KR100457351B1 - ＩｇＥ-의존적 히스타민 방출인자(ＨＲＦ) 및 그에결합하는 펩타이드의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 IgE-의존적 히스타민 방출인자(IgE-dependent histamine-releasing factor; HRF)의 신경전달물질(neurotransmitter) 방출 유도 및 그의 억제를 위한 HRF 결합 펩타이드의 용도에 관한 것으로서, 세포사멸-관련 신경 질환, 예를 들어, 뇌졸중, 알츠하이머병 또는 파킨슨씨병 등의 진단, 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＩｇＥ-의존적 히스타민 방출인자(ＨＲＦ) 및 그에 결합하는 펩타이드의 용도{Uses of IgE-dependent histamine-releasing factor(HRF) and peptides binding thereto}

본 발명은 IgE-의존적 히스타민 방출인자(IgE-dependent histamine-releasing factor, 이하 "HRF"라 함) 및 그에 결합하는 펩타이드의 신규 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 HRF의 신경전달물질(neurotransmitter)방출 유도를 위한 용도 및 그를 억제하기 위한 HRF 결합 펩타이드의 용도에 관한 것이다.

HRF는 모든 세포질에 존재하는, 172 개의 아미노산으로 구성되어 있는 공지의 단백질이다[봄(Bohm) 등, 1989]. 그 중 C-말단의 45 개 아미노산은 염기성 도메인(basic domain)을 형성하고 있으며, 이 부위는 미소관-결합 단백질(microtubule-associated protein)인 MAP-1B와 약 46%의 상동성을 나타내므로, 미소관 결합 단백질인 것으로 추정되고 있다. 고쉐(Gachet) 등(1997)은 공촛점 현미경(confocal microscope)을 이용하여 HRF의 분포와 세포골격망 분포가 어느 정도 일치함을 관찰하였는데, 이것은 HRF가 세포골격과 결합되어 있음을 시사하는 것이다.

알러지 환자의 경우, 알러젠에 노출되면 즉시 반응(immediate reaction)이 일어나고 여러 염증-관련 세포들이 모이게 되며, 수 시간 후에는 호염기구(basophil), 호산구(eosinophil) 및 림프구(lymphocyte)로부터 분비되는 히스타민에 의해 후기 반응(late-phase reaction, 이하 "LPR"이라 함)이 일어나게 되는데, 이때 HRF는 호염기구에서 히스타민을 분비시키는 작용을 하여, IgE-의존적 LPR로의 진전을 유발하는 것으로 밝혀져 있다[맥도날드(MacDonald) 등, 1995]. HRF는 친수성이고 세포질내에 존재하는 단백질이나, LPR 알러지 환자의 혈장에서 다량으로 검출되는 점으로 미루어 보아, 세포사멸(apoptosis)이나 다른 작용기전에 의해 세포외로 분비되며, 호염기구 세포막에 존재하는 HRF 수용체를 통해 히스타민을 유리시키는 것으로 추정되고 있었다.

이러한 HRF는 대부분의 조직에 존재하므로, 염증-관련 세포 이외의 다른 조직 세포에서도 기능을 수행할 것으로 추정된다. 그러나, 염증-관련 세포 이외의 다른 조직, 특히 뇌 조직이나 신경 세포에서 HRF의 기능에 대해서는 거의 보고된 바가 없다. 다만, 최근 들어 2-D 겔 전기영동 및 프로테오믹스(proteomics)를 이용하여, 인간 뇌에 존재하는 단백질들을 분석하던 중, HRF가 발견되었으며[란젠(Langen) 등, 1999], 이어서 동일 그룹의 연구진들에 의해 다운 증후군이나 알츠하이머병에 의해 사망한 환자의 뇌에서 HRF 단백질의 감소가 관찰된다는 보고가 있었을 뿐이다[김((Kim) 등, 2001].

한편, 세포의 안정 막전위 형성 및 삼투성의 균형 조절에 관여하는 (Na,K)ATPase는 신경 세포, 특히 신경 말단 또는 시냅토좀(synaptosome) 막에도 높은 농도로 존재하고 신경 활성에 중요한 역할을 수행한다. 신경 세포막에 존재하는 (Na,K)ATPase의 활성이 저해 내지 소실되면, 여러 신경병리학적 변화나 세포사멸이 유발되는 것으로 보고되어 있다[리즈(Lees), 1991]. 이것은 뇌의 허혈(ischemia)이나 산소결핍(anoxia) 상태에서 (Na,K)ATPase 효소 활성에 필수적인 세포내 ATP가 빠르게 고갈된다는 보고[마틴(Martin) 등, 1994; 산토스(Santos) 등, 1996]와도 관련되어 있다. 따라서, 이러한 종류의 뇌질환 상태에서, 이 효소 활성 역시 저해되는 것으로 여겨지고 있다. 더불어, (Na,K)ATPase의 활성 저해시 신경전달물질의 방출이 증가된다는 것이 쥐 뇌조직 절편(slices), 시냅토좀(synaptosome) 및 인 비트로 배양 시스템에서 증명된 바 있다. 또한, 인 비보 및 인 비트로 연구로부터 허혈 또는 산소결핍과 유사한 상태에서 신경전달물질의 방출이 증가되고, 그에 따른 시냅스후 세포막 수용체의 활성화가 신경 손상의 중요한 과정이라고 제시되었다[최(Choi), 1990; 마틴(Martin) 등, 1994].

