JP2002330772A - ＩｇＥ依存性ヒスタミン放出因子（ＨＲＦ）の受容体、ＨＲＦ結合ペプチド及びこれらをコードする核酸、並びにこれらの用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 アレルギー疾患を誘発するＩｇＥ−依存性ヒ
スタミン放出因子（ＨＲＦ）の新規な受容体、ＨＲＦ結
合ペプチド、及びこれらをコードする核酸、及びこれら
の用途を提供する。 【解決手段】 特定なアミノ酸配列又はこれと８５％以
上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＨＲＦ受容
体。（Ａ，ＬまたはＷ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ａ，Ｌ，
ＳまたはＷ）−（Ａ，ＰまたはＭ）のアミノ酸配列を有
するＨＲＦ結合ペプチド。これらはＨＲＦによるヒスタ
ミン放出を抑制できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＩｇＥ依存性ヒス
タミン放出因子（以下、「ＨＲＦ」と称する）の受容
体、ＨＲＦ結合ペプチドおよびこれらをコードする核
酸、並びにこれらの用途に関する。より詳細には、本発
明は喘息；鼻炎；痰麻疹；アナフィラキシー；アレルギ
ー性気管支拡張症；食物、薬物、花粉または虫によるア
レルギー；花粉症；寒冷じん麻疹；またはアトピー性皮
膚炎等のようなアレルギー疾患を誘発するＨＲＦの新規
な受容体、ＨＲＦ結合ペプチドおよびそれらをコードす
る核酸、並びにそれらの医薬分野における用途に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】アレルギーは、アレルゲンに対して遺伝
的に過敏にＩｇＥを生成するか、ＩｇＥの分泌を増加さ
せるインターロイキン−４（ＩＬ−４）とＩｇＥの分泌
を減少させるγ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）の均
衡が破れて起こると考えられている。アレルゲンに曝さ
れると、即時反応が起こり、炎症と関連した様々な細胞
が集まってきて、その数時間後には好塩基球、好酸球お
よびリンパ球から、ヒスタミン又は他のサイトカインが
分泌されることによる後期反応（「ＬＰＲ」と略記す
る）が起こる。該ＬＰＲでは好塩基球からヒスタミンが
分泌されるが、この時には反応を誘発したアレルゲンが
ない。そして、アレルギー患者のおよそ半分だけがＬＰ
Ｒにまで進展するため、何が好塩基球よりヒスタミンを
遊離させているのか、その原因物質が何であるのかとい
うことが大きな関心事であった。これまでに、ＭＣＰ−
３、ＭＣＰ−１またはランテス（ＲＡＮＴＥＳ）等のよ
うなサイトカインがヒスタミンを分泌させることが知ら
れており、ＩｇＥ−依存性ＬＰＲでは、「ＨＲＦ」と呼
ばれる物質だけが、好塩基球よりヒスタミンを分泌させ
る物質であることが明らかになっている［マクドナルド
（ＭａｃＤｏｎａｌｄ）ら、１９９５］。しかしなが
ら、ＨＲＦがどういう作用機構によって、好塩基球より
ヒスタミン分泌を誘導しているかはいまだ知られていな
い。

【０００３】ＨＲＦは諸細胞質に存在する、１７２個の
アミノ酸よりなる公知のタンパク質である［ボーム（Ｂ
ｏｈｍ）ら、１９８９］。そのうち、Ｃ末端の４５個の
アミノ酸は塩基性ドメインを形成しており、この部位は
微小管結合タンパク質（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）のＭＡＰ−１Ｂと
約４６％の相同性を示すことから、微小管結合タンパク
質の一種と推定されている。ゴーセ（Ｇａｃｈｅｔ、１
９９７）らは、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉ
ｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いてＨＲＦの分布と細胞骨格網
分布がある程度一致していることを観察したが、これは
ＨＲＦが細胞骨格と結合していることを示唆するもので
ある。一方、サンチェス（Ｓａｎ-ｃｈｅｚ、１９９
７）らは、ＨＲＦが一般的なＣａ結合タンパク質ファミ
リーに属していないにもかかわらず、Ｃａ²⁺と結合する
ことを発表した。また酵母サカロマイセスセレビジエ
（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
で、ＨＲＦ遺伝子を欠失させても酵母は生存できること
も確認した。これらの結果は、ＨＲＦが重複経路（ｒｅ
ｄｕｎｄａｎｔ ｐａｔｈｗａｙ）を有する遺伝子ファ
ミリーに属することを暗示するものである。

【０００４】このように、ＨＲＦは細胞質内に存在する
タンパク質であるにもかかわらず、マクドナルド（Ｍａ
ｃＤｏｎａｌｄ、１９９５）らは細胞外で該ＨＲＦを発
見した。また、ＨＲＦが細胞外に存在しながらＩｇＥ感
作好塩基球を刺激し、ヒスタミンを遊離させていると知
られていた。しかしながら、ＩｇＥとＨＲＦの明確な相
互作用はいまだ究明されていない（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ
ｅｔ ａｌ．、１９９６）。シュレーダー（Ｓｃｈｒｏ
ｅｄｅｒ）ら（１９９７）は、ＩｇＥが存在していない
時にも、抗ＩｇＥ抗体で誘導されるヒスタミンを好塩基
球から放出する反応が調節されることを観察し、ＨＲＦ
がＩｇＥに結合して作用するものではなく、特異な細胞
膜受容体に結合して作用することを提示した。したがっ
て、細胞質タンパク質であるＨＲＦがどういう経路で細
胞外に出られるのか、どういう作用機構でＨＲＦがＩｇ
Ｅ感作好塩基球を刺激しヒスタミンを放出させるのかは
大切な問題である。

【０００５】ＨＲＦは親水性で細胞内に存在するタンパ
ク質であるが、ＬＰＲアレルギー患者の血漿から多量に
検出される。このことから、アポトーシスや他の作用機
構により細胞外に放出され、好塩基球の細胞膜に存在す
るＨＲＦ受容体を介してヒスタミンを遊離させるものと
推定されていた。

【０００６】また、ＨＲＦは大部分の組織に存在するた
め、炎症関連細胞以外の組織細胞においてもその機能を
発揮するものと推定される。しかしながら、炎症関連細
胞以外の他組織、とりわけ脳組織や神経細胞でのＨＲＦ
の機能については殆ど報告されていない。但し、最近２
−Ｄゲル電気永動およびプロテオミックス（ｐｒｏｔｅ
ｏｍｉｃｓ）を用いて、ヒトの脳に存在している各種タ
ンパク質の分析中に、ＨＲＦが見出されており［ランゼ
ン（Ｌａｎｇｅｎ）ら、１９９９］、次いで同一グルー
プの研究陣らによって、ダウン症候群やアルツハイマー
病で死亡した患者の脳よりＨＲＦタンパク質が減少して
いることが観察されたという報告があっただけである
［キム（Ｋｉｍ）ら、２００１］。

【０００７】一方、細胞の安定膜電位形成および浸透性
の均衡調節に係わるＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼは神経細
胞、とりわけ神経末端またはシナプトゾーム（ｓｙｎａ
ｐｔｏｓｏｍｅ）の膜にも高濃度で存在し、神経活性に
重要な役割を果たしている。神経細胞膜に存在している
Ｎａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼの活性が阻害され又は活性が
消失すると、色々な神経病理学的変化やアポトーシスが
誘発されると報告されている［リーズ（Ｌｅｅｓ）、１
９９１］。これは、脳の虚血や酸素欠乏状態でＮａ⁺，
Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼの酵素活性に必須的な細胞内ＡＴＰ
が枯渇するという報告［マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）
ら、１９９４；サントス（Ｓａｎｔｏｓ）ら、１９９
６］にも関連している。したがって、このような脳疾患
状態では該酵素の活性も阻害されるとされている。ま
た、Ｎａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼ活性が阻害される時、神
経伝達物質の放出が増加することが、マウス脳組織切
片、シナプトゾームおよび試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ）培養システムにより証明された。なお、生体内（ｉ
ｎ ｖｉｖｏ）および試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で
の研究より、虚血または酸素欠乏と似た状態で神経伝達
物質の放出が増加し、その結果、シナプス後膜受容体の
活性化が神経損傷について重要な過程であると提示され
た［チェ（Ｃｈｏｉ、１９９０）、マーティン（Ｍａｒ
ｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９９４）］。

【０００８】脳のＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼ活性は、ド
ーパミン、セロトニン、ノルエピネフリン、グルタメー
ト等の神経伝達物質だけでなく、インスリン、酸化窒素
（ＮＯ）等の内因性物質によっても調節される。脳に、
植物から抽出された配糖体のウワバインと構造的に類似
した内因性Ｎａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼ阻害物質である
「脳ウワバイン」が存在することが見出された［バドジ
カウスキー（Ｂｕｄｚｉｋｏｗｓｋｉ）ら、１９９８］
が、ロードリゲスら［Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ．ａ
ｌ、１９９２］は、脳の可溶性分画に、Ｎａ⁺，Ｋ⁺−Ａ
ＴＰアーゼの活性を特異的に阻害し、ウワバインとは構
造も特性も異なる内因性ウワバイン様因子（ｅｎｄｏｇ
ｅｎｏｕｓ ｏｕａｂａｉｎ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ）
が存在し、これにより高親和性³Ｈ−ウワバイン結合が
遮断されて神経伝達物質の放出が誘導され、また、該神
経伝達物質によるＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼ活性の調節
にも関与すると報告した。最近、この物質はエンドバイ
ン（ｅｎｄｏｂａｉｎ）Ｅ［ヴァッタ（ｖａｔｔａ）
ら、１９９９］と命名されたが、その実体については依
然明らかにされていない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＨＲ
Ｆの新規受容体、ＨＲＦ結合ペプチドおよびそれらの用
途を提供することである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ｉ）ＨＲＦ
が親水性タンパク質であるにもかかわらず、細胞膜を通
過できることと、ii）酵母の２ハイブリッド分析（ｙｅ
ａｓｔ ｔｗｏ-ｈｙｂｒｉｄ ａｓｓａｙ）によりＨＲ
Ｆ受容体がＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼの第３細胞質ドメ
イン（ＣＤ３）であるという驚くべき事実を見出した。
なお、細胞外に分泌されたＨＲＦが好塩基球内で、ヒス
タミンの分泌を促進する明確な作用機構も本発明者によ
り最初に究明された。

【００１１】ひいては、上記の研究結果に基づいて、本
発明者はｉ）ＨＲＦが細胞内に入る段階を遮断すること
により、あるいはii）ＨＲＦがＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアー
ゼに結合する段階を遮断してＨＲＦのヒスタミン分泌を
阻害することにより、アレルギー疾患の予防または治療
ができると考えた。その一環として、ドデカマーおよび
ヘプタマーファージディスプレーライブラリーをスクリ
ーニングし、ＨＲＦに結合するペプチドを研究していた
ところ、ある特定配列を有するペプチドのヒスタミン分
泌阻害率が極めて優れていることを確認し、本発明の完
成に至った。

【００１２】第１の発明は、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．）１、２および３よりなる群から選ばれたアミノ酸
配列を有する、ラットＨＲＦ受容体に関する。

【００１３】第２の発明は、配列番号４、５および６よ
りなる群から選ばれたアミノ酸配列を有する、ヒトＨＲ
Ｆ受容体に関する。

【００１４】第３の発明は、前記アミノ酸配列と８５％
以上の配列相同性を有するＨＲＦ受容体に関する。

【００１５】本発明のＨＲＦ受容体は、Ｎａ⁺，Ｋ⁺−Ａ
ＴＰアーゼ α１、α２、またはα３サブユニットの大
型細胞質ループ［ＣＤ３（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄ
ｏｍａｉｎ ３］で有り得る。

【００１６】第４の発明は、ＨＲＦ受容体をコードする
核酸に関する。本発明の核酸は配列番号７、８および９
よりなる群から選ばれた塩基配列（ラットＨＲＦ）、ま
たは配列番号１０、１１および１２（ヒトＨＲＦ）より
なる群から選ばれた塩基配列を含有し得る。

【００１７】第５の発明は、前記核酸を含有する組替え
ベクターに関する。

【００１８】第６の発明は、前記ベクターによって形質
転換された形質転換体に関する。

【００１９】第７の発明は、前記形質転換体を、被験化
合物および前記受容体と相互作用すると知られている化
合物と接触させる工程；前記被験化合物のうち、前記受
容体と相互作用すると知られている化合物の相互作用を
減少させる化合物を選別する工程を含む、ＨＲＦ受容体
と相互作用する化合物の同定方法である［競合結合分析
（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａ
ｙ）］。

【００２０】第８の発明は、下記のアミノ酸配列を有す
るＨＲＦ結合ペプチドに関する： （Ａ，ＬまたはＷ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ａ，Ｌ，Ｓま
たはＷ）−（Ａ，ＰまたはＭ） ｛ここで、Ｘは任意のアミノ酸を示す｝。

【００２１】本発明のＨＲＦ結合ペプチドは、好ましく
はアミノ酸配列（Ａ，ＬまたはＷ）−Ｘ−Ｘ−（Ｙ，Ｐ
またはＡ）−（Ｐ，ＧまたはＫ）−（Ａ，Ｌ，Ｓまたは
Ｗ）−（Ａ，ＰまたはＭ）を有するものであり、より好
ましくは、アミノ酸配列（Ａ，ＬまたはＷ）−（Ｖ，
Ｙ，ＥまたはＡ）−（Ｔ，Ｖ，ＦまたはＡ）−（Ｙ，Ｐ
またはＡ）−（Ｐ，ＧまたはＫ）−（Ａ，Ｌ，Ｓまたは
Ｗ）−（Ａ，ＰまたはＭ）、例えば、配列番号１３、１
４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１および
２２よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を有するもの
である。さらに好ましくは、アミノ酸配列（Ａまたは
Ｗ）−（ＹまたはＡ）−（ＶまたはＡ）−（Ｙまたは
Ａ）−（ＰまたはＫ）−（ＳまたはＡ）−（Ｍまたは
Ａ）、例えば、配列番号１４、１６、１７、１８、１
９、２０、２１および２２よりなる群から選ばれたアミ
ノ酸配列を有するものである。最も好ましくは、アミノ
酸配列Ｗ−（ＹまたはＡ）−（ＶまたはＡ）−（Ｙまた
はＡ）−（ＰまたはＫ）−（ＳまたはＡ）−Ｍ、例え
ば、配列番号１４、１７、１８、１９、２０、及び２１
よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を有するものであ
る。

