gln Asp Asn Ile 100 105 110 Pro Val Leu Lys Arg Asp Val Ala Gly Asp Ala Ser Glu Ser Ala Leu 115 120 125 Leu Lys Cys Ile Glu Leu Ser Ser Gly Ser Val Lys Leu Met Arg Glu 130 135 140 Arg Asn Lys Lys Val Ala Glu Ile Pro Phe Asn Ser Thr Asn Lys Tyr 145 150 155 160 Gln Leu Ser Ile His Glu Thr Glu Asp Pro Asn Asp Asn Arg Tyr Leu 165 170 175 Leu Val Met Lys Gly Ala Pro Glu Arg Ile Leu Asp Arg Cys Ala Thr 180 185 190 Ile Leu Leu Gln Gly Lys Glu Gln Pro Leu Asp Glu Glu Met Lys Glu 195 200 205 Ala Phe Gln Asn Ala Tyr Leu Glu Leu Gly Gly Leu Gly Glu Arg Val 210 215 220 Leu Gly Phe Cys His Tyr Tyr Leu Pro Glu Glu Gln Phe Pro Lys Gly 225 230 235 240 Phe Ala Phe Asp Cys Asp Asp Val Asn Phe Thr Thr Asp Asn Leu Cys 245 250 255 Phe Val Gly Leu Met Ser Met Ile Asp Pro Pro Arg Ala Ala Val Pro 260 265 270 Asp Ala Val Gly Lys Cys Arg Ser Ala Gly Ile Lys Val Ile Met Val 275 280 285 Thr Gly Asp His Pro Ile Thr Ala Lys Ala Ile Ala Lys Gly Val Gly 290 295 300 Ile Ile Ser Glu Gly Asn Glu Thr Val Glu Asp Ile Ala Ala Arg Leu 305 310 315 320 Asn Ile Pro Val Ser Gln Val Asn Pro Arg Asp Ala Lys Ala Cys Val 325 330 335 Ile His Gly Thr Asp Leu Lys Asp Phe Thr Ser Glu Gln Ile Asp Glu 340 345 350 Ile Leu Gln Asn His Thr Glu Ile Val Phe Ala Arg Thr Ser Pro Gln 355 360 365 Gln Lys Leu Ile Ile Val Glu Gly Cys Gln Arg Gln Gly Ala Ile Val 370 375 380 Ala Val Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Lys Lys Ala 385 390 395 400 Asp Ile Gly Val Ala Met Gly Ile Ala Gly Ser Asp Val Ser Lys Gln 405 410 415 Ala Ala Asp Met Ile Leu Leu Asp Asp Asn Phe Ala Ser Ile Val Thr 420 425 430 Gly Val Glu Glu Gly Arg Leu Ile Phe Asp Asn Leu Lys Lys 435 440 445 <210> 4 <211> 446 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Val Ala Asn Val Pro Glu Gly Leu Leu Ala Thr Val Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ala Lys Arg Met Ala Arg Lys Asn Cys Leu Val Lys Asn 20 25 30 Leu Glu Ala Val Glu Thr Leu Gly Ser Thr Ser Thr Ile Cys Ser Asp 35 40 45 Lys Thr Gly Thr Leu Thr Gln Asn Arg Met Thr Val Ala His Met Trp 50 55 60 Phe Asp Asn Gln Ile His Glu Ala Asp Thr Thr Glu Asn Gln Ser Gly 65 70 75 80 Val Ser Phe Asp Lys Thr Ser Ala Thr Trp Leu Ala Leu Ser Arg Ile 85 90 95 Ala Gly Leu Cys Asn Arg Ala Val Phe Gln Ala Asn Gln Glu Asn Leu 100 105 110 Pro Ile Leu Lys Arg Ala Val Ala Gly Asp Ala Ser Glu Ser Ala Leu 115 120 125 Leu Lys Cys Ile Glu Leu Cys Cys Gly Ser Val Lys Glu Met Arg Glu 130 135 140 Arg Tyr Ala Lys Ile Val Glu Ile Pro Phe Asn Ser Thr Asn Lys Tyr 145 150 155 160 Gln Leu Ser Ile His Lys Asn Pro Asn Thr Ser Glu Pro Gln His Leu 165 170 175 Leu Val Met Lys Gly Ala Pro Glu Arg Ile Leu Asp Arg Cys Ser Ser 180 185 190 Ile Leu Leu His Gly Lys Glu Gln Pro Leu Asp Glu Glu Leu Lys Asp 195 200 205 Ala Phe Gln Asn Ala Tyr Leu Glu Leu Gly Gly Leu