뇌의 (Na,K)ATPase 활성은 도파민(dopamine), 세로토닌(serotonin), 노르에피네프린(norepinephrine), 글루타메이트(glutamate) 등의 신경전달물질과 인슐린, 산화질소(NO) 등과 내인성 물질들에 의해 조절되기도 한다. 뇌에서 식물로부터 추출된 배당체인 우아바인(ouabain)과 구조적으로 유사한 내인성 (Na,K)ATPase 저해물질인 "브레인 우아바인"(brain ouabain)[벋지코프스키(Budzikowski) 등, 1998]의 존재가 밝혀지기도 하였으나, 로드리게즈(Rodriguez) 등(1992)은 뇌의 가용성 분획에 (Na,K)ATPase의 활성을 특이적으로 저해하고 우아바인과는 구조 및 성질이 상이한 내인성 우아바인-양 인자(endogenous ouabain-like factor)가 존재하며, 이 물질에 의해 고친화성³H-우아바인 결합이 차단되고 신경전달물질의 방출이 유도되며, 신경전달물질에 의한 (Na,K)ATPase의 활성 조절에도 관여한다고 보고하였다. 최근 이 물질은 엔도바인(endobain) E[바타(Vatta) 등, 1999]로 명명되었으나, 그 실체에 대해서는 여전히 밝혀지지 않고 있다.

본 발명자들은 HRF가 뇌와 신경 세포에서 상기한 바와 같은 내인성 인자로 작용하여 신경전달물질의 방출을 유도하는지 조사하였고, 특히 병변이 유발된 신경 세포나 뇌 조직에서의 기능 변화를 규명하였다. 즉, 신경 세포와 뇌 조직에서 HRF 의 발현을 확인하고, 정제된 재조합 HRF를 신경세포의 외부에 처리한 경우, 세포내로 유입되어 신경전달물질 방출반응을 나타내며, 이것이 스크리닝에 의해 얻은 HRF결합 펩타이드에 의해 효과적으로 억제됨을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 HRF의 신경전달물질 방출 유도제로서의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 HRF 결합 펩타이드의 신경전달물질 방출 억제제로서의 용도를 제공하는 것이다.

도 1a 및 1b는 수용성 단백질인 HRF가 세포내로 들어갈 수 있음을 공촛점 현미경과 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과를 나타내는 사진;

도 2는 HRF가 세포내 Na⁺의 농도를 증가시키는 것을 나타내는 그래프;

도 3은 HRF가 (Na,K)ATPase의 활성도를 감소시키는 것을 나타내는 그래프;

도 4a 내지 4c는 HRF에 의해 세포내 Ca²⁺이 증가하고, Na/Ca 교환체에 의해 세포외 Ca²⁺원을 소비하며, IgE 존재시 ROS 생성으로 인해 세포내 Ca²⁺이 더욱 증가함을 나타내는 그래프;

도 5는 IgE 존재하에 세포내 Ca²⁺의 농도가 높아지면 HRF에 의해 히스타민이 분비되는 것을 나타내는 그래프;

도 6은 HRF 결합 펩타이드를 코딩하는 유전자의 분리과정을 개략적으로 도시한 도면;

도 7은 본 발명에 따른 파아지가 코딩하는 펩타이드가 HRF에 특이적으로 결합하는 것을 나타내는 그래프;

도 8은 본 발명에 따른 파아지가 코딩하는 펩타이드와 HRF 단백질의 결합 친화도를 나타내는 그래프;

도 9a 내지 9c는 HRF 결합 파아지가 갖는 펩타이드와, 그와 아미노산 서열이 동일한 합성 펩타이드가 상호 경쟁하는 것을 나타내는 그래프;

도 10은 본 발명에 따른 펩타이드의 HRF 결합능을 비교하는 그래프;

도 11은 RBL-2H3 세포주에서 본 발명에 따른 펩타이드가 히스타민 분비를 억제하는데 필요한 양을 측정한 용량-반응 결과를 나타내는 그래프;

도 12는 RBL-2H3 세포주에서 본 발명에 따른 펩타이드의 HRF에 의한 히스타민 분비 억제를 비교하는 그래프;

도 13은 PC12 세포에서 HRF가 도파민 방출을 농도-의존적으로 증가시킴을 보여주는 그래프; 및,

도 14는 PC12 세포에서 본 발명에 따른 펩타이드가 HRF에 의해 증가된 도파민 방출을 억제함을 보여주는 그래프.

첫째, 본 발명은 유효성분으로서 HRF 또는 그를 코딩하는 핵산을 함유하는 신경전달물질 방출 유도제에 관한 것이다.

둘째, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 갖는 HRF 결합 펩타이드 또는 그를 코딩하는 핵산을 함유하는 신경전달물질 방출 억제제에 관한 것이다:

(A, L 또는 W)-X-X-X-X-(A, L, S 또는 W)-(A, P 또는 M)

여기서, X는 임의의 아미노산을 나타낸다.

본 발명에서, HRF 결합 펩타이드는 바람직하게는 아미노산 서열 (A, L 또는 W)-X-X-(Y, P 또는 A)-(P, G 또는 K)-(A, L, S 또는 W)-(A, P 또는 M)을 갖는 것이다.

보다 바람직하게는, 아미노산 서열 (A, L 또는 W)-(V, Y, E 또는 A)-(T, V, F 또는 A)-(Y, P 또는 A)-(P, G 또는 K)-(A, L, S 또는 W)-(A, P 또는 M), 예를 들어, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이다.

보다 더 바람직하게는, 아미노산 서열 (A 또는 W)-(Y 또는 A)-(V 또는 A)-(Y또는 A)-(P 또는 K)-(S 또는 A)-(M 또는 A), 예를 들어, 서열번호 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이다.

