JP2008512356A - 治療及び診断用途のための多価構築体の製造方法 - Google Patents

治療及び診断用途のための多価構築体の製造方法 Download PDF

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Abstract

治療用途及び診断用途の多価構築体の製造方法を提供する。より詳しくは、治療用途及び診断用途のための、式：Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’Ｆで示される多価構築体の新規な製造方法を提供する、これらの方法は、種々な実施態様において、ジカルボン酸誘導体（例えば、グルタル酸ビスＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル若しくはその誘導体）；又はジアミン誘導体を含む、新規なリンカーＤを用いる。多価構築体 Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’Ｆにおける他の構成要素は、次のように定義される：Ａはペプチドであり、Ｂは第１分枝基であり、Ｃは任意の第１スペーサーであり、Ｅは任意の第２スペーサーであり、これは前記第１スペーサーＣと同じものでも、異なるものでもよい、Ｂ’は任意の第２分枝基であり、これは前記第１分枝基Ｂと同じものでも、異なるものでもよい、Ｆは第２ペプチドであり、これは前記第１ペプチドＡと同じものでも、異なるものでもよい。
【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は、米国仮出願No.60/440,201 (2003年1月15日出願）及び米国仮出願No.60/360,821(2002年3月1日出願）の利益を主張する、米国特許出願No.10/379,287（2003年3月3日出願）の一部継続出願である、米国特許出願No.10/661,032(2003年9月11日出願）の一部継続出願である。これらの出願の全ては、それらの全体において、本明細書に援用される。
発明の分野
本発明は、治療及び診断用途のための多価構築体の使用と、このような構築体の製造方法に関する。
発明の背景
生体分子ターゲットと、それらのナチュラルペプチド／タンパク質リガンドとの間の多価若しくはマルチポイント相互作用の役割は、細胞レベルでの該リガンドの活性にとって重要であるとして、ますます、認識されつつある。例えば、Mammen, M. et al., "Polyvalent interactions in biological systems: Implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors," Angew. Chem. Int. Edn. Engl. 37, 2754-2794 (1998); Gestwicki, J.E. et al., "Influencing Receptor-Ligand Binding Mechanisms with Multivalent Ligand Architecture," J. Am. Chem. Soc. 124, 14922-933 (2002)参照。
結果として、in vivo又はin vitroでの生体分子プロセスを阻害する又は刺激するための多価相互作用のアビディティ及び特異性を利用することができる合成マルチマー若しくはリンクペプチド構築体(linked peptide constructs)の開発への研究は、多大の進歩を遂げている。このような構築体は、新規な抗生物質として（Tarn, J. P. et al., "Antimicrobial Dendrimeric Peptides," European Journal of Biochemistry 269, 923-932 (2002)参照); 癌放射性診断薬のためのターゲッティング・エンティティとして(Liu, S. et al., "99mTc-Labeling of Hydrazinonicotiniamide-Conjugated Vitronection Receptor Antagonist Useful for Imaging Tumors," Bioconjugate Chem. 12, 624-629 (2001)参照);癌放射性治療薬として(Hillairet de Boisferon, M. et al., "Enhanced Targeting Specificity to Tumor Cells by Simultaneous Recognition of Two Antigens," Bioconjugate Chem. 11, 452-460 (2000)参照);治療薬として(Schaffer, L. et al., "Assembly of High Affinity Insulin Receptor Agonists and Antagonists from Peptide Building Blocks," Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 4435-39 (2003)参照); 免疫原として(Jackson, D. C. et al., "Preparation and properties of totally synthetic immunogens," Vaccine 18, 355-361 (1999); Ben-Yedidia, T. et al., "Design of peptide and polypeptide vaccines," Current Opinion in Biotechnology 8, 442-448 (1997); O'Brien-Simpson, N. et al., "Polymerization of Unprotected Synthetic Peptides: A View toward Synthetic Peptide Vaccines," Journal of the American Chemical Society 119, 1183-1188 (1997)参照); バイオセンサーとして(Baltzer, L. et al., "Modified helix-loop-helix polypeptide dimers as scaffolds for use in biosensors and array technology," PCT Int. Appl. WO 2003080653 Al 20031002 (2003); Chao, H. et al., "Biosensor device and method involving coiled-coil heterodimer formation and detection," PCT Int. Appl. WO 2003018797 A2 20030306 (2003); Sal-Man, N. et al., "Preassembly of membrane-active peptides is an important factor in their selectivity toward target cells," Biochemistry 41, 11921-11930 (2002); Madou, M. et al, "Multimeric biopolymers as structural elements, sensors and actuators in microsystems," PCT Int. Appl. WO 2002006789 A2 20020124 (2002); Benters, R. et al., "Biosensors or other devices manufactured with an activated surface containing dendrimers for immobilizing biological macromolecules," PCT Int. Appl. WO 2001070681 A1 20010927 (2001)参照);及び人工タンパク質として(Chen, H. et al., "Interaction of dendrimers (artificial proteins) with biological hydroxyapatite crystals," Journal of Dental Research 82, 443-448 (2003); Lucke, A. J. et al., "Designing supramolecular structures from models of cyclic peptide scaffolds with heterocyclic constraints," Journal of Molecular Graphics & Modelling 21(5), 341-355 (2003); Mutter, Manfred et al., "Evolution versus design: template-directed self-assembly of peptides to artificial proteins (TASP)," Chimia 54, 552-557 (2000); Futaki, Shiroh, "Creation of ion channel function using synthetic peptides," Yuki Gosei Kagaku Kyokaishi 56, 125-133 (1998)参照)用いることができる。
同様に、癌の免疫療法、遺伝子療法及び免疫診断法のための単一特異性形、二特異性形又は三特異性形でさえの多価抗体フラグメント（ジアボディ(diabodies)、トリアボディ(triabodies)、テトラボディ(tetrabodies)）を製造するために、生合成的方法が用いられている（Todorovska, A. et al., "Design and Application of Diabodies, Triabodies and Tetrabodies for Cancer Targeting," J. Immunol. Methods 248, 47-66 (2001)参照)。
ペプチド及びタンパク質の高分子的多様性及び増大する合成的アクセス可能性は、バイオメディカル及びバイオテクノロジー研究の非常に多くの領域における、それらの用途に劇的な進歩を可能にする。Bajusz, Sandor, "Peptide related drug research," Journal of Peptide Science 9(6), 321-332 (2003); Q Loffet, Albert, "Peptides as drugs: is there a market?" Peptides: The Wave of the Future, Proceedings of the Second International and the Seventeenth American Peptide Symposium (San Diego, CA, June 9-14, 2001); Rocchi, Raniero et al., "Peptide science in the years to come," Chimica Oggi 20(7/8), 26-29 (2002); Pang, Guangchang et al., "Research progress and prospect of bioactive peptides," Shipin Kexue 22(2), 80-84 (Beijing, 2001); Dembowsky, Klaus et al. eds., Novel Therapeutic Proteins (2001); Remmele, R.L, Jr. ed., "Rational Protein Drug Design in Pharmaceutical Development," Curr. Pharm. Biotechnol. 3(4), (Bentham Science Publishers Ltd., Hilversum, Neth., 2002); Billinge, S.J.L. et al. eds., From Semiconductors to Proteins: Beyond the Average Structure (Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 2002); Chasman, Daniel L, Protein Structure: Determination, Analysis, and Applications for Drug Discovery (Marcel Dekker, Inc., 2003); Nail, Steven L. et al. eds., "Development and Manufacture of Protein Pharmaceuticals," Pharm. Biotechnol. 14 (Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2002); Walsh, Gary, "A new generation of biopharmaceuticals," LaborPraxis 26(10), 30-33 (2002); Souriau, Christelle et al., "Recombinant antibodies for cancer diagnosis and therapy," Expert Opinion on Biological Therapy 1(5), 845-55 (2001)を参照のこと、これらの全ては、それらの全体において、本明細書に援用される。
リードペプチドのダイマー構築体は、このようなものとして、化学及び生物学研究にますます用いられている。ペプチドの多価構築体は、予め構築されたマルチマーコア上へのペプチド合成と化学的ライゲーション方法を用いて、製造されている。前者の方法は、抗体導出のためのＭＡＰコア・アプローチによって例示される。単一ペプチドの多重コピーを、予め作製したＮ−分枝リシンコア（Ｎ＝４，８）上に付加させて、デンドリマー状に配列した多重ペプチドを有するＮ−分枝構築体を得る。Veprek, P et al., J. Pept. Sci. 5, 5 (1999); 5, 203 (1999); Tarn, J., "Vaccines 90. Modem approaches to new vaccines including prevention of AIDS," p. 21 (R.A. Lerner et al. Eds., Cold Spring Harbor Lab., New York, 1990)を参照のこと。
化学的ライゲーション手法は、単一ペプチドのマルチマー構築を可能にするか、又はペプチド・フラグメントを連結して、大きいペプチド若しくはタンパク質を作製するための手段を与える、特殊な化学を用いる。多くの場合に、該連結機能は非ペプチド的(nonpeptidic)であるが、さらに最近に開発された方法は、アミド結合(amide linkages)を有する生成物を与えることができる。Sadler, Kristen et al., "Peptide dendrimers: applications and synthesis," Reviews in Molecular Biotechnology 90(3-4), 195-229 (2002) (general review); Thumshirn, Georgette et al., "Multimeric cyclic RGD peptides as potential tools for tumor targeting: Solid-phase peptide synthesis and chemoselective oxime ligation," Chemistry - A European Journal 9(12), 2717-2725 (2003) (oxime based ligation); Wilken, Jill et al., "Chemical protein synthesis," Current Opinion in Biotechnology 9(4), 412-426 (1998) (native chemical ligation at cysteine residue); Wade, John D. et al., "Use of thiazolidine-mediated ligation for site specific biotinylation of mouse EGF for biosensor immobilisation," Letters in Peptide Science (2002), Vol. date: 2001 : 8(3-5), 211-220 (thiazolidine formation)を参照のこと。
特異的細胞に（受容体又はその他を介して）結合するターゲッティング部分若しくはリガンドの能力を利用して、例えば検出可能な標識又は治療剤のような組成物を動物（特にヒト）の特定の組織に向かわせようと、研究者は長い間試みている。このような状況において、ターゲッティング部分がターゲットに結合する能力（例えば、アフィニティ、アビディティ、及び／又は特異性）は、所望の組織を的確に標的とする可能性に有意に影響を与える。
in vivoでターゲッティング部分として、ナチュラル抗体（例えば、ポリクローナル）及びモノクローナル抗体を用いるために、非常に多くの試みがなされている。しかし、このような抗体の使用は、例えば、ヒト化抗体に対してさえ−許容し難いレベルの抗原性のような、ある種の欠点を提示する。さらに、ナチュラル抗体は、鎖の数、ジスルフィド結合及びグリコシル化のために、組み換え体の形態で製造することが困難である。ナチュラル抗体はまた、薬物動態的問題も提示する。抗体は、それらの大きいサイズのために、血管外ターゲット組織中への蓄積と、血管系からのクリアランスが両方とも緩慢であるので、イメージング用途及び放射線療法用途において重大な問題を有する。この問題は、大きい血液媒介化合物の進入に対して付加的なバリヤーを提示する充実性腫瘍に対処する場合に、特に重要である。同様な問題は、例えば磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、超音波及び光のような、他のモーダリティ(modalities)を用いるイメージングに用いられる抗体に関しても生じる。該抗体を診断用又は治療用の放射性核種で放射能標識する場合には、低いターゲット対バックグラウンド比率がイメージを生じる。さらに、腫瘍と正常組織とに、放射線暴露の好ましくない分配が生じる。
これらの問題を解決しようと試みて、ナチュラル抗体結合領域の本質的な特徴を用いて、同様な結合アフィニティを有するより小さいエンティティの構築に向けて努力がなされている。構築ブロック(building blocks)は、典型的には、単価である単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。この種類のフラグメントを、それらが抗体の二価若しくは多価性質を有するように組み合わせることは、今まで問題があった。表面にドッキングするために、抗体上の２つの結合部位をフレキシブル・ヒンジによって一定領域に接続することが有利である。したがって、抗体の結合効果を模倣するためには、結合部位は再現されなければならないのみでなく、二価性（又はそれ以上の多価性）及びフレキシブル性でもなければならない。このフレキシブル性は、該ｓｃＦｖの非結合領域を構成するタンパク質主鎖が結合部位に比べて非常にバルキーであるので、必要である。
２つのｓｃＦｖフラグメントを一緒に接合するために、適当な方法がひと度考案されたならば、異なるｓｃＦｖフラグメントを一緒に接合させることができ、並びにナチュラル抗体中に存在する慣例の２つのｓｃＦｖ部分より多くのｓｃＦｖフラグメントを一緒に接合させることも可能である。ある一定のｓｃＦｖフラグメントは、ＶＨ／ＶＬ界面とリンカー長さの両方に依存して、自発的に、ダイマー化する又はマルチマー化することができる。これらの「ジアボディ」はナチュラル抗体よりも小さく、それらに欠けているＦｃ部分（補体を活性化する及び／又は受容体に結合する）の免疫学的性質を有さない。該２つ（又はそれ以上）の結合部位は、相互に対して回転するので、このプレゼンテーションに対応するように、抗原を正確に位置付けなければならない。
「ミニ抗体(miniantibodies)」は、ジアボディの性質に類似した性質を有するが、これらは、短い５〜２０アミノ酸リンカーではなく、ナチュラル抗体の場合と同様に、相互に対して、結合部位の自由なオリエンテーションを可能にする、比較的大きくフレキシブルなリンカーを有する。ジアボディと同様に、ミニ抗体は、高分子量の、免疫学的に活性なＦｃダイマー・フラグメントを有さない。これらのミニ抗体は、細菌系によって作製することもできる。これらは、ナチュラル抗体を越える好ましい利点を有するが、ミニ抗体はまだ、それらの薬物動態に影響を及ぼす、比較的大きいサイズであるという欠点を有し、生物学的方法を用いて作製されなければならない。最も小さいミニ抗体は、約１２０ｋＤａのサイズである。
二特異性抗体（例えば、２つの別々のターゲットに結合する抗体）を用いて、抗体の主要な欠点の１つ、即ち、抗体のサイズが血管外ターゲット組織中の蓄積及び血液からのクリアランスを緩慢にすることを克服する、試みがなされている。用いられた二特異性アプローチは、「プレターゲッティング(pretargeting)」と呼ばれている。このアプローチは、二工程プロトコール(two-step protocol)を用いる。腫瘍関連抗原を認識する、少なくとも１つのアームと、診断剤又は治療剤上のエピトープを認識する、少なくとも１つの他のアームを有する二特異性抗体を、第１注射として与える。未結合抗体が非ターゲット組織を実質的に通過し、腫瘍中で最大レベルに達した後に、より小さい、二特異性抗体認識可能な診断剤又は治療剤を投与する。後者の作用剤がより迅速に身体中に分布して、腫瘍中に局在する二特異性抗体に結合するか、又は腎臓を介して除去されることが望ましい。
このアプローチの代替手段は、二工程方法に混合抗体アビジン／ビオチン系を用いることを試みる。例えば、ターゲッティング抗体をアビジン又はビオチンのいずれかとコンジュゲートさせてから、注射すると、該ターゲッティング抗体は問題の腫瘍中に局在する。その後に、イメージング又は放射線療法の放射性核種を有する、ビオチン又はアビジンのいずれか（どちらが該ターゲッティング抗体に結合するかに依存して）を注射すると、これは、一次抗体の部位に、アビジン又はビオチンにそれぞれ結合することによって、局在することになる。
放射性医薬品又は他の診断用イメージング剤のターゲッティング部分として抗体を用いる、他のアプローチは、二価ハプテンを用いて、細胞結合二特異性抗体のアビディティを循環抗体のアビディティ以上に高めようと試みている。このアプローチは、二座結合(bidentate binding)が、細胞結合抗体では該細胞上の表面密度が充分に高いために生じるが、循環抗体では濃度が低すぎるために生じないことに基づいている。結局、この系は、細胞上の抗体／抗原の近接した提示によって惹起されるアビディティ上昇を利用する。
ターゲッティング部分として、ペプチドも用いられている。該結合を改良しようと試みて、異なるターゲットに対して選択的な、２つ以上のペプチドに基づくターゲッティング剤によって、二特異性ペプチド構築体が作製されている。例えば、報告によると、ソマスタチン、ＧＲＰ−、ＣＣＫ−、サブスタンスＰ−又はＶＩＰ受容体とαＶβ３インテグリンから選択される、２つのターゲットに対するリガンドを有するハイブリッド・ペプチドが製造されて、腫瘍細胞への結合能力に関して試験された。初期の評価では、研究された多重リガンド系に関して腫瘍取り込みの改良は示されなかった。研究者らは、立体障害が、該ダイマー構造の受容体アフィニティの低下を招くと思い込んだ。他の研究者は、αＶβ３インテグリンとソマトスタチン−２−受容体の両方をターゲットとして設定される、ＲＧＤ−ＤＩＰＡ−オクトレオテート・ハイブリッドペプチドを、いずれか一方のターゲットに対して選択的なペプチドの腫瘍取り込み以上に腫瘍取り込みを増大させる能力に関して試験している。該２つのターゲッティング部分の、それらのターゲット、血管と腫瘍細胞に対して異なる結合アフィニティは、より強い（ソマトスタチン媒介）相互作用によって支配される、腫瘍に対するアビディティを生じた。
これらのアプローチの変化は、同じ抗原上の２つの異なるエピトープをターゲットとして設定される二特異性ジアボディを用いる。このアプローチは、該結合が各エピトープに対しては一価であるが、結合エピトープの各々は同じターゲット分子内に局在するので、構築体は全体としてそのターゲットに対して二価であるため、ターゲットに対する該構築体のアビディティを高めようと試みている。単一分子ターゲットの場合には、ｓｃＦｖフラグメントは不十分なアフィニティを有することが判明しており、アビディティの増強が必要である。
上記アプローチの根底には２つの理論がある。最初の理論は、２つの異なるターゲッティング分子を用いて、充実性腫瘍への抗体のデリバリーに関連した薬物動態的問題の幾つかを克服する。第２理論は、２つの異なるターゲッティング分子を用いて、例えば単一分子又は腫瘍全体のような、一定のターゲットに対する構築体のアビディティを高める。しかし、上記アプローチの全ては、種々な欠点を有する。したがって、問題のターゲットに対して大きいアフィニティ及び／又はアビディティを有する診断剤と治療剤の必要性が依然としてある。哺乳動物にin vivo投与したときに、許容される薬物動態的性質を有する診断剤と治療剤の必要性も依然としてある。
血管新生、新しい血管の形成は、胚発育及び正常組織の成長と修復中に生じるのみでなく、創傷及び骨折の回復にも関連する。正常な個体に生じる血管新生の他に、脈管形成イベントは、多くの病的プロセス、特に、腫瘍成長と転移、及び血管増殖が増加する他の状態、例えば、糖尿病性網膜症、乾癬及び関節症に関与する。血管新生は、肥厚性から腫瘍性増殖(from hyperplastic to neoplastic growth)への腫瘍推移において非常に重要であるので、血管新生の阻害は、有効な癌療法の研究分野になっている。
腫瘍誘導性血管新生(tumor-induced angiogenesis)は、既存血管を平穏かつ安定に維持する他の影響力に勝る、前脈管形成(pro-angiogenic)増殖因子の、腫瘍細胞による産生に依存すると考えられる。これらの前脈管形成剤のなかで最もよく特徴付けられているのは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である(Cohen et al., FASEB J., 13: 9-22 (1999))。ＶＥＧＦは、低酸素症及び幾つかの他の刺激に応じて、多様な細胞種類によって自然に産生される。多くの腫瘍も、多量のＶＥＧＦを産生する、及び／又は近隣の間質性細胞を誘導して、ＶＥＧＦを作製させる(Fukumura et al., Cell, 94: 715-725 (1998))。ＶＥＧＦ−Ａとも呼ばれる、ＶＥＧＦは、１２１、１４５、１６５、１８９及び２０６アミノ酸の５種類の異なるスプライス・アイソフォームとして合成される。ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５は、特に腫瘍中で産生される主要な形態である(Cohen et al, 1999,上記文献参照）。ＶＥＧＦ１２１は、ＶＥＧＦ１６５とは異なって、ＶＥＧＦ遺伝子のエクソン６と７によってコードされる基本ドメインを有さず、ヘパリン又は細胞外マトリックスに結合しない。
ＶＥＧＦファミリーのメンバーは、主として、受容体チロシンキナーゼに結合することによって作用する。一般に、受容体チロシンキナーゼは、１つ以上の特異的増殖因子を結合することができる細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン（通常は、αヘリックス）、膜近傍ドメイン（この場合には、受容体は例えばリン酸化によって調節されうる）、チロシンキナーゼ・ドメイン（該受容体の触媒構成要素）及び、多くの受容体において、チロシンキナーゼの基質の認識と結合に関与するカルボキシ末端テールを有する糖タンパク質である。ＶＥＧＦを結合することが知られている、３種類の内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼ：ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ若しくはＦｌｋ−１）及びＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）が存在する。Ｆｌｔ−１とＫＤＲは、一次高アフィニティＶＥＧＦ受容体として同定されている。Ｆｌｔ−１はＶＥＧＦに対して高いアフィニティを有するが、ＫＤＲはより豊富な内皮細胞発現を示す(Bikfalvi et al., J. Cell. Physiol., 149: 50-59 (1991))。さらに、ＫＤＲは、脈管形成反応(angiogenic response)を支配すると考えられるので、より大きな治療的及び診断的関心が持たれる（Cohen et al. 1999, 上記文献参照）。ＫＤＲの発現は、特に、強い脈管形成反応を誘発する腫瘍中の新生血管内で、高度にアップレギュレートされる(Veikkola et al., Cancer Res., 60: 203-212 (2000))。血管新生におけるＫＤＲの重要な役割は、ホモ接合型ＫＤＲノックアウトマウス胚における血管発育の完全な欠落によって強調される(Folkman et al., Cancer Medicine, 5th Edition (B.C. Decker Inc.; Ontario, Canada, 2000) pp. 132-152)。
ＫＤＲ（キナーゼドメイン領域）は、その十分に成長した形で、１３３６アミノ酸から構成される。ＫＤＲのグリコシル化形は、約２０５ｋＤａの見かけの分子量を有して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で移動する。ＫＤＲは、その細胞外ドメインに７つの免疫グロブリン様ドメインを含有し、そのうちの最初の３つがＶＥＧＦ結合において最も重要である（Cohen et al. 1999, 上記文献）。ＶＥＧＦ自体は、２つのＫＤＲ分子に同時に結合することができるホモダイマーである。この結果、２つのＫＤＲ分子は結合時にダイマー化し、自己リン酸化して、非常に大きく活性になる。増大したキナーゼ活性は、次に、ＶＥＧＦのＫＤＲ特異的生物学的効果を仲介するシグナリング経路を開始する。
したがって、in vivoでの血管新生にとってＫＤＲのＶＥＧＦ結合活性のみが重要であるのではなく、内皮細胞上のＫＤＲアップレギュレーションを検出する又はＶＥＧＦ／ＫＤＲ結合複合体を検出する能力も、血管新生の検出又はモニターリングに極めて有利であると考えられる。例えば悪性腫瘍成長の検出のような診断用途と、例えば殺腫瘍剤又は血管新生阻害剤に腫瘍部位を標的とさせるような治療用途が、特に有利であると考えられる。
肝細胞増殖因子（散乱因子としても知られる）は、例えば胚形成、創傷治癒及び血管新生のような、種々な生理的プロセスに関与する多重機能性増殖因子である。ＨＧＦが、その高アフィニティ受容体（ｃＭｅｔ）との相互作用によって、腫瘍成長、浸潤及び転移に関与することは、明らかになっている。実際に、調節不能な(dysregulated)ｃＭｅｔ発現（例えば、結腸直腸アデノーマの腫瘍性上皮及び他の癌における、正常粘膜に比較して、ｃＭｅｔの過剰発現）及び／又は活性、並びにＨＧＦによる自己分泌刺激ループを介してのｃＭｅｔ受容体の過剰活性が、多様な腫瘍組織において実証されており、特定細胞系の腫瘍転換を誘導する。
一般に、ＨＧＦは、多くの上皮腫瘍の一部を形成する間質細胞によって産生されるが；腫瘍細胞自体によるＨＧＦの産生は、特定腫瘍の過剰増殖を招く主要経路を含むと考えられる。ＨＧＦ／ｃＭｅｔ自己分泌刺激ループが、神経膠腫、骨肉腫並びの乳癌、前立腺癌、乳房癌、肺癌及びその他の癌において検出されている。
ｃＭｅｔ受容体とのＨＧＦ相互作用を中断すると、動物モデルにおける腫瘍進行は緩慢になる。ｃＭｅｔの活性化を介して、ある一定の癌細胞の増殖を刺激することの他に、ＨＧＦはまた、高増殖性表現型の影響を受けやすい、多様な細胞系（例えば、乳房癌）におけるＤＮＡ損傷剤誘導の細胞毒性をも防御する。それ故、ＨＧＦがｃＭｅｔに結合するのを防止すると、ある一定の癌細胞はある種の薬物の細胞毒性を受けやすくなる可能性がある。
高増殖性障害の他に、ｃＭｅｔは血管新生にも関連付けられている。例えば、ｃＭｅｔの刺激は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の産生を招き、この血管内皮増殖因子が次に血管新生を刺激する。さらに、ｃＭｅｔの刺激は、創傷治癒の促進にも関連付けられている。
高増殖性障害、血管新生及び創傷治癒のための治療的ターゲットとしてｃＭｅｔ受容体を同定することの他に、腫瘍性組織と対応する正常組織との間の大きい相違は、ｃＭｅｔが、高増殖性障害に関するイメージング用途のための魅力的なターゲットであることを示す。
発明の概要
本発明は、１実施態様において、ジカルボン酸の誘導体を含む、新規なリンカーＤを用いて、治療及び診断用途の多価構築体を製造するための新規な方法に関する。より詳しくは、１つの好ましい実施態様において、本発明は、式：Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆで示される多価化合物の製造方法であって、前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ’又はＦのいずれかを、式：Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆにおける、その各隣接構成要素(単数又は複数）のいずれかに、化合物Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆが形成されるまで、任意の順序で取り付ける工程を含み、この場合、Ｄが、ジカルボン酸の誘導体を含むリンカーである方法に関する。
他の実施態様では、本発明は、ジカルボン酸誘導体を含む、新規なリンカーＤを用いて、治療及び診断用途の多価構築体を製造するための新規な方法に関する。グルタル酸ビス−ＮＨＳエステル又はその誘導体が、好ましいジカルボン酸誘導体である。リンカーＤは、該構築体の２つ以上のペプチドを一緒に保持する又は接続する。より詳しくは、他の好ましい実施態様において、本発明は、式：Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆで示される多価化合物の製造方法であって、前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ’又はＦのいずれかを、式：Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆにおける、その各隣接構成要素(単数又は複数）のいずれかに、化合物Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆが形成されるまで、任意の順序で取り付ける工程を含み、この場合、Ｄが、グルタル酸ビスＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル又はその誘導体を含むリンカーである方法に関する。
他の実施態様では、本発明は、ジアミン又はその誘導体を含む、新規なリンカーＤを用いて、治療及び診断用途の多価構築体を製造するための新規な方法に関する。より詳しくは、他の好ましい実施態様において、本発明は、式：Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆで示される多価化合物の製造方法であって、前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ’又はＦのいずれかを、式：Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆにおける、その各隣接構成要素(単数又は複数）のいずれかに、化合物Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆが形成されるまで、任意の順序で取り付ける工程を含み、この場合、Ｄが、ジアミン又はその誘導体を含むリンカーである方法に関する。
多価構築体Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆにおける残りの構成要素は、次のように定義される：Ａは第１ペプチドであり、Ｂは第１分枝基であり、Ｃは任意の第１スペーサーであり、Ｅは、前記第１スペーサーＣと同じものでも、異なるものでもよい、任意の第２スペーサーであり、Ｂ’は、前記第１分枝基Ｂと同じものでも、異なるものでもよい、任意の第２分枝基であり、Ｆは、前記第１ペプチドＡと同じものでも、異なるものでもよい、第２ペプチドである。本明細書で用いる限り、ペプチドＡとＦは、本明細書に記載するモノマーのいずれも包含し、特に、１９項における表１中のモノマーを包含する。好ましい実施態様では、ペプチドＡとペプチドＦの少なくとも１つは、２つ以上のアミノ酸を含む化合物(単数又は複数）である。ペプチドＡとＦは、異なるペプチド、場合によっては、ターゲッティングペプチドであることができ、同じターゲットの異なるエピトープを標的とすることができる、又は同じ受容体の異なるエピトープを標的とすることができる。該受容体は、ＫＤＲ又はｃＭＥＴを包含することができる。第１ペプチドＡと第２ペプチドＦの一方又は両方がジスルフィドペプチドであることができる。
分枝基ＢとＢ’は、化合物への任意のレポーター−ｓｐ基の取り付け点を与える。前記第１分枝基Ｂと前記第２分枝基Ｂ’の一方又は両方は、非限定的に、リシン、オルニチン、アスパラギン酸又はグルタミン酸であることができる。
スペーサーＣとＥは、リンカーＤを、化合物の他の構成要素Ａ、Ｂ、Ｂ’又はＦに、これらの他の構成要素をリンカーＤから、ある距離をおいて又はある「スペース」をおいて維持しながら、取り付ける。スペーサーＣ又はＥは任意であり、下記：（ａ）Ｇｌｙ、（ｂ）Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、（ｃ）Ｓｅｒ（Ｓ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｓ）式中、Ｓ基は、例えば、Ｎ−アセチルガラクトースアミン、Ｄ−（＋）−アロース、Ｄ−（＋）−アルトロース、Ｄ−（＋）−グルコース、Ｄ−（＋）−マンノース、Ｄ−（−）−グロース、Ｄ−（−）−イドース、Ｄ−（＋）−ガラクトース、Ｄ−（−）−タロース、Ｄ−（−）−リボース、Ｄ−（−）−アラビノース、Ｄ−（＋）−キシロース又はＤ−（−）−リキソースから選択されうる糖部分のような親水性官能基(hydrophilic function)を含み、セリン側鎖酸素と該糖との結合はアノマー炭素を介する；（ｄ）８−アミノ−３，５−ジオキサオクタン酸；（ｅ）８−（８−アミノ−３，５−ジオキサオクタノイル)アミノ−３，５−ジオキサオクタン酸若しくは９，１７−ジアミノ−１０−オキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸；（ｆ）４−アミノ安息香酸；（ｇ）４−アミノメチル安息香酸；（ｈ）４’−アミノ−４−ビフェニルカルボン酸；（ｉ）４’−アミノメチル−４−ビフェニルカルボン酸；（ｊ）４−メルカプト酪酸；（ｋ）２−メルカプト酢酸；（ｌ）システイン；（ｍ）４−（２−ピリジルジチオ）酪酸；（ｎ）２−ピリジルジチオ酢酸；（ｏ）システイン−２−チオピリジルジスルフィド；又は（ｐ）２−アミノエチル−２−ピリジルジスルフィドの１つ以上を含むことができる。
１実施態様では、リンカーＤは、例えば、下記式：
で示されるような、ジアミン・リンカーを含む。
他の実施態様では、リンカーＤは、式：ＮＨ２−Ｑ−Ｚ−Ｑ’−ＮＨ２［式中、
（１）Ｚは、２つのアミノ基を有する足場である芳香核又は複素環核を表す；及び
（２）ＱとＱ’は、
であり；この場合、ＱとＱ’は、ここに挙げた部分のセットの同じメンバー又は異なるメンバーのいずれでもよい］
で示される、置換された芳香族又は複素環ジアミンを含む。
他の実施態様では、リンカーＤはジカルボン酸の誘導体を含み、これは、Ｄ若しくはＬアミノ酸に由来しうる、又はリシン、オルニチン若しくは２，３−ジアミノプロピオン酸に由来するＤ若しくはＬアミノ酸に由来しうる。リンカーＤは、下記：４−アミノメチルベンジルアミン、４−アミノメチル−４’−アミノメチルビフェニル、Ｎ−メチルピロール−２，５−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミド、ピリジン−２，６−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミド、Ｎ−メチルピロール−２，３−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミド、Ｎ−メチルピロール−２，４−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミド、ピリジン−２，３−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミド、ピリジン−３，５−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミド、及びピリジン−３，４−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミドのなかから選択されうる。
他の実施態様では、リンカーＤは、グルタル酸ビスＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル又はその誘導体を含む。
本発明の方法を用いて、前記第１ペプチドＡと前記第２ペプチドＦは、例えば（ａ）Ｃ末端からＣ末端へ；（ｂ）Ｎ末端からＣ末端へ；（ｃ）Ｃ末端からＮ末端へ；又は（ｄ）Ｎ末端からＮ末端へを含めた、多くの配置で接続することができる。
他の実施態様では、本発明の方法は、第１レポーター−ｓｐ基を前記分枝基Ｂ又はＢ’の１つに取り付ける工程を含む。さらに、分枝基Ｂ及びＢ’の両方が存在する場合には、好ましい方法は、第１レポーター−ｓｐ基が取り付けられなかった、前記分枝基Ｂ又はＢ’の他方に第２レポーター−ｓｐ基を取り付ける工程を含む。
レポーター−ｓｐ基若しくは分子は、レポーター若しくは特別な目的の分子として役立つ、又は両方の機能を果たすことができる。第１レポーター−ｓｐ基と第２レポーター−ｓｐ基の一方又は両方がリン脂質若しくは脂質部分を含むことができる。第１レポーター−ｓｐ基と第２レポーター−ｓｐ基の一方又は両方は、反磁性若しくは磁性金属キレート、金属キレーター系、放射性金属キレート形成系、放射性同位元素標識分子、染料分子、蛍光性分子、リン光性分子、ＵＶスペクトル吸収分子、近赤外線若しくは遠赤外線吸収可能な分子；又はＸ線、ガンマー線、ベータ粒子、アルファ粒子、超音波、光学若しくは磁気シグナルを吸収及び／又は放出する分子若しくは超分子構築体を含むことができる。第１レポーター−ｓｐ基と第２レポーター−ｓｐ基の一方又は両方は、治療剤として作用する能力、並びに／或いは癌細胞若しくは正常組織の増殖を選択的に殺す及び／又は阻害するために用いられるトキシンとして作用する能力を有することができる。最終の多価化合物は、１、２又は３個以上さえものレポーター−ｓｐ基を含むことができる。
本発明は、多価構築体の製造に関して、多くの利益と、当該技術分野又は他の既知方法との違いとを提供する。多価構築体を製造するために新規なリンカーを用いるのみでなく、適当な垂直保護手段と、選択的試薬と、試薬及び中間体の異なる物理的性質の有利な利用とに関連した、このようなリンカーの使用がさらに、実際に任意の順序で達成することができる、多価構築体の新規な製造方法を生み出す。このようなものとして、本発明の方法から、新しい、改良されたフレキシビリティが生じる。特に、本発明の方法は、構成モノマーの１つ以上へのレポーター−ｓｐ基の組み入れの高度な制御を可能にする。この方法はまた、レポーター―ｓｐ基の組み入れが行われる合成段階に関しても制御可能である。
さらに、同じターゲット若しくは受容体の異なるエピトープを標的とするペプチドの新規な使用方法は、本発明の多価構築体に予想外に優れた結合特徴を与える。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、２つ以上の結合部分を有し、該結合部分の少なくとも２つが同じターゲット上の異なる結合部位に結合する化合物が、ターゲットに結合するための予想外の、有意に改良された能力を有するという発見に、一部、基づいている。好ましくは、該ターゲットは、受容体又は受容体／リガンド複合体である。ターゲットに結合する本発明の化合物（本明細書では、様々に、「多価ターゲッティング構築体」、「ヘテロダイマー」、「ヘテロダイマー構築体」、「ヘテロトリマー」、「ヘテロテトラマー」、「ヘテロマルチマー」及び／又は「ヘテロマルチマー構築体」と呼ばれる）の改良された能力は、該ターゲットに結合する個々の構成結合部位の能力と比較することによって実証することができる。
例えば、本発明のヘテロマルチマーの結合強度を、該ヘテロマルチマーの構造を構成するモノマーの１つの結合強度に比較することができる。好ましくは、本発明のヘテロマルチマーは、ターゲットと個々の構成モノマーとの相互作用に関して観察されるアフィニティに比較して、アフィニティの増強を示す（例えば、低下した解離定数ＫＤの測定によって判断して）。
本発明は、新規なリンカー（リンカーＤ）を用いる、治療及び診断用途のための多価構築体の新規な製造方法に関する。
Ａ．定義
本明細書で用いる限り、「組換え体」なる用語は、非自然的に変化若しくは操作された核酸、外因性核酸でトランスフェクトされた宿主細胞、又は単離ＤＮＡの操作及び宿主細胞の形質転換によって、非自然的に発現されたポリペプチドを表すために用いられる。組換え体は、特に、in vitroで遺伝子操作手法を用いて構築されたＤＮＡ分子を包含する用語であり、分子、構築体、ベクター、トランスフェクトされた細胞、ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドを表すための形容詞としての用語「組換え体」の使用は、自然発生する、このような分子、構築体、ベクター、細胞、ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドを特に除外する。
「バクテリオファージ」なる用語は、ＤＮＡコアと、多くの異なるタンパク質分子の凝集によって形成される保護シェルとを含有する細菌ウイルスとして定義される。「バクテリオファージ」と「ファージ」なる用語は、本明細書では互変可能に用いられる。
「ポリペプチド」なる用語は、ペプチドアミド結合（−Ｃ（：Ｏ）ＮＨ−）によって主鎖（側鎖に対して）を通して接合された２つ以上のアミノ酸の化合物を意味するように、用いられる。「ペプチド」なる用語は、本明細書では、「ポリペプチド」とは互変可能に用いられるが、一般には、４０より少ない、好ましくは２５より少ないアミノ酸を有するポリペプチドを意味するように用いられる。
「結合(binding)」なる用語は、結合ポリペプチドが認識し、ある一定のターゲットに可逆的に結合するという、本明細書に記載するアッセイを含めた標準アッセイによる測定を意味する。このような標準アッセイは、非限定的に、平衡透析、ゲル濾過、表面プラスモン共鳴、及び結合から生じる分光的変化のモニターリングを包含する。
本明細書で用いる「結合ポリペプチド」なる用語は、他の分子との結合複合体を形成することができる、任意のポリペプチドを意味する。「結合ポリペプチド」の定義には、本明細書に開示されるような、修飾される又は最適化されるポリペプチドも包含される。このような修飾の特別の例は、以下で詳細に考察するが、性質を最適化する、酵素切断部位等の特徴を除去する若しくは変化させるような、親ポリペプチド配列のアミノ酸に代わるアミノ酸の置換；例えば、検出可能なイメージング標識若しくは他の基質に結合ポリペプチドを連結するための、Ｃ−若しくはＮ−末端アミノ酸の置換若しくは伸長、この例は、精製を助成するためのポリヒスチジン「テール」の付加を包含する；切断(truncations)；アミド結合変化；転座；レトロインバーソ型(retroinverso)ペプチド；ペプトイド；レトロインバーソペプトイド；Ｎ−末端若しくはＣ−末端修飾又はリンカー、例えばポリグリシン若しくはポリリシン・セグメントの使用；固体担体上の本発明による結合ペプチドの固定又は蛍光染料の取り付けを助成するための官能基、特にヒドラジド（−ＮＨ−ＮＨ２）官能基若しくはＣ−末端リンカー−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓを含める変化；薬物動態に影響を与える修飾；構造特徴を保持する若しくは強化するための構造的修飾；水溶性を高める又は処方を容易にするための塩の形成；等を包含する。本明細書にさらに記載する検出可能な標識の他に、結合ポリペプチドを、放射性治療剤、細胞傷害剤、殺腫瘍剤若しくは殺腫瘍性酵素、リポソーム（例えば、治療剤、超音波感知ガス、若しくはこれらの両方を負荷）に連結させる又はコンジュゲートさせることができる。さらに、本発明の結合ポリペプチドは、例えば、ウェル、プレート、ビーズ、チューブ、スライド、フィルター又はディッシュのような、固体担体に結合させる又は連結させることができる。さらに、１つ以上の結合ポリペプチドのダイマー又はマルチマーを形成することができる。このような構築体は、例えば、ターゲットへの大きな結合能力を示すことができる。このような修飾ポリペプチドの全ても、それらがターゲットに結合する能力を保持する限り、「結合ポリペプチド」と見なされる。
本明細書に記載する結合ポリペプチドの「相同体(homologues)」は、本明細書に記載する又は当業者に知られた修飾若しくは最適化手法のいずれかを用いて、作製することができる。このような相同性ポリペプチドは、アミノ酸の置換、付加若しくは欠失又は他の、このような修飾がターゲットへの結合能力を消去しない限り、本発明の範囲内及び「結合ポリペプチド」の定義の範囲内に入ると理解されるであろう。本明細書で用いる「相同性」なる用語は、２つのポリマー（即ち、ポリペプチド分子又は核酸分子）間の
配列類似性度を意味する。同じヌクレオチド若しくはアミノ酸残基又は実質的に同じ性質を有するもの（即ち、保存的置換(conservative substitution)）が、比較される２つのポリマーの配列に位置を占める場合には、これらのポリマーはこの位置において相同である。例えば、２つのポリペプチド配列における１００アミノ酸位置の６０においてアミノ酸残基が一致する又は相同であるならば、２つの配列は６０％相同である。本明細書で言及する相同％値は、２ポリマー間の可能な最大相同、即ち、一致する（相同）位置の最大数を有するように２ポリマーを整列させる場合の相同％を表す。本発明の範囲内のポリペプチド相同体は、本明細書に開示する結合配列の少なくとも１つに少なくとも７０％、好ましくは８０％より大の相同性である。
「ＫＤＲ結合ポリペプチド」は、in vitro又はin vivoで血管内皮増殖因子受容体−２（又はＫＤＲ、Ｆｌｋ−１）と複合体を形成する結合ポリペプチドである。
「ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合ポリペプチド」は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）とＫＤＲとの間に形成される結合複合体と、特に、ホモダイマーＶＥＧＦと血管新生中に内皮細胞の表面に形成されると考えられる１つ若しくは２つのＫＤＲ分子との複合体と、in vitro又はin vivoで複合体を形成する結合ポリペプチドである。ＫＤＲ−及びＶＥＧＦ／ＫＤＲ−結合ポリペプチドの特定の例は、非限定的に、本明細書及びU.S.S.N 60/360,851 とU.S.S.N 60/440,441（これらの両方とも、それらの全体で本明細書に援用される）と、「ＫＤＲ−及びＶＥＧＦ／ＫＤＲ−結合ポリペプチドと、診断及び療法におけるそれらの使用」なる名称の同時係属出願U.S.S.N 10/661,156に提示され、考察されるペプチドを包含し、このようなペプチド並びに相同体を組み込む、ハイブリッド及びキメラ・ポリペプチドを包含する。
「ｃＭｅｔ結合ポリペプチド」は、ＨＧＦ受容体、ｃＭｅｔとin vitro又はin vivoで複合体を形成する結合ポリペプチドである。
「ｃＭｅｔ／ＨＧＦ複合体−結合ポリペプチド」は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃＭｅｔとの間に形成される結合複合体と、in vitro又はin vivoで複合体を形成する結合ポリペプチドである。ｃＭｅｔ−及びｃＭｅｔ／ＨＧＦ−結合ポリペプチドの特定の例は、非限定的に、本明細書及び「ＨＧＦ受容体（ｃＭｅｔ）と特に結合するペプチドと、その使用」なる名称のU.S.S.N同時係属出願U.S.S.N 60/451,588 とU.S.S.N 10/792,582（それらの全体で、本明細書に援用される）に提示され、考察されるペプチドを包含し、このようなペプチド並びに相同体を組み込む、ハイブリッド及びキメラ・ポリペプチドを包含する。
本明細書で用いる「標識基」又は「検出可能な標識」は、例えば、磁気共鳴イメージング、放射性イメージング、超音波イメージング、Ｘ線イメージング、光イメージングのような診断イメージングのためにシグナルを発することができる基若しくは部分である、又は例えば放射線療法若しくは他の形式の療法に用いることができる放射性金属若しくは他のエンティティのような部分を有する基若しくは部分である。
「特異性」なる用語は、１つのターゲットに対して他のターゲットよりも高い結合アフィニティを有する結合ポリペプチドを意味する。結合特異性は、２つの供試ターゲット物質に対する解離平衡定数（ＫＤ）又は会合平衡定数（Ｋａ）によって特徴付けることができる。好ましい実施態様では、本発明の結合ポリペプチドは、約１０μＭより低い、より好ましくは約１μＭより低い、最も好ましくは約０．５μＭ未満若しくはさらに低い、目的ターゲットに対する解離定数を有する。
「ＫＤＲ特異性」なる用語は、的外れのターゲットよりもＫＤＲに対してより高いアフィニティを有するＫＤＲ−結合部分を意味する。「ＶＥＧＦ／ＫＤＲ特異性」なる用語は、的外れのターゲットよりもＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に対してより高いアフィニティを有するＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合部分を意味する。好ましい実施態様では、本発明によるヘテロマルチマーは、ＫＤＲ又はＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に対して特異性であり、好ましくは、約１０μＭより低い、より好ましくは約１μＭ未満、最も好ましくは約０．５μＭ未満若しくはさらに低い解離定数を有する。「ｃＭｅｔ特異性」なる用語は、的外れのターゲットよりもｃＭｅｔに対してより高いアフィニティを有するｃＭｅｔ結合部分を意味する。「ｃＭｅｔ／ＨＧＦ特異性」なる用語は、的外れのターゲットよりもｃＭｅｔ／ＨＧＦ複合体に対してより高いアフィニティを有するｃＭｅｔ／ＨＧＦ複合体−結合部分を意味する。好ましい実施態様では、本発明による結合ヘテロマルチマーは、ｃＭｅｔ又はｃＭｅｔ／ＨＧＦ複合体に対して特異性であり、好ましくは、約１０μＭより低い、より好ましくは約１μＭ未満、最も好ましくは約０．５μＭ未満若しくはさらに低い解離定数を有する。