Gly Glu Arg Val 210 215 220 Leu Gly Phe Cys His Leu Phe Leu Pro Asp Glu Gln Phe Pro Glu Gly 225 230 235 240 Phe Gln Phe Asp Thr Asp Asp Val Asn Phe Pro Ile Asp Asn Leu Cys 245 250 255 Phe Val Gly Leu Ile Ser Met Ile Asp Pro Pro Arg Ala Ala Val Pro 260 265 270 Asp Ala Val Gly Lys Cys Arg Ser Ala Gly Ile Lys Val Ile Met Val 275 280 285 Thr Gly Asp His Pro Ile Thr Ala Lys Ala Ile Ala Lys Gly Val Gly 290 295 300 Ile Ile Ser Glu Gly Asn Glu Thr Val Glu Asp Ile Ala Ala Arg Leu 305 310 315 320 Asn Ile Pro Val Ser Gln Val Asn Pro Arg Asp Ala Lys Ala Cys Val 325 330 335 Val His Gly Ser Asp Leu Lys Asp Met Thr Ser Glu Gln Leu Asp Asp 340 345 350 Ile Leu Lys Tyr His Thr Glu Ile Val Phe Ala Arg Thr Ser Pro Gln 355 360 365 Gln Lys Leu Ile Ile Val Glu Gly Cys Gln Arg Gln Gly Ala Ile Val 370 375 380 Ala Val Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Lys Lys Ala 385 390 395 400 Asp Ile Gly Val Ala Met Gly Ile Ala Gly Ser Asp Val Ser Lys Gln 405 410 415 Ala Ala Asp Met Ile Leu Leu Asp Asp Asn Phe Ala Ser Ile Val Thr 420 425 430 Gly Val Glu Glu Gly Arg Leu Ile Phe Asp Asn Leu Lys Lys 435 440 445 <210> 5 <211> 446 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Val Ala Asn Val Pro Glu Gly Leu Leu Ala Thr Val Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ala Lys Arg Met Ala Arg Lys Asn Cys Leu Val Lys Asn 20 25 30 Leu Glu Ala Val Glu Thr Leu Gly Ser Thr Ser Thr Ile Cys Ser Asp 35 40 45 Lys Thr Gly Thr Leu Thr Gln Asn Arg Met Thr Val Ala His Met Trp 50 55 60 Phe Asp Asn Gln Ile His Glu Ala Asp Thr Thr Glu Asp Gln Ser Gly 65 70 75 80 Ala Thr Phe Asp Lys Arg Ser Pro Thr Trp Thr Ala Leu Ser Arg Ile 85 90 95 Ala Gly Leu Cys Asn Arg Ala Val Phe Lys Ala Gly Gln Glu Asn Ile 100 105 110 Ser Val Ser Lys Arg Asp Thr Ala Gly Asp Ala Ser Glu Ser Ala Leu 115 120 125 Leu Lys Cys Ile Glu Leu Ser Cys Gly Ser Val Arg Lys Met Arg Asp 130 135 140 Arg Asn Pro Lys Val Ala Glu Ile Pro Phe Asn Ser Thr Asn Lys Tyr 145 150 155 160 Gln Leu Ser Ile His Glu Arg Glu Asp Xaa Ser Pro Gln Ser His Val 165 170 175 Leu Val Met Lys Gly Ala Pro Glu Arg Ile Leu Asp Arg Cys Ser Thr 180 185 190 Ile Leu Val Gln Gly Lys Glu Ile Pro Leu Asp Lys Glu Met Gln Asp 195 200 205 Ala Phe Gln Asn Ala Tyr Met Glu Leu Gly Gly Leu Gly Glu Arg Val 210 215 220 Leu Gly Phe Cys Gln Leu Asn Leu Pro Ser Gly Lys Phe Pro Arg Gly 225 230 235 240 Phe Lys Phe Asp Thr Asp Glu Leu Asn Phe Pro Thr Glu Lys Leu Cys 245 250 255 Phe Val Gly Leu Met Ser Met Ile Asp Pro Pro Arg Ala Ala Val Pro 260 265 270 Asp Ala Val Gly Lys Cys Arg Ser Ala Gly Ile Lys Val Ile Met Val 275 280 285 Thr Gly Asp His Pro Ile Thr Ala Lys Ala Ile Ala Lys Gly Val Gly 290 295 300 Ile Ile Ser Glu Gly Asn Glu Thr Val Glu Asp Ile Ala Ala Arg Leu 305 310 315 320 Asn Ile Pro Met Ser Gln Val Asn Pro Arg Glu Ala