가장 바람직하게는, 아미노산 서열 W-(Y 또는 A)-(V 또는 A)-(Y 또는 A)-(P 또는 K)-(S 또는 A)-M, 예를 들어, 서열번호 2, 5, 6, 7, 8 및 9로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이다.

본 발명에 따른 HRF 결합 펩타이드는 L-, D-, 또는 L- 및 D-아미노산으로 구성될 수 있으며, 하나 이상의 변형(modified) 아미노산, 예를 들어, 아미노산 유도체 또는 알킬화, 특히 메틸화된 아미노산을 가질 수 있다.

본 발명에서, 신경전달물질은 예를 들어 도파민일 수 있고, HRF 또는 그를 코딩하는 핵산, 또는 HRF 결합 펩타이드 또는 그를 코딩하는 핵산이 체중 1 ㎏당 0.3∼2.5 ㎎으로 투여되도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 억제제는 세포사멸 관련 신경 질환, 특히 뇌졸중, 알츠하이머병 또는 파킨슨씨병의 진단, 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

한국 출원 제10-2000-0030130호 및 제10-2001-0027896호에서, 본 발명자들은 효모 2-하이브리드 방법을 이용하여, HRF가 (Na,K)ATPase α 서브유닛중 대형 세포질 루프(CD3)에 결합하는 것을 최초로 확인하였다. 또한, 공면역침전법(coimmunoprecipitation)으로 효모 세포 및 포유 세포에서 HRF와 (Na,K)ATPase α 서브유닛의 CD3가 상호작용한다는 사실을 확인하고, 그 결합 친화도를 측정하였다. 나아가, HRF의 수용체가 (Na,K)ATPase α 서브유닛의 CD3임을 공촛점 현미경(confocal microscope)으로 확인하였다.

또한, HRF가 수용성 단백질임에도 불구하고, 세포내로 들어갈 수 있음을 공촛점 현미경과 웨스턴 블랏팅으로 입증하고, 세포내 Na⁺및 Ca²⁺농도를 증가시키며, 이 때 Na/Ca 교환체(exchanger)에 의해 세포외 Ca²⁺원이 소모됨을 밝혔다. 또한, HRF가 IgE 존재시 ROS(reactive oxygen species)를 생성하며, 이로 인해 세포내로 더욱 많은 Ca²⁺이 유입됨을 밝혔다.

이상 언급한 결과들로부터, HRF가 호염기구에서 히스타민 분비를 촉진하는 정확한 작용기전이 규명되었다. 즉, 세포외로 분비된 HRF가 호염기구내로 들어와 (Na,K)ATPase α 서브유닛중 제3세포질 도메인(CD3)과 결합하고, 우아바인(ouabain)과 같이 (Na,K)ATPase 작용을 저해하며, 이로써 세포내 Na⁺의 농도는 증가하고 Na/Ca 교환체가 활성화됨에 따라 세포내 Ca²⁺의 농도도 증가한다. 또한, IgE 존재시 ROS 생성으로 인해 세포내 Ca²⁺이 더욱 증가하므로, 결국 히스타민 분비가 촉진되는 것이다. 이것은 HRF의 수용체가 바로 (Na,K)ATPase의 CD3이며, HRF가 (Na,K)ATPase의 세포질 리프레서(repressor)임을 의미하는 것이다.

따라서, 본 발명자들은 HRF의 수용체가 (Na,K)ATPase α 서브유닛의 CD3임을 최초로 밝혀내고, 래트 및 인간 HRF 수용체 및 그를 코딩하는 핵산을 개시한 바 있다.

또한, 상기 출원에서는 HRF에 특이적으로 높은 친화도로 결합하여 히스타민 분비를 저해하는 펩타이드 및 그를 코딩하는 핵산을 제공한 바, 상기 HRF 결합 펩타이드는 예를 들어, 아미노산 서열 (A, L 또는 W)-X-X-X-X-(A, L, S 또는 W)-(A, P 또는 M)[여기서, X는 임의의 아미노산을 나타낸다]을 갖는 것이다. HRF 결합 펩타이드의 아미노산 서열의 예는 하기의 것을 포함한다:

(A, L 또는 W)-X-X-(Y, P 또는 A)-(P, G 또는 K)-(A, L, S 또는 W)-(A, P 또는 M);

특히, (A, L 또는 W)-(V, Y, E 또는 A)-(T, V, F 또는 A)-(Y, P 또는 A)-(P, G 또는 K)-(A, L, S 또는 W)-(A, P 또는 M), 예를 들어, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10;

보다 특히, (A 또는 W)-(Y 또는 A)-(V 또는 A)-(Y 또는 A)-(P 또는 K)-(S 또는 A)-(M 또는 A), 예를 들어, 서열번호 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10;

가장 특히, W-(Y 또는 A)-(V 또는 A)-(Y 또는 A)-(P 또는 K)-(S 또는 A)-M, 예를 들어, 서열번호 2, 5, 6, 7, 8 또는 9.

상기 출원된 전체 내용은 본 출원에서 참조로서 인용된다.

나아가, 본 발명에서는 먼저 HRF가 신경 세포에서 (Na,K)ATPase의 억제제로 작용하여 신경전달물질의 방출을 증가시키는지를 조사하였다. 이를 위하여, 세포내에 신경전달물질의 분비 과립을 함유하고 있어, 특히 카테콜아민(catecholamine)의 방출 조절 연구에 적합한 것으로 알려진 신경 세포주, PC12세포[아부-라야(Abu-Raya) 등, 1999]의 배양액에 HRF를 가하여, [³H]-표지된 도파민의 방출 변화를 측정하였다. 그 결과, HRF는 PC12 세포에서 도파민의 기저 및 K⁺농도 증가에 의해 유도되는 탈분극시의 흥분성 방출(K⁺-stimulated release)을 농도 의존적으로 증가시킴을 확인하였다. 또한, 상기 출원된 HRF 결합 펩타이드들이 신경 세포에서도 HRF에 의해 유도된 신경전달물질의 방출을 효과적으로 차단시킴을 밝혔다.