本明細書で用いる「患者」なる用語は、任意の哺乳動物、特にヒトを意味する。
「製薬的に受容される」キャリヤー若しくは賦形剤は、本発明の化合物と共に患者に投与することができ、本発明の化合物の薬理学的活性を破壊しない、非毒性のキャリヤー若しくは賦形剤を意味する。
「ターゲット」又は「ターゲット分子」なる用語は、結合部分若しくは結合ポリペプチドが結合することができる任意の物質、例えば、タンパク質若しくはポリペプチド、細胞、受容体、炭水化物、脂質等を意味する。本明細書で用いる限り、「ターゲット」はさらに、例えば、タンパク質−チロシンキナーゼ受容体のような、受容体のファミリーを包含する。
「治療剤」又は「治療薬(therapeutic)」なる用語は、in vivoで有益な、治療的又は細胞傷害性効果を有する化合物若しくは作用剤を意味する。治療剤は、例えば、生体活性作用剤(bioactive agent)、細胞傷害剤、薬物、化学療法剤、放射線治療剤(radiotherapeutic agents)、遺伝物質等と呼ばれるような組成物を包含する。
本明細書を通して、下記の一般的な略号を用いる：９-フルオレニルメチルオキシカルボニル(ｆｍｏｃ又はＦｍｏｃ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）、（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）−３−メチルブチル（ｉｖＤｄｅ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、試薬Ｂ（ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：フェノール：トリイソプロピルシラン、８８：５：５：２）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）。
Ｂ．本発明のダイマー及びマルチマー・ターゲッティング構築体
本発明のターゲッティング構築体は、単一ターゲットの異なる結合部位に結合する、２つ以上の結合部分を含む。該結合部分は同じターゲットの異なる部位に対して特異的である。これらは、ペプチド、ペプチド模倣体等であることができ、本明細書で定義するような結合ポリペプチドを包含する。さらに、結合部分は小結合分子を包含する。好ましい実施態様では、該結合部分は、結合ポリペプチドを含む。これらのターゲッティング構築体は、定義によると、ダイマー又はマルチマーであり、例えば、「多価ターゲッティング構築体」、「ヘテロダイマー」、「ヘテロダイマー構築体」、「ヘテロダイマー構築体」、「ヘテロトリマー」、「ヘテロテトラマー」、「ヘテロマルチマー」、「ヘテロマルチマー構築体」又は「ヘテロマー」と呼ばれることができる。これらのダイマー又はマルチマー構築体は、モノマー構築体に比べて、改良された結合を示す。構築体が結合ポリペプチドを含む場合には、該ポリペプチド配列をそれらのＮ−若しくはＣ−末端において又は適当に配置されたリシン部分（又は例えば側鎖オキシアミン若しくは他の求核基のような選択的な誘導体化可能な基を有する、他の官能基）のＮ−ε窒素において取り付けることができる、或いは適当な取り付け化学を用いて、１つ以上のリンカーを介して一緒に接合させることができる。このカップリング化学は、アミド、尿素、チオ尿素、オキシム又はアミノアセチルアミド（クロロ若しくはブロモ・アセトアミド誘導体から）を包含することができるが、これらに限定される訳ではない。
１実施態様では、本発明による好ましいダイマーは、第１結合ペプチドを、分枝基〜第１スペーサー〜リンカー〜第２スペーサーに、最後に第２結合ペプチドに連結することによって、構築することができる。ダイマーの、この連結スキームは、下記一般構造によって表すことができる：
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ
式中、ＡとＦは、同じターゲット上の異なる部位に結合する、２つの異なる結合ペプチドであり、Ｂは分枝基であり、ＣとＥは任意のスペーサーであり、Ｄはリンカーである。適当なスペーサーとリンカーは、当該技術分野で知られており、以下の実施例にも記載する。種々な実施態様では、Ｃ、Ｄ及び／又はＥは、場合によって、存在することも、存在しないこともありうる。場合によっては、レポーター部分又は同様な基をダイマーに分枝基を介して取り付けることができる。これらの構成要素の正確な配置は、例えば、該ペプチドがＣ−末端からＣ−末端へ、Ｎ−末端からＣ−末端へ、又はＮ−末端からＮ−末端へのいずれで連結するかに依存して、変化することができる。これらの異なる取り付けスキームの例は、図３７Ａ〜３７Ｅに示す。
他の実施態様では、本発明は、式：
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆ
で示される多価化合物の製造方法であって、前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ’又はＦのいずれかを、式：Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆにおける、その各隣接構成要素(単数又は複数）のいずれかに、化合物Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆが形成されるまで、任意の順序で取り付ける工程を含み、この場合、Ｄはジカルボン酸の誘導体を含むリンカーである方法に関する。
他の実施態様では、本発明は、式：
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆ
で示される多価化合物の製造方法であって、前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ’又はＦのいずれかを、式：Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆにおける、その各隣接構成要素(単数又は複数）のいずれかに、化合物Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆが形成されるまで、任意の順序で取り付ける工程を含み、この場合、Ｄはグルタル酸ビスＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル又はその誘導体を含むリンカーである方法に関する。
他の実施態様では、本発明は、式：
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆ
で示される多価化合物の製造方法であって、前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ’又はＦのいずれかを、式：Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆにおける、その各隣接構成要素(単数又は複数）のいずれかに、化合物Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆが形成されるまで、任意の順序で取り付ける工程を含み、この場合、Ｄはジアミンリンカー又はその誘導体である方法に関する。
好ましい多価構築体Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆの構成要素は、下記のように定義される：Ａは第１ペプチドであり、Ｂは第１分枝基であり、Ｃは任意の第１スペーサーであり、Ｄは、ジカルボン酸の誘導体又はジアミン若しくはその誘導体を含むリンカーであり、Ｅは、前記第１スペーサーＣと同じものでも、異なるものでもよい、任意の第２スペーサーであり、Ｂ’は、前記第１分枝基Ｂと同じものでも、異なるものでもよい、任意の第２分枝基であり、Ｆは、前記第１ペプチドＡと同じものでも、異なるものでもよい第２ペプチドである。好ましい実施態様では、Ｄはグルタル酸ビスＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである。
本明細書で用いる限り、ペプチドＡとＦは、本明細書に記載するモノマーのいずれも包含し、特に、１９項における表１中のモノマーを包含する。好ましい実施態様では、ペプチドＡとペプチドＦの少なくとも１つは、２つ以上のアミノ酸を含む。ペプチドＡとＦは、異なるペプチド、場合によっては、ターゲッティングペプチドであることができ、同じターゲットの異なるエピトープを標的とすることができる、又は同じ受容体の異なるエピトープを標的とすることができる。該受容体は、ＫＤＲ又はｃＭＥＴを包含することができる。
分枝基ＢとＢ’は、化合物への任意のレポーター−ｓｐ基の取り付け点を与える。前記第１分枝基Ｂと前記第２分枝基Ｂ’の一方又は両方は、非限定的に、リシン、オルニチン、アスパラギン酸又はグルタミン酸であることができる。
任意のスペーサーＣとＥは、リンカーＤを、化合物の他の構成要素Ａ、Ｂ、Ｂ’又はＦに、これらの他の構成要素をリンカーＤから、ある距離をおいて又はある「スペース」をおいて維持しながら、取り付けるために用いることができる。
これらの構成要素の各々は、以下の実施例及び教示にさらに詳しく記載する。種々な実施態様では、Ｂ’、Ｃ及び／又はＥは場合によっては存在しないことも可能である。場合によっては、レポーター部分又は同様な基を、分枝基を介して、ダイマーに取り付けることも可能である。
これらの構成要素の正確な配置は、例えば、該ペプチドがＣ−末端からＣ−末端へ、Ｎ−末端からＣ−末端へ、又はＮ−末端からＮ−末端へのいずれで連結するかに依存して、変化することができる。これらの異なる取り付けスキームの例は、図３７Ａ〜３７Ｅに示す。
以下の教示（例えば、１５〜１８項）から明らかになるように、本発明の新規な方法による新規なリンカーＤ（即ち、例えば、グルタル酸ビス−ＮＨＳエステル若しくはその誘導体のようなジカルボン酸の誘導体；又はジアミン）の使用は、当該技術分野で知られたものに比べて、改良され、優れた、製造と生成物の特徴を与える。
１．ペプチド構築体の製造
２つの異なる結合ペプチド（又は特定ペプチドの２分子）と標識基(labeling group)を有するダイマー構築体の製造は、本明細書に記載するように又は当該技術分野で知られた他の方法によって達成することができる。例えば、完全に保護された結合ペプチドをＥｌｌｍａｎ型セーフティ・キャッチ樹脂上に自動化若しくは手動式Ｆｍｏｃペプチド合成プロトコールを用いて形成することができる。Backes, B.J., et al., J. Am. Chem. Soc. 118(12), 3055-6 (1996) 参照、これはその全体で本明細書に援用される。別に、ペプチド合成の分野で知られた標準方法（例えば、, Fields, G.B. et al., “Principles and Practice of Solid Phase Synthesis” in Synthetic Peptides, A Users Guide, Grant, G.A. ed., Chap. 3: pp.77-183 W.H. Freeman Co. NY. 1992参照、これはその全体で本明細書に援用される）を用いて、ジリシン誘導体を２−クロロトリチル樹脂上に構築することができる。Barlos, K. and Gatos, D. “Convergent Peptide Synthesis” in Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Chan, W.C. and White, P.D. eds., Chap 9: pp 215-228 (Oxford University Press, New York, 2000)参照、これはその全体で本明細書に援用される。２−クロロトリチル樹脂からこの誘導体を、側鎖保護基を除去せずに、分離して、カルボキシル基を活性化させ、任意のアミン官能基化標識基にカップリングさせると、ジリシン誘導体が得られる、この誘導体の保護された側鎖窒素原子を暴露すると、２つの遊離アミノ基を生じることができる。上記セーフティ・キャッチ樹脂を活性化させ、所望のＮ−脱保護標識基−官能基化ジリシン誘導体を該活性化セーフティ・キャッチ樹脂に加える。今や該樹脂及びジリシン構造全体部分から引き離されている、セーフティ・キャッチ樹脂結合ペプチドのカルボキシ末端によって、側鎖アミノ基をアシル化する。ジリシン構築体のアミノ基の完全な反応を保証するために、過剰なセーフティ・キャッチ樹脂結合ペプチドを用いることができる。このスキームの反応パートナーの比率を最適化すると、収率が最適化される。トリフルオロ酢酸に基づく切断プロトコールを用いて、結合ペプチドの保護基を除去する。
例えば、１つの構築体上に２つ以上の結合ペプチドが存在する、ダイマー及びマルチマー構築体の合成は容易に達成される。垂直保護スキーム（例えば、１つの窒素上のアリルオキシカルボニル基と他の窒素上のＦｍｏｃ基、又は例えばＦｍｏｃ基を他方の窒素上のｉＶ−Ｄｄｅ保護基と共に用いる）を用いて、上記ジリシン誘導体の側鎖窒素原子を識別することができる。アミノ基の１つの暴露と、続いての得られた生成物と活性化セーフティ・キャッチ樹脂に結合した結合ペプチドとの上述したような反応は、単一結合ペプチドが付加したジリシン構築体を生成する。第２保護基の除去は残留窒素を暴露する。例えば、Mellor, S.L. et al., “Synthesis of Modified Peptides” in Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Chan, W.C. and White, P.D. eds., Chap 6: pp. 169-176(Oxford University Press, New York, 2000)を参照のこと、これはその全体で本明細書に援用される。得られた生成物を、異なる結合ペプチドを有する第２セーフティ・キャッチ樹脂と反応させて、完全保護ヘテロダイマー構築体を得ることができ、これは、トリフルオロ酢酸による保護基の除去後に、所望の物質を生成する。
或いは、結合ペプチドを最初にＲｉｎｋ−アミド樹脂に、自動化若しくは手動式ペプチド・カップリング方法によって、通常はＦｍｏｃペプチド合成プロトコールを用いてアセンブルする。該ペプチドは、例えば、リシン部分のＮε−アミノ基のような、付加的求核基を有することができる、リンカー又はリンカー標識基構築体によって官能基化された、Ｃ−末端又はＮ−末端を有することができる。保護基の切断は、該ペプチドの性質に依存して、適当な修飾剤(modifiers)と共にトリフルオロ酢酸を用いることによって達成することができる。次に、完全に脱保護されたペプチドを次に、例えばグルタル酸ビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Tyger Scientific Inc., 324 Stokes Avenue, Ewing, NJ, 08638から商業的に入手可能）のような、非常に過剰な二官能性求核試薬と反応させる。得られたモノアミド化したグルタル酸モノ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを、次に、同じペプチドの付加的当量によって、又は異なる結合ペプチドの当量によって処理する。得られた物質をＨＰＬＣによって精製すると、適当な標識基を有する、所望のホモ−又はヘテロ−ダイマー構築体が得られる。
さらに他のアプローチでは、モジュラー・スキームを用いて、上記で定義したような、適当な標識基を有するダイマー又はより高度なマルチマー構築体を製造することができる。簡単な説明では、ｆｍｏｃ−リシン（ｉＶＤｄｅ）Ｒｉｎｋアミド樹脂をピペリジンで処理して、ｆｍｏｃ部分を除去する。次に、例えば、ビオチン、５−カルボキシフルオレセイン又はＮ，Ｎ−ジメチル−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−ＯＨのような標識官能基を該窒素原子にカップリングさせる。この樹脂を次にヒドラジンで処理して、ｉＶＤｄｅ基を除去する。完全に洗浄した後に、該樹脂を塩化シアヌルと、例えばジイソプロピルエチルアミンのようなヒンダード塩基とによって、例えばＤＭＦ、ＮＭＰ又はジクロロメタンのような、適当な溶媒中で処理して、樹脂に結合した単官能基化ジクロロトリアジンを得る。その後の、２当量の結合ペプチドによる又は１当量の結合ペプチド、続いての第２結合ペプチドによる残留塩素原子の連続的置換が、樹脂結合ヘテロ−又はホモ−ダイマーの標識基官能基化構築体を生成する。例えば、Falorni, M., et al., Tetrahedron Lett. (1998), 39(41), 7607-7610; Johnson, C.R., et al., Tetrahedron (1998), 54(16), 4097-4106; Stankova, M. and Lebl, M., Mol. Diversity (1996), 2(1/2), 75-80参照。
状況が許すならば、適切であるとして、該受け入れペプチドを保護することも、保護しないことも可能である。保護基の切断は、上述したように、トリフルオロ酢酸に基づく脱保護試薬を用いて達成され、所望の物質を高性能液体クロマトグラフィーによって精製する。
これらの方法の各々において、リシン誘導体、オルニチン又は２，３−ジアミノプロピオン酸を連続的に用いて、該マルチマーの多重度を高めることができると、理解される。足場として作用するため、結合ペプチドの間の距離を変えるため、及び（結合ペプチドの相互及び該レポーターに対する運動及び相対的位置を制約することによって）構築体の剛性を高めるために必要な数の遮蔽された又は垂直保護された窒素原子を有する、関連した、より剛性の分子の使用は、完全に、本明細書で記載する合成方法の範囲内である。
固相ペプチド合成、液相合成等を含めた、慣用的手法を用いて、結合ペプチドの直接合成を達成することができる。固相合成が好ましい。本明細書に援用される、Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1989), W. H. Freeman Co., San Francisco; Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963); Bodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, New York 1984) を参照のこと。本発明のポリペプチドは、業務としてペプチド合成を提供する企業によって商業的に用意することもできる（例えば、BACHEM Bioscience, Inc., King of Prussia, PA; Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkinton, MA）。例えば、Perkin-Elmer Applied Biosystemsによって製造されるような、自動化ペプチド合成装置も利用可能である。
該ポリペプチド化合物がひと度単離された又は化学的若しくは組み換え手法によって合成されたならば、該ポリペプチド化合物を精製することが好ましい。精製のためには、例えばＣ４−、Ｃ８−又はＣ１８−シリカのようなアルキル化シリカカラムを用いる逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を含めた、使用可能な、多くの標準方法が存在する。精製を達成するためには、有機含量を高める勾配移動相、例えば、少量のトリフルオロ酢酸を通常含有する水性バッファー中のアセトニトリルが一般に用いられる。ペプチドをそれらの電荷に基づいて分離するために、イオン交換クロマトグラフィーを用いることも可能である。ポリペプチドの精製度は、ＨＰＬＣ上の主要な大きいピークの同定を含めて、種々な方法によって測定することができる。ＨＰＬＣカラム上の投入物質の少なくとも９５％である、単一ピークを生じるポリペプチドが好ましい。ＨＰＬＣカラム上の投入物質の少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は９９．５％以上さえもである、単一ピークを生じるポリペプチドがさらにより好ましい。
上記手法のいずれかを用いて得られるペプチドが、本発明の組成物に用いるための所望のペプチドであることを保証するために、ペプチド組成の分析を行なうことができる。このような組成分析は、ペプチドの分子量を測定するための高分解能質量分光分析を用いて行なうことができる。或いは、ペプチドのアミノ酸含量を、酸水溶液中でのペプチドの加水分解、ＨＰＬＣ又はアミノ酸アナライザーを用いての、混合物の構成要素の分離、同定及び定量によって確認することができる。連続的にペプチドを分解して、アミノ酸を順々に同定するタンパク質シーケンサーを用いて、ペプチドの配列を決定することもできる。
例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸（ポリヌクレオチド）を用い、次にそれらを組換え的に発現させる、即ち、宿主細胞を外因性核酸分子の既知方法での導入によって操作し、所望の結合ポリペプチドを作製することによって、結合ポリペプチドは組換えＤＮＡ手法を用いても製造することができる。このような手段は、当業者の能力の範囲内である（Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)参照、これはその全体で本明細書に援用される）。本明細書に記載するような、短いペプチドの組換え製造は、直接合成に比べて実用的でないかもしれないが、本発明の結合部分をハイブリッド・ポリペプチド又は融合タンパク質に組み入れる場合には、製造の組換え手段が非常に有利である可能性がある。
本発明の１実施態様の実施では、ターゲットに対するヘテロマルチマー若しくは構成結合部分の、他のタンパク質若しくはターゲットに比較した、アフィニティの測定は、有用な指標(measure)であり、ターゲットに対するアフィニティと呼ばれる。結合を定量し、アフィニティを測定するための標準アッセイは、例えば、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、表面プラスモン共鳴、又は結合部分とそのターゲットとの相互作用から生じうる、多くの分光学的変化（例えば、蛍光偏光の変化）のモニターリングを包含する。これらの手法又はそれらの改変は、リガンド（又はタンパク質）濃度の関数として、結合したリガンドと遊離リガンドの濃度を測定する。結合したヘテロマルチマー若しくはポリペプチドの濃度（［Ｂｏｕｎｄ］）は、遊離ヘテロマルチマー若しくはポリペプチドの濃度（［Ｆｒｅｅ］）及び該ポリペプチドの結合部位の濃度に関連する、即ち、ＫＤＲ、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体、ｃＭｅｔ、ｃＭｅｔ／ＨＧＦ複合体（Ｎ）上で、次式：
［Ｂｏｕｎｄ］＝Ｎ ｘ ［Ｆｒｅｅ］／（（１／Ｋａ）＋［Ｆｒｅｅ］）
に表されるように関係する。
この式によるデータの解決は、会合定数Ｋａ、結合アフィニティの量的尺度を生じる。会合定数Ｋａは、解離定数ＫＤの逆数である。アフィニティの測定では、ＫＤの方が頻繁に報告されている。好ましい実施態様では、本発明のヘテロマルチマーと構成結合ポリペプチドは、ターゲット、例えば、ＫＤＲ、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体、ｃＭｅｔ又はｃＭｅｔ／ＨＧＦに結合し、１ナノモル（ｎＭ）〜１００マイクロモル（μＭ）の範囲内のターゲットに対するＫＤを有し、好ましくは５０μＭ未満、より好ましくは１μＭ未満、さらにより好ましくは５０ｎＭ未満、最も好ましくは１０ｎＭ未満のＫＤ値を有する。
ヘテロマルチマーをイメージング剤として用いる場合には、結合アフィニティの他の態様がより重要になる。例えば、このようなイメージング剤は、ターゲット（例えば、活性化内皮上のＫＤＲ又はＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体）へのイメージング剤の結合がイメージング処置を通して安定な平衡状態ではないという点で、動的系で作用する。例えば、イメージング剤を最初に注入すると、イメージング剤及び該剤−ターゲット複合体の濃度は急激に上昇する。しかし、注入後間もなく、循環（遊離）イメージング剤が腎臓又は肝臓からクリアされ、イメージング剤の血漿濃度が低下し始める。血漿中の遊離イメージング剤濃度のこの低下は、最終的には、イメージング剤−ターゲット複合体を解離させる。イメージング剤の有用性は、該剤のクリア速度(clearing rate)を基準にした該剤−ターゲット解離速度の相違に依存する。理想的には、解離速度がクリア速度に比べて緩慢になると、長いイメージング時間が生じて、この時間中に血漿中には高濃度の該剤−ターゲット複合体と低濃度の遊離イメージング剤（バックグラウンドシグナル）が存在する。
例えば本発明のヘテロマルチマー結合化合物のような、ヘテロマルチマー結合化合物の利点は、それらが一般に、それらの構成モノマーに比べて、非常に緩慢な解離速度を有することである（Tissot et al., J. Immunol. Methods 236(1-2):147-165 (2000)参照）。さらに、ターゲット分子上の２つの識別可能なエピトープに結合することができるヘテロマルチマー化合物は同時に、細胞表面上のターゲット分子間の距離に関係なく、マルチマー結合を達成することができる。他方では、ホモマルチマー結合化合物は、該ホモマルチマーがターゲット分子間の距離を橋渡しすることができるほど、密に近接している２つ以上のターゲット分子の存在に依存する。したがって、細胞表面上にあまり豊富に存在しないため、相互から大きく離れている受容体と他の細胞表面分子に結合するために、本発明のヘテロマルチマー結合化合物は特に良好に適する。
解離速度の数値的測定は、当該技術分野に知られた幾つかの方法、例えば、光ファイバー蛍光定量法（例えば、Anderson and Miller, Clin. Chem., 34(7):1417-21 (1988)参照)、表面プラスモン共鳴(Malmborg et al., J. Immunol. Methods, 198(1):51-7 (1996) 及び Schuck, Current Opinion in Biotechnology, 8:498-502 (1997)参照)、共鳴ミラー及びグレーティング結合プレーナ導波路（grating coupled planar waveguiding ）(例えば、Hutchinson, Molec. Biotechnology, 3:47-54 (1995)参照)を用いて、容易に行なうことができる。自動化バイオセンサーは、結合動力学を測定するために商業的に入手可能である：ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラスモン共鳴センサー(Biacore AB, Uppsala SE)、ＩＡｓｙｓ共鳴ミラーセンサー (Fisons Applied Sensor Technology, Cambridge GB)、ＢＩＯＳ−１グレイテッド結合プレーナ導波センサー（grated coupled planar waveguiding sensor）(Artificial Sensor Instruments, Zurich CH)。
２．結合ポリペプチドの修飾又は最適化
ヘテロマルチマーの修飾又は最適化は、本発明の範囲内である。特に、修飾された又は最適化されたヘテロマルチマーは、「ヘテロマルチマー」の定義の範囲内に含まれる。同様に、修飾された又は最適化された結合ポリペプチドは、「結合ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、フレーズ「ＫＤＲ及びＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチド」は、修飾された又は最適化されたＫＤＲ及びＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドを包含し、フレーズ「ｃＭｅｔ及びｃＭｅｔ／ＨＧＦ複合体結合ポリペプチド」は、修飾された又は最適化されたｃＭｅｔ及びｃＭｅｔ／ＨＧＦ複合体結合ポリペプチドを包含する。具体的には、本発明のヘテロマルチマーに用いるためのポリペプチド配列を修飾して、その効力、薬物動態的挙動、安定性及び／又は他の生物学的、物理学的及び化学的性質を最適化することができる。
３．アミノ酸残基の置換
同じクラス内のアミノ酸の置換（例えば、１つの塩基性アミノ酸を他のアミノ酸に代えて置換する）は、当該技術分野で周知である。例えば、得られたポリペプチドが上記性質の同様な又は改良されたプロフィルを有するであろうと期待して、親ポリペプチド配列に下記の等電子配置及び／又は保存アミノ酸変化を行なうことができる：
アルキル置換疎水性アミノ酸の置換：脂肪族側鎖の１〜１０炭素含有分枝鎖、環状及び直鎖アルキル、アルケニル若しくはアルキニル置換によって置換された、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、Ｓ−２−アミノ酪酸、Ｓ−シクロヘキシルアラニン又は他の単純α−アミノ酸を包含する。
芳香族置換疎水性アミノ酸の置換：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ビフェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、２−ベンゾチエニルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジン、上記芳香族アミノ酸のアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化（フルオロ、クロロ、ブロモ若しくはヨード）又はアルコキシ（Ｃ１−Ｃ４）置換形（これらの具体的な例は、２−、３−若しくは４−アミノフェニルアラニン、２−、３−若しくは４−クロロフェニルアラニン、２−、３−若しくは４−メチルフェニルアラニン、２−、３−若しくは４−メトキシフェニルアラニン、５−アミノ−、５−クロロ−、５−メチル−若しくは５−メトキシトリプトファン、２’−、３’−若しくは４’−アミノ−、２’−、３’−若しくは４’−クロロ−、２−、３−若しくは４−ビフェニルアラニン、２’−、３’−若しくは４’−メチル−２−、３−若しくは４−ビフェニルアラニン、及び２−若しくは３−ピリジルアラニンである）を包含する。
塩基性官能基を含有するアミノ酸の置換：アルギニン、リシン、ヒスチジン、オルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニン、置換基がヘテロ原子（例えば、α窒素若しくは末端窒素(単数又は複数））上にあろうと、又は例えばｐｒｏ−Ｒ位置におけるα炭素上にあろうと、上記アミノ酸のアルキル、アルケニル若しくはアリール−置換（Ｃ１−Ｃ１０分枝、線状若しくは環状）誘導体を包含する。具体的例として役立つ化合物は、Ｎ−ε−イソプロピル−リシン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−グリシン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−アラニン、Ｎ，Ｎ−γ，γ’−ジエチル−ホモアルギニンを包含する。例えば、アルキル基がα炭素のｐｒｏ−Ｒ位置を占める、αメチルアルギニン、αメチル２，３−ジアミノプロピオン酸、αメチルヒスチジン、αメチルオルニチンのような化合物も包含される。アルキル、芳香族、ヘテロ芳香族（ヘテロ芳香族基は、１つ以上の窒素、酸素又は硫黄原子を単独で又は組み合わせて有する）カルボン酸又は多くの周知の活性化誘導体、例えば、酸塩化物、活性エステル、活性アゾリド及び関連誘導体のいずれかと、リシン、オルニチン又は２，３−ジアミノプロピオン酸から形成されるアミドも包含される。
酸性アミノ酸の置換：アサパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、チロシン、２，３−ジアミノプロピオン酸、オルニチン又はリシンのアルキル、アリール、アラルキル及びヘテロアリール・スルホンアミド；及びテトラゾール置換アルキルアミノ酸を包含する。
側鎖アミド残基の置換：アスパラギン、グルタミン及び、アスパラギン又はグルタミンのアルキル若しくは芳香族置換誘導体を包含する。
ヒドロキシル含有アミノ酸の置換：セリン、トレオニン、ホモセリン、２，３−ジアミノプロピオン酸及び、セリン又はトレオニンのアルキル若しくは芳香族置換誘導体を包含する。
上記カテゴリーの各々内のアミノ酸が同じグループの他のアミノ酸に代わって置換されうることも、理解される。
アミノ酸が、同様な立体的特徴を有するが、その酸性又は塩基性官能基が、立体的に類似するが、その酸性又は塩基性の性質が変化される、逆転される、弱められる又は増強される可能性がある基を用いて、模倣されている類似体によって置換されうることも理解される。例は、アルギニンの、グアニジン基がグアニジンＮＨ２基の１つに付加したシアノ基を有する類似体による置換；アルギニンの、グアニジン基がウレイド官能基によって置換されているシトルリンによる置換；及びリシンの、グルタミンによる又はグルタミン酸δヒドラジドによる置換である。
４．アミド結合の置換
本発明の範囲内の、他のタイプの修飾は、結合ポリペプチド主鎖内のアミド結合の置換である。例えば、好ましくないタンパク質分解、若しくは血清安定性を低下させて、生体活性の低下若しくは除去を招く、他の分解経路を弱める若しくは排除するために、又は立体配座フレキシビリティを制限する若しくは高めるために、該ペプチド主鎖内のアミド結合を、既存の立体配座を模倣する又は該立体配座を好ましいやり方で変化させる官能基によって置換することが一般的である。このような修飾は、結合アフィニティの増強又は薬物動態的挙動の改良を生じる可能性がある。ペプチド合成の技術分野に精通した人は、２つのアミノ酸を連結する任意のアミド結合に対して下記アミド結合変化を、得られたペプチドが同じ若しくは改良された活性を有することができると期待して、行なうことができると理解される：α−Ｎ−メチルアミド若しくはペプチドアミド主鎖チオアミドの挿入；同系二次アミン(cognate secondary amines)を生じるためのカルボニルの除去；セミカルバゾン誘導体を得るためのアザ−アミノ酸による１つのアミノ酸の置換；及びＥ−オレフィンと置換Ｅ−オレフィンの、アミド結合代用としての使用。
５．Ｄ−アミノ酸の導入
本発明の範囲内の、他のアプローチは、不安定なペプチド結合に遠位又は近位の、Ｄ−アラニン又は他のＤ−アミノ酸の導入である。この場合に、このようなＤ−アミノ酸置換が、その側鎖が置換されるＬ−アミノ酸の側鎖に対して保存置換(conservative replacements)ではないＤ−アミノ酸によって行なうことができ、時には、このようなＤ−アミノ酸によって行なわなければならないことも、理解される。この理由は、キラリティの相違とそのための側鎖配向の相違であり、これらによって、置換されたＬ−アミノ酸の側鎖によって与えられるものと比べて、電荷、疎水性、立体的必要条件等が異なる部分を有するターゲットの結合部位の今までに未踏の領域にアクセスすることができる。
６．薬力学的又は薬物動態的性質の修飾
特定の用途における本発明のヘテロマルチマー構築体の使用は、薬力学的及び薬物動態的挙動を改良するような、ペプチドの修飾又はペプチドの処方(formulations)を必要としうることも理解される。所望の物理的若しくは化学的性質をもたらすと予想される部分の取り付けによって、該ペプチドの性質が変化されうると期待される。ヘテロマルチマーが結合ポリペプチドを含む場合には、薬物動態的及び薬力学的挙動に影響を与える、このような部分をペプチドに、酸若しくはアミンを用いて、それぞれ、該ペプチドのＮ−若しくはＣ−末端に、又は適当に配置されたリシン若しくはリシン誘導体、ジアミノプロピオン酸、オルニチン、又は側鎖アミン基若しくは側鎖アルコキシアミノ基若しくはヒドラジン基を有するペプチドの他のアミノ酸に、アミド結合若しくは尿素結合を介して付加させることができる。導入される部分は、問題のペプチドと、その性質を修飾する残存する必要性に依存して、親水性、塩基性又は非極性のアルキル若しくは芳香族基であることができる。
７．アミノ酸残基のグリコシル化
本発明の範囲内のさらに他の修飾は、結合部分又はリンカー部分のいずれか又は両方におけるグリコシル化アミノ酸残基（例えば、セリン、トレオニン又はアスパラギン残基）を、単独で又は組み合わせて、用いることである。標準条件を用いて行なうことができるグリコシル化を用いて、溶解度を強化する、薬物動態及び薬力学を変化させる、又はグリコシド部分を伴う特異的若しくは非特異的相互作用を介して結合を強化することができる。他のアプローチでは、例えば、Ｏ−（２−アセトアミド−２−でオキシ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）セリン又は類似のトレオニン誘導体(Ｄ−若しくはＬ−アミノ酸）をペプチドに、手動若しくは自動化固相合成中に又は手動若しくは自動化液相合成中に組み入れることができる。同様に、Ｄ−若しくはＬ−Ｎ’−（２−アセトアミド−２−デオキシ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−アスパラギンを用いることができる。グリコシル化に用いることができる、適当に官能基化された及び活性化された炭水化物部分の媒介によって、側鎖酸素、窒素若しくは硫黄官能基(pendant oxygen, nitrogen or sulfur function)上でグリコシル化されたアミノ酸の使用が、期待される。このような炭水化物官能基は、単糖類、二糖類又はオリゴ糖のさらに大きいアセンブリでさえあることができる（(Kihlberg, Jan., “Glycopeptide synthesis,” In: Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis - A Practical Approach, Chan, W.C. and White, P.D. Eds., Chap. 8, pp. 195-213 (Oxford University Press, New York, NY 2000)。
グリコシル化以外の手段による、アノマー炭素における脱離基の活性化を介した、アミノ酸への炭水化物官能基の付加も期待される。グリコシドへのアミノ酸の連結は、炭水化物官能基のアノマー炭素への結合の形成に限定されない。この代わりに、アミノ酸への炭水化物部分の連結は、任意の充分に反応性の酸素原子、窒素原子、炭素原子又は該炭水化物官能基の他の側鎖原子を通して、当該技術分野で知られた、Ｃ−ヘテロ原子、Ｃ−Ｃ又はヘテロ原子−ヘテロ原子（例は、Ｓ−Ｓ、Ｏ−Ｎ、Ｎ−Ｎ、Ｐ−Ｏ、Ｐ−Ｎ）結合で行なわれることができる。
８．塩の形成
該ペプチドの水溶性及び処方の容易さを高めることができる種々な塩を形成することも、本発明の範囲内である。これらの塩は、非限定的に、Ｎ−メチルグルカミン（メグルミン）、酢酸塩、シュウ酸塩、アスコルビン酸塩等を包含することができる。
９．構造特徴を保持する構造修飾
本発明の範囲内のさらに他の修飾は、環状ポリペプチドの切断(truncation)である。本発明の多くのポリペプチドの環状性は、特に環内の、ペプチド配列に利用可能な立体配座スペースを限定する。それ故、Ｎ−末端又はＣ−末端領域における、環に遠位又は近位でさえの１つ以上の残基によるペプチドの切断は、切断されたペプチドに同様な又は改良された生物学的活性を与えることができる。結合活性を惹起するアミノ酸の特有の配列、３アミノ酸程度の小さい配列でさえ、ＲＧＤペプチドに関して述べられたように、同定することができる。例えば、E.F. Plow et al., Blood (1987), 70(1), 110-5; A. Oldberg et al., Journal of Biological Chemistry (1988), 263(36), 19433-19436; R. Taub et al., Journal of Biological Chemistry (1989 Jan. 5), 264(1), 259-65; A. Andrieux et al., Journal of Biological Chemistry (1989 Jun. 5), 264(16), 9258-65; 及び U.S. Patent Nos. 5,773,412 と 5,759,996を参照のこと、これらの各々は、それらの全体で本明細書に援用される。
大きいペプチド環を、外来のアミノ酸を除去して、但し、重要な結合残基を含めて、実質的に縮小することができることも、文献に示されている。その全体で本明細書に援用される米国特許No. 5,556,939 を参照のこと。ジスフィド結合又は、適当に配置されたカルボン酸基とアミノ基のアミド結合を用いて、縮小した環状ペプチドを形成することができる。
さらに、回転特徴を安定化させるために、Ｄ−アミノ酸をペプチド配列に加えることが可能である（特に、グリシンの場合）。他のアプローチでは、α、β、γ又はδジペプチド又は回転模倣体（例えば、α、β、γ又はδ回転模倣体）（これらの幾つかは、下記構造１、２及び３に示す）を用いて、ペプチドの構造モチーフと回転特徴を模倣することができ、同時に、タンパク質分解からの安定性を与え、他の性質、例えば、立体配座安定性及び溶解性を強化することができる（構造１：Hart et al., J. Org. Chem., 64, 2998-2999(1999); 構造２: Hanessian et al., "Synthesis of a Versatile Peptidomimetic Scaffold" in Methods in Molecular Medicine, Vol. 23: Peptidomimetics Protocols, W.M. Kazmierski Ed. (Humana Press Inc. Totowa N.J. 1999), Chapter 10, pp. 161-174; 構造３: WO 01/16135）。
さらに、１対のアミノ酸を含有する、環状ペプチドのある領域を、同じ距離又は同様な距離に及ぶ単一アミノ酸と置換することができる。このようなアミノ酸は、置換された該アミノ酸対の構造の模倣体として作用することができる、又はこれらは、特に、該アミノ酸対が該化合物の活性にとって重要でないことを示す情報が、（該物質の生物学的活性又は望ましい立体配座への構造中の特定アミノ酸の必要性又は寄与を実証するように設計された、アラニン・スキャン、Ｄ−アミノ酸スキャン又は他の手法からとして）入手可能である場合には、単にスペーサーとして作用することができる。このようなスペーサーアミノ酸は、カルボン酸官能基とアミノ基との間に４個の介入原子を有する莫大な化合物のプールから引き出すことができる。このような化合物の例は、４−アミノ安息香酸、４−アミノシクロヘキサンカルボン酸、５−アミノ吉草酸、５−ヒドラジノブタン酸、３−アミノメチルシクロブタンカルボン酸、１-アミノシクロブタン−３−酢酸、３−アミノフェニル酢酸及びＮ−アミノイソニペコチン酸である。本発明はさらに、本質的なスペーサー要素が保存されており、その上、ペプチドの結合活性を強化しうる他の官能基が該分子中に含まれている、他の化合物も包含する。
１０．ジスルフィド模倣体の置換
本発明の結合ポリペプチド内のジスルフィド結合に代わるジスフィド模倣体の置換も、本発明の範囲内に含まれる。ヘテロマルチマー構築体の作製にジスフィド含有ペプチドを用いる場合は、時にはジスルフィド結合の存在によって惹起される、ある種の困難を回避するために、ジスフィド結合を置換する必要がありうる。例えば、ヘテロマルチマー９９ｍＴｃ（又は他の放射性核種）に基づく放射性医薬品又はある種の他のヘテロマルチマー構築体を作製する場合に、ジスルフィド結合の存在が重大な問題になりうる。ペルテクネテートイオンの還元と、その後の、Ｔｃ適合性キレート形成基を有する物質中への還元されたＴｃ種の組み込みに依存する経路を介して９９ｍＴｃを組み込むように設計された手段中に、ジスルフィド結合の完全性を維持することが困難である。この理由は、放射性医薬品の一工程調製のために考案されたキットに一般に用いられる還元剤によって、むしろジスルフィド結合が容易に還元されるからである。それ故、Ｔｃキレート形成中にジスルフィド結合が容易に還元されうることが、ジスルフィド結合の模倣体による置換を必要とする可能性がある。したがって、本発明の範囲内の、他の修飾は、以下に開示する方法又は当業者に知られた他の方法を用いて、本発明に用いられる結合ポリペプチドの活性及び他の好ましい性質を保持しながら、ジスルフィド部分を模倣体によって置換することである。
ａ．オキシム・リンカー
オキシム部分は、多くの状況(contexts)において研究者によって、リンカーとして用いられている。最も興味深いのは、Wahl, F と Mutter Mによる研究（Tetrahedron Lett. (1996) 37, 6861-6864)である。アミノアルコール官能基を含有するアミノ酸（４）と、アルコキシアミノ官能基を含有するアミノ酸(５ａ若しくは５ｂ）を、必ずしもペプチド鎖の末端においてではなく、ペプチド鎖中に組み入れる。ペプチドの形成後に、側鎖保護基を除去する。アルデヒド基が暴露されて、オキシム結合(oxime linkage)が形成される。
ｂ．ランチオニン・リンカー
ランチオニンは、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）が（Ｃ−Ｓ）結合によって置換される環状スルフィドである。したがって、還元に対する不安定性度は極端に低く、この結合は、塩化第１スズに安定である筈である。ランチオニンは、多くの方法によって製造することができる。
ｉ．ブロモアセチル化ペプチドを用いるランチオニンの製造
ランチオニンは、既知方法を用いて容易に製造される。例えば、Robey et al. (Robey, F.A. and Fields, R.L., Anal. Biochem. (1989) 177, 373-377) and Inman, et al. (Inman, J.K.; Highet, P.F.; Kolodny, N.; and Robey, F.A. Bioconjugate Chem. (1991) 2, 458-463; Ploinsky, A. Cooney, M.C. Toy-Palmer, A. Osapay, G. and Goodman, M. J. Med. Chem. (1992) 35, 4185-4194; Mayer, J.P.; Zhang, J.; and Liu, C.F. in: Tam, J.P. and Kaumaya, P.T.P. (eds), “Peptides, Frontiers of Peptide Science,” Proceedings of the 15thAmerican Peptide Symposium, June 14-19 Nashville, Tenn. Klumer Academic Pub. Boston. pp 291-292; Wakao, Norihiro; Hino, Yoichi; Ishikawa, Ryuichi. Jpn. Kokai Tokkyo Koho (1995), 7 pp.を参照のこと。JP 07300452 A2 19951114 Heisei; JP 95-49692 19950309; JP 94-41458 19940311が、この分野で公開されている。Ｂｏｃ自動化ペプチド合成を用いてペプチドを製造し、続いて、該ペプチド末端をブロモ酢酸とカップリングさせると、ブロモアセチル化ペプチドが良好な収率で得られる。該ペプチドの切断と脱保護は、ＨＦ／アニソールを用いて達成される。該ペプチドがシステイン基を含有する場合には、その反応性を低いｐＨで制御することができる。媒質のｐＨが６〜７に上昇すると、該ペプチドの重合又は環化のいずれかが行なわれる。高濃度（１００ｍｇ／ｍｌ）では重合が支持され、低濃度（１ｍｇ／ｍｌ）では環化が支持され、例えば、スキーム１では、６が環化されて、７になる。
スキーム１：側鎖ブロモアセトアミド官能基を有するシステインの環化の例
Ｉｎｍａｎらは、Ｂｏｃペプチド合成に用いることができて、配列のいずれかにブロモアセチル含有部分の配置を可能にする、ブロモアセチル基の担体としてのＮα−（Ｂｏｃ）−Ｎβ−［Ｎ−（ブロモアセチル）−β−アラニル］−Ｌ−リシンの使用を実証している。予備実験では、システインからブロモアセチル−リシン誘導体を分離する４〜６アミノ酸を有するペプチドが環化する傾向があり、非常に多様な環サイズのランチオニンの製造に、この方法の有力な使用を実証している。
或いは、セーフティ、キャッチ樹脂上又はＲｉｎｋ−アミド樹脂上でのｆｍｏｃペプチド合成方法によって、ペプチドを製造することができる。ピペリジン／ＤＭＦを用いて又はＤＭＦ中２％ＤＢＵを用いて、Ｎ−末端アミノ基を暴露させることができる。次に、この樹脂を例えば酢酸のような弱刺激性の酸による処理によって中和させて、強い求核性ピペリジン又は強い塩基性ＤＢＵの痕跡を除去することができる。次に、該樹脂をＤＩＥＡで処理して、樹脂上のＮ−末端アミノ基とのイオン対として存在する酢酸を除去することができる。次に、ＤＭＦで洗浄して、ＤＩＥＡとＤＩＥＡアセテートの痕跡を除去する。ブロモ酢酸とＤＩＣによる樹脂の処理によって、ブロモアセチル基を付加させる。試薬Ｂによる又は最適には、最小のスキャベンジャーを用いる関連ＴＦＡベース切断カクテル（例えば、ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：アニソール、９０：５：５）による樹脂の処理は、側鎖保護基を除去する。エーテルの添加によって、ペプチドを沈殿させ、回収し、ＤＭＦ中に再溶解させ、例えばＤＩＥＡのような適当な塩基の存在下の希薄な溶液中で、システインチオールによる、ブロモアセチル基からのブロミドイオンの求核置換を行なう。未加工の沈殿ペプチドは、水中又は水と例えば、ＤＭＳＯ、ＮＭＰ、ＤＭＡ、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、グリム、ジグリム、トリグリム、テトラグリム、テトラヒドロフラン若しくはジオキサンのような、適当な有機共溶媒との混合物中に溶解することもでき、この溶液のｐＨを例えばＮ−メチルグルカミン若しくは水酸化アンモニウムのような塩基の添加によって７．０〜８．０に調節して、該混合物を周囲温度において撹拌する。ランチオニンの形成をＨＰＬＣ及び質量分光分析によって追跡する。反応の完了時に、所望のペプチドをゲル濾過、ＨＰＬＣ及び当業者に知られた、他のペプチド精製手法によって精製する。
ｉｉ．アクリルアミドへのシステインチオール付加によるランチオニンの製造
この方法の幾つかの変形を実施することができる。樹脂結合セリンを用いて、臭化−脱臭化水素−チオール付加シーケンス又は炭酸ジスクシンイミジルによる脱水とその後のチオール付加のいずれかによって、樹脂上にランチオニン環を製造することができる。Ploinsky et al., M. J. Med. Chem., 35:4185-4194 (1992); Mayer et al., "Peptides, Frontiers of Peptide Science", in Proceedings of the 15 th American Peptide Symposium, Tam & Kaumaya (eds.), June 14-19, 1995, Nashville, Tenn. (Kluwer Academic Pub. Boston) pp. 291-292。アクリルアミドへのチオールのコンジュゲート付加も充分に説明されており、アクリルアミドへの２−メルカプトエタノールの付加も言及されている。Wakao et al., Jpn. Kokai Tokkyo Koho, JP 07300452 A2 (1995)。
ｃ．ジアリールエーテル又はジアリールアミン結合
ｉ．アリールボロン酸とチロシンの分子内環化からのジアリールエーテル結合
非対称ジアリールエーテルと関連アミンを好収率（９８％程度）で得るための、塩基としてピリジン又はトリエチルアミンのいずれかを用いて、ジクロロメタン中、空気中の周囲温度において酢酸第２銅の存在下でのアリールボロン酸と、フェノール、アミン及び複素環式アミンとの反応が報告されている。例えば、Evans et al., Tetrahedron Lett., 39:2937-2940 (1998); Chan et al., Tetrahedron Lett., 39:2933-2936 (1998); Lam et al., Tetrahedron Lett., 39:2941-2944 (1998)を参照のこと。フェノール成分としてのＮ−保護チロシン誘導体の場合には、収率も９８％程度の高さであった。これは、アミノ酸アミド（ペプチド）が形質転換に対して安定であると期待されること及び収率が高いことを実証する。分子内反応の先例は、ラクタムへのペプチドの容易な分子内環化、ＳＮＡｒ反応に基づく分子内ビアリールエーテル形成、及び高希釈条件下又は、擬似希釈効果が高希釈条件を模倣する樹脂上での分子内環化反応の一般性を考慮すると存在する。
ｄ．分子内ネイティブ化学ライゲーションによるラクタム結合を有する環状ペプチドの形成
スキーム２：ペプチドアルデヒドとシステイン部分との分子内反応によるチアゾリジン結合を有する環状ペプチドの形成
使用可能である、他のアプローチは、適当に配置された近隣のアミノメルカプタン官能基（通常は、線状配列の末端における、又は例えばリシンの側鎖窒素を介して配列にテザーされた、システインの配置に由来する）と、アルデヒド官能基との、チアゾリジンを生成する分子内環化を含む、該チアゾリジンは二環状ペプチドの形成をもたらし、その１つの環は主鎖中の残基によって形成される環であり、第２環はチアゾリジン環である。上記スキーム２は、１例を与える。必要なアルデヒド官能基は、リシン部分の側鎖アミノ基への付加によって鎖にテザーされた非保護セリンとして存在しうる、適当に配置された近隣アミノアルコール官能基のメタ過ヨウ素酸ナトリウム切断によって形成されることができる。場合によっては、必要なアルデヒド官能基は、該鎖のＣ−末端又はＮ−末端における保護されたアルデヒド誘導体の暴露によって形成される。この方法の１例は、Botti, P.; Pallin, T.D. and Tam, J.P. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 10018-10034に見出される。
１１．樹脂上のカルボキシル基による側鎖アミノ基の分子内環化に基づくラクタム
マクロ環状ペプチドは、ヘッド−テイル型環化又は側鎖基環化によるラクタム形成によって製造することができる。基本的方法は、アミン保護基とカルボキシ保護基を選択的に除去することができる完全保護ペプチドを製造することである。垂直保護スキームが開発されている。開発された方法のうち、アリル方法、トリチル方法及びＤｄｅ方法が最も用いられている。Mellor et al., “Synthesis of Modified Peptides,” in Fmoc Solid Phase Synthesis: A Practical Approach, White and Chan (eds) ([Oxfoerd University Press,, New York, 2000]), Chapt. 6, pp. 169-178を参照のこと。Ｄｄｅアプローチは、カルボン酸官能基（Ｄｍａｂエステル）とアミノ基（Ｄｄｅ基）の両方に対して同様な保護基を用いるという理由から、該アプローチが興味深い。両方が、周囲温度におけるＤＭＦ中２〜１０％ヒドラジンによって除去される。或いは、アミノ基に対してＤｄｅを用い、カルボキシルに対してアリル基を用いることができる。