Lys Ala Cys Val 325 330 335 Val His Gly Ser Asp Leu Lys Asp Met Thr Ser Glu Gln Leu Asp Glu 340 345 350 Ile Leu Lys Asn His Thr Glu Ile Val Phe Ala Arg Thr Ser Pro Gln 355 360 365 Gln Lys Leu Ile Ile Val Glu Gly Cys Gln Arg Gln Gly Ala Ile Val 370 375 380 Ala Val Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Lys Lys Ala 385 390 395 400 Asp Ile Gly Ile Ala Met Gly Ile Ser Gly Ser Asp Val Ser Lys Gln 405 410 415 Ala Ala Asp Met Ile Leu Leu Asp Asp Asn Phe Ala Ser Ile Val Thr 420 425 430 Gly Val Glu Glu Gly Arg Leu Ile Phe Asp Asn Leu Lys Lys 435 440 445 <210> 6 <211> 446 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Val Ala Asn Val Pro Glu Gly Leu Leu Ala Thr Val Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Thr Val Thr Ala Lys Arg Met Ala Arg Lys Asn Cys Leu Val Lys Asn 20 25 30 Leu Glu Ala Val Glu Thr Leu Gly Ser Thr Ser Thr Ile Cys Ser Asp 35 40 45 Lys Thr Gly Thr Leu Thr Gln Asn Arg Met Thr Val Ala His Met Trp 50 55 60 Phe Asp Asn Gln Ile His Glu Ala Asp Thr Thr Glu Asp Gln Ser Gly 65 70 75 80 Thr Ser Phe Asp Lys Ser Ser His Thr Trp Val Ala Leu Ser His Ile 85 90 95 Ala Gly Leu Cys Asn Arg Ala Val Phe Lys Gly Gly Gln Asp Asn Ile 100 105 110 Pro Val Leu Lys Arg Asp Val Ala Gly Asp Ala Ser Glu Ser Ala Leu 115 120 125 Leu Lys Cys Ile Glu Leu Ser Ser Gly Ser Val Lys Leu Met Arg Glu 130 135 140 Arg Asn Lys Lys Val Ala Glu Ile Pro Phe Asn Ser Thr Asn Lys Tyr 145 150 155 160 Gln Leu Ser Ile His Glu Thr Glu Asp Pro Asn Asp Asn Arg Tyr Leu 165 170 175 Leu Val Met Lys Gly Ala Pro Glu Arg Ile Leu Asp Arg Cys Ser Thr 180 185 190 Ile Leu Leu Gln Gly Lys Glu Gln Pro Leu Asp Glu Glu Met Lys Glu 195 200 205 Ala Phe Gln Asn Ala Tyr Leu Glu Leu Gly Gly Leu Gly Glu Arg Val 210 215 220 Leu Gly Phe Cys His Tyr Tyr Leu Pro Glu Glu Gln Tyr Pro Gln Gly 225 230 235 240 Phe Ala Phe Asp Cys Asp Asp Val Asn Phe Thr Thr Asp Asn Leu Cys 245 250 255 Phe Val Pro Leu Met Ser Met Ile Gly Pro Pro Arg Ala Ala Val Pro 260 265 270 Asp Ala Val Gly Lys Cys Arg Ser Ala Gly Ile Lys Val Ile Met Val 275 280 285 Thr Gly Asp His Pro Ile Thr Ala Lys Ala Ile Ala Lys Gly Val Gly 290 295 300 Ile Ile Ser Glu Gly Asn Glu Thr Val Glu Asp Ile Ala Ala Arg Leu 305 310 315 320 Asn Ile Pro Val Ser Gln Val Asn Pro Arg Asp Ala Lys Ala Cys Val 325 330 335 Ile His Gly Thr Asp Leu Lys Asp Phe Thr Ser Glu Gln Ile Asp Glu 340 345 350 Ile Leu Gln Asn His Thr Glu Ile Val Phe Ala Arg Thr Ser Pro Gln 355 360 365 Gln Lys Leu Ile Ile Val Glu Gly Cys Gln Arg Gln Gly Ala Ile Val 370 375 380 Ala Val Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Lys Lys Ala 385 390 395 400 Asp Ile Gly Val Ala Met Gly Ile Ala Gly Ser Asp Val Ser Lys Gln 405 410 415 Ala Ala Asp Met Ile Leu Leu Asp Asp Asn Phe Ala Ser Ile Val Thr 420 425 430 Gly Val Glu Glu Gly Arg Leu