이상 언급한 바와 같이, (Na,K)ATPase 활성의 세포내 조절에 관여하는 HRF는 신경세포에서도 신경 활성에 중요한 역할을 수행하는 (Na,K)ATPase의 억제에 따른 신경전달물질의 방출을 촉진시키며, 이에 따라, 신경 세포 및 뇌에서 나타나는 병태 생리학적 효과에 중요한 작용을 할 것으로 믿어진다. 이러한 이유로, HRF의 신경전달물질의 방출 증가작용을 차단시킬 수 있는 HRF 결합 펩타이드는 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨씨병 등과 같은 다양한 세포사멸-관련 신경 질환의 진단, 예방 또는 치료제로 유용하다.

따라서, 본 발명은 유효성분으로서 HRF 결합 펩타이드를 함유하는 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨씨병 등의 세포사멸-관련 신경 질환의 진단, 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 펩타이드의 유효량은 체중 1 ㎏당 약 0.1∼5 ㎎, 바람직하게는, 0.3∼2.5 ㎎일 수 있다. 본 발명의 조성물은 용액 또는 미셀 형태로 직접 주입되거나 제제화하여 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 비경구 또는 국소투여에 의해 인체에 적용될 수 있는데, 정맥주사, 피하주사, 내피주사, 근육주사 등 주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해, 본 발명의 펩타이드를 약제학적으로 허용가능한 담체에 현탁시키거나 용해시키는데, 이 때 특히 수용성 담체를 사용하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하지만, 이것은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: HRF의 세포막을 건너갈 수 있는 능력 측정 실험

pRSET-A 벡터에 PCR(polymerase chain reaction)로 클로닝한 래트 HRF 전장 서열[치트파티마(Chitpatima) 등, 1988]을 클로닝한 후,E. coli에서 과발현(overexpression)시켰다. 발현된 재조합 단백질을 His-결합 Ni 칼럼(Novagen)을 이용하여 정제하고 COS-7 세포 배양액에 가한 후, COS-7 세포를 Ca²⁺과 Mg²⁺을 함유하는 3.7% 포름알데하이드로 10 분동안 고정시켰다. 그 후, 0.1% 사포닌을 함유하는 항-His 모노클로날 항체(1:100)를 1 시간동안 실온에서 가하여 염색하였다. 계속해서 항-마우스-FITC(1:100) 2 차 항체로 30 분동안 인큐베이션하였다. 항-표백제 용액을 가하고 레이저 공촛점 현미경(Leica TCSNT 시스템)으로 관찰하였다.

또한, 100 mm 배양 플레이트에서 배양된 COS-7 세포를 상기 방법으로 처리한 후, 각각 세포질과 세포막 부분으로 분리하고 10 % SDS-PAGE 겔에 로딩하여 항-His모노클로날 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.

그 결과를 도 1a 및 1b에 나타내었으며, 이로부터 HRF를 가한지 1 분 후에 HRF가 세포내에서 검출됨을 확인할 수 있다.

실시예 2: HRF가 세포내 Na ⁺ 농도에 미치는 영향 측정 실험

RBL-2H3 세포를 3.0×10⁵∼1×10⁶세포/㎖로 24 웰에 로딩한 후 37 ℃에서 18 시간동안 배양하였다. 여기에 최종농도가 8 M이 되도록 Hams F-12 배지(페놀레드 또는 혈청 결핍 2 mM 중탄산나트륨 및 10 mM HEPES pH 7.3)와 소듐 그린 테트라아세테이트(Molecular Probes, Eugene, OR) 염료를 혼합하고 세포에 로딩하였다(Amorino and Fox, 1995). 래트 IgE(Serotec)를 0.2 g/㎖로 45∼60 분동안 감작시킨 후, 약 20∼60 분동안 실온에서 배양하고 F-12 배지로 3 회 세척하였다. 계속해서 히스타민 방출 완충액에 포함된 HRF(10∼20 ㎍/㎖)를 가한 후, 485/530 nm에서 15 분동안 마이크로타이터 리더(FL600, Bio-tek Instruments, Inc., Winooski, VT)로 형광 강도를 측정하였다. 이때, 캘리브레이션(Calibration)으로 그라미시딘(gramicidin) D(Sigma)를 이용하여 Na⁺와 K⁺을 적정 농도로 혼합한 용액을 측정하였다(Amorino and Fox, 1995). 그 결과를 도 2에 나타내었으며, 이로부터 HRF가 세포내 Na⁺의 농도를 증가시킴을 알 수 있다.

실시예 3: HRF의 (Na,K)ATPase 활성 저해 실험

RBL-2H3 세포를 실시예 2에 기재된 방법으로 배양 및 감작시킨 후, 크렙스-링거 완충액(Krebs-Ringer buffer)(KRP, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1 mM MgSO₄, 1.4 mM CaCl₂, 2.5 mM 글루코스, pH 7.4)으로 3 회 세척하였다. 계속해서 세포를 37 ℃에서 15 분동안 인큐베이션한 후, 1 mM 우아바인(ouabain)을 포함한 0.1% 소 혈청 알부민(BSA) 함유 KRP 완충액을 가하였다.⁸⁶Rb⁺(0.5 Ci/㎖, NEN)을 트래이서로 사용하여 5∼10 분동안 배양하고 10∼20 ㎍/㎖ HRF을 가한 후 각각 5, 10, 15 분동안 K⁺-소비를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3으로부터 HRF가 (Na,K)ATPase의 활성도를 10.8%, 40.4% 및 50.7%로 감소시킴을 알 수 있다.