標準ペプチドカップリング試薬（例えば、ＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰ等）による分子内カップリングによって得られるラクタム官能基は、ジスルフィド結合の代用物として作用することができる。Ｄｄｅ／Ｄｍａｂアプローチは、以下のスキーム３ａに示す。
スキーム３ａ：ＬｙｓとＡｓｐの擬似垂直脱保護とその後の樹脂上環化と樹脂からの切断によるジスルフィド結合のラクタム代用物
したがって、Ｄｄｅ保護リシンとＤｍａｂエステルとを含有する線状配列は、ＴｅｎｔａｇｅｌベースＲｉｎｋアミド樹脂上に低負荷（約０．１〜０．２ｍｍｏｌ／ｇ）で製造することができる。次に、ヒドラジンによる両官能基の脱保護に続いて、樹脂上での環化によって所望の生成物を得る。
スキーム３ｂ：アリルベース保護基を用いたＬｙｓとＡｓｐの擬似垂直脱保護とその後の樹脂上環化と樹脂からの切断によるジスルフィド結合のラクタム代用物
スキーム３ｂに示したアリル・アプローチでは、環化を受けることになる側鎖カルボキシルを、アリルエステルとして保護して、側鎖アミノ基をａｌｌｏｃ基として保護する。樹脂上で、両方は、ＤＭＦ中、Ｎ−メチルモルホリンと酢酸の存在下でのパラジウム・トリス−トリフェニルホスフィンによる処理によって選択的に暴露される。ＤＭＦ中ＤＩＥＡの存在下でのジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムを用いて、残留パラジウム塩を除去し、続いて、ＤＭＦによって洗浄する。次に、Ｎ−メチルモルホリンの存在下でＨＡＴＵ／ＨＯＡｔを用いて、ラクタム環を形成する。上述したように、他のカップリング剤を用いることができる。次に、該ペプチドのプロセシングを上述したように実施して、所望のペプチドラクタムを得る。
続いて、樹脂からの切断と精製も行なうことができる。該ペプチドのＮ−末端官能基化のために、例えば、トランス−４−（ｉＶＤｄｅ）メチルアミノシクロヘキサンカルボン酸、トランス−４−（ｉＶＤｄｅ）メチルアミノ安息香酸、又はそれらのａｌｌｏｃコンジナー(congeners)のようなアミノ酸が使用可能であることは理解される。さらに他のアプローチは、樹脂からの切断中に分子内ラクタム形成のためにセーフティ・キャッチ方法を用いることである。
１２．オレフィンメタセシスに基づく環状ペプチド
Ｇｒｕｂｂｓ反応（以下のスキーム４）は、オレフィン結合のメタセシス／環化を含む、以下に示すように説明される。例えば、Schuster et al., Angewandte. Chem. Int. Edn Engl., 36:2036-2056 (1997); Miller et al., J. Am.Chem. Soc 118:9606-9614 (1996)を参照のこと。
スキーム４：Ｇｒｕｂｂｓオレフィン・メタセシス環化
出発物質がジオレフィン（１６）である場合に、得られる生成物が環状化合物１７であるであろうことは、容易に分かる。この反応は、実際に、オレフィン官能基化ペプチドからの環の作製に適用されている。例えば、Pernerstorfer et al., Chem. Commun., 20:1949-50 (1997); Covalent capture and stabilization of cylindrical b-sheet peptide assemblies, Clark et al., Chem.Eur. J., 5(2):782-792 (1999); Highly efficient synthesis of covalently cross-linked peptide helices by ring-closing metathesis, Blackwell et al., Angew. Chem., Int. Ed., 37(23):3281-3284 (1998); Synthesis of novel cyclic protease inhibitors using Grubbs olefin metathesis, Ripka et al., Med. Chem. Lett., 8(4):357-360 (1998); Application of Ring-Closing Metathesis to the Synthesis of Rigidified Amino Acids and Peptides, Miller et al., J. Am.Chem. Soc.,118(40):9606-9614 (1996); Supramolecular Design by Covalent Capture, Design of a Peptide Cylinder via Hydrogen-Bond- Promoted Intermolecular Olefin Metathesis, Clark et al., J. Am.Chem. Soc., 117(49):12364-12365 (1995); Synthesis of Conformationally Restricted Amino Acids and Peptides Employing Olefin Metathesis, Miller et al., J. Am. Chem. Soc., 117(21):5855-5856 (1995)を参照のこと。ジスルフィド結合含有ペプチドの代用物としてカルバ−架橋(carba-bridged)環状ペプチドを製造するために、Ｃ−アリル化アミノ酸或いはＮ−アリル化アミノ酸のいずれかを製造して、この反応に用いることができる。
オレフィン基を有する新規な化合物を製造することもできる。オレフィン含有テザーによるチロシンヒドロキシルの官能基化は、１つのオプションである。リシンε−アミノ基は、例えば、アシル化部分の一部としてのオレフィン含有単位の付加による、他のアプローチである。その代わりに、リシン側鎖アミノ基をオレフィン含有テザーによってアルキル化すると、これはさらに、レポーターの取り付け点としても機能することができる。リシン、オルニチン又はジアミノプロピオン側鎖アミノ基のアシル化剤としての５−ペンテン酸の使用は他の可能性である。構造活性関係を調べるために、オレフィン含有テザーの長さを変化させることもできる。
１３．ペプチド配列の操作
本発明の範囲内の、他の修飾は、同様な又は改良された生物学的性質を有するペプチドを生成すると期待することができる、ペプチド配列の操作を含む。これらの操作は、例えば、アミノ酸転座（配列中のアミノ酸のスワッピング）、オリジナル配列又は修飾オリジナル配列の代わりにレトロインバーソ型ペプチドの使用、ペプトイド、レトロインバーソ型ペプトイド配列、及び合成ペプチドを包含する。特定の残基がペプチドではなくペプトイドである構造であって、完全にはペプチドでなく、完全にはペプトイドでないハイブリッド分子を生じる構造も、考えられる。
１４．リンカー
さらに、本発明の範囲内の修飾は、結合部分若しくは結合ポリペプチドと、検出可能な標識若しくは治療剤との間にリンカー又はスペーサーを導入することを包含する。例えば、このようなリンカー／スペーサーの使用は、結合ペプチドの関連した性質を改良する（例えば、血清安定性を高める、等）ことができる。リンカーは、非限定的に、置換若しくは非置換アルキル鎖、ポリエチレングリコール誘導体、アミノ酸スペーサー、糖、又は当該技術分野で一般的な、脂肪族若しくは芳香族スペーサーを包含することができる。
例えば、適当なリンカーは、ホモ二官能性及びヘテロ二官能性架橋分子を包含する。ホモ二官能性分子は、同一である、少なくとも２つの反応性官能基を有する。ホモ二官能性分子上の反応性官能基は、例えば、アルデヒド基と活性エステル基を包含する。アルデヒド基を有するホモ二官能性分子は、例えば、グルタルアルデヒドとスバルアルデヒド(subaraldehyde)を包含する。
少なくとも２つの活性エステル単位を有するホモ二官能性リンカー分子は、ジカルボン酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステルを包含する。このようなＯ−スクシンイミジルエステルの幾つかの例は、ジスクシンイミジルスベレート及びジチオ−ビス−（スクシンイミジルプロピオネート）と、それらの溶解性ビス−スルホン酸及びビス−スルホン酸塩、例えばそれらのナトリウム塩及びカリウム塩を包含する。
ヘテロ二官能性リンカー分子は、少なくとも２つの異なる反応性基を有する。反応性ジスルフィド結合を含有するヘテロ二官能性試薬の幾つかの例は、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジル−ジチオ）プロピオネート（Carlsson et al., Biochem J.173: 723-737(1978)、ナトリウムＳ−４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチルベンジルチオスルフェート、及び４−スクシンイミジルオキシカルボニル―α−メチル−（２−ピリジルジチオ）トルエンを包含する。Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジル−ジチオ）プロピオネートが好ましい。チオール基と反応する二重結合を有する反応性基を含むヘテロ二官能性試薬の幾つかの例は、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートとスクシンイミジルｍ−マレイミドベンゾエートを包含する。他のヘテロ二官能性分子は、スクシンイミジル３−（マレイミド）プロピオネート、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミド−フェニル）ブチレート、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル−シクロヘキサン）−１−カルボキシレート、マレイミドベンゾイル−５Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルを包含する。
さらに、上記分子及び／又は部分の組み合わせであるリンカーも、ペプチドの性質に特別な利益を与えるために用いることができる。リンカーを有する脂質分子を取り付けて、超音波バブル、リポソーム又は他の凝集に基づく構築体の処方を可能にすることができる。このような構築体は、診断レポーター、治療剤（例えば、療法のための化学的「弾頭」）又はこれらの組み合わせのターゲッティング及びデリバリーのための作用剤として用いることができる。
１５．付加的なペプチド構築体
本発明の１実施態様では、ペプチド１（上記では、構築体Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−ＦにおけるＡと呼ぶ）は、３〜５０（Ｄ若しくはＬ）−α−アミノ酸、好ましくは８〜２４アミノ酸（ジスルフィド結合を含む若しくは含まない）を含むことができ、これは、アミド結合を介してスペーサー１（上記では、構築体Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−ＦにおけるＣと呼ぶ）に、第１分枝基（上記では、構築体Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−ＦにおけるＢと呼ぶ）によって与えられるアミノ基によって、例えば、リシンが第１分枝基Ｂである場合にはεアミノ基によって、又はオルニチンが第１分枝基Ｂである場合にはオルニチンのγアミノ基によって、又はジアミノプロピオン酸がペプチド１のＮ−末端若しくはＣ−末端における分枝基Ｂである場合にはジアミノプロピオン酸のβアミノ基によって接合することができる。
ペプチド１は、本明細書に記載する他のモノマー、例えば１９項における表１に記載するモノマーも含むことができる。１実施態様では、ペプチド１は、ターゲットの第１結合部位に対する特異性を有する。他の実施態様では、ペプチド１は、例えばＫＤＲ又はｃＭｅｔのようなレポーター上の結合部位に対して特異的である。
或いは、分枝基Ｂのαアミノ基を用いて、スペーサー１との結合を形成することができ、分枝基Ｂの側鎖アミノ基は、ペプチド１への分枝基Ｂの取り付け点であることができる。分枝基Ｂは、例として挙げられている上記残基に限定される訳ではない。ペプチド１は、分枝基Ｂを構成するアミノ酸(単数又は複数）に、例えば、セリン、システイン、Ｓ−カルボキシメチルシステイン、Ｓ−２−チオピリジルシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ｐ−アミノフェニルアラニン、プロパルギル又は他のアルキニル置換グリシン誘導体に、及びペプチド１とのペプチド結合の形成後に、側鎖ヒドロキシ、カルボン酸、チオール、ジスルフィド、アルキルカルボン酸、アミノ、アルキルアミノ、アルキニル又は、スペーサー１と結合を形成するために用いることができる他の官能基を有する、他のアミノ酸に取り付けることができる。図３８Ａを参照のこと。
好ましい分枝基は、リシン、オルニチン、アスパラギン酸及びグルタミン酸を包含する。ペプチドのＣ−末端が分枝基の取り付け点である場合には、ペプチド１又はペプチド２構築体の実際のＣ−末端は、第１級カルボキサミド又はカルボキサミド基ＮＨ−Ｔとして存在しうる、分枝基Ｂのアシル基である。Ｔ基は、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、アルキル、アルケニル、アルコキシカルボニル、アルキニル、アリール、アリル、プロパルギル、ヘテロアリール、カルボキシアルキル、カルボキシアミドアルキル、水素、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ポリヒドロキシアルキル、ポリエチレンオキシ［構造（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｇを意味する、式中、Ｇは、アミノアルキル、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルキル、カルボキシル、メチレンカルボキシ、アルキルカルボキサミド−若しくはアルキルカルボキシ（アルキル）アミド−、アルキルホルミル、２−メルカプトエチル又は２−ピリジルジチオアルキルから選択される末端基であり、この場合、アルキル基は２〜２０炭素原子を含有し、ｎ＝０〜１５０である］であることができ、この場合、鎖又は環構造中の炭素原子数は０〜１５０の範囲内である。
Ｔに関して上述した官能基(functionality)は、当該技術分野で知られた反応及び手法によって、Ｒｉｎｋアミド樹脂の窒素に導入することができる。例えば、Ｔがアルキル基、アラルキル基及び／又はヘテロアリールアルキル基を意味する場合には、これらは、ホウ水素化ナトリウム又はシアノホウ水素化ナトリウムの存在下の緩和な脱水条件下でのアルキルアルデヒドとＲｉｎｋアミド樹脂との反応によって導入することができる。同様に、例えば、２官能基の１つがアルデヒドである二官能性分子のような、より複雑な誘導体とＲｉｎｋアミド樹脂との、シアノホウ水素化ナトリウムの存在下でのｐＨ５における反応は、第２官能基を有するアルキル基が存在する一置換アルキルＲｉｎｋアミド樹脂を生成するであろう。唯一つの必要条件は、他方の官能基がシアノホウ水素化ナトリウムと適合することである。
アリール基の導入は、ソルボリシス手段によって系に窒素を導入するために芳香族アミンを用いて、又は活性化芳香族化合物上での求核芳香族置換の充分に確立された手法によって、オリジナルＲｉｎｋアミド樹脂部分を製造することによって行なうことができる。環アミド樹脂の窒素にアリール基を導入するための他の方法は、アミノ基のカップリングを促進する金属触媒の存在下でのハロ芳香族化合物の反応によるものである。アルキル又は官能基化アルキル基も、Ｒｉｎｋアミド樹脂アミノ基のアルキル化によって導入することができる。ヒドロキシエチル基は、適当にＯ−保護した２−ハロエチル基によるＲｉｎｋアミド樹脂アミノ基のアルキル化を用いて、又は例えばジエチルカーボネートによるアルキル化によって導入することができる。当業者は、レポーター−ｓｐ基をＴ基の一部としてＲｉｎｋアミド樹脂に導入することができること、及びさらに、これらを充分に耐久性であるならば、必要な場合には全合成を通して最後まで運ぶことができることも認識するであろう。他の実施態様では、ペプチド１−分枝基Ｂ−スペーサー１分子とペプチド２−分枝基Ｂ’−スペーサー２分子を、セーフティ・キャッチ樹脂上にアセンブルすることができる、この樹脂を、活性化した時点で、上述したようにＴ基(単数又は複数）含有二官能性アミンで処理して、溶液中で、該分枝基のＣ−末端アミドがＮＨ−Ｔ基によってアミド化されている構築体を得ることができる。
合成において進んだ生成物を生成するためにさらに反応する予定である、分枝基Ｂ若しくは分枝基Ｂ’のアミノ酸の保護された若しくは脱離基官能基化誘導体又はレポーター−ｓｐ基官能基化誘導体を表示する場合に、最終構築体に最終的に含有される分枝基が脱離基若しくは保護基をもはや存在させない該アミノ酸又は他の前述部分を含むことを、当業者は理解するであろう。当該技術分野で具体的には、このような保護基又は脱離基が合成の特異性を方向付けるために一時的に用いられること、及び分枝基としてのこのような官能基化アミノ酸の記述が、それらを用いる合成路若しくは方法を理解し易くするために与えられていることが分かる。例えば、分枝基がＬｙｓ［ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）］として記述される場合には、最終的構築体が、保護基が欠損した−Ｌｙｓ（Ｌｙｓ）−官能基を含有すること、及び保護基の代わりに、以前に保護された原子と、他の部分、例えばペプチド１、ペプチド２又はスペーサー１若しくはスペーサー２又は付加されたレポーター−ｓｐ基との間に結合が存在することになることが理解される。
分枝基Ｂがスペーサー１との結合形成のためにアミノ基以外の何らかの基を有する場合には、当業者は、スペーサー１がＢとの結合形成に適した官能基によって構築されることを理解するであろう。例えば、分枝基Ｂが遊離のチオール官能基を有する場合には、スペーサー１は２−アミノエチル−２−ピリジルジスルフィドであるか又は、最終的にスペーサーとして２−アミノエチルチオ部分を生じる、該化合物のアミン保護バージョンであることができる。ジスルフィド結合の形成後に、スペーサー１のアミノ基は、以下で説明するように、リンカー官能基Ｄとの反応に用いられる。或いは、ペプチド１は、ペプチド１のＮ−末端におけるアミノ酸のαアミンを介してスペーサー１に、又は分枝基に属するとして上記に開示した遠位若しくは側鎖官能基のいずれかを有する、ペプチド１のＮ末端における部分に接合することができる。このような方法は図３９に示される。
スペーサー１（上記で、構築体Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−ＦにおけるＣと呼ぶ）は存在しないことも、又は例えば自然発生若しくは非自然αアミノ酸及び自然発生若しくは非自然非αアミノ酸を含めた、１つ以上のアミノ酸を含むこともできる。スペーサーの多様なセットを用いて、ペプチド１とリンカー（上記で、構築体Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−ＦにおけるＤと呼ぶ）との間の距離を修飾することができるが、ダイマー構築体の親水性又は疎水性を変える手段を与えることもできる。本発明に使用可能であるスペーサー１の例は、限定する訳ではなく、下記アミノ酸又はアミノ酸若しくは他の二官能性分子の連結シリーズを包含する：
・Ｇｌｙ
・Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
・Ｓｅｒ（Ｓ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｓ）
式中、Ｓ基は、例えば、Ｎ−アセチルガラクトースアミン、Ｄ−（＋）−アロース、Ｄ−（＋）−アルトロース、Ｄ−（＋）−グルコース、Ｄ−（＋）−マンノース、Ｄ−（−）−グロース、Ｄ−（−）−イドース、Ｄ−（＋）−ガラクトース、Ｄ−（−）−タロース、Ｄ−（−）−リボース、Ｄ−（−）−アラビノース、Ｄ−（＋）−キシロース又はＤ−（−）−リキソースから選択されうる糖部分のような親水性官能基を含み、セリン側鎖酸素と該糖との結合はアノマー炭素を介する；
・８−アミノ−３，５−ジオキサオクタン酸
・８−（８−アミノ−３，５−ジオキサオクタノイル)アミノ−３，５−ジオキサオクタン酸若しくは９，１７−ジアミノ−１０−オキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸
・４−アミノ安息香酸
・４−アミノメチル安息香酸
・４’−アミノ−４−ビフェニルカルボン酸
・４’−アミノメチル−４−ビフェニルカルボン酸
・４−メルカプト酪酸
・２−メルカプト酢酸
・システイン
・４−（２−ピリジルジチオ）酪酸
・２−ピリジルジチオ酢酸
・システイン−２−チオピリジルジスルフィド
・２−アミノエチル−２−ピリジルジスルフィド。
最も好ましくは、スペーサー１は８−アミノ−３，５−ジオキサオクタン酸である。
スペーサー１とスペーサー２との間のリンカーＤ（上記で、構築体Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−ＦにおけるＤと呼ぶ）は、１実施態様では、スペーサー１とスペーサー２とをアミド結合によって接合させるジカルボン酸の誘導体である。活性化リンカーを形成するために用いられるジカルボン酸は、式：ＨＯＯＣ−Ｚ−ＣＯＯＨで示され、式中、Ｚは式：（ＣＨ２）ｎで示され、例えばＣＯ２Ｈ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２Ｈ（ｎ＝０〜１０）のような化合物；好ましくはグルタル酸（ｎ＝３）を生成することができる。好ましくは、リンカーＤとして用いられるジカルボン酸の誘導体は、グルタル酸ビスＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル又はその誘導体である。Ｚ基は、Ｎ若しくはＯ−置換アルキル鎖を含有して、例えば以下に示すような構造を生じることもできる：
リンカーＤを形成するために用いられるジカルボン酸は、式：ＨＯＯＣ−Ｚ−ＣＯＯＨで示され、式中、Ｚは、２カルボキシル基を有する足場である芳香核又は複素環核を表す。このような分子の例は、限定する訳ではなく、ベンゼン−１，４−ジカルボン酸、ビフェニル−１，４’−ジカルボン酸、（４−カルボキシメトキシ−フェノキシ)-酢酸、（４’−カルボキシメトキシ−ビフェニル−４−イルオキシ）−酢酸、Ｎ−メチルピロール−２，５−ジカルボン酸、ピリジン−２，６−ジカルボン酸、Ｎ−メチルピロール−２，３−ジカルボン酸、Ｎ−メチルピロール−２，４−ジカルボン酸、ピリジン２，３-ジカルボン酸、ピリジン３，５-ジカルボン酸、ピリジン３，４-ジカルボン酸、又はピペリジン３，５-ジカルボン酸を包含する。リンカー中のＲ基は、例えば、アセチル、アシルアミノ、アシルアミノアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、アルキル、アルケニル、アルコキシカルボニル、アルキニル、アリール、アリル、プロパルギル、ヘテロアリール、カルボキシアルキル、カルボキサミド、カルボキシアミドアルキル、ホルミル、水素、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ポリヒドロキシアルキル、ポリエチレンオキシ［構造（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｇを意味する、式中、Ｇは、アルキルアミノ、アルキル、アルキルヒドロキシ、アルキル、カルボキシ、メチレンカルボキシ、アルキルカルボキサミド−若しくはアルキルカルボキシ（アルキル）アミド−、アルキルホルミル、２−メルカプトエチル又は２−ピリジルジチオアルキルから選択される末端基であり、この場合にアルキル基は２〜２０炭素原子を含有し、ｎ＝０〜１５０である］であることができ、この場合、鎖又は環構造中の炭素原子数は０〜１５０の範囲内である。Ｚが今や、芳香族若しくは複素環式Ｚの飽和誘導体である、上記芳香族化合物の飽和誘導体は、同じ基ＲとＧと共にリンカーＤとして用いることもできる。Ｚが、リンカーＤを含むことができる、芳香族又は脂肪族のいずれかであるジカルボン酸の例は、図４０に示す。
リンカーＤの形成に用いられるジカルボン酸は、一般に、式：Ｘ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｚ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｙ［式中、Ｚは上記と同じであり、ＸとＹは脱離基である］で示される活性化アシル化種の形成によって、スペーサー１又はスペーサー２の遊離アミンにカップリングするように、活性化することができる。例えば、図４１に示す基から選択される、同じ又は異なるものでありうる、Ｘ又はＹとして図４１に示した基のシリーズを有する、このような活性化アシル化誘導体は、酸塩化物、酸フッ化物、酸臭化物、活性エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステル、７−アザ−１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾリルエステル、５若しくは６−クロロ−１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリルエステル、置換１−ヒドロキシ−１，２，３−トリアゾリルエステル、２，３，４，５，６−ペンタクロロフェニルエステル、２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニルエステル、２若しくは４−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、置換Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、置換イミダゾールのＮ−アシル誘導体、置換テトラゾールの１−アシル誘導体、１−アシル置換トリアゾール、ピリジン２−チオールのＳ−アシル誘導体、アシルシアニド、アシルアジド、混合アルキル炭酸無水物、トリフルオロ酢酸の混合無水物又は２，４，６−トリクロロ安息香酸の混合無水物であることができる。
リンカーＤは、好ましくは、ジカルボン酸であるとはいえ、スペーサー１（上記でＣと呼ばれる）が分枝基Ｂへの付加後に、例えば２−ピリジルジスルフィド官能基のような側鎖官能基を含有する場合に、混合ジスルフィドとの反応時に、スペーサー２のアミノ基へのペプチド結合を形成して、所望のダイマーを形成するために用いることができる側鎖官能基（例えば、カルボン酸の官能基）を与えることができるような、二官能性分子でありうることを、当業者は知るであろう。したがって、リンカーは、例えば、分枝基からの２−チオピリジンの排除に用いることができる４−メルカプトブタン酸であることもできる。この場合に、リンカーＤの側鎖官能基は、ペプチド２-分枝基Ｂ’−スペーサー２−ＮＨ２（式中、ＮＨ２はアミノ基であり、カルボキサミドのアミド窒素ではない）のアミノ基にカップリングして、アセンブルしたダイマーを形成するように活性化されることができるカルボキシル基であると考えられる。
１８項でさらに詳述する、他の好ましい実施態様では、リンカーＤはジアミン・リンカー又はその誘導体である。
スペーサー２（上記で、構築体Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−ＦにおけるＥと呼ぶ）は存在しないことも、又は例えば自然発生若しくは非自然αアミノ酸及び自然発生若しくは非自然非αアミノ酸を含めた１つ以上のアミノ酸、又は２つの別々の化学エンティティに付加可能である他の二官能性分子を含むこともできる。スペーサーの多様なセットを用いて、ペプチド２とリンカーＤとの間の距離を修飾することができるが、ダイマー構築体の親水性又は疎水性を変える手段を与えることもできる。本発明に使用可能であるスペーサー２の例は、限定する訳ではなく、下記アミノ酸又はアミノ酸若しくは他の二官能性分子の連結シリーズを包含する：
・Ｇｌｙ
・Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
・Ｓｅｒ（Ｓ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｓ）
式中、Ｓ基は、例えば、Ｎ−アセチルガラクトースアミン、Ｄ−（＋）−アロース、Ｄ−（＋）−アルトロース、Ｄ−（＋）−グルコース、Ｄ−（＋）−マンノース、Ｄ−（−）−グロース、Ｄ−（−）−イドース、Ｄ−（＋）−ガラクトース、Ｄ−（−）−タロース、Ｄ−（−）−リボース、Ｄ−（−）−アラビノース、Ｄ−（＋）−キシロース又はＤ−（−）−リキソースから選択されうる糖部分のような親水性官能基を含み、セリン側鎖酸素と該糖との結合はアノマー炭素を介する；
・８−アミノ−３，５−ジオキサオクタン酸
・８−（８−アミノ−３，５−ジオキサオクタノイル)アミノ−３，５−ジオキサオクタン酸若しくは９，１７−ジアミノ−１０−オキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸
・４−アミノ安息香酸
・４−アミノメチル安息香酸
・４’−アミノ−４−ビフェニルカルボン酸
・４’−アミノメチル−４−ビフェニルカルボン酸
・４−メルカプト酪酸
・２−メルカプト酢酸
・Ｎ−アセチル−システイン
・４−（２−ジチオピリジル）酪酸
・２−ピリジルジチオ酢酸
・Ｎ−アセチル−システイン−２−チオピリジルジスルフィド
・２−アミノエチル−２−ピリジルジスルフィド。
最も好ましくは、スペーサー２は８−アミノ−３，５−ジオキサオクタン酸である。
１実施態様では、ペプチド２（上記では、構築体Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−ＦにおけるＦと呼ぶ）は、３〜５０（Ｄ若しくはＬ）−α−アミノ酸、好ましくは８〜２４アミノ酸（ジスルフィド結合を含む若しくは含まない）を含むことができ、これは、アミド結合を介してスペーサー２（上記では、構築体Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−ＦにおけるＥと呼ぶ）に、リシンのεアミノ基によって、又はオルニチンのγアミノ基によって、又はペプチド２のＮ−末端若しくはＣ−末端における２，３−ジアミノプロピオン酸のβアミノ基によって与えられる、ペプチド２のアミノ基によって接合することができる。或いは、ペプチド２は、ペプチド２のＮ−末端におけるアミノ酸のαアミンを介してスペーサー２に、又は分枝基Ｂ若しくは分枝基Ｂ’に属するとして上述した側鎖若しくは遠位官能基のいずれかを有する、ペプチド２のＮ−末端における部分に接合することができる。
ペプチド２は、本明細書に記載する他のモノマー、例えば１９項における表１に記載するモノマーも含むことができる。１実施態様では、ペプチド２は、ターゲットの第１結合部位に対する特異性を有する。他の実施態様では、ペプチド２は、３〜５０アミノ酸のペプチドであり、例えばＫＤＲ又はｃＭｅｔのような受容体上の結合部位に対して特異的である。
或いは、分枝基Ｂ’のαアミノ基を用いて、スペーサー２との結合を形成することができ、上記分枝基の各々の側鎖アミノ基は、ペプチド２への分枝基Ｂ’の取り付け点であることができる。該分枝基は、例としてのみ挙げられている上記残基に限定される訳ではない。
ペプチド２は、分枝基Ｂ’のアミノ酸に、例えば、セリン、システイン、Ｓ−カルボキシメチルシステイン、Ｓ−２−チオピリジルシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソニペコチン酸、ｐ−アミノフェニルアラニン、プロパルギル又は他のアルキニル置換グリシン誘導体に、及びペプチド２とのペプチド結合の形成後に、側鎖ヒドロキシ、カルボン酸、チオール、ジスルフィド、アルキルカルボン酸、アミノ、アルキルアミノ、アルキニル又は、スペーサー２と結合を形成するために用いることができる他の官能基を有する、他のアミノ酸に取り付けることができる。分枝基Ｂ’がスペーサー２との結合形成のためにアミノ基以外の基を有する場合には、スペーサー２が分枝基Ｂ’との結合形成に適した官能基によって構成されるであろうことを、当業者は理解するであろう。例えば、分枝基Ｂ’が遊離のチオール官能基を有する場合には、スペーサー２は２−アミノエチル−２−ピリジルジスルフィド又は該化合物のアミノ保護バージョンであるように選択することができる。ジスルフィド結合の形成後に、該アミノ基は、以下に説明するように、リンカーＤとの反応に用いられると考えられる。
当業者は、スペーサー２にペプチド２を連結する分枝基Ｂ’がアミノ酸である必要はなく、ＮＨ２−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（式中、ｎ＝０〜２０）型又はＮＨ２−ＣＨ２（ＣＨ２）ｊＯ−(ＣＨ２（ＣＨ２）ｍＯ）ｎ−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ２（式中、ｊ＝１〜２０、ｍ＝１〜２、ｎ＝１〜１００及びｐ＝１〜２０）型のジアミノ化合物であることもできる。或いは、ペプチド２を、ペプチド２のＮ−末端におけるアミノ酸のαアミンを介してスペーサー２に、又は分枝基Ｂ’に属するとして上述した側鎖官能基のいずれかを有するペプチド２のＮ−末端の部分に接合することができる。
必要な場合には、ｉｖＤｄｅ又はａｌｏｃとして保護される内部リシン（又は、例えばオルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸又はイソニペコチン酸のような、側鎖アミノ基を有する他のアミノ酸）による、ペプチド１−分枝基Ｂとペプチド２−分枝基Ｂ’の固相ペプチド合成によって、一般的合成を開始することができる。ペプチド１構築体の製造は、図４４に示す。
分枝基Ｂ’は、存在しないことも、又は分枝基Ｂに関して上述したような、例えば、セリン、システイン、Ｓ−カルボキシメチルシステイン、Ｓ−２−チオピリジルシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ｐ−アミノフェニルアラニン、プロパルギル又は他のアルキニル置換グリシン誘導体のような、他のアミノ酸を含むこともできる；しかし、このアプローチの説明は、分枝基Ｂ’としてのリシン残基の使用に関連して考察されるであろう。各ペプチドの対応するスペーサー、即ち、スペーサー１とスペーサー２は、別のフラスコにおける、例えば、ＤＭＳＯ、ＮＭＰ、ＤＭＦ、ＤＭＡ又はジクロロメタンのような、適当な溶媒中で、例えばＲｉｎｋアミド樹脂のような固体担体上のペプチド１及びペプチド２の分枝基Ｂ及びＢ’に、アミド結合形成カップリング反応を用いて付加させることができる（αアミ基はＦｍｏｃとして保護され、カップリング後に除去される）。
各ペプチドを固体担体から切断した後に、任意に、水との共溶媒としてジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＤＭＡ、テトラヒドロフラン、ジオキサン、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、エチレングリコール、イソプロパノール、イソブタノール、ｎ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、１，２−ジメトキシエタン、２−エトキシエタノール、２−エトキシエトキシ−エタノール、ジグリム、トリグリム若しくはテトラグリムを単独で又は組み合わせて用いる水溶液中で空気酸化によって又は、ジスルフィド形成のために当該技術分野で知られた他の酸化手法（例えば、ＨｇＣｌ２、Ｔｌ（ＯＯＣＣＦ３）３、Ｍｅ３ＳｉＣｌ／ＤＭＳＯ、ヨウ素）を用いて、任意のスルフィド結合を形成する。場合によっては、非水性溶媒自体を用いる、又は少量（＜１５％）の水を用いることが必要である。ジスルフィド結合形成反応は、アシドリシス切断及び、ＴＦＡベース溶媒混合物を用いる脱保護と同時に行なうこともできる(Alberico, F.; Annis, L.; Royo, M. and Barany, G., “Preparation and handling of peptides containing methionine and cysteine,” Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis - A Practical Approach (Chan, W.C. and White, P.D. Eds.) Oxford University Press, New York, NY Chap. 4, pp. 87-114 (2000)参照; さらに Andreu, D.; Alberico, F.; Sole, N.A.; Munson, M.C.; Ferrer, M. and Barany, G., “Formation of Disulfide Bonds in Synthetic Peptides and Proteins,” Peptide Synthesis Protocols (Pennington, M.W. and Dunn, B.M. Eds.) Humana Press, Totowa NJ Chap. 7, pp 91 - 169 (1994)参照)。得られた環状ジスルフィド・ペプチドを次に、ＨＰＬＣ又は他の適当な方法（以下参照）によって精製する。ジスルフィド結合の形成前に、スペーサー１又はスペーサー２が加えられていないならば、これらを例えばＤＭＳＯ、ＮＭＰ、ＤＭＦ、ＤＭＡ若しくはジクロロメタンのような、適当な溶媒中での溶液カップリングによって加えることができ、保護された（必要な場合に）スペーサーについては、保護基（例えば、ｆｍｏｃ）を除去する。
ダイマー（図４５参照）は、ペプチド１−分枝基Ｂ−スペーサー１を、例えばＤＭＳＯ、ＮＭＰ、ＤＭＦ、ＤＭＡ若しくはジクロロメタンのような、適当な溶媒中で過剰な（５〜１００倍）ビス−活性化リンカーＤ（上記で、Ｘ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｚ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｙとして表示）と反応させて、構築体ペプチド１−分枝基Ｂ−スペーサー１−リンカーＤ-脱離基を形成することによって、製造することができる。この溶液を濃縮して、残渣を例えば酢酸エチル又はエーテルのような適当な溶媒で処理して、該ペプチド構築体を沈殿させるか、又はこれを別の相、例えば油相中に大部分隔離して、該溶媒中に溶解性である過剰な活性化リンカーをデカントによって除去する。残留する残渣は、ペプチド構築体と過剰な活性化リンカーＤの分離に用いた溶媒によって洗浄して、残留する痕跡量の後者物質を除去し、次に残渣を例えばＤＭＳＯ、ＮＭＰ、ＤＭＦ、ＤＭＡ若しくはジクロロメタンのような、適当な溶媒中に溶解する。次に、ペプチド２−分枝基Ｂ’−スペーサー２を加えて、アセンブルされたダイマー ペプチド１−分枝基Ｂ−スペーサー１−リンカー−スペーサー２−分枝基Ｂ’−ペプチド２を得る。
本明細書に記載する方法は、例えば、実施例９に記載するようなダイマーの製造に用いることができる。
１６．レポーター−ｓｐ基
場合によっては、同じ又は異なるものであることができる、１つ以上のレポーター−ｓｐ分子を、図３７Ａ〜３７Ｅに示すように、分枝基に取り付けることができる。この考察では、「レポーター−ｓｐ分子」なる名称は、（１）実際にレポーター−ｓｐ機能を果たす分子；及び（２）レポーター系として役立つ他に又は以外に、特別な目的若しくは機能を有する系に付加される分子の両方を包含すると理解される。図３７Ｂ、３７Ｃ、３７Ｄ及び３７Ｅは、上述した及び下記考察に含まれる系のグラフ表示である。
さらに詳しくは、レポーター−ｓｐ分子は、レポーターとして若しくは特別な目的の分子として役立つ、又は両方の機能を果たす分子である。「レポーター」なる用語は、吸収若しくは放出測定によるシグナルを、又はレポーター系によって直接発生される若しくはレポーター系の存在によって影響されるのいずれにしても、電磁気周波数スペクトルの一部におけるシグナルの吸収レベルの変化を測定する検出手法によるそれらの検出を可能にする特性(attributes)を有する分子を意味する。このような分子は、反射されたシグナル若しくは異なる強度のインプットシグナルを与えることができる（減衰又は強化又は時間分解方法）、又は異なる周波数のシグナル、刺激シグナル若しくは放出シグナルの調和であるシグナル、又はインプットシグナルによって影響されるシグナルを与えることができる。
レポーター分子の例は、非限定的に、反磁性若しくは磁性金属キレート、金属キレーター系、放射性金属キレート形成系、放射性金属を有する金属キレーターを包含する放射性同位元素標識分子、染料分子、蛍光性分子、リン光性分子、ＵＶスペクトル吸収分子、近赤外線若しくは遠赤外線吸収可能な分子；及びＸ線、ガンマー線、ベータ粒子、アルファ粒子、超音波、光学若しくは磁気シグナルを吸収及び／又は放出する分子若しくは超分子構築体を包含する。
特定目的分子としても知られるＳＰ分子は、検出系との相互作用に直接関与することも又は直接関与しないこともできるが、ペプチド構築体の使用を何らかの方法で容易にする機能的な特性を有する分子として定義される。このような分子は、例えば、ペプチド構築体に付加する場合に、装置若しくは器具による照射期間中若しくは後のシグナルの有無、シグナル強度の変化、又はシグナル若しくは誘導シグナルの反射のいずれかによる、シグナルの検出のために使用可能である、より大きなアレイの分子（例えば、超分子構築体）中へのペプチド構築体の組み込みを可能にすることができる。
特定目的分子の１つの注目に値する例は、リン脂質又は脂質部分である。例えば、リン脂質コンジュゲート分子(phospholipid conjugated molecules)をリポソーム中に又はミクロバブル中に組み込むことができる。リポソームは、化学療法剤のカプセル化溶液のデリバリーを容易にするために用いることができ、該リン脂質−ペプチド・コンジュゲートはリポソーム中に組み込むことができ、それによって、該リポソームに特定の生体分子ターゲットを標的とさせ、該治療剤を高濃度でかつ標的領域の近傍に放出させることができる。同様に、例えばターゲッティングペプチドのような特殊化分子を有するリン脂質を、バルクリン脂質と、ガスを封入する、幾つかの他の小さい構成要素とから成るミクロバブル中に組み込むことができる。ペプチドは該ミクロバブルの表面上に提示され、このようなペプチドの充分な数が該ミクロバブルの表面上に提示される場合には、該ミクロバブルは生体分子ターゲットを発現させる細胞表面又は血管内面に結合することができる。該ペプチドによって対応される生体分子ターゲットに充分に結合したならば、次に、ミクロバブルを超音波イメージング手法によって検出して、それによって、疾患状態の診断又は予後を可能にすることができる。
特定目的分子は他の役割を有することもできる。例えば、これらは、治療剤として又は選択的に癌細胞を殺す及び／又は癌細胞の増殖を阻害するために若しくは、必要な場合には正常組織の成長を阻害若しくは促進するために用いられるトキシンとして作用する能力を有することができる。レポーターとしてとＳＰ分子としての二重の役割は、放射性金属キレート又は他の放射性同位体標識分子によって、それらを該ペプチド構築体に付加した場合に実現することができる；これは、治療的役割を果たす放射性同位体によって放出される放射線がイメージング系によっても検出されうるという事実によるものである。
１７．レポーター−ｓｐ基の取り付け
レポーター−ｓｐ官能基化ダイマーの作製が望ましい場合には、ペプチド１から生じる分枝基Ｂは、１対のアミノ酸を含むことができ、この各々は、例えばＬｙｓ（Ｌｙｓ）のような側鎖を有するアミノ基を有し、この場合、Ｃ末端（第１）リシンのεアミノ基は、第２リシンのカルボニル基によってアミド化され、第２リシンはそのα窒素とε窒素上に異なる保護基を有するか、又はこれらの窒素原子の少なくとも一方が保護されるが、他方は保護されず、反応に有効である。
１実施態様では、第２リシン上に存在するａｌｏｃ若しくはｉｖＤｄｅ基を除いて、全ての保護基がアセンブルされたダイマーから除去されていると、想定することができる。ｉｖＤｄｅ基はアセンブルされたダイマーの分枝基Ｂから、ＤＭＦ中１０％ヒドラジンによる処理によって除去される。これに続いて、標準の合成後処理を行なう、この処理は、順相、逆相、親水性相互作用、イオン交換又は他の適当な形式のＨＰＬＣ（単独若しくは組み合わせ）、ＳＰＥ（固相抽出）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、ゲル濾過、中圧若しくは低圧逆相若しくは順相クロマトグラフィー、又は分取薄層クロマトグラフィー手法によるダイマーの精製を包含しうる。次に、レポーター−ｓｐ分子を、該ダイマーに、ペプチド１の分枝基Ｂの、残留リシン遊離εアミノ基の反応によってコンジュゲートする。これは、例えばＤＩＣ／ＨＯＢｔ、ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ、ＢＯＰ／ＤＩＥＡ、ＰｙＢＯＰ／ＤＩＥＡ若しくは当業者に知られた、他のカップリング剤のような試薬を用いた、レポーター−ｓｐ分子のカルボン酸官能基の活性化によって、又は例えばＤＭＳＯ、ＮＭＰ、ＤＭＦ、ＤＭＡ若しくはジクロロメタンのような、適当な溶媒中の予備形成された活性アシル化種の使用と、活性アシル化レポーター−ｓｐ分子によるダイマーの処理によってレポーター−ｓｐ官能基化ダイマーを得ることによって、達成される（図４６参照）。最終生成物をＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、逆相ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー又は他のクロマトグラフィー手法（最後から２番目のダイマーに関して上述したような）によって単独で又は必要に応じて組み合わせて精製する。
他の実施態様では、該アミノ酸対はＬｙｓ−Ｌｙｓであることができる、この場合に、Ｃ末端リシンのεアミノ基は例えばａｌｏｃ若しくはｉｖＤｄｅ基で保護され、該分枝基の先行リシンの側鎖アミノ基は上記ダイマー形成反応に用いられたものである。
レポーター−ｓｐ官能基の取り付けは、次のように行なうこともできる：ペプチド１の分枝基ＢのＣ末端リシンに遊離アミノ基を有するダイマーを、大きく過剰な、ビス活性化リンカーＤ分子と、好ましくはグルタル酸ビスＮＨＳエステルと、例えば、ＤＭＳＯ、ＮＭＰ、ＤＭＦ、ＤＭＡ又はジクロロメタンのような適当な溶媒中で反応させることができる。この工程に続いて、場合によっては、反応溶媒を蒸発させ、次に、適当な溶媒（過剰なビス活性化リンカー化合物を溶解し、該ダイマーを沈殿させる若しくは該ダイマーを不溶性相中に隔離する溶媒、好ましくは、例えば酢酸エチル若しくはエーテルのような溶媒）を加えて、該ダイマーを沈殿させる。グルタル酸半アミドのモノＮＨＳエステルを有する、得られる活性化ダイマーを、上清溶液のデカントによって単離する、この操作は過剰なグルタル酸ビス−ＮＨＳエステルを除去するために役立つ。残留ビス−活性化リンカー反応物の溶解及び除去を完成するために、続けての洗浄が必要になりうる。残渣を今や、例えばＤＭＳＯ、ＮＭＰ、ＤＭＦ、ＤＭＡ又はジクロロメタンのような適当な溶媒中に溶解することができ、アミノ基を有するレポーター−ｓｐ分子を該溶液に加えることができる。該アミノ基と、ダイマーに付加したグルタリル半アミド・モノ−ＮＨＳエステルの活性化カルボキシル基との反応が、レポーター−ｓｐ−官能基化ダイマーを生成する（図４７参照）。
さらに他の実施態様では、ダイマーのアセンブリ前に、ペプチド１−分枝基Ｂに、レポーター−ｓｐ分子を取り付けることができる。得られた化合物をさらに複雑化して、レポーター−ｓｐ官能基化ペプチド１−分枝基Ｂ−スペーサー１−ＮＨ２を合成し、最後に、ペプチド２−分枝基Ｂ’−スペーサー２−リンカーＤを含有する適当な種と反応させて、所望のレポーター−ｓｐ−官能基化ダイマー構築体を得ることができる。このアプローチでのフレキシビリティの付加的測定は、該ダイマー上のレポーター−ｓｐの位置が完全に制御可能であるということである。該アプローチの両方の態様を以下に説明し、図４８に示す。
例えば、分枝基ＢがＣ−末端におけるＬｙｓ［ｆｍｏｃ−１−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）］である、ペプチド１-分枝基Ｂは、例えば、Ｒｉｎｋ−アミド樹脂上での固相合成によって製造することができる。ｆｍｏｃ基を除去し、続けて、活性化アシル化レポーター−ｓｐ（上述したように形成）と反応させて、樹脂に結合した、レポーター−ｓｐ官能基化ペプチド１−（Ｎα−レポーター−ｓｐ−分枝基Ｂ）−Ｒｉｎｋアミド樹脂を得る、この場合に、該レポーター−ｓｐは、ｉｖＤｄｅ基を有するリシン残基のＮαに付加する。この時点で、ペプチド１−（Ｎα−レポーター−ｓｐ−分枝基Ｂ）−Ｒｉｎｋアミド樹脂をＤＭＦ若しくはＤＭＡ又は他の適当な溶媒中のヒドラジンで処理して、Ｃ−末端リシンεアミノ基を遊離させることができる。活性化スペーサー１、例えば、ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸ＮＨＳエステル（注：介在するｆｍｏｃ除去工程が必要であることを思い出すこと）又は該酸のＨＢＴＵ若しくはＤＩＣ／ＨＯＢｔによるin situ活性化によって形成されるＨＯＢｔエステルを用いる、２つの脱保護（ｆｍｏｃ除去）カップリング環の処理(execution)と、その後のｆｍｏｃ基の除去と、樹脂からの切断によって、構築体、ペプチド１−［Ｎα−レポーター−ｓｐ−分枝基Ｂ−（Ｎα−スペーサー１−ＮＨ２］が得られ、これはペプチド２−分枝基Ｂ’−スペーサー２−リンカーＤ活性化基と反応して、レポーター−ｓｐ官能基化ダイマーを形成することができる、又は非常に過剰なビス−活性化リンカーＤと反応させ、その後、過剰なビス−活性化リンカーＤを上述したように洗浄除去して、構築体ペプチド１−［Ｎα−レポーター−ｓｐ−分枝基Ｂ−（Ｎε−スペーサー１−リンカーＤ−活性化基）］を得ることができ、これを次に化学量論量若しくはやや過剰なペプチド２−分枝基Ｂ’−スペーサー２−ＮＨ２と反応させて、生成物ペプチド１−［Ｎα−レポーター−ｓｐ−分枝基Ｂ−（Ｎε−スペーサー１−リンカーＤ−スペーサー２-分枝基Ｂ’−ペプチド２）］を得ることができる。これは、図４８、パートＡに示す。
レポーター−ｓｐをペプチド１の最後から２番目のリシンのＮε窒素にテザーされるリシンのＮε位置に付加することが望ましい場合には、分枝基ＢがＬｙｓ［ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）］−Ｒｉｎｋアミド樹脂である構築体ペプチド１−分枝基ＢからＮα−ｆｍｏｃ基を簡単に除去することができ、次に、該遊離アミノ基を例えば、９−アミノ，１７−ｂｏｃ−アミノ−１０−オキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸のようなスペーサー１分子で官能基化することができる。これは、例えばＨＢＴＵのような適当な活性化剤及び例えばＤＩＥＡ若しくはＤＩＣ/ＨＯＢｔのような塩基の存在下でｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸及び８−ｂｏｃ−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（介在するｆｍｏｃ除去工程と共に）のいずれかの逐次カップリングによって、又は９−アミノ，１７−ｂｏｃ−アミノ−１０−オキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸を例えばＤＩＥＡ若しくはＤＩＣ／ＨＯＢｔのような塩基の存在下で、例えばＨＢＴＵのような適当な活性化剤を用いてカップリングさせて、行なうことができ、構築体ペプチド１−分枝基Ｂ−スペーサー１−ＮＨ−ｂｏｃを得ることができる。ＤＭＦ若しくはＤＭＡのような適当な溶媒中でのヒドラジンによるＮε−ｉｖＤｄｅ基の取り出しと、続いての、分枝基の先行リシン残基のＮεにテザーされたリシン残基のＮεアミノ基の反応によって、構築体ペプチド１−（Ｎα−スペーサー１−ＮＨ-ｂｏｃ）-分枝基Ｂ−（Ｎε−レポーター−ｓｐ）が得られる。これの、樹脂からの切断と、その後の上述したようなジスルフィド環化とによって、構築体ペプチド１−（Ｎα−スペーサー１−ＮＨ２）-分枝基Ｂ−（Ｎε−レポーター−ｓｐ）が得られ、式中、ＮＨ２は、活性アシル化種へのカップリングに有効なアミノ基である。この物質を次に、ペプチド２−分枝基Ｂ‘−スペーサー２−リンカーＤ−脱離基と反応させて、完全アセンブルしたレポーター−ｓｐ−官能基化ダイマー構築体ペプチド１−（Ｎα−スペーサー１−リンカーＤ−スペーサー２−分枝基Ｂ’−ペプチド２）-分枝基Ｂ−（Ｎε−レポーター−ｓｐ）を得る。これは図４８、パートＢに示す。
本発明は、２個若しくはそれ以上のレポーター−ｓｐ基が存在するダイマーを包含する。構造分枝基Ｂ（これはペプチド１と結合する）、例えばＬｙｓ（Ｌｙｓ）若しくは、垂直保護され、必要時に遊離されることができる側鎖基を有する、他の適当なジペプチド構築体を構築するために用いられるとして本明細書に記載する、分枝基Ｂ‘のための部分を単に用いることが、分枝基Ｂ’へのレポーター−ｓｐの容易な取り付けを可能にする。別々のフラスコでスペーサー１とスペーサー２とを、それぞれ、分枝基Ｂと分枝基Ｂ‘に付加し、次に、２つのレポーター−ｓｐ−官能基化ペプチド−分枝基−スペーサー構造をリンカーＤと結合させることによってダイマー中に組み込むペプチド構築体の各々についてのさらなるエラボレーション(eraboration)は、ペプチド１とペプチド２がそれぞれレポーター−ｓｐ官能基を有するダイマー・エンティティを生成する。このような構築体は、例えば、二重標識実験、立体配座研究、生体内分布研究及び代謝研究のために貴重でありうる（この方法論によってアクセス可能な一般的構造に関して、図３７Ａ〜３７Ｅを参照のこと）。
分枝基Ｂ若しくはＢ‘を含むリシン若しくは他の上記関連アミノ酸残基の他に、ペプチド１とペプチド２の配列中に２つ以上のリシン、オルニチン若しくは２，３−ジアミノプロピオン酸が存在する場合には、２つ以上(more than one)の垂直保護基の使用が必要になりうることを、当業者は認識するであろう。それ故、分枝基のリシン又は他の上記関連アミノ酸官能基をペプチド中で他から独立的に及び選択的に操作するべきであることを考慮した、合成の必要条件は、分枝基ＢとＢ’中のアミノ酸のアミノ基の選択的操作を容易にするために、ａｌｏｃ−及びｉｖＤｄｅ−保護残基を同じペプチド又はダイマー構築体中に用いることを可能にする。したがって、例えば、ペプチド１又はペプチド２の配列中に１つ以上のリシンが存在する場合には、最終生成物へのそのエラボレーションにおける如何なる段階においても、個々のペプチド、ペプチド１とペプチド２中又はダイマー構築体中の種々なリシン残基の選択的な操作を容易にするために、ペプチド１又はペプチド２の配列内の分枝基Ｂ若しくはＢ’ 中のリシン又はリシン残基のｉｖＤｄｅ若しくはａｌｏｃ基を、合成における適当な連結箇所で(at the appropriate juncture)、ヒドラジン（ｉｖＤｄｅ）によって又はパラジウムベース試薬(palladium-based reagents)を用いる還元方法（ａｌｏｃ）によって除去することができる。最終生成物を、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、逆相ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、又は他のクロマトグラフィー手法によって単独で又は必要に応じて組み合せて、精製することができる。例えばカルボキシル、チオール若しくはヒドロキシル基又は分枝基ＢとＢ’の若しくはリンカーＤ官能基さえもの記載に挙げた他の基のような、側鎖官能基を有する２つ以上のアミノ酸が分子中の他の基の存在下でも特異的に操作される筈であるという、垂直保護方法の有利な使用が予想される。