Ile Phe Asp Asn Leu Lys Lys 435 440 445 <210> 7 <211> 1338 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 7 gtagccaacg tgccggaagt tttgctggcc accgtcacgg tatgtctgac gctcactgcc 60 aagcgcatgg ccaggaagaa ctgcctggtg aagaacctgg aagctgtgga gaccttgggg 120 tccacatcca ccatctgctc cgacaagact ggaactctga ctcagaaccg gatgacagtg 180 gctcacatgt ggtttgacaa tcaaatccat gaagctgaca ccacagagaa tcagagtggg 240 gtctcctttg acaagacgtc agccacctgg ttcgctctgt ccagaattgc tggtctctgt 300 aacagggcag tgtttcaggc taaccaggaa aacctgccta tcctgaagcg tgcagtagcg 360 ggagatgctt ccgagtcggc gctcctaaag tgcatcgagg tctgctgtgg ctccgtgatg 420 gagatgaggg agaagtacac caagatagtg gagattcctt tcaactccac caacaagtac 480 cagctctcca ttcacaagaa cccaaacgca tcggagccta agcacctgct agtgatgaag 540 ggcgccccag aaaggatcct ggaccgatgc agttctatcc tcctccacgg caaggagcag 600 cccctggacg aagagctgaa ggacgccttt cagaatgcct acctggagct gggtggcctg 660 ggagaacgtg tgctaggttt ctgccacctc cttctgcctg acgaacagtt tcctgaaggc 720 ttccagtttg acactgatga agtcaatttc cccgtggata acctctgctt cgtgggtctt 780 atctccatga ttgaccctcc tcgagctgct gtccccgatg ctgtgggcaa atgccgcagc 840 gctgggatta aggtcatcat ggtcacagga gaccatccaa tcacagccaa agccattgct 900 aagggggtgg gcattatctc agaaggtaac gagaccgtgg aagacattgc tgcccgcctc 960 aacattccag tgaaccaggt gaaccccaga gatgccaagg cctgtgtagt acatggcagt 1020 gacttgaagg acatgacctc tgaggagctg gatgacattt tgcggtacca cacggagatt 1080 gtctttgcta ggacctctcc tcaacagaag ctcatcattg tggagggctg ccagcggcag 1140 ggtgccatcg tggctgtcac aggggatggt gtcaatgact ctccagcttt gaaaaaggca 1200 gatattgggg ttgccatggg gattgttggc tcggatgtgt ccaagcaagc tgctgacatg 1260 attcttctgg atgacaactt tgcctccatc gtgactggag tagaagaagg tcgtctgata 1320 tttgataact tgaagaaa 1338 <210> 8 <211> 1338 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 8 gtagccaacg tccccgaagg gctcttggcc actgttactg tgtgcctgac gctgacagcc 60 aagcgcatgg ctcgcaagaa ctgcctggtg aagaacctgg aggcggtgga gacgctgggc 120 tccacgtcca ccatctgctc ggacaagaca ggcaccctca cccagaaccg catgacggtg 180 gctcacatgt ggtttgacaa ccagatccat gaggctgaca ccactgaaga tcagtctggg 240 gccacttttg acaagcggtc cccgacgtgg acagccctgt ctcggatcgc tggtctctgc 300 aatcgtgccg tcttcaaggc tgggcaggag aacatctccg tgtctaagcg ggacacagct 360 ggtgacgcct ctgagtcagc tctgctcaag tgcatcgagt tgtcctgtgg ctcagtgagg 420 aagatgaggg acaggaatcc caaggtggca gaaattccct tcaactctac caacaaatat 480 cagctttcca tccatgagag ggaagacagc ccccagagcc atgtgctgnn ngtgatgaaa 540 ggtgccccgg agcgcatcct ggaccgatgc tctaccatcc tggtacaggg caaggagatc 600 cctcttgaca aggagatgca agatgccttt caaaacgcct acatggagct gggaggactc 660 ggggagcgag tgctgggctt ctgtcagctg aacctgcctt ctggaaagtt tcctcggggc 720 ttcaaatttg acacggatga gctgaacttt cccacagaga agctctgctt tgtggggctc 780 atgtctatga ttgatccccc cagagcagct gtgccagatg ctgtgggcaa gtgcagaagt 840 gcaggcatca