CN101591386B - 抑制兴奋性毒性损伤的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抑制兴奋性毒性损伤的多肽及其应用。该多肽为由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的多肽。实验表明，本发明的多肽不仅在NMDA损伤前预处理可以减轻NMDA致细胞损伤，在NMDA处理后再加入细胞中仍可以发挥细胞保护作用，表明多肽对NMDA受体诱导的兴奋性毒性损伤不仅可以发挥预防作用，还具有治疗作用。因此，本发明的多肽在抑制兴奋性毒性损伤中具有广阔的应用前景。

Description

抑制兴奋性毒性损伤的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及抑制兴奋性毒性损伤的多肽及其应用。

背景技术

兴奋性毒性的概念最早是在上个世纪70年代由Olney等人提出的，是由中枢兴奋性神经递质——谷氨酸受体的过度持续活化而导致的神经元死亡过程。谷氨酸受体过度激活使正常生理刺激下引起的生物学效应进一步放大，从而使突触后神经元过度兴奋并最终死亡。突触前神经元递质释放增加、胶质细胞对递质的重摄取减少以及谷氨酸转运蛋白的逆向转运等因素，均可导致细胞外谷氨酸浓度的升高。此外，谷氨酸受体敏感性增加也是产生兴奋性毒性损伤的因素之一。

目前认为，中风、脑外伤、癫痫等急性脑损伤以及帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化等慢性神经退行性疾病，均有谷氨酸兴奋性毒性损伤的参与。生理状态下，细胞消耗70％的能量用于通过Na⁺/K⁺ATPase维持胞内高K⁺低Na⁺的浓度梯度及细胞膜电位。缺血、缺氧等因素致细胞能量供应不足或细胞能量代谢发生障碍时，ATP生成减少，Na⁺/K⁺ATPase功能失调，胞内K⁺释放，胞外Na⁺内流，细胞膜电位丧失，从而使神经元和胶质细胞Na⁺依赖的谷氨酸转运蛋白发生逆向转运，将谷氨酸从胞内转运至胞外。此外，突触前神经元去极化可增加谷氨酸递质的释放。上述因素共同导致细胞外谷氨酸浓度的升高和兴奋性毒性损伤，继之以神经元死亡。

谷氨酸受体分为离子型谷氨酸受体和代谢型谷氨酸受体两种类型，其中前者又分为α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-proprionic acid，AMPA)受体、N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体和海人藻酸(kainatereceptor，KA)受体。谷氨酸受体过度激活导致兴奋性毒性损伤的主要过程包括：第一阶段，谷氨酸与突触后AMPA和KA受体结合，大量Na⁺、Cl^-内流和被动性的H₂O内流，细胞发生急性渗出性肿胀，此为可逆性变化。部分细胞可发生溶解和即刻性死亡，在伤后1-2小时内出现；第二阶段，大量谷氨酸与NMDA受体结合，同时突触后神经元去极化使Mg²⁺对NMDA受体电压依赖性的阻滞作用去除，NMDA受体被激活，大量Ca²⁺内流，形成致死性Ca²⁺超载，造成延迟性细胞死亡，一般在数小时至数天发生，此为兴奋性毒性损伤的主要过程。

NMDA受体是由两个NR1亚基和两个NR2亚基形成的异四聚体结构，同时表达NR1和NR2亚基是形成功能性NMDA受体所必需的。NR1亚基被认为是NMDA受体的结构性亚基，NR2亚基是调节性亚基，赋予NMDA受体不同的药理学和电生理学特性，其中NR2A和NR2B亚基是两种主要的类型。

与AMPA受体和KA受体相比，NMDA受体具有独特的功能特性，即甘氨酸的协同激活作用、Mg²⁺电压依赖性阻滞、Ca²⁺的高通透性和缓慢的门控动力学。尽管基础状态下，快速兴奋性突触传递主要通过AMPA受体介导，但由于NMDA受体对Ca²⁺具有高通透性，Ca²⁺作为第二信使可激活多条信号转导通路，调节受体功能及其生物学效应，因此，NMDA受体在中枢神经系统的突触传递和突触可塑性调节中发挥重要作用，与感觉、运动、学习和记忆等生理活动密切相关。同时正是由于NMDA受体对Ca²⁺的高通透性，使其成为介导谷氨酸兴奋性毒性损伤的核心分子。

NMDA受体是导致大量钙内流、钙超载的首要原因，其他通道如电压门控钙通道、电压门控钠通道等仅起继发性作用。因此，理论上NMDA受体拮抗剂可用来治疗兴奋性毒性引起的细胞损伤，发挥神经保护作用，NMDA受体谷氨酸结合位点拮抗剂、甘氨酸结合位点拮抗剂、通道阻断剂、N端拮抗剂等各种具有不同亲和力和亚型选择性的拮抗剂不断涌现。但临床实验结果令人失望，由于几乎所有的神经元都表达NMDA受体，拮抗剂不可避免地阻断了NMDA受体正常的兴奋性突触传递功能，产生明显的毒副作用，如幻觉和记忆障碍等精神症状以及对运动功能的损伤。拮抗剂已经不是阻断NMDA受体兴奋性毒性作用的理想药物，从NMDA受体的调节分子和作用蛋白入手，另辟蹊径，通过干扰蛋白质相互作用，阻断NMDA受体兴奋性毒性损伤的下游信号通路，从而减缓兴奋性毒性损伤，具有重要的理论和现实意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供可抑制兴奋性毒性损伤的多肽(及其编码基因)。