レポーター−ｓｐ基を含むダイマーと、それらの製造を本明細書の開示を通して、例えば実施例９、図４６、図４７及び図４８に記載する。
１８．リンカーＤとしてジアミンを用いるペプチド構築体の製造方法
本発明の他の実施態様では、Ｄはジアミン・リンカーである。
ジアミン・リンカーＤは、好ましくは、スペーサー１とスペーサー２をアミド結合を介して結合するジアミンである。ジアミン・リンカーＤとして用いられるジアミンは、下記式で示されることができる：
（ａ）ＮＨ２−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２、式中 ｎ＝０〜２０；
（ｂ）ＮＨ２−ＣＨ２（ＣＨ２）ｊＯ−（ＣＨ２（ＣＨ２）ｍＯ）ｎ−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ２、式中、ｊ＝１〜２０、ｍ＝１〜２、ｎ＝１〜１００及びｐ＝１〜２０。
ジアミン・リンカーＤとして用いられるジアミンは、式：ＮＨ２−Ｑ−ＺＺ−Ｑ’−ＮＨ２で示される置換芳香族若しくは複素環式ジアミンであることもできる：式中、
・ ＺＺは、２つのアミノ基を有する骨格である芳香核若しくは複素環核を表す；及び
（２）ＱとＱ’は、
である。ＱとＱ’は、本明細書に記載する部分のセットの同じ又は異なるメンバーであることができる。
このような分子の例は、限定する訳ではなく、４−アミノメチルベンジルアミン、４−アミノメチル−４’−アミノメチルビフェニル、Ｎ−メチルピロール−２，５−ジカルボン酸ビス２−アミノエチルアミド、ピリジン−２，６−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミド、Ｎ−メチルピロール−２，３−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミド、Ｎ−メチルピロール−２，４−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミド、ピリジン−２，３−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミド、ピリジン−３，５−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミド、及びピリジン−３，４−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミドを包含する（図５０）。
図５０の分子に関して示すような、使用可能である付加的芳香核は、限定する訳ではなく、ナフチル、キノリル、イソキノリル、フリル、アントラセニル、フェナントリル、２，２’−ビチエニル、２，３’−ビチエニル、２−フェニルチエニル、３−フェニルチエニル、フルオレニル、２−（２−チエニル）ピリジン、３−（２−チエニル）ピリジン、２，２’−ビピリジル、及び３−（３−チエニル）ピリジンを包含する。
上記芳香族化合物の飽和誘導体［この場合、ＺＺは今や芳香族若しくは複素環ＺＺの飽和誘導体である］も、同じ基によってジアミン・リンカーＤとして用いることができる。ＺＺが、リンカーＤを含むことができる脂肪族である、ジアミンの例は、図５１に示す。リンカーＤジアミン中のＲ基は、限定する訳ではなく、アセチル、アシルアミノ、アシルアミノアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、アルキル、アルケニル、アルコキシカルボニル、アルキニル、アリール、アリル、プロパルギル、ヘテロアリール、カルボキシアルキル、カルボキサミド、カルボキシアミドアルキル、ホルミル、水素、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ポリヒドロキシアルキル、ポリエチレンオキシ［構造（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｇを意味する、式中、Ｇは、アルキルアミノ、アルキル、アルキルヒドロキシ、アルキル、カルボキシ、メチレンカルボキシ、アルキルカルボキサミド−若しくはアルキルカルボキシ（アルキル）アミド−、アルキルホルミル、２−メルカプトエチル又は２−ピリジルジチオアルキルから選択される末端基であり、この場合、アルキル基は２〜２０炭素原子を含有し、ｎ＝０〜１５０である］であることができ、この場合、鎖又は環構造中の炭素原子数は０〜１５０の範囲内である。
さらに他の実施態様では、ジアミン・リンカーＤは、Ｄ若しくはＬ−アミノ酸、又はリシン、オルニチン若しくは２，３−ジアミノプロピオン酸に由来するＤ若しくはＬ−アミノ酸アミドに由来することができる。これらは、上述したように、ジアミン・リンカーＤとして用いることができる。αアミノ基と側鎖アミノ基を用いて、最終ダイマー構築体のスペーサー１とスペーサ−２へのリンカーＤからの結合を形成することができる。アミノ酸アシル基は、図５１に示す脂肪族ＮＨ２−Ｑ−ＺＺ−Ｑ’−ＮＨ２リンカーに関して上述したような、−Ｎ−Ｒ基によってアミド化することができる。アミノ酸に由来するジアミンリンカーのαアミノ基又は側鎖アミノ基の反応の特異性は、該アミノ酸の該アミノ基の１つを、例えば、ｉｖＤｄｅ基、ベンジルオキシカルボニル基、ａｌｏｃ基、４−メチルトリチル基又は２−クロロトリチル基で保護することによって、制御することができる；このことは、上記分枝基の直接反応のための垂直保護方法の使用と同様である。２つのアミノ基の１つが保護されているリシン誘導体のような、アミノ酸誘導体と、ペプチド１−分枝基Ｂ−スペーサー１−脱離基との反応が、構築体ペプチド１−分枝基Ｂ−スペーサー１−リンカーＤ−ＮＨ−ＰＧ［式中、ＰＧは、リシンの第２アミノ官能基のための保護基である］を生成する。当該技術分野で知られた手法（例えば、ｉｖＤｄｅ基−ＤＭＦ中１０％ヒドラジン；ベンジルオキシカルボニル基−触媒転移水素化；ａｌｏｃ基−Ｂｕ３ＳｎＨとのトリス−トリフェニルホスフィン・パラジウム複合体；４−メチルトリチル若しくは２−クロロトリチル基−トリフルオロ酢酸）による保護基の除去と、その後のエーテル若しくは酢酸エチルとの生成物の摩砕と、得られた物質の任意のＨＰＬＣ精製と共にエーテル若しくは酢酸エチルによる洗浄によって、構築体ペプチド１−分枝基Ｂ−スペーサー１−リンカーＤ−ＮＨ２［式中、ＮＨ２基は、リンカーＤとして用いられるリシンのα若しくはεアミノ基のいずれかである］が得られる。
ジアミン・リンカーＤを含有するダイマーは、例えば、実施例９（Ｄ１６）と図４９に記載する。
ジアミン・リンカーＤが用いられる、本発明の多価ペプチドを製造するための好ましい一般的合成方法は、ペプチド１とペプチド２を、それらの結合分枝基ＢとＢ’と共に、別々のフラスコ中で過剰量のビス−活性化ジカルボン酸スペーサー：例えば、３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジカルボン酸ビスＮ−スクシンイミジルエステル（スペーサー１−Ｃ）及びグルタル酸−ビス−ＮＨＳ−エステル（スペーサー２−Ｅ）にカップリングさせて、それぞれ、ペプチド１−分枝基Ｂ−スペーサー１−ＮＨＳエステルと、ペプチド２−分枝基Ｂ’−スペーサー２−ＮＨＳエステルを得ることができる方法である。これらのそれぞれのジカルボン酸の過剰なビス−ＮＨＳエステル誘導体は、スペーサー１とスペーサー２のビス−ＮＨＳエステルを選択的に可溶化して、それぞれの溶液をデカントすることによる、それらの除去を可能にする、例えばエーテル若しくは酢酸エチルのような適当な溶媒によって、ペプチド１−分枝基Ｂ−スペーサー１−モノ−ＮＨＳエステルと、ペプチド２−分枝基Ｂ’−スペーサー２−モノ−ＮＨＳエステルを沈殿させることによって、洗浄除去することができる。次に、ペプチド１−分枝基Ｂ’−スペーサー１−ＮＨＳエステルを、例えばＤＭＳＯ、ＮＭＰ、ＤＭＦ又はＤＭＡのような、適当な溶媒中に溶解することができ、この溶液を、例えばＤＭＦ又はＤＭＡのような、適当な溶媒中に溶解した、過剰な（典型的には、５〜１００倍過剰な）ジアミン・リンカーＤ、例えば４，７，１０−トリオキサトリデカン−１，１３−ジアミン、好ましいジアミンリンカーに加えて、ペプチド１−分枝基Ｂ−スペーサー１−リンカーＤモノアミンを得ることができる。残留するジアミンリンカーＤは、蒸発又は例えばエーテル若しくは酢酸エチルのような溶媒中への選択的溶解のいずれかによって除去することができる。上述したように、エーテル若しくは酢酸エチルの添加は、過剰なジアミンリンカーＤを有する相とは別の相中にペプチド１−分枝基Ｂ−スペーサー１−リンカーＤ−モノアミンの沈殿又は隔離(sequestration)を生じる。次に、上清をデカントして、過剰なジアミンリンカーＤを除去する。
過剰なジアミンリンカーＤは、これらの２つの操作の連続的実施によっても除去することができる。過剰なジアミンリンカーＤの全てを除去するためには、該プロトコールを反復する、恐らく２回以上反復する必要がありうることも、予想される。次に、ペプチド１−分枝基Ｂ−スペーサー１−リンカーＤ−モノアミンを、例えばＤＭＳＯ、ＮＭＰ、ＤＭＦ又はＤＭＡのような、適当な溶媒中に溶解して、ペプチド２−分枝基Ｂ’−スペーサー２−モノ−ＮＨＳエステルと、化学量論量で反応させて、アセンブルされたダイマー、即ちペプチド１−分枝基Ｂ−スペーサー１−リンカーＤ−スペーサー２−分枝基Ｂ’−ペプチド２を得ることができる。反応成分モノマーペプチド−分枝基−スペーサー構築体と介在する中間体の化学量論量の使用は、不可欠ではなく、以下に略述するように、所望のヘテロダイマー・ペプチド構築体の製造を招く反応パートナーのいずれかの化学量論量以外を用いることが望ましいこともありうる。
望ましい場合には、第２反応パートナー、即ち、ペプチド２−分枝基Ｂ’−スペーサー２−モノ−ＮＨＳエステルの使用量は、任意に、化学量論量より多いことも少ないことも可能である。使用量の任意の変化は、２つの化合物の反応性、出発ペプチド２−分枝基Ｂ’−スペーサー２−モノ−ＮＨＳエステル（又はその加水分解生成物カルボン酸コンジナー）又はペプチド１−分枝基Ｂ−スペーサー１−リンカーＤ−モノアミン構築体からの目的生成物ダイマーの分離の相対的容易さ及び構築体のいずれかの入手可能性の関数である。
例えば、構築体ペプチド２−分枝基Ｂ’−スペーサー２−モノ−ＮＨＳエステルを、ペプチド１−分枝基Ｂ−スペーサー１−リンカーＤ−モノアミン構築体からではなく、ダイマー反応生成物から分離することが困難である場合には、構築体ペプチド２−分枝基Ｂ’−スペーサー２−モノ−ＮＨＳエステルの完全な消費を保証して、生成物ダイマーからのこの物質の困難な分離の問題を未然に防ぐために、構築体ペプチド２−分枝基Ｂ’−スペーサー２−モノ−ＮＨＳエステルの限定的な化学量論量を用いることが、最良の対策である。上述したこのような臨機応変の措置を用いて、化合物の製造及び精製のあらゆる段階を最適化することができることを、当業者は認識するであろう。シーケンスの全体を、図４９に示す。
１９．特許請求した方法のフレキシブル性
本発明の方法は、それらのモジュラー性、それらの多様性及び、分子の一端又は両端にレポーター−ｓｐ基を組み入れる、それらの能力のために有利である。当業者は、（１）ペプチド１とペプチド２が同じペプチドでよいこと；（２）スペーサー１とスペーサー２が同じスペーサーでよいこと；（３）同じペプチドと異なるスペーサーとの組み合わせ又は異なるペプチドと同じスペーサーとの組み合わせを作ることが可能であること；及び最後には、これらの可能性の全てが、上記の一般的な記載から考えられ、予想されることを認識するであろう。さらに、分枝基Ｂ若しくは分枝基Ｂ’を構成するアミノ酸残基を含有する側鎖上で又は必要に応じて、ペプチド１及び／又はペプチド２の配列中に存在しうるような残基上で、アミノ基のｉｖＤｄｅ、ａｌｏｃ、ｆｍｏｃ、ｂｏｃ、ベンジルオキシカルボニル、２−クロロトリチル、４−メチルトリチル、トリチル、ｔｅｒｔ−ブチル、メチル、ベンジル、ｔ−ブチルチオ、２−チオピリジル及び他の垂直保護方法、又は例えばＣＯＯＨ、ＯＨ若しくはＳＨのような、他の側鎖保護基を単独で又は組み合わせて用いることが、本明細書に記載するダイマー構築方法を、レポーター−ｓｐが分枝基、リンカーＤのアミノ酸の窒素、酸素若しくは硫黄原子上に、又はペプチド１若しくはペプチド２のＮ末端に存在しうるレポーター−ｓｐ官能基化ダイマーの構築にまで、上記と本質的に同じ方法で拡大させうることが予想される。
当業者は、さらに、完全に又は部分的に上述した方法以外の他の化学的方法が、ペプチド、スペーサー及びリンカーを、それらの構築の過程と、所望の多価ターゲッティング構築体、ヘテロダイマー、ヘテロダイマー構築体、ヘテロトリマー、ヘテロテトラマー、ヘテロマルチマー及び／又はヘテロマルチマー構築体の構築の過程において、ペプチド、スペーサー及びリンカーを連結するために用いることが可能であることを認識するであろう。これらの方法は、例えば、ペプチド、スペーサー若しくはリンカーのアミノ基と、他のペプチド、リンカー若しくはスペーサーのアルデヒド官能基とを用いる還元的アミノ化による第２級アミンの形成のような、結合形成反応を包含する。同様に、レポーター−ｓｐを同じ方法で付加することができる。結合形成反応のための他の可能な方法は、例えば、ペプチド、分枝基、スペーサー又はリンカーの１つのアミノ基を、イソシアナト官能基を有する適当なパートナーとカップリングさせることによる尿素の形成と、他のペプチド、分枝基、スペーサー若しくはリンカーのアミノ基の、カルボニルジイミダゾール、ホスゲン、又は例えばジホスゲン若しくはトリホスゲンのようなホスゲン代理物による処理による混合尿素の製造を包含する。形成されうる他の結合は、例えば、ジスルフィド結合、エーテル、エステル、カルバメート、ヒドラゾン、アシルヒドラゾン、セミカルバゾン、チオアミド又はチオ尿素を包含する。これらの異なるカップリング方法を促進することは、上記パートナーの１つのカルボン酸若しくはアミノ基を、例えばアルデヒド、アミン、アルコール、ヒドラジン、アシルヒドラジン、イソチオシアネート、メルカプタン、２−ピリジルジスルフィドに変化することを必然的に必要とするであろう。官能基中のこのような変化は、当業者によって必要とされ、期待される。
このダイマー化方法は、優れた位置的フレキシビリティを有し、他の連結基(linking groups)を許容する。Ｎ−末端からＮ−末端へ（Ｎ−Ｎ）、Ｃ−末端からＮ−末端へ（Ｃ−Ｎ）、Ｎ−末端からＣ−末端へ（Ｎ−Ｃ）、及びＣ−末端からＣ−末端へ（Ｃ−Ｃ）ダイマー化の例を、本明細書に記載する。記載した例では、Ｃ−末端におけるダイマー化はリシンのεアミンを用いたとしても、Ｃ−末端カルボキシル基にジアミンをカップリングさせ、得られたアミンをダイマー化プロトコールに用いることも可能である。他の非α−アミノ酸をＮ−末端アミン又はリシンのεアミンにカップリングすることによって、２つのペプチド間に異なる長さのリンカーを組み込むことができる。生物学的性質を最適化するために、このダイマー化方法に適合する他の官能基を一方のペプチド又は両ペプチドに付加することができる。
本発明の方法は、チロシン又はトレオニン誘導体をエステル化することなく、ダイマー化ペプチドを生成することに、注目に値するほどフレキシブルである。同様に、アルギンのグアニジン基はアシル化されず、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボン酸基は影響されない。ダイマー形成中のアシル化を防止するために、リシン基をｉｖＤｄｅ基で選択的に保護し、後で、ヒドラジンによって脱保護し、必要な場合に、さらなるエラボレーションに用いることができる。
例えば、環状ラクタム・ペプチド、環状ラクトン・ペプチド、ジスルフィド模倣体として述べた環状ペプチド型の全てのような、環状ジスルフィド、他の環状ペプチド、線状ペプチド及び他の型のモノマー・ペプチド及び例えば小分子、単なるジスルフィド模倣体以外のペプチド模倣体のような、他のモノマー型の全てを用いて、ヘテロダイマー及びホモダイマーさえも形成することができる。
当業者はさらに、レポーターを含む又は含まないヘテロダイマー（又はホモダイマー）構築体は、本開示に述べたモノマー型の全てから製造することができることも認識するであろう。下記の表は、モノマーの組み合わせと、得られるダイマーを例示する。表１のタイトルのすぐ下の列は、ペプチド「Ａ」−ペプチド「Ｂ」ヘテロダイマー構築体のペプチド「Ａ」のために利用可能なモノマー型を列挙する。左端の欄は、ペプチド「Ｂ」に利用可能なモノマー型を列挙する。最上列と左端欄とのメンバーの交差を形成するセルは、形成されうる、ヘテロダイマー・ペプチド「Ａ」−ペプチド「Ｂ」の型、又はホモダイマー・ペプチド「Ａ」−ペプチド「Ａ」若しくはペプチド「Ｂ」−ペプチド「Ｂ」の型さえも、構成モノマー型に関して示す。
既述したように、「ペプチドＡ」とペプチド「Ｂ」が、結合したスペーサー（単数又は複数）とレポーター−ｓｐ分子を有するペプチドを意味する広範囲な用語であること、及びダイマー形成がリンカー官能基をも必要としうることが理解される。好ましい実施態様では、ペプチドＡとペプチドＢは単一ターゲット上の異なるエピトープに結合する。より好ましい実施態様では、ペプチドＡとペプチドＢはＫＤＲ−又はｃＭＥT受容体上の異なるエピトープに結合する。
本発明の方法は、ホマダイマーとヘテロダイマーの製造を可能にし、両ペプチドの結合位置の制御を可能にし、さらに、化合物の親水性、リンカーの長さと剛性の制御を可能にし、したがって、化合物の物理的性質と結合性(binding properties)の最適化を可能にする。さらに、本発明の方法は、アシル化に依存して、幾つかの化学的ライゲーションアプローチ（上記参照）と対比して不可逆的に所望の生成物を生成し、保護されたペプチドにも、保護されないペプチドにも適合する。
モノマー・ペプチドと総合アプローチのごくマイナーのごく軽度な修飾によって、本発明の方法は、例えば発蛍光団、ビオチン及び金属キレーターのような標識基の位置的に制御された組み込みを可能にする。さらに、このような基の導入を、それらが何時――ダイマー化の前若しくは後に導入されるかに関して制御することができる。これらの本発明の方法は、優れた生物学的性質を有する、高アフィニティのホモダイマー及びヘテロダイマーの製造の基礎を形成する。
Ｃ．ヘテロマルチマー構築体の使用
本発明のヘテロマルチマー構築体は、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩSＡ）を含めた多くの用途に、種々な疾患の治療に有用な医薬品として、並びにin vivo診断及び療法に使用可能である。例えば、本明細書に記載するヘテロマルチマー構築体は、in vitro又はin vivoでのターゲット含有組織の検出及び／又はイメージングに非常に有用である。例えば、ＫＤＲ−又はＶＥＧF／ＫＤＲ複合体結合ヘテロマルチマー構築体は、ＫＤＲ−又はＶＥＧF／ＫＤＲ複合体−含有組織の検出及び／又はイメージングのために、特に、上記で説明したように、ＶＥＧＦとＫＤＲが密接に関与する血管新生の部位の検出及び／又はイメージングのために極めて有用である。ＫＤＲ又はＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体の分析又はイメージングのための、いずれの適当な方法も使用可能である。同様に、ｃＭｅt又はＨＧＦ/ｃＭｅｔ複合体結合ヘテロマルチマー構築体は、ｃＭｅt又はＨＧＦ/ｃＭｅｔ複合体−含有組織の検出及び／又はイメージングのために、特に、上記で説明したように、ＨＧＦとｃＭｅｔが密接に関与する、腫瘍若しくは他の高増殖部位の検出及び／又はイメージングのために極めて有用である。ｃＭｅｔ又はＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体の分析又はイメージングのための、いずれの適当な方法も使用可能である。
本発明の化合物はさらに、単独で使用又は他の治療剤と組み合わせて使用のいずれにしても、種々な疾患状態の治療にも有用である。例えば、上述したように、疾患状態を助長する生物学的プロセスを阻害する本発明の化合物は、それ自体で、治療剤又は薬剤組成物として使用可能である。或いは（又は、組み合わせて）、本発明の化合物は１種類以上の付加的な治療剤を含むことができる。１実施態様では、本発明は、それら自体で治療剤として用いることができるか又は１種類以上の治療剤（例えば、化学療法的、放射線治療的、遺伝物質等）を、血管新生部位を含めた、ＫＤＲ発現細胞若しくは多くの病原体に関連した細胞に局在させるために用いることができる、ＫＤＲ−又はＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合部分を含むヘテロマルチマーを包含する。他の実施態様では、本発明は、それら自体で治療剤として用いることができるか又は１種類以上の治療剤（例えば、化学療法的、放射線治療的、遺伝物質等）を、腫瘍、高増殖部位若しくは血管新生部位を含めた、ｃＭｅｔ発現細胞に局在させるために用いることができる、ｃＭｅｔ又はＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体結合部分を含むヘテロマルチマーを包含する。
本発明のヘテロマルチマー構築体は、内皮細胞を関与させる状態を治療するための治療剤として特に有用である。内皮細胞の重要な機能は血管新生（血管の形成）であるので、本発明のヘテロマルチマーは、例えば、充実性腫瘍、腫瘍転移及び良性腫瘍を含めた、血管新生を関与させる状態の治療に特に有用である。このような腫瘍と関連障害は、当業者に周知であり、例えば、黒色腫、中枢神経系腫瘍、神経内分泌系腫瘍、肉腫、多発性骨髄腫、乳房、肺，前立腺、結腸、頭頚部及び卵巣の癌を包含する。この他の腫瘍と関連障害は、米国特許Ｎｏ．6,025,331（Moses et al.に２０００年２月１５日発行）（これの教示は本明細書に援用される）の表１に列挙される。良性腫瘍は、例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、及び化膿性肉芽腫を包含する。血管新生に関与する他の関連疾患は、例えば、リウマチ様関節炎、乾癬及び、例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、レベオシス(rebeosis)、Osler-Webber症候群、心筋血管新生、プラーク血管新生、末梢血管拡張症、血友病関節症、血管線維腫、及び創傷肉芽化を包含する。血管増殖に関与する、他の関連疾患又は状態は、腸管癒着症、アテローム硬化症、強皮症、肥大性瘢痕及び潰瘍を包含する。さらに、本発明のヘテロマルチマーは、胚子着床に必要な子宮血管新生を軽減する又は防止するために、例えば、避妊薬として用いることができる。
溶液中のターゲットの検出のためには、本発明によるヘテロマルチマーを検出可能に標識して、例えば、発蛍光団標識、酵素標識、又は放射性核種若しくは常磁性金属による標識をして、又はバブルに付加させて、該溶液と接触させることができる、その後に、ヘテロマルチマーとターゲットとの間での複合体形成を検出することができる。１例として、発蛍光団標識ＫＤＲ-又はＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ヘテロマルチマー構築体は、in vitroでのＫＤＲ又はＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体検出アッセイのために用いることができる、このアッセイでは、ＫＤＲ又はＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に関して試験すべき溶液に、結合の発生を可能にする条件下で該ヘテロマルチマー構築体を加える。発蛍光団標識ＫＤＲ-又はＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ヘテロマルチマー構築体と、ＫＤＲ-又はＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体ターゲットとの間の複合体は、ＫＤＲ-又はＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ヘテロマルチマーから生ずる蛍光偏光の、遊離ヘテロマルチマーのそれに比べた上昇を測定することによって、検出し、数値化することができる。ｃＭｅｔ結合部分を含むヘテロマルチマーも同様に用いることができる。
或いは、サンドイッチ型「ＥＬＩＳＡ」アッセイを用いることができる、このアッセイでは、ヘテロマルチマー構築体を例えばプラスチック管若しくはウェルのような固体サポートに固定し、次に、ターゲットを含有すると疑われる溶液を、該固定ヘテロマルチマー構築体と接触させ、結合しない物質を洗浄除去し、例えばターゲットを認識するモノクローナル抗体のような、適当な検出試薬を用いて、複合体化ターゲットを検出する。モノクローナル抗体は、検出可能に標識する、例えば、放射能標識する、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ等のような酵素とコンジュゲートする、又は発蛍光団標識するを含めた、当該技術分野で知られた慣用的な手段によって検出可能である。
例えば、溶液中で又は溶液から溶解性ターゲットを検出又は精製するために、本発明のヘテロマルチマーを例えばクロマトグラフィー・サポート又は他のマトリックス物質のような固体基体上に固定することができ、次に、固定されたヘテロマルチマーに、ヘテロマルチマー：ターゲット複合体の形成に適した条件下で、溶液を負荷する又は接触させることができる。結合していないターゲットと非結合物質を含有する溶液を取り出すことができ、該複合体を例えば、ターゲットに対する抗体、例えば抗結合ポリペプチド抗体（例えば、ａｎｔｉ−ＫＤＲ、ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体、ａｎｔｉ−ｃＭｅｔ、又はａｎｔｉ−ｃＭｅｔ／ＨＧＦ複合体抗体）を用いて検出することができる、或いは、ヘテロマルチマー：ターゲット複合体を、適当な溶離条件下で、結合部分から放出させることができる。
血管新生の生物学と、血管新生を開始させ、維持することにおけるＶＥＧＦとＫＤＲの役割は、多くの研究者によって研究されており、この現象は、研究と開発の活発な分野であり続けている。多量のＫＤＲ又はＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体を純粋な形で精製する方法は、研究と開発を進めるために、望ましく、上記の一般的な精製方法を用いる、本明細書に記載するＫＤＲ又はＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体ヘテロマルチマーは、このために特に有用である。
１．診断イメージング
本発明の、適当に標識されたヘテロマルチマー構築体は、特定の組織又は細胞障害をイメージするために、in vivo診断用途に用いることができる。本発明によるヘテロマルチマー構築体の特に好ましい使用は、生体分子ターゲットを発現若しくは含有する組織の視覚的に読み取り可能なイメージを作製するためである。この実施態様のために、本発明のヘテロマルチマーを診断検出のために適当なラベルと、任意にリンカーを介入させて、コンジュゲートさせる。適当なリンカーは、置換若しくは非置換アルキル鎖、アミノ酸鎖（例えば、ポリグリシン）、ポリエチレングリコール、ポリアミド、及び当該技術分野で知られた、他の簡単なオリゴマー若しくはポリマー・リンカーであることができる。実際のリンカー構造を形成するために、１種類以上のリンカーを単独で又は組み合わせて用いることができる。好ましくは、ターゲットに対して、他の血清タンパク質に対するよりも非常に大きい特異性を示すヘテロマルチマーを、用いる検出方法に適当なラベルにコンジュゲートさせる又は連結させる。例えば、本発明のヘテロマルチマーを、リンカーあり又はリンカー無しで、磁気共鳴イメージング（ＭＲI）に適した常磁性キレートに、又はＸ線、ＰＥＴ若しくはシンチグラフィ・イメージングに適した放射性ラベル（必要な場合には、例えば放射性金属に関して本明細書に記載したようなキレーターを含む）に、又は超音波検出に適した超音波造影剤（例えば、安定化ミクロバブル、ミクロバルーン、ミクロスフェア若しくはガス充填「リポソーム」と呼ばれているもの）に、又は光学イメージング染料にコンジュゲートすることができる。
例えば、本発明のＫＤＲ若しくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合ヘテロマルチマー構築体又はｃＭｅt−若しくはＨＧＦ複合体−結合ヘテロマルチマー構築体を用いて、生残と転移のために血管新生を必要とする新生物腫瘍を、又は血管新生活性の他の部位をイメージすることができる。この実施態様では、ＫＤＲ若しくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合ポリペプチド又はｃＭｅt−若しくはＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体−結合ポリペプチドを含むヘテロマルチマー構築体は、本明細書に記載するように、任意にリンカーを介して、診断検出のために適当なラベルとのコンジュゲーションによって、イメージング試薬に転化される。
一般に、検出可能に標識されたヘテロマルチマー構築体の使用方法は、該ラベルが患者の体外で検出可能であるシグナルを発するという前提に基づいている。例えば、１実施態様では、本発明の、検出可能に標識されたヘテロマルチマー構築体を、例えば腫瘍のために血管新生が生じている患者に投与すると、該ヘテロマルチマー構築体に含まれるＫＤＲ若しくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合部分の、ＫＤＲ若しくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に対する高いアフィニティが、該ヘテロマルチマー構築体を血管新生部位に結合させて、該血管新生部位にラベルを蓄積させる。該標識ヘテロマルチマー構築体が血管新生部位に局在するために、充分な時間が許される。標識されたペプチドから発せられるシグナルは、使用するラベルの種類によって変化するスキャンニング・デバイスによって検出され、その後、シグナルは、血管新生部位のイメージに転換される。
他の実施態様では、本発明の検出可能なラベル又は放射線療法構築体で本発明のヘテロマルチマーを直接標識するのではなく、本発明のヘテロマルチマーを、例えばアビジン、ビオチン又は、検出可能なラベル若しくは放射性療法剤(radiotherapeutics)に結合する抗体若しくは抗体フラグメントにコンジュゲートすることができる。例えば、１実施態様では、ターゲット含有若しくはターゲット発現細胞にin vivo結合するように、ヘテロマルチマーをストレプトアビジン若しくはアビジンにコンジュゲートすることができる。未結合ヘテロマルチマーを身体からクリアした後に、ターゲッティング構築体が結合する部位に迅速に集積する、ビオチニル化検出可能ラベル又は放射性療法構築体（例えば、放射性金属と錯体化したキレート分子）を注入することができる。状況によっては、このアプローチは、検出可能ラベルを投与した後、イメージングを行なうことができるまでに要する時間を短縮することができる。このアプローチは、ターゲット部位におけるシグナル：ノイズ比率を高めて、検出可能ラベル又は放射性療法構築体の必要用量を減ずることもできる。このことは、放射性ラベル又は放射性療法剤を用いる場合に、例えば骨髄、腎臓及び肝臓のような、体内の正常であるが放射線感受性の部位にデリバリーされる放射線量が減ぜられるので、特に有用である。時には、プレ−ターゲッティング又は二工程若しくは三工程アプローチと呼ばれる、このアプローチは、Goodwin et al.,(“Advances in pretargeting biotechnology” )Biotechnology Advances 19(6), 435-450(2001)（これは、本明細書に援用される）；及びRosebrough, Q.J. Nucl.Med. 40:234-251(1996)（これは、本明細書に援用される）によって考察されている。好ましい実施態様では、ＫＤＲ若しくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ結合部分を含むヘテロマルチマー構築体を用いる。他の好ましい実施態様では、ｃＭｅｔ若しくはＨＧＦ/ｃＭｅｔ結合部分を含むヘテロマルチマー構築体を用いる。
２．磁気共鳴イメージング
本発明のヘテロマルチマーは、ＭＲＩに用いるための造影剤を形成するために、一種類以上の常磁性金属キレートと有利にコンジュゲートすることができる。好ましい常磁性金属イオンは、原子番号２１〜２９、４２、４４又は５７〜８３を有する。これは、不対電子を１個、より好ましくは５個以上有し、少なくとも１．７Ｂｏｈｒマグネトンの磁気能率を有する、遷移金属若しくはランタニド系列のイオンを包含する。好ましい常磁性金属は、非限定的に、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、マンガン（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、プラセオジミウム（ＩＩＩ）、ネオジミウム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）、エロピウム（ＩＩＩ）、及びイッタービウム（ＩＩＩ）を包含する。さらに、本発明のヘテロマルチマーは、１つ以上の超常磁性粒子とコンジュゲートすることもできる。
ＭＲＩには、Ｇｄ（ＩＩＩ）がその高い緩和度と低い毒性、及び生物学的にアクセス可能な唯一つの酸化状態の利用可能性のために特に好ましい。Ｇｄ（ＩＩＩ）キレートは、臨床及び放射線医学ＭＲ用途に、１９８８年以来用いられており、現在、ＭＲ検査の約３０％がガドリニウムに基づく造影剤を用いている。
当業者は、ターゲット含有組織を検出するために必要な線量に応じて、及び対象に対する金属の毒性のような、他の要因を考慮して金属を選択するであろう。Tweedle et al., Magnetic Resonance Imaging(2nd ed.), vol.1, pp796-97,Partain et al.,eds.(W.B.Saunders Co.1988)を参照のこと。一般に、個々の金属の望ましい線量は、その緩和度に比例し、該金属の生体内分布、薬物動態及び代謝によって修正される。三価カチオン、Ｇｄ３+は、その高い緩和度と低い毒性のために、さらに、該金属が生物学的にアクセス可能な唯一つの酸化状態で存在し、この状態が患者による該金属の好ましくない代謝を最小にするというさらなる利点によって、ＭＲＩ造影剤として特に好ましい。他の有用な金属はＣｒ３+であり、これは比較的安価である。
常磁性金属キレーターは、常磁性金属若しくは金属イオンに対するリガンドとして、及び常磁性金属若しくは金属イオンとの錯体として作用する１個以上の極性基を有する分子である。適当なキレーターは、当該技術分野で知られており、メチレンホスホン酸基、メチレンヒドロキサム酸基、カルボキシエチリデン基又はカルボキシメチレン基による酸を包含する。キレーターの例は、非限定的に、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１−置換１，４，７−トリカルボキシメチル１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン三酢酸（ＤＯ３Ａ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、及び１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）を包含する。この他のキレート形成リガンドは、エチレンビス−（２−ヒドロキシ−フェニルグリシン）（ＥＨＰＧ）と、５−Ｃｌ−ＥＨＰＧ、５−Ｂｒ−ＥＨＰＧ、５−Ｍｅ−ＥＨＰＧ、５−ｔ−Ｂｕ−ＥＨＰＧ及び５−ｓｅｃ−Ｂｕ−ＥＨＰＧを含めた、その誘導体；ベンゾジエチレントリアミン五酢酸（ベンゾ−ＤＴＰＡ）と、ジベンゾ−ＤＴＰＡ、フェニル−ＤＴＰＡ、ジフェニル−ＤＴＰＡ、ベンジル−ＤＴＰＡ及びジベンジル−ＤＴＰＡを含めた、その誘導体；ビス−２−（ヒドロキシベンジル）−エチレン−ジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）とその誘導体；少なくとも３炭素原子、より好ましくは６炭素原子と、少なくとも２ヘテロ原子（Ｏ及び／又はＮ）を含有するマクロ環状化合物の種類、このマクロ環状化合物は単環、又はヘテロ環元素において一緒に接合した２環若しくは３環から成ることができる、例えば、ベンゾ−ＤＯＴＡ、ジベンゾ−ＤＯＴＡ及びベンゾ−ＮＯＴＡ（この場合、ＮＯＴＡは１，４，７−トリアザシクロノナンＮ，Ｎ’，Ｎ“−三酢酸である）、ベンゾ−ＴＥＴＡ、ベンゾ−ＤＯＴＭＡ（この場合、ＤＯＴＭＡは１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，７，１０−テトラ（メチル四酢酸）である）、及びベンゾ−ＴＥＴＭＡ（この場合、ＴＥＴＭＡは１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−（メチル四酢酸）である）、１，３−プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）及びトリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）の誘導体；１，５，１０−Ｎ，Ｎ‘，Ｎ”−トリス（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）−トリカテコレート（ＬＩＣＡＭ）及び１，３，５−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）アミノメチルベンゼン（ＭＥＣＡＭ）の誘導体である。本発明に用いるために好ましいキレーターは、ＤＴＰＡである。本発明によって考慮される、典型的なキレーター及びキレート剤の例は、WO 98/18496、 WO 86/06605、 WO 91/03200、 WO 95/28179、 WO 96/23526、 WO 97/36619、 PCT/US98/01473、 PCT/US98/20182及び U.S. 4,899,755、 U.S. 5,474,756、 U.S. 5,846,519及び U.S. 6,143,274に記載されており、これらの各々はその全体で本明細書に援用される。キレートＤＯ３Ａの使用が特に好ましい。
本発明の１実施態様では、ＭＲＩ造影剤のキレーター（単数又は複数）を、例えばＫＤＲ-若しくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合ポリペプチド又はｃＭｅｔ−若しくはＨＧＦ/ｃＭｅｔ複合体−結合ポリペプチドから成るヘテロマルチマーのような、ヘテロマルチマーにカップリングさせる。キレート（単数又は複数）の位置決め(positioning)は、ヘテロマルチマー構築体の結合アフィニティ又は特異性を妨害しないように選択するべきである。好ましくは、該キレート（単数又は複数）をＮ−末端若しくはＣ−末端に付加するが、該キレート（単数又は複数）を配列内のいずれに付加することも可能である。好ましい実施態様では、遊離中央カルボン酸基（例えば、ＤＴＰＡ−Ａｓｐ（β−ＣＯＯＨ）−Ｏ−ｔ−Ｂｕ）を有するキレーターが、結合ペプチドのＮ−末端に該キレーターを、アミド結合の形成によって取り付けることを容易にする。該キレート（単数又は複数）を、リンカーを用いて、Ｃ−末端に取り付けることもできる。或いは、ペプチド配列内のいずれかの遊離アミノ基に適当なイソチオシアナト基含有ＤＴＰＡを連結する方法として、イソチオシアナト・コンジュゲーション化学を用いることができる。
例えば、該ヘテロマルチマーを金属キレーター（単数又は複数）（若しくは他の検出可能なラベル）に直接結合若しくは共有結合させることができる、又はリンカーを用いて金属キレーター（単数又は複数）にカップリング若しくはコンジュゲートさせることができ、リンカーは、非限定的に、アミド、尿素、アセタール、ケタール、二重エステル、カルボニル、カルバメート、チオ尿素、スルホン、チオエステル、エステル、エーテル、ジスルフィド、ラクトン、イミン、ホスホリル若しくはホスホジエステル結合；置換若しくは非置換飽和若しくは不飽和アルキル鎖；単一アミノ酸若しくは異なるアミノ酸（例えば、結合部分のＮ−若しくはＣ−末端の延長部）の、線状、分枝状若しくは環状アミノ酸鎖；誘導体化若しくは非誘導体化ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン若しくはポリビニルピリジン鎖；置換若しくは非置換ポリアミド鎖；誘導体化若しくは非誘導体化ポリアミン、ポリエステル、ポリエチレンイミン、ポリアクリレート、ポリ（ビニルアルコール）、ポリグリセロール若しくはオリゴ糖（例えば、デキストラン）鎖；交互ブロックコポリマー；マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸及びピメリン酸；カプロン酸；単純ジアミン及びジアルコール；本明細書に開示した、他のリンカーのいずれか；又は当該技術分野で知られた、任意の他の単純ポリマー・リンカー（例えば、WO98/18497、WO98/18496を参照のこと）であることができる。該リンカーの分子量を厳密に制御することができることが好ましい。該分子量は、１００未満から１０００を超えるまでの大きさの範囲であることができる。好ましくは、該リンカーの分子量は３００未満である。さらに、本発明のイメージング試薬の効果的な排泄経路を与えるようにin vivoで生分解可能であるリンカーを用いることが、望ましいと考えられる。このような生分解可能な官能基は、該リンカー内のそれらの位置に依存して、エステル、二重エステル、アミド、ホスホエステル、エーテル、アセタール及びケタール官能基を包含することができる。
一般に、既知方法を用いて、金属キレートと本発明のヘテロマルチマーとをこのようなリンカーによってカップリングさせることができる。例えば、WO 95/28967、WO 98/18496,、WO 98/18497及び上記で考察した方法を参照のこと。例えば、ヘテロマルチマーを構成要素−結合部分のＮ−若しくはＣ−末端を通して、例えばアミド結合によって、金属キレートの金属配位主鎖窒素に又は金属キレート自体のアセテート・アームに連結させることができる。本発明は、金属キレートが毒性を最小にするために金属を厳重に結合する能力を保持することを条件として、任意の位置でキレート（単数又は複数）を連結することを考慮する。同様に、金属キレートへの取り付け部位を生じるために、ヘテロマルチマーの構成要素−結合部分を修飾する又は伸長することができる、但し、このような修飾又は伸長がヘテロマルチマーのターゲット結合能力を排除しないことを条件とする。
この開示に従って製造したＭＲＩ造影試薬(contrast reagents)は、慣用的なＭＲＩ造影試薬と同じ方法で用いることができる。例えば血管新生部位のような、ターゲット含有組織を画像化する場合に、バックグラウンド血液及び組織に対する該部位の対比(contrast)を強調するために、ある一定のＭＲ手法及びパルス・シーケンス(pulse sequences)が好ましいと考えられる。これらの手法は、（非限定的に）、例えばファスト・スピン・エコー・シーケンス（例えば、Alexander et al., Magnetic Resonance in Medicine, 40(2): 298-310 (1998)参照) 及びフロー−スポイルド・グラジエント・エコー・シーケンス（flow-spoiled gradient echo sequences）（例えば、 Edelman et al., Radiology, 177(1): 45-50 (1990)参照)のような、血液を黒色にする必要がある黒色血液血管造影法を包含する。これらの方法は、例えば血管由来腫瘍のような、ターゲット含有組織とバックグラウンド組織との間の対比を増強する、反転回復生成シーケンス又は飽和回復生成シーケンス(inversion-recovery prepared or saturation-recovery prepared sequences)のような、対比の差異を強化する流量非依存型手法(flow independent techniques)をさらに包含する。最後に、磁化移動生成(magnetization transfer preparations)もこれらの作用剤による対比を改良することができる（例えば、Goodrich et al., Investigative Radiology, 31(6): 323-32 (1996)参照)。
標識された試薬を、注射可能な組成物の形態で患者に投与する。ＭＲＩ造影剤の投与方法は、静脈内、動脈内、くも膜下、間質的又は腔内を意味する非経口的であることが好ましい。活性な血管新生を画像化するためには、静脈内又は動脈内投与が好ましい。ＭＲＩのためには、ターゲット（例えば、血管新生部位）におけるＭＲシグナルを少なくとも１０％強化するために充分な量の造影剤を対象が受容することが考慮される。ＭＲＩ試薬を含むヘテロマルチマー構築体の注射後に、患者をＭＲＩ装置でスキャンして、ターゲット含有部位の位置を決定する。治療セッティングでは、ターゲットを局在化した直後に、必要な場合には、細胞傷害剤又は治療剤を投与することができ、続いて、患者をスキャンして、治療効果を可視化することができる。
好ましい実施態様では、ＫＤＲ−若しくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合部分を含むヘテロマルチマーを、１種類以上の常磁性金属キレート又は１種類以上の超常磁性粒子に、任意にリンカーを介して、コンジュゲートさせる。他の好ましい実施態様では、ｃＭｅｔ若しくはＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体−結合部分を含むヘテロマルチマー構築体を用いる。このようなヘテロマルチマー構築体を１種類以上の常磁性金属によって錯化して、血管新生部位におけるＭＲシグナルを少なくとも１０％強化するために充分な量で投与する。注射後に、患者をスキャンして、血管新生（例えば、血管由来腫瘍等）又は高増殖性組織の如何なる部位の位置をも決定する。必要な場合には、脈管形成部位若しくは高増殖性部位の位置を確認した直後に、抗脈管新生剤又は殺腫瘍剤、例えば、ＶＥＧＦ（又はＫＤＲのＶＥＧＦ活性化）の阻害剤を投与することができる。必要な場合には、患者を再度スキャンして、腫瘍退縮、血管新生の停止等を可視化／追跡することができる。
３．超音波イメージング
超音波を物質に通して伝達するときに、該物質の音響効果(acoustic properties)は、伝達速度と物質の密度に依存する。音響効果の変化は、異なる物質（固体、液体、気体）の界面において最も顕著になるであろう。超音波造影剤は、該造影剤と周囲組織との間の音響差による強度な音波反射体である。ガス含有又はガス発生超音波造影剤が、液体（例えば、血液）とガス含有又はガス発生超音波造影剤との間の音響差のために特に有用である。ミクロバブル、ミクロバルーン等を含む超音波造影剤は、それらのサイズのために、他の検出可能な部分よりも注射後血流中に長時間留まることができ；そのため、ターゲットとされる超音波造影剤は、ターゲットを発現する又は含有する組織の優れたイメージングを明確に示すことができる。
本発明のこの態様では、ヘテロマルチマー構築体は、超音波イメージングのために有用である物質を含むことができる。例えば、本発明のヘテロマルチマーは、小嚢（例えば、ミクロバブル、ミクロバルーン、ミクロスフェア等）又は、検出可能なラベルとして機能する液体若しくはガス（例えば、音波発生ガス若しくは音波発生ガスを発生可能な物質）を含有するエマルジョンを形成するために用いられる物質に連結することができる。このような小嚢を作製するための物質は、界面活性剤、脂質、スフィンゴ脂質、オリゴ脂質、リン脂質、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物及び合成若しくは天然ポリマー物質を包含する。例えば、WO 98/53857、 WO 98/18498、 WO 98/18495、 WO 98/18497、 WO 98/18496及び WO 98/18501を参照のこと、これらはそれらの全体で本明細書に援用される。
安定化ミクロバブルの懸濁液を含む造影剤（好ましい実施態様）のためには、リン脂質、特に飽和リン脂質が好ましい。好ましいガス充填ミクロバブルは、当該技術分野で知られた手段によって、例えば、下記特許のいずれかに記載の方法によって作製することができる：
これらの各々は、その全体で本明細書に援用される。好ましい実施態様では、リン脂質部分の少なくとも１つは、下記に示す式１８若しくは式１９：
［式中、ｎ＝４及びｎ＝ｍ］
で示され、米国特許Ｎｏ．U.S. 5,686,060（これは、その全体で本明細書に援用される）に記載される構造を有する。
適当なリン脂質の例は、１若しくは２分子の脂肪酸（同じ若しくは異なる）及びリン酸によるグリセロールのエステルを包含する、この場合、リン酸残基は次に、例えばコリン、セリン、イノシトール、グリセロール、エタノールアミン基等のような親水性基に結合する。リン脂質中に存在する脂肪酸は、一般に、長鎖脂肪酸、典型的に１２〜２４（ｍ及び／又はｎ＝１〜１２）炭素原子、好ましくは１４〜２２（ｍ及び／又はｎ＝３〜１０）炭素原子を有する脂肪酸であり、飽和であることも、１つ以上の不飽和を含有することもできる。適当な脂肪酸の例は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸である。リン脂質のモノエステルは、当該技術分野でリン脂質の「リソ（ｌｙｓｏ）」形としても知られる。
リン脂質のさらなる例は、ホスファチジン酸、即ち、脂肪酸によるグリセロール−リン酸のジエステル、スフィンゴミエリン、即ち、脂肪酸によるグリセロールジエステルの残基がセラミド鎖によって置換されているようなホスファチジルコリン類似体、カルジオリピン、即ち、脂肪酸による１，３−ジホスファチジルグリセロールのエステル、ガングリオシド、セレブロシド等である。
本明細書で用いる限り、「リン脂質」なる用語は、単独で又は混合物として用いることができる、自然生成する生成物、又は半合成的若しくは合成的に製造される生成物を包含する。
自然生成するリン脂質の例は、例えば、典型的に、大豆レシチン若しくは卵黄レシチンのような、天然レシチン（ホスファチジルコリン（ＰＣ）誘導体）である。
半合成リン脂質の例は、自然生成レシチンの部分的又は完全水素化誘導体である。
合成リン脂質の例は、例えば、ジラウリロイル−ホスファチジルコリン（「ＤLＰＣ」）、ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（「ＤＰＰＣ」）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（「ＤＡＰＣ」）、ジステアロイル−ホスファチジルコリン（「ＤＳＰＣ」）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（「ＭＰＰＣ」）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（「ＰＭＰＣ」）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（「ＰＳＰＣ」）、１−ステアロイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（「ＳＰＰＣ」）、ジオレオイルホスファチジルコリン（「ＤＯＰＣ」）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（Ｅｔｈｙｌ−ＤＳＰＣ）、ジラウリロイル−ホスファチジルグリセロール（「ＤＬＰＧ」）とそのアルカリ金属塩、ジアラキドイルホスファチジルグリセロール（「ＤＡＰＧ」）とそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）とそのアルカリ金属塩、ジパルミトイル−ホスファチジルグリセロール（「ＤＰＰＧ」）とそのアルカリ金属塩、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＳＰＧ」）とそのアルカリ金属塩、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（「ＤＯＰＧ」）とそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジン酸（「ＤＭＰＡ」）とそのアルカリ金属塩、ジパルミトイルホスファチジン酸（「ＤＰＰＡ」）とそのアルカリ金属塩、ジステアロイルホスファチジン酸（「ＤＳＰＡ」）、ジアラキドイルホスファチジン酸（「ＤＡＰＡ」）とそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＤＭＰＥ」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＰＰＥ」）、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＤＳＰＥ」）、ジミリストイルホスファチジルセリン
（「ＤＭＰＳ」）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（「ＤＡＰＳ」）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（「ＤＰＰＳ」）、ジステアロイルホスファチジルセリン（「ＤＳＰＳ」）、ジオレオイルホスファチジルセリン（「ＤＯＰＳ」）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（「ＤＰＳＰ」）及びジステアロイルスフィンゴミエリン（「ＤＳＳＰ」）である。
他の好ましいリン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジン酸、及びジパルミトイルホスファチジルセリンである。該組成物は、ＰＥＧ−４０００及び／又はパルミチン酸を含有することもできる。本明細書に開示した又は当業者に知られたガスのいずれも用いることができるが；例えばＳＦ６のような不活性ガス若しくは例えばＣＦ４、Ｃ３Ｆ８及びＣ４Ｆ10のようなフルオロカーボンが好ましい。
好ましいミクロバブル懸濁液は、リン脂質から、適当な溶媒中の粗リン脂質の凍結乾燥溶液若しくは噴霧乾燥溶液のような既知方法を用いて、又は下記：
に記載された方法を用いて製造することができる、上記特許の各々は、その全体で本明細書に援用される。最も好ましくは、リン脂質を有機溶媒中に溶解して、リポソーム形成段階を通さずに、該溶液を乾燥させる。これは、リン脂質を適当な有機溶媒中に、親水性安定剤物質又は有機溶媒と水の両方に溶解性の化合物と共に溶解して、該溶液を凍結乾燥若しくは噴霧乾燥することによって行うことができる。この実施態様では、親水性安定剤の選択に用いた基準は、選択した有機溶媒中でのその溶解性である。水と有機溶媒に溶解性の親水性安定剤化合物の例は、例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のようなポリマー、リンゴ酸、グリコール酸、マルトール等である。このような親水性化合物はさらに、ミクロバブルのサイズ分布の均質化にも役立ち、貯蔵下の安定性を強化する。任意の適当な有機溶媒を、噴霧乾燥、凍結乾燥(lyophilization)又は当業者に知られた、他の乾燥手法による、その後の乾燥を容易にするほど、その沸点が充分に低く、その融点が充分に高い限り、用いることができる。典型的な有機溶媒は、例えば、ジオキサン、シクロヘキサノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、テトラクロロジフルオロエチレン（Ｃ２Ｃｌ４Ｆ２）又は２−メチル−２−ブタノールを包含するが；２−メチル−２−ブタノールとＣ２Ｃｌ４Ｆ２が好ましい。