aggtgatcat ggtgactggg gatcacccta tcacagccaa ggccattgcc 900 aaaggtgtgg gcatcatatc agagggtaac gagactgtgg aagacattgc agccaggctc 960 aacattcctg tgagtcaagt caatcccaga gaagccaagg catgtgtagt gcacggctca 1020 gacctgaagg acatgacttc agagcagctg gatgagatcc tcagggacca cacggagatc 1080 gtgtttgccc ggacctcccc tcagcagaag ctcatcattg tggagggctg tcagaggcag 1140 ggagccatcg tggcagtgac tggtgacggg gtgaacgact cccccgcgct gaagaaggct 1200 gacattggca ttgccatggg catctctggc tctgatgtct ctaagcaggc agctgacatg 1260 atccttctcg acgacaactt tgcctccatt gtgacgggcg tggaggaggg gcgcctgatc 1320 tttgacaacc tgaagaag 1338 <210> 9 <211> 1338 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 9 gtggccaatg tcccagaggg gctgctggct actgtcacgg tgtgtctgac gctgaccgcc 60 aagcgcatgg ctcggaagaa ctgtctggta aagaacctgg aggcggtgga gacgctaggc 120 tccacatcca ccatctgctc cgacaagacc ggcaccctca cccagaaccg catgaccgtc 180 gcccacatgt ggtttgacaa ccagatccac gaggccgaca ctactgagga tcagtcaggg 240 acctctttcg acaagagctc acacacctgg gtggccctgt cccacatcgc cggtctctgc 300 aaccgggctg tcttcaaggg cgggcaggat aacatccctg tactcaagag ggacgtggcg 360 ggtgatgcct cagagtccgc cctgcttaag tgcatcgagc tgtcctcggg ttccgtaaag 420 ctgatgcgcg aacgaaacaa gaaagtggcc gagattccct tcaactccac taacaaatac 480 cagctatcca tccatgagac tgaggacccc aatgacaacc gatacctgtt agtgatgaag 540 ggcgcccctg aacgcattct ggaccgctgt gcgaccatcc tcctgcaggg caaggagcag 600 cctctggatg aggagatgaa ggaggccttc cagaacgcct acctggagct tggtggcctg 660 ggcgagcgtg tgctgggttt ctgccattac tacctgccgg aggaacagtt ccccaagggc 720 tttgcctttg actgtgatga cgtgaacttc accacagaca acctttgctt cgtgggtctc 780 atgtccatga tcgaccctcc ccgggcagct gtccctgatg ctgtgggcaa atgccgcagt 840 gcaggcatca aggtcatcat ggtcaccggc gatcacccca tcactgcgaa ggccatcgcc 900 aaaggtgtag gcatcatctc cgagggtaac gagactgtgg aggacatcgc tgcccggctc 960 aacatccctg tcagccaggt caaccccagg gatgccaaag cctgtgtgat tcatggcacc 1020 gacctcaagg acttcacctc tgagcagatt gacgagatcc tacagaacca cactgagatc 1080 gtctttgccc gaacctcccc tcagcagaag ctcatcatcg tggagggctg tcagagacag 1140 ggagcaattg tggctgtgac tggcgatggt gtgaatgact cccctgctct gaagaaggct 1200 gatattgggg tggccatggg cattgctggc tctgatgtct ctaagcaggc tgccgacatg 1260 attctgctgg atgacaattt tgcttccatt gtcactggtg tggaggaagg ccgcctgatc 1320 tttgacaacc tgaagaaa 1338 <210> 10 <211> 1355 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gtagccaatg tgccggaagg tttgctggcc actgtcacgg tctgtctgac acttactgcc 60 aaacgcatgg caaggaaaaa ctgcttagtg aagaacttag aagctgtgga gaccttgggg 120 tccacgtcca ccatctgctc tgataaaact ggaactctga ctcagaaccg gatgacagtg 180 gcccacatgt ggtttgacaa tcaaatccat gaagctgata cgacagagaa tcagagtggt 240 gtctcttttg acaagacttc agctacctgg cttgctctgt ccagaattgc aggtctttgt 300 aacagggcag tgtttcaggc taaccaggaa aacctaccta ttcttaagcg ggcagttgca 360 ggagatgcct ctgagtcagc actcttaaag tgcatagagc