【００２２】本発明のＨＲＦ結合ペプチドは、構成アミ
ノ酸がＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸又はＤＬ−アミノ酸
であってもよく、さらに修飾されたアミノ酸、例えばア
ミノ酸誘導体またはアルキル化、とりわけメチル化アミ
ノ酸を１つ以上含んでもよい。

【００２３】第９の発明は、前記ＨＲＦ結合ペプチドを
コードする核酸に関する。

【００２４】第１０の発明は、前記核酸を含有する組変
えベクターに関する。

【００２５】第１１の発明は、前記組変えベクターで形
質転換された形質転換体に関する。

【００２６】第１２の発明は、有効成分として前記ＨＲ
Ｆ結合ペプチドまたはそれをコードする核酸を含有する
アレルギー、とりわけ、喘息；鼻炎；痰麻疹；アナフィ
ラキシー；アレルギー性気管支拡張症；食物、薬物、花
粉または虫によるアレルギー；花粉症、寒冷じん麻疹；
またはアトピー性皮膚炎の診断、予防または治療用組成
物に関する。

【００２７】第１３の発明は、有効成分としてＩｇＥ−
依存性ヒスタミン放出因子（ＨＲＦ）またはそれをコー
ドする核酸を含有する神経伝達物質、例えば、ドーパミ
ン放出誘導剤に関する。

【００２８】第１４の発明は、有効成分として前記ＨＲ
Ｆ結合ペプチドまたはそれをコードする核酸を含有する
神経伝達物質、例えば、ドーパミン放出抑制剤、とりわ
け脳卒中、アルツハイマー病またはパーキンソン病等の
ようなアポトーシス関連神経疾患の診断、予防または治
療用組成物に関する。

【００２９】第１５の発明は、有効成分として前記ＨＲ
Ｆ結合ペプチドまたはそれをコードする核酸を含有する
マラリアの診断、予防または治療用組成物に関する。

【００３０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００３１】本発明者は、まず酵母の２ハイブリッド法
を利用し、ＨＲＦがＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼ αサブ
ユニットのうち、大型細胞質ループ（ＣＤ３）に結合す
ることを始めて見出した。なお、共同免疫沈澱法（ｃｏ
ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を用いて酵
母細胞および哺乳細胞で、ＨＲＦとＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰ
アーゼ αサブユニットのＣＤ３が相互作用することを
確認し、その結合親和度を測定した。さらに、ＨＲＦの
受容体がＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼ αサブユニットの
ＣＤ３であることを共焦点顕微鏡で確認した。

【００３２】また、ＨＲＦが水溶性タンパクであるにも
かかわらず、細胞内に侵入できることを共焦点顕微鏡と
ウエスタンブロッティング法で立証し、該ＨＲＦが細胞
内のＮａ⁺およびＣａ²⁺濃度を増加させ、この際、Ｎａ
／Ｃａ交換体により細胞外のＣａ源が消耗されることを
明らかにした。また、ＨＲＦがＩｇＥの存在下で、反応
性酸素源（ＲＯＳ）を生成し、その結果細胞内により多
くのＣａ²⁺が流入されることを明らかにした。

【００３３】以上の結果より、好塩基球からのヒスタミ
ン放出を、ＨＲＦが促進する作用機構が明らかにされ
た。即ち、細胞外に分泌されたＨＲＦが好塩基球内に入
り込み、Ｎａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼ αサブユニット中
の第３細胞質ドメイン（ＣＤ３）と結合し、ウワバイン
の様に、Ｎａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼの作用を阻害し、そ
の結果、細胞内のＮａ⁺濃度は増加し、次いでＮａ／Ｃ
ａ交換体が活性化されることによって細胞内のＣａ²⁺濃
度も増加する。また、ＩｇＥが存在すると、ＲＯＳの生
成により細胞内のＣａ²⁺が一層増加するため、結局ヒス
タミン分泌が促進される。以上の結果は、ＨＲＦの受容
体がこのＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼのＣＤ３であり、Ｈ
ＲＦがＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼの細胞質リプレッサー
であることを意味する。

【００３４】したがって、本発明者は、ＨＲＦ受容体の
実体を始めて究明し、これにより、配列番号１、２およ
び３よりなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するＨＲ
Ｆ受容体を提供できる。ＨＲＦ受容体は夫々ラットから
分離されたＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼ α１、α２およ
びα３サブユニットのＣＤ３に属するものであり、該当
技術分野で通常の知識を有した者であれば誰でもヒトＨ
ＲＦ受容体を容易に同定することができる。従って、ヒ
トＨＲＦ受容体も同様に本発明の範囲内に属する。ヒト
ＨＲＦ受容体は、配列番号４（α１）、５（α２）また
は６（α３）に記載のアミノ酸配列を有する。

【００３５】ラットのＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼ α１
ＣＤ３とα２ ＣＤ３との間での配列相同性は８７．６
％であり、α２ ＣＤ３とα３ ＣＤ３との間での配列相
同性は８９．４％であった。一方、ラットとヒトの間で
のＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼα ＣＤ３の配列相同性
は、α１同士で９７．５％、α２同士で９９．３％、α
３同士で９８．８％を示した（図１８〜２１参照）。従
って、本発明は前記配列番号に記載の夫々のアミノ酸配
列と８５％以上の配列相同性を有するＨＲＦ受容体を提
供する。

【００３６】また、本発明はＨＲＦ受容体をコードする
核酸、例えば、配列番号７（ラットα１）、配列番号８
（ラットα２）および配列番号９（ラットα３）のいず
れか一つ、又は配列番号１０（ヒトα１）、配列番号１
１（ヒトα２）および配列番号１２（ヒトα３）のいず
れか一つに記載の塩基配列を有する核酸を提供する。同
時に、本発明は前記核酸を含有する組換えベクターおよ
び該ベクターで形質転換された形質転換体をも提供す
る。

【００３７】なお、本発明は前記細胞を競合結合分析に
使用することを含む、ＨＲＦ受容体と相互作用する化合
物を同定する方法を提供する。本発明の競合結合分析で
は、ＨＲＦ受容体及びＨＲＦタンパクをコードする核酸
を含有した組換えベクターで形質転換された細胞を、被
験化合物および前記受容体と相互作用すると知られてい
る化合物と接触させ、前記被験化合物の中より、前記受
容体と相互作用すると知られている化合物の相互作用を
減少させる化合物を選別する。以上より、最終的には細
胞内でヒスタミン分泌が効果的に調節できる新規な化合
物をスクリーニングすることができる。

【００３８】また、本発明はＨＲＦに特異的に高親和度
で結合し、ヒスタミンの分泌を阻害するペプチドを提供
する。一例として、本発明のＨＲＦ結合ペプチドはアミ
ノ酸配列を有する。 （Ａ，ＬまたはＷ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ａ，Ｌ，Ｓま
たはＷ）−（Ａ，ＰまたはＭ） ｛ここで、Ｘは任意のアミノ酸を示す｝ ＨＲＦ結合ペプチドのアミノ酸配列の例は下記のものを
含有する。

【００３９】（Ａ，ＬまたはＷ）−Ｘ−Ｘ−（Ｙ，Ｐま
たはＡ）−（Ｐ，ＧまたはＫ）−（Ａ，Ｌ，Ｓまたは
Ｗ）−（Ａ，ＰまたはＭ）； 好ましくは、（Ａ，ＬまたはＷ）−（Ｖ，Ｙ，Ｅまたは
Ａ）−（Ｔ，Ｖ，ＦまたはＡ）−（Ｙ，ＰまたはＡ）−
（Ｐ，ＧまたはＫ）−（Ａ，Ｌ，ＳまたはＷ）−（Ａ，
ＰまたはＭ）であり、例えば、配列番号１３〜２２が挙
げられる；より好ましくは、（ＡまたはＷ）−（Ｙまた
はＡ）−（ＶまたはＡ）−（ＹまたはＡ）−（Ｐまたは
Ｋ）−（ＳまたはＡ）−（ＭまたはＡ）であり、例え
ば、配列番号１４、１６、１７、１８、１９、２０、２
１および２２が挙げられる；最も好ましくは、Ｗ−（Ｙ
またはＡ）−（ＶまたはＡ）−（ＹまたはＡ）−（Ｐま
たはＫ）−（ＳまたはＡ）−Ｍであり，例えば、配列番
号１４、１７、１８、１９、２０および２１が挙げられ
る。

【００４０】本発明者は、前記ペプチドをファージディ
スプレーライブラリースクリーニングを通じて得、次い
で合成ペプチドを用いて実験を繰返し行った。本発明の
ペプチドは化学的に合成されるか遺伝子組変え技術を用
いて製造することができる。好ましくは、本発明のぺプ
チドを構成するドメインを生体内に存在するタンパク質
若しくはその一部により製造してもよい。他の方法とし
ては、本発明のペプチドは、それをコードする塩基配列
を有するＤＮＡを挿入した発現ベクターを用いて組変え
ＤＮＡ技術で製造してもよい。

【００４１】前記ベクターは生体内で標的にできるよう
に製造され、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの方
法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ）により適当な宿主細胞で形質転換され、適当な条
件下で発現されるように製造される。また、本発明のア
ミノ酸配列を包む融合タンパク質を用いて本発明のペプ
チドを製造することもできる。

【００４２】一方、本発明のペプチドのアミノ酸配列
は、当業界で公知の通常の技術により変更してもよい。
例えば、本発明のペプチドは、アミノ酸の数を変えるこ
とによって変更することができる。また、本発明のペプ
チドの活性を低下させない範囲内で、結合に直接的に関
与、または保存されるべき残基を除いた特定残基成分の
置換、或いはその順番を換えることにより変更され得
る。天然に存在するＬ−α−アミノ酸に変更する場合だ
けでなく、β、γ、δ−アミノ酸は勿論、Ｄ−α−アミ
ノ酸誘導体に変更することもできる。

【００４３】アミノ酸を１つだけ置換したペプチドを用
いて、静電気力や親水性が結合に及ぼす影響を調べた結
果、典型的には、正に帯電されるアミノ酸（例えば、Ｌ
ｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）や負に帯電されるアミノ酸（例
えば、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）が置換される
場合に、その敏感度が変化することが分かる。このよう
に、置換または付加される残基の数と形態は、必須的な
結合点との間に必要な空間、親水性または疎水性のよう
に要求される機能により適宜決定される。このような置
換により、本発明のペプチドの目的タンパク質に対する
親和度をより増加させることができる。

【００４４】置換により、機能においても重要な変化が
見られる。置換される残基として何を選択するかという
ことは、目的の位置に存在する分子の電気度、疎水性、
側鎖の変化またはらせん構造の変化等、ペプチドの基本
骨格を維持するのに大きな影響を及ぼす。一般的に、ペ
プチドの性質に重大な変化をもたらすのは、セリンのよ
うな親水性残基がロイシン、イソロイシン、フェニルア
ラニン、バリン、アラニンのような疎水性残基で置換さ
れる場合；リジン、アルギニンまたはヒスチジンのよう
な電気的に陽性の残基がグルタミン酸やアスパラギン酸
のような電気的に陰性の残基で置換される場合；グリシ
ンのような側鎖を持たないアミノ酸が嵩高い側鎖の残基
で置換される場合である。

【００４５】上述したことを考慮すれば、前記特定ペプ
チドを、該ペプチドのＨＲＦに対する結合力およびそれ
に従うヒスタミン分泌阻害活性を維持又は増加する範
囲、すなわち、ＨＲＦに対する結合力およびそれに従う
ヒスタミン分泌阻害活性を損傷しない範囲内で、当業者
は通常の技術を利用して変更できる。従って、かかる範
囲で変更されたものは、本発明の範囲内に属する。

【００４６】本発明のペプチドは、ＨＲＦが関与する全
てのアレルギー疾患、例えば、喘息；鼻炎；痰麻疹；ア
ナフィラキシー;アレルギー性気管支拡張症；食物、薬
物、花粉または虫によるアレルギー；花粉症；寒冷じん
麻疹；またはアトピー性皮膚炎の診断、予防または治療
に有用である。前記のようなアレルギー疾患をわずらっ
ている患者の血液では、例外なくＨＲＦが検出されるの
で（図２２参照）、前記アレルギー疾患の診断、予防ま
たは治療に本発明のペプチドが有効であることは当業者
に自明なことである。

【００４７】従って、本発明は有効成分として前記ペプ
チドを含有する、アレルギーの予防または治療用組成物
を提供する。前記ペプチドの有効量は、体重１ｋｇ当り
約０．１〜５ｍｇ、好ましくは０．３〜２．５ｍｇであ
ってもよい。本発明の組成物は、溶液またはミセルの形
で、ヒト又は動物に直接注入されるか製剤化して使用で
きる。本発明の組成物は非経口または局所投与により人
体に適用してもよいが、静脈注射、皮下注射、内皮注
射、筋肉注射等の注射により投与することが好ましい。
このために、本発明のペプチドを薬剤学的に許容可能な
担体に懸濁、または溶解させるが、このとき、とりわけ
水溶性担体を使用することが好ましい。

【００４８】また、本発明のペプチドはアレルギー診断
キットにも効果的に用いることができる。よって、ＨＲ
Ｆが結合するペプチド（ＨＲＦ結合ペプチド）と抗ＨＲ
Ｆモノクローナル抗体を含む診断キットを用いた試験
で、血液反応で陽性と判定されると、アレルゲンがなく
てもアレルギーを起こし得る疾患を保有していると判断
される。即ち、ＬＰＲアレルギー患者の血液にはＨＲＦ
が浮遊しているため、血液検査の際、本キットを使用す
れば、血液中でのＨＲＦの存在有無が分かり、この結果
ＬＰＲ患者であるかどうかが判断できる。本発明では、
容器の底にＨＲＦ結合ペプチドを付着させた後、血液サ
ンプルを反応させ、さらに複合抗ＨＲＦモノクローナル
抗体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ＨＲＦ ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を加える方
法を用いてもよい。