水性キャリヤー中に分散させることによってミクロバブルの懸濁液を形成する前に、凍結乾燥した又は噴霧乾燥したリン脂質粉末を空気若しくは他のガスに接触させる。水性キャリヤーに接触させると、その構造が既に破壊されている粉末リン脂質は、ラメラ化又は薄層状セグメントを形成し、その中に分散したガスのミクロバブルを安定化する。この方法は、長期間貯蔵したときさえ安定であり、乾燥した薄層状リン脂質（望ましいガス下で貯蔵されていた）を振とうせずに又は激しく撹拌せずに単純に溶解することによって得られる、ミクロバブルの懸濁液の製造を可能にする。
或いは、例えば、WO 97/29783に開示されているように、ガスを水溶液中に高い撹拌速度で懸濁させることによって、ミクロバブルを製造することができる。ミクロバブルの他の製造方法は、同時係属ヨーロッパ特許出願No. 03002373(本明細書に援用される)に開示されており、この方法は、リン脂質の存在下の水性媒質中有機溶媒のエマルジョンを作製し、次に、任意の洗浄及び／又は濾過工程後に、該エマルジョンを凍結乾燥させることを含む。
当業者に知られた添加剤を安定化ミクロバブルの懸濁液に含めることもできる。例えば、ポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレングリコール及び同様な化合物並びにこれらの種々なコポリマーを含めた非フィルム形成界面活性剤；例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸のような脂肪酸、又はこれらの誘導体、エルゴステロール、フィトステロール、シトステロール、ラノステロール、トコフェロール、プロピルガレート、アスコルビルパルミテート及びブチル化ヒドロキシトルエンを加えることができる。これらの非フィルム形成界面活性剤の量は、通常、界面活性剤の総量の５０重量％までであるが、好ましくは０〜３０重量％である。
他のガス含有懸濁液は、例えば、US 5,798,091とWO 97/29783に開示されているものを包含し、上記特許はそれらの全体で本明細書に援用される。これらの作用剤は、US 5,798,091又はWO 97/29783（これらはそれらの全体で本明細書に援用される）に記載されているように製造することができる。
他の好ましい超音波造影剤は、ミクロバルーンを含む。「ミクロバルーン」なる用語は、境界物質（material boundary）又はエンベロープによるガス充填体を意味する。ミクロバルーン製剤及び製造方法に関するさらなる情報は、例えば、下記：
に見出すことができ、これらの特許の各々は、その全体で、本明細書に援用される。
好ましいミクロバルーンは、生分解性で生理的に適合可能なポリマー又は生分解性固体脂質を含むエンベロープを有する。本発明のミクロバルーン製造に有用なポリマーは、例えば、下記特許：EP 458745, US 5,711,933, US 5,840,275, EP 554213, US 5,413,774 及び US 5,578,292のいずれかに記載されているような、生分解性で生理的に適合可能なポリマーから選択することができ、これらの全内容は、本明細書に援用される。特に、例えば、低水溶性の多糖類、ポリラクチド及びポリグリコリドとこれらのコポリマー、ラクチドと例えばε−カプロラクトン、γ−バレロラクトンのようなラクトンとのコポリマー、及びポリペプチドのような、生分解性で生理的に適合可能なポリマーから選択することができる。他の適当なポリマーは、ポリ（オルト）エステル（例えば、US 4,093,709; US 4,131,648; US 4,138,344; US 4,180,646参照)；ポリ乳酸及びポリグリコール酸とこれらのコポリマー、例えば、ＤＥＸＯＮ（J. Heller, Biomaterials 1 (1980), 51参照）；ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−ε−カプロラクトン）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−γ−バレロラクトン）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−γ−ブチロラクトン）、ポリアルキルシアノアクリレート；ポリアミド、ポリヒドロキシブチレート；ポリジオキサノン；ポリ−β−アミノケトン（A. S. Angeloni, P. Ferruti, M. Tramontini and M. Casolaro, The Mannich bases in polymer synthesis: 3. Reduction of poly(beta-aminoketone)s to poly(gamma-aminoalcohol)s and their N-alkylation to poly(gamma-hydroxyquaternary ammonium salt)s, Polymer 23, pp 1693-1697 (1982))；ポリホスファゼン（Allcock, Harry R., Polyphosphazenes: new polymers with inorganic backbone atoms (Science 193(4259), 1214-19 (1976))及びポリ無水物を包含する。本発明のミクロバルーンはさらに、WO-A-96/15815（本明細書に援用される）の方法に従って製造することもできる、この方法では、好ましくはモノ−、ジ−、トリ−グリセリド、脂肪酸、ステロール、ワックス及びこれらの混合物から選択される、生分解性脂質を含む生分解性膜から、ミクロバルーンが製造される。好ましい脂質は、ジ−若しくはトリ−グリセリド、例えば、ジ−若しくはトリ−ミリスチン、−パルミチン又は−ステアリンであり、特に、トリパルミチン又はトリステアリンである。
ミクロバルーンは、本明細書に開示されている又は当業者に知られているガスのいずれも用いることができるが；例えば、フッ化ガスのような不活性ガスが好ましい。ミクロバルーンを、当業者に知られた任意の添加剤と安定剤を含む、製薬的に受容される液体キャリヤー中に懸濁させることができる。
他のガス含有造影剤製剤は、そのなかに含有された又は他のやり方でそれと関連した（例えば、その表面に吸着された及び／又はそのなかの間隙、空洞若しくは穴に含有された）ガスを有するミクロ粒子（特に、ミクロ粒子の凝集体）を包含する。これらの製剤の製造方法は、下記：
に記載されている通りであり、これらの特許の各々は、その全体で、本明細書に援用される。
これらの超音波組成物のいずれも、可能な限り、血液と等張性であるべきである。そのため、注射前に、上記超音波造影剤懸濁液のいずれにも少量の等張剤(isotonic agent)を加えることができる。該等張剤は、医薬品に一般的に用いられる生理的溶液であり、これらは、生理的食塩水溶液（０．９％ＮａＣｌ）、２．６％グリセロール溶液、５％デキストロース溶液等を含む。さらに、超音波組成物は、例えば、乳化剤、粘度調節剤、凍結防止剤、リオプロテクタント(lyoprotectant)、充填剤等を含めた、標準的な製薬的に受容される添加剤を含むことができる。
本発明に有用な超音波造影剤に、任意の生体適合性ガスを用いることができる。本明細書で用いる「ガス」なる用語は、正常なヒト体温で実質的にガス形状の任意の物質（混合物を包含する）を包含する。したがって、該ガスは、例えば、空気；窒素；酸素；ＣＯ２；アルゴン；キセノン若しくはクリプトン；フッ化ガス（例えば、ペルフルオロカーボン、ＳＦ６、ＳｅＦ６を包含する）、低分子量炭化水素（例えば、１〜７炭素原子を含有する）、例えば、メタン、エタン、プロパン、ブタン若しくはペンタンのようなアルカン、例えば、シクロプロパン、シクロブタン若しくはシクロペンタンのようなシクロアルカン、例えば、エチレン、プロペン、プロパジエン若しくはブテンのようなアルケン、又は例えば、アセチレン若しくはプロピンのようなアルキン、及び／又はこれらの混合物を包含することができる。しかし、フッ化ガスが好ましい。フッ化ガスは、少なくとも１個のフッ素原子を含有する物質を包含する。例は、非限定的に、例えば、ＳＦ６、フレオン（１個以上の炭素原子とフッ素を含有する有機化合物、即ち、ＣＦ４、Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０、ＣＢｒＦ３、ＣＣｌ２Ｆ２、Ｃ２ＣｌＦ５及びＣＢｒＣｌＦ２）、及びペルフルオロカーボンのような化合物を包含する。「ペルフルオロカーボン」なる用語は、炭素原子とフッ素原子のみを含有する化合物を意味する。このような化合物は、飽和、不飽和及び環状ペルフルオロカーボンを包含する。好ましい飽和ペルフルオロカーボンは、式：ＣｎＦｎ＋２（式中、ｎは、１〜１２、好ましくは２〜１０、より好ましくは３〜８、最も好ましくは３〜６である）を有する。適当なペルフルオロカーボンは、非限定的に、ＣＦ４、Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０、Ｃ５Ｆ１２、Ｃ６Ｆ１２、Ｃ７Ｆ１４、Ｃ８Ｆ１８及びＣ９Ｆ２０を包含する。最も好ましくは、該ガス若しくはガス混合物は、ＳＦ６又は、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０、Ｃ５Ｆ１２、Ｃ６Ｆ１２、Ｃ７Ｆ１４、Ｃ８Ｆ１８から成る群から選択されるペルフルオロカーボンを含み、Ｃ４Ｆ１０が特に好ましい。さらに、WO 97/29783, WO 98/53857, WO 98/18498, WO 98/18495, WO 98/18496, WO 98/18497, WO 98/18501, WO 98/05364及び WO 98/17324も参照のこと、これらの各々は、その全体で、本明細書に援用される。
ある一定の状況では、ガス状物質の前駆物質（例えば、in vivoでガスに転化されうる物質、しばしば、「ガス前駆物質」と呼ばれる）を含めることが望ましいと思われる。好ましくは、該ガス前駆物質と、それが生成するガスは、製薬的に受容されるものである。該ガス前駆物質はｐＨ活性化、光活性化、温度活性化等されることができる。例えば、ある一定のペルフルオロカーボンは、温度活性化されるガス前駆物質として用いることができる。例えば、ペルフルオロペンタンのような、これらのペルフルオロカーボンは、室温を超えるが体温未満である液体／気体相転移温度（又は、作用剤が生成され及び／又は貯蔵される温度）を有する；したがって、これらは、体温の範囲内で相シフトを経験して、ガスに転化される。
前述したように、該ガスはガス混合物を包含することができる。下記組み合わせが特に好ましいガス混合物である：０．５〜４１容量％の量で存在する、ガス（Ｂ）の少なくとも１つが８０ダルトンを超える分子量を有するフッ化ガスであり、（Ａ）が空気、酸素、窒素、二酸化炭素及びこれらの混合物から成る群から選択され、混合物の残部がガス（Ａ）である、ガス（Ａ）とガス（Ｂ）との混合物。
超音波小嚢は、本明細書に述べる、他の検出可能なラベルよりも大きい可能性があるので、該作用剤のターゲッティング効率を高めるために、複数のヘテロマルチマー構築体にそれらを連結する若しくはコンジュゲートすることができる。上述した（又は当業者に知られた）超音波造影剤への取り付けは、前述したように、結合ポリペプチドと、該小嚢の作製に用いられる物質との間の直接共有結合を介して又はリンカーを介して行うことができる。例えば、二官能性ＰＥＧリンカーへのペプチド取り付けとその後のリポソーム組成物との反応に関する記載に関しては一般に、WO 98/53857を参照のこと。さらに、Ultrasound in Med. & Bio., 23(6): 863-870 (1997)も参照のこと。
ヘテロマルチマーにコンジュゲートしたミクロバブルの懸濁液の製造には、多くの方法を用いることができる。例えば、リン脂質製剤中に５重量％のＮ−ＭＰＢ−ＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−４−（ｐ−マレイミド−フェニルブチルアミド）（Avanti Polar-Lipids,Inc）を組み入れることによって、マレイミド誘導体化ミクロバブルを製造することができる。次に、脱アセチル化溶液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ＭヒドロキシルアミンＨＣｌ、ｐＨ７．５）中でインキュベートしたメルカプトアセチル化ヘテロマルチマーの溶液(ＤＭＦ中１０ｍｇ／ｍｌ）を、該マレイミド活性化ミクロバブル懸濁液に加える。穏やかに撹拌しながら、暗所でインキュベートした後に、ヘテロマルチマーがコンジュゲートしたミクロバブルを遠心分離によって精製することができる。
ミクロバブルの誘導体化にために用いることができる化合物は、典型的に、下記構成要素を包含する：（ａ）小嚢のエンベロープ中への化合物の効果的な組み入れを可能にするために、ミクロバブル若しくはミクロバルーンのエンベロープを形成する物質と適合性の疎水性部分；該部分は典型的に脂質部分（例えば、ジパルミチン、ジステアロイル）によって代表される；及び（ｂ）ある場合には、任意であるスペーサー（典型的には、異なる分子量のＰＥＧs）（ミクロバブルは、例えば、スペーサーがあまりに長い場合には、凍結乾燥するのが困難である）、又は他のある場合には、好ましいスペーサー（例えば、ペプチドは、短いスペーサーによってミクロバルーンにコンジュゲートした場合には、低活性になる可能性がある）；及び（ｃ）コンジュゲートされるペプチド上の対応する反応性部分と反応することができる反応性基（例えば、マレイミドと、システインの−ＳＨ基）。
或いは、ミクロバブルにコンジュゲートしたヘテロマルチマーは、ビオチン／アビジン系を用いて製造することができる。例えば、アビジンがコンジュゲートしたミクロバブルは、メルカプトアセチル化アビジン（脱アセチル化溶液と共にインキュベートされている）に加えられる、上述したように製造されたマレイミド活性化リン脂質ミクロバブル懸濁液を用いて、製造することができる。次に、ビオチニル化ヘテロマルチマー（本明細書に記載するように製造）をアビジンがコンジュゲートしたミクロバブルの懸濁液に加えて、ヘテロマルチマーにコンジュゲートしたミクロバブルの懸濁液を得る。
凍結乾燥した残渣は、過分極化ガス(hyperpolarized gas)(特別な貯蔵条件を必要とすることが知られる)を含有しない限り、その環境の温度制御を必要とせずに貯蔵し、輸送することができる；特に、これは、病院及び医者に、このようなユーザーが特別な貯蔵施設を有することを必要とせずに、すぐに使える投与可能な懸濁液にワン−サイト製剤化するために供給することができる。好ましくは、このような場合に、これは、２つの別々の容器又は二重室容器を含むことができる、二成分キットの形で供給されることができる。前者の場合には、好ましくは、該容器は、慣用的なセプタム−シールド・バイアルであり、工程（ｂ）の凍結乾燥残渣を含有するバイアルがセプタムでシールされ、このセプタムを通して、任意に予充填された注射器を用いて、キャリヤー液体を注入することができる。このような場合に、第２成分の容器として用いられる注射器は、次に、造影剤を注入するためにも用いられる。後者の場合には、好ましくは、二重室容器は、二重室注射器であり、ひと度凍結乾燥物を再構成して、適当に混合するか又は穏やかに撹拌したならば、造影剤の注射のために該容器を直接用いることができる。両方の場合に、該容器の中身に充分なバブル形成エネルギーを直接導入する又は該エネルギーの添加を可能にする手段が装備される。しかし、上述したように、本発明による安定化造影剤の場合には、ガスミクロバブルの大きさが、再構成された乾燥生成物に加えられる撹拌エネルギー量に実質的に関係ない。したがって、一致したミクロバブル・サイズを有する再現可能な生成物を得るために、穏やかな手動撹拌のみが必要であるにすぎない。
乾燥粉末を水溶液と無菌式に一緒にすることができる、他の二室再構成系も本発明の範囲内であることは、当業者によって理解されることができる。このような系では、水不溶なガスと環境との間に水相を挿入することができるならば、該製品の貯蔵寿命を高めるために特に有利である。造影剤を形成するために必要な物質が容器中に予め存在しない場合には（例えば、再構成中にリン脂質に連結するターゲッティング・リガンド）、それをキットの他の構成要素と一緒に、好ましくは、キットの他の構成要素との容易な組み合わせを促進するために適した形式又は容器でパッケージすることができる。
特別な容器、バイアル又は接続系は必要ではなく；本発明は、慣用的な容器、バイアル及びアダプターを用いることができる。唯一つの必要条件は、ストッパーと容器との間の良好なシールである。それ故、このシールの品質が、一番関心のある問題になり；シール完全性の如何なる劣化も、好ましくない物質の該バイアルへの侵入を可能にする。無菌性を保証することの他に、安全で、適当な再構成を保証するように、周囲圧力又は減圧において製品にシールを施すために真空保持が重要である。該ストッパーに関して、これは、例えばポリ（イソブチレン）又はブチルゴムのような、エラストマーに基づくコンパウンド又は多成分製剤(multicomponent formulation)であることができる。
本発明によって使用可能な、超音波イメージング手法は、例えばカラーＤｏｐｐｌｅｒ、パワーＤｏｐｐｌｅｒ、Ｄｏｐｐｌｅｒ振幅、刺激聴覚イメージング、及び二次元若しくは三次元イメージング手法のような、既知手法を包含する。イメージングは、調波(harmonic)（共鳴周波数）又は基本モードで行なうことができ、第２高調波が好ましい。
超音波適用では、リン脂質安定化ミクロバブルによって形成される造影剤は、例えば、注射されるリン脂質量が０．１〜２００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１〜３０μｇ／ｋｇ体重の範囲内であるような投与量で、投与することができる。ミクロバルーン含有造影剤は、典型的に、壁形成ポリマー又は脂質の量が約１０μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重であるような投与量で投与される。
好ましい実施態様では、本明細書に記載した超音波造影剤は、ＫＤＲ−若しくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合部分を含む１つ以上のヘテロマルチマーと、ＫＤＲを発現するターゲット組織にコンジュゲートする。実施例に示すように、これらの標的超音波造影剤は、血管新生部位及びＫＤＲを発現する他の組織に局在して、脈管形成組織の優れたイメージングを実証することができる。実施例に例示する、他の好ましい実施態様では、本明細書に記載する超音波造影剤は、ｃＭｅｔ−若しくはＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体−結合部分を含む１つ以上のヘテロマルチマーと、ｃＭｅｔを発現するターゲット組織にコンジュゲートする。これらの標的超音波造影剤は、高増殖又は血管新生（腫瘍を包含する）の部位及びｃＭｅｔを発現する他の組織に局在して、このような組織の優れたイメージングを実証する。
４．光学的イメージング、ソノルミネセンス又は光音響イメージング
本発明によると、例えば、ＫＤＲ、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体、ｃＭｅｔ若しくはＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体のようなターゲットの位置を、光学的標識ヘテロマルチマー構築体を対象に注入した後のin vivo光イメージングによって決定するために、多くの光学的パラメータを用いることができる。イメージの形成で検出される光学的パラメータは、例えば、透過される電磁波(transmitted radiation)、吸光(absorption)、蛍光若しくは燐光放射、光反射、吸光度の振幅と最大値の変化、及び伸縮的な散乱光線を包含することができる。例えば、生物学的組織は、６５０〜１０００ｎｍの近赤外（ＮＩＲ）波長範囲の光に対して比較的透光性である。ＮＩＲ光線は、数ｃｍまで組織に浸透することができ、in vivoでのターゲット含有組織のイメージングに、本発明のヘテロマルチマー構築体を用いることを可能にする。例えば、ＫＤＲ-、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−、ｃＭｅｔ−若しくはＨＧＦ／ｃＭｅｔ−結合ポリペプチドから成るヘテロマルチマー構築体は、in vivoでのＫＤＲ、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体、ｃＭｅｔ若しくはＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体の光学的イメージングのために用いることができる。
他の実施態様では、本発明のヘテロマルチマー構築体は、例えば、有機発色団若しくは発蛍光団を含み、広範囲にコンジュゲートする、したがって非局在化の環系を有し、４００〜１５００ｎｍの範囲内の吸収若しくは放射最大値を有する光学的染料のような、フォトラベル(photolabels)とコンジュゲートすることができる。或いは、本発明の化合物をバイオルミネセンス分子によって誘導体化することができる。ヘモグロビンからのシグナルによる妨害を最小にするために、フォトラベルの吸収最大値の好ましい範囲は、６００〜１０００ｎｍの範囲である。好ましくは、吸光ラベルは、大きなモル吸光係数、例えば、１０５ｃｍ−１Ｍ−１より大を有する、そして一方では、蛍光性光学的染料は高い量子収量を有する。光学的染料の例は、非限定的に、WO 98/18497, WO 98/18496, WO 98/18495, WO 98/18498, WO 98/53857, WO 96/17628, WO 97/18841, WO 96/23524, WO 98/47538及びこれらに引用された参考文献に記載された光学的染料を包含する。例えば、フォトラベルは、例えば、ＫＤＲ-、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合ペプチドを含むヘテロマルチマーのような、本発明のヘテロマルチマーに直接共有結合するか、又はこのようなヘテロマルチマーに、前述したようなリンカーを介して結合することができる。
光学的に標識したヘテロマルチマー構築体を注射した後に、患者を該剤中に用いられたフォトラベルに適当な波長範囲内で１つ以上の光源（例えば、レーザー）によってスキャンする。用いる光は単色性でも、多色性でもよく、連続的でも、パルス状でもよい。透過した、又は散乱した、又は反射した光を、１波長若しくは多重波長に合わせて調整した光検出器で検出して、対象中のターゲット含有組織（例えば、ＫＤＲ、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体、ｃＭｅｔ若しくはＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体を含有する組織）の位置を決定する。光学的パラメータの変化を、長期間にわたってモニターして、ターゲット部位（例えば、血管新生部位）における光学的に標識された試薬の蓄積を検出することができる。標準イメージ・プロセシングと検出デバイス(standard image processing and detecting devices)を、本発明の光学的イメージング試薬と共に用いることができる。
上記光学的イメージング試薬は、光学的標識イメージング剤によって行われる音響−光又はソノルミネセンス・イメージングに用いることもできる（U.S. 5,171,298, WO 98/57666と、それらのなかの参考文献参照）。音響−光イメージングでは、超音波放射線を対象に加えて、透過され、放射され又は反射される光の光学的パラメータに影響を与える。ソノルミネセンス・イメージングでは、加えた超音波が実際に、検出される光を発生する。このような手法を用いる、適当なイメージング方法は、WO 98/57666に記載されており、この特許は、これによって、その全体で本明細書に援用される。
５．放射性イメージング（放射性核種イメージング）と放射線療法
本発明のヘテロマルチマーは、シンチグラフィ、ＳＰＥＣＴ若しくはＰＥＴイメージングのために適当な放射性核種レポーターと、又は放射線療法のために適当な放射性核種とコンジュゲートすることができる。本発明のヘテロマルチマーが診断イメージングのために有用な放射性核種に対するキレーターと、放射線療法のために有用な放射性核種に対するキレーターとの両方にコンジュゲートしている構築体は、本発明の範囲内である。
ＰＥＴ剤として用いるためには、ヘテロマルチマーを、例えば51Mn, 52Fe, 60Cu, 68Ga, 72As, 94mTc,又は 110Inのような、種々なポジトロン放出金属イオンの１つによって錯化することができる。該ヘテロマルチマー構築体は、例えば18F, 124I, 125I, 131I, 123I, 77Br, 及び 76Brのような放射性核種を用いるハロゲン化によって標識することもできる。シンチグラフィ又は放射線療法のための好ましい金属放射性核種は、下記を包含する：
金属若しくはハロゲンの選択は、所望の治療又は診断用途に基づいて決定される。例えば、診断目的のために好ましい放射性核種は、64Cu, 67Ga, 68Ga, 99mTc,及び 111Inを包含する。治療目的のために好ましい放射性核種は、64Cu, 90Y, 105Rh, 111In, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 175Yb, 177Lu, 186/188Re,及び 199Auを包含する。診断用途のためには、 99mTcがその低いコスト、入手可能性、イメージング性及び高い比放射能のために特に好ましい。99mTcの核と放射能の性質が、この同位体を理想的なシンチグラフィ・イメージング剤にしている。この同位体は、１４０ｋｅＶの単フォトンエネルギーをと約６時間の放射能半減期を有し、99Mo−99mTc 発生器から容易に入手可能である。
金属放射性核種は、例えば、線状、マクロ環状、テルピリジン、及びＮ３Ｓ、Ｎ２Ｓ２若しくはＮ４キレート形成剤(chelants)( U.S. 5,367,080, U.S. 5,364,613, U.S. 5,021,556, U.S. 5,075,099, U.S. 5,886,142も参照のこと)と、非限定的に、ＨＹＮＹＣ、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ及びビスアミノビスチオール（ＢＡＴ）キレーター（U.S.5,720,934も参照）を包含する、当該技術分野で知られた、他のキレーターによって、キレート化することができる。例えば、Ｎ４キレーターは、米国特許No. 6,143,274; 6,093,382; 5,608,110; 5,665,329; 5,656,254; 及び 5,688,487に記載されている。ある一定のＮ３Ｓキレーターは、PCT/CA94/00395, PCT/CA94/00479, PCT/CA95/00249と、米国特許 No. 5,662,885; 5,976,495;及び 5,780,006に記載されている。キレーターは、Ｎ３Ｓを含有する、キレート形成リガンド メルカプト−アセチル−アセチル−グリシル−グリシン（ＭＡＧ３）の誘導体と、例えば、ＭＡＭＡ（モノアミドモノアミンジチオール）、ＤＡＤＳ（Ｎ２Ｓジアミンジチオール）、ＣＯＤＡＤS等のようなＮ２Ｓ２系をも包含することができる。これらのリガンド系と、多様な、他のリガンド系は、Liu and Edwards, Chem Rev99, 2235-2268 (1999)と、そのなかの参考文献に記載されている。
キレーターは、四座配列で金属に与えられないリガンド原子を含有する錯体をも包含することができる。これらは、例えばU.S. Patent Nos. 5,183,653; 5,387,409;及び 5,118,797（これらの開示は、それらの全体で、本明細書に援用される）に記載されているような、テクネチウム及びレニウムのジオキシムのボロン酸アダクツを包含する。
他の実施態様では、本発明の結合ポリペプチドのジスルフィド結合を、例えば９９ｍＴｃのような放射性核種のキレート化のための２リガンドとして用いる。このようにして、Ｔｃの導入によってペプチド・ループは拡大される（ペプチド−Ｓ−Ｓ−ペプチドがペプチド−Ｓ−Ｔｃ−Ｓ−ペプチドに変化する）。これは、文献（J. Q. Chen, A. Cheng, N. K. Owen, T. H. Hoffman, Y. Miao, S. S. Jurisson, T. P. Quinn. J. Nucl. Med. 42, 1847-1855 (2001)）における他のジスルフィド含有ペプチドにも、生物学的活性を維持しながら用いられている。Ｔｃに対する他のキレート形成基は、主鎖のアミド窒素、他のシスチン・アミノ酸又は、アミノ酸の他の修飾によって供給することができる。
特に好ましい金属キレーターは、式２０、２１及び２２（111In と、例えば 常磁性Gd3+ のようなランタニドと、例えば177Lu, 90Y, 153Sm,及び 166Hoのような放射性ランタニドに対する）で示されるキレーターと、以下に記載する式２３、２４及び２５ (放射性 99mTc, 186Re,及び 188Reに対する)で示されるキレーターを包含する。これらの及び他の金属キレート形成基は、米国特許 No. 6,093,382 及び 5,608,110（これらは、それらの全体で、本明細書に援用される）に記載されている。さらに、式２２で示されるキレート形成基は例えば米国特許No. 6,143,274に記載されており; 式２４で示されるキレート形成基は例えば米国特許No. 5,627,286と 6,093,382に記載されており、そして式２５で示されるキレート形成基は例えば米国特許No. 5,662,885; 5,780,006;及び 5,976,495に記載されている。
上記式２０と２１において、Ｒはアルキル、好ましくはメチルである。上記式２４において、ＸはＣＨ２又はＯのいずれかであり；ＹはＣ１−Ｃ１０分枝又は非分枝アルキルのいずれかであり；Ｙは、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アリールアミノアシルであり；Ｙはアリールアルキルであり、この場合、アリール基に結合したアルキル基は、Ｃ１−Ｃ１０分枝又は非分枝アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０分枝又は非分枝ヒドロキシ若しくはポリヒドロキシアルキル基又はポリアルコキシアルキル若しくはポリヒドロキシ−ポリアルコキシアルキル基である、ＪはＣ（＝Ｏ）−、ＯＣ（＝Ｏ）−、ＳＯ２、ＮＣ（＝Ｏ）−、ＮＣ（＝Ｓ）−、Ｎ（Ｙ）、ＮＣ（＝ＮＣＨ３）−、ＮＣ（＝ＮＨ）−、Ｎ＝Ｎ−、合成若しくは自然生成アミノ酸に由来するホモポリアミド又はヘテロポリアミドであり；全ての場合に、ｎ＝１〜１００である。これらの構造の他の変形は、例えば、米国特許No.6,093,382に記載されている。上記特許、出願及び参考文献の各々は、それらの全体で、本明細書に援用される。
キレーターは、ヘテロマルチマーに直接共有結合することができる、又は前述したように、リンカーを介してヘテロマルチマーに結合することができ、次に、最適の放射性金属によって直接標識されることができる（WO 98/52618, U.S. 5,879,658,及び U.S. 5,849,261参照)。
放射性テクネチウムの錯体は、診断イメージングのために特に有用であり、放射性レニウムの錯体は、放射線療法のために特に有用である。本発明の試薬によって放射性テクネチウムの錯体を形成する場合に、テクネチウム錯体、好ましくは９９ｍＴｃペルテクネテートの塩を還元剤の存在下で該試薬と反応させる。好ましい還元剤は、亜ジチオン酸塩、第１スズイオン及び第１鉄イオンであり；最も好ましい還元剤は塩化第１スズである。このような錯体を製造するための手段は、標識されるべき本発明の試薬の所定量と、該試薬を９９ｍＴｃで標識するための充分な量の還元剤を含有する密封バイアルを含むキットの形態で便利に提供される。或いは、適当なキレーターとコンジュゲートした、本発明のヘテロマルチマーを、テクネチウムの予め形成した不安定な錯体及び、転移リガンド(transfer ligand)として知られる他の化合物と反応させることによって、錯体を形成することができる。この方法は、リガンド交換として知られ、当業者に周知である。不安定な錯体は、例えば、タルトレート、シトレート、グルコネート又はマンニトールのような、転移リガンドを用いて形成することができる。本発明によって有用な９９ｍＴｃペルテクネテート塩には、例えばナトリウム塩のようなアルカリ金属塩、アンモニウム塩又は低級アルキルアンモニウム塩が含まれる。
金属が放射性レニウムである、本発明の錯体の製造は、金属が＋５又は＋７酸化状態であるレニウム化合物を出発物質として用いて、達成することができる。レニウムがＲｅ（ＶＩＩ）状態である化合物の例は、ＮＨ４ＲｅＯ４又はＫＲｅＯ４である。Ｒｅ（Ｖ）は、例えば、［ＲｅＯＣｌ４］（ＮＢｕ４）、［ＲｅＯＣｌ４］（ＡｓＰｈ４）、ＲｅＯＣｌ３（ＰＰｈ３）２として、及びＲｅＯ２（ピリジン）４ ＋（Ｐｈはフェニルであり；Ｂｕはｎ−ブチルである）として入手可能である。レニウム錯体を形成することができる、他のレニウム試薬も使用可能である。
本発明によって提供する放射性標識シンチグラフィ・イメージング剤は、適当量の放射能を含有しなければならない。９９ｍＴｃ錯体の形成において、約０．０１ミリキュリー（ｍＣｉ）〜１００ｍＣｉ／ｍｌの濃度で放射能を含有する溶液中で放射性錯体を形成することが、一般に好ましい。
一般に、単位投与量は、約０．０１ｍＣｉ〜約１００ｍＣｉ、好ましくは１ｍＣi〜２０ｍＣｉの放射能を有する。単位投与量で注射すべき溶液は、約０．０１ｍｌ〜約１０ｍｌである。
本発明の放射性核種標識ヘテロマルチマー構築体イメージング剤の典型的な投与量は、１０〜５０ｍＣｉを与える。ヘテロマルチマー放射性核種イメージング剤の患者への注射後に、該イメージング剤に組み込まれた核種のγ線エネルギーに関して較正されたＰＥＴカメラ又はγカメラを用いて、該剤の取り込み領域をイメージして、該部位中に存在する放射能量を数値化する。該部位のin vivoイメージングは、およそ数分間で行なうことができる。しかし、放射性標識ペプチドを患者に注射した後、必要な場合には、数時間又はさらに長く経過しても、イメージングを行なうことができる。大抵の場合には、投与された線量のうちの充分な量が約０．１時間以内(within about 0.1 of an hour)にイメージングされるべき領域に蓄積して、シンチフォトグラフの撮影を可能にするであろう。
本発明の放射線療法用化合物の適当な投与量スケジュールは、当業者に知られている。該化合物は、非限定的に、単回又は複数回のＩＶ若しくはＩＰ注射を包含する、多くの方法によって、標的組織の損傷若しくは除去を生ずるために充分であるが、非ターゲット（正常組織）には実質的な損傷を生じないような放射能量を用いて投与することができる。必要な該量及び線量は、用いる同位体のエネルギーと半減期、取り入れ度、及び身体と腫瘍塊からの該剤のクリアランスに依存して、異なる構築体では異なる。一般に、線量は約３０〜５０ｍＣｉの単回量から約３キュリーまでの累積量までの範囲であることができる。
本発明の放射線療法用組成物は、生理的に受容されるバッファーを含むことができ、注射前の化合物への放射線分解損傷を防止するために放射線安定剤を必要とする可能性がある。放射線安定剤は、当業者に知られており、例えば、パラ−アミノ安息香酸、アスコルビン酸、ゲンチスチン酸(gentistic acid)等を包含することができる。
放射性核種以外の、本発明の放射性医薬品を製造するために必要な化合物の全てを含有する、シングル−バイアル若しくはマルチ−バイアル・キットは、本発明の不可欠な部分である。
シングル−バイアル・キットは、好ましくは、キレート形成リガンド（金属放射性核種を用いる場合）、第１スズ塩の供給源（還元が必要である場合、例えば、テクネチウムを用いる場合）又は他の製薬的に受容される還元剤を含有し、ｐＨを約３〜約９の値に調節するために、製薬的に受容される酸若しくは塩基で適当に緩衝化される。用いる還元剤の量と種類は、形成される交換錯体(exchange complex)の性質に大きく依存すると考えられる。適当な条件は、当業者に周知である。キット内容物が凍結乾燥形であることが好ましい。このようなシングル−バイアル・キットは、例えばグルコヘプトネート、グルコネート、マンニトール、マレート、クエン酸若しくは酒石酸のような、不安定な又は交換リガンドを任意に含有することができ、最終生成物の放射性化学的純度及び安定性を改良するために役立つ、例えば、ジエチレントリアミン―五酢酸（ＤＰＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、又はα−、β−若しくはγ−シクロデキストリンのような、反応調節剤をも含有することができる。該キットは、さらに、安定剤、凍結乾燥プロセスを助成するように設計されている、例えばマンニトールのような充填剤、及び当業者に知られた、他の添加剤をも含有することができる。
マルチ−バイアル・キットは、好ましくは、放射性医薬品の再構成に２つ以上のバイアルを用いること以外は、同じ一般的構成要素を含有する。例えば、１つのバイアルは、ペルテクネテート（例えば、第１スズの供給源、又は他の還元剤）の添加時に不安定なＴｃ（Ｖ）錯体を形成するために必要である成分の全てを含有することができる。このバイアルにペルテクネテートを加えて、適当な時間待機した後に、このバイアルの内容物を、リガンドと、ｐＨをその最適値に調節するために適当なバッファーを含有する第２バイアルに加える。約５〜６０分間の反応時間後に、本発明の錯体が形成される。このマルチ−バイアル・キットの両バイアルの内容物を凍結乾燥することが有利である。上記のように、反応調節剤、交換リガンド、安定剤、充填剤等がいずれかの又は両方のバイアルに存在することが可能である。
好ましい実施態様では、本明細書に記載する放射線療法剤と放射線診断剤を、ＫＤＲ−若しくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合部分から成る１つ以上のヘテロマルチマーと、ＫＤＲ発現ターゲット組織にコンジュゲートさせる。実施例に示すように、これらの標的放射性医薬品は、血管新生部位及びＫＤＲを発現する他の組織に局在して、脈管形成組織又はＫＤＲを発現する他の組織の治療又はイメージングに用いられることができる。実施例に例示する、他の好ましい実施態様では、本明細書に記載する放射線療法剤と放射線診断剤を、ｃＭｅｔ−若しくはＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体−結合部分から成る１つ以上のヘテロマルチマーと、ｃＭｅｔ発現ターゲット組織にコンジュゲートさせる。これらの標的放射線医薬品は、高増殖若しくは血管新生（腫瘍を包含する）部位及びｃＭｅｔ発現ターゲット組織に局在して、このような組織のイメージング及び治療を可能にするであろう。
６．他の治療用途
本発明のヘテロマルチマー構築体は、例えば、ターゲットに対する治療剤のアフィニティ及ターゲットにおける滞留時間を改良することによって、治療剤の活性及び／又は効力を改良するために用いることができる。この実施態様では、ヘテロマルチマーを治療剤とコンジュゲートさせる。或いは、上記で考察したように、治療剤を含有するリポソーム又はバブルを本発明のヘテロマルチマーにコンジュゲートさせることができる。該治療剤は、上記で考察した放射線療法剤、薬物、化学療法剤若しくは殺腫瘍剤、遺伝物質(genetic material)、又は遺伝子デリバリー媒体(gene delivery vehicle)等であることができる。該コンジュゲートのヘテロマルチマー部分は、治療剤をターゲット発現／局在の部位に「向かわせ(home)」、これらの部位に対する該コンジュゲートのアフィニティを改良して、該コンジュゲートの治療活性がターゲット部位にいっそう限局され、集中するようにする。例えば、１実施態様では、ＫＤＲ-若しくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に対する治療剤のアフィニティと、血管新生を受ける内皮上のＫＤＲ-若しくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体における治療剤の滞留時間とを与える又は改良することによって、ＫＤＲ-若しくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合ポリペプチドを含むヘテロマルチマーを用いて、例えば、新生物腫瘍内で生じるような、好ましくない血管新生に対する治療剤（例えば、抗脈管形成剤若しくは殺腫瘍剤）の活性を改良することができる。本発明のこの態様では、ＫＤＲ-若しくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合ヘテロマルチマーを治療剤とコンジュゲートさせることによって、ハイブリッド剤(hybrid agents)を提供する。このようなヘテロマルチマー構築体は、ヒトを含めた哺乳動物における、血管新生に関連した疾患、特に、新生物腫瘍の成長と転移の治療に有用であろう。治療方法は、治療を必要とする哺乳動物に、治療剤とコンジュゲートした、ＫＤＲ-若しくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合ポリペプチドを含むヘテロマルチマー構築体の有効量を投与することを含む。本発明はまた、ヒトを含めた哺乳動物における血管新生に関連した疾患の治療のための薬剤の製造への該コンジュゲートの使用を提供する。ｃＭｅｔ−若しくはＨＧＦ/ｃＭｅｔ複合体−結合部分を含む、本発明のヘテロマルチマー構築体を、高増殖若しくは血管新生に関連した疾患の治療に同様に用いることができる。
本発明のこの態様に用いるために適した治療剤は、非限定的に：抗腫瘍剤、例えば、白金化合物（例えば、スピロプラチン、シスプラチン及びカルボプラチン）、メトトレキセート、アドリアマイシン、マイトマイシン、アンサミトシン、ブレオマイシン、シトシン、アラビノシド、アラビノシル・アデニン、メルカプトポリリシン、ビンクリスチン、ブスルファン、クロラムブシル、メルファラン（例えば、ＰＡＭ、ａ，ＬＰＡＭ又はフェニルアラニン・マスタード）、メルカプトプリン、ミトタン、塩酸プロカルバジン、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、タキソール、マイトマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、アミノグルテチミド、リン酸エストラムスチンナトリウム、フルタミド、酢酸塩、酢酸メゲストロール、クエン酸タモキシフェン、テストラクトン、トリロスタン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アスパラギナーゼ（Ｌ−アスパラギナーゼ）Erwina aparaginase、エトポシド（ＶＰ−１６）、インターフェロンｃｘ−２ａ、インターフェロンｃｘ−２ｂ、テニポシド（ＶＭ−２６）、硫酸ビンブラスチン（ＶＬＢ）、硫酸ビンクリスチン、硫酸ブレオマイシン、アドリアマイシン、及びアラビノシル；抗脈管形成剤、例えば、血管新生及び／又は腫瘍成長に重要なシグナリング分子に対する活性を有するチロシン・キナーゼ阻害剤、例えばＳＵ５４１６とＳＵ６６６８(Sugen/Pharmacia & Upjohn)、エンドスタチン（EntreMed)、アンギオスタチン(EntreMed)、コンブレタスタチン（Oxigene)、サイクロスポリン、５−フルオロウラシル(5-fuorouracil)、ビンブラスチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、ダウノルビシン、イムノトキシン；凝固因子；抗ウイルス剤、例えば、アシクロビル、アマンタジン アジドチミジン（AZT又はZidovudine）、リバビリン及びビダラビン１水和物（アデニン・アラビノシド、ａｒａ−Ａ）；抗生物質、抗マラリア薬、抗原虫薬、例えば、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、メトロニダゾール、キニン及びアンチモン酸メグルミン；抗炎症薬、例えば、ジフルニサル、イブプロフェン、インドメタシン、メクロフェナメート、メフェナム酸、ナプロキセン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アスピリン、及びサリチレートを包含する。
ヘテロマルチマー構築体が他の組織を標的とし、他の疾患状態の治療に有用である場合には、当業者は、適当な治療剤を代わりに用いることができる。
本発明のヘテロマルチマー構築体は、特定の細胞に遺伝物質を向かわせるために用いることもできる。例えば、本発明のヘテロマルチマー構築体は、目的のターゲットを含有する細胞又は組織に遺伝物質を局在させるために用いることができる。したがって、このような構築体は遺伝子療法に有用であると考えられる。該遺伝物質は、天然若しくは合成起源の、例えばＲＮＡ若しくはＤＮＡのような、組み換えＲＮＡとＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡとＤＮＡを含めた、核酸を包含することができる。使用可能である遺伝物質の種類は、例えば、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）及び欠陥ウイルス若しくは「ヘルパー」ウイルス、抗原核酸、一本鎖と二本鎖の両方のＲＮＡ及びＤＮＡと、これらの類似体、例えば、ホスホロチオエート及びホスホロジチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのような、発現ベクター上で運ばれる遺伝子を包含する。さらに、該遺伝物質は、例えば脂質、タンパク質又は他のポリマーと組み合わせることもできる。遺伝物質のデリバリー媒体(delivery vehicles)は、例えば、ウイルス粒子、レトロウイルス、又は他の遺伝子療法ベクター、リポソーム、脂質（特にカチオン性脂質）と遺伝物質との複合体、デキストラン誘導体と遺伝物質との複合体等を包含することができる。
好ましい実施態様では、本発明のヘテロマルチマー構築体は、血管新生に関連した疾患を治療するための遺伝子療法に用いられる。この実施態様では、例えば、血管新生に関連した疾患の治療に有用な、遺伝物質、又は遺伝物質を含有する１つ以上のデリバリー媒体を、本発明の１つ以上のＫＤＲ-若しくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合ヘテロマルチマー又はｃＭｅｔ−若しくはＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体−結合ヘテロマルチマーとコンジュゲートさせて、患者に投与することができる。
遺伝物質と本発明のＫＤＲ−結合ヘテロマルチマーとを含む構築体を用いて、特に、血管形成内皮細胞に遺伝子を選択的に導入することができる、これは、癌の治療のみに有用であるのではなく、血管形成術後にも有用であり、この場合には血管新生の阻害が再狭窄を防止することができる。
治療剤と、本発明のヘテロマルチマーとを、本明細書で考察した同じ種類のリンカーを用いて、既知方法で連結する又は融合することができる。好ましいリンカーは、置換若しくは非置換のアルキル鎖、アミノ酸鎖、ポリエチレングリコール鎖、及び当該技術分野で知られた、他のポリマー・リンカーであり、これらは、単独で又は相互に組み合わせて用いることができる。より好ましくは、治療剤自体が、それをコードするＤＮＡ配列が知られているタンパク質である場合には、該治療剤タンパク質と、本発明の結合ポリペプチドとを、上述したような組み換えＤＮＡ手法を用いて作製された、同じ合成遺伝子から共発現させることができる。例えば、ペプチドを該治療剤タンパク質のアミノ−若しくはカルボキシ−末端で、又は該末端の間の場所で、このような配置が治療剤タンパク質又は結合ポリペプチドの必要な生物学的機能を破壊しないことが判明したならば、発現させるように、結合ポリペプチドのコーディング配列を、治療剤タンパク質のコーディング配列とフレーム内で融合させることができる。この一般的アプローチの特別な利点は、複数の、直列に配置された結合ポリペプチドのコンカテマー化が可能であり、これによって、各治療剤タンパク質に関連した結合部位の数と濃度が上昇することである。この方法で、結合ペプチドの結合活性は上昇し、このことは、組み換え治療剤融合タンパク質の効力を改良すると期待される。
結合ポリペプチドの１つ以上のコーディング配列を含有する、同様な組み換えタンパク質は、イメージング又は治療用途に有用であると考えられる。例えば、以下で考察するプレターゲッティング用途の変化では(in a variation of the pre-targeting applications)、ａ ＫＤＲ−、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−、ｃＭｅｔ−又はＨＧＦ／ｃＭｅｔ−結合ペプチドのコーディング配列を、例えば、放射性核種（又は他の検出可能なラベル）に対するキレーターに結合する抗体（又は抗体フラグメント、若しくは抗体を含む組み換えＤＮＡ構築体等）をコードする配列にフレーム内で融合させることができる。次に、ＫＤＲ−、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−、ｃＭｅｔ−又はＨＧＦ／ｃＭｅｔ−結合ポリペプチドを発現する抗体を患者に投与して、ＫＤＲ−又はｃＭｅｔ−発現組織に局在させ、結合させる。非結合抗体をクリアさせた後に、該抗体が認識するキレーター−放射性核種複合体（又は他の検出可能なラベル）を投与して、ＫＤＲ−又はｃＭｅｔ−発現組織のイメージング又は該組織への放射線療法を可能にする。さらに、結合ペプチドのコーディング配列を、生物学的効果（例えば、アポトーシス、凝固、インターナリゼーション、分化、細胞静止(cellular stasis)、免疫系刺激若しくは抑制、又はこれらの組み合わせ）を生じる、例えば血清タンパク質若しくは他のタンパク質をコードする配列にフレーム内で融合させることができる。得られた組み換えタンパク質は、イメージング、放射線療法、及び血管新生に関与する癌及び他の疾患又は本明細書で考察する病原体に関連した疾患に対する療法に有用である。
さらに、本発明のヘテロマルチマーは、それ自体で、多くの疾患を治療するための治療薬として用いられることができる。例えば、タンパク質又は他の分子（例えば、増殖因子、ホルモン等）の結合が、疾患進行のために必要であるか又は疾患進行に寄与し、結合部分がこのような結合を妨害する場合には、このような結合部分を含むヘテロマルチマーが治療薬として有用であると考えられる。同様に、結合部分自体の結合が、疾患進行を阻害する場合には、このような結合部分を含有するヘテロマルチマーも、治療薬として有用でありうる。
ＶＥＧＦの結合と、ＫＤＲの活性化が脈管形成活性のためにひつようであるので、本発明の１実施態様では、ＫＤＲに対するＶＥＧＦの結合を阻害する又はＫＤＲに対するＶＥＧＦを阻害する（又は他のやり方でＫＤＲの活性化を阻害する）ＫＤＲ−若しくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合ポリペプチドを含むヘテロマルチマーは、抗脈管形成剤として用いることができる。ＫＤＲの活性化を阻害する、本発明のある一定のヘテロマルチマーは実施例で考察する。特に好ましいヘテロマルチマーは、ヘテロダイマー−含有構築体Ｄ１（以下の実施例９に示す構造）である。他の好ましいヘテロダイマー構築体は、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１３、Ｄ１７、Ｄ２３、Ｄ２４、Ｄ２５及びＤ２６（以下の実施例に示す構造）を包含する。これら及び他のヘテロマルチマーは、癌、又は不適当な若しくは過剰な血管新生に関連した、他の疾患、例えば、関節炎とアテローム斑、トラコーマ、角膜移植片血管新生、乾癬、硬皮症、血管腫と肥厚性瘢痕、血管癒着、血管線維腫、及び眼疾患、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、水晶体後方線維増殖、レベオシス、Osler-Webber症候群、心筋血管新生、プラーク血管新生、末梢血管拡張症、血友病関節症、血管線維腫、及び創傷肉芽化の治療に有用でありうる。血管新生に関与する、他の状態は、例えば、充実性腫瘍、腫瘍転移及び良性腫瘍を包含する。このような腫瘍と、関連障害は、当該技術分野で周知であり、例えば、黒色腫、中枢神経系腫瘍、神経内分泌系腫瘍、肉腫、多発性骨髄腫、並びに乳房、肺，前立腺、結腸、頭頚部及び卵巣の癌を包含する。この他の腫瘍と関連障害は、米国特許Ｎｏ．6,025,331（Moses et al.に２０００年２月１５日発行）（これの教示は本明細書に援用される）の表１に列挙される。良性腫瘍は、例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、及び化膿性肉芽腫を包含する。血管増殖に関与する、他の関連疾患又は状態は、腸管癒着症、アテローム硬化症、強皮症、肥大性瘢痕及び潰瘍を包含する。さらに、本発明のヘテロマルチマーは、胚子着床に必要な子宮血管新生を軽減する又は防止するために、避妊薬として用いることができる。
本発明のヘテロマルチマーは、ＶＥＧＦがＫＤＲに結合するときに、生じうる血管透過性イベントを治療するためにも有用であることができる。例えば実施例３０を参照のこと。腎不全の場合には、抗−ＶＥＧＦ抗体が損傷を逆転させることができ、同様にして、本発明の化合物が例えば糖尿病における腎透過病原性(renal permeability pathogenesis)を逆転させることができることが判明している。
ｃＭｅｔ受容体とのＨＧＦ相互作用の部分的又は完全な遮断を意味する中断(interruption)は、腫瘍進行を緩慢にするので、他の実施態様では、該ヘテロマルチマーは、ｃＭｅｔのＨＧＦへの結合を阻害する（又は他のやり方で、ｃＭｅｔの活性化を阻害する）ｃＭｅｔ−若しくはＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体−結合ポリペプチドを包含して、腫瘍及び他の高増殖性障害の治療に用いることができる。ｃＭｅｔを阻害する、特定のヘテロマルチマーは、実施例で考察する。好ましいヘテロマルチマーはＤ２８（以下の実施例９に示す構造）である。