tgtgctgtgg ttccgtgaag 420 gagatgagag aaagatacgc caaaatcgtc gagataccct tcaactccac caacaagtac 480 cagttgtcta ttcataagaa ccccaacaca tcggagcccc aacacctgtt ggtgatgaag 540 ggcgccccag aaaggatcct agaccgttgc agctctatcc tcctccacgg caaggagcag 600 cccctggatg aggagctgaa agacgccttt cagaacgcct atttggagct ggggggcctc 660 ggagaacgag tcctaggttt ctgccacctc tttctgccag atgaacagtt tcctgaaggg 720 ttccagtttg acactgacga tgtgaatttc cctatcgata atctgtgctt tgttgggctc 780 atctccatga ttgaccctcc acgggcggcc gttcctgatg ccgtgggcaa atgtcgaagt 840 gctggaatta aggtcatcat ggtcacagga gaccatccaa tcacagctaa agctattgcc 900 aaaggtgtgg gcatcatctc agaaggcagt ggacctatga gcagaggaaa atcgtggagt 960 tcacctgcca cacagccttc ttcgtcagta tcgtggtggt gcagtgggcc gacttggtca 1020 tctgntaaga ccaggaggaa ttcggtcttc cagcagggga tgaagaacaa gatcttgata 1080 tttggcctct ttgaagagac agccctggct gctttccttt cctactgccc tggaatgggt 1140 gttgctctta ggatgtatcc cctcaaaccn ntacctggtg gttctgtgcn cttcccctac 1200 tctcttctca tcttcgtata tgacgaagtc anngaaaact catcatcagg cgacgccnnn 1260 ctggcggctg ggtggannnn gaaggaaacc tactattagc cccccgtcct gcacgccgtg 1320 gagcatcagg ccacacactc tgcatccgac accca 1355 <210> 11 <211> 1355 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gtggccaacg tgcctgaggg gcttctggcc actgtcactg tgtgcctgac cctgacagcc 60 aagcgcatgg cacggaagaa ctgcctggtg aagaacctgg aggcggtgga gacgctgggc 120 tccacgtcca ccatctgctc ggacaagacg ggcaccctca cccagaaccg catgaccgtc 180 gcccacatgt ggttcgacaa ccaaatccat gaggctgaca ccaccgaaga tcagtctggg 240 gccacttttg acaaacgatc ccctacgtgg acggccctgt ctcgaattgc tggtctctgc 300 aaccgcgccg tcttcaaggc aggacaggag aacatctccg tgtctaagcg ggacacagct 360 ggtgatgcct ctgagtcagc tctgctcaag tgcattgagc tctcctgtgg ctcagtgagg 420 aaaatgagag acagaaaccc caaggtggca gagattcctt tcaactctac caacaagtac 480 cagctgtcta tccacgagcg agaagacagc ccccagagcc nnnacgtgct ggtgatgaag 540 ggggccccag agcgcattct ggaccggtgc tccaccatcc tggtgcaggg caaggagatc 600 ccgctcgaca aggagatgca agatgccttt caaaatgcct acatggagct ggggggactt 660 ggggagcgtg tgctgggatt ctgtcaactg aatctgccat ctggaaagtt tcctcggggc 720 ttcaaattcg acacggatga gctgaacttt cccacggaga agctttgctt tgtggggctc 780 atgtctatga ttgaccctcc ccgggctgct gtgccagatg ctgtgggcaa gtgccgaagc 840 gcaggcatca aggtgatcat ggtaaccggg gatcacccta tcacagccaa ggccattgcc 900 aaaggcgtgg gcatcatatc agagggtaac gagactgtgg aggacattgc agcccggcnt 960 caacattccc atgagtcaan nnngtcanna ccccagagaa gccaaggnca tgcgtggtgc 1020 acggctctga cctgaaggac atganncatc gnnnnngagc agctcgatga gatcctcaag 1080 aaccacacag agatcgtctt tgctcgaacg tctccccagc agaagctcat cattgtggag 1140 ggatgtcaga ggcagggagc cattgtggcc gtgacgggtg acggggtgaa cgactcccct 1200 gcattgaaga aggctgacat tggcattgcc atgggcatct ctggctctga cgtctctaag 1260 caggcagccg acatgatcct gctggatgac aactttgcct ccatcgtcac gggggtggag 1320 