실시예 4: HRF가 세포내 Ca ²⁺ 농도에 미치는 영향 측정 실험

RBL-2H3 세포를 실시예 2에 기재된 방법으로 배양한 후, 크렙스-링거 완충액(KRH, 125 mM NaCl, 1.2 mM KH₂PO₄, 1.2 mM MgSO₄, 6 mM 글루코스, 2 mM CaCl₂, 25 mM Hepes, pH 7.4)으로 세척하였다. 이어서 2 μM Fluo-3-AM(Molecular Probes, Eugene, OR)과 0.2% BSA를 포함한 KRH 완충액으로 30 분동안 인큐베이션시킨 후, DMEM 완전 배지로 10∼30 분동안 보정하였다. 계속해서 KRH 완충액으로 세척하고 실시예 2에 기재된 방법으로 감작시켰다. 감작 후 HRF, 항-IgE(Serotec),각각의 저해제를 히스타민 방출 완충액(100 mM NaCl, 0.4 mM MgCl₂, 5 mM KCl, 5.6 mM 글루코스, 0.1% BSA, 25 mM Hepes, pH 7.4)과 함께 칼슘의 유/무에 따라 처리하였다. 488/515 nm에서 fluo-3AM의 형광 강도를 레이저 스캐닝 공촛점 현미경으로 측정하였다. 그 결과를 도 4a에 나타내었다.

또한, 세포내 ROS를 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트(2',7'-dichlorofluorescein diacetate; DCFH-DA)를 사용하여 레이저 스캐닝 공촛점 현미경으로 측정하였다. 즉, RBL-2H3 세포를 IgE의 존재 또는 부재하에 완전 DMEM 배지에서 1 시간 배양하였다. 이어서, 크렙스-링거 용액으로 세척한 후, 5 μM DCFH-DA를 함유한 크렙스-링거 용액중에서 5 분간 배양하였다. 그 후, 488/515 nm에서 형광을 스캐닝하며 관찰하였다. 그 결과를 도 4b 및 4c에 나타내었다.

이상으로부터, HRF에 의해 세포내 Ca²⁺가 증가하고, 이때 Na/Ca 교환체에 의해 세포외 Ca²⁺이 소비되며(도 4a), IgE 존재시에는 ROS가 생성되고, 이로 인해 세포내 Ca²⁺이 더욱 증가함(도 4b 및 4c)을 확인할 수 있다.

실시예 5: HRF에 의한 Ca ²⁺ 증가와 히스타민 분비의 관계 확인 실험

pRSET-A 벡터에 PCR로 클로닝한 래트 HRF 전장 서열[치트파티마 등, 1988]을 클로닝한 후,E. coli에서 과발현시켰다. 발현된 재조합 단백질을 His-결합 Ni 칼럼(Novagen)을 이용하여 정제하고 RBL-2H3 세포를 자극하기 위해 사용하였다.RBL-2H3을 1×10⁶세포로 24-웰에서 증식시킨 후, 래트 IgE 항체(0.2 ㎍/㎖, Serotec)로 45∼60 분간 감작시키고 재조합 HRF 단백질을 20 ㎍/㎖과 상기에서 사용한 저해제로 각각 처리하였다. 상기에서 얻은 샘플을 RIA-분석 키트(Immunotech, 프랑스)를 이용하여 아실화된 히스타민으로 제조한 후¹²⁵I-아실화된 히스타민과 모노클로날 항체에 경쟁 결합시켰다. 이 샘플을 다시 γ-계수기에서 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이로부터 IgE 존재하에 세포내 Ca²⁺농도가 높아지면 HRF에 의해 히스타민이 분비됨을 알 수 있다.

실시예 6: HRF에 결합하는 파아지 디스플레이 펩타이드 클론의 분리

HRF를 플라스틱 웰에 고정화(immobilization)시킨 후 헵타머 랜덤 리피트 펩타이드 라이브러리(7-mer random peptide library; New England Biolabs, USA)의 친화성 선별을 통해 HRF에 결합할 수 있는 펩타이드를 분리하였다.

약술하면, 코팅 완충액(0.1 M NaHCO₃, pH8.6)에 20 ㎍/㎖ 농도로 용해시킨 HRF를 50 ㎕씩 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트에 가하고, 4 ℃에서 밤새 코팅한 후 BSA로 비특이적 결합을 차단하였다. 0.1 % Tween/TBS(TBST)로 6 회 세척한 후 파아지-디스플레이 펩타이드 라이브러리(phage-displayed peptide library) 원액 10 ㎕를 3 % BSA/TBS 40 ㎕에 희석한 용액을 가하고 실온에서 1 시간동안 정치하였다. TBST를 사용하여 5 분간 방치한 후 세척하되, 1 회 패닝(panning)시에는한 번, 2 회와 3 회 패닝시에는 다섯 번, 4 회 패닝시에는 열 번 실시하였다. 글리신/HCl 완충액(pH 2.2) 50 ㎕를 가하고 5 분간 방치한 후 파아지를 용출하고 1 M Tris-HCl(pH 9.1) 8 ㎕로 중화하였다.