本发明所提供的多肽，为如下a)、b)、c)、d)或e)所示的多肽：

a)、由SEQID NO.1自N端起第21-40位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的多肽；

b)、由SEQ ID NO.1自N端起第1-50位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的多肽；

c)、由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的多肽；

d)、由SEQ ID NO.1自N端起第51-256位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的多肽；

e)、由SEQ ID NO.1自N端起第101-256位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的多肽；

f)、将a)、b)、c)、d)或e)限定的多肽的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的分别由a)、b)、c)、d)或e)限定的多肽衍生的多肽。

含有上述任一所述多肽的编码基因的重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种抑制兴奋性毒性损伤的药物。

本发明所提供的抑制兴奋性毒性损伤的药物，其活性成份为上述任一所述多肽或上述任一所述编码基因或上述任一所述重组载体。

上述任一所述多肽或任一所述编码基因或任一所述重组载体在制备抑制兴奋性毒性损伤的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的发明人进行了大量实验探索研究，发现蛋白DREAM/Calsenilin/KChIP3(以下简称DREAM，downstream regulatory elementantagonist modulator，氨基酸残基序列如SEQ ID NO.1所示)可以与NMDA受体的NR1亚基发生直接的结合，结合位点包括其N端(1-50位氨基酸)和C端(101-256位氨基酸，含有4个EF hand结构域)，并且二者单独均可以与NR1亚基结合，但前者与NR1亚基的结合能力强，后者与NR1亚基的结合相对较弱。DREAM 21-40位氨基酸构成其N端与NR1亚基结合的核心序列。据此序列，构建具有穿膜能力的TAT融合肽TAT-21-40。免疫共沉淀实验表明，TAT-21-40使与DREAM结合的NR1亚基量降低至对照组的51.67±7.67％(P＜0.05)。完全体外pull-down实验表明，TAT-21-40使与DREAM 1-50结合的NR1亚基量降低至对照组的54.32±5.69％(P＜0.05)。NMDA损伤前预处理细胞模型实验表明，与scramble-TAT相比，TAT-21-40使神经元使NMDA处理引起的LDH渗出量从2.10±0.18下降为1.09±0.06(P＜0.05)，使NMDA处理引起的PI阳性细胞数从38.34±1.82％下降为25.39±1.46％(P＜0.001)，统计学差异显著。NMDA处理后细胞模型实验表明，TAT-21-40使NMDA致LDH释放量从4.70±0.20下降到4.20±0.06(P＜0.05)，PI阳性细胞数从46.89±1.59％下降到38.54±1.35％(P＜0.001)，差异具有统计学意义。表明，TAT-21-40不仅在NMDA损伤前预处理可以减轻NMDA致细胞损伤，在NMDA处理后再加入细胞中仍可以发挥细胞保护作用，表明TAT-21-40对NMDA受体诱导的兴奋性毒性损伤不仅可以发挥预防作用，还具有治疗作用。因此，本发明的多肽及其编码基因在抑制兴奋性毒性损伤中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为DREAM与NR1亚基结合位点的鉴定。

图2为TAT-21-40对DREAM与NR1亚基结合的影响。

图3为TAT-21-40预处理对NMDA致细胞损伤程度的影响。

图4为TAT-21-40后处理对NMDA致细胞损伤程度的影响。

图5为TAT-21-40减少NMDA受体在胞膜的表达。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、DREAM蛋白与NR1亚基结合位点的鉴定

DREAM蛋白全长256个氨基酸，在其102-113，139-150，175-186和223-234位氨基酸各有一个EF hand结构域。据此将DREAM蛋白分段，N端定义为1-100位，C端定义为101-256位，含有4个完整的EF hand结构域，N端进一步又分为1-50位和51-100位两段。

DREAM蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实验一中使用如下肽段：DREAM 1-50(SEQ ID NO.1所示DREAM蛋白N端起第1-50位氨基酸肽段)、DREAM 51-100(SEQ ID NO.1所示DREAM蛋白N端起第51-100位氨基酸肽段)、DREAM 101-256(SEQ ID NO.1所示DREAM蛋白N端起第101-256位氨基酸肽段)、DREAMΔ1-50(SEQ ID NO.1所示DREAM蛋白N端起第51-256位氨基酸肽段)、DREAM(SEQ ID NO.1所示)(图1a)。实验时在各肽段前加GST标签。