さらに、本発明のヘテロマルチマーは、例えば、マラリア、ＨＩＶ、ＳＩＶ、サル出血熱ウイルス等を含めた、ある一定の病原体に関連した疾患の治療に有用でありうる。ＮＣＢＩにおけるＢＬＡＳＴプログラムを用いるファージ・ディスプレイによって同定されるＫＤＲ−結合ペプチドの配列相同性研究は、病原微生物の表面上に存在することが知られる又は予想される、多くの相同タンパク質を同定している。ＫＤＲ−及びＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合ポリペプチドと、種々なマラリア菌株、ＨＩＶ、ＳＩＶ、サル出血熱ウイルス及び腸出血性Ｅ．ｃoli菌株からのタンパク質との間には、相同性が認められている。例えばＰｆＥＭＰ１とＥＢＬ−１のような、相同タンパク質の幾つかは、病原性に関与すると知られている超変異性接着タンパク質である。これらのタンパク質は、宿主表面上の２つ以上(more than one)のターゲット分子に結合することができる多重結合部位を有する。これらの高い突然変異率と組み換え率(recombination rate)は、これらが新しい結合部位を迅速に発達させて、生残及び／又は侵入を促進することを可能にする。同様に、例えばＨＩＶのｇｐ１２０（本明細書に開示するＫＤＲ-結合ペプチドの幾つかにも相同性を有する）のようなタンパク質は、それらの宿主への病原体の接着に重要な役割を果たす。
今までに報告されていないが、本明細書に開示するＫＤＲ-結合ペプチドに対して相同性を有する病原体タンパク質の多くはＫＤＲにも結合することが可能である。病原体タンパク質配列と、対応するペプチド配列との比較は、該ペプチド配列の結合性を強化する、ペプチド配列の変化及び他の修飾を示唆することができる。さらに、本明細書に開示するＫＤＲ-結合ペプチド配列を含むヘテロマルチマー構築体は、相同性を有する病原体種による感染の阻止に有用でありうる。実際に、ウイルス・エンベロープ・タンパク質が、例えばＣＤ４のような、それらの既知細胞表面ターゲットに結合するのを防止しようと試みることによって、ＨＩＶ感染を阻止する方法が用いられている。Howie SE, et al., “Synthetic peptides representing discontinuous CD4 binding epitopes of HIV-1 gp120 that induce T cell apoptosis and block cell death induced by gp120,” FASEB J 12(11):991-8 (Aug. 1998)を参照のこと。したがって、ＫＤＲは、多くの病原体に対する今までに知られていないターゲットを表すことができる、それ故、ＫＤＲ−若しくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合ペプチドを含むヘテロマルチマー構築体は、これらの病原体に関連した疾患の治療に有用であると考えられる。
上記治療方法では、該化合物は、治療剤に慣習的な、いずれかの便利な経路によって；例えば、非経口的に、腸内に若しくは鼻腔内に、好ましくは、注入若しくはボラス注射によって、又はデポー若しくは緩慢放出製剤によって投与することができる。好ましい実施態様では、ヒトへの静脈内投与に適した薬剤組成物として、ルーチンな手段によって該組成物を処方することができる。典型的に、静脈内投与用組成物は、無菌等張性水性バッファー中の溶液である。他の製薬的に受容されるキャリヤーは、非限定的に、滅菌水、生理的食塩水溶液、緩衝化生理的食塩水（リン酸塩若しくは酢酸塩のようなバッファーを包含する）、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、パラフィン等を包含する。必要な場合には、該組成物は、可溶化剤と、注射部位の痛みを緩和するための、例えばリドカインのような局部麻酔薬をも包含することができ；さらに、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、塩、潤滑剤等を、それらが活性化合物と不利に反応しない限り、包含することができる。同様に、該組成物は、慣用的な賦形剤、即ち、非経口的、腸内若しくは鼻腔内用途に適し、活性化合物と不利に反応しない、製薬的に受容される有機若しくは無機キャリヤー物質を含むことができる。一般に、成分は別々に供給されるか、又は単位投与形で一緒に混合されて、例えば、活性単位での活性剤の量を意味するアンプル若しくはサシェのような、密閉された容器内の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給される。該組成物を注入によって投与する予定である場合には、無菌の製薬等級「注射用水」又は生理的食塩水を含有する注入ボトルによって、該組成物を分配することができる。該組成物を注射によって投与する予定である場合には、注射の前に成分を混合することができるように、無菌の注射用水又は生理的食塩水のアンプルを装備することができる。
物質の投与量は、状態の重篤さに依存する。例えば、脈管形成状態の治療のためには、例えば、新生物腫瘍成長の場合には、腫瘍の位置と大きさが物質の投与量に影響を及ぼす。正確な使用量と投与形式は、必然的に、苦痛の性質を考慮して、治療を管理する医師が状況に応じて決定しなければならない。一般に、ヘテロマルチマー／治療剤コンジュゲートの投与量は、該治療剤単独に対してルーチンである投与量に従うが、本発明のヘテロマルチマーの、そのターゲットに対する改良されたアフィニティが、標準投与量の減少を可能にする。
このようなコンジュゲート薬剤組成物は、好ましくは、非経口投与用に処方され、最も好ましくは、静脈内又は動脈内投与用に処方される。一般に、そして特に、投与が静脈内又は動脈内である場合には、薬剤組成物をボラスとして、時間的に分離された２回以上の投与量として又は絶え間ない流れ若しくは非線形流れの注入として与えることができる。
該ヘテロマルチマーは、個人に、状態の性質と所望の成果に依存して、適当な時間過程にわたって、投与することができる。該ヘテロマルチマー構築体は、予防的に、即ち、状態が診断される前に又は状態に罹患し易い個人に投与することができる。或いは、本発明のヘテロマルチマーは、個人が状態の症状を示す間に、又は症状が終わった若しくは他の方法で軽減した後（例えば、腫瘍の除去後）に投与することができる。さらに、本発明のヘテロマルチマーは、例えば、再発、症状又は状態を防止する又は軽減するために、維持計画の一部として投与することができる。本明細書に記載するように、本発明のヘテロマルチマーは、全身に又は局部に投与することができる。
本明細書に用いる限り、「治療的」なる用語は、ある一定の状態の症状の少なくとも部分的な緩和を包含する。本発明のヘテロマルチマー構築体は、有用であるために、症状の完全な緩和を生じる必要はない。例えば、個人の治療は、腫瘍若しくは罹患部位の大きさの減少、又は腫瘍若しくは罹患部位の大きさ上昇の予防、又は他の症状の部分的な緩和をもたらすことができる。治療は、問題の部位における血管数の減少をもたらすことができる、又は問題の部位における血管数の増加を予防することができる。治療はまた、主要な腫瘍（単数又は複数）の転移性増殖物の数又は大きさを抑制又は軽減することができる。
１実施態様では、緩和されうる症状は、例えば、ＶＥＧＦ受容体活性及び内皮細胞のマイグレーション能力のような生理的特徴を包含する。本発明のヘテロマルチマーは、ＶＥＧＦ−２／ＫＤＲ、ＶＥＧＦ−１／Ｆｌｔ−１及びＶＥＧＦ−３／Ｆｌｔ−４を含めた、ＶＥＧＦ受容体の活性を阻害することができる。このような阻害は、さらに、結合ポリペプチド若しくはその構築体の存在下又は結合ポリペプチド若しくはその構築体による治療後に該受容体のリン酸化状態を測定することによっても検出することができる。本明細書に記載する教えに基づいて、当業者は、本明細書に記載され、治療の前後に測定される、結合ポリペプチド若しくはその構築体の適当な用量を投与する方法を知り、投与することができると考えられる。他の実施態様では、関連受容体のリン酸化状態又は問題の領域における内皮細胞のマイグレーション能力を、個人から採取したサンプルで測定することができる。ＶＥＧＦ受容体又は内皮細胞は、サンプルから単離して、本明細書に記載するアッセイに用いることができる。
ヘテロマルチマーの投与量は、個人の年齢、性別、健康及び体重並びに状態の性質と総合治療計画に依存する可能性がある。マルチマーの生物学的効果を本明細書に記載する。それ故、本明細書で提供するヘテロマルチマーの生物学的効果と治療の所望の成果に基づくと、好ましい投与量は当業者によって、経路最適化方法によって決定される。典型的には、１日投与計画は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
本明細書で提供するヘテロマルチマーは、唯一の有効成分として製薬的に受容される賦形剤と共に投与することができる、或いは他の結合ポリペプチドとその構築体、他の治療剤又はこれらの組み合わせと共に投与することができる。さらに、該ヘテロマルチマーは、例えば特異性、体内での滞留時間又は治療効果を改良するために、治療剤にコンジュゲートすることができる。このような他の治療剤は、例えば、他の抗脈管形成性化合物と殺腫瘍性化合物を包含する。治療剤は抗体を含むことも可能である。
さらに、本発明のヘテロマルチマーは、内皮細胞ホーミング・デバイス(homing device)として用いることができる。それ故、該ヘテロマルチマー構築体は、核酸を内皮細胞に向かわせるために、例えば、治療用ポリペプチドをコードする核酸にコンジュゲートすることができる。ひと度核酸に暴露されたならば、それによって、治療用ペプチドがターゲット細胞にデリバリーされる。
本発明の他の実施態様では、治療剤を超音波造影剤組成物に結合させることができ、前記超音波造影剤は、既述したように、造影剤中に含まれる小嚢（特に、ミクロバブル若しくはミクロバルーン）の形成に用いられる物質に結合した本発明のＫＤＲ−、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−、ｃＭｅｔ又はＨＧＦ／ｃＭｅｔ−結合ペプチドを包含する。例えば、前記造影剤／治療剤結合は、本明細書に援用されるUS 6,258,378に記載されるように実施することができる。したがって、超音波造影剤を投与し、ＫＤＲ−、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体、ｃＭｅｔ又はＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体を発現する病原性部位に結合した造影剤を任意にイメージングした後に、該病原性部位にエネルギー・ビーム（好ましくは、例えば０．３〜３ＭＨｚの周波数を有する超音波）を照射して、例えば上記米国特許No. 6,258,378に記載されるように、ミクロ小嚢を破裂させる。したがって、治療剤の治療効果は、ミクロ小嚢の破裂によって放出されるエネルギーによって有利に強化され、特に、標的病原性部位への該治療剤の効果的なデリバリーを生じる。
上記で考察したように、ヘテロマルチマーは、任意の適当な経路によって投与することができる。適当な投与経路は、非限定的に、局所投与、経皮投与、非経口的、胃腸管、膣内、及び経肺胞（transalveolar)を包含する。所望の投与経路に適した組成物は、製薬技術分野で周知の方法のいずれかによって調製することができる。投与量、投与形、投与形式、組成等に関する詳細は、標準的製薬テキスト、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Alfonso R. Gennaro, ed. (Mack Publishing Co., Easton, PA 1990)（これは、本明細書に援用される）にさらに考察されている。
局所投与のためには、ヘテロマルチマーを例えばクリーム、ゲル又はリンス中に懸濁させて、該ポリペプチド又は構築体を皮膚に浸透させ、全身投与のために血流に侵入させ、限局的デリバリーのために問題の領域に接触させることができる。局所投与に適した組成物は、該ポリペプチドが少なくとも最低限に溶解性である、任意の製薬的に受容される塩基を包含する。
経皮投与のためには、ヘテロマルチマーを適当な経皮デバイス又は「パッチ」と共に製薬的に受容される懸濁液として塗布することができる。本発明のヘテロマルチマーの投与のための適当な経皮デバイスの例は、例えば、米国特許No. 6,165,458（December 26, 2000 、 Foldvari, et al.に発行）及び米国特許 No. 6,274,166B1（August 4, 2001、Sintov, et al.に発行）（これらの教示は、本明細書に援用される）に記載されている。
非経口的投与のためには、該ヘテロマルチマーを、例えば、製薬的に受容される無菌等張性溶液、例えば生理的食塩水及びリン酸塩緩衝化生理的食塩水中に懸濁させることができる。次に、本発明の構築体を静脈内、筋肉内、腹腔内又は皮下に注射することができる。
胃腸管及び膣内投与のためには、該ヘテロマルチマーを、服用のためには製薬的に受容される粉末、ピル若しくは液体中に、そして直腸若しくは膣投与のためには座薬中に組み入れることができる。
経肺胞、頬側又は肺投与のためには、該ヘテロマルチマーを、エアゾール化及び吸入のために又はマウスウォッシュとして適当な、製薬的に受容される賦形剤中に懸濁させることができる。例えば、アトマイザー及びベポライザーのような、経肺胞投与に適したデバイスも、本発明の範囲内に包含される。頬側又は肺経路を用いた、ポリペプチドのエアゾール・デリバリーに適した処方は、例えば、米国特許No.6,312,665B1（Nov.6,2001, Pankaj Modiに発行）（これの教示は、本明細書に援用される）に見出すことができる。
さらに、本発明のヘテロマルチマーは鼻又は眼に投与することができ、この場合には、該ヘテロマルチマーを、滴下投与に適した、製薬的に受容される液剤中に懸濁させる。
本発明のヘテロマルチマーは、該ポリペプチドが個体内で長時間にわたって放出されるように（持続又は制御放出）、投与することもできる。例えば、該ヘテロマルチマーを、単回投与が本発明の構築体を少なくとも１週間にわたって、又は１年間以上の期間にわたってデリバリーするような、組成物に処方することができる。制御放出系は、モノリシック若しくはレザバー型マイクロカプセル、デポーインプラント、浸透圧ポンプ、小嚢、ミセル、リポソーム、経皮パッチ及びイオン導入デバイス(iontophoretic devices)を包含する。１実施態様では、本発明のヘテロマルチマーを、緩慢な分解性の非毒性ポリマー中に封入する又は混合する。本発明の構築体の制御放出に適した、他の製剤は、米国特許 No. 4,391,797（July 5, 1983, Folkman, et al.に発行）（これの教示は、本明細書に援用される）に記載されている。
本発明のヘテロマルチマーを個人にデリバリーするための他の適当な方法は、該ポリペプチドのin vivo産生によるものである。該ポリペプチドをコードする遺伝子を、コードされるポリペプチドが発現されるように、個人に投与することができる。該遺伝子は一過性に発現されることができる。特定の実施態様では、該ポリペプチドをコードする遺伝子を、患者から得られている細胞中にトランスフェクトする、この方法はex vivo遺伝子療法と呼ばれる。次に、該ポリペプチドを発現する細胞を患者の体に戻す。ex vivo遺伝子療法の方法は当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許No. 4,391,797（March 21, 1998 , Anderson, et al.に発行）（これの教示は、本明細書に援用される）に記載されている。
本発明によるヘテロマルチマー構築体の製造と試験を、下記実施例でさらに説明する。下記実施例に含まれる特定のパラメータは、本発明の実施を例示するように意図するものであり、これらは如何なる意味でも本発明の範囲を限定するために提示するのではない。
典型的な実施態様の概要
本発明は、問題のターゲットに結合する多価構築体と、これらの構築体の使用に関連した種々な方法を特徴とする。本発明は、同じターゲットの異なる結合部位に結合する小さいターゲッティング部分を用いて、目的ターゲットへの改良された局在を可能にして、該ターゲット部位の検出、イメージング及び／又は治療のための改良された手段を提供する。
同じターゲットの異なる結合部位に対して特異的な、２つ以上のターゲッティング部分、例えば結合ポリペプチドを含む、多価（例えば、ダイマー若しくはマルチマー）ターゲッティング構築体の製造と使用を、本明細書に記載する。これらのターゲッティング構築体は、検出可能なラベル及び／又は治療剤（本明細書で定義したような）に連結又はコンジュゲートして、検出可能なラベル及び／又は治療剤を問題のターゲットにデリバリーするために用いることができる。したがって、本発明は、ターゲッティング構築体自体の他に、種々な疾患状態の診断イメージング及び治療に有用な、診断イメージング剤と治療剤を包含する。さらに、本発明は、疾患を治療するための本発明のターゲッティング構築体自体の使用を包含する。
１態様では、本発明は、複数の結合部分を有し、少なくとも２つの結合部分が同じターゲット上の異なる結合部位に対して特異性を有する化合物を特徴とする。好ましい実施態様では、該複数の結合部分はポリペプチドを包含する。他の好ましい実施態様では、該ターゲッティング部分は、全て、目的ターゲット上の異なる部位に結合する結合ポリペプチドである。ある一定の好ましい実施態様では、該ターゲットはタンパク質、受容体、又は受容体／リガンド複合体であり、該結合ポリペプチドは、タンパク質、受容体、又は受容体／リガンド複合体上の異なるエピトープに結合する。１実施態様では、該ターゲットは、血管新生、高増殖性障害又は創傷治癒に関連した受容体である。他の実施態様では、該ターゲットは、例えば、タンパク質−チロシン・キナーゼ受容体のような、受容体のファミリーを包含する。特に、好ましい実施態様では、該ターゲットはＫＤＲ又はＫＤＲ/ＶＥＧＦ複合体であり、結合部分、特に結合ペプチドは、ＫＤＲ又はＫＤＲ/ＶＥＧＦ複合体上の異なるエピトープに結合する。
他の好ましい実施態様では、該ターゲットは、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）受容体（ｃＭｅｔ）又はＨＧＦ/ｃＭｅｔ複合体であり、結合部分（特に、結合ポリペプチド）は、ｃＭｅｔ又はＨＧＦ/ｃＭｅｔ複合体上の異なるエピトープに結合する。
他の好ましい実施態様では、本発明の化合物の、そのターゲットに対するアフィニティ定数は、該ターゲットに対する構成ポリペプチドのアフィニティ定数よりも大きい。
他の態様では、本発明の化合物は、標識化基(labeling group)又は治療剤を包含する。ある一定の実施態様では、本発明の化合物は、結合部分と標識化基との間にリンカーを含む。例えば、該リンカーは、置換アルキル鎖、非置換アルキル鎖、ポリエチレングリコール誘導体、アミノ酸スペーサー、糖、脂肪族スペーサー、芳香族スペーサー、脂質分子、又はこれらの組み合わせを包含することができる。好ましい標識化基は、放射性核種、常磁性金属イオン、超音波造影剤、及び／又はフォトラベルを包含する。例えば、本発明の化合物に用いる、好ましい常磁性金属イオンは、下記を包含する：
放射性核種は、さらに好ましい検出可能なラベルであり、治療剤である。放射性核種の選択は、目的の治療用途又は診断用途に基づいて決定される。好ましい実施態様では、検出可能なラベルが常磁性金属又は放射性核種である場合に、本発明の化合物は、キレーター又はキレート形成基を含む。好ましいキレーターは、DTPA, DOTA, DO3A, EDTA, TETA, EHPG, HBED, NOTA, DOTMA, TETMA, PDTA, TTHA, LICAM,又は MECAMを包含する。ＰＥＴ剤として用いるためには、ペプチドを例えば51Mn, 52Fe, 60Cu, 68Ga, 72As, 94mTc又は 110Inのような、種々なポジトロン放出金属イオンの１つによって錯化することができる。該ヘテロマルチマー構築体を、例えば、18F, 124I, 125I, 131I, 123I, 77Br,及び 76Brのような放射性核種を用いるハロゲン化によって標識することも可能である。シンチグラフィ又は放射線療法のために好ましい金属放射性核種は、下記を包含する：
金属又はハロゲンの選択は、目的の治療用途又は診断用途に基づいて決定される。例えば、診断目的のためには、好ましい放射性核種は、64Cu, 67Ga, 68Ga, 99mTc, 及び 111Inを包含する。治療目的のためには、好ましい放射性核種は、下記を包含する：
本発明の化合物に用いる、最も好ましいキレーターは、１−置換１，４，７−トリカルボキシメチル１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラドデカン三酢酸（ＤＯ３Ａ）である。好ましくは、例えば、177Lu, 90Y, 153Sm, 111In, 又は 166Hoのような放射性ランタニドを、本発明の化合物に、ＤＯＴＡ又はＤＯ３Ａと共に用いる。
本発明の化合物は、下記構造を有するキレーターを包含する：
式中、ＸはＣＨ２又はＯであり；ＹはＣ１−Ｃ１０分枝若しくは非分枝アルキル、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アリールアミノアシル又は、Ｃ１−Ｃ１０分枝若しくは非分枝アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０分枝若しくは非分枝ヒドロキシ若しくはポリヒドロキシアルキル基又はポリアルコキシアルキル若しくはポリヒドロキシ−ポリアルコキシアルキル基を含むアラルキルであり、ＪはＣ（＝Ｏ）−、ＯＣ（＝Ｏ）−、ＳＯ２−、ＮＣ（＝Ｏ）−、ＮＣ（＝Ｓ）−、Ｎ（Ｙ）、ＮＣ（＝ＮＣＨ３）−、ＮＣ（＝ＮＨ）−、Ｎ＝Ｎ−、合成若しくは自然生成アミノ酸に由来するホモポリアミド又はヘテロポリアミドであり；ｎ＝１〜１００である。最も好ましくは、該化合物はさらに、99mTc,186Re又は188Reを包含する。
１実施態様では、本発明の化合物は、下記構造：
で示されるキレーターを包含する。
最も好ましくは、該化合物はさらに、99mTc, 186Re,又は 188Reを包含する。
他の実施態様では、該キレーターは、下記構造：
で示される化合物を含む。
最も好ましくは、該化合物はさらに、９９ｍTcを包含する。
他の実施態様では、本発明の化合物は、下記構造：
［式中、Ｒは、例えばＣＨ３のようなアルキル基である］
で示されるキレーターを包含する。最も好ましくは、該化合物はさらに177Lu、90Y、153Sm、111In又は166Hoを包含する。
さらに他の実施態様では、本発明の化合物は、下記構造：
［式中、Ｒは、例えばＣＨ３のようなアルキル基である］
で示されるキレーターを包含する。最も好ましくは、該化合物はさらに177Lu、90Y、153Sm、111In又は166Hoを包含する。
他の実施態様では、本発明の化合物は、下記構造：
で示されるキレーターを包含する。
最も好ましくは、該化合物はさらに177Lu、90Y、153Sm、111In又は166Hoを包含する。
本発明の化合物に用いるための好ましい超音波造影剤は、フッ化ガスを含有する、リン脂質安定化ミクロバブル又はミクロバルーンを包含する。
本発明の１つの好ましい実施態様は、ターゲット上の異なる結合部位に対する特異性を有する、少なくとも２つの結合部位を含む化合物を包含する。好ましくは、該ターゲットは、例えばＫＤＲ若しくはＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体又はｃＭｅｔ若しくはｃＭｅｔ／ＶＥＧＦ複合体のような、単独受容体又は受容体／リガンド複合体である。他の好ましい実施態様では、該結合部分は、受容体又は受容体／リガンド複合体上の異なるエピトープに結合する。特に好ましい実施態様では、該結合部分は、ポリペプチドを包含する。他の好ましい実施態様では、本発明の化合物は、配列番号ＮＯ：1、配列番号ＮＯ：２、配列番号ＮＯ：４、配列番号ＮＯ：５、配列番号ＮＯ：６、配列番号ＮＯ：７、配列番号ＮＯ：８、配列番号ＮＯ：９、配列番号ＮＯ：1０、配列番号ＮＯ：１１、配列番号ＮＯ：１２、配列番号ＮＯ：２６、配列番号ＮＯ：２７、配列番号ＮＯ：２８、又は配列番号ＮＯ：２９のアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。本発明はまた、１つ以上のアミノ酸置換、アミド結合置換、Ｄ−アミノ酸置換、グリコシル化アミノ酸、ジスルフィド模倣置換(disulfide mimetic substitutions)、アミノ酸転位を含むように修飾されている、又はレトロインバーソ型(retroinverso)ペプチド、ペプトイド、レトロインバーソ型ペプトイド、及び／又は合成ペプチドを含むように修飾されている、１つ以上の上記アミノ酸配列を有する化合物を提供する。好ましい実施態様では、本発明の化合物は、配列番号ＮＯ：４、配列番号ＮＯ：５、配列番号ＮＯ：８、配列番号ＮＯ：９、配列番号ＮＯ：１１、配列番号ＮＯ：１２、配列番号ＮＯ：２６及び／又は配列番号ＮＯ：２７を含む。より好ましい実施態様では、このような化合物はさらに、本明細書に記載するような、標識化基又は治療剤を包含する。
他の態様では、本発明は、標識化基を含む本発明の化合物を用いる、診断イメージング方法を特徴とする。本発明の方法は、標識化基を含む本発明の化合物を含む薬剤製剤を患者に投与する工程と、患者への投与後に、化合物をイメージングする工程を含む。好ましい実施態様では、該イメージング工程は、磁気共鳴イメージング、超音波イメージング、光イメージング、ソノルミネセンス・イメージング、光音響イメージング、又は放射性イメージング(nuclear imaging)を包含する。これらの方法では、投与工程は、例えば、吸入、経皮吸収、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、動脈内注射、又は非経口的投与を包含する。
他の態様では、本発明の化合物は、それ自体で、治療剤として役立つ、及び／又は治療剤を含む。ある一定の実施態様では、本発明の化合物は、結合部分と治療剤との間にリンカーを含む。例えば、リンカーは、置換アルキル鎖、非置換アルキル鎖、ポリエチレングリコール誘導体、アミノ酸若しくはペプチド・スペーサー、糖、脂肪族スペーサー、芳香族スペーサー、脂質分子、又はこれらの組み合わせを包含することができる。本発明の化合物と共に用いるために、好ましい治療剤は、生体活性剤、細胞傷害剤、薬物、化学療法剤、又は放射線療法剤を包含する。
他の態様では、本発明は、患者に本発明の化合物を含む薬剤製剤を投与することによる、疾患の治療方法を特徴とする。１実施態様では、該化合物の１つ以上の結合部分が、疾患状態に寄与する生物学的プロセスを阻害する場合に、該疾患状態を治療するために該化合物を投与することができる。例えば、該結合部分は、受容体の活性を防止する又は低下させることによって（例えば、受容体の本来のリガンド(natural ligand)との競合によって、本来のリガンドが結合するかしないかに拘わらず、受容体活性の直接の阻害によって、又は両方の組み合わせによって）、該生物学的プロセスを阻害することができる。したがって、本発明のヘテロマルチマー化合物は、例えばＫＤＲ若しくはｃＭeｔの活性を阻害することができ、このようにして、血管新生及び／又は高増殖を阻害し、その結果、これらのプロセスが寄与する疾患を阻害することができる。それ故、本発明は、本発明の化合物を単独で、又は別の治療剤に取り付けて若しくは連結させて含む薬剤製剤を患者に投与することによる、疾患の治療方法を特徴とする。好ましい実施態様では、本発明は、血管新生又は高増殖に関連した疾患の治療方法を特徴とする。最も好ましい実施態様では、該疾患は新生物腫瘍成長である。
本発明はまた、改良された結合アフィニティを有するヘテロマルチマー化合物のスクリーニング方法を特徴とする。この方法は、複数の結合部分を含み、そのうちの少なくとも２つの結合部分がターゲットの異なる結合部位に結合する、標識されたヘテロマルチマー化合物を製造する工程；該標識されたヘテロマルチマー化合物をターゲットに接触させる工程；該標識されたヘテロマルチマー化合物の結合強度を測定する（例えば、解離定数の測定によって）工程；及び該標識されたヘテロマルチマー化合物の結合強度（例えば、解離定数）を、１つ以上の個別の結合部分の結合強度（例えば、解離定数）と比較する工程を含む。この方法の好ましい実施態様では、該結合部分の１つはポリペプチドを包含する。他の好ましい実施態様では、該ターゲットはＫＤＲ若しくはＫＤＲ/ＶＥＧＦ複合体である。好ましい実施態様では、この方法に用いられるポリペプチドの１つは、配列番号ＮＯ：1、配列番号ＮＯ：２、配列番号ＮＯ：４、配列番号ＮＯ：５、配列番号ＮＯ：６、配列番号ＮＯ：７、配列番号ＮＯ：８、配列番号ＮＯ：９、配列番号ＮＯ：1０、配列番号ＮＯ：１１、又は配列番号ＮＯ：１２である。好ましくは、この方法は、構成結合部分の結合強度より大きい結合強度（例えば、解離定数の低下によって測定されるような）を有する、標識されたヘテロマルチマー化合物を同定する工程を含む。
１つの好ましい実施態様では、本発明は、ＫＤＲ若しくはＫＤＲ/ＶＥＧＦ複合体の異なる結合部位に結合する、２つ以上のＫＤＲ若しくはＫＤＲ/ＶＥＧＦ複合体−結合ポリペプチドを含むダイマー若しくはマルチマー・ターゲッティング構築体を特徴とする。このようなポリペプチドは、U.S.S.N. 60/360,851及び U.S.S.N. 60/440,441（これらの両方とも、それらの全体で、本明細書に援用される）と、同時係属出願U.S.S.N. 10/661,156, 名称 “KDR and VEGF/KDR-binding peptides and their use in diagnosis and therapy”（Aaron Sato et al.の名前で、 September 11, 2003に出願され、その全体で本明細書に援用される）に詳細に記載されている。これらの構築体は、本明細書では、「ＫＤＲ−ターゲッティング構築体」と呼ばれる。該ＫＤＲターゲッティング構築体は、モノマーのＫＤＲ若しくはＫＤＲ/ＶＥＧＦ複合体−結合ポリペプチドに比べて、及び単独のＫＤＲ-結合ポリペプチドのダイマー若しくはマルチマー構築体に比べて、ＫＤＲへの改良された結合（例えば、特異性及び／又はアフィニティ及び／又は結合活性の上昇）を示す。これらの好ましい化合物を、検出可能な部分に連結又はコンジュゲートさせて、これらの組成物をＫＤＲ発現細胞に向かわせて、ＫＤＲ発現組織のイメージングを可能にするために用いることができる。
他の好ましい実施態様では、本発明は、ｃＭｅｔ若しくはＨＧＦ/ｃＭｅｔ複合体の異なる結合部位に結合する、２つ以上のｃＭｅｔ若しくはＨＧＦ/ｃＭｅｔ複合体−結合ポリペプチドを含むダイマー若しくはマルチマー・ターゲッティング構築体を特徴とする。このようなポリペプチドは、同時係属出願U.S.S.N.60/451,588及び U.S.S.N. 10/792,582、名称“Peptides that specifically bind HGF receptor (cMet) and uses thereof” （これらは、それらの全体で本明細書に援用される）に詳細に記載されている。これらの構築体は、本明細書では、「ｃＭｅｔ−ターゲッティング構築体」と呼ばれる。該ｃＭｅｔ−ターゲッティング構築体は、モノマーのｃＭｅｔ若しくはＨＧＦ/ｃＭｅｔ複合体−結合ポリペプチドに比べて、及び単独のｃＭｅｔ-結合ポリペプチドのダイマー若しくはマルチマー構築体に比べて、ｃＭｅｔへの改良された結合（例えば、特異性及び／又はアフィニティ及び／又は結合活性の上昇）を示す。
本発明のｃＭｅｔ及びＫＤＲ−ターゲッティング構築体を治療剤に連結又はコンジュゲートさせて、治療剤をｃＭｅt又はＫＤＲ発現組織に局在させるために用いることができる。或いは、又はさらに、本発明のｃＭｅｔ及びＫＤＲ−ターゲッティング構築体を、本明細書に記載するように、治療剤そのものとして用いることもできる。
特に好ましい実施態様では、本発明のＫＤＲ−ターゲッティング構築体は、下記ＫＤＲ及びＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合ポリペプチド：配列番号ＮＯ：1、配列番号ＮＯ：２、配列番号ＮＯ：４、配列番号ＮＯ：５、配列番号ＮＯ：６、配列番号ＮＯ：７、配列番号ＮＯ：８、配列番号ＮＯ：９、配列番号ＮＯ：1０、配列番号ＮＯ：１１又は配列番号ＮＯ：１２の２つ以上を包含する。
他の好ましい実施態様では、本発明のｃＭｅt-ターゲッティング構築体は、下記結合ポリペプチド：配列番号ＮＯ：２６、配列番号ＮＯ：２７、配列番号ＮＯ：２８及び／又は配列番号ＮＯ：２９の２つ以上を包含する。
他の実施態様では、本発明は、ターゲットに結合して、それによって、構成ポリペプチドの結合に比べて、改良された結合（例えば、解離定数によって測定して）を有するＫＤＲ-結合ポリペプチドのマルチマー構築体を同定する能力に関して、ＫＤＲ−ターゲッティング構築体をスクリーニングするための新規な方法を提供する。さらに、本発明の方法は、該マルチマー・ターゲッティング構築体がin vivoの血清の存在下で安定であるかどうかの迅速な判断を可能にする。
２つ以上のＫＤＲ若しくはＫＤＲ/ＶＥＧＦ−結合ポリペプチドを含む構築体は、対応するモノマーの結合ポリペプチドに比べて、改良されたターゲット分子結合能力を示す。例えば、以下の実施例６に示すように、本明細書に提供するＫＤＲ-結合ポリペプチドのテトラマー構築体は、ＫＤＲトランスフェクトされた２９３Ｈ細胞に結合する改良された能力を示した。単一分子構築体中で２つ以上の結合ポリペプチドを組み合わせると、ＫＤの低下によって示されるように、モノマーの結合ポリペプチドに比べて、構築体の結合活性が改良されることがわかる。
さらに、本明細書で実証するように、ＫＤＲ及び／又はＫＤＲ／ＶＥＧＦの異なるエピトープに対して特異的な２つ以上の結合ポリペプチドを含む構築体（例えば、「ヘテロマー」構築体））を作製した。本明細書で提供する、２つ以上の結合ポリペプチドを含む構築体は、ＫＤＲ及び／又はＫＤＲ／ＶＥＧＦ上の多重部位をブロックすると期待される。該ヘテロマー構築体は、対応するモノマーと、同じ結合ポリペプチドの多重コピーを含むテトラマー構築体との両方を凌駕する優れた結合能力を示す。さらに、異なるエピトープに対して特異的な２つ以上の結合ペプチドを含むヘテロマー構築体は、ＫＤＲトランスフェクトされた２９３Ｈ細胞に効果的に結合することも可能であった。したがって、異なるエピトープを認識する２つ以上の結合ポリペプチドを含むことは、ＫＤの低下によって実証されるように、ターゲット分子に対する該構築体の結合活性をさらに改良する。
本明細書で提供する結合ポリペプチドのヘテロマー構築体は、受容体チロシンキナーゼ機能を阻害する能力の改良を示す。本明細書に記載する実験に基づいて、ＫＤＲ及び／又はＫＤＲ／ＶＥＧＦの異なるエピトープに対して特異的な少なくとも２つの結合ポリペプチドを含む、本発明のダイマー及び他のマルチマー構築体は、受容体チロシンキナーゼ機能を阻害すると期待される。特に、このような構築体は、ＶＥＧＦ−２／ＫＤＲ、ＶＥＧＦ−１／Ｆｌｔ−１及びＶＥＧＦ−３／Ｆｌｔ−４の機能を阻害すると期待される。さらに、ｃＭｅｔ及び／又はｃＭｅｔ／ＨＧＦの異なるエピトープに対して特異的な、２つ以上の結合部分を含む、本発明のヘテロマルチマー構築体は、受容体チロシンキナーゼの機能を、特にｃＭｅtの機能を阻害すると期待される。
本発明の目的のために、受容体チロシンキナーゼの機能は、下記のいずれかを包含することができる：該受容体のオリゴマー化、受容体リン酸化、受容体のキナーゼ活性、下流シグナリング分子の補充(recruitment)、細胞増殖の遺伝子誘導の誘発、細胞マイグレーションの誘導、又はこれらの組み合わせ。例えば、本明細書で提供する、結合ポリペプチドのヘテロマー構築体は、ＫＤＲ受容体のＶＥＧＦ誘導リン酸化の阻害によって実証されるように、ヒト内皮細胞におけるＶＥＧＦに誘導されるＫＤＲ受容体不活化を阻害する。さらに、本明細書で提供する、結合ポリペプチドのヘテロマー構築体は、ＶＥＧＦに刺激される内皮細胞マイグレーションを阻害する。本明細書に示すように、ＫＤＲ上の２つ以上の区別可能なエピトープを、単一結合構築体でターゲッティングすることは、受容体機能を阻害する該構築体の能力を大きく改良する。受容体活性をブロックする弱い能力を有する結合ペプチドでさえ、ＶＥＧＦに誘導される受容体機能をブロックする改良された能力を有するヘテロマー構築体の形成に利用することができる。実際に、本発明のヘテロマルチマーは、ＶＥＧＦがＫＤＲに結合する場合に生じる可能性がある血管透過イベントの治療に有用であることも可能である。例えば、実施例３０参照。腎不全においては、抗ＶＥＧＦ抗体が損傷を逆転させうることが判明しており、同様にして、本発明の化合物は、例えば糖尿病における腎透過性病因を逆転させることができる。
さらに、本明細書でさらに実証するように、ｃＭｅｔの異なるエピトープに対して特異的な２つ以上の結合ポリペプチドを含む構築体を作製した。本明細書で提供する、２つ以上のｃＭｅｔ−結合ポリペプチドを含む構築体は、ｃＭｅｔ上の多重部位をブロックすると期待される。これらのヘテロマーｃＭｅｔ−ターゲッティング構築体は、対応するモノマーを凌駕する優れた結合能力を示す。
それ故、本発明は、２つ以上の結合ポリペプチドを含む構築体をも包含する。本発明のマルチマー構築体は、該構築体の少なくとも２つの結合ポリペプチドがターゲット、例えば、ＫＤＲ及び／又はＫＤＲ／ＶＥＧＦと、ｃＭｅｔ及び／又はｃＭｅt／ＨＧＦ、の異なるエピトープに特異的であるように、２つ以上の結合ポリペプチドを含む。これらの構築体は、本明細書で「ヘテロマー構築体」、「ヘテロダイマー構築体」、「ヘテロダイマー」、「ヘテロマルチマー」及び／又は「ヘテロマルチマー構築体」とも呼ばれる。本発明の構築体は、無関係の又は対照のペプチド（単数又は複数）を包含することもできる。該構築体は、２つ以上、３つ以上又は4つ以上の結合ポリペプチドを含むことができる。本明細書に記載する教示に基づいて、当業者は、本明細書で提供する結合ポリペプチドをアセンブルして、マルチマー構築体を得ることができ、例えば、改良されたターゲット分子結合能力、又は改良された受容体チロシンキナーゼ機能阻害能力のような、改良された性質を有するマルチマー構築体を選択することができるであろう。改良された性質を有する、このようなマルチマー構築体は、本発明に包含される。さらに、本明細書で提供する方法及び教示は、多様な異なるターゲット（例えば、ＫＤＲとｃＭｅｔ）に対する改良された結合を可能にし、したがって、本発明の広範囲な適用可能性を実証することが判明している。
実施例
実施例１
ペプチド合成とフルオレセイン標識
陽性ファージ分離株に対応する選択されたＫＤＲ又はＶＥＧＦ／ＫＤＲ結合ペプチドを９−フルオレニルメトキシカルボニルプロトコルを用いて固相合成し、逆相クロマトグラフィーで精製した。ペプチドの分子量はエレクトロスプレー質量分析で確認し、ペプチドは、適切な場合、２８０ｎｍにおける吸光度によって定量した。合成のため、ファージベクター配列（これからペプチドが切り取られる）の２個のＮ末端及び２個のＣ末端アミノ酸を残し、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ２リンカーを各ペプチドのＣ末端に付加した。選択されたリジン残基を有するペプチドは１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）−３−メチルブチル（ｉｖＤｄｅ）保護基で保護された。これによってＣ末端リジンへの選択的カップリングが可能になる。この基はペプチド切断時には除去されないが、カップリング後、ＤＭＦ中２％ヒドラジン又は水中０．５Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ８）で除去された。
各ペプチドを、５−カルボキシ−又は６−カルボキシ−フルオレセイン又は５−カルボキシ及び６−カルボキシ−フルオレセインの混合物（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体として）又はＤＭＦ中２％ＤＩＥＡ溶液中のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を用い、Ｃ末端リジン上でフルオレセイン含有部分により標識した。ペプチドがｉｖＤｄｅ保護リジンを含有する場合、反応は２％ヒドラジン（あらゆる残存ＮＨＳ−フルオレセインと反応し、内部保護基を除去する化合物）の添加によってクエンチングされた。その他全てのペプチドの場合、反応は等量の０．５Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ８）の添加によってクエンチングされた。クエンチングされた反応混合物は次に組成物のＤＭＦ含有量が１０％未満になるまで水で希釈し、Ｃ１８逆相クロマトグラフィー（通常、半分取又は分取Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ）を用いて精製した。ペプチドの純度及び正確な質量について、ＬＣ−ＭＳシステム（インラインＳＣＩＥＸ ＡＰ１５０シングル四重極質量分析計を備えたＨＰ１１００ ＨＰＬＣ）で特性分析した。
１．蛍光異方性測定及びＢｉａＣｏｒｅアッセイ
蛍光異方性測定は、３８４ウェルのマイクロプレート中で結合緩衝液（ＰＢＳ、０．０１％トゥイーン−２０、ｐＨ７．５）中１０μＬの体積で、Ｔｅｃａｎ Ｐｏｌａｒｉｏｎ蛍光偏光プレートリーダーを用いて実施した。場合により、ヘパリン（０．５μｇ／ｍＬ）又は１０％ヒト血清を結合緩衝液に加えた。フルオレセイン標識ペプチドの濃度は一定（２０ｎＭ）に維持したが、ＫＤＲ−Ｆｃ（又は類似の標的）の濃度は様々であった。結合混合物はマイクロプレート中３０℃で１０分間平衡化してから測定した。観察された異方性の変化を非線形回帰によって下記の等式（１）に当てはめ、見かけのＫＤを得た。等式（１）は、合成ペプチド及びＨＳＡは溶液中で１：１の化学量論で可逆複合体を形成すると仮定している。
式中、ｒｏｂｓは観察された異方性、ｒｆｒｅｅは遊離ペプチドの異方性、ｒｂｏｕｎｄは結合ペプチドの異方性、ＫＤは見かけの解離定数、ＫＤＲは総ＫＤＲ濃度、及びＰは総フルオレセイン標識ペプチド濃度である。
ＫＤＲ−Ｆｃ（又は別のタンパク質標的）をＣＭ５センサーチップのデキストラン表面に標準的アミンカップリング法で架橋した（５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ６．０で１：２０に希釈された０．５ｍｇ／ｍＬ溶液、ＲＬ ＫＤＲ−Ｆｃ＝１２８５９）。実験はＨＢＳ−Ｐ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート２０（ｖ／ｖ））中で実施した。吸光係数によって定量されたペプチド溶液をＨＢＳ−Ｐ中で４００ｎＭに希釈した。系列希釈を実施して２００、１００、５０、及び２５ｎＭの溶液を作製した。結合のためにペプチドを２０μＬ／分で１分間、キンジェクト(kinject)プログラムを用いて注入した。１分間の解離時間後、あらゆる残存ペプチドを標的表面から１Ｍ ＮａＣｌを５０μＬ／分で２５秒間急速注入して除去した。全サンプルとも二重に注入した（同じものを複製した）。各ペプチド系列の間の緩衝液注入と非標的結合ペプチド注入は追加の対照として機能した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．１の同時ｋａ／ｋｄ適合プログラムを用いてセンサーグラムを分析した。
本明細書全体を通じて下記の共通の略号を使用する。
９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ｆｍｏｃ又はＦｍｏｃ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）、（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）−３−メチルブチル（ｉｖＤｄｅ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、試薬Ｂ（ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：フェノール：トリイソプロピルシラン、８８：５：５：２）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及び放射化学的純度（ＲＣＰ）。
実験法
実施例では下記の方法を採用した。
１．ＡＣＴ ３５７ ＭＰＳ及びＡＣＴ ４９６ ＭＯＳ 合成機のための方法１
ペプチドは、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＲ（Ｒｉｎｋアミド）樹脂（０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上で、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ ＡＣＴ ３５７又はＡＣＴ ４９６ 合成機のいずれかを用い、Ｆｍｏｃペプチド合成プロトコルを使用して合成した。具体的にはＨＯＢｔ／ＤＩＣをカップリング試薬として、ＮＭＰを溶媒として使用した。Ｆｍｏｃは、Ｎｏｖａ−Ｓｙｎ ＴＧＲ（Ｒｉｎｋアミド−ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社製、カリフォルニア州サンジエゴ）樹脂結合ペプチドを、ＤＭＦ中２５％ピペリジンで２回（４分及び１０分）処理することによって除去した。全アミノ酸をＮＭＰに溶解した（アミノ酸が純ＮＭＰに不溶の場合、ＤＭＦを加えた）。アミノ酸の濃度は０．２５Ｍ、ＨＯＢｔ及びＤＩＣの濃度は０．５Ｍであった。
ａ．０．０４ｍｍｏｌ規模の合成について：
典型的なアミノ酸カップリングサイクル（洗浄ステップを含まず）として、ピペリジン溶液（２．４ｍＬ）を各ウェルに分配し、４分間混合した後、全ウェルを空にした。ＮＭＰ（３２０μＬ）、ＨＯＢｔ溶液（３２０μＬ、４当量）、アミノ酸（６４０μＬ、４当量）及びＤＩＣ（３２０μＬ、４当量）溶液を各ウェルに分配した。カップリング時間は３時間であった。次いで樹脂を洗浄した。このサイクルを各アミノ酸について繰り返した。最後のアミノ酸カップリング後、樹脂結合ペプチドを２５％ピペリジンで処理してＦｍｏｃ保護基を除去した。洗浄後、樹脂結合ペプチドを１．０ＭのＡｃ２Ｏ（ウェルあたり１．２ｍＬ）及びＤＭＦ中ジイソプロピルエチルアミン（所望により混合物中に様々な量のＨＯＢｔを含めて）で３０分間キャッピングした。樹脂をまずメタノールで、次いでジクロロメタンで洗浄し、乾燥させた。樹脂からのペプチドの切断と側鎖の脱保護は試薬Ｂを４．５時間用いて達成した。切断溶液を回収し、樹脂を追加分量の試薬Ｂで洗浄した。合わせた溶液を濃縮乾固した。エーテルを残渣に回旋又は撹拌しながら加え、ペプチドを沈殿させた。エーテルをデカントし、固体を回収した。この操作を２〜３回繰り返して不純物を除去した。粗ペプチドをＤＭＳＯ水溶液と水の混合物に溶解し、ＨＰＬＣで精製した（カラム：Ｗａｔｅｒ’ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＸＴｅｒｒａ Ｃ１８、１９×５０ｍｍ、勾配溶離プロトコル使用；溶離液：０．１％ＴＦＡ入りＨ２Ｏ及び０．１％ＴＦＡ入りＣＨ３ＣＮ；ＵＶ ２２０ｎｍ；流速：５０〜６０ｍＬ／分）。所望ペプチドを含有する溶液を凍結乾燥し、所望ペプチドをフワフワの白色凍結乾燥物として得た（純度＞９０％）。
精製された直鎖ジシステイン含有ペプチドを水、水−アセトニトリル混合物、又は水−ＤＭＳＯ混合物に０．１ｍｇ／ｍＬ〜２．０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。溶媒の選択は、粗ペプチドの溶媒中の溶解度に依存する。溶液のｐＨはアンモニア水、炭酸アンモニウム水溶液又は炭酸水素アンモニウム水溶液で７．５〜８．５に調整した。混合物は空気中で２４〜４８時間激しく撹拌した。非ＤＭＳＯ含有溶媒系の場合、溶液のｐＨはトリフルオロ酢酸水溶液で２に調整した。混合物を凍結乾燥して粗環状ジスルフィド含有ペプチドを得た。次に該環状ジスルフィドペプチドを、最小量のアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）含有水（０．１％ＴＦＡ）に溶解して１〜２ｍＬの体積にした。得られた溶液を逆相カラムに装填し、水中アセトニトリルの勾配溶離によって所望化合物を得た。使用したのはＣ１８又はＣ８逆相半分取又は分取ＨＰＬＣカラムであった。ＤＭＳＯ含有溶液の場合、溶液を、ペプチドを沈殿させない最小のＤＭＳＯ濃度となるまで希釈した。得られた混合物を希トリフルオロ酢酸でｐＨ２に迅速に酸性化し、前述のように逆相ＨＰＬＣシステムに装填して精製した。所望物質を含有するフラクションをプールし、ペプチドを凍結乾燥によって単離した。
２．ＡＣＴ ３５７ ＭＰＳ及びＡＣＴ ４９６ ＭＯＳ 合成機のための方法２
ペプチドは方法１のように合成したが、下記の点を変更した。カップリング試薬としてＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ、溶媒としてＮＭＰを使用した。前述のＮｏｖａ−Ｓｙｎ ＴＧＲ樹脂から製造した低装填（〜０．２ｍｍｏｌ／ｇ）Ｆｍｏｃ−ＧＧＧＫ（Ｂｏｃ）−ＮｏｖＳｙｎ−ＴＧＲ−樹脂をペプチド合成用として０．０１ｍｍｏｌ規模の合成に使用した。
ａ．０．０１ｍｍｏｌ規模の合成について：
Ｆｍｏｃ基の除去後、標準的カップリング法で、ＨＯＢｔ（７２０μＬ、６当量）、アミノ酸（８０４μＬ、６．６当量）、ＨＢＴＵ（７２０μＬ、６当量）及びＤＩＥＡ（７９８μＬ、１３．３当量）の溶液を使用した。混合物を１５分間撹拌し、空にして樹脂を洗浄した。前述のように、全てのカップリング後並びに切断及び精製後、所望の直鎖ペプチド含有溶液を凍結乾燥し、ペプチドをフワフワの白色固体として得た（純度＞９０％）。
エーテル沈殿させた粗製の直鎖ジシステイン含有ペプチドを、水、アセトニトリル水溶液の混合物（０．１％ＴＦＡ）、又はＤＭＳＯ水溶液に溶解し、溶液のｐＨをアンモニア水、炭酸アンモニウム水溶液、又は炭酸水素アンモニウム水溶液の添加によって７．５〜８．５に調整することによって環化した。ペプチド濃度は０．１〜２．０ｍｇ／ｍＬであった。混合物を空気中で２４〜４８時間撹拌し、トリフルオロ酢酸水溶液でｐＨ２に酸性化し、次いで水中アセトニトリルの濃度勾配を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製した。所望物質を含有するフラクションをプールし、ペプチドを凍結乾燥によって単離した。
３．ＡＣＴ ４９６ ＭＯＳ 合成機のための方法３
ペプチドは、方法１のように、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ ＡＣＴ ４９６ ＭＯＳ 合成機を用いて合成した。低装填（〜０．２ｍｍｏｌ／ｇ）ＧＧＧＫ（Ｂｏｃ）−ＮｏｖａＳｙｎ−ＴＧＲ樹脂をペプチド合成用に用いた。カップリング溶媒はＮＭＰ／ＤＭＳＯ ８：２であった。合成は、０．０２ｍｍｏｌ規模で３時間のカップリング時間を用いて実施した。粗直鎖ペプチドは上記方法１に記載のようにさらに処理した。
ＡＣＴ ４９６ ＭＯＳ 合成機のための方法４
ペプチドは、方法３を用い、ＡＣＴ ４９６上でＨＢＴＵ／ＤＩＥＡをカップリング試薬として、ＮＭＰを溶媒として使用して合成した。１Ｍ溶液の２，４，６−コリジンを塩基として使用した。低装填Ｆｍｏｃ−ＧＧＧＫ（ｉｖＤｄｅ）−Ｎｏｖｓｙｎ−ＴＧＲ樹脂（〜０．２ｍｍｏｌ／ｇ）をペプチド合成に使用した。カップリング時間は３０分間であった。粗直鎖ペプチドは上記方法１に記載のようにさらに処理した。
５．ＡＢＩ ４３３Ａ 合成機のための方法５
ペプチド合成は、ＦａｓｔＭｏｃプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を用い、０．２５ｍｍｏｌ規模で実施した。このプロトコルの各サイクルでは、カートリッジに入った１．０ｍｍｏｌの乾燥保護アミノ酸を０．９ｍｍｏｌのＨＢＴＵ、２ｍｍｏｌのＤＩＥＡ、及び０．９ｍｍｏｌのＨＯＢｔのＤＭＦ中溶液（ＮＭＰを追加）に溶解した。ペプチドは、０．１ｍｍｏｌのＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＲ（Ｒｉｎｋアミド）樹脂（樹脂置換０．２ｍｍｏｌ／ｇ）を用いて製造した。このプロトコルのカップリング時間は２１分間であった。Ｆｍｏｃの脱保護はＮＭＰ中２０％ピペリジンで実施した。最終サイクルの終わりに合成ペプチドを無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＨＯＢｔ／ＮＭＰを用いてアセチル化した。ペプチド樹脂を洗浄し乾燥させて、更なる操作又は樹脂からの切断（試薬Ｂを使用）に供した。一般的に、切断されたペプチドは上記方法１のように環化された。
６．樹脂結合ペプチドのビオチン化のための方法６
ペプチドは方法５によって製造した。Ｃ末端リジン上のｉｖＤｄｅ保護基は、ＤＭＦ中１０％ヒドラジンで処理して選択的に除去した。次に樹脂を、ＤＩＥＡの存在下、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルのＤＭＦ中溶液で処理した。洗浄後、樹脂を乾燥させ、試薬Ｂを用いて切断を実施した。樹脂をろ過除去し、ろ液を濃縮乾固した。ビオチン化ペプチドをＤＭＳＯ原液又はＤＭＳＯ水溶液中に溶解し、ＤＩＥＡで処理し、４〜６時間撹拌してジスルフィド環化を実行した。粗混合物を分取ＨＰＬＣによって精製した。
典型的な実験では、２００ｍｇの樹脂結合ペプチドをＤＭＦ中１０％ヒドラジン（２×２０ｍＬ）で処理し、ＤＭＦ（２×２０ｍＬ）次いでジクロロメタン（１×２０ｍＬ）で洗浄した。樹脂をＤＭＦ（１０ｍＬ）中に再懸濁させ、ビオチン−ＮＨＳエステル（０．２ｍｍｏｌ、５当量）及びＤＩＥＡ（０．２ｍｍｏｌ）の溶液で処理し、樹脂を試薬と４時間混合した。反応の完了はニンヒドリンテストでチェックした。次にペプチドを試薬Ｂ（１０ｍＬ）で４時間処理することにより樹脂から外した。樹脂をろ過除去し、試薬Ｂを真空下で除去して、ペプチドを無水エーテルの添加によって沈殿させた。形成された固体を回収し、エーテルで洗浄して乾燥させた。固体を無水ＤＭＳＯに溶解して混合物をＤＩＥＡでｐＨ７．５に調整し、４〜２４時間撹拌してジスルフィド環化を実行した。ジスルフィド環化反応は分析ＨＰＬＣによってモニタした。環化完了後、混合物溶液を水中２５％アセトニトリルで希釈し、ＨＰＬＣの逆相Ｃ１８カラムで水中アセトニトリル（どちらも０．１％ＴＦＡ含有）の勾配を用いて直接精製した。フラクションを分析ＨＰＬＣで分析し、純生成物含有フラクションを回収し、凍結乾燥して必要なビオチン化ペプチドを得た。
７．精製ペプチドのビオチン化のための方法７
遊離アミノ基を含有する精製ペプチド（１０ｍｇ、方法１〜５によって製造）を無水ＤＭＦ又はＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解し、ビオチン−ＮＨＳエステル（５当量）及びＤＩＥＡ（５当量）を加えた。反応をＨＰＬＣでモニタし、反応完了後（１〜２時間）、粗反応混合物を分取ＨＰＬＣで直接精製した。フラクションを分析ＨＰＬＣで分析し、純生成物含有フラクションを回収し、凍結乾燥して必要なビオチン化ペプチドを得た。
８．リンカーを含有する樹脂結合ペプチドのビオチン化のための方法８