용출한 파아지 용액을 20 ㎖의 ER2537 배양액(OD₆₀₀=0.5∼1)에 첨가하고 37 ℃ 쉐이킹 인큐베이터(shaking incubator; rpm=200)에서 2 시간 배양한 후 100 ㎖ SB 배지를 가하고 250 rpm에서 밤새 배양하였다. 배양액을 10,000 rpm(4 ℃)에서 15 분간 원심분리하여 얻은 상청액 100 ㎖에 30 ㎖의 5×PEG/NaCl(20% PEG(w/v), 15% NaCl(w/v))를 가하여 5 분동안 용해시키고 얼음에 30 분간 정치하였다. 10,000 rpm(4 ℃)에서 20 분간 원심분리한 후 상청액을 모두 제거하고 펠렛을 1 ㎖의 3% BSA/TBS에 부유시켰다. 그 후, 14,000 rpm에서 5 분간 원심분리한 상청액을 다음 패닝에 사용하였다. 친화성 정제와 파아지 복제를 4 회 반복한 후 얻은 용출 파아지의 적정 플레이트로부터 각각의 파아지 클론을 얻고 ELISA 분석을 통해 특이적인 친화도를 나타내는 파아지 클론만을 서열분석하여 펩타이드 서열을 확인하였다. 도 6에 상기 HRF 결합 펩타이드를 코딩하는 유전자의 분리과정을 개략적으로 도시하였다. 또한, HRF에 대해 우세한 결합을 나타내는 파아지 디스플레이 펩타이드를 하기 표 1에 나타내었다.

파아지	펩타이드	아미노산 서열	빈도
ph1	p1	LVTYPLP	1
ph2	p2	WYVYPSM	18
ph3	p3	SYLPYPY	1
ph4	p4	WEFPGWM	5

실시예 7: 파아지 ELISA 분석

하기와 같이, 실시예 6에서 얻은 파아지의 결합 친화도를 ELISA로 비교하였다.

즉, SB 배지에서 배양한 ER2537 배양액(OD₆₀₀=0.5∼1) 1 ㎖씩에 각각의 파아지 플라크를 옮기고 37 ℃ 인큐베이터(rpm=250)에서 5 시간 배양하였다. 각각의 배양액 100 ㎕씩을 900 ㎕의 SB 배지에 가하고 밤새 배양한 후, 14,000 rpm에서 5 분씩 2 회 원심분리한 상청액을 ELISA 분석에 사용하였다.

HRF 또는 BSA(대조)를 코팅한 플라스틱 웰에, 분리해낸 각각의 파아지 용액을 동량의 6% BSA/PBS에 희석한 용액 50 ㎕씩을 가하고 2 시간동안 정치하였다. PBST로 5 회 세척한 후 3 % BSA/PBS에 1:5000으로 희석한 HRP-컨쥬게이트된 항-M13 항체(Pharmacia) 100 ㎕씩을 가하고 1 시간동안 정치하였다. PBST로 6 회, PBS로 1 회 세척한 후 퍼옥시다아제(peroxydase) 기질 용액 100 ㎕씩을 가하여 발색 정도를 ELISA 리더를 사용하여 405 nm에서 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 이로부터, 본 발명의 파아지 ph1, ph2 및 ph4, 특히 ph2 및 ph4가 HRF에 특이적으로 결합함을 알 수 있다.

실시예 8: 농도에 따른 HRF와 파아지 클론의 결합력 측정

HRF를 20 ㎍/㎖ 농도에서부터 1/5로 연속적으로 희석한 후(각각 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032 ㎍/㎖) 50㎕ 씩 플라스틱 웰에 고정화하였다. 여기에 역시 1/5 씩 연속적으로 희석한(원액의 1/2, 1/10, 1/50, 1/250, 1/1250) 파아지 ph2 용액을 가하여 ELISA 분석을 실시하고 405 nm에서 발색정도를 측정하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8로부터, 본 발명에 따른 파아지 ph2 클론이 HRF를 0.4, 0.08, 0.016 및 0.032 ㎍/㎖까지 희석한 경우에도 HRF와의 특이적 결합력을 유지하고 있음을 확인하였다.

실시예 9: 경쟁 결합 분석

a) ELISA 분석을 통해 특이적인 친화도를 나타내는 파아지 클론(ph2 및 ph4)만을 서열분석하여 디스플레이된 펩타이드 서열을 확인한 후, 헵타머 펩타이드(p2 및 p4)를 제작하였다. 또한, 음성 대조군으로서 랜덤 펩타이드(ran, 아미노산 서열: LMEGCRA)를 합성하였다. HRF를 코팅한 웰에 1000 nM에서부터 연속적으로 6% BSA/PBS에 희석한(1000, 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 nM) 펩타이드 용액 30 ㎕씩을 가하고 실온에서 30 분간 정치한 후, 여기에 파아지 원액을 1/25로 희석한 것을 가하여 2 시간 더 정치하였다. PBST로 5 회 세척한 후 HRP-컨쥬게이트된 항-M13 항체를 100 ㎕씩 가하고 1 시간 정치하였다. PBST로 6 회, PBS로 1 회 세척한 후, 퍼옥시다아제 기질 용액 100 ㎕씩을 가하여 발색 정도를 통해 경쟁 여부를 확인하였다. 그 결과를 도 9a 및 9b에 나타내었다. 이로부터, 합성 펩타이드 p2 및 p4가 모두 파아지 클론 ph2 및 ph4와 경쟁적으로 HRF에 결합함을 알 수 있다.

b) p1, p2 및 p4가 HRF의 동일한 부위에 결합하는지 여부를 시험하기 위하여, 상기 a)와 실질적으로 동일한 방법에 따라 HRF를 코팅하고 ph2에 대한 p1, p2 및 p4의 경쟁결합 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 9c에 나타내었다. 이로부터,p1, p2 및 p4가 모두 HRF의 동일 부위에 결합함을 알 수 있다.