实验二中使用如下肽段：DREAM 1-20(SEQ ID NO.1所示DREAM蛋白N端起第1-20位氨基酸肽段)、DREAM 11-30(SEQ ID NO.1所示DREAM蛋白N端起第11-30位氨基酸肽段)、DREAM 21-40(SEQ ID NO.1所示DREAM蛋白N端起第21-40位氨基酸肽段)、DREAM 31-50(SEQID NO.1所示DREAM蛋白N端起第31-50位氨基酸肽段)(图1d)。实验时在各肽段前加GST标签。

几种带有His₆标签或GST标签的蛋白的制备如下：构建原核表达载体然后进行制备。

GST-tag菌体裂解液：10mM PMSF/1×PI/1×PBS；

His₆-tag菌体裂解液：Na₂HPO₄·H₂O 7.8g，NaCl 17.54g，咪唑(Sigma)0.68g溶于800ml ddH₂O中，用NaOH调pH值至8.0。

表1、引物序列表

1、His₆-NR1-1a亚基C末端蛋白的制备和纯化：

1)制备NR1-1a亚基C末端的编码基因：以大鼠全脑cDNA为模板，用表1中序列1所示引物进行PCR扩增，得到NR1-1a亚基C末端的编码基因(大鼠NR1基因834-938位)，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；NR1-1a亚基C末端蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2)含有“His₆-NR1-1a亚基C末端的编码基因”的重组菌的制备：将上述PCR产物经ECoRI和HindIII双酶切插入pet28(+)载体(Clontech公司)，得到含有“His₆-NR1-1a亚基C末端的编码基因”的重组载体；将重组载体导入BL21(DE3)菌(天根生化科技(北京)有限公司)，得到含有“His₆-NR1-1a亚基C末端的编码基因”的重组菌，经测序(上海生工生物工程技术服务有限公司)确认插入片段正确。

3)发酵重组菌，诱导His₆-NR1-1a亚基C末端蛋白表达及纯化：

取单克隆重组菌，摇菌过夜；取上述菌液按最终诱导体积1/10的比例加入新鲜培养基中，37℃250rpm，摇菌2-3h；加入0.5mM IPTG诱导，30℃250rpm继续摇菌1-2h；4℃3,000rpm×15min离心，弃上清，收集菌体沉淀；每ml菌液加入100ul裂解液重悬菌体，超声破碎细胞40W 6s×3次；加入10％TritonX-100，使其终浓度为1％，4℃混悬1h；4℃12,000rpm×20min离心，取上清；上清中加入15-20ul珠子(Ni-NTA agrose，Qiagen，Cat#30210)，4℃混悬2h；wash buffer(Na₂HPO₄·H₂O 7.8g，NaCl 17.54g，咪唑1.36g溶于800ml ddH₂O中，用NaOH调pH值至8.0)清洗珠子6次，4℃2,000rpm×2min离心，去除非特异性结合；加入适量洗脱缓冲液(Na₂HPO₄·H₂O 7.8g，NaCl 17.54g，咪唑17g溶于800ml ddH₂O中，用NaOH调pH值至8.0)，4℃静置30min，2,000rpm×2min离心取上清，此为纯化的His₆-NR1-1a亚基C末端蛋白(即带有组氨酸标签的NR1-1a亚基C末端蛋白)。

2、分别连有GST标签的蛋白的制备：

1)各蛋白的编码基因的扩增：以大鼠全脑cDNA为模板，以表1中所示序列为引物，进行PCR扩增，分别得到如下多肽片段的编码基因；将PCR产物进行测序验证，结果产物序列正确。

DREAM 1-50(SEQ ID NO.1所示DREAM蛋白N端起第1-50位氨基酸肽段)(引物表1中3)、

DREAM 51-100(SEQ ID NO.1所示DREAM蛋白N端起第51-100位氨基酸肽段)(引物表1中4)、

DREAM 101-256(SEQ ID NO.1所示DREAM蛋白N端起第101-256位氨基酸肽段)(引物表1中5)、

DREAMΔ1-50(SEQ ID NO.1所示DREAM蛋白N端起第51-256位氨基酸肽段)(引物表1中6)、

DREAM(SEQ ID NO.1所示)(引物表1中2)、

DREAM-1-20(SEQ ID NO.1所示DREAM蛋白N端起第1-20位氨基酸肽段)(引物表1中7)、

DREAM-11-30(SEQ ID NO.1所示DREAM蛋白N端起第11-30位氨基酸肽段)(引物表1中8)、

DREAM-21-40(SEQ ID NO.1所示DREAM蛋白N端起第21-40位氨基酸肽段)(引物表1中9)、

DREAM-31-50(SEQ ID NO.1所示DREAM蛋白N端起第31-50位氨基酸肽段)(引物表1中10)。

2)含有“各肽段的编码基因”的重组菌的制备：上述PCR产物经ECoRI和XhoI双酶切插入PGEX-5X-1载体(Clontech公司)，得到含有“连接有GST标签的各肽段的编码基因”的重组载体；将重组载体导入BL21(DE3)菌，得到含有“连接有GST标签的各肽段的编码基因”的重组菌，经测序确认插入片段正确。