典型的な実験では、４００ｍｇの樹脂結合ペプチド（ＡＢＩ−４３３ Ａ 合成機を用いて製造され、ｉｖＤｄｅ保護リジンを持つ）をＤＭＦ中１０％ヒドラジン（２×２０ｍＬ）で処理した。該樹脂をＤＭＦ（２×２０ｍＬ）及びＤＣＭ（１×２０ｍＬ）で洗浄した。樹脂をＤＭＦ（１０ｍＬ）中に再懸濁させ、Ｆｍｏｃ−アミノジオキサオクタン酸（０．４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．４ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（０．４ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．８ｍｍｏｌ）で、４時間混合しながら処理した。反応後、樹脂をＤＭＦ（２×１０ｍＬ）及びＤＣＭ（１×１０ｍＬ）で洗浄した。次に樹脂をＤＭＦ中２０％ピペリジン（２×１５ｍＬ）で各回１０分ずつ処理した。樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ−ジアミノジオキサオクタン酸とのカップリング及びＦｍｏｃ保護基の除去をもう一度繰り返した。得られた樹脂は、遊離アミノ基を持つペプチドを含有しているが、これをビオチン−ＮＨＳエステル（０．４ｍｍｏｌ、５当量）及びＤＩＥＡ（０．４ｍｍｏｌ、５当量）のＤＭＦ中溶液で２時間処理した。ペプチド−樹脂を前述のように洗浄及び乾燥させ、次いで試薬Ｂ（２０ｍＬ）で４時間処理した。混合物をろ過し、ろ液を濃縮乾固した。残渣をエーテルと撹拌して固体を生成させ、それを回収し、エーテルで洗浄、そして乾燥させた。固体を無水ＤＭＳＯに溶解し、ｐＨをＤＩＥＡで７．５に調整した。該混合物を４〜６時間撹拌してジスルフィド環化反応を実行した（分析ＨＰＬＣでモニタ）。環化完了後、ＤＭＳＯ溶液を水中２５％アセトニトリルで希釈し、逆相Ｃ１８カラムに直接かけた。精製は、水中アセトニトリル（どちらも０．１％ＴＦＡ含有）の勾配を用いて実行した。フラクションを分析ＨＰＬＣで分析し、純生成物含有フラクションを回収し、凍結乾燥して必要なビオチン化ペプチドを得た。
９．５−カルボキシフルオレセイン標識ペプチド形成のための方法９
方法５から得られ、リジンのイプシロン窒素上にｉｖＤｄｅ保護基を含有するペプチド−樹脂を、ヒドラジンのＤＭＦ中溶液（１０％ヒドラジン／ＤＭＦ、２×１０ｍＬ、１０分間）と混合してｉｖＤｄｅ基を除去した。リジンのイプシロン窒素を、ＤＭＦ中フルオレセイン−５−イソチオシアネート（０．１２ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（０．１２ｍｍｏｌ）で標識した。混合物を１２時間撹拌した（フルオレセイン含有化合物は光から保護された）。次に、樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）及び２回のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）で洗浄し、窒素下で１時間乾燥させた。試薬Ｂを４時間用いてペプチドを樹脂から切断し、溶液をろ過により回収した。揮発性物質を減圧下で除去し、残渣を真空下で乾燥させた。ペプチドをエーテルを用いて沈殿させ、回収して沈殿物を窒素流下で乾燥させた。沈殿物を水（１ｍｇ／ｍＬ）に加え、混合物のｐＨを１０％メグルミン水溶液で８に調整した。ペプチドの環化を４８時間実施し、溶液を凍結乾燥させた。粗環状ペプチドを水に溶解し、Ｃ１８カラム、水中アセトニトリル（両相とも０．１％ＴＦＡ含有）の直線勾配を用い、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。純生成物含有フラクションを回収し、凍結乾燥させた。ペプチドは陽イオン又は陰イオンＥＳＩ−ＭＳによって特性分析し、純度はＲＰ−ＨＰＬＣ（水中アセトニトリル／０．１％ＴＦＡの直線勾配）により決定した。
１０．Ｔｃへの結合のためのペプチドキレート製造のための方法１０Ａ
単一アミノ酸のカップリングによる方法
ペプチドは、０．１ｍｍｏｌのＮｏｖａＳｙｎ−ＴＧＲ樹脂（０．２ｍｍｏｌ／ｇ置換）を用いて合成を始めた。次に脱保護（ｉｖＤｄｅ）された樹脂を、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを組み込むためのプロトコルＡに従って処理した。
単一アミノ酸の手動カップリングのためのプロトコルＡ：
１．４当量の対応するＦｍｏｃ−アミノ酸、４．１当量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び４．１当量のＨＯＢ並びに４．１当量のＤＩＣで５時間処理
２．ＤＭＦで洗浄（３×１０ｍＬ）
３．ＤＭＦ中２０％ピペリジンで処理（２×１０ｍＬ、１０分間）
４．ＤＭＦで洗浄（３×１０ｍＬ）
次にＦｍｏｃ−保護ペプチド装填樹脂をＤＭＦ中２０％ピペリジン（２×１０ｍＬ、１０分間）で処理し、ＤＭＦ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。次にＮ，Ｎ−ジメチルグリシン（０．１１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（０．１１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）中溶液をペプチド装填樹脂に添加し、手動カップリングを５時間続けた。反応後、樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）及びＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させた。
１１．Ｔｃへの結合のためのペプチドキレート製造のための方法１０Ｂ
グルタリル−ＰｎＡＯ６キレーターのペプチドへの付加による方法−−４−｛２−（２−ヒドロキシイミノ−１，１−ジメチルプロピルアミノ）−１−［（２−ヒドロキシイミノ−１，１−ジメチル−プロピルアミノ）−メチル］−エチルカルバモイル｝−酪酸，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−化合物Ｂの製造
４−｛２−（２−ヒドロキシイミノ−１，１−ジメチル−プロピルアミノ）−１−［（２−ヒドロキシイミノ−１，１−ジメチル−プロピルアミノ）−メチル］−エチルカルバモイル｝−酪酸（化合物Ａ）（４０ｍｇ）をＤＭＦ（７００μＬ）に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．５当量、１７．２ｍｇ）及び１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（１．５当量、２４μＬ）を加えた。反応の進行は質量分析によってモニタした。１７時間後反応が完了した。揮発性物質を真空下で除去し、残渣をエーテルで洗浄（５回）して未反応ＮＨＳを除去した。残渣を乾燥させて化合物Ｂを得た。これをこれ以上処理も精製もせずにそのまま使用した。
４−｛２−（２−ヒドロキシイミノ−１，１−ジメチルプロピルアミノ）−１−［（２−ヒドロキシイミノ−１，１−ジメチル−プロピルアミノ）−メチル］−エチルカルバモイル｝−酪酸，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−（化合物Ｂ）によるペプチドの官能化
ペプチド（例えば方法１〜１３によって製造）をＤＭＦに溶解し、化合物Ｂ、及び混合物の塩基性を維持するに足るＤＩＥＡで処理した。反応の進行はＨＰＬＣと質量分析によってモニタした。反応の完了後、揮発性物質は真空下で除去し、残渣は、逆相ＨＰＬＣによって精製、又は側鎖保護基の選択的除去によって更に処理、又は合成スキームの次のステップでの要求に応じてあらゆる残存保護基を切断のいずれかであった。
１２．Ｓ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いるメルカプト−アセチル化ペプチド形成のための方法１１
ペプチド（０．００５ｍｍｏｌ、方法１〜５から得られ、遊離アミンを有する）のＤＭＦ（０．２５ｍＬ）中溶液に、Ｓ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＡＴＡ）（０．００５５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を周囲温度で６時間撹拌した。揮発性物質を真空下で除去し、残渣を水中アセトニトリル（いずれも０．１％ＴＦＡ含有）の勾配溶離を用いて分取ＨＰＬＣにより精製した。純生成物含有フラクションを回収し、凍結乾燥してメルカプトアセチル化ペプチドを得た。メルカプトアセチル化ペプチドはＥＳＩ−ＭＳによって特性分析し、純度は水中アセトニトリル（いずれも０．１％ＴＦＡ含有）の直線勾配を用いる逆相ＨＰＬＣ分析により決定した。
１３．Ｓ−アセチルチオグリコール酸を用いるメルカプトアセチル化ペプチド形成のための方法１２
方法５の精製ペプチドを、ジスルフィド環化後、Ｓ−アセチルグリコール酸（１．５〜１０当量）／ＨＯＢｔ（１．５〜１０当量）／ＤＩＣ（１．５〜１０当量）とＮＭＰ中で２〜１６時間、室温でカップリングさせた。次に混合物を分取ＨＰＬＣによって精製し、純ペプチド含有フラクションを一緒に合わせて凍結乾燥させた。ｉｖＤｄｅ基で保護された別のリジンを有する化合物の場合、脱保護反応はＤＭＳＯ中２％ヒドラジンを室温で３時間用いて実施した。反応混合物の精製により純ペプチドを得た。
２個のアミノジオキサオクタン酸基とペプチドに結合したＳ−アセチルチオグリコール酸を有する化合物を製造する場合、方法５の遊離アミノ基を有する精製ペプチドを、ＡｃＳＣＨ２−ＣＯ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ）２−ＯＨ（３０当量）／ＨＯＢｔ（３０当量）／ＤＩＣ（３０当量）にＮＭＰ中で４０時間室温でカップリングさせた。混合物を精製し、ｉｖＤｄｅ基を除去した。第二の精製で最終生成物を白色凍結乾燥物として得た。
あるいは、Ｆｍｏｃアミノジオキサオクタン酸を２回続けてペプチド（方法５によって製造）に結合させ、次いでＦｍｏｃの除去及びＳ−アセチルチオグリコール酸へのカップリングを行うこともできた。
１４．ホモ二量体及びヘテロ二量体製造のための方法１３
必要な精製ペプチドは方法５を用いてＳＰＰＳによって製造した。ホモ二量体を製造するため、二量体の製造に必要なペプチドの半分をＤＭＦに溶解し、１０当量のグルタル酸ビスＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルで処理した。反応の進行はＨＰＬＣ分析と質量分析によってモニタした。反応の完了後、揮発性物質を真空下で除去し、残渣を酢酸エチルで洗浄して未反応のビス−ＮＨＳエステルを除去した。残渣を乾燥させ、無水ＤＭＦに再溶解して、２当量のＤＩＥＡの存在下、もう半分のペプチドで処理した。反応は２４時間進行させた。この混合物をＷａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｃ−１８ ＸＴｅｒｒａ ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに直接かけ、直線的濃度勾配の水中アセトニトリル（いずれも０．１％ＴＦＡ含有）で溶離して精製した。
ヘテロ二量体の場合、モノマーの一つをグルタル酸のビスＮＨＳエステルと反応させ、過剰のビスＮＨＳエステルを洗浄除去した後、第二のアミンをＤＩＥＡの存在下で加えた。反応後、混合物を分取ＨＰＬＣで精製した。
ａ．ＫＤＲ及びＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドの製造
前述の方法を利用して、表１ａのＫＤＲ及びＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドを製造した。表１ａで使用されているペプチド配列中の文字“Ｊ”は、スペーサー又はリンカー基の８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイルのことである。また、表１で使用されている記号“Ｃ＊”はジスルフィド結合に寄与するシステイン残基のことである。ビオチン化ポリペプチドのＫＤＲへの結合能は下記のアッセイを用いて評価した。
以下のビオチン化ペプチドはＫＤＲ発現細胞によく結合した。Ｐ１３−ＸＢ（ＫＤ １．８１ｎＭ ＋／− ０．２７）、Ｐ５−ＸＢ（ＫＤ １４．８７ ＋／− ５．０７ｎＭ、４回の実験の平均）、Ｐ６−ＸＢ（ＫＤ １０．００ ＋／− ２．３６ｎＭ、４回の実験の平均）、Ｐ１２−ＸＢ（ＫＤ ４．０３１ ＋／− ０．８６ｎＭ、３回の実験の平均）、Ｐ６−Ｆ−ＸＢ（ＫＤ ６．９４ ＋／− １．９４ｎＭ、１回の実験）、及びＰ１２−Ｆ−ＸＢ（ＫＤ ３．０２ ＋／− ０．７５ ｎＭ、１回の実験）。
ｂ．ＫＤＲ及びＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体標的に対するライブラリースクリーニング
ＩｇのＦｃ領域とヒトＫＤＲ（＃３５７−ＫＤ−０５０）、マウスＫＤＲ（＃４４３−ＫＤ−０５０）、ヒトＶＥＧＦＲ−１（＃３２１−ＦＬ−０５０）、ヒトＶＥＧＦＲ−３（＃３４９−Ｆ４−０５０）、及びヒトＴｒａｉｌ Ｒ４（＃６３３−ＴＲ−１００）とのキメラ融合体を無担体形（ＢＳＡなし）でＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。Ｔｒａｉｌ Ｒ４ Ｆｃは、標的Ｆｃ融合体（ＫＤＲ Ｆｃ）と同じＦｃ融合領域を持つ無関係のＦｃ融合タンパク質なので、Ｆｃ結合剤のライブラリーを除去するのに使用した。ＶＥＧＦ１６５（＃１００−２０）は無担体形でＰｅｐｒｏｔｅｃｈ（ニュージャージー州ロッキーヒル）から購入した。プロテインＡ磁気ビーズ（＃１００．０２）はＤｙｎａｌ（オスロ、ノルウェー）から購入した。ヘパリン（＃Ｈ−３３９３）はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。２成分テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）系はＫＰＬ（メリーランド州ゲイザーズバーグ）から購入した。
下記の操作において、マイクロタイタープレートはＢｉｏ−Ｔｅｋ ４０４ プレートウォッシャー（バーモント州ウィヌースキ）で洗浄した。ＥＬＩＳＡシグナルはＢｉｏ−Ｔｅｋ プレートリーダー（バーモント州ウィヌースキ）で読んだ。９６ウェルプレートの撹拌はＬａｂＱｕａｋｅシェーカー（Ｌａｂｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，カリフォルニア州バークリー）上で行った。
固定化ＫＤＲ及びＶＥＧＦ／ＫＤＲ標的に対するスクリーニングのために、８個のＭ１３ファージディスプレイライブラリーを用意した。すなわち、環状ペプチドディスプレイライブラリーＴＮ６／ＶＩ、ＴＮ７／ＩＶ、ＴＮ８／ＩＸ、ＴＮ９／ＩＶ、ＴＮ１０／ＩＸ、ＴＮ１２／Ｉ、及びＭＴＮ１３／Ｉ、並びに直鎖ディスプレイライブラリーＬｉｎ２０である。これらのライブラリーの設計は上に記載した。
ライブラリーをコードするＤＮＡは、両側に一定のＤＮＡを用いて合成し、ＤＮＡをＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウェルズリー）を用いてＰＣＲ増幅したり、ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで切断したり、同様に切断されたファージディスプレイベクターに連結できるようにした。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＦＲ’大腸菌細胞は連結ＤＮＡで形質転換した。全ライブラリーとも同様に構築した。
ｃ．ヘパリン存在下におけるＫＤＲ選択プロトコル
プロテインＡ磁気ビーズを１Ｘ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％トゥイーン−２０、０．１％ＨＳＡ（ブロッキング緩衝液）で３０分間、室温で１回ブロックし、次いで１Ｘ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％トゥイーン−２０、５μｇ／ｍＬヘパリン（ＰＢＳＴＨ緩衝液）で５回洗浄した。
環状ペプチド、又は“拘束ループ(constrained loop)”のライブラリーを、最初のスクリーニングのために二つのプールにプールした。すなわち第一のプールにＴＮ６／ＶＩ、ＴＮ７／ＩＶ及びＴＮ８／ＩＸ、第二のプールにＴＮ９／ＩＶ、ＴＮ１０／ＩＸ及びＴＮ１２／Ｉである。プールされた二つのライブラリーと直鎖ライブラリー（Ｌｉｎ２０）を、Ｔｒａｉｌ Ｒ４ Ｆｃ融合体（無関係のＦｃ融合体）に対して除去し、次いでＫＤＲ Ｆｃ融合体に対して選択した。各ライブラリーからＰＢＳＴＨ１００μＬあたり１０１１プラーク形成単位（ｐｆｕ）を一緒にプールした。例えば、３つのプールされたライブラリーは総体積がＰＢＳＴＨ中〜３５０μｌになるであろう。
無関係のＦｃ融合体ビーズを調製するため、５００μｌのＴｒａｉｌ Ｒ４−Ｆｃ融合体（０．１μｇ／μｌ ＰＢＳＴ（ヘパリンなし）中ストック）を１０００μｌの洗浄されブロックされたプロテインＡ磁気ビーズに加えた。融合体を４℃で一晩撹拌しながらビーズに結合させた。翌日、ビーズをＰＢＳＴＨで５回洗浄した。各ファージプールを５０μｌのＴｒａｉｌ Ｒ４ Ｆｃ融合体ビーズとＬａｂｑｕａｋｅシェーカー上、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ファージの上清を除去し、別の５０μＬのＴｒａｉｌ Ｒ４ビーズとインキュベートした。この操作を合計５回繰り返して非特異的Ｆｃ融合体及びビーズ結合ファージをライブラリーから除去した。
ＫＤＲ標的ビーズを調製するため、５００μｌのＫＤＲ−Ｆｃ融合体（０．１μｇ／μＬ ＰＢＳＴ（ヘパリンなし）中ストック）を５００μＬの洗浄されブロックされたビーズに加えた。ＫＤＲ−Ｆｃ融合体を４℃で一晩撹拌しながら結合させた。翌日、ビーズをＰＢＳＴＨで５回洗浄した。それぞれの除去済みライブラリープールを１００μＬのＫＤＲ−Ｆｃビーズに加え、ＬａｂＱｕａｋｅシェーカー上、室温で１時間インキュベートした。次に、磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてビーズをなるべく迅速に５×１ｍＬのＰＢＳＴＨで洗浄し、ビーズと洗浄緩衝液を分離した。洗浄後もビーズと結合しているファージを２５０μｌのＰＢＳＴＨ中ＶＥＧＦ（５０μｇ／ｍＬ、〜１μＭ）で、室温で１時間、ＬａｂＱｕａｋｅシェーカー上で１回溶離した。１時間の溶出液を取り出し保存した。最初の溶離後、ビーズを再度２５０μｌのＶＥＧＦ（５０μｇ／ｍＬ、〜１μＭ）と室温で一晩ＬａｂＱｕａｋｅシェーカー上でインキュベートした。二つのＶＥＧＦ溶出液を別個に保存し、滴定のためにそれぞれから少量ずつ取り出した。各溶出液を一定分量のＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（又はその他のＦ’細胞株）大腸菌細胞（中間対数期まで成長させた後氷上で冷やしたもの）と混合した。ＶＥＧＦ溶離後に残ったビーズも細胞と混合して、ビーズにまだ結合しているファージ、すなわち２回のＶＥＧＦインキュベーション（１時間及び一晩（Ｏ／Ｎ）の溶離）に勝ち残ったＫＤＲ結合ファージを増幅させた。室温で約１５分間放置後、ファージ／細胞混合物を５０μｇ／ｍＬのアンピシリン入りＮＺＣＹＭ寒天２５０ｍＬを含有するＢｉｏ−Ａｓｓａｙ Ｄｉｓｈｅｓ（２４３×２４３×１８ｍｍ、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ）上に広げた。該プレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌日、各増幅ファージ培養物をそれぞれのプレートから採取した。翌日中にインプット、アウトプット及び増幅ファージ培養物をＦＯＩ（すなわちＦｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｐｕｔ＝ファージアウトプット／ファージインプット）について滴定した。
第一のラウンドで、各プールから３個の増幅溶出液を得た。これらの溶出液を、〜１０１０インプットファージ／ラウンドを用い、前述したのと同じプロトコルに従って、さらに２〜３回の選択にかけて選別した。それぞれの追加ラウンドで、ＫＤＲ−Ｆｃビーズはラウンド開始前夜に調製した。次のラウンドの溶離ステップで、増幅された溶出液のＫＤＲ−Ｆｃビーズ上での再スクリーニングは、常に同一様式で溶離され、全てのその他の溶出液は洗液として処理された。例えば、大腸菌に感染させるため、結合されたままのビーズ(still-bound beads)を用いることによって回収された増幅溶出液の場合、１時間及び一晩のＶＥＧＦ溶離が実施され、その後洗液として廃棄された。次にビーズを再度大腸菌感染に用い、次のラウンドの増幅溶出液を作製した。この手順を用いると、各ライブラリープールからは選択終了時に３個の最終溶出液しか得られない。従って、二つのプールと一つの直鎖ライブラリーから、選択終了時に合計９個の最終溶出液を得た。
この選択手順を、全ての結合緩衝液中にヘパリンが存在しない状態で、すなわち全ステップでＰＢＳＴＨをＰＢＳＴ（ＰＢＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％トゥイーン−２０）に換えて、全てのライブラリーについて繰り返した。
ｄ．ヘパリン不在下におけるＫＤＲ選択プロトコル
真のＴＮ１１／１ライブラリーを用いてＫＤＲ結合剤をスクリーニングした。ヘパリンを除外した以外は上記（ヘパリン存在下におけるＫＤＲ選択プロトコル）と同じ選択プロトコルを使用した。三つの溶離条件は、ＶＥＧＦ溶離（１ｕＭ；１時間；元のプロトコルと同じ）、二量体Ｄ６溶離（０．１ｕＭ；１時間）、そしてビーズ溶離（上記と同じ）であった。選択及びスクリーニングにはＴＮ１１／１のみを使用した。選択されたペプチドに関しては［図４０Ａ〜４０Ｒ］参照。
実施例２
ファージディスプレイによって同定されたペプチドのＫＤＲ発現細胞を結合する能力を確認するためのビーズ結合アッセイ
以下の実験は、ＫＤＲ結合ペプチドの、ＫＤＲ発現細胞への結合能を評価するために実施した。本実験では、ＫＤＲ結合ペプチドのＰ５−Ｂ及びＰ５−ＸＢ並びにＰ６−Ｂ及びＰ６−ＸＢを蛍光ビーズに結合させて、ＫＤＲ発現２９３Ｈ細胞に結合するそれらの能力を評価した。実験から、どちらのペプチド配列もビーズのような粒子をＫＤＲ発現部位に結合させるのに使用できることが示されている。一般的に、Ｐ６ペプチドのほうがＰ５よりもＫＤＲ発現細胞への良好な結合を示した。しかしながら、両ペプチドの結合ともスペーサーを加えることで改良された。
１．抗ＫＤＲ抗体のビオチン化
Ｓｉｇｍａ社の抗ＫＤＲ（Ｖ−９１３４）（腹水として）を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社のキット（Ｆ−６３４７）を用い、製造業者の説明書に従ってビオチン化した。
ペプチド結合蛍光ビーズの調製
各ビオチン化ペプチドの０．２ｍＭストック溶液０．１ｍＬ（上記のようにして製造、５０％ＤＭＳＯ中）を、０．１ｍＬのニュートラアビジン被覆赤色蛍光微小球（直径２ミクロン、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社の特注品）及び０．２ｍＬの５０ｍＭ ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｍ−８２５０）緩衝液（ｐＨ６．０）と回転器上、室温で１時間インキュベートした。陽性対照として、ビオチン化抗ＫＤＲ抗体を上記のようにニュートラアビジン被覆ビーズとインキュベートした。この場合、ペプチド溶液ではなくＰＢＳ中ビオチン化抗体調製物０．０３ｍｇ（Ｇｉｂｃｏ １４１９０−１３６）を使用した。ビーズは必要になるまで最長１週間４℃で保存可能である。
２．２９３Ｈ細胞のトランスフェクション
実施例６に記載のプロトコルを用いて２９３Ｈ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションは、黒／透明９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃ ３５４６４０）で実施した。プレートの半分（４８ウェル）の細胞は偽トランスフェクト（ＤＮＡなし）で、プレートのもう半分の細胞にＫＤＲのｃＤＮＡをトランスフェクトした。細胞はトランスフェクション時８０〜９０％のコンフルエント状態であったが、翌日のアッセイ時には完全コンフルエント状態であった。そうでなければアッセイは中止された。
３．結合アッセイ
上記ビーズ調製物から０．１２ｍＬを取り、マイクロ遠心機中、室温で１０分間２０００ｒｐｍで遠心した。上清を除去し、０．０６ｍＬのＭＥＳ（ｐＨ６．０）を加えた。次に、各ビーズ溶液を水浴中で１５分間、渦撹拌及び超音波処理した。１．４７ｍＬのＤＭＥＭ、高グルコース（ＧＩＢＣＯ １１９６５−０８４）＋１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＮＥＡＡ）（ＧＩＢＣＯ １１１４０−０５０）及び４０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３００７０．０２）に、０．０３ｍＬの超音波処理ビーズ調製物を加えた。偽トランスフェクト２９３Ｈ細胞をカラム１〜６に、ＫＤＲトランスフェクト細胞をカラム７〜１２に播種された９６ウェルプレート（前述の通り）を排水し、ＤＭＥＭ、高グルコース＋１×ＮＥＡＡ及び４０％ＦＢＳで１回洗浄した。各ウェルに０．１ｍＬのビーズ溶液を、一つのビーズ調製物につき６個のウェルに加えた。室温で３０分間インキュベートした後、プレートを逆さまにしてウェルから排水し、０．１ｍＬのＰＢＳ（Ｃａ＋＋Ｍｇ＋＋入り）（ＧＩＢＣＯ １４０４０−１１７）で４回洗浄した。洗浄は各回５分間ずつ振盪しながら室温で実施した。排水後、ウェルあたり０．１ｍＬのＰＢＳを加えた。次にプレートをＰａｃｋａｒｄ ＦｌｕｏｒｏＣｏｕｎｔフルオロメータで励起５５０ｎｍ／発光６２０ｎｍで読んだ。非結合ニュートラアビジンビーズを陰性対照として使用した。ビオチン化抗ＫＤＲ抗体と結合させたビーズはアッセイの陽性対照として使用した。
ウェルあたりの結合ビーズ数を算出するために、同じ蛍光ビーズの数を増やしていく標準曲線を各アッセイプレートに含めた。この標準曲線を用いて、各ウェルの蛍光強度に基づき、ウェルあたりの結合ビーズ数を計算した。
図１に示されているように、抗ＫＤＲを結合させた陽性対照ビーズは明らかにＫＤＲ発現細胞に優先的に結合したが、何も結合していないアビジンビーズはどちらの細胞タイプにも結合しなかった。ビオチン化Ｐ５ビーズは、偽トランスフェクト細胞よりも著しく多くＫＤＲトランスフェクト細胞に結合したわけではなかったが、ペプチド部分とビオチン基の間に親水性スペーサーを加えると、偽トランスフェクト細胞への結合は増加せず、ＫＤＲ細胞への結合が増加した。ビオチン化Ｐ６ビーズはＫＤＲトランスフェクト細胞への結合がもっと大きかった。Ｐ５の場合と同様、分子のペプチド部分とビオチンの間に親水性スペーサーを加えると、トランスフェクト細胞のＫＤＲへの特異的結合が著しく改良された。このように、Ｐ５及びＰ６のペプチド配列とも、ビーズのような粒子をＫＤＲ発現部位に結合させるのに使用できる。
実施例３
ＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合に対するＫＤＲ結合ペプチドと１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦの競合
以下の実験で、トランスフェクト２９３Ｈ細胞が発現しているＫＤＲへの結合をめぐって１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦと競合するＫＤＲ結合ペプチドの能力を評価する。ＫＤＲ結合ポリペプチドのＰ４は１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦと著しく競合することはなかったが、Ｐ５−ＸＢ、Ｐ６及びＰ１２−ＸＢは１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦと非常によく競合して、１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦ結合を９６．２９±２．９７％及び１０４．４８±２．０７％阻害した。
１．２９３Ｈ細胞のトランスフェクション
実施例６に記載のプロトコルを用いて２９３Ｈ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションは、黒／透明９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃ ３５４６４０）で実施した。プレートの半分（４８ウェル）の細胞は偽トランスフェクト（ＤＮＡなし）で、プレートのもう半分の細胞にＫＤＲのｃＤＮＡをトランスフェクトした。細胞はトランスフェクション時８０〜９０％のコンフルエント状態であったが、翌日のアッセイ時には完全コンフルエント状態であった。そうでなければアッセイは中止された。
２．Ｍ１９９培地の調製
アッセイ用のＭ１９９培地を調製するために、一つのＭ１９９培地パケット（ＧＩＢＣＯ、カタログ＃ ３１１００−０３５）、２０ｍＬの１ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ、カタログ＃１５６３０−０８０）、及び２ｇのＤＩＦＣＯゼラチン（ＤＩＦＣＯ、カタログ＃ ０１４３−１５−１）を９５０ｍＬの二重蒸留（ｄｄ）Ｈ２Ｏに加え、溶液のｐＨを約４ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨを加えることによって７．４に調整した。ｐＨ調整後、Ｍ１９９培地を水浴中３７℃で２時間温め、ゼラチンを溶解し、次いで０．２μｍフィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ＃ ４３１０９）を用いてフィルタ滅菌し、後にアッセイで使用するために４℃で保存した。
３．ペプチド溶液の調製
ペプチドＰ６、Ｐ４、Ｐ５−ＸＢ、及びＰ１２−ＸＢ（前述のように製造）の５０％ＤＭＳＯ中３ｍＭのストック溶液を調製した。
４．アッセイのための １２５ Ｉ−標識ＶＥＧＦ溶液の調製
２５μＣｉの凍結乾燥１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ＃ ＩＭ２７４）を２５０μＬのｄｄＨ２Ｏで再構成（還元）してストック溶液を作製し、これを後に使用するために−８０℃で保存した。各アッセイのために、３００ｐＭの１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦ溶液を上記ストック溶液をＭ１９９培地中に希釈することによって新たに作製した。１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦの濃度は、当日の材料の比放射能に基づいて毎日計算した。
５．３００ｐＭの １２５ Ｉ−標識ＶＥＧＦ中３０μＭ及び０．３μＭペプチド溶液の調製
各９６ウェルプレートに対し、Ｍ１９９培地中３００ｐＭの１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦ１０ｍＬを４℃で調製した。各ペプチド溶液（３ｍＭ、上記のように調製）を、３００ｐＭの１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦ入りＭ１９９培地３００μＬ中で１：１００及び１：１００００に希釈して、３００ｐＭの１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦを含有する３０μＭ及び０．３μＭペプチド溶液を調製した。調製したら溶液は使用の準備が整うまで氷上に保存した。３００ｐＭの１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦ含有Ｍ１９９培地中のペプチドの希釈は各実験ごとに新たに行った。
６．２９３Ｈ細胞における １２５ Ｉ−標識ＶＥＧＦとの競合を検出するためのアッセイ
細胞はトランスフェクションの２４時間後に使用し、アッセイ用細胞を準備するために細胞を室温のＭ１９９培地で３回洗浄し、冷蔵庫に入れた。１５分後、Ｍ１９９培地をプレートから除去し、Ｍ１９９培地中３００ｐＭの１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦ７５μＬ（上記のように調製）で置き換えた。各希釈液を偽及びＫＤＲトランスフェクト細胞の３個の別個のウェルに加えた。４℃で２時間インキュベートした後、プレートを冷結合緩衝液で５回洗浄し、そっと水分を吸い取って顕微鏡下で細胞消失についてチェックした。１００μＬの可溶化溶液（２％トリトンＸ−１００、１０％グリセロール、０．１％ＢＳＡ）を各ウェルに加え、プレートを室温で３０分間インキュベートした。各ウェル中の可溶化溶液をピペットで上下して混合し、１．２ｍＬ管に移した。各ウェルを１００μＬの可溶化溶液で２回洗浄し、洗液を対応する１．２ｍＬ管に加えた。次に各１．２ｍＬ管をＬＫＢガンマカウンタでカウントする（１２５Ｉウィンドウで１分間）ために１５．７ｍｍ×１０ｃｍの管に移した。
７．２９３Ｈ細胞における １２５ Ｉ−標識ＶＥＧＦとペプチドの競合
ＫＤＲ結合ペプチドＰ６、Ｐ４、Ｐ５−ＸＢ、及びＰ１２−ＸＢの、１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦのＫＤＲへの結合を特異的に遮断する能力を偽トランスフェクト及びＫＤＲトランスフェクト細胞で評価した。Ｐ４はアッセイで陰性対照として使用した。Ｐ４が選ばれた理由は、ＦＰアッセイでＫＤＲへの結合不良を示したため、ＶＥＧＦを置換又は競合しないだろうと期待されたためである。ＫＤＲへの特異的結合を計算するために、１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦの偽トランスフェクト細胞への結合をＫＤＲトランスフェクト細胞から差し引いた。従って、ＫＤＲ以外の部位（２９３Ｈ細胞に存在するかもしれないし存在しないかもしれない）への１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦの結合は、ＫＤＲ結合ペプチドによる１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦの２９３Ｈ細胞への結合の阻害を計算する場合、含まれていない。
図２に、二つの異なる濃度（３０μＭ及び０．３μＭ）のペプチド（Ｐ６、Ｐ４、Ｐ５−ＸＢ、及びＰ１２−ＸＢ）による、１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦのＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合の阻害率を示す。阻害率は式［（Ｙ１−Ｙ２）×１００／Ｙ１］を用いて計算した。式中、Ｙ１はペプチド不在下におけるＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への特異的結合、Ｙ２はペプチド又はＤＭＳＯ（ビヒクル）存在下におけるＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への特異的結合である。ＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への特異的結合は、ＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合から偽トランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合を差し引くことによって計算した。Ｐ６、Ｐ４及びＰ５−ＸＢの結果は３回の実験の平均±ＳＤであるが、Ｐ１２−ＸＢの結果は１回の実験による。
図２に示されているように、Ｐ４は、その比較的高いＫＤのため（＞２μＭ、ＦＰによってＫＤＲ−Ｆｃに対して測定）陰性対照として使用されたが、１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦと著しく競合せず、３０μＭで１２．６９±７．１８％及び０．３μＭで−５．４５±９．３７％であった（図２）。同時にＰ６及びＰ１２−ＸＢは１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦと非常によく競合し、それぞれ３０μＭで９６．２９±２．９７％及び１０４．４８±２．０７％、０．３μＭで５２．２７±３．７８％及び８０．９６±３．８％の１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦの結合を阻害した。Ｐ５−ＸＢによる阻害率は、３０μＭで１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦ結合の４７．９５±５．０９％、０．３μＭで２４．４１±８．４３％であった（図２）。このように、予想通り、ＫＤＲと良く結合しないペプチドはＶＥＧＦ結合を遮断しなかったが、他の三つのＫＤＲ結合ペプチドはＶＥＧＦと確かに競合し、それらの効力はそれらの結合親和性に従って増大した。このアッセイは、ＫＤＲには固く結合するがＶＥＧＦと競合しないペプチドを識別するのにも有用なはずである。この状況は、そうでなければＫＤＲ標的分子の結合を遮断するであろうＶＥＧＦの局所濃度が高いことが多い腫瘍内のＫＤＲを画像化するのに有用となりうる特徴である。
実施例４
ファージディスプレイによって同定されたペプチドによるＶＥＧＦ誘導ＫＤＲ受容体活性化の阻害
ファージディスプレイによって同定されたＫＤＲ結合ペプチドの、ＶＥＧＦにより誘導されるＫＤＲの活性化（リン酸化）を阻害する能力を以下のアッセイを用いて評価した。本発明のいくつかのペプチドは、Ｐ５−Ｄ、Ｐ６−Ｄ、Ｐ１０−Ｄ及びＰ１１−Ｄを含む単量体及び／又は四量体構築物でＫＤＲの活性化を阻害することが示された。前述のように、ＫＤＲの活性化を阻害するペプチドは抗血管新生薬として有用であり得る。
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ カタログ番号ＣＣ−２５１９）をドライアイス上で凍結させた状態で入手し、解凍するまで液体窒素中で保存した。これらの細胞を解凍し、継代し、製造業者の記載に従ってＥＧＭ−ＭＶ培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ カタログ番号ＣＣ−３１２５）中で維持した。１００ｍｍ皿に播種された細胞はコンフルエントになるまで放置された後、血清を含まない基本ＥＢＭ培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ カタログ番号ＣＣ−３１２１）中で一晩培養した。翌朝、皿の培地を、無添加（陰性対照）、５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ カタログ番号６７６４７２又はＰｅｐｒｏｔｅｃｈ カタログ番号１００−２０）（陽性対照）、又は５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ＋示された濃度のＫＤＲ結合ペプチド（前述のようにして調製）を含有する１０ｍＬの新鮮なＥＢＭ培地（３７℃）で置き換えた。場合により、中和抗ＫＤＲ抗体（カタログ番号ＡＦ３５７，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を陽性対照の活性阻害薬として使用した。そのような場合、抗体は試験細胞と３７℃で３０分間プレインキュベートしてから、ＶＥＧＦ及び抗体の両方を含有する新鮮培地に添加した。皿を３７℃の組織培養インキュベータで５分間インキュベートした後、カルシウム及びマグネシウムを含有する氷冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で３回洗浄し、最後の１０ｍＬのＤ−ＰＢＳは取り除かずに残したまま氷上に置いた。セットの第一の皿を排水し、０．５ｍＬのトリトン溶解（リーシス）緩衝液（２０ｍＭのトリス塩基ｐＨ８．０、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００、２ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＦ、５０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１０μｇ／ｍＬのロイペプチン、１０μｇ／ｍＬのアプロチニン）を加えた。細胞は、細胞スクレイパー（Ｆａｌｃｏｎ，カタログ番号３５３０８７）を用いて迅速に掻き取って溶解緩衝液に入れ、ピペットで短時間上下して分散させ、そして得られた溶解物（ライセート）を、排水されたペアの第二の皿に移した。別の０．５ｍＬの溶解緩衝液を用いて第一の皿をすすぎ、第二の皿に移した。それをまた掻き取って分散させた。２個の皿からプールされた溶解物を１．５ｍＬのエピンドルフ(Eppindorf)管に移した。上記手順をそれぞれの対照及び試験サンプル（ＫＤＲ結合ペプチド）に対して一つずつ繰り返した。溶解物は全サンプルが処理されるまで氷上に保存した。この時点で、サンプルは−７０℃で保存することにするか、又は中断せずにアッセイの最後まで処理するかのいずれかであった。
溶解物は、新たに調製したものであれ凍結解凍したものであれ、２０μＬのプロテインＡ−セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ ３３９１、Ｄ−ＰＢＳ中で予備膨潤）を加えることによって予め清澄化し、大過剰のＤ−ＰＢＳで３回洗浄し、６ｍＬのＤ−ＰＢＳで再構成（還元）して５０％スラリーとし、４℃で３０分間揺動させた。ビーズは、Ｐｉｃｏｆｕｇｅ（Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ，カタログ番号４００５５０)中で２分間２０００×ｇで遠心分離してペレット化し、上清を新しい１．５ｍＬ管に移した。２０μｇの抗−Ｆｌｋ−１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，カタログ番号ｓｃ−５０４）を各管に加え、それらの管を一晩（１６〜１８時間）４℃で回転器上でインキュベートしてＫＤＲを免疫沈降させた。翌日、４０μＬのプロテインＡ−セファロースビーズを管に加え、それを４℃で１時間、回転器上でインキュベートした。その後各管のビーズはＰｉｃｏｆｕｇｅ中で２分間遠心分離することによって３回洗浄し、上清を廃棄し、ビーズを１ｍＬの新たに加えたＴＢＳＴ緩衝液（２０ｍＭのトリス塩基ｐＨ７．５、１３７ｍＭのＮａＣｌ、及び０．１％のトゥイーン２０）中に分散させた。遠心分離と最後の洗浄の液体を除いた後、４０μＬのＬａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，カタログ番号１６１−０７３７）を各管に加え、管に蓋をして５分間沸騰させた。冷却後、各管のビーズを遠心分離によってペレット化し、免疫沈降ＫＤＲを含有する上清を新しい管に移して、直ちに使用するか又は後の分析のために凍結し−７０℃で保存した。
免疫沈降物中のリン酸化ＫＤＲ並びに総ＫＤＲの検出はイムノブロット分析によって実施した。各免疫沈降物の半分（２０μＬ）をＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ“バクテリオファージＴ４の頭部アセンブリ時の構造タンパク質の切断(Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4)”Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）；２２７，６８０−６８５）に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥにより７．５％プレキャストＲｅａｄｙ Ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，カタログ番号１６１−１１５４）上で分解した。
Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のミニ−Ｐｒｏｔｅａｎ ３ 装置（カタログ番号１６５−３３０２）を用いた。各ゲル中の分解タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１６２−０１７４）に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のミニＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔセル（カタログ番号１７０−３９３０）中、ＣＡＰＳ緩衝液（１０ｍＭのＣＡＰＳ，Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｃ−６０７０，１％ＡＣＳ級メタノール、ｐＨ１１．０）中で２時間１４０ｍＡでＭａｔｓｕｄａｉｒａの方法（Ｐ．Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ．“ポリビニリデンジフルオリド膜上に電気泳動的転写されたピコモル量のタンパク質の配列(Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidine diflouride membranes)”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８７）；２６２，１００３５−１００３８）に従って電気泳動的転写した。ブロットを、３７℃に予め温めた５％Ｂｌｏｔｔｏ−ＴＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ カタログ番号３７５３０）中、室温で２時間ブロックした。ブロットはまず、室温で２時間、０．１％トゥイーン２０を加えた５％Ｂｌｏｔｔｏ−ＴＢＳ中で１：２００に希釈された抗ホスホチロシン抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｓ，カタログ番号Ｐ１１１２０）でプローブ検査された。非結合抗体はブロットを０．１％トゥイーン２０を含有するＤ−ＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳＴ）で４回、各回５分ずつ洗浄することによって除去した。次にブロットは、室温で１時間、０．１％トゥイーン２０を加えた５％Ｂｌｏｔｔｏ−ＴＢＳ中で１：２５，０００に希釈されたＨＲＰ結合ヒツジ抗マウス抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ カタログ番号ＮＡ９３１）でプローブ検査され、Ｄ−ＰＢＳＴで４回洗浄された。最後にブロットを、上に散布した２ｍＬの化学発光基質（ＥＣＬ Ｐｌｕｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ カタログ番号ＲＰＮ２１３２）と２分間インキュベートし、よくドリップ排水し、プラスチックシートプロテクタ（Ｃ−Ｌｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，カタログ番号６２０３８）に入れ、そしてＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ ＭＬ，カタログ番号１１３９４３５）に最適のコントラストを達成するために様々な長さの時間暴露した。
アッセイで類似量のＫＤＲが比較されていることを確認するために、ブロットを、ｐＨをＨＣｌで２．４に調整したＴＢＳＴ中で３０分間３７℃でインキュベートすることによって剥がし、０．１％トゥイーン２０入りの５％Ｂｌｏｔｔｏ−ＴＢＳ（Ｂｌｏｔｔｏ−ＴＢＳＴ）で１時間室温でブロックし、そして１％正常ヤギ血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ、カタログ番号１６２１００６４）入りの５％Ｂｌｏｔｔｏ−ＴＢＳＴ中１：２００の抗−Ｆｌｋ−１ポリクローナル抗体（カタログ番号ｓｃ−３１５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で再プローブ検査した。非結合抗体はブロットをＤ−ＰＢＳＴで４回、各回５分ずつ洗浄することによって除去した。次にブロットは、室温で１時間、５％Ｂｌｏｔｔｏ−ＴＢＳ中で１：１０，０００に希釈されたＨＲＰ結合ロバ抗ウサギ二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ カタログ番号ＮＡ９３４）でプローブ検査され、Ｄ−ＰＢＳＴで４回洗浄された。最後にブロットを、２ｍＬの化学発光基質とインキュベートし、前述のようにＸ線フィルムに暴露した。
ＨＵＶＥＣから、事前のＶＥＧＦ刺激がある場合とない場合で調製されたＫＤＲ免疫沈降物のイムノブロット（図３に示されている）は、ＨＵＶＥＣをＶＥＧＦで刺激した場合に活性化（リン酸化）ＫＤＲが検出できたことを示している。抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ−２０）は、刺激されていないＨＵＶＥＣからＫＤＲが泳動した位置付近にリン酸化タンパク質をブロット上に検出しなかったが、５分間のＶＥＧＦ刺激後は強いバンドが予想位置に常に観察された（図３、上図）。酸性溶液中でのインキュベーションによってブロットから結合抗体を除去し、抗ＫＤＲ抗体（ｓｃ−３１５）で再プローブ検査したところ、リン酸化タンパク質バンドのアイデンティティはＫＤＲであることが確認された。さらに、非刺激ＨＵＶＥＣ由来の免疫沈降物はＶＥＧＦ刺激ＨＵＶＥＣ由来の免疫沈降物とほぼ同じ総ＫＤＲを含有することが観察された（図３、下図）。
検出されたリン酸化ＫＤＲは、ＶＥＧＦ結合によって得られるＫＤＲ二量体の自己リン酸化を通じて既存のＫＤＲから形成されたと結論づけるのが合理的である。なぜならば、ＫＤＲのような大きいグリコシル化細胞表面受容体を合成及び処理するには５分間では足りないからである。
ＶＥＧＦによるＫＤＲの活性化を遮断できる薬剤を検出するアッセイの能力は、ＶＥＧＦと組み合わせたＨＵＶＥＣに一連の化合物を加え、前述のイムノブロットアッセイを用いてＫＤＲのリン酸化を測定することによって評価した。陰性及び陽性対照として、あらゆる試験化合物不在下での非刺激ＨＵＶＥＣ由来及びＶＥＧＦで刺激されたＨＵＶＥＣ由来の免疫沈降物も各アッセイで試験した。中和抗ＫＤＲ抗体（カタログ番号ＡＦ−３５７，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＶＥＧＦと組み合わせると、ＫＤＲリン酸化の程度は大きく低下し（図４、上図）、抗体が、ＶＥＧＦのＫＤＲへの結合及び活性化能力を妨害できることを示していた。ＶＥＧＦ誘導性のＤＮＡ合成を遮断する抗体の能力は、製造業者の抗体品質管理試験の一部なので、この結果は予想されたことである。抗ＫＤＲ抗体でブロットを再プローブ検査すると（図４、下図）、ＶＥＧＦ＋抗体処理レーン（＋Ｖ＋α−ＫＤＲ）に存在する総ＫＤＲはＶＥＧＦのみ処理レーン（＋Ｖ）と比べてわずかに少ないことが示されたが、その差は抗体処理レーンにはリン酸化ＫＤＲがずっと少ないことを説明するほど大きくはなかった。
ファージディスプレイで同定されたＫＤＲ結合ペプチド（Ｐ１０−Ｄ）の効力を評価するために、Ｐ１０−Ｄを用いて実験をＶＥＧＦの存在下で繰り返した。Ｐ１０−ＤはＶＥＧＦが誘導するＫＤＲのリン酸化を大きく阻害できた。総ＫＤＲを求めるためのブロットの再プローブ検査で、ＶＥＧＦ＋Ｐ１０−Ｄ処理細胞（＋Ｖ＋Ｐ１０−Ｄ）における総ＫＤＲはＶＥＧＦのみ処理細胞（＋Ｖ）より多いとさえ言えることが示された（図５、下図）。従って、Ｐ１０−Ｄの存在下でのＫＤＲのリン酸化の減少は、サンプル装填量の差によるものではなく、ＶＥＧＦによるＫＤＲの活性化を阻害する化合物の能力によるものであることが明らかである。
本実施例の方法を用いて、下記ペプチドが１０μＭでＶＥＧＦ誘導性ＫＤＲリン酸化を少なくとも５０％阻害することが示された。
Ｐ２−Ｄ、Ｐ３−Ｄ、Ｐ６−Ｄ、Ｐ７−Ｅ、Ｐ８−Ｄ、Ｐ９−Ｄ、Ｐ１０−Ｄ、Ｐ１１−Ｄ
Ｐ２及びＰ６がアッセイでは最も強力な化合物で、１μＭでＶＥＧＦ誘導性ＫＤＲリン酸化を少なくとも５０％阻害できた。
下記ペプチドはアッセイで試験したが、１０μＭでＫＤＲ活性化の顕著な阻害を起こさなかった。
Ｐ５−Ｅ、Ｐ１４−Ｄ、Ｐ１５−Ｄ、Ｐ１６−Ｄ、Ｐ１７−Ｄ、Ｐ１８−Ｅ、Ｐ１９−Ｅ、Ｐ２０−Ｅ、Ｐ２１−Ｅ、Ｐ２３−Ｄ
さらに、Ｐ６−ＸＢ又はＰ１２−ＸＢのビオチン化誘導体の四量体複合体（前述のようにして調製、下記実施例６で解説）は、１０ｎＭでＶＥＧＦ誘導性ＫＤＲリン酸化を少なくとも５０％阻害した。
実施例５
Ｔｃ標識ポリペプチドのＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合
本実施例では、Ｔｃ標識Ｐ１２−ＣのＫＤＲを結合する能力をＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞を用いて評価した。結果は、Ｔｃ標識Ｐ１２−ＣはＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞に偽トランスフェクト２９３Ｈ細胞よりも著しく良く結合し、結合はＴｃ標識ポリペプチドの濃度に従って直線的に増加した。
１．Ｔｃへの結合のためのペプチドキレート（Ｐ１２−Ｃ）のＳＰＰＳによる製造
２５０ｍＬのＳＰＰＳ反応容器に６．６４ｍｍｏｌのＨ−Ｇｌｙ−２−Ｃｌ−トリチル樹脂（０．８４ｍｍｏｌ／ｇ，Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）を加えた。それを８０ｍＬのＤＭＦ中で１時間膨潤させた。各カップリングサイクルのために、２６．６ｍｍｏｌのＤＩＥＡ、２６．６ｍｍｏｌのＤＭＦ中Ｆｍｏｃ−アミノ酸（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２６．６ｍｍｏｌのＤＭＦ中ＨＯＢＴ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、及び２６．６ｍｍｏｌのＤＩＣを樹脂に加えた。ＤＭＦの総容量は８０ｍＬであった。反応混合物を４時間振盪した。次いで樹脂をろ過し、ＤＭＦ（３×８０ｍＬ）で洗浄した。ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液（８０ｍＬ）を樹脂に加え、１０分間振盪した。樹脂をろ過し、このピペリジン処理を繰り返した。最後に樹脂をＤＭＦ（３×８０ｍＬ）で洗浄し、次のカップリングサイクルの準備が整った。最後のカップリングサイクル時、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（Ａｌｄｒｉｃｈ）をＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ活性化を用いてカップリングした。そこで、ＤＭＦ中Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン懸濁液（２６．６ｍｍｏｌ）に、２６．６ｍｍｏｌのＨＡＴＵ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＤＭＦ中溶液及び５３．１ｍｍｏｌのＤＩＥＡを加えた。透明溶液を樹脂に加え、１６時間振盪した。合成後、樹脂をろ過し、ＤＭＦ（３×８０ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（３×８０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させた。樹脂を８０ｍＬのＡｃＯＨ／ＣＦ３ＣＨ２ＯＨ／ＤＣＭ（１／１／８、ｖ／ｖ／ｖ）と混合し、４５分間振盪した。樹脂をろ過し、ろ液を蒸発させてペーストにした。２５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭを用いるシリカゲルクロマトグラフィーによる粗製物質の精製で、２．０ｇの最終生成物を得た。
２．ペプチドキレート（Ｐ１２−Ｃ）のペプチドへのカップリング（フラグメントカップリング）