【００４９】さらに、本発明者らは、ＨＲＦが神経細胞
内でＮａ⁺、Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼを阻害することにより、
神経伝達物質の放出を増加させるか否かを次の様にして
調べた。すなわち、細胞内の神経伝達物質の分泌顆粒を
含有していて、特にカテコールアミンの放出調節の研究
に適しているとされている神経細胞株のＰＣ１２（Ａｂ
ｕ−Ｒａｙａ ｅｔ ａｌ．、１９９９）の培養液にＨＲ
Ｆを加え、[³Ｈ]−標識ドーパミンの放出変化を測定し
た。ＰＣ１２細胞でドーパミンの基底およびＫ ⁺濃度の
増加により誘導される脱分極時のＫ⁺興奮性放出（Ｋ⁺−
Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）がＨＲＦの濃
度に依存して増加することを確認した。また、前記ＨＲ
Ｆ結合ペプチドが神経細胞においてもＨＲＦにより誘導
された神経伝達物質の放出を効果的に遮断することが明
らかになった。

【００５０】以上述べたように、Ｎａ⁺、Ｋ⁺−ＡＴＰア
ーゼ活性の細胞内調節に関与するＨＲＦは、神経細胞に
おいても神経活性に重要な役割を果たすＮａ⁺、Ｋ⁺−Ａ
ＴＰアーゼを阻害して神経伝達物質の放出を促進させ
る。従って、ＨＲＦは、神経細胞および脳より現われる
病体生理学的効果に重要な役割を演じると確信される。
こうした理由から、ＨＲＦの神経伝達物質の放出増加作
用を遮断できるＨＲＦ結合ペプチドは脳卒中、アルツハ
イマー病、パーキンソン病等のような種々のアポトーシ
スに関連する神経疾患の診断、予防または治療剤として
有用である。

【００５１】従って、本発明は有効成分としてＨＲＦ結
合タンパク質を含有する脳卒中、アルツハイマー病、パ
ーキンソン病等のアポトーシス関連性神経疾患の診断、
予防または治療用組成物を提供する。この場合、前記の
投与経路と投与量を適用してもよい。

【００５２】一方、ＨＲＦは、翻訳により調節される腫
瘍タンパク質とも言われており、ビスティバン（Ｂｈｉ
ｓｕｔｔｈｉｂｈａｎ）ら（１９９８）によって、すで
に抗マラリア剤のアルテミシニンがマラリアタンパク質
のＨＲＦに結合し作用することが明らかにされている。
従って、本発明のペプチドもＨＲＦとの結合親和性を有
するため、アルテミシニンと同様に、マラリアの予防お
よび治療に用いられることができる。この場合、前記の
投与経路と投与量を適用してもよい。

【００５３】

【実施例】以下、本発明を具体的な実施例を挙げより詳
しく説明するが、これは本発明の理解を深めるだけであ
り、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

【００５４】実施例 １：酵母の２ハイブリッド法を利
用したＨＲＦのＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼ大型細胞質ル
ープに対する結合実験 ラットの骨格筋より全細胞質ＲＮＡを抽出した後、ｐＪ
Ｇ４−５ベクターを用いて、酵母の２ハイブリッド分析
用のｃＤＮＡライブラリーを製作した。Ｎａ⁺、Ｋ⁺−Ａ
ＰＴａｓｅ α２サブユニットを用いてＣＤ３部位をＬ
ｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメイン（ｐＥＧ２０２ベクター）
に挿入した後、これをスクリーニング用のバイト（ｂａ
ｉｔ）として使用した。リポーター遺伝子を活性化させ
た陽性クローンを選択し、塩基配列分析、制限酵素マッ
ピングとＢＬＡＳＴサーチを利用して配列分析を行っ
た。これらのうち、一つのクローンがＩｇＥ依存性ＨＲ
Ｆの配列と完全に一致した。

【００５５】Ｎａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼ α１およびα
２サブユニットのＣＤ３部位をｐＥＧ２０２ベクターに
挿入した後、イソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）による相
互作用を調べた。前記製造したすべての作製物で、Ｌｅ
ｘＡｏｐ−ＬＥＵ２およびＬｅｘＡｏｐ−ＬａｃＺリポ
ーター遺伝子を含有する酵母細胞（ＥＧＹ４８／ｐＳＨ
１８−３４）を形質転換した後、選択培地プレートで増
殖させた。

【００５６】結果を図１に示す。図１より、ＨＲＦの受
容体がＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼの大型細胞質ループ
（ＣＤ３）であることを確認した。

【００５７】実施例 ２：共同免疫沈澱法を用いた酵母
およびＣＯＳ−７細胞における、ＨＲＦと（Ｎａ，Ｋ）
ＡＴＰアーゼの相互作用の実験 グルコシルＵｒａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−およびガラクトシ
ルＵｒａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−培地で、実施例１で調製し
た前記作製物で形質転換された酵母細胞を増殖させた
後、３０００×ｇで５分間遠心分離を行い細胞を集め
た。集められた細胞を再び酵母溶菌緩衝液（ｙｅａｓｔ
ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
８．０、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５
０ｍＭ ＮａＦ、２ｍＭ ＺｎＣｌ₂、プロテアーゼ阻害
剤カクテル）で懸濁させた後、グラスビーズに加え、攪
拌した。この混合物に、ＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴ
Ａ，１％ＮＰ₄Ｏ，０．５％ デオキシコレートナトリウ
ム、０．１％ＳＤＳ）を加えた後、１０,０００×ｇ、
４℃で３０分間遠心した。

【００５８】以上により製造された細胞抽出物にＩｇＧ
ｓｏｒｂ（Ｔｈｅ ＥｎｚｙｍｅＣｅｎｔｅｒ、Ｉｎ
ｃ）を加えた後、４℃で３０分間培養した後、１０,０
００×ｇで５分間遠心した。この混合物にまた親和性の
精製抗−ＨＡ １２ＣＡ５モノクローナル抗体を加えた
後、４℃で３時間、または一晩培養した。生成された免
疫複合体に５０％タンパク質Ａアガロース溶液（Ｒｏｃ
ｈｅ，ＵＳＡ）を加え、４℃で４時間培養した。次いで
５秒間遠心してから、ペレットをＲＩＰＡ緩衝液と洗浄
緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．
０、０．１％ＮＰ₄Ｏ）で夫々洗浄した。

【００５９】ペレットを２×ＳＤＳサンプル緩衝液に再
懸濁させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にローディング
した。相互作用するタンパク質を調べるため、ウサギポ
リクロナールＬｅｘＡ抗体を使用した。その結果を図２
に示す。図２よりＨＲＦとＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼの
大型細胞質ループが相互作用することを確認した。

【００６０】次いで、哺乳細胞での相互作用を調べるた
めに、ＣＯＳ−７細胞をＤＭＥＭ⁺培地（１０％牛胎児
血清、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００
ｕｎｉｔｓ／ｍｌストレプトマイシン含有のＤｕｌｂｅ
ｃｃｏｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅｓ 培地）で増殖
させた。ｐＣＤＮＡｎｅｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）に挿入した、Ｎ末端ＨＡ−タッグ（ｔａｇ）のＨ
ＲＦ作製物をトランスフェクションさせた。ＣＯＳ−７
細胞抽出物の免疫沈澱をフロルキエヴィツ（Ｆｌｏｒｋ
ｉｅｗｉｃｚ）ら（１９９８）の方法により行い、相互
作用するタンパク質を調べるため、ウサギポリクローナ
ル抗Ｎａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼ抗体を使用した。その結
果を図３に示す。図３より、哺乳細胞のＣＯＳ−７細胞
においても、ＨＲＦとＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼの大型
細胞質ループが相互作用することを確認した。

【００６１】実施例３：バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）
分析を用いたＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼとＨＲＦの結合
親和度の測定実験 ＣＭ５センサーチップに、組換えラットＨＲＦをｐＨ
４．０、１０ｍＭアセテートに１０ｍｇ／ｍｌの濃度で
固定させた後、ＨＢＳ緩衝液（０．０１Ｍ Ｈｅｐｅ
ｓ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）を流し補正した。
この混合液に５０ｍＭ ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド）と２００ｍＭ ＥＤＣ［Ｎ−エチル−Ｎ−
（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド］を流
し活性化させた後、Ｎａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼを流し結
合親和度を測定した。その結果を図４に示した。図４
中、Ｋｄの値は８．５×１０^-7Ｍである。

【００６２】実施例４：共焦点顕微鏡を用いたＮａ⁺，
Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼとＨＲＦの相互作用の実験 ＣＯＳ−７細胞を、Ｃａ²⁺及びＭｇ²⁺を含有する３．７
％ホルムアルデヒドで10分間固定させた後、０．１％サ
ポニンを含有するマウスモノクローナル抗ＨＲＦ抗体
（１：１００）（梨花女子大学抗体センター）および／
またはウサギポリクローナル抗Ｎａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアー
ゼ抗体（１：１００）を1時間、室温で加え染色した。
次いで、抗マウス−ＦＩＴＣ（１：１００）及び２次抗
体の抗ウサギ−ローダミン抗体（１：１００）と３０分
間培養した。その後、抗漂白剤溶液を加えてから、レー
ザー共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳＮＴ ｓｙｓｔｅ
ｍ）で観察した。その結果を図５に示した。

【００６３】実施例５：ＨＲＦの細胞膜透過能の測定実
験 ｐＲＳＥＴ−Ａベクターに、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖
反応）により増幅したラットＨＲＦ全長配列（Ｃｈｉｔ
ｐａｔｉｍａ ｅｔ ａｌ．、１９８８）をクローニング
した後、Ｅ．ｃｏｌｉ内で過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ）させた。発現された組換えタンパク質をＨ
ｉｓ−結合Ｎｉカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用い精製
し、ＣＯＳ−７細胞培養液に加えた後、ＣＯＳ−７細胞
を、Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺を含有する３．７％ホルムアル
デヒドで１０分間固定した。その後、０．１％サポニン
を含有する抗Ｈｉｓモノクロナール抗体（１：１００）
を１時間、室温で加え染色した。次いで、２次抗体の抗
マウス−ＦＩＴＣ（１：１００）とともに３０分間培養
した。その後、抗漂白剤溶液を加えレーザー共焦点顕微
鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳＮＴ ｓｙｓｔｅｍ）で観察し
た。

【００６４】また、１００ｍｍ培養プレートで培養した
ＣＯＳ−７細胞を前記の方法で処理した後、夫々細胞質
と細胞膜部分に分離し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに
ローディングし、抗Ｈｉｓモノクローナル抗体を用いて
ウエスタンブロッティングを行った。

【００６５】その結果を図６（ａ）および図６（ｂ）に
示す。図６より、ＨＲＦを加えて１分後にＨＲＦが細胞
内で検出されることを確認した。

【００６６】実施例６：ＨＲＦが細胞内のＮａ⁺濃度に
及ぼす影響の測定実験 ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を３．０×１０⁵〜１．０×１０⁶ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で２４ウエルプレートにローディ
ングした後、３７℃で１８時間培養した。各ウエルに、
最終濃度が８Ｍになるように、Ｈａｍｓ Ｆ−１２培地
（フェノールレッドまたは血清欠乏２ｍＭ炭酸水素ナト
リウムおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３）と染料
のナトリウムグリーンテトラアセテート（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を混合し、
細胞にローディングした（Ａｍｏｒｉｎｏ ａｎｄ Ｆｏ
ｘ、１９９５）。その後、ラットＩｇＥ（Ｓｅｒｏｔｅ
ｃ）を０．２ｇ／ｍｌで４５〜６０分間感作させた後、
約２０〜６０分間、室温で培養してからＦ−１２培地で
３回洗浄した。次いで、ヒスタミン放出緩衝液に含まれ
たＨＲＦ（１０〜２０ｇ／ｍｌ）を加えた後、４８５／
５３０ｎｍで１５分間、マイクロタイターリーダー（Ｆ
Ｌ６００、Ｂｉｏ−ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，
Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）で蛍光強度を測定
した。その際、目盛り用に、Ｓｉｇｍａ社のグラミシジ
ンＤ（ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ Ｄ）を用いて、Ｎａ⁺とＫ
⁺を適正濃度に混合した溶液を測定した（Ａｍｏｒｉｎ
ｏａｎｄ Ｆｏｘ，１９９５）。その結果を図７に示
す。図７より、ＨＲＦが細胞内Ｎａ⁺濃度を増加させる
ことを確認した。

【００６７】実施例７：ＨＲＦによるＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴ
Ｐアーゼ活性の阻害実験 ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を前記実施例６と同様の方法で培養
および感作させた後、クレプス−リンガー緩衝液（Ｋｒ
ｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ ｂｕｆｆｅｒ；ＫＲＰ，１４０
ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ
₄，１ｍＭ ＭｇＳＯ₄、１．４ｍＭ ＣａＣｌ₂、２．５
ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。次い
で、細胞を３７℃で１５分間培養した後、１ｍＭウワバ
インを含有した０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
含有のＫＲＰ緩衝液を加えた。⁸⁶Ｒｂ⁺（０．５Ｃｉ／
ｍｌ，ＮＥＮ）をトレーサーとして用いて５〜１０分間
培養し、１０〜２０ｇ／ｍｌのＨＲＦを加えた後、５、
１０、１５分後のＫ⁺の消費を夫々測定した。その結果
を図８に示す。図８より、ＨＲＦがＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰ
アーゼの活性度を、夫々１０．８％、４０．４％、５
０．７％に減少させることを確認した。