3)发酵重组菌，制备连接有GST标签的各肽段及连接有该蛋白的珠子：取单克隆重组菌，摇菌过夜；取上述菌液按最终诱导体积1/10的比例加入新鲜培养基中，37℃250rpm，摇菌2-3h；加入0.5mM IPTG诱导，30℃250rpm继续摇菌1-2h；4℃3,000rpm×15min离心，弃上清，收集菌体沉淀；每ml菌液加入100μl裂解液重悬菌体，超声破碎细胞40W 6s×3次；加入10％Triton X-100，使其终浓度为1％，4℃混悬1h；4℃12,000rpm×20min离心，取上清；上清中加入15-20μl珠子(Glutathione Sepharose^TM 4 fast flow，Amersham Pharmacia，Cat#17-5132-01)，4℃混悬2h；1×PBS清洗珠子6次，4℃2,000rpm×2min离心，去除非特异性结合，备用。

分别得到连有蛋白GST-DREAM 1-50、蛋白GST-DREAM 51-100、蛋白GST-DREAM101-256、蛋白GST-DREAMΔ1-50、蛋白GST-DREAM的珠子(图1a)。

分别得到连有蛋白GST-DREAM 1-20、蛋白GST-DREAM 11-30、蛋白GST-DREAM21-40、蛋白GST-DREAM 31-50的珠子(图1d)。

海马组织总蛋白提取物的制备：大鼠断头，迅速分离海马，单侧海马加入500ul组织裂解液[Tris-HCl(pH7.5)50mM，NaCl 250mM，EDTA 10mM，NP-400.5％，Leupeptin 10uM，PMSF 1mM，NaF 4mM]，组织匀浆器(Pellet

Motor，Rontes)研磨，研磨充分后补加500ul裂解液，4℃混悬1h；4℃12,000g×4min离心，分离组织碎片，取上清即为海马组织总蛋白提取物。

一、完全体外pull-down实验

将纯化的His₆-NR1a亚基C末端蛋白分别与结合GST标签蛋白(GST标签蛋白、GST-DREAM 1-50、GST-DREAM 51-100、GST-DREAM 101-256、GST-DREAMΔ1-50、GST-DREAM蛋白)的珠子孵育，孵育液用预冷的0.1％Triton X-100/1×TBS，4℃混悬2h；预冷的0.1％Triton X-100/1×TBS清洗珠子6次，2,000rpm×2min离心，去除非特异结合；每管加入洗脱缓冲液[10mM还原型谷胱甘肽(Roche)，50mM Tris-Cl(pH8.0)]10μl冰浴10-20min，洗脱蛋白，加入6×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，SDS-PAGE电泳；待电泳前沿指示剂至凝胶底部时，停止电泳，去除浓缩胶，将分离胶放入转膜液中，室温洗胶20min；4℃恒压转膜(100V)1h；将NC膜放入到封闭液(含5％脱脂奶粉的1×TBST溶液)中，室温封闭1h；一抗His₆标签抗体(北京普利莱基因技术有限公司，CAT#C1301，小鼠单克隆抗体，1∶1000稀释)或GST标签抗体(北京普利莱基因技术有限公司，CAT#C1303，小鼠单克隆抗体，1∶2000稀释)孵育，1×TBST洗膜，5min×3次；HRP标记羊抗小鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，CAT#ZB-2305，1∶1000稀释)孵育，1×TBST洗膜，10min×3次；化学发光液(A，B液等量混合，Santa Cruz，sc 2048)孵育2min，暗室曝光。

实验设3次重复。结果表明，除GST-DREAM 51-100(记作51-100)外，GST-DREAM1-50(记作1-50)、GST-DREAM 101-256(记作101-256)、GST-DREAMΔ1-50(记作Δ1-50)及GST-DREAM(记作full length)均可以与His₆-NR1C-末端蛋白结合，并且DREAM 1-50的结合力最强(图1b)。

二、半体外pull-down实验

实验方法与实验一中所述方法相同，不同的是将海马组织总蛋白提取物分别与结合GST蛋白(GST标签蛋白、GST-DREAM 1-50、GST-DREAM 51-100、GST-DREAM101-256、GST-DREAM 51-256、GST-DREAM蛋白)的珠子孵育。

实验设3次重复。结果与实验一类似，虽然GST-DREAM 1-50、GST-DREAM101-256、GST-DREAMΔ1-50及GST-DREAM(记作full length)均可以与内源性表达的NR1亚基结合，但GST-DREAM 1-50与NR1亚基的结合最强(图1c)。

三、将DREAM1-50进一步分段，再进行完全体外pull-down实验

实验方法与实验一中方法相同，不同的是所用的珠子如下：连有GST蛋白、GST-DREAM 1-50、GST-DREAM 1-20、GST-DREAM 11-30、GST-DREAM 21-40、GST-DREAM31-50蛋白的珠子。