실시예 10: HRF 결합 펩타이드의 아미노산 서열 변이

본 발명에 따른 헵타머 펩타이드의 HRF 결합 친화도에 관여하는 잔기를 확인하기 위하여, p2의 아미노산 서열을 하나씩 알라닌(A)으로 치환하고, 단 m5의 경우에만 라이신(K)으로 치환하였다(표 2 참조).

헵타펩타이드	아미노산 서열
p2	WYVYPSM
m1	AYVYPSM
m2	WAVYPSM
m3	WYAYPSM
m4	WYVAPSM
m5	WYVYKSM
m6	WYVYPAM
m7	WYVYPSA

상기 펩타이드의 HRF 결합능을 실시예 7과 실질적으로 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. 이로부터, HRF 결합능이 p2, m6>m7>m3>m2>m5>m1>m4임을 알 수 있다.

실시예 11: 히스타민 분비 측정

pRSET-A 벡터에 PCR로 클로닝된 래트 HRF 전장 서열(Chitpatima 등, 1988)을 클로닝한 후,E. coli에서 과발현시켰다. 발현된 재조합 단백질을 His-결합 Ni 칼럼(Novagen)을 이용하여 정제하고 RBL-2H3 세포를 자극하기 위해 사용하였다. RBL-2H3을 1×10⁶세포로 24-웰에서 증식시킨 후, 래트 IgE 항체(0.2 ㎍/㎖,Serotec)로 45∼60 분간 감작시키고 재조합 HRF 단백질을 20 ㎍/㎖로 처리하였다(양성 대조군). 상기에서 준비한 세포에 헵타머 펩타이드 p1 및 p2를 용량-의존적 방법으로 처리하였다. 또한, 재조합 HRF 단백질과 펩타이드 p1, p2, p4 및 m1 내지 m7을 20 ㎍/㎖로 HRF와 동일한 농도로 처리하였다.

상기에서 얻은 샘플을 RIA-분석 키트(Immunotech, 프랑스)를 이용하여 아실화된 히스타민으로 제조한 후¹²⁵I-아실화된 히스타민과 모노클로날 항체에 경쟁 결합시켰다. 이 샘플을 다시 γ-계수기에서 측정하였다. 그 결과를 도 11 및 12에 나타내었다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 서열번호 2의 펩타이드(p2)를 RBL-2H3 세포에 가한 경우, 0.01 ㎍/㎖에서부터 HRF에 의한 히스타민 분비를 저해하였다. 또한, 도 12에 나타낸 바와 같이, p1, p2, p4 및 m1 내지 m7을 20 ㎍/㎖를 가하였을 때, m2>m5>m4>p2>m3>p1=p4>m1>m7>의 순서로 HRF에 의한 히스타민 분비를 저해하며, m6의 경우 히스타민 분비를 오히려 증가시킴을 관찰하였다.

실시예 12: HRF의 신경전달물질 방출에 대한 영향 분석

HRF가 (Na,K)ATPase 효소의 억제물질로 작용하여 신경전달물질의 방출을 증가시킬 수 있는지를 조사하였다. 이를 위하여, PC12 세포[아부-라야(Abu-Raya) 등, 1999]의 배양액에 HRF을 가하여 기저 상태 및 K⁺-탈분극 상태에서 유도되는 [³H]-표지된 도파민의 방출 변화를 측정하였다. PC12 세포로는 계대 번호(passage number) 5 내지 15에서 얻은 세포를 사용하였으며, 이를 10% 말 혈청, 5% 우태아혈청, 페니실린(100 U/㎖) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖)이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 5% CO₂공급하에 37 ℃에서 배양하였다.

[³H]-도파민 방출을 측정하기 위하여, 실험 하루전 폴리-L-라이신(10 ㎍/㎖)으로 코팅된 12 웰 디쉬에서 세포(1×10^-6세포/웰)를 배양하고, [³H]-도파민(0.5 μCi/㎖)이 포함된 새로운 배지를 로딩하여 37 ℃에서 3 시간동안 배양하였다. PBS(1×)로 웰당 1 ㎖씩 2∼3 회 세척한후, 크렙스 링거(KR) 완충액(125 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgSO₄, 1.2 mM KH₂PO₄, 6 mM 글루코스, 5 mM NaHCO₃)에 아르코르브산(0.2 ㎎/㎖), 파르길린(pargyline)(0.6 ㎎/㎖) 및 데스피라민(despiramine)(2 μM)을 가하고, 이것을 HRF와 함께 1 ㎖씩 로딩한 후, 37 ℃에서 20 분간 반응시켰다. 탈분극 상태에서의 방출은 50 mM KCl이 포함된 KR 완충액에서 측정하였으며, Ca²⁺-결핍 배지는 CaCl₂를 제거하고 0.5 mM EGTA를 가하여 제조된 KR 완충액에서 측정하였다.

반응이 완료된 후, 배양액을 4 ℃, 1,000×g에서 10 분간 원심분리하여 방출된 도파민의 방사능을 측정하고, 세포를 0.5 N NaOH로 가용화시킨 후 조직내의 방사능을 측정하였다. 방출된 도파민의 방출률(%)은 [상징액의 방사능/(상징액의 방사능+조직내의 방사능)×100]으로 계산하였다.