【００６８】実施例８：ＨＲＦが細胞内Ｃａ²⁺濃度に及
ぼす影響の測定実験 ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を前記実施例６と同様の方法で培養
した後、クレプス−リンガー緩衝液（ＫＲＰ，１２５ｍ
Ｍ ＮａＣｌ，１．２ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、１．２ｍＭ Ｍ
ｇＳＯ₄，６ｍＭグルコース、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、２５
ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）で洗浄した。次いで、
２μＭ Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒ
ｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と０．２％ＢＳＡを含
有したＫＲＨ緩衝液で３０分間培養した後、ＤＭＥＭ完
全培地で１０〜３０分間補正した。次いで、ＫＲＨ緩衝
液で洗浄し、前記実施例６に記載の方法で感作させた。
感作後、ＨＲＦ、抗ＩｇＥ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、各阻害
剤をヒスタミン放出緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、
０．４ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ ＫＣｌ、５．６ｍＭグ
ルコース、０．１％ＢＳＡ、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐ
Ｈ７．４）と共にカルシウムイオンの存在下又は不在下
で処理した。なお、４８８／５１５ｎｍにおけるｆｌｕ
ｏ−３ＡＭの蛍光強度を、レーザースキャーニング共焦
点顕微鏡で測定し、その結果を図９（ａ）に示した。

【００６９】また、細胞内のＲＯＳを２′，７′−ジク
ロロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ−ＤＡ）を
用いてレーザースキャーニング共焦点顕微鏡で測定し
た。即ち、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞をＩｇＥの存在または不
在下で、完全ＤＭＥＭ培地で１時間培養した。次いで、
クレプス−リンガー溶液で洗浄した後、５μＭ ＤＣＦ
Ｈ−ＤＡを含有したクレプス−リンガー溶液中で５分間
培養した。その後、４８８／５１５ｎｍで蛍光をスキャ
ーニングしながら観察した。その結果を図９（ｂ）およ
び図９（ｃ）に示した。

【００７０】以上の結果より、ＨＲＦにより細胞内のＣ
ａ²⁺濃度が増加し、その際、Ｎａ／Ｃａ交換体により細
胞外のＣａ²⁺が消費され（図９（ａ）参照）、ＩｇＥの
存在下ではＲＯＳが生成され、それにより細胞内Ｃａ²⁺
が一層増加する（図９（ｂ）および図９（ｃ）参照）こ
とを確認した。

【００７１】実施例９：ＨＲＦによるＣａ²⁺の増加とヒ
スタミン分泌との関係の確認実験 ｐＲＳＥＴ−Ａベクターに、ＰＣＲで増幅したラットＨ
ＲＦ全長配列（Ｃｈｉｔｐａｔｉｍａ ｅｔ ａｌ．、１
９８８）をクローニングした後、Ｅ．ｃｏｌｉで過発現
させた。発現された組換えタンパク質をＨｉｓ−結合Ｎ
ｉカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて精製し、ＲＢＬ−
２Ｈ３細胞を刺激するのに使用した。ＲＢＬ−２Ｈ３を
１×１０⁶細胞を２４−ウエルプレート上で増殖させた
後、ラットＩｇＥ抗体（０．２μｇ／ｍｌ、Ｓｅｒｏｔ
ｅｃ）で４５〜６０分間感作させ、組換えＨＲＦタンパ
ク質２０μｇ／ｍｌと前記阻害剤で夫々処理した。以上
より得られたサンプルを、ＲＩＡ−分析キット（Ｉｍｍ
ｕｎｏｔｅｃｈ，フランス）を用いてアシル化ヒスタミ
ンに調製した後、¹²⁵Ｉ−アシル化ヒスタミン及びモノ
クローナル抗体に競合的に結合させた。その後、該サン
プルを再びγ−計数器で測定し、その結果を図１０に示
した。図１０より、ＩｇＥの存在下、細胞内Ｃａ²⁺濃度
が増加すると、ＨＲＦによりヒスタミンが放出されるこ
とを確認した。

【００７２】実施例１０：ＨＲＦに結合するファージデ
ィスプレーペプチドクローンの分離 ＨＲＦをウエルに固定した後、ＨＲＦ−ヘプタマーラン
ダムリピートペプチドライブラリー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）から、親和性に基づ
くスクリーニングによりＨＲＦに結合できるペプチドを
分離した。

【００７３】すなわち、コーティング緩衝液（０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ₃、ｐＨ８．６）に２０μｇ／ｍｌの濃度で
溶解したＨＲＦ５０μｌずつをポリスチレンマイクロタ
イタープレートに加え、４℃で一晩コーティングした
後、ＢＳＡで非特異的結合を遮断した。その後、０．１
％Ｔｗｅｅｎ／ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で６回洗浄してか
ら、ファージディスプレーペプチドライブラリーの原液
１０μｌを３％ＢＳＡ／ＴＢＳ４０μｌで希釈した溶液
を加え、静置した。５分間放置後、ＴＢＳＴを用いて、
次の要領で洗浄（ｐａｎｎｉｎｇ）した。第一洗浄では
一回、第2および第３洗浄では５回、第４洗浄では１０
回行った。 次いで、グリシン／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
２．２）５０μｌを加えて５分間放置した後、ファージ
を溶出してから、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．
１）８μｌで中和した。

【００７４】溶出してきたファージ溶液を２０ｍｌのＥ
Ｒ２５３７培養液（ＯＤ₆₀₀＝０．５〜１）に添加し、
３７℃の攪拌インキュベータ（２００ｒｐｍ）上で２時
間培養した後、ＳＢ培地１００ｍｌを加え２５０ｒｐｍ
で一晩培養した。この培養液を１０,０００ｒｐｍ（４
℃）で５分間遠心して得られた上清液１００ｍｌに、３
０ｍｌの５×ＰＥＧ／ＮａＣｌ［２０％ＰＥＧ（ｗ／
ｖ）、１５％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）］を加え５分間溶解さ
せてから氷中に３０分間静置した。次いで、１０,００
０ｒｐｍ（４℃）で２０分間遠心し、その上清液をすべ
て取り除き、ペレットを３％ＢＳＡ／ＴＢＳ １ｍｌに
浮遊させた。その後、１４,０００ｒｐｍで５分間遠心
し、その上清液を次の洗浄（ｐａｎｎｉｎｇ）に使用し
た。親和性による精製とファージクローニングを４回繰
り返し、溶出ファージの滴定プレートより、夫々のファ
ージクローンを得た。ＥＬＩＳＡ分析で特異的親和度を
示したファージクローンのみについて配列分析し、その
アミノ酸配列を同定した。 図１１に前記ＨＲＦ結合ペ
プチドをコードする遺伝子の分離過程を概略的に示し
た。また、ＨＲＦに対して優勢的な結合を示すファージ
ディスプレーペプチドを下記の表１に示す。

【００７５】

【表１】

【００７６】実施例１１：ファージＥＬＩＳＡ分析 下記の通り、実施例１０より得られたファージの結合親
和度を、以下の様にしてＥＬＩＳＡで比較した。

【００７７】即ち、ＳＢ培地で培養したＥＲ２５３７培
養液（ＯＤ₆₀₀＝０．５〜１）１ｍｌずつ分取した後、
各ファージプラークを移し、３７℃インキュベータ（２
５０ｒｐｍ）で５時間培養した。各培養液を１００μｌ
ずつ９００μｌのＳＢ培地に加え一晩培養した後、１
４,０００ｒｐｍで５分間、２回続けて遠心して得られ
た上清液をＥＬＩＳＡ分析のために使用した。

【００７８】分離した各ファージ溶液を同量の６％ＢＳ
Ａ／ＰＢＳで希釈した後、該希釈溶液を５０ｍｌずつ、
ＨＲＦまたはＢＳＡ（対照群）でコーティングしたウエ
ルに加え２時間静置した。その後、ＰＢＳＴで５回洗浄
してから、３％ＢＳＡ／ＰＢＳに、１：５,０００の割
合で希釈したＨＲＰ−複合抗Ｍ１３抗体（ＨＲＰ−ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−Ｍ１３ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を１００ｍｌずつ加え１
時間静置した。次いで、ＰＢＳＴで６回、ＰＢＳで１回
洗浄した後、パーオキシダーゼ基質溶液を１００μｌず
つ加え、その発色度をＥＬＩＳＡリーダーを用いて４０
５ｎｍで測定した。その結果を図１２に示す。、図１２
より、本発明のファージｐｈ１、ｐｈ２およびｐｈ４、
とりわけｐｈ２およびｐｈ４がＨＲＦに特異的に結合す
ることを確認した。

【００７９】実施例１２：濃度によるＨＲＦとファージ
クローンの結合親和性の測定 ＨＲＦの濃度を２０μｇ／ｍｌから１／５倍に連続希釈
した後（即ち、夫々２０、４、０．８、０．１６、０．
０３２μｇ／ｍｌ）、各希釈液を５０μｌずつとりプラ
スチックウエルに固定した。また、このウエルに前記同
様に、１／５倍で連続希釈したファージｐｈ２溶液（原
液の１／２、１／１０、１／５０、１／２５０、１／１
２５０）を加え、ＥＬＩＳＡ分析を行い、４０５ｎｍで
その発色度を測定した。その結果を図１３に示す。図１
３より本発明のファージｐｈ２クローンが、ＨＲＦを
０．４，０．０８，０．０１６，０．０３２μｇ／ｍｌ
まで希釈した場合でも、ＨＲＦと特異的な結合親和性を
維持していることを確認した。

【００８０】実施例１３：競争結合分析 ａ） ＥＬＩＳＡ分析を通じて、特異的親和度を示すフ
ァージクローン（ｐｈ２およびｐｈ４）の配列を分析
し、その配列を確認した後、ヘプタマーペプチド（ｐ２
およびｐ４）を製造した。なお、陰性対照群として、ラ
ンダムペプチド（ｒａｎ，アミノ酸配列：ＬＭＥＧＣＲ
Ａ）を合成した。ＨＲＦでコーティングしたウエルに、
１,０００ｎＭ ペプチド溶液を６％ＢＳＡ／ＰＢＳで希
釈した溶液（１／１０倍で連続希釈；１,０００、１０
０、１０、１、０．１、０．０１、０．００１ ｎＭ）
を３０μｌずづ加え室温で３０分間静置した後、各ウエ
ルに１／２５倍で希釈したファージ溶液（原液）を加
え、さらに２時間静置した。その後、プレートをＰＢＳ
Ｔで５回洗浄してから、各ウエルにＨＲＰ−複合抗Ｍ１
３抗体を１００μｌずつ加え１時間静置した。再び、Ｐ
ＢＳＴで６回、ＰＢＳで１回洗浄した後、各ウエルにパ
ーオキシダーゼ基質溶液を１００μｌずつ加え、その発
色度より競合の有無を確認した。その結果を図１４
（ａ）および１４（ｂ）に示す。図１４（ａ）及び図１
４（ｂ）より、合成ペプチドｐ２およびｐ４は、ＨＲＦ
との結合において、夫々ファージクローンｐｈ２および
ｐｈ４と競合していることを確認した。

【００８１】ｂ） ｐ１、ｐ２およびｐ４がＨＲＦの同
一部位に結合するか否かを試験するため、前記ａ）と実
質的に同一の方法により、各ウエルをＨＲＦでコーティ
ングし、ｐｈ２に対するｐ１、ｐ２およびｐ４の競争結
合の分析を行った。その結果を図１４（ｃ）に示す。図
１４（ｃ）より、ｐ１、ｐ１およびｐ４がすべてＨＲＦ
の同一部位に結合することを確認した。

【００８２】実施例１４：ＨＲＦ結合ペプチドのアミノ
酸配列変位 本発明のヘプタマーペプチドのＨＲＦ結合親和度に関与
する残基を確認するため、ｐ２のアミノ酸配列を１個ず
つアラニン（Ａ）で置換した。但し、ｍ５の場合のみリ
ジン（Ｋ）で置換した（表２参照）。

【００８３】

【表２】

【００８４】前記ペプチドのＨＲＦ結合親和度を、実施
例１１と実質的に同一の方法で測定した。その結果を図
１５に示す。図１５より、ＨＲＦ結合親和度が、ｐ２、
ｍ６＞ｍ７＞ｍ３＞ｍ２＞ｍ５＞ｍ１＞ｍ４であること
を確認した。

【００８５】実施例１５：ヒスタミン分泌の測定 ｐＲＳＥＴ−Ａベクターに、ＰＣＲで増幅したラットＨ
ＲＦ全長配列（Ｃｈｉｔｐａｔｉｍａ ｅｔ ａｌ．、１
９８８）をクローニングした後、Ｅ．ｃｏｌｉで過発現
させた。発現された再組換えタンパク質をＨｉｓ−結合
Ｎｉカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ）で精製し、ＲＢＬ−２Ｈ
３細胞を刺激するのに使用した。ＲＢＬ−２Ｈ３を２４
−ウエルで増殖（１×１０⁶細胞）させた後、ラットＩ
ｇＥ抗体（０．２μｇ／ｍｌ、Ｓｅｒｏｔｅｃ）で４５
〜６０分間感作した後、２０μｇ／ｍｌの組換えタンパ
ク質で処理した（陽性対照群）。 その後、前記細胞に
ヘプタマーペプチドｐ１およびｐ２を容量依存的方法で
処理した。また、組換えＨＲＦタンパク質とペプチドｐ
１、ｐ２、ｐ４およびｍ１〜ｍ７を、夫々ＨＲＦと同様
に２０μｇ／ｍｌの濃度で処理した。

【００８６】得られたサンプルを、ＲＩＡ−分析キット
（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，フランス）を用いて、アシル
化ヒスタミンに調製した後、¹²⁵Ｉ−アシル化ヒスタミ
ンと共にモノクローナル抗体に競合結合させた。このサ
ンプルを再びγ−計数器で測定し、その結果を図１６お
よび図１７に示した。図１６から、配列番号１４のペプ
チド（ｐ２）をＲＢＬ−２Ｈ３細胞に加えた場合、０．
０１μｇ／ｍｌ以上の濃度より、配列１４のペプチド
（ｐ２）がＨＲＦによるヒスタミンの放出を阻害するこ
とがわかった。また、図１７に示された通り、ｐ１、ｐ
２、ｐ４およびｍ１〜ｍ７を２０μｇ／ｍｌ加えた際、
ｍ２＞ｍ５＞ｍ４＞ｐ２＞ｍ３＞ｐ１=ｐ４＞ｍ１＞ｍ
７の順でＨＲＦによるヒスタミン分泌を阻害し、ｍ６の
場合は、逆にヒスタミン分泌を増加させていることを確
認した。