实验设3次重复。结果显示，GST-DREAM 21-40(记作21-40)与His₆-NR1 C-末端蛋白结合最强(图1e)。

综合实验一、二和三的结果，表明DREAM N端和C端均参与NR1亚基的相互作用，但N端起第21-40位氨基酸肽段与NR1亚基的结合最强。

实施例2、TAT-21-40抑制兴奋性毒性损伤的应用

TAT(transcriptional activator protein)穿膜肽是跨膜递送载体之一，可以将与其共价连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入细胞，甚至可以通过血脑屏障，转导效率高并且对细胞无损伤，在细胞生物学、基因治疗学及药学等领域得到广泛应用。根据DREAM N端与NR1亚基结合的主要位点即其N端21-40位氨基酸，构建具有穿膜能力的融合肽——TAT-21-40。将靶序列的氨基酸顺序打乱，构建scramble-TAT作为对照。

TAT-21-40的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，由TAT穿膜序列(RKKRRQRRR)和DREAM N端起第21-40位氨基酸组成。TAT-21-40由吉尔生化(上海)有限公司合成，其分子量为3873.67，分子式为C₁₆₇H₂₉₅N₇₁O₃₆。(图2a)

scramble-TAT的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，由吉尔生化(上海)有限公司合成，其分子量为3873.67，分子式为C₁₆₇H₂₉₅N₇₁O₃₆。(图2a)

一、TAT-21-40抑制DREAM与NR1亚基的结合

1、免疫共沉淀实验检测TAT-21-40对DREAM与NR1亚基结合的影响

免疫共沉淀实验步骤：先用预冷的PBS缓冲液清洗珠子(protein A-SepharoseCL-4，Amersham Pharmacia，CAT#17-5280)3次，2,000rpm×2min离心，弃上清；珠子(每管20μl)与DREAM抗体(Santa cruz，CAT#sc 9142)孵育，按1∶100的比例用组织裂解液稀释DREAM抗体，4℃混悬3h，得到孵育液；在上述孵育液中加入200μg海马组织总蛋白提取物，4℃混悬过夜；用预冷的0.1％TritonX-100/1×TBS清洗珠子6次，2,000rpm×2min离心，去除非特异结合；吸净上清，加入2×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，煮沸，使与珠子结合的蛋白释放；SDS-PAGE电泳；转膜、封闭、一抗NR1抗体(Santa Cruz，CAT#sc 1467，1∶500稀释)孵育，置4℃摇床过夜；1×TBST洗膜5min×3次，二抗HRP标记兔抗羊二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，CAT#ZB 2306，1∶1000稀释)孵育，室温1h；1×TBST洗膜10min×3次；暗室曝光。

实验组(记作TAT-21-40)：向孵育液中同时加入200μg海马组织蛋白提取物和TAT-21-40(TAT-21-40在孵育液中的浓度为3μM)，进行实验。

对照组(记作Scramble-TAT)：向孵育液中同时加入200μg海马组织蛋白提取物和scramble-TAT(scramble-TAT在孵育液中的浓度为3μM)，进行实验。

定量统计“TAT-21-40抑制DREAM与NR1亚基的结合”：将SDS-PAGE电泳后转膜经抗体检测的条带扫描，利用TotalLab软件(Amersham Biosciences)进行灰度分析，并将对照组的灰度值设为1，实验组与对照组相比所得数值为实验组的灰度值。

实验设3次重复。结果显示TAT-21-40显著抑制DREAM与NR1亚基的结合。定量统计结果显示：TAT-21-40使与DREAM结合的NR1亚基量降低至对照组的51.67±7.67％(P＝0.0242，n＝3，Paired t-test)(图2b和c)。以上结果表明TAT-21-40能够竞争性抑制DREAM与NR1亚基的结合，但不能完全阻断二者的结合。

2、完全体外pull-down实验检测TAT-21-40对DREAM-1-50与NR1亚基C端结合的影响

实验步骤与实施例1中实验一中所述相同，不同的是将His₆-NR1C末端蛋白与结合有GST-DREAM 1-50的珠子孵育。

实验组(记作TAT-21-40)：将His₆-NR1C-末端蛋白与珠子孵育时，向孵育液中加入TAT-21-40(TAT-21-40在孵育液中的浓度为3μM)，进行实验。

对照组(记作Scramble-TAT)：将His₆-NR1C-末端蛋白与珠子孵育时，向孵育液中加入scramble-TAT(scramble-TAT在孵育液中的浓度为3μM)，进行实验。

定量统计方法与上述实验1中所述相同。

实验设3次重复。结果显示在孵育液中加入3μMTAT-21-40可以显著降低DREAM1-50与NR1亚基C端的结合(图2d)。定量统计结果显示：TAT-21-40使与DREAM1-50结合的NR1亚基量降低至对照组的54.32±5.69％(图2e，n＝3，*P＝0.0152，Paired t-test)。

实验1和2的结果显示TAT-21-40显著抑制DREAM N端1-50与NR1亚基C末端蛋白的结合。结合上述工作结果，Δ1-50DREAM具有比DREAM更强的减缓兴奋性毒性损伤的效应，TAT-21-40通过竞争性抑制DREAM N端1-50与NR1亚基的结合，使DREAM C端更好地发挥细胞保护效应。