gagggccnng cctgatcttt gacaacttga agaaa 1355 <210> 12 <211> 1355 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gtggccaatg tcccagaggg tctgctggcc actgtcactg tgtgtctgac cgtgaccgcc 60 aagcgcatgg cccggaagaa ctgcctggtg aagaacctgg aggctgtaga gaccctgggc 120 tccacgtcca ccatctgctc agataagaca gggaccctca ctcagaaccg catgacagtc 180 gcccacatgt ggtttgacaa ccagatccac gaggctgaca ccactgagga ccagtcaggg 240 acctcatttg acaagagttc gcacacctgg gtggccctgt ctcacatcgc tgggctctgc 300 aatcgcgctg tcttcaaggg tggtcaggac aacatccctg tgctcaagag ggatgtggct 360 ggggatgcgt ctgagtctgc cctgctcaag tgcatcgagc tgtcctctgg ctccgtgaag 420 ctgatgcgtg aacgaaacaa gaaagtggct gagattccct tcaattccac caacaaatac 480 cagctctcca tccatgagac cgaggacccc aacgacaacc gatacctgct ggtgatgaag 540 ggtgcccccg agcgcatcct ggaccgctgc tccaccatcc tgctacaggg caaggagcag 600 cctctggacg aggaaatgaa ggaggccttt cagaatgcct accttgagct cggtggcctg 660 ggcgagcgcg tgcttggttt ctgccattat tacctgcccg aggagcagta tccccaaggc 720 tttgccttcg actgtgatga cgtgaacttc accacggaca acctctgctt tgtgccgctc 780 atgtccatga tcggcccacc ccgggcagcc gtccctgacg cggtgggcaa gtgtcgcagc 840 gcaggcatca aggtcatcat ggtcaccggc gatcacccca tcacggccaa ggccattgcc 900 aagggtgtgg gcatcatctc tgagggcaac gagactgtgg aggacatcgc cgcccggcnt 960 caacattccc gtcagccagn nnngttanna cccccgggat gccaaggncc tgcgtgatcc 1020 acggcaccga cctcaaggac ttcanncctc cnnnnngagc aaatcgacga gatcctgcag 1080 aatcacaccg agatcgtctt cgcccgcaca tccccccagc agaagctcat cattgtggag 1140 ggctgtcaga gacagggtgc aattgtggct gtgaccgggg atggtgtgaa cgactccccc 1200 gctctgaaga aggccgacat tggggtggcc atgggcatcg ctggctctga cgtctccaag 1260 caggcagctg acatgatcct gctggacgac aactttgcct ccatcgtcac aggggtggag 1320 gagggccnng cctgatcttc gacaacctaa agaag 1355 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 13 Leu Val Thr Tyr Pro Leu Pro 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 14 Trp Tyr Val Tyr Pro Ser Met 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 15 Trp Glu Phe Pro Gly Trp Met 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 16 Ala Tyr Val Tyr Pro Ser Met 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 17 Trp Ala Val Tyr Pro Ser Met 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 18 Trp Tyr Ala Tyr Pro Ser Met 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 19 Trp Tyr Val Ala Pro Ser Met 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 20 Trp Tyr Val Tyr Lys Ser Met 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine releasing factor binding peptide <400> 21 Trp Tyr Val Tyr Pro Ala Met 1 5 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine releasing factor binding peptide <400> 22 Trp Tyr Ala Tyr Pro Ser Ala 1 5

Claims

서열번호 1, 2 및 3으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 래트 IgE-의존적 히스타민 방출인자(HRF) 수용체.