【００８７】実施例１６：神経伝達物質の放出に対する
ＨＲＦの影響の分析 ＨＲＦが酵素Ｎａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼの抑制物質とし
て作用し、神経伝達物質の放出を増加させることが可能
であるかを調べた。まず、ＰＣ１２細胞（Ａｂｕ−Ｒａ
ｙａ ｅｔ ａｌ．、１９９９）の培養液にＨＲＦを加
え、基底状態およびＫ⁺−脱分極状態で誘導される
［³Ｈ］−標識ドーパミンの放出変化を測定した。ＰＣ
１２細胞としては、パッセージナンバー５〜１５より得
られた細胞を用い、該細胞を１０％ウマ血清、５％ウシ
胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレ
プトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）が添加されたＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地で５％ＣＯ₂の供給下、３７℃で培養
した。

【００８８】［³Ｈ］−ドーパミンの放出を測定するた
め、実験一日前、ポリ−Ｌ−リジン（１０μｇ／ｍｌ）
でコーティングされた１２ウエルプレートに、細胞（１
×１０―⁶細胞／ウエル）を培養し、［³Ｈ］−ドーパミ
ン（０．５μＣｉ／ｍｌ）が含まれた新たな培地にロー
ディングし、さらに３７℃で３時間培養した。各ウエル
をＰＢＳ（１×）１ｍｌで２〜３回洗浄した後、クレプ
スリンガー（ＫＲ）緩衝液（１２５ｍＭ ＮａＣｌ、５
ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、１０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ₄、１．２mM ＫＨ₂ＰＯ₄、６
ｍＭ グルコース、５ｍＭ ＮａＨＣＯ₃）にアスコルビ
ン酸（０．２ｍｇ／ｍｌ）、パルジリン（０．６ｍｇ／
ｍｌ）およびデスピラミン（ｄｅｓｐｉｒａｍｉｎｅ）
（２μＭ）を加え、該混合液をＨＲＦと共に１ｍｌずつ
ローディングした後、３７℃で２０分間反応させた。脱
分極状態での放出は５０ｍＭのＫＣｌが含有されたＫＲ
緩衝液で測定した。また、Ｃａ²⁺欠乏培地はＣａＣｌ₂
を取り除き、０．５ｍＭのＥＧＴＡを加えて調製したＫ
Ｒ緩衝液で測定した。

【００８９】反応の終了後、培養液を４℃、１,０００
×ｇで１０分間遠心し、放出されたドーパミンの放射能
を測定し、細胞を０．５Ｎ ＮａＯＨで可溶化した後、
組織内の放射能を測定した。ドーパミンの放出率（％）
は、下式により計算した。 ［上精液の放射能／（上精液の放射能＋組織内の放射
能）×１００］

【００９０】結果を図２３に示す。図２３より、神経類
似細胞のＰＣ１２細胞で、ドーパミンの基底放出が、Ｈ
ＲＦの濃度に依存して増加することがわかる。すなわ
ち、１０μｇのＨＲＦで処理した場合には、細胞外のＫ
⁺濃度の増加によって誘導される脱分極時の興奮性放出
と同等程度にドーパミンの放出を促進させた。また、３
０μｇ以上のＨＲＦで処理した場合には、ドーパミンの
放出が急激に増加し、細胞が培養容器の底に付着せず、
死滅することが観察された。一方、ＨＲＦは高濃度の細
胞外のＫ⁺により誘導される脱分極時の興奮性放出も濃
度依存的に増加させ、ＨＲＦ濃度に従ったドーパミンの
放出増加反応が基底放出増加反応と比べて、左側にシフ
トする様子を示したが、ドーパミン放出の増加の程度
は、ＨＲＦによる基底放出増加の度合と比べ相対的に小
さかった。

【００９１】実施例１７：ＨＲＦ結合ペプチドのＨＲＦ
による神経伝達物質放出抑制実験 前記ＨＲＦによるヒスタミンの放出を遮断するペプチド
が、神経細胞においてもＨＲＦにより誘導された神経伝
達物質の放出を遮断するか否かを確認するために、実施
例１６と実質的に同様の方法で、ＨＲＦにより増加した
ドーパミンの放出に対する配列番号１４のペプチドｐ２
の影響を分析した。

【００９２】その結果を図２４に示す。図２４から、配
列番号１４のペプチド６０μｇ／ｍｌ存在下では、ＨＲ
Ｆ１５μｇ／ｍｌにより約１１０％程度増加したドーパ
ミンの放出が、約６０％程度抑制されたことがわかる。
従って、前記ＨＲＦ結合ペプチドは、神経細胞内で、Ｈ
ＲＦにより増加された神経伝達物質の放出を効果的に遮
断することを確認できた。

【００９３】

【発明の効果】本発明により、ＨＲＦ受容体の実体とＨ
ＲＦの好塩基球におけるヒスタミン放出を促進する作用
機構を始めて究明できた。したがって、本発明のＨＲＦ
の受容体の作用機構と優れた薬物動態学的安定性を示す
ＨＲＦ結合ペプチドを用い、細胞内でのヒスタミン分泌
を効果的に阻害することにより、動物を含めてヒトの喘
息；鼻炎；痰麻疹；アナフィラキシー；アレルギー性気
管支拡張症；食物、薬物、花粉または虫によるアレルギ
ー；花粉症；寒冷じん麻疹；またはアトピー性皮膚炎等
のようなアレルギー疾患を予防、治療および診断するこ
とができる。

【００９４】また、Ｎａ⁺、Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼ活性の細
胞内調節に関与するＨＲＦは、神経細胞においても神経
活性に大切な役割を果たすＮａ⁺、Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼを
抑制することにより神経伝達物質の放出を促進させ、そ
の結果、神経細胞および脳で現れる病態生理学的効果に
大きい働きをすると信じられる。したがって、ＨＲＦに
よる神経伝達物質の放出増加作用を遮断する本発明のペ
プチドは、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病
等の様々なアポトーシス関連神経疾患の診断、予防およ
び治療剤として有用に用いられる。

【００９５】さらに、ＨＲＦ受容体またはＨＲＦ結合ペ
プチドは、マラリアの診断、予防及び治療にも用いるこ
とができる。さらにまた、ＨＲＦ受容体やＨＲＦ結合ペ
プチドを前駆体にして様々な非ペプチド誘導物質を製造
することもできる。