二、TAT-21-40抑制NMDA受体介导的兴奋性毒性损伤作用

NMDA处理造成的神经元兴奋性毒性离体模型常被用来研究NMDA受体参与兴奋性毒性损伤的机制及筛选神经保护药物。在原代培养9天的海马神经元上，通过NMDA处理造成兴奋性毒性损伤模型，观察TAT融合肽预处理和后处理对细胞损伤程度的影响。

原代海马神经元的培养：E18SD孕鼠购自北京大学医学部实验动物科学部。E18SD孕鼠脱臼处死，立即在无菌条件下分离胚胎置于预冷的解剖液中，用尖头小镊子剥离皮肤和颅骨，取全脑，置于装有预冷的解剖液的小平皿中，用游丝镊仔细分离双侧海马；加入0.125％胰酶37℃消化30min，然后用含10％FBS的DMEM培养基终止消化；吹打得到细胞悬液，静置，取上清，沉淀中再加入含10％FBS的DMEM液继续吹打，静置，取上清，如此反复数次；将几次取得的上清合并，200目细胞筛过滤除去组织碎片，血球计数板计数，调整细胞至合适密度；将细胞分别接种于Poly-D-lysine(1mg/ml，Sigma)处理过的孔板或培养皿中；4-6h后，待细胞贴壁换为含B27的Neurobasal培养基；2天后加入终浓度为10μM的Ara-C(cytosinearabinoside，Sigma)，每3天半量换液一次。培养9天，进行下一步实验。

乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)测定：采用CytoTox96non-radioactive cytotoxicity assay kit(Promega，CAT#G1780)，具体步骤如下：吸取待测孔培养基上清加入96孔板中，每孔50μl；将assay buffer与reconstitute substrate mix混合，加入上述测定孔中，每孔50μl；混匀，室温避光孵育30min；每孔加入50μl stop solution，终止反应；酶标仪490nm读数；每个样本3复孔，取其均值为该样本吸光值；将加入scramble-TAT并未经NMDA处理组作为空白对照组，其吸光值的均值标准化为1，加入scramble-TAT并经NMDA处理组、加入TAT-21-40未经NMDA处理组和经NMDA处理组的吸光值除以空白对照组吸光值均值所得数值为测量值。数值越高，代表LDH释放量越多，细胞损伤越严重。

Hoechst 33342与碘化丙啶PI(propidium iodide)双标染色：细胞处理完毕后，加入含2μg/ml Hoechst 33342(Sigma)和1μg/ml PI(Sigma)的1×PBS室温染色10min；用1×PBS轻洗细胞2次，即刻荧光显微镜(Leica DRM，Germany)观察，CCD摄像头、Qcapture软件(Qimagine，Media Cybernetics，Canada)拍照，每个样本随机选取至少6个视野。Hoechst 33342为紫外光激发，发射蓝光，标记所有细胞；PI为绿光激发，发射红光，标记死亡细胞。统计PI阳性细胞比例；PI阳性细胞比例的计算公式为：PI阳性细胞数/Hoechst阳性细胞数×100％。

1、TAT-21-40预处理对细胞损伤程度的影响

1)加入TAT-21-40：

NMDA处理组：先在神经元原培养基中加入终浓度为3μM的TAT-21-40孵育1小时，然后加入终浓度为100μM的NMDA(Sigma，CAT#M3262)和终浓度为100μM的甘氨酸(Novon)，处理1小时后更换为新鲜无酚红neurobasal培养基(Gibco，CAT#12348017)，12小时后进行细胞损伤测定(通过检测培养基中LDH的释放量和计数PI阳性细胞数反映细胞的损伤程度)(图3a)。

未处理组：先在神经元原培养基中加入终浓度为3μM的TAT-21-40孵育1小时，然后更换为新鲜无酚红neurobasal培养基，12小时后进行细胞损伤测定。

2)加入scramble-TAT：

NMDA处理组：方法同上述加入TAT-21-40的NMDA处理组，不同的是将TAT-21-40替换为scramble-TAT。

未处理组：方法同上述加入TAT-21-40的未处理组，不同的是将TAT-21-40替换为scramble-TAT。

实验设3次重复。结果显示，未经NMDA处理组，scramble TAT组神经元LDH的基础释放量为1±0.10，TAT-21-40组神经元LDH的基础释放量为1.19±0.04，差异无统计学意义；NMDA处理组，与scramble-TAT相比，TAT-21-40使神经元经NMDA处理引起的LDH渗出量从2.10±0.18下降为1.09±0.06(P＜0.05)，统计学差异显著(图3b，n＝4，*P＜0.05，双因素方差分析)。同时，PI阳性细胞计数结果显示，未经NMDA处理组，scramble TAT组的PI阳性细胞数为11.61±0.88％，TAT-21-40组的PI阳性细胞数为13.63±1.50％，差异无统计学意义；NMDA处理组，与scramble TAT相比，TAT-21-40使NMDA处理引起的PI阳性细胞数从38.34±1.82％下降为25.39±1.46％(P＜0.001)，统计学差异显著(图3c，n＝26，***P＜0.001，双因素方差分析)。