그 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에 나타낸 바와 같이, HRF는 신경 유사 세포인 PC12 세포에서 도파민의 기저 방출을 농도 의존적으로 증가시키며, 10㎍ 처리시, 세포밖의 K⁺농도 증가에 의해 유도되는 탈분극시의 흥분성 방출과 유사한 정도로 도파민의 방출을 촉진시켰다. 또한, 30 ㎍ 이상 처리시, 도파민의 방출이 급격히 증가하였으며, 이 때부터 세포는 배양 디쉬의 바닥에 접착하지 않고 사멸하는 것이 관찰되었다. 한편, HRF는 고농도의 세포밖 K⁺에 의해 유도되는 탈분극시의 흥분성 방출도 농도 의존적으로 증가시켰으며, 농도에 따른 도파민의 방출 증가 반응이 기저 방출 증가 반응에 비해 왼쪽으로 이동되는 양상을 나타내었으나, HRF에 의한 기저 방출 증가 정도에 비해서는 상대적으로 그 증가의 폭이 작았다.

실시예 13: HRF 결합 펩타이드의 HRF에 의한 신경전달물질 방출 억제 시험

한국 출원 제10-2000-0030130호 및/또는 제10-2001-0027896에 개시되어 있는 HRF에 의한 히스타민 방출을 차단하는 펩타이드가 신경 세포에서도 HRF에 의해 유도된 신경전달물질의 방출을 차단하는지 확인하기 위하여, 실시예 12의 방법과 실질적으로 동일한 방법으로 서열번호 2의 펩타이드(p2)가 HRF에 의해 증가된 도파민의 방출에 미치는 영향을 분석하였다.

그 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에 나타낸 바와 같이, HRF 15 ㎍/㎖에 의해 약 110% 증가된 도파민의 방출은 서열번호 2의 펩타이드 60 ㎍/㎖에 의해 약 60% 억제되었다. 따라서, 상기 HRF 결합 펩타이드는 신경 세포에서 HRF에 의해 증가된 신경전달물질의 방출을 효과적으로 차단하는 것으로 확인되었다.

본 발명에 따르면, (Na,K)ATPase 활성의 세포내 조절에 관여하는 HRF는 신경세포에서도 신경 활성에 중요한 역할을 수행하는 (Na,K)-ATPase의 억제에 따른 신경전달물질의 방출을 촉진시키고, 이에 따라, 신경 세포 및 뇌에서 나타나는 병태 생리학적 효과에 중요한 작용을 할 것으로 믿어진다. 따라서, HRF에 의한 신경전달물질의 방출 증가작용을 차단하는 본 발명의 펩타이드는 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨씨병 등의 다양한 세포 사멸-관련 신경 질환의 진단, 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

<110> LEE, kyunglim <120> Uses of IgE-dependent histamine-releasing factor(HRF) and peptides binding thereto <130> PC01-0145-LKR <160> 10 <170> KOPATIN 1.71 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 1 Leu Val Thr Tyr Pro Leu Pro 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 2 Trp Tyr Val Tyr Pro Ser Met 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 3 Trp Glu Phe Pro Gly Trp Met 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 4 Ala Tyr Val Tyr Pro Ser Met 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 5 Trp Ala Val Tyr Pro Ser Met 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 6 Trp Tyr Ala Tyr Pro Ser Met 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 7 Trp Tyr Val Ala Pro Ser Met 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 8 Trp Tyr Val Tyr Lys Ser Met 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 9 Trp Tyr Val Tyr Pro Ala Met 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE-dependent histamine-releasing factor binding peptide <400> 10 Trp Tyr Ala Tyr Pro Ser Ala 1 5

Claims (16)

1. 삭제
2. 하기 아미노산 서열을 갖는 HRF 결합 펩타이드 또는 그를 코딩하는 핵산을 유효성분으로 함유하는 뇌졸중, 알츠하이머병 및 파킨슨씨병으로 구성된 군으로부터 선택된 신경질환에 대한 예방 또는 치료용 조성물:

   (A, L 또는 W)-X-X-X-X-(A,L,S 또는 W)-(A, P 또는 M)

   여기서, X는 임의의 아미노산을 나타낸다.
3. 제2항에 있어서, HRF 결합 펩타이드가 아미노산 서열 (A, L 또는 W)-X-X-(Y, P 또는 A)-(P, G 또는 K)-(A,L,S 또는 W)-(A, P 또는 M)을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제3항에 있어서, HRF 결합 펩타이드가 아미노산 서열 (A, L 또는 W)-(V, Y, E 또는 A)-(T, V, F 또는 A)-(Y, P 또는 A)-(P, G 또는 K)-(A,L,S 또는 W)-(A, P 또는 M)을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제4항에 있어서, HRF 결합 펩타이드가 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제4항에 있어서, HRF 결합 펩타이드가 아미노산 서열 (A 또는 W)-(Y 또는 A)-(V 또는 A)-(Y 또는 A)-(P 또는 K)-(S 또는 A)-(M 또는 A)을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제6항에 있어서, HRF 결합 펩타이드가 서열번호 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제6항에 있어서, HRF 결합 펩타이드가 아미노산 서열 W)-(Y 또는 A)-(V 또는 A)-(Y 또는 A)-(P 또는 K)-(S 또는 A)-M을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제8항에 있어서, HRF 결합 펩타이드가 서열번호 2, 5, 6, 7, 8 및 9로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제2항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, HRF 결합 펩타이드가 L-, D-, 또는 L- 및 D-아미노산으로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 제2항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, HRF 결합 펩타이드가 하나 이상의 변형 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
12. 제11항에 있어서, 변형 아미노산이 아미노산 유도체 또는 알킬화된 아미노산 인 것을 특징으로 하는 조성물.
13. 제2항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 신경전달물질이 도파민인 것을 특징으로 하는 조성물.
14. 제2항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, HRF 결합 펩타이드 또는 그를 코딩하는 핵산이 체중 1 ㎏당 0.3~2.5 ㎎으로 투여되도록 하는 것을 특징으로 하는 조성물.
15. 삭제
16. 삭제