【００９６】

【配列表】 <110> LEE, Kyunglim <120> IgE-dependent histamine-releasing factor(HRF) receptor, HRF- binding peptides, nucleic acids encoding the same, and uses thereof <130> PC01-0144-LKR <150> KR10-2000-0030130 <151> 2000-06-01 <160> 22 <170> KOPATIN 1.71 <210> 1 <211> 446 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 1 Val Ala Asn Val Pro Glu Val Leu Leu Ala Thr Val Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ala Lys Arg Met ala Arg Lys Asn Cys Leu Val Lys Asn 20 25 30 Leu Glu Ala Val Glu Thr Leu Gly Ser Thr Ser Thr Ile Cys Ser Asp 35 40 45 Lys Thr Gly Thr Leu Thr Gln Asn Arg Met Thr Val Ala His Met Trp 50 55 60 Phe Asp Asn Gln Ile His Glu Ala Asp Thr Thr Glu Asn Gln Ser Gly 65 70 75 80 Val Ser Phe Asp Lys Thr Ser Ala Thr Trp Phe Ala Leu Ser Arg Ile 85 90 95 Ala Gly Leu Cys Asn Arg Ala Val Phe Gln Ala Asn Gln Glu Asn Leu 100 105 110 Pro Ile Leu Lys Arg Ala Val Ala Gly Asp Ala Ser Glu Ser Ala Leu 115 120 125 Leu Lys Cys Ile Glu Val Cys Cys Gly Ser Val Met Glu Met Arg Glu 130 135 140 Lys Tyr Thr Lys Ile Val Glu Ile Pro Phe Asn Ser Thr Asn Lys Tyr 145 150 155 160 Gln Leu Ser Ile His Lys Asn Pro Asn Ala Ser Glu Pro Lys His Leu 165 170 175 Leu Val Met Lys Gly Ala Pro Glu Arg Ile Leu Asp Arg Cys Ser Ser 180 185 190 Ile Leu Leu His Gly Lys Glu Gln Pro Leu Asp Glu Glu Leu Lys Asp 195 200 205 Ala Phe Gln Asn Ala Tyr Leu Glu Leu Gly Gly Leu Gly Glu Arg Val 210 215 220 Leu Gly Phe Cys His Leu Leu Leu Pro Asp Glu Gln Phe Pro Glu Gly 225 230 235 240 Phe Gln Phe Asp Thr Asp Glu Val Asn Phe Pro Val Asp Asn Leu Cys 245 250 255 Phe Val Gly Leu Ile Ser Met Ile Asp Pro Pro Arg Ala Ala Val Pro 260 265 270 Asp Ala Val Gly Lys Cys Arg Ser Ala Gly Ile Lys Val Ile Met Val 275 280 285 Thr Gly Asp His Pro Ile Thr Ala Lys Ala Ile Ala Lys Gly Val Gly 290 295 300 Ile Ile Ser Glu Gly Asn Glu Thr Val Glu Asp Ile Ala Ala Arg Leu 305 310 315 320 Asn Ile Pro Val Asn Gln Val Asn Pro Arg Asp Ala Lys Ala Cys Val 325 330 335 Val His Gly Ser Asp Leu Lys Asp Met Thr Ser Glu Glu Leu Asp Asp 340 345 350 Ile Leu Arg Tyr His Thr Glu Ile Val Phe Ala Arg Thr Ser Pro Gln 355 360 365 Gln Lys Leu Ile Ile Val Glu Gly Cys Gln Arg Gln Gly Ala Ile Val 370 375 380 Ala Val Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Lys Lys Ala 385 390 395 400 Asp Ile Gly Val Ala Met Gly Ile Val Gly Ser Asp Val Ser Lys Gln 405 410 415 Ala Ala Asp Met Ile Leu Leu Asp Asp Asn Phe Ala Ser Ile Val Thr 420 425 430 Gly Val Glu Glu Gly Arg Leu Ile Phe Asp Asn Leu Lys Lys 435 440 445 <210> 2 <211> 446 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 2 Val Ala Asn Val Pro Glu Gly Leu Leu Ala Thr Val Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ala Lys Arg Met ala Arg Lys Asn Cys Leu Val Lys Asn 20 25 30 Leu Glu Ala Val Glu Thr Leu Gly Ser Thr Ser Thr Ile Cys Ser Asp 35 40 45 Lys Thr Gly Thr Leu Thr Gln Asn Arg Met Thr Val Ala His Met Trp 50 55 60 Phe Asp Asn Gln Ile His Glu Ala Asp Thr Thr Glu Asp Gln Ser Gly 65 70 75 80 Ala Thr Phe Asp Lys Arg Ser Pro Thr Trp Thr Ala Leu Ser Arg Ile 85 90 95 Ala Gly Leu Cys Asn Arg Ala Val Phe Lys Ala Gly Gln Glu Asn Ile 100 105 110 Ser Val Ser Lys Arg Asp Thr Ala Gly Asp Ala Ser Glu Ser Ala Leu 115 120 125 Leu Lys Cys Ile Glu Leu Ser Cys Gly Ser Val Arg Lys Met Arg Asp 130 135 140 Arg Asn Pro Lys Val Ala Glu Ile Pro Phe Asn Ser Thr Asn Lys Tyr 145 150 155 160 Gln Leu Ser Ile His Glu Arg Glu Asp Xaa Ser Pro Gln Ser His Val 165 170 175 Leu Val Met Lys Gly Ala Pro Glu Arg Ile Leu Asp Arg Cys Ser Thr 180 185 190 Ile Leu Val Gln Gly Lys Glu Ile Pro Leu Asp Lys Glu Met Gln Asp 195 200 205 Ala Phe Gln Asn Ala Tyr Met Glu Leu Gly Gly Leu Gly Glu Arg Val 210 215 220 Leu Gly Phe Cys Gln Leu Asn Leu Pro Ser Gly Lys Phe Pro Arg Gly 225 230 235 240 Phe Lys Phe Asp Thr Asp Glu Leu Asn Phe Pro Thr Glu Lys Leu Cys 245 250 255 Phe Val Gly Leu Met Ser Met Ile Asp Pro Pro Arg Ala Ala Val Pro 260 265 270 Asp Ala Val Gly Lys Cys Arg Ser Ala Gly Ile Lys Val Ile Met Val 275 280 285 Thr Gly Asp His Pro Ile Thr Ala Lys Ala Ile Ala Lys Gly Val Gly 290 295 300 Ile Ile Ser Glu Gly Asn Glu Thr Val Glu Asp Ile Ala Ala Arg Leu 305 310 315 320 Asn Ile Pro Val Ser Gln Val Asn Pro Arg Glu Ala Lys Ala Cys Val 325 330 335 Val His Gly Ser Asp Leu Lys Asp Met Thr Ser Glu Gln Leu Asp Glu 340 345 350 Ile Leu Arg Asp His Thr Glu Ile Val Phe Ala Arg Thr Ser Pro Gln 355 360 365 Gln Lys Leu Ile Ile Val Glu Gly Cys Gln Arg Gln Gly Ala Ile Val 370 375 380 Ala Val Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Lys Lys Ala 385 390 395 400 Asp Ile Gly Ile Ala Met Gly Ile Ser Gly Ser Asp Val Ser Lys Gln 405 410 415 Ala Ala Asp Met Ile Leu Leu Asp Asp Asn Phe Ala Ser Ile Val Thr 420 425 430 Gly Val Glu Glu Gly Arg Leu Ile Phe Asp Asn Leu Lys Lys 435 440 445 <210> 3 <211> 446 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 3 Val Ala Asn Val Pro Glu Gly Leu Leu Ala Thr Val Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ala Lys Arg Met ala Arg Lys Asn Cys Leu Val Lys Asn 20 25 30 Leu Glu Ala Val Glu Thr Leu Gly Ser Thr Ser Thr Ile Cys Ser Asp 35 40 45 Lys Thr Gly Thr Leu Thr Gln Asn Arg Met Thr Val Ala His Met Trp 50 55 60 Phe Asp Asn Gln Ile His Glu Ala Asp Thr Thr Glu Asp Gln Ser Gly 65 70 75 80 Thr Ser Phe Asp Lys Ser Ser His Thr Trp Val Ala Leu Ser His Ile 85 90 95 Ala Gly Leu Cys Asn Arg Ala Val Phe Lys Gly Gly Gln Asp Asn Ile 100 105 110 Pro Val Leu Lys Arg Asp Val Ala Gly Asp Ala Ser Glu Ser Ala Leu 115 120 125 Leu Lys Cys Ile Glu Leu Ser Ser Gly Ser Val Lys Leu Met Arg Glu 130 135 140 Arg Asn Lys Lys Val Ala Glu Ile Pro Phe Asn Ser Thr Asn Lys Tyr 145 150 155 160 Gln Leu Ser Ile His Glu Thr Glu Asp Pro Asn Asp Asn Arg Tyr Leu 165 170 175 Leu Val Met Lys Gly Ala Pro Glu Arg Ile Leu Asp Arg Cys Ala Thr 180 185 190 Ile Leu Leu Gln Gly Lys Glu Gln Pro Leu Asp Glu Glu Met Lys Glu 195 200 205 Ala Phe Gln Asn Ala Tyr Leu Glu Leu Gly Gly Leu Gly Glu Arg Val 210 215 220 Leu Gly Phe Cys His Tyr Tyr Leu Pro Glu Glu Gln Phe Pro Lys Gly 225 230 235 240 Phe Ala Phe Asp Cys Asp Asp Val Asn Phe Thr Thr Asp Asn Leu Cys 245 250 255 Phe Val Gly Leu Met Ser Met Ile Asp Pro Pro Arg Ala Ala Val Pro 260 265 270 Asp Ala Val Gly Lys Cys Arg Ser Ala Gly Ile Lys Val Ile Met Val 275 280 285 Thr Gly Asp His Pro Ile Thr Ala Lys Ala Ile Ala Lys Gly Val Gly 290 295 300 Ile Ile Ser Glu Gly Asn Glu Thr Val Glu Asp Ile Ala Ala Arg Leu 305 310 315 320 Asn Ile Pro Val Ser Gln Val Asn Pro Arg Asp Ala Lys Ala Cys Val 325 330 335 Ile His Gly Thr Asp Leu Lys Asp Phe Thr Ser Glu Gln Ile Asp Glu 340 345 350 Ile Leu Gln Asn His Thr Glu Ile Val Phe Ala Arg Thr Ser Pro Gln 355 360 365 Gln Lys Leu Ile Ile Val Glu Gly Cys Gln Arg Gln Gly Ala Ile Val 370 375 380 Ala Val Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Lys Lys Ala 385 390 395 400 Asp Ile Gly Val Ala Met Gly Ile Ala Gly Ser Asp Val Ser Lys Gln 405 410 415 Ala Ala Asp Met Ile Leu Leu Asp Asp Asn Phe Ala Ser Ile Val Thr 420 425 430 Gly Val Glu Glu Gly Arg Leu Ile Phe Asp Asn Leu Lys Lys 435 440 445 <210> 4 <211> 446 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Val Ala Asn Val Pro Glu Gly Leu Leu Ala Thr Val Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ala Lys Arg Met ala Arg Lys Asn Cys Leu Val Lys Asn 20 25 30 Leu Glu Ala Val Glu Thr Leu Gly Ser Thr Ser Thr Ile Cys Ser Asp 35 40 45 Lys Thr Gly Thr Leu Thr Gln Asn Arg Met Thr Val Ala His Met Trp 50 55 60 Phe Asp Asn Gln Ile His Glu Ala Asp Thr Thr Glu Asn Gln Ser Gly 65 70 75 80 Val Ser Phe Asp Lys Thr Ser Ala Thr Trp Leu Ala Leu Ser Arg Ile 85 90 95 Ala Gly Leu Cys Asn Arg Ala Val Phe Gln Ala Asn Gln Glu Asn Leu 100 105 110 Pro Ile Leu Lys Arg Ala Val Ala Gly Asp Ala Ser Glu Ser Ala Leu 115 120 125 Leu Lys Cys Ile Glu Leu Cys Cys Gly Ser Val Lys Glu Met Arg Glu 130 135 140 Arg Tyr Ala Lys Ile Val Glu Ile Pro Phe Asn Ser Thr Asn Lys Tyr 145 150 155 160 Gln Leu Ser Ile His Lys Asn Pro Asn Thr Ser Glu Pro Gln His Leu 165 170 175 Leu Val Met Lys Gly Ala Pro Glu Arg Ile Leu Asp Arg Cys Ser Ser 180 185 190 Ile Leu Leu His Gly Lys Glu Gln Pro Leu Asp Glu Glu Leu Lys Asp 195 200 205 Ala Phe Gln Asn Ala Tyr Leu Glu Leu Gly Gly Leu Gly Glu Arg Val 210 215 220 Leu Gly Phe Cys His Leu Phe Leu Pro Asp Glu Gln Phe Pro Glu Gly 225 230 235 240 Phe Gln Phe Asp Thr Asp Asp Val Asn Phe Pro Ile Asp Asn Leu Cys 245 250 255 Phe Val Gly Leu Ile Ser Met Ile Asp Pro Pro Arg Ala Ala Val Pro 260 265 270 Asp Ala Val Gly Lys Cys Arg Ser Ala Gly Ile Lys Val Ile Met Val 275 280 285 Thr Gly Asp His Pro Ile Thr Ala Lys Ala Ile Ala Lys Gly Val Gly 290 295 300 Ile Ile Ser Glu Gly Asn Glu Thr Val Glu Asp Ile Ala Ala Arg Leu 305 310 315 320 Asn Ile Pro Val Ser Gln Val Asn Pro Arg Asp Ala Lys Ala Cys Val 325 330 335 Val His Gly Ser Asp Leu Lys Asp Met Thr Ser Glu Gln Leu Asp Asp 340 345 350 Ile Leu Lys Tyr His Thr Glu Ile Val Phe Ala Arg Thr Ser Pro Gln 355 360 365 Gln Lys Leu Ile Ile Val Glu Gly Cys Gln Arg Gln Gly Ala Ile Val 370 375 380 Ala Val Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Lys Lys Ala 385 390 395 400 Asp Ile Gly Val Ala Met Gly Ile Ala Gly Ser Asp Val Ser Lys Gln 405 410 415 Ala Ala Asp Met Ile Leu Leu Asp Asp Asn Phe Ala Ser Ile Val Thr 420 425 430 Gly Val Glu Glu Gly Arg Leu Ile Phe Asp Asn Leu Lys Lys 435 440 445 <210> 5 <211> 446 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Val Ala Asn Val Pro Glu Gly Leu Leu Ala Thr Val Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ala Lys Arg Met ala Arg Lys Asn Cys Leu Val Lys Asn 20 25 30 Leu Glu Ala Val Glu Thr Leu Gly Ser Thr Ser Thr Ile Cys Ser Asp 35 40 45 Lys Thr Gly Thr Leu Thr Gln Asn Arg Met Thr Val Ala His Met Trp 50 55 60 Phe Asp Asn Gln Ile His Glu Ala Asp Thr Thr Glu Asp Gln Ser Gly 65 70 75 80 Ala Thr Phe Asp Lys Arg Ser Pro Thr Trp Thr Ala Leu Ser Arg Ile 85 90 95 Ala Gly Leu Cys Asn Arg Ala Val Phe Lys Ala Gly Gln Glu Asn Ile 100 105 110 Ser Val Ser Lys Arg Asp Thr Ala Gly Asp Ala Ser Glu Ser Ala Leu 115 120 125 Leu Lys Cys Ile Glu Leu Ser Cys Gly Ser Val Arg Lys Met Arg Asp 130 135 140 Arg Asn Pro Lys Val Ala Glu Ile Pro Phe Asn Ser Thr Asn Lys Tyr 145 150 155 160 Gln Leu Ser Ile His Glu Arg Glu Asp Xaa Ser Pro Gln Ser His Val 165 170 175 Leu Val Met Lys Gly Ala Pro Glu Arg Ile Leu Asp Arg Cys Ser Thr 180 185 190 Ile Leu Val Gln Gly Lys Glu Ile Pro Leu Asp Lys Glu Met Gln Asp 195 200 205 Ala Phe Gln Asn Ala Tyr Met Glu Leu Gly Gly Leu Gly Glu Arg Val 210 215 220 Leu Gly Phe Cys Gln Leu Asn Leu Pro Ser Gly Lys Phe Pro Arg Gly 225 230 235 240 Phe Lys Phe Asp Thr Asp Glu Leu Asn Phe Pro Thr Glu Lys Leu Cys 245 250 255 Phe Val Gly Leu Met Ser Met Ile Asp Pro Pro Arg Ala Ala Val Pro 260 265 270 Asp Ala Val Gly Lys Cys Arg Ser Ala Gly Ile Lys Val Ile Met Val 275 280 285 Thr Gly Asp His Pro Ile Thr Ala Lys Ala Ile Ala Lys Gly Val Gly 290 295 300 Ile Ile Ser Glu Gly Asn Glu Thr Val Glu Asp Ile Ala Ala Arg Leu 305 310 315 320 Asn Ile Pro Met Ser Gln Val Asn Pro Arg Glu Ala Lys Ala Cys Val 325 330 335 Val His Gly Ser Asp Leu Lys Asp Met Thr Ser Glu Gln Leu Asp Glu 340 345 350 Ile Leu Lys Asn His Thr Glu Ile Val Phe Ala Arg Thr Ser Pro Gln 355 360 365 Gln Lys Leu Ile Ile Val Glu Gly Cys Gln Arg Gln Gly Ala Ile Val 370 375 380 Ala Val Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Lys Lys Ala 385 390 395 400 Asp Ile Gly Ile Ala Met Gly Ile Ser Gly Ser Asp Val Ser Lys Gln 405 410 415 Ala Ala Asp Met Ile Leu Leu Asp Asp Asn Phe Ala Ser Ile Val Thr 420 425 430 Gly Val Glu Glu Gly Arg Leu Ile Phe Asp Asn Leu Lys Lys 435 440 445 <210> 6 <211> 446 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Val Ala Asn Val Pro Glu Gly Leu Leu Ala Thr Val Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Thr Val Thr Ala Lys Arg Met ala Arg Lys Asn Cys Leu Val Lys Asn 20 25 30 Leu Glu Ala Val Glu Thr Leu Gly Ser Thr Ser Thr Ile Cys Ser Asp 35 40 45 Lys Thr Gly Thr Leu Thr Gln Asn Arg Met Thr Val Ala His Met Trp 50 55 60 Phe Asp Asn Gln Ile His Glu Ala Asp Thr Thr Glu Asp Gln Ser Gly 65 70 75 80 Thr Ser Phe Asp Lys Ser Ser His Thr Trp Val Ala Leu Ser His Ile 85 90 95 Ala Gly Leu Cys Asn Arg Ala Val Phe Lys Gly Gly Gln Asp Asn Ile 100 105 110 Pro Val Leu Lys Arg Asp Val Ala Gly Asp Ala Ser Glu Ser Ala Leu 115 120 125 Leu Lys Cys Ile Glu Leu Ser Ser Gly Ser Val Lys Leu Met Arg Glu 130 135 140 Arg Asn Lys Lys Val Ala Glu Ile Pro Phe Asn Ser Thr Asn Lys Tyr 145 150 155 160 Gln Leu Ser Ile His Glu Thr