2、TAT-21-40后处理对细胞损伤程度的影响

1)加入TAT-21-40：

NMDA处理组：在神经元原培养基中加入终浓度为100μM的NMDA和终浓度为100μM的甘氨酸处理1小时后更换为新鲜无酚红neurobasal培养基，同时加入终浓度为3μM的TAT-21-40孵育，12小时后进行细胞损伤测定(检测培养基中LDH的释放量和计数PI阳性细胞数)(图4a)。

未处理组：正常培养神经元与NMDA处理组同时更换为新鲜无酚红neurobasal培养基，同时加入终浓度为3μM的TAT-21-40孵育，12小时后进行细胞损伤测定。

2)加入scramble-TAT：

NMDA处理组：方法同上述加入TAT-21-40的NMDA处理组，不同的是将TAT-21-40替换为scramble-TAT。

未处理组：方法同上述加入TAT-21-40的未处理组，不同的是将TAT-21-40替换为scramble-TAT。

LDH的释放量和计数PI阳性细胞数方法与实验1中所述相同。

实验设3次重复。LDH测定结果显示，未经NMDA处理组，TAT-21-40与scrambleTAT相比，神经元LDH的基础释放量从1.00±0.14下降为0.34±0.02(图4b，n＝3-4，**P＜0.01，双因素方差分析)；NMDA处理组，TAT-21-40使NMDA致LDH释放量从4.70±0.20下降到4.20±0.06(P＜0.05)(图4b，n＝3-4，*P＜0.05，双因素方差分析)。PI阳性细胞计数结果显示，未经NMDA处理组，scramble TAT组PI阳性细胞数为4.75±0.64％，TAT-21-40组为2.25±0.30％，差异无统计学意义；NMDA处理组，与scramble TAT组相比，TAT-21-40使PI阳性细胞数从46.89±1.59％下降到38.54±1.35％(P＜0.001)，差异具有统计学意义(图4c，n＝27-28，***P＜0.001，双因素方法分析)。

以上结果说明，预先使用TAT-21-40可以对NMDA致神经元损伤发挥一定的保护作用，更重要的是在NMDA损伤后使用TAT-21-40仍然可以减轻神经元的损伤程度，具有细胞保护效应。

三、TAT-21-40减少NMDA受体在胞膜的表达

原代海马神经元的培养：同本实施例中实验二所述。

生物素标记细胞表面蛋白实验：采用EZ link-NHS-LC-biotin标记试剂盒(Pierce，CAT#21335)和

Immobilized NeutrAvidin^TM Protein Plus(Pierce，CAT#53151)。平衡瓶装biotin至室温，称取1mg溶于2ml含Ca²⁺，Mg²⁺DPBS中，biotin终浓度为0.5mg/ml；用冰冷的含Ca²⁺，Mg²⁺DPBS轻洗细胞3次，加入适量的上述biotin溶液(覆盖皿底)，4℃1-2h；小心弃去biotin溶液，用预冷的中和液[含100mM甘氨酸的Ca²⁺，Mg²⁺DPBS(PH 7.2)]轻洗细胞3次，中和残留的未与蛋白结合的biotin；加入适量裂解液(1％Triton X-100/0.1％SDS/1×PI/1×PBS)裂解细胞，冰上15min，刮下细胞，12,000g×4min离心，取上清，即为总蛋白提取物；BCA蛋白定量；每管蛋白(200μg)中加入20ul珠子(预先用PBS清洗3次)，4℃混悬过夜；4℃5,000g×1min离心，wash buffer[1％Triton X-100/0.1％SDS/1×PBS]轻洗珠子6次；弃净上清，加入10-15μl2×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，SDS-PAGE电泳；转膜、封闭、一抗、二抗孵育(所用抗体同免疫共沉淀实验)、曝光。

实验组(记作TAT-21-40)：用3μM TAT-21-40处理神经元细胞2小时，然后进行生物素标记细胞膜表面蛋白检测实验。

对照组(记作scramble-TAT)：用3μMscramble-TAT处理神经元细胞2小时，然后进行生物素标记细胞膜表面蛋白检测实验。

定量统计“TAT-21-40抑制NMDA受体在胞膜的表达”：与本实施例实验一定量统计“TAT-21-40抑制DREAM与NR1亚基的结合”所述一致。

实验设3次重复。结果显示，3μMTAT-21-40处理神经元2小时，引起胞膜NR1亚基的表达量下降为sramble-TAT对照组的44.33±9.40％(P＝0.0274)(图5，n＝3，*P＝0.0274，Paired t-test)。以上结果说明，TAT-21-40通过抑制NMDA受体在胞膜的表达，从而减轻其介导的兴奋性毒性损伤作用。

序列表

<110>北京大学

<120>抑制兴奋性毒性损伤的多肽及其应用

<160>5

<210>1

<211>256

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Met Gln Arg Thr Lys Glu Ala Met Lys Ala Ser Asp Gly Ser Leu Leu