서열번호 4, 5 및 6으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 인간 HRF 수용체.
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서, (Na,K)ATPase α1, α2 또는 α3 서브유닛의 대형 세포질 루프(large cytoplasmic loop; CD3)인 HRF 수용체.
제1항 또는 제2항에 따른 HRF 수용체를 코딩하는 핵산.
제5항에 있어서, 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 및 12로 구성된 그룹으로부터 선택된 염기 서열을 갖는 핵산.
제5항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
제7항에 따른 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제8항에 따른 형질전환체를 시험 화합물 및 상기 수용체와 상호작용하는 것으로 알려져 있는 화합물과 접촉시키고, 시험 화합물중에서 상기 수용체와 상호작용하는 것으로 알려져 있는 화합물의 상호작용을 감소시키는 화합물을 선별하는 것을 포함하는, HRF 수용체와 상호작용하는 화합물을 동정하는 방법.
삭제
삭제
첫 번째 아미노산은 A, L 및 W로 구성된 군으로부터 선택되고, 두 번째 아미노산은 V, Y, E 및 A로 구성된 군으로부터 선택되고, 세 번째 아미노산은 T, V, F 및 A로 구성된 군으로부터 선택되고, 네 번째 아미노산은 Y, P 및 A로 구성된 군으로부터 선택되고, 다섯 번째 아미노산은 P, G 및 K로 구성된 군으로부터 선택되고, 여섯 번째 아미노산은 A, L, S 및 W로 구성된 군으로부터 선택되고, 일곱 번째 아미노산은 A, P 및 M로 구성된 군으로부터 선택되는 일련의 아미노산 서열로 이루어지는, HRF 결합 펩타이드.
제12항에 있어서, 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.
제12항에 있어서, 첫 번째 아미노산은 A 또는 W로부터 선택되고, 두 번째 아미노산은 Y 또는 A로부터 선택되고, 세 번째 아미노산은 V 또는 A로부터 선택되고, 네 번째 아미노산은 Y 또는 A로부터 선택되고, 다섯 번째 아미노산은 P 또는 K로부터 선택되고, 여섯 번째 아미노산은 S 또는 A로부터 선택되고, 일곱 번째 아미노산은 M 또는 A로부터 선택되는 일련의 아미노산 서열로 이루어지는, HRF 결합 펩타이드.
제14항에 있어서, 서열번호 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.
제14항에 있어서, 첫 번째 아미노산은 W이고, 일곱 번째 아미노산은 M인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제16항에 있어서, 서열번호 14, 17, 18, 19, 20 및 21로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.
제10항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서, L-, D-, 또는 L- 및 D-아미노산으로 구성된 펩타이드.
제10항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 변형 아미노산을 포함하는 펩타이드.
제19항에 있어서, 변형 아미노산이 아미노산 유도체 또는 알킬화된 아미노산인 펩타이드.
제10항 내지 제17항중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 코딩하는 핵산.
제21항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
제22항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
유효성분으로서 제10항 내지 제17항중 어느 한 항에 따른 펩타이드 또는 제21항에 따른 핵산을 함유하는 알러지 진단, 예방 또는 치료용 조성물.
제24항에 있어서, 천식; 비염; 담마진; 아나필락시스; 알러지성 기관지확장증; 음식, 약물, 화분 또는 벌레로 인한 알러지; 헤이 피버; 한냉두드러기; 또는 아토피성 피부염의 진단, 예방 또는 치료용 조성물.
유효성분으로서 제10항 내지 제17항중 어느 한 항에 따른 펩타이드 또는 제21항에 따른 핵산을 함유하는 말라리아 진단, 예방 또는 치료용 조성물.