Glu Asp Pro Asn Asp Asn Arg Tyr Leu 165 170 175 Leu Val Met Lys Gly Ala Pro Glu Arg Ile Leu Asp Arg Cys Ser Thr 180 185 190 Ile Leu Leu Gln Gly Lys Glu Gln Pro Leu Asp Glu Glu Met Lys Glu 195 200 205 Ala Phe Gln Asn Ala Tyr Leu Glu Leu Gly Gly Leu Gly Glu Arg Val 210 215 220 Leu Gly Phe Cys His Tyr Tyr Leu Pro Glu Glu Gln Tyr Pro Gln Gly 225 230 235 240 Phe Ala Phe Asp Cys Asp Asp Val Asn Phe Thr Thr Asp Asn Leu Cys 245 250 255 Phe Val Pro Leu Met Ser Met Ile Gly Pro Pro Arg Ala Ala Val Pro 260 265 270 Asp Ala Val Gly Lys Cys Arg Ser Ala Gly Ile Lys Val Ile Met Val 275 280 285 Thr Gly Asp His Pro Ile Thr Ala Lys Ala Ile Ala Lys Gly Val Gly 290 295 300 Ile Ile Ser Glu Gly Asn Glu Thr Val Glu Asp Ile Ala Ala Arg Leu 305 310 315 320 Asn Ile Pro Val Ser Gln Val Asn Pro Arg Asp Ala Lys Ala Cys Val 325 330 335 Ile His Gly Thr Asp Leu Lys Asp Phe Thr Ser Glu Gln Ile Asp Glu 340 345 350 Ile Leu Gln Asn His Thr Glu Ile Val Phe Ala Arg Thr Ser Pro Gln 355 360 365 Gln Lys Leu Ile Ile Val Glu Gly Cys Gln Arg Gln Gly Ala Ile Val 370 375 380 Ala Val Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Lys Lys Ala 385 390 395 400 Asp Ile Gly Val Ala Met Gly Ile Ala Gly Ser Asp Val Ser Lys Gln 405 410 415 Ala Ala Asp Met Ile Leu Leu Asp Asp Asn Phe Ala Ser Ile Val Thr 420 425 430 Gly Val Glu Glu Gly Arg Leu Ile Phe Asp Asn Leu Lys Lys 435 440 445 <210> 7 <211> 1338 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 7 gtagccaacg tgccggaagt tttgctggcc accgtcacgg tatgtctgac gctcactgcc 60 aagcgcatgg ccaggaagaa ctgcctggtg aagaacctgg aagctgtgga gaccttgggg 120 tccacatcca ccatctgctc cgacaagact ggaactctga ctcagaaccg gatgacagtg 180 gctcacatgt ggtttgacaa tcaaatccat gaagctgaca ccacagagaa tcagagtggg 240 gtctcctttg acaagacgtc agccacctgg ttcgctctgt ccagaattgc tggtctctgt 300 aacagggcag tgtttcaggc taaccaggaa aacctgccta tcctgaagcg tgcagtagcg 360 ggagatgctt ccgagtcggc gctcctaaag tgcatcgagg tctgctgtgg ctccgtgatg 420 gagatgaggg agaagtacac caagatagtg gagattcctt tcaactccac caacaagtac 480 cagctctcca ttcacaagaa cccaaacgca tcggagccta agcacctgct agtgatgaag 540 ggcgccccag aaaggatcct ggaccgatgc agttctatcc tcctccacgg caaggagcag 600 cccctggacg aagagctgaa ggacgccttt cagaatgcct acctggagct gggtggcctg 660 ggagaacgtg tgctaggttt ctgccacctc cttctgcctg acgaacagtt tcctgaaggc 720 ttccagtttg acactgatga agtcaatttc cccgtggata acctctgctt cgtgggtctt 780 atctccatga ttgaccctcc tcgagctgct gtccccgatg ctgtgggcaa atgccgcagc 840 gctgggatta aggtcatcat ggtcacagga gaccatccaa tcacagccaa agccattgct 900 aagggggtgg gcattatctc agaaggtaac gagaccgtgg aagacattgc tgcccgcctc 960 aacattccag tgaaccaggt gaaccccaga gatgccaagg cctgtgtagt acatggcagt 1020 gacttgaagg acatgacctc tgaggagctg gatgacattt tgcggtacca cacggagatt 1080 gtctttgcta ggacctctcc tcaacagaag ctcatcattg tggagggctg ccagcggcag 1140 ggtgccatcg tggctgtcac aggggatggt gtcaatgact ctccagcttt gaaaaaggca 1200 gatattgggg ttgccatggg gattgttggc tcggatgtgt ccaagcaagc tgctgacatg 1260 attcttctgg atgacaactt tgcctccatc gtgactggag tagaagaagg tcgtctgata 1320 tttgataact tgaagaaa 1338 <210> 8 <211> 1338 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 8 gtagccaacg tccccgaagg gctcttggcc actgttactg tgtgcctgac gctgacagcc 60 aagcgcatgg ctcgcaagaa ctgcctggtg aagaacctgg aggcggtgga gacgctgggc 120 tccacgtcca ccatctgctc ggacaagaca ggcaccctca cccagaaccg catgacggtg 180 gctcacatgt ggtttgacaa ccagatccat gaggctgaca ccactgaaga tcagtctggg 240 gccacttttg acaagcggtc cccgacgtgg acagccctgt ctcggatcgc tggtctctgc 300 aatcgtgccg tcttcaaggc tgggcaggag aacatctccg tgtctaagcg ggacacagct 360 ggtgacgcct ctgagtcagc tctgctcaag tgcatcgagt tgtcctgtgg ctcagtgagg 420 aagatgaggg acaggaatcc caaggtggca gaaattccct tcaactctac caacaaatat 480 cagctttcca tccatgagag ggaagacagc ccccagagcc atgtgctgnn ngtgatgaaa 540 ggtgccccgg agcgcatcct ggaccgatgc tctaccatcc tggtacaggg caaggagatc 600 cctcttgaca aggagatgca agatgccttt caaaacgcct acatggagct gggaggactc 660 ggggagcgag tgctgggctt ctgtcagctg aacctgcctt ctggaaagtt tcctcggggc 720 ttcaaatttg acacggatga gctgaacttt cccacagaga agctctgctt tgtggggctc 780 atgtctatga ttgatccccc cagagcagct gtgccagatg ctgtgggcaa gtgcagaagt 840 gcaggcatca aggtgatcat ggtgactggg gatcacccta tcacagccaa ggccattgcc 900 aaaggtgtgg gcatcatatc agagggtaac gagactgtgg aagacattgc agccaggctc 960 aacattcctg tgagtcaagt caatcccaga gaagccaagg catgtgtagt gcacggctca 1020 gacctgaagg acatgacttc agagcagctg gatgagatcc tcagggacca cacggagatc 1080 gtgtttgccc ggacctcccc tcagcagaag ctcatcattg tggagggctg tcagaggcag 1140 ggagccatcg tggcagtgac tggtgacggg gtgaacgact cccccgcgct gaagaaggct 1200 gacattggca ttgccatggg catctctggc tctgatgtct ctaagcaggc agctgacatg 1260 atccttctcg acgacaactt tgcctccatt gtgacgggcg tggaggaggg gcgcctgatc 1320 tttgacaacc tgaagaag 1338 <210> 9 <211> 1338 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 9 gtggccaatg tcccagaggg gctgctggct actgtcacgg tgtgtctgac gctgaccgcc 60 aagcgcatgg ctcggaagaa ctgtctggta aagaacctgg aggcggtgga gacgctaggc 120 tccacatcca ccatctgctc cgacaagacc ggcaccctca cccagaaccg catgaccgtc 180 gcccacatgt ggtttgacaa ccagatccac gaggccgaca ctactgagga tcagtcaggg 240 acctctttcg acaagagctc acacacctgg gtggccctgt cccacatcgc cggtctctgc 300 aaccgggctg tcttcaaggg cgggcaggat aacatccctg tactcaagag ggacgtggcg 360 ggtgatgcct cagagtccgc cctgcttaag tgcatcgagc tgtcctcggg ttccgtaaag 420 ctgatgcgcg aacgaaacaa gaaagtggcc gagattccct tcaactccac taacaaatac 480 cagctatcca tccatgagac tgaggacccc aatgacaacc gatacctgtt agtgatgaag 540 ggcgcccctg aacgcattct ggaccgctgt gcgaccatcc tcctgcaggg caaggagcag 600 cctctggatg aggagatgaa ggaggccttc cagaacgcct acctggagct tggtggcctg 660 ggcgagcgtg tgctgggttt ctgccattac tacctgccgg aggaacagtt ccccaagggc 720 tttgcctttg actgtgatga cgtgaacttc accacagaca acctttgctt cgtgggtctc 780 atgtccatga tcgaccctcc ccgggcagct gtccctgatg ctgtgggcaa atgccgcagt 840 gcaggcatca aggtcatcat ggtcaccggc gatcacccca tcactgcgaa ggccatcgcc 900 aaaggtgtag gcatcatctc cgagggtaac gagactgtgg aggacatcgc tgcccggctc 960 aacatccctg tcagccaggt caaccccagg gatgccaaag cctgtgtgat tcatggcacc 1020 gacctcaagg acttcacctc tgagcagatt gacgagatcc tacagaacca cactgagatc 1080 gtctttgccc gaacctcccc tcagcagaag ctcatcatcg tggagggctg tcagagacag 1140 ggagcaattg tggctgtgac tggcgatggt gtgaatgact cccctgctct gaagaaggct 1200 gatattgggg tggccatggg cattgctggc tctgatgtct ctaagcaggc tgccgacatg 1260 attctgctgg atgacaattt tgcttccatt gtcactggtg tggaggaagg ccgcctgatc 1320 tttgacaacc tgaagaaa 1338 <210> 10 <211> 1355 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gtagccaatg tgccggaagg tttgctggcc actgtcacgg tctgtctgac acttactgcc 60 aaacgcatgg caaggaaaaa ctgcttagtg aagaacttag aagctgtgga gaccttgggg 120 tccacgtcca ccatctgctc tgataaaact ggaactctga ctcagaaccg gatgacagtg 180 gcccacatgt ggtttgacaa tcaaatccat gaagctgata cgacagagaa tcagagtggt 240 gtctcttttg acaagacttc agctacctgg cttgctctgt ccagaattgc aggtctttgt 300 aacagggcag tgtttcaggc taaccaggaa aacctaccta ttcttaagcg ggcagttgca 360 ggagatgcct ctgagtcagc actcttaaag tgcatagagc tgtgctgtgg ttccgtgaag 420 gagatgagag aaagatacgc caaaatcgtc gagataccct tcaactccac caacaagtac 480 cagttgtcta ttcataagaa ccccaacaca tcggagcccc aacacctgtt ggtgatgaag 540 ggcgccccag aaaggatcct agaccgttgc agctctatcc tcctccacgg caaggagcag 600 cccctggatg aggagctgaa agacgccttt cagaacgcct atttggagct ggggggcctc 660 ggagaacgag tcctaggttt ctgccacctc tttctgccag atgaacagtt tcctgaaggg 720 ttccagtttg acactgacga tgtgaatttc cctatcgata atctgtgctt tgttgggctc 780 atctccatga ttgaccctcc acgggcggcc gttcctgatg ccgtgggcaa atgtcgaagt 840 gctggaatta aggtcatcat ggtcacagga gaccatccaa tcacagctaa agctattgcc 900 aaaggtgtgg gcatcatctc agaaggcagt ggacctatga gcagaggaaa atcgtggagt 960 tcacctgcca cacagccttc ttcgtcagta tcgtggtggt gcagtgggcc gacttggtca 1020 tctgntaaga ccaggaggaa ttcggtcttc cagcagggga tgaagaacaa gatcttgata 1080 tttggcctct ttgaagagac agccctggct gctttccttt cctactgccc tggaatgggt 1140 gttgctctta ggatgtatcc cctcaaaccn ntacctggtg gttctgtgcn cttcccctac 1200 tctcttctca tcttcgtata tgacgaagtc anngaaaact catcatcagg cgacgccnnn 1260 ctggcggctg ggtggannnn gaaggaaacc tactattagc cccccgtcct gcacgccgtg 1320 gagcatcagg ccacacactc tgcatccgac accca 1355 <210> 11 <211> 1355 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gtggccaacg tgcctgaggg gcttctggcc actgtcactg tgtgcctgac cctgacagcc 60 aagcgcatgg cacggaagaa ctgcctggtg aagaacctgg aggcggtgga gacgctgggc 120 tccacgtcca ccatctgctc ggacaagacg ggcaccctca cccagaaccg catgaccgtc 180 gcccacatgt ggttcgacaa ccaaatccat gaggctgaca ccaccgaaga tcagtctggg 240 gccacttttg acaaacgatc ccctacgtgg acggccctgt ctcgaattgc tggtctctgc 300 aaccgcgccg tcttcaaggc aggacaggag aacatctccg tgtctaagcg ggacacagct 360 ggtgatgcct ctgagtcagc tctgctcaag tgcattgagc tctcctgtgg ctcagtgagg 420 aaaatgagag acagaaaccc caaggtggca gagattcctt tcaactctac caacaagtac 480 cagctgtcta tccacgagcg agaagacagc ccccagagcc nnnacgtgct ggtgatgaag 540 ggggccccag agcgcattct ggaccggtgc tccaccatcc tggtgcaggg caaggagatc 600 ccgctcgaca aggagatgca agatgccttt caaaatgcct acatggagct ggggggactt 660 ggggagcgtg tgctgggatt ctgtcaactg aatctgccat ctggaaagtt tcctcggggc 720 ttcaaattcg acacggatga gctgaacttt cccacggaga agctttgctt tgtggggctc 780 atgtctatga ttgaccctcc ccgggctgct gtgccagatg ctgtgggcaa gtgccgaagc 840 gcaggcatca aggtgatcat ggtaaccggg gatcacccta tcacagccaa ggccattgcc 900 aaaggcgtgg gcatcatatc agagggtaac gagactgtgg aggacattgc agcccggcnt 960 caacattccc atgagtcaan nnngtcanna ccccagagaa gccaaggnca tgcgtggtgc 1020 acggctctga cctgaaggac atganncatc gnnnnngagc agctcgatga gatcctcaag 1080 aaccacacag agatcgtctt tgctcgaacg tctccccagc agaagctcat cattgtggag 1140 ggatgtcaga ggcagggagc cattgtggcc gtgacgggtg acggggtgaa cgactcccct 1200 gcattgaaga aggctgacat tggcattgcc atgggcatct ctggctctga cgtctctaag 1260 caggcagccg acatgatcct gctggatgac aactttgcct ccatcgtcac gggggtggag 1320 gagggccnng cctgatcttt gacaacttga agaaa 1355 <210> 12 <211> 1355 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gtggccaatg tcccagaggg tctgctggcc actgtcactg tgtgtctgac cgtgaccgcc 60 aagcgcatgg cccggaagaa ctgcctggtg aagaacctgg aggctgtaga gaccctgggc 120 tccacgtcca ccatctgctc agataagaca gggaccctca ctcagaaccg catgacagtc 180 gcccacatgt ggtttgacaa ccagatccac gaggctgaca ccactgagga ccagtcaggg 240 acctcatttg acaagagttc gcacacctgg gtggccctgt ctcacatcgc tgggctctgc 300 aatcgcgctg tcttcaaggg tggtcaggac aacatccctg tgctcaagag ggatgtggct 360 ggggatgcgt ctgagtctgc cctgctcaag tgcatcgagc tgtcctctgg ctccgtgaag 420 ctgatgcgtg aacgaaacaa gaaagtggct gagattccct tcaattccac caacaaatac 480 cagctctcca tccatgagac cgaggacccc aacgacaacc gatacctgct ggtgatgaag 540 ggtgcccccg agcgcatcct ggaccgctgc tccaccatcc tgctacaggg caaggagcag 600 cctctggacg aggaaatgaa ggaggccttt cagaatgcct accttgagct cggtggcctg 660 ggcgagcgcg tgcttggttt ctgccattat tacctgcccg aggagcagta tccccaaggc 720 tttgccttcg actgtgatga cgtgaacttc accacggaca acctctgctt tgtgccgctc 780 atgtccatga tcggcccacc ccgggcagcc gtccctgacg cggtgggcaa gtgtcgcagc 840 gcaggcatca aggtcatcat ggtcaccggc gatcacccca tcacggccaa ggccattgcc 900 aagggtgtgg gcatcatctc tgagggcaac gagactgtgg aggacatcgc cgcccggcnt 960 caacattccc gtcagccagn nnngttanna cccccgggat gccaaggncc tgcgtgatcc 1020 acggcaccga cctcaaggac ttcanncctc cnnnnngagc aaatcgacga gatcctgcag 1080 aatcacaccg agatcgtctt cgcccgcaca tccccccagc agaagctcat cattgtggag 1140 ggctgtcaga gacagggtgc aattgtggct gtgaccgggg atggtgtgaa cgactccccc 1200 gctctgaaga aggccgacat tggggtggcc atgggcatcg ctggctctga cgtctccaag 1260 caggcagctg acatgatcct gctggacgac aactttgcct ccatcgtcac aggggtggag 1320 gagggccnng cctgatcttc gacaacctaa agaag 1355 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 13 Leu Val Thr Tyr Pro Leu Pro 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 14 Trp Tyr Val Tyr Pro Ser Met 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 15 Trp Glu Phe Pro Gly Trp Met 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 16 Ala Tyr Val Tyr Pro Ser Met 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 17 Trp Ala Val Tyr Pro Ser Met 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 18 Trp Tyr Ala Tyr Pro Ser Met 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 19 Trp Tyr Val Ala Pro Ser Met 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 20 Trp Tyr Val Tyr Lys Ser Met 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine releasing factor binding peptide <400> 21 Trp Tyr Val Tyr Pro Ala Met 1 5 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine releasing factor binding peptide <400> 22 Trp Tyr Ala Tyr Pro Ser Ala 1 5