1               5                  10                  15

Gly Asp Pro Gly Arg Ile Pro Leu Ser Lys Arg Glu Gly Ile Lys Trp

            20                  25                  30

Gln Arg Pro Arg Phe Thr Arg Gln Ala Leu Met Arg Cys Cys Leu Ile

        35                  40                  45

Lys Trp Ile Leu Ser Ser Ala Ala Pro Gln Gly Ser Asp Ser Ser Asp

    50                  55                  60

Ser Glu Leu Glu Leu Ser Thr Val Arg His Gln Pro Glu Gly Leu Asp

65                  70                  75                  80

Gln Leu Gln Ala Gln Thr Lys Phe Thr Lys Lys Glu Leu Gln Ser Leu

                85                  90                  95

Tyr Arg Gly Phe Lys Asn Glu Cys Pro Thr Gly Leu Val Asp Glu Asp

            100                 105                 110

Thr Phe Lys Leu Ile Tyr Ser Gln Phe Phe Pro Gln Gly Asp Ala Thr

        115                 120                 125

Thr Tyr Ala His Phe Leu Phe Asn Ala Phe Asp Ala Asp Gly Asn Gly

    130                 135                 140

Ala Ile His Phe Glu Asp Phe Val Val Gly Leu Ser Ile Leu Leu Arg

145                 150                 155                 160

Gly Thr Val His Glu Lys Leu Lys Trp Ala Phe Asn Leu Tyr Asp Ile

                165                 170                 175

Asn Lys Asp Gly Tyr Ile Thr Lys Glu Glu Met Leu Ala Ile Met Lys

            180                 185                 190

Ser Ile Tyr Asp Met Met Gly Arg His Thr Tyr Pro Ile Leu Arg Lys

        195                 200                 205

Asp Ala Pro Leu Glu His Val Glu Arg Phe Phe Gln Lys Met Asp Arg

    210                 215                 220

Asn Gln Asp Gly Val Val Thr Ile Asp Glu Phe Leu Glu Thr Cys Gln

225                 230                 235                 240

Lys Asp Glu Asn Ile Met Ser Ser Met Gln Leu Phe Glu Asn Val Ile

                245                 250                 255

<210>2

<211>105

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Glu Ile Ala Tyr Lys Arg His Lys Asp Ala Arg Arg Lys Gln Met Gln

1               5                   10                  15

Leu Ala Phe Ala Ala Val Asn Val Trp Arg Lys Asn Leu Gln Asp Arg

            20                  25                  30

Lys Ser Gly Arg Ala Glu Pro Asp Pro Lys Lys Lys Ala Thr Phe Arg

        35                  40                  45

Ala Ile Thr Ser Thr Leu Ala Ser Ser Phe Lys Arg Arg Arg Ser Ser

    50                  55                  60

Lys Asp Thr Ser Thr Gly Gly Gly Arg Gly Ala Leu Gln Asn Gln Lys

65                  70                  75                  80

Asp Thr Val Leu Pro Arg Arg AlaIle Glu Arg Glu Glu Gly Gln Leu

                85                  90                  95

Gln Leu Cys Ser Arg His Arg Glu Ser

            100                 105

<210>3

<211>315

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gagatcgcct acaagcgaca caaggatgcc cgtaggaagc agatgcagct ggcttttgca     60

gccgtgaacg tgtggaggaa gaacctgcag gatagaaaga gtggtagagc agagcccgac    120

cctaaaaaga aagccacatt tagggctatc acctccaccc tggcctccag cttcaagaga    180

cgtaggtcct ccaaagacac gagcaccggg ggtggacgcg gcgctttgca aaaccaaaaa    240

gacacagtgc tgccgcgacg cgctattgag agggaggagg gccagctgca gctgtgttcc    300

cgtcataggg agagc                                                     315

<210>4

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Ile Pro Leu Ser Lys Arg

1               5                   10                  15

Glu Gly Ile Lys Trp Gln Arg Pro Arg Phe Thr Arg Gln

            20                  25

<210>5

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Lys Phe Gln Glu Ile Arg

1               5                   10                  15

Gln Leu Thr Ile Pro Trp Ser Lys Pro Arg Arg Arg Gly

            20                  25

Claims (8)

1.一种多肽，为如下a)、b)或c)所示的多肽：

a)、由SEQ ID NO.l自N端起第21-40位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的多肽；

b)、由SEQ ID NO.1自N端起第1-50位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的多肽；

c)、由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的多肽。

2.权利要求1中所述多肽的编码基因。

3.含有权利要求2所述编码基因的重组载体。

4.含有权利要求2所述编码基因的重组菌。

5.含有权利要求2所述编码基因的表达盒。

6.含有权利要求2所述编码基因的转基因细胞系。

7.一种抑制兴奋性毒性损伤的药物，其活性成份为权利要求1中任一所述多肽或权利要求2中所述编码基因或权利要求3中所述重组载体。

8.权利要求1中任一所述多肽或权利要求2中所述编码基因或权利要求3中所述重组载体在制备抑制兴奋性毒性损伤的药物中的应用。

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