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＨＲＦの受容体がＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼ
の大型細胞質ループであることを酵母の２ハイブリッド
法で確認した結果を示した図である。

【図２】 ＨＲＦとＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼの大型細
胞質ループが相互作用することを、酵母細胞で共同免疫
沈澱法を用いて確認した結果を示した図である。

【図３】 ＨＲＦとＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼの大型細
胞質ループが相互作用することを、ＣＯＳ−７細胞で共
同免疫沈澱法を用いて確認した結果を示した図である。

【図４】 ＨＲＦとＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼの大型細
胞質ループの親和度をバイアコア（ｂｉａｃｏｒｅ）法
で測定した結果を示したグラフである。

【図５】 ＨＲＦの受容体がＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼ
の大型細胞質ループであることを、共焦点顕微鏡で確認
した結果を示した写真である。

【図６】 図６（ａ）及び図６（ｂ）は、水溶性タンパ
ク質のＨＲＦが、細胞内に侵入できることを共焦点顕微
鏡及びウエスタンブロッティング法で確認した結果を示
した写真である。

【図７】 ＨＲＦが細胞内のＮａ⁺濃度を上昇させるこ
とを示したグラフである。

【図８】 ＨＲＦがＮａ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼの活性を
低下させることを示したグラフである。

【図９】 図９（ａ）〜（ｃ）は、ＨＲＦによって細胞
内のＣａ²⁺濃度が上昇し、Ｎａ／Ｃａ交換体により細胞
外のＣａ²⁺源が消費され、ＩｇＥの存在下でＲＯＳが生
成し、その結果、細胞内のＣａ²⁺濃度が一層上昇するこ
とを示したグラフである。

【図１０】 ＩｇＥの存在下で細胞内のＣａ²⁺濃度が上
昇すると、ＨＲＦによってヒスタミンが分泌されること
を示したグラフである。

【図１１】 ＨＲＦ結合ペプチドをコードする遺伝子の
分離過程の概略を示した図である。

【図１２】 本発明のファージがコードするペプチドが
ＨＲＦに特異的に結合することを示したグラフである。

【図１３】 本発明のファージがコードするペプチドと
ＨＲＦタンパク質の結合親和度を示したグラフである。

【図１４】 図１４（ａ）〜（ｃ）は、ＨＲＦ結合ファ
ージでディスプレーされたペプチドと、該ペプチドと同
一アミノ酸配列を有する合成ペプチドが、同一であるこ
とを示したグラフである。

【図１５】 本発明のペプチドのＨＲＦ結合能を比較し
たグラフである。

【図１６】 ＲＢＬ−２Ｈ３細胞株を用いて、本発明の
ペプチドがヒスタミン放出を抑制するのに必要な量を測
定した容量−反応関係を示したグラフである。

【図１７】 ＲＢＬ−２Ｈ３細胞株を用いて、本発明の
ＨＲＦ結合ペプチドの、ＨＲＦによるヒスタミン放出に
対する阻害を比較したグラフである。

【図１８Ａ】 ラットＨＲＦ受容体間で保存されたアミ
ノ酸配列を示した図である。

【図１８Ｂ】 ラットＨＲＦ受容体間で保存されたアミ
ノ酸配列を示した図である。

【図１９Ａ】 ラットＨＲＦ受容体をコードするＤＮＡ
配列間の配列保存性を示した図である。

【図１９Ｂ】 ラットＨＲＦ受容体をコードするＤＮＡ
配列間の配列保存性を示した図である。

【図１９Ｃ】 ラットＨＲＦ受容体をコードするＤＮＡ
配列間の配列保存性を示した図である。

【図１９Ｄ】 ラットＨＲＦ受容体をコードするＤＮＡ
配列間の配列保存性を示した図である。

【図２０Ａ】 ヒトＨＲＦ受容体のアミノ酸配列間の配
列保存性を示した図である。

【図２０Ｂ】 ヒトＨＲＦ受容体のアミノ酸配列間の配
列保存性を示した図である。

【図２１Ａ】 ヒトＨＲＦ受容体をコードするＤＮＡ配
列間の配列保存性を示した図である。

【図２１Ｂ】 ヒトＨＲＦ受容体をコードするＤＮＡ配
列間の配列保存性を示した図である。

【図２１Ｃ】 ヒトＨＲＦ受容体をコードするＤＮＡ配
列間の配列保存性を示した図である。

【図２１Ｄ】 ヒトＨＲＦ受容体をコードするＤＮＡ配
列間の配列保存性を示した図である。

【図２２】 様々なアレルギー患者の血液からＨＲＦが
検出されたことを示す図である。

【図２３】 ＰＣ１２細胞で、ＨＲＦの濃度に依存して
ドーパミンの放出が上昇することを示したグラフであ
る。

【図２４】 ＰＣ１２細胞で、本発明のＨＲＦ結合ペプ
チドが、ＨＲＦによるドーパミン放出を抑制することを
示したグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/16 Ａ６１Ｐ 33/06 25/28 37/08 33/06 43/00 １０５ 37/08 １１１ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 7/06 １１１ 14/705 Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ１２Ｎ 1/15 14/705 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 イー キョン リム 大韓民国 120−750 ソウル市 ソデムン −ク デヒョン−ドン 11−１ 梨花女子 大学校 薬学大学内 (72)発明者 チョン ジュン ホー 大韓民国 110−799 ソウル市 ジョンノ −ク ヨンコン−ドン 28 ソウル大学校 医科大学 生化学科内 (72)発明者 キム ファー ジョン 大韓民国 120−750 ソウル市 ソデムン −ク デヒョン−ドン 11−１ 梨花女子 大学校 薬学大学内 (72)発明者 キム ミー ヨン 大韓民国 120−750 ソウル市 ソデムン −ク デヒョン−ドン 11−１ 梨花女子 大学校 薬学大学内 (72)発明者 チョン ジェー フン 大韓民国 120−750 ソウル市 ソデムン −ク デヒョン−ドン 11−１ 梨花女子 大学校 薬学大学内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 BA80 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ20 QR59 QR77 QR80 QS24 QS28 4B065 AA90X AA91Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 BA01 BA16 BA17 CA53 CA59 DC50 ZA022 ZA162 ZA362 ZA592 ZA892 ZB132 ZB212 ZC022 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA14 CA40 DA50 EA21 EA23 EA27 EA50 EA52 FA74

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１、２および３よりなる群から
   選ばれたアミノ酸配列を有するラットＩｇＥ依存性ヒス
   タミン放出因子（ＨＲＦ）受容体。
2. 【請求項２】 配列番号４、５および６よりなる群から
   選ばれたアミノ酸配列を有するヒトＨＲＦ受容体。
3. 【請求項３】 請求項１または２のアミノ酸配列と８５
   ％以上の相同性を有するＨＲＦ受容体。
4. 【請求項４】 Ｎａ⁺、Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼ α１、α２
   またはα３サブユニットの大型細胞質ループ（ｌａｒｇ
   ｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｌｏｏｐ；ＣＤ３）であ
   る請求項１または２に記載のＨＲＦ受容体。
5. 【請求項５】 請求項１または２のＨＲＦ受容体をコ
   ードする核酸。
6. 【請求項６】 配列番号７、８、９、１０、１１および
   １２よりなる群から選ばれた塩基配列を有する請求項５
   に記載の核酸。
7. 【請求項７】 請求項５の核酸を含有する組換えベクタ
   ー。
8. 【請求項８】 請求項７のベクターで形質転換された形
   質転換体。
9. 【請求項９】 請求項８の形質転換体を、被験化合物お
   よび前記受容体と相互作用すると知られている化合物と
   接触させる工程；及び前記被験化合物のうち、前記受容
   体と相互作用すると知られている化合物の相互作用を減
   少させる化合物を選別する工程を含むＨＲＦ受容体と相
   互作用する化合物のスクリーニング方法。
10. 【請求項１０】 下記のアミノ酸配列を有するＨＲＦ結
    合ペプチド： （Ａ，ＬまたはＷ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ａ，Ｌ，Ｓま
    たはＷ）−（Ａ，ＰまたはＭ） ｛ここで、Ｘは任意のアミノ酸を示す｝
11. 【請求項１１】 アミノ酸配列（Ａ，ＬまたはＷ）−Ｘ
    −Ｘ−（Ｙ，ＰまたはＡ）−（Ｐ，ＧまたはＫ）−
    （Ａ，Ｌ，ＳまたはＷ）−（Ａ，ＰまたはＭ）を有する
    請求項１０に記載のペプチド。
12. 【請求項１２】 アミノ酸配列（Ａ，ＬまたはＷ）−
    （Ｖ，Ｙ，ＥまたはＡ）−（Ｔ，Ｖ，ＦまたはＡ）−
    （Ｙ，ＰまたはＡ）−（Ｐ，ＧまたはＫ）−（Ａ，Ｌ，
    ＳまたはＷ）−（Ａ，ＰまたはＭ）を有する請求項１１
    に記載のペプチド。
13. 【請求項１３】 配列番号１３、１４、１５、１６、１
    ７、１８、１９、２０、２１および２２よりなる群から
    選ばれたアミノ酸配列を有する請求項１２に記載のペプ
    チド。
14. 【請求項１４】 アミノ酸配列（ＡまたはＷ）−（Ｙま
    たはＡ）−（ＶまたはＡ）−（ＹまたはＡ）−（Ｐまた
    はＫ）−（ＳまたはＡ）−（ＭまたはＡ）を有する請求
    項１２に記載のペプチド。
15. 【請求項１５】 配列番号１４、１６、１７、１８、１
    ９、２０、２１および２２よりなる群から選ばれたアミ
    ノ酸配列を有する請求項１４に記載のペプチド。
16. 【請求項１６】 アミノ酸配列Ｗ−（ＹまたはＡ）−
    （ＶまたはＡ）−（ＹまたはＡ）−（ＰまたはＫ）−
    （ＳまたはＡ）−Ｍを有する請求項１４に記載のペプチ
    ド。
17. 【請求項１７】 配列番号１４、１７、１８、１９、２
    ０、及び２１よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を有
    する請求項１６に記載のペプチド。
18. 【請求項１８】 前記配列を構成するアミノ酸がＬ−ア
    ミノ酸，Ｄ−アミノ酸またはＤＬ−アミノ酸である請求
    項１０〜１７のいずれかに記載のペプチド。
19. 【請求項１９】 前記配列を構成するアミノ酸には、修
    飾されたアミノ酸が１つ以上含まれている請求項１０〜
    １７のいずれかに記載のペプチド。
20. 【請求項２０】 前記修飾されたアミノ酸は、アミノ酸
    誘導体またはアルキル化アミノ酸である請求項１９に記
    載のペプチド。
21. 【請求項２１】 請求項１０〜１７のいずれかのペプチ
    ドをコードする核酸。
22. 【請求項２２】 請求項２１の核酸を含有する組換えベ
    クター。
23. 【請求項２３】 請求項２２の組換えベクターで形質転
    換された形質転換体。
24. 【請求項２４】 有効成分として、請求項１０〜１７の
    いずれかのペプチドまたは請求項２１の核酸を含有する
    アレルギー診断、予防または治療用組成物。
25. 【請求項２５】 前記アレルギーは、喘息；鼻炎；痰麻
    疹；アナフィラキシー；アレルギー性気管支拡張症；食
    物、薬物、花粉または虫によるアレルギー；花粉症；寒
    冷じん麻疹；及びアトピー性皮膚炎よりなる群から選ば
    れる少なくとも１種である請求項２４に記載の組成物。
26. 【請求項２６】 有効成分として、請求項１０〜１７の
    いずれかのペプチドまたは請求項２１の核酸を含有する
    マラリア診断、予防または治療用組成物。
27. 【請求項２７】 有効成分として、ＨＲＦまたはＨＲＦ
    をコードする核酸を含有する神経伝達物質放出誘導剤。
28. 【請求項２８】 前記神経伝達物質がドーパミンである
    請求項２７に記載の誘導剤。
29. 【請求項２９】 有効成分として、請求項１０〜１７の
    いずれかのペプチドまたは請求項２１の核酸を含有する
    神経伝達物質放出抑制剤。
30. 【請求項３０】 前記神経伝達物質がドーパミンである
    請求項２９に記載の抑制剤。
31. 【請求項３１】 アポトーシス関連神経疾患の診断、予
    防または治療が目的である請求項２９に記載の抑制剤。
32. 【請求項３２】 前記アポトーシス関連神経疾患が脳卒
    中、アルツハイマー病またはパーキンソン病である請求
    項３１に記載の抑制剤。