精製Ｍｅ２Ｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＯＨ−とヒドロキシベンゾトリアゾール（０．００５５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．２５ｍＬ）中混合物に、ジイソプロピルカルボジイミド（０．００５５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で６時間撹拌した。次にＤＭＦ（０．２５ｍＬ）中ペプチド（０．００５ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、撹拌をさらに６時間続けた。ＤＭＦを真空下で除去し、残渣を試薬Ｂで処理して３時間撹拌した。ＴＦＡを減圧下で除去し、残渣を０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル−水を用いる分取ＨＰＬＣによって精製した。純生成物含有フラクションを回収し、凍結乾燥してペプチドを得た。該ペプチドはＥＳ−ＭＳによって特性分析し、純度は逆相ＨＰＬＣ（アセトニトリル−水／０．１％ＴＦＡ）勾配によって測定した。
３． ９９ｍ Ｔｃ−標識ペプチドの合成
グルコン酸第一スズ溶液を、窒素パージした１ＮのＨＣｌ中２０μｇ／ｍＬのＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ溶液２ｍＬを１３ｍｇのグルコヘプトン酸ナトリウムを含有する窒素パージ水１．０ｍＬに加えることによって製造した。４ｍＬの自動サンプル採取バイアルに、５０／５０のエタノール／Ｈ２Ｏに溶解した２０〜４０μＬ（２０〜４０μｇ）のＰ１２−Ｃリガンド、生理食塩水中６〜１２ｍＣｉの９９ｍＴｃＯ４ -及び１００μＬのグルコヘプトン酸第一スズ溶液を加えた。混合物を１００℃で２２分間加熱した。得られた放射化学的純度（ＲＣＰ）は、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８ペプチド及びタンパク質カラムを用い、それを流速１ｍＬ／分で６６％Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）／３４％ＡＣＮ（０．０８５％ＴＦＡ）で溶離して分析したところ１０〜４７％であった。反応混合物は、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）上ＨＰＬＣにより、流速１ｍＬ／分で水性相として０．１％ＴＦＡ含有水及び有機相として０．０８５％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用いて精製した。以下の勾配を用いた。２９．５％有機相を３５分間、５分間かけて８５％有機相にまで上げ、そして１０分間保持。９９ｍＴｃ−Ｐ１２−Ｃ（もはやＡＣＭ保護基は含有しない）を含有するフラクションを、５０ｍＭのリン酸緩衝液中に５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸及び１６ｍｇ／ｍＬのヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンを含有する安定化緩衝液５００μＬ中に回収した。混合物を遠心蒸発器を用いて濃縮してアセトニトリルを除去し、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５）中０．１％ＨＳＡ ２００μＬを加えた。得られた生成物のＲＣＰは１００％であった。動物への注射前に化合物は生理食塩水で所望の放射濃度に希釈された。
４．２９３Ｈ細胞のトランスフェクション
アビジンＨＲＰ実施例に記載のプロトコルを用いて２９３Ｈ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションは、黒／透明９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃ ３５４６４０）で実施した。プレートの半分（４８ウェル）の細胞は偽トランスフェクト（ＤＮＡなし）で、プレートのもう半分の細胞にＫＤＲのｃＤＮＡをトランスフェクトした。細胞はトランスフェクション時８０〜９０％のコンフルエント状態であったが、翌日のアッセイ時には完全コンフルエント状態であった。そうでなければアッセイは中止された。
５．０．１％ＨＳＡ入りｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地の調製
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ＃ １１０５８−０２１）から入手し、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）はＳｉｇｍａ（カタログ＃ Ａ−３７８２）から入手した。０．１％ＨＳＡ入りｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地を調製するために、０．１％ ｗ／ｖ ＨＳＡをｏｐｔｉ−ＭＥＭＩに加え、室温で２０分間撹拌し、次いで０．２μＭフィルタを用いてろ過滅菌した。
６．アッセイ用 ９９ｍ Ｔｃ−標識ペプチド希釈液の調製
９９ｍＴｃ標識Ｐ１２−Ｃ（１１７μＣｉ／ｍＬ）のストック溶液を０．１％ＨＳＡ入りｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ中で１：１００、１：５０、１：２５及び１：１０に希釈し、最終濃度１．１７、２．３４、４．６８及び１１．７μＣｉ／ｍＬのＴｃ標識Ｐ１２−Ｃの溶液を得た。
７． ９９ｍ Ｔｃ−標識ペプチドの結合を検出するためのアッセイ
細胞はトランスフェクションの２４時間後に使用し、アッセイ用細胞を準備するために細胞を室温の０．１％ＨＳＡ入りｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ １００μＬで１回洗浄した。洗浄後、０．１％ＨＳＡ入りｏｐｔｉ−ＭＥＭＩをプレートから除去し、７０μＬの１．１７、２．３４、４．６８及び１１．７μＣｉ／ｍＬの９９ｍＴｃ標識Ｐ１２−Ｃ（上記のように調製）と取り替えた。各希釈液を偽及びＫＤＲトランスフェクト細胞の３個の別個のウェルに加えた。室温で１時間インキュベートした後、プレートを４℃に１５分間移し、そして１００μＬの冷結合緩衝液（０．１％ＨＳＡ入りｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ）で５回洗浄し、そっと水分を吸い取って顕微鏡下で細胞消失についてチェックした。１００μＬの分量の可溶化溶液（２％トリトンＸ−１００、１０％グリセロール、０．１％ＢＳＡ）を各ウェルに加え、プレートを３７℃で１０分間インキュベートした。各ウェル中の可溶化溶液をピペットで上下して混合し、得られた溶液を１．２ｍＬ管に移した。各ウェルを１００μＬの可溶化溶液で１回洗浄し、洗液を対応する１．２ｍＬ管に加えた。次に各１．２ｍＬ管をＬＫＢガンマカウンタでカウントする（９９ｍＴｃウィンドウで２０秒間）ために１５．７ｍｍ×１００ｃｍの管に移した。
８． ９９ｍ Ｔｃ−標識ペプチドのＫＤＲトランスフェクト細胞への結合
９９ｍＴｃ標識Ｐ１２−ＣのＫＤＲに特異的に結合する能力を一過性トランスフェクト２９３Ｈ細胞を用いて示した。図６に示すように、９９ｍＴｃ標識Ｐ１２−Ｃは、偽トランスフェクト２９３Ｈ細胞に比べてＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞に著しく良く結合した。ＫＤＲへの特異的結合を計算するために、９９ｍＴｃ標識Ｐ１２−Ｃの偽トランスフェクト細胞への結合をＫＤＲトランスフェクト細胞への結合から差し引いた。図７に示すように、９９ｍＴｃ標識Ｐ１２−ＣのＫＤＲへの特異的結合が９９ｍＴｃ標識Ｐ１２−Ｃの濃度の増加とともに直線的に増加しているのが観察された。直線的結合（の増加）は予想通りであった。それは、９９ｍＴｃ標識Ｐ１２−Ｃの濃度がわずか〜１００ｐＭ（アッセイで試験された最高濃度１１．７μＣｉ／ｍＬでも）であり、これはＰ１２のＫＤ値〜３−４ｎＭ（アビジンＨＲＰアッセイを用いて算出）よりずっと低く、結合の飽和が考えられないためである。
実施例６
ＫＤＲ結合ペプチド／アビジンＨＲＰ複合体のＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合
ファージディスプレイによって同定されたペプチドの、一過性トランスフェクト２９３Ｈ細胞に発現されたＫＤＲへの結合を測定するために、ニュートラアビジンＨＲＰと複合体化させたビオチン化ペプチドの、トランスフェクト細胞表面上のＫＤＲへの結合を測定する新規アッセイを開発した。このアッセイを用いて前述のビオチン化ペプチドをスクリーニングした。ストレプトアビジン又はアビジンの代わりにニュートラアビジンを使用したのは、ニュートラアビジンにレクチン結合糖質部分がないため及び細胞接着受容体結合ＲＹＤドメインがないため、ビオチン以外の分子との非特異的結合が少ないからである。
本明細書中に記載の実験では、ＫＤＲ結合ペプチドＰ６−ＸＢ、Ｐ５−ＸＢ、Ｐ１２−ＸＢ、及びＰ１３−ＸＢ並びに対照ペプチドＰ１−ＸＢの四量体複合体を製造し、ＫＤＲを一過性にトランスフェクトされた２９３Ｈ細胞へのそれらの結合能力を試験した。ＫＤＲ結合ペプチドの４つの四量体複合体はすべてＫＤＲ発現細胞に結合したが、Ｐ１３−ＸＢが最善のＫＤを示した（１．８１ｎＭ）。ＫＤＲ結合ペプチドのＰ６−ＸＢ及びＰ５−ＸＢの四量体複合体は、それらの同種単量体に比べて改善された結合を示した。さらに、これらの構築物にスペーサーを含めると（ＫＤＲ結合ペプチドとビオチンの間）、結合を改善することが実験Ｂで示された。
実験Ｃは、本発明のペプチドのＫＤＲ及びＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体への結合に及ぼす血清の影響を評価するための本アッセイの使用を示している。Ｐ５−ＸＢ、Ｐ６−ＸＢ及びＰ１３−ＸＢの結合は血清の存在によって顕著な影響を受けなかったが、Ｐ１２−ＸＢの結合は血清の存在下で５０％を超えて削減された。
実験Ｄは、このアッセイが、二つ以上のＫＤＲ及びＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドを含有する多量体標的構築物に使用するための異なった組合せのＫＤＲ及びＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドの評価にも有用であることを示している。さらに実験Ｄ及びＥは、異なる結合部位に結合する２個以上のＫＤＲ結合ペプチドを持つヘテロマー構築物が、標的ペプチドのみの“ホモ四量体”構築物より優れた結合を示すことを立証している。
実験Ａ
ａ．ｍＲＮＡ及び５’ＲＡＣＥ準備済みｃＤＮＡライブラリーの製造
ＨＵＶＥＣ細胞を１７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏａｔ，カタログ＃ ６４７８）でほぼ８０％のコンフルエント状態に成長させ、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，カタログ＃ ＰＦ００３）を２４時間加えてＫＤＲの発現を誘導した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのマイクロ−ファーストトラック２．０キット（カタログ＃ Ｋ１５２０−０２）を用いてｍＲＮＡを単離した。キットの説明書に従って１２μｇのｍＲＮＡ（２６０ｎｍにおける吸光度によって測定）を２個のフラスコ（約３０００万個の細胞）から得た。ｃＤＮＡを作成するための逆転写を、２μｇのｍＲＮＡ、オリゴｄＴプライマー（５’−（Ｔ）２５ＧＣ−３’）及び／又はスマートIIオリゴ（５’ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡ ＣＧＣＧＧＧ−３’）でモロニーマウス白血病ウィルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素を用いて実施した。反応は総容量２０μＬで実施され、反応混合物は、２μＬのＲＮＡ、１μＬのスマートIIオリゴ、１μＬのオリゴｄＴプライマー、４μＬの５×第一鎖緩衝液（２５０ｍＭのトリスＨＣｌ ｐＨ８．３、３７５ｍＭのＫＣｌ、３０ｍＭのＭｇＣｌ２）、１μＬのＤＴＴ（２０ｍＭ、これも逆転写酵素とともに供給）、１μＬのｄＮＴＰミックス（ｄｄＨ２Ｏ中、各１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ＃ ２００４１５）、９μＬのｄｄＨ２Ｏ及び１μＬのＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、カタログ＃８４６０−１）を含有していた。逆転写反応は４２℃で９０分間実施し、２５０μＬのトリシン−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭのトリシン、１．０ｍＭのＥＤＴＡ）の添加によって反応を停止させた。逆転写産物の５’ＲＡＣＥ準備済みｃＤＮＡライブラリーは−２０℃で３ヶ月間保存できる。ＤＮＡ及びＲＮＡ用途に使用した全ての水は、ＵＳＢ社のＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅ除去水（カタログ＃ ７０７８３）であった。
ｂ．ｓ−ＫＤＲのＴＯＰＯIIベクターへのクローニング
ｓ−ＫＤＲのクローニングのために５’オリゴ（Ｇ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ Ｇ）及び３’オリゴ（Ｃ ＣＡＡ ＧＴＴ ＣＧＴ ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＧＣ Ａ）を使用した。これらは、５’ＲＡＣＥ準備済みｃＤＮＡライブラリー（上で製造）からｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カタログ＃ ６００１３５）によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＫＤＲの完全細胞外ドメイン（〜２．２ｋｂｐ）を増幅するために設計された。ＰＣＲ反応は総容量５０μＬで実施され、反応混合物は、２μＬの５’ＲＡＣＥ準備済みｃＤＮＡライブラリー、１μＬの５’オリゴ（１０μＭ）、１μＬの３’オリゴ（１０μＭ）、５μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液［ＰＣＲ緩衝液（２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．８、２０ｍＭのＭｇＳＯ４、１００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４）にｐｆｕ酵素＋１％ＤＭＳＯ及び８％グリセロールが補給されている］、１μＬのｄＮＴＰミックス（１０ｍＭ）及び４０μＬのｄｄＨ２Ｏを含有していた。ＰＣＲ反応は、９４℃で１分間、６８℃で１分間及び７２℃で４分間の４０サイクルにセットされたプログラムを使用して実施した。ＰＣＲ産物は、１体積のフェノールによる抽出、次いで１体積のクロロホルムによる抽出によって精製し、３体積のエタノール及び１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウムを用いて沈殿させた。ＰＣＲ産物を１７μＬのｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁し、２μＬの１０×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５００ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１％のゼラチン）及び１μＬのＴａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カタログ＃ ６００１３１）を加えて、産物の各末端にＡのオーバーハングを生成させた。７２℃で１時間インキュベートした後、修飾産物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴＯＰＯIIベクター（カタログ＃ Ｋ４６００−０１）に製造業者のプロトコルに従って直接クローニングし、ＴＯＰＯ−ｓＫＤＲを得た。ＴＯＰＯベクターは、Ｔａｑ（ＰＣＲ酵素）処理ＰＣＲ産物中にＡ−オーバーハングがあるため、ＰＣＲ産物の容易なクローニングを可能にする。
ｃ．ＫＤＲの膜貫通及び細胞質ドメインのＴＯＰＯIIベクターへのクローニング
ＫＤＲの膜貫通及び細胞質ドメインをクローニングするために、５’オリゴ（ＴＣＣ ＣＣＣ ＧＧＧ ＡＴＣ ＡＴＴ ＡＴＴ ＣＴＡ ＧＴＡ ＧＧＣ ＡＣＧ ＧＣＧ ＧＴＧ）及び３’オリゴ（Ｃ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＧＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＴＧＴ ＧＧＴ Ｃ）を使用した。これらは、５’ＲＡＣＥ準備済みｃＤＮＡライブラリー（上記）からｐｆｕポリメラーゼによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＫＤＲの完全膜貫通及び細胞質ドメイン（〜１．８ｋｂｐ）を増幅するために設計された。ＰＣＲ反応の条件及びプログラムはｓ−ＫＤＲで前述したのと全く同じであった。ｓ−ＫＤＲ配列の場合とちょうど同じように、ＰＣＲ産物をフェノールクロロホルム抽出を用いて精製し、Ｔａｑポリメラーゼで処理し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴＯＰＯIIベクターにクローニングしてＴＯＰＯ−ＣＹＴＯを得た。
ｄ．完全長ＫＤＲのｐｃＤＮＡ６ベクターへのクローニング
完全長受容体を創製するため、細胞外ドメインと細胞質ドメイン（膜貫通ドメインを含む）をＴＯＰＯ−ｓＫＤＲ及びＴＯＰＯ−ＣＹＴＯからそれぞれＰＣＲによって別個に増幅し、後で連結して完全長受容体を創製した。細胞外ドメインの５’末端にＮｏｔ１部位を有するオリゴ（Ａ ＴＡＡ ＧＡＡ ＴＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＧＧ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ Ｇ）及び細胞外ドメインの３’末端に相補的なオリゴ（ＴＴＣ ＣＡＡ ＧＴＴ ＣＧＴ ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＧＣ ＡＣＣ）を用いて、ＴＯＰＯ−ｓＫＤＲの細胞外ドメインをＰＣＲにより増幅した。同様に、５’オリゴ（ＡＴＣ ＡＴＴ ＡＴＴ ＣＴＡ ＧＴＡ ＧＧＣ ＡＣＧ ＧＣＧ ＧＴＧ）及びＮｏｔ１部位を有する３’オリゴ（Ａ ＴＡＡ ＧＡＡ ＴＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＡＣ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＧＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＴＧＴ ＧＧＴ Ｃ）を用いて、ＴＯＰＯ−ＣＹＴＯからＫＤＲの細胞質ドメイン（膜貫通ドメインを含む）をＰＣＲにより増幅した。両ＰＣＲ産物をＮｏｔ１で消化して一緒に連結し、完全長受容体を創製した。完全長受容体をコードするｃＤＮＡをアガロースゲル上で精製し、ｐｃＤＮＡ６／Ｖ５−ＨｉｓＣベクターのＮｏｔ１部位に連結した。ＤＮＡの精製と連結はｐｓＫＤＲで前述したように行った。連結反応物を用いてＤＨ５α菌の培養物を形質転換し、いくつかの個別クローンを、ＥｃｏＲＩ酵素による各クローンの精製プラスミドの制限分析によってインサートの存在及び配向について分析した。
ｅ．細胞培養
２９３Ｈ細胞はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ＃ １１６３１）から入手し、推奨培地に１ｍＬ／Ｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ＃ １５１４０−１４８）を加えた中で単層培養物として成長させた。全ての細胞とも毎日の培養では抗生物質の存在下で成長させたが、トランスフェクションの前には１６〜２０時間抗生物質除去培地に分け入れた。
ｆ．トランスフェクションのためのＤＮＡの製造
グリセロールストックからｐｆ−ＫＤＲを含有する大腸菌ＤＨ５αを、５０μｇ／ｍＬアンピシリン入りのＬＢ（ＬＢ寒天はＵＳ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓのカタログ＃ ７５８５１、アンピシリンはＳｉｇｍａのカタログ＃Ａ２８０４）プレート上に画線し、プレートを３７℃のインキュベータに放置して一晩成長させた。翌朝、単一コロニーをプレートから取り出し、３ｍＬのＬＢ／アンピシリン培地（ＬＢはＵＳ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓのカタログ＃ ＵＳ７５８５２）で３７℃で成長させた。８時間後、１００μＬの細菌培養物を３ｍＬ管から２５０ｍＬのＬＢ／アンピシリン培地に３７℃で一晩インキュベートするため移した。細菌はＬａｂ−Ｌｉｎｅインキュベータシェーカー内の５００ｍＬボトル（Ｂｅｃｋｍａｎ，カタログ＃ ３５５６０５）中、２２０ｒｐｍで円形に撹拌されながら成長した。翌日、細菌培養物をｍａｘｉ−ｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ，カタログ＃ １２１６３）を用いて処理した。一般的に２５０ｍＬの細菌培養物から約１ｍｇのプラスミドＤＮＡ（２６０ｎｍにおける吸光度によって定量）が得られた。
ｇ．９６ウェルプレートでの２９３Ｈ細胞のトランスフェクション
トランスフェクションは、ポリ−Ｄ−リジン被覆９６ウェルプレートを用いてリポフェクタミン２０００プロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ＃ １１６６８−０１９）に推奨されているように実施した。３２０ｎｇのＫＤＲ ＤＮＡ（ｐｃ−ＤＮＡ６−ｆＫＤＲ）／ウェル０．１ｍＬを９６ウェルプレートのトランスフェクションに用いた。トランスフェクションは血清含有培地で実施し、トランスフェクション試薬混合物は６〜８時間後に細胞から除去し、通常の血清含有培地と取り替えた。トランスフェクションは、黒／透明９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃ ３５４６４０）で実施した。プレートの半分（４８ウェル）の細胞は偽トランスフェクト（ＤＮＡなし）で、プレートのもう半分の細胞にＫＤＲのｃＤＮＡをトランスフェクトした。細胞はトランスフェクション時８０〜９０％のコンフルエント状態であったが、翌日のアッセイ時には完全コンフルエント状態であった。そうでなければアッセイは中止された。
ｈ．Ｍ１９９培地の調製
Ｍ１９９培地は前述のように調製した。
ｉ．ＳｏｆｔＬｉｎｋソフトリリースアビジン−セファロースの調製
ＳｏｆｔＬｉｎｋソフトリリースアビジン−セファロースは、Ｐｒｏｍｅｇａ社から入手したセファロース（カタログ＃ Ｖ２０１１）を１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、氷冷水で２回洗浄し（洗浄と洗浄の間に遠心分離）、そしてペレットを氷冷水に再懸濁してｄｄＨ２Ｏ中５０％スラリーを製造することによって調製した。アビジン−セファロースの新鮮な５０％スラリーが各実験ごとに調製された。
ｊ．ペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰ溶液の調製
ビオチン化ペプチドＰ６−ＸＢ、Ｐ５−ＸＢ、Ｐ１２−ＸＢ、Ｐ１３−ＸＢ及びビオチン化対照ペプチドＰ１−ＸＢ（前述のように調製）を用いて５０％ＤＭＳＯ中２５０μＭのストック溶液を調製し、ニュートラアビジンＨＲＰの３３μＭストック溶液は、２ｍｇのニュートラアビジンＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ＃ ３１００１）を１ｍＬのｄｄＨ２Ｏに溶解することによって調製した。ペプチドのストック溶液は−２０℃で保存したが、ニュートラアビジンＨＲＰのストック溶液は−８０℃で保存した。ビオチン化ペプチドの構造は表１ａに示してある。ペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰ複合体を調製するために、１０μＬの２５０μＭビオチン化ペプチドストック溶液と１０μＬの３３μＭニュートラアビジンＨＲＰを１ｍｌのＭ１９９培地に加えた。この混合物を回転器上、４℃で６０分間インキュベートし、次いで５０μＬのソフトリリースアビジン−セファロース（ｄｄＨ２Ｏ中５０％スラリー）を加えて過剰のペプチドを除去し、さらに３０分間、回転器上４℃でインキュベートした。最後に、ソフトリリースアビジン−セファロースを１２，０００ｒｐｍで５分間室温で遠心分離することによってペレット化し、得られた上清をアッセイに使用した。新鮮なペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰ複合体を各実験ごとに調製した。
ｋ．アッセイのためのペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰ希釈液の調製
飽和結合実験のために、１２０μＬ、６０μＬ、２０μＬ、１０μＬ、８μＬ、６μＬ、４μＬ及び１μＬのペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰ複合体を１．２ｍｌ分量のＭ１９９培地に加えて、それぞれ最終濃度３３．３３ｎＭ、１６．６５ｎＭ、５．５５ｎＭ、２．７８ｎＭ、１．６７ｎＭ、１．１１ｎＭ及び０．２８ｎＭの希釈液を作製した。
ｌ．トランスフェクト２９３Ｈ細胞のためのブロッキング溶液の調製
ブロッキング溶液は、２０ｍＬのＭ１９９培地を１０ｍｇの凍結乾燥非標識ニュートラアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ＃ ３１０００）に加えることによって調製した。各実験ごとに新鮮なブロッキング溶液を使用した。
ｍ．ペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰの結合を検出するためのアッセイ
トランスフェクション後（２４時間）、２９３Ｈ細胞の各ウェルを１００μＬのＭ１９９培地で１回洗浄し、８０μＬのブロッキング溶液と３７℃でインキュベートした。１時間後、細胞を１００μＬのＭ１９９培地で２回洗浄し、Ｐ１−ＸＢ、Ｐ６−ＸＢ、Ｐ５−ＸＢ、Ｐ１２−ＸＢ及びＰ１３−ＸＢのペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰ希釈液７０μＬと２時間半室温でインキュベートした。各希釈液を、偽並びにＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞の３個の別のウェルに加えた（各飽和結合実験に２枚のプレートを使用）。室温でのインキュベーション後、プレートを４℃に移してさらに半時間インキュベートした。その後、細胞を氷冷Ｍ１９９培地で５回、氷冷ＰＢＳで１回で洗浄した（この順）。最後の洗浄後、１００μＬの氷冷ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ，カタログ＃ ５０−７６−００）を各ウェルに加え、各プレートを３７℃で３０分間エアインキュベータ中でインキュベートした。最後に５０μＬの１Ｎリン酸を各ウェルに加えてＨＲＰ酵素反応を停止し、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ Ｍｏｄｅｌ ３５５０）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定することによって結合を定量した。
ｎ．ペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰのＫＤＲトランスフェクト細胞への結合
このアッセイでは、Ｐ６−ＸＢ、Ｐ５−ＸＢ、Ｐ１２−ＸＢ、Ｐ１３−ＸＢペプチド及び対照ペプチドＰ１−ＸＢとニュートラアビジンＨＲＰとの複合体を前述のように製造し、ＫＤＲを一過性トランスフェクトされた２９３Ｈ細胞へのそれらの結合能を試験した。ペプチド／ニュートラアビジン複合体の製造中、ニュートラアビジンＨＲＰより７．５倍過剰のビオチン化ペプチドを使用して、ニュートラアビジン上の全４つのビオチン結合部位が確実に占有されるようにした。複合体形成後、過剰の遊離ビオチン化ペプチドはソフトリリースアビジン−セファロースを用いて除去し、遊離ビオチン化ペプチドとニュートラアビジンＨＲＰ複合体化ビオチン化ペプチドとの間で何らかの競合が起こらないようにした。
実験は、いくつかの異なる濃度のペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰで実施し、０．２８ｎＭ〜３３．３３ｎＭでＰ５−ＸＢ及びＰ６−ＸＢについて飽和結合曲線を作成し（図８Ａ）、０．２８〜５．５５ｎＭでＰ１２−ＸＢ及びＰ１３−ＸＢの飽和結合曲線を作成した（図８Ｂ）。飽和結合曲線を描くために、試験した各濃度のそれぞれ異なるペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰ複合体について、偽トランスフェクト細胞へのバックグラウンド結合をＫＤＲトランスフェクト細胞への結合から差し引いた。従って、図８のＹ軸の吸光度は示差吸光度（ＫＤＲマイナス偽）であって、絶対吸光度ではない。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン３．０）を用いた図８の飽和結合データの分析から、四量体Ｐ６−ＸＢは１０．００ｎＭ（＋／−２．３６）、四量体Ｐ５−ＸＢは１４．８７ｎＭ（＋／−５．０７）、四量体Ｐ１２−ＸＢは４．０３ｎＭ（＋／−０．８６）、及び四量体Ｐ１３−ＸＢペプチド複合体は１．８１ｎＭ（＋／−０．２７）のＫＤが得られた。これらの結合定数は、予想通り、関連単座ペプチドＰ６（６９ｎＭ）及びＰ５（２８０ｎＭ）（フルオレセイン化）についてＫＤＲＦｃ構築物に対してＦＰで測定した値より低かったが、単座ペプチドＰ１２（３ｎＭ）とは類似していた。予想通り、対照のＰ１−ＸＢペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰ複合体については結合の飽和は観察されなかった。図９に示されているように、一つの濃度（５．５５ｎＭ）におけるペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰ複合体の結合をプロットすると、単一濃度実験がＫＤＲ結合ペプチド（Ｐ６−ＸＢ、Ｐ５−ＸＢ及びＰ１２−ＸＢ）を非結合ペプチド（Ｐ１−ＸＢ）から区別するのに使用できることが示された。
実験Ｂ
実験Ｂは、ＫＤＲ結合配列（Ｐ６及びＰ５）とビオチン間のスペーサー（Ｘ）の効果を見るために設計された。本実験では、ビオチン化Ｐ６及びＰ５（スペーサーＸがある場合とない場合、前述のように製造）を試験し、Ｐ１（スペーサーがある場合とない場合、前述のように製造）を陰性対照として使用した。
本実験は前述の実験Ａに示したように実施したが、単一濃度２．７８ｎＭでしか行わなかった。図１０に示された結果から、Ｐ６及びＰ５の効果的な結合にスペーサー（Ｘ）が必要とされることが明らかである。結合配列とビオチン間のスペーサー（Ｘ）は、複数の機序によって標的分子への結合を高めるのに役立ちうる。第一に、４個のビオチン化ペプチドが単一アビジン分子に結合した後のそれらの間での立体障害を削減するのに役立ちうる。第二に、単一細胞上で利用できる複数の結合部位に届くのに必要な余分の長さが得られる。
実験Ｃ
実験ＣではＰ６−ＸＢ、Ｐ５−ＸＢ、Ｐ１２−ＸＢ、及びＰ１３−ＸＢの結合に及ぼす血清の影響を試験した。本実験では、Ｐ６−ＸＢ、Ｐ５−ＸＢ、Ｐ１２−ＸＢ、及びＰ１３−ＸＢのビオチン化ペプチド／アビジンＨＲＰ複合体を、４０％ラット血清がある場合とない場合でＭ１９９培地（実験Ａで前述の通り）で試験した。本実験は実験Ａで記載の通りに実施したが、Ｐ６−ＸＢ及びＰ５−ＸＢについては６．６６ｎＭ、Ｐ１２−ＸＢについては３．３３ｎＭ、及びＰ１３−ＸＢについては２．２２ｎＭの単一濃度でしか行わなかった。
図１１に示された結果によれば、Ｐ６−ＸＢ、Ｐ５−ＸＢ及びＰ１３−ＸＢの結合は４０％ラット血清による顕著な影響を受けなかったが、Ｐ１２−ＸＢの結合は４０％ラット血清の存在下で５０％を超えて低下した。上記実施例５に記載の方法によって製造されたＴｃ標識Ｐ１２−Ｃ（Ｔｃ−キレートを有するＰ１２）の結合では、４０％ラット血清の存在下で８０％を超える低下が観察された（データは図２５に示す）。Ｔｃ標識Ｐ１２−Ｃの結合に及ぼす血清の影響は、本明細書中に開示されたアビジンＨＲＰアッセイで擬似されるので、このアッセイはペプチドのＫＤＲへの結合に及ぼす血清の影響を迅速に評価するのに使用できる。
実験Ｄ
実験Ｄは、ＫＤＲ及びＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドＰ６−ＸＢ及びＰ５−ＸＢの四量体複合体、特に構築物が少なくとも２個のＫＤＲ結合ポリペプチドを包含する場合の結合を評価するために設計された。ＫＤＲ結合ペプチド及び対照結合ペプチド（Ｐ１−ＸＢ）は前述のように製造した。本実験は、実験Ａに示したプロトコルを用いて実施したが、下記の手順は本実験に特有であった。
ａ．ペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰ溶液の調製
ビオチン化ペプチドＰ１−ＸＢ、Ｐ６−ＸＢ、及びＰ５−ＸＢの２５０μＭストック溶液を５０％ＤＭＳＯ中に調製し、ニュートラアビジンＨＲＰの３３μＭストック溶液は、２ｍｇのニュートラアビジンＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ＃ ３１００１）を１ｍＬのｄｄＨ２Ｏに溶解することによって調製した。ペプチドのストック溶液は−２０℃で保存したが、ニュートラアビジンＨＲＰのストック溶液は−８０℃で保存した。ペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰ複合体を製造するために、全部で５．３６μＬの２５０μＭビオチン化ペプチドストック溶液（又はペプチド溶液の混合物、ペプチド分子をアビジンＨＲＰ分子の数の４倍にするため）と１０μＬの３３μＭニュートラアビジンＨＲＰを１ｍＬのＭ１９９培地に加えた。この混合物を回転器上、４℃で６０分間インキュベートし、次いで５０μＬのソフトリリースアビジン−セファロース（ｄｄＨ２Ｏ中５０％スラリー）を加えて過剰のペプチドを除去し、さらに３０分間、回転器上４℃でインキュベートした。最後に、ソフトリリースアビジン−セファロースを１２，０００ｒｐｍで５分間室温で遠心分離することによってペレット化し、得られた上清をアッセイに使用した。新鮮なペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰ複合体を各実験ごとに製造した。
ｂ．ペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰの結合を検出するためのアッセイ
前述の手順を用いてペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰの結合を検出した。本実験の結果から、Ｐ６−ＸＢ及びＰ５−ＸＢはＫＤＲに多量体様式で結合し、２９３Ｈトランスフェクト細胞中のＫＤＲへの結合のために互いに協力していることが立証された。
Ｐ１−ＸＢはＰ１のビオチン化誘導体で、ＫＤＲに結合しない対照ペプチドである。予想されるとおり、Ｐ１−ＸＢのアビジン−ＨＲＰとの四量体複合体は、ＫＤＲトランスフェクト細胞への結合向上を示さなかった。図１２に示されているように、Ｐ６−ＸＢ又はＰ５−ＸＢの四量体複合体は、偽トランスフェクト細胞よりＫＤＲトランスフェクト細胞に著しく良く結合した。しかしながら、Ｐ６−ＸＢ四量体はＰ５−ＸＢ四量体よりずっと良く結合した。四量体複合体を形成するのに使用されるペプチド混合物にＰ１−ＸＢを加えると、ＫＤＲトランスフェクト細胞への結合は低下した。四量体の、単量体、二量体及び三量体に対する特異的結合の比率は、四量体、三量体及び二量体の特異的結合（偽トランスフェクト細胞への結合をＫＤＲトランスフェクト細胞から差し引くことによって得られる）を単量体のそれで割ることによって計算した。結果は、ＫＤＲトランスフェクト細胞への結合に対してＰ５−ＸＢ、Ｐ６−ＸＢ及びＰ１３−ＸＢの多量体化の協力的効果があることを示唆している。
＊３．３３ｎＭにおける単量体ペプチド結合はゼロだったので、比率は５．５５ｎＭにおける結合を用いて計算した。
２５％Ｐ１−ＸＢと７５％Ｐ５−ＸＢとの混合物はバックグラウンドよりも顕著にＫＤＲトランスフェクト細胞に結合するということはなく、Ｐ５−ＸＢ／アビジン−ＨＲＰ複合体がアッセイの間ずっとＫＤＲに結合したままであるために多価結合が重要であることを示している。この現象はＰ６−ＸＢにも当てはまり、四量体複合体中の５０％のペプチドをＰ１−ＸＢで置換すると、トランスフェクト細胞上のＫＤＲへのほとんど全ての結合が見られなくなった。
５０％Ｐ１−ＸＢと２５％Ｐ６−ＸＢ及び２５％Ｐ５−ＸＢで構成されるペプチド混合物は、偽トランスフェクト細胞に比べてＫＤＲトランスフェクト細胞にかなり良く結合した。このことは、同じ標的分子上の二つの結合部位を標的にすることに大きな利点があることを示している。さらに、異なる比率のＰ６−ＸＢ及びＰ５−ＸＢ（３：１、２：２、及び１：３）を含有する四量体複合体はすべて、どちらかのペプチドの純四量体よりもずっと良くＫＤＲトランスフェクト細胞に結合した。このことも、単一の標的分子上の二つの異なる部位を標的にすることは単一部位への多量体結合より優れているという見解と一致している。これは、単一標的への多量体結合は、多量体結合をする実体が二つ以上の別の標的分子（実体がそれらを同時に一緒に結合できるほど十分近くにある）にまたがる必要があるのに、単一標的上の二つ以上の異なる部位に結合できる多量体結合剤は、多量体結合を達成するためにその届く範囲内で別の標的分子を見つけることに頼る必要がないためであろう。ヘテロ四量体、ヘテロ三量体及びヘテロ二量体の単量体に対する特異的結合の比率は、四量体、三量体及び二量体の特異的結合（偽トランスフェクト細胞への結合をＫＤＲトランスフェクト細胞から差し引くことによって得られる）を単量体のそれで割ることによって計算した。各ヘテロマーのセットの、比率を計算するために使用した単量体は、表中の各ヘテロマーのリストの最後に記録し、比率１を与えてある。
ホモ二量体の結合比率の向上は表２に示されているように約１〜４倍の範囲であるが、ヘテロ二量体の結合は２〜１１０倍で、相補的配列の結合強さに及ぼす相乗効果を示している（表３）。
実験Ｅ
実験Ｅは、Ｐ６−ＸＢ及びＰ５−ＸＢがＫＤＲ上の異なる結合部位に結合することを確認するために設計された。ペプチドがＫＤＲ上の同一部位に結合するとすれば、それらはＫＤＲへの結合を巡って互いに競合しそうである。しかしながらペプチドが異なる部位に結合するとすれば、ＫＤＲへの結合を巡ってペプチド間で競合は起こらないはずである。本実験は、各ウェルに単一濃度のＰ５−ＸＢ／アビジンＨＲＰ（３．３３ｎＭ）溶液を用い、様々な濃度（０〜２．５μＭ）のＰ１−ＸＢ、Ｐ５−ＸＢ及びＰ６−ＸＢ（いずれもアビジンと複合体化されていない）を添加して実施した。
図１３に示された結果から明らかなように、Ｐ５−ＸＢはＫＤＲトランスフェクト細胞への結合を巡ってＰ５−ＸＢ／アビジンＨＲＰ溶液と確かに競合しているが、Ｐ１−ＸＢ及びＰ６−ＸＢはＫＤＲトランスフェクト細胞への結合を巡ってＰ５−ＸＢ／アビジンＨＲＰ溶液と競合していない。従って、Ｐ５−ＸＢ及びＰ６−ＸＢはＫＤＲ上の異なるそして相補的な部位に結合する。
実施例７
ヘテロ二量体構築物の製造
ＫＤＲ受容体への高親和性ペプチド結合剤を得るために、二つの直鎖ペプチド（Ｐ９，Ｐ１０）を一緒に連結してヘテロ二量体を形成した。ＶＥＧＦ競合アッセイによって判定されたように、これら二つのペプチドはＫＤＲ上の異なる部位に結合する。従って、ヘテロ二量体中の両ペプチドは同時に単一のタンパク質分子に結合可能なので、結果として受容体に対して総体的により高い親和性で結合する。この二座結合事象に対する最適の配向を決定しようとして、二つの形態のヘテロ二量体を合成した。ペプチドは、それらのＣ末端リジン残基を介して末端と末端(tail-to-tail)が連結している配向又はそれらのＮ末端アミノ基を介して先端と先端(head-to-head)が連結している配向のいずれかであった。
ペプチドは、標準のＦｍｏｃ固相ペプチド合成プロトコルを用いて合成した。二量体中の二つのペプチドの間にスペースを加えるために、それぞれの個別ペプチド単量体をＣ末端リジン（末端−末端二量体を製造するため）又はＮ末端アミノ（先端−先端二量体を製造するため）のいずれかで、単分散ＰＥＧベースのアミノ酸リンカー（Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ４−ＣＯ２Ｈ）により修飾した。各ＰＥＧリンカーのＦｍｏｃ基の脱保護後、Ｐ９ペプチドをレブリン酸（ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｈ）で標識し、Ｐ１０ペプチドをＢｏｃ−アミノ−オキシ酢酸で標識した。脱保護、切断及び精製後、二つのペプチドを変性緩衝液（８Ｍの尿素、０．１Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．６）中で１：１の比率で一緒に連結し、二つの異なるペプチド間にオキシム連結基（−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−）を形成した。二つの異なる単量体セットを用いて、末端−末端及び先端−先端ヘテロ二量体を溶液中で形成し、標準の逆相プロトコルによって精製し均質にした。この連結化学のより詳細な説明は、Ｋ．Ｒｏｓｅら、ＪＡＣＳ，１９９９，１２１：７０３４−７０３８（引用によってその全文を本明細書に援用する）に見られる。
１．ヘテロ二量体構築物の結合親和性についてのアッセイ
どちらかの単量体ペプチドと比べて改良された結合親和性について検定するために、各ヘテロ二量体を結合に関して、表面プラズモン共鳴装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００）を用いて検定した。可溶性ＫＤＲ受容体をＣＭ５センサーチップのデキストラン表面に標準アミンカップリング法によって架橋した。０．５ｍｇ／ｍＬの溶液を５０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ６．０）で１：４０に希釈して総ＲＬ１２７２１を固定化した。実験はＰＢＳＴ緩衝液（５．５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．６５、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１％のトゥイーン−２０ （ｖ／ｖ））中で実施した。吸光係数によって定量したペプチド溶液を希釈して、１０００、５００、２５０、１２５、６２．５及び３１．３ｎＭ溶液を調製した。結合のためにペプチドを２０μＬ／分で２分間、キンジェクト(kinject)プログラムを用いて注入した。３分間の解離時間後、あらゆる残存ペプチドをＫＤＲ表面から５０ｍＭのＮａＯＨ、１ＭのＮａＣｌを７５μＬ／分で１５秒間急速注入して除去した。単量体Ｐ９及びＰ１０は標準として働いた。センサーグラムをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．１を用いるグローバル分析により分析した。
ＢＩＡｃｏｒｅ分析によってこの試験で調べたペプチド二量体は、構成単量体のいずれかよりも著しく高い親和性でＫＤＲに結合している。設計上、二量体ペプチドとＫＤＲとの相互作用は二つの速度論的ステップを通して進行すると考えられる。より詳細な分析をすれば、これらのステップの個々の速度定数を正確に解析することが可能であろう。しかしながら、二量体の相互作用に関する見かけのＫＤを、初期遭遇を説明する速度（ｋａ，１）及び支配的な解離速度(off-rate)（ｋｄ，２）を用いて計算した。この分析から、先端−先端二量体の見かけのＫＤは２．２ｎＭ、末端−末端二量体のそれは１１ｎＭであった（表４）。これらの推定値は、個々の単量体に優る親和性の増加を表しており、Ｐ９とＴ−Ｔ二量体のＫＤの比較では６０倍大きく（７３２ｎＭ／１１．１ｎＭ）、Ｐ１０とＨ−Ｈ二量体のＫＤでは５６０倍大きかった（１２６０ｎＭ／２．２４ｎＭ）。
実施例８
以下の方法を使用して、実施例（８〜１２）に記載の個々のペプチド及び二量体ペプチドを製造した。
１．自動ペプチド合成
ペプチド合成は、ＡＢＩ−４３３Ａ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，カリフォルニア州フォスターシティ）上、０．２５ｍｍｏｌ規模でＦａｓｔＭｏｃプロトコルを用いて実施した。このプロトコルの各サイクルにおいて予備活性化は、カートリッジに入った必要な乾燥をされたＮα-Ｆｍｏｃ側鎖保護アミノ酸１．０ｍｍｏｌを、０．９ｍｍｏｌのＨＢＴＵ、２ｍｍｏｌのＤＩＥＡ、及び０．９ｍｍｏｌのＨＯＢｔのＤＭＦ−ＮＭＰ混合物中溶液で溶解することによって達成した。ペプチドは、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＲ（Ｒｉｎｋアミド）樹脂（置換レベル０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上で構築された。カップリングは２１分間実施した。Ｆｍｏｃの脱保護はＮＭＰ中２０％ピペリジンで実施した。最終サイクルの終わりに、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を除去し、完全保護された樹脂結合ペプチドを無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＨＯＢｔ／ＮＭＰを用いてアセチル化した。
２．粗ペプチドの切断、側鎖脱保護及び単離
樹脂からのペプチドの切断及び側鎖脱保護は、試薬Ｂを周囲温度で４．５時間用いて達成した。切断溶液を回収し、樹脂を追加分量の試薬Ｂで洗浄した。合わせた溶液を濃縮乾固した。残渣にジエチルエーテルを回旋又は撹拌しながら加え、ペプチドを沈殿させた。液相をデカントし、固体を回収した。この操作を２〜３回繰り返し、不純物及び残留切断カクテル成分を除去した。
３．ジシステインペプチドの環化
エーテル沈殿させた粗製の直鎖ジシステイン含有ペプチドを、水、アセトニトリル水溶液（０．１％ＴＦＡ）、ＤＭＳＯ水溶液又は１００％ＤＭＳＯの混合物に溶解し、溶液のｐＨをアンモニア水、炭酸アンモニウム水溶液、炭酸水素アンモニウム水溶液、Ｎ−メチルグルカミン（メグルミン）水溶液又はＤＩＥＡの添加によって７．５〜８．５に調整することにより環化した。混合物は空気中で１６〜４８時間撹拌し、トリフルオロ酢酸水溶液でｐＨ２に酸性化し、次いで水中アセトニトリルの濃度勾配を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製した。所望物質を含有するフラクションをプールし、精製ペプチドを凍結乾燥によって単離した。
４．リンカーを含有するペプチドの製造
典型的な実験では、ｉｖＤｄｅ保護リジンを持つ樹脂結合ペプチド４００ｍｇをＤＭＦ中１０％ヒドラジンで処理した（２×２０ｍＬ）。樹脂をＤＭＦ（２×２０ｍＬ）及びＤＣＭ（１×２０ｍＬ）で洗浄した。樹脂をＤＭＦ（１０ｍＬ）中に再懸濁し、Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（０．４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．４ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（０．４ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．８ｍｍｏｌ）で４時間混合しながら処理した。反応後、樹脂をＤＭＦ（２×１０ｍＬ）及びＤＣＭ（１×１０ｍＬ）で洗浄した。次に、樹脂をＤＭＦ中２０％ピペリジン（２×１５ｍＬ）で各回１０分間処理した。樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸とのカップリング及びＦｍｏｃ保護基の除去をもう１回繰り返した。
得られた遊離アミノ基を有する樹脂結合ペプチドを洗浄及び乾燥させ、次いで試薬Ｂ（２０ｍＬ）で４時間処理した。混合物をろ過し、ろ液を濃縮乾固した。残渣をエーテルとともに撹拌して固体を生成させ、これをエーテルで洗浄して乾燥させた。固体を無水ＤＭＳＯに溶解し、ｐＨをＤＩＥＡで７．５に調整した。混合物を１６時間撹拌してジスルフィド環化を実行した。反応は分析ＨＰＬＣによってモニタした。環化完了後、反応混合物を水中２５％アセトニトリルで希釈し、逆相Ｃ−１８カラムに直接かけた。水中アセトニトリル（どちらも０．１％ＴＦＡ含有）の濃度勾配を用いて精製を実行した。フラクションをＨＰＬＣで分析し、純生成物を含有するフラクションを合わせて凍結乾燥し、必要なペプチドを得た。
５．リンカーを含有するビオチン化ペプチドの製造
典型的な実験では、ｉｖＤｄｅ保護リジンを持つ樹脂結合ペプチド４００ｍｇをＤＭＦ中１０％ヒドラジンで処理した（２×２０ｍＬ）。樹脂をＤＭＦ（２×２０ｍＬ）及びＤＣＭ（１×２０ｍＬ）で洗浄した。樹脂をＤＭＦ（１０ｍＬ）中に再懸濁し、Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（０．４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．４ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（０．４ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．８ｍｍｏｌ）で４時間混合しながら処理した。反応後、樹脂をＤＭＦ（２×１０ｍＬ）及びＤＣＭ（１×１０ｍＬ）で洗浄した。次に、樹脂をＤＭＦ中２０％ピペリジン（２×１５ｍＬ）で各回１０分間処理した。樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸とのカップリング及びＦｍｏｃ保護基の除去をもう１回繰り返した。
得られた遊離アミノ基を有する樹脂結合ペプチドを、ビオチン−ＮＨＳエステル（０．４ｍｍｏｌ、５当量）及びＤＩＥＡ（０．４ｍｍｏｌ、５当量）のＤＭＦ中溶液で２時間処理した。樹脂を前述のように洗浄及び乾燥させ、次いで試薬Ｂ（２０ｍＬ）で４時間処理した。混合物をろ過し、ろ液を濃縮乾固した。残渣をエーテルとともに撹拌して固体を生成させ、これを回収し、エーテルで洗浄して乾燥させた。固体を無水ＤＭＳＯに溶解し、ｐＨをＤＩＥＡで７．５に調整した。混合物を４〜６時間撹拌してジスルフィド環化を実行した。これは分析ＨＰＬＣによってモニタした。環化完了後、反応混合物を水中２５％アセトニトリルで希釈し、逆相Ｃ−１８カラムに直接かけた。水中アセトニトリル（どちらも０．１％ＴＦＡ含有）の濃度勾配を用いて精製を実行した。フラクションをＨＰＬＣで分析し、純生成物を含有するフラクションを回収して凍結乾燥し、必要なビオチン化ペプチドを得た。
６．選択されたガドリニウム又はインジウム同位体で標識するためのＤＯＴＡ−結合ペプチドの製造
典型的な実験では、Ｎε−ｉｖＤｄｅ保護リジン部分を持つ樹脂結合ペプチド４００ｍｇをＤＭＦ中１０％ヒドラジンで処理した（２×２０ｍＬ）。樹脂をＤＭＦ（２×２０ｍＬ）及びＤＣＭ（１×２０ｍＬ）で洗浄した。樹脂をＤＭＦ（１０ｍＬ）中に再懸濁し、Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（０．４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．４ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（０．４ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．８ｍｍｏｌ）で４時間混合しながら処理した。反応後、樹脂をＤＭＦ（２×１０ｍＬ）及びＤＣＭ（１×１０ｍＬ）で洗浄した。次に、樹脂をＤＭＦ中２０％ピペリジン（２×１５ｍＬ）で各回１０分間処理した。樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸とのカップリング及びＦｍｏｃ保護基の除去をもう１回繰り返した。得られた遊離アミノ基を有する樹脂結合ペプチドをＤＭＦ（１０ｍＬ）中に再懸濁し、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸，−１，４，７−トリス−ｔ−ブチルエステル（ＤＯＴＡ−トリス−ｔ−ブチルエステル、０．４ｍｍｏｌ、５当量）、ＨＯＢｔ（０．４ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（０．４ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）中溶液で４時間混合しながら処理した。反応完了後、樹脂をＤＭＦ（２×１０ｍＬ）及びＤＣＭ（１×１０ｍＬ）で洗浄し、試薬Ｂ（２０ｍＬ）で４時間処理した。混合物をろ過し、ろ液を濃縮乾固した。残渣をエーテル中で撹拌して固体を生成させ、これを回収し、エーテルで洗浄して乾燥させた。固体を無水ＤＭＳＯに溶解し、ｐＨをＤＩＥＡで７．５に調整した。混合物を１６時間撹拌してジスルフィド環化を実行した。これはＨＰＬＣによってモニタした。環化完了後、混合物を水中２５％アセトニトリルで希釈し、逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムに直接かけた。水中アセトニトリル（どちらも０．１％ＴＦＡ含有）の濃度勾配を用いて精製を実行した。フラクションをＨＰＬＣで分析し、純生成物を含有するフラクションを合わせて凍結乾燥し、必要なビオチン化ペプチドを得た。
以下の表５の単量体ペプチドは上記方法によって製造した。
上の表５及び本明細書中の各所で使用されている記号“Ｃ＊”は、ジスルフィド結合に寄与するシステイン残基を表す。一般的に、本明細書中に記載の単量体ペプチドは、環状ジスルフィドペプチドとして製造され、次いで一緒に連結されて二量体を形成する。従って、システイン残基に“Ｃ＊”の記号がなくても、単量体中の最も近くにあるシステインへのジスルフィド結合の存在が通常仮定できる。二量体の単量体成分も、システイン残基が“Ｃ＊”の記号を含有するしないに関わらず、通常そのようなジスルフィド結合を含有することになろう。しかしながら、当業者であれば、本発明の二量体及びその他のヘテロ多量体は、代替的に単量体を連結して二量体を形成した後にジシステインペプチドの環化を実施することによって製造することもできること、及び本発明はそのようなジスルフィド結合の存在又は不在に関して制限するつもりはないことは理解されるであろう。
実施例９
上記実施例８に記載の精製ペプチド単量体を用いて様々なホモ二量体及びヘテロ二量体構築物を製造した。
１．ホモ二量体含有構築物の製造
ホモ二量体化合物を製造するため、二量体の製造に必要なペプチドの半分をＤＭＦに溶解し、１０当量のグルタル酸ビスＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルで処理した。反応の進行はＨＰＬＣ分析と質量分析によってモニタした。反応の完了後、揮発性物質を真空下で除去し、残渣を酢酸エチルで洗浄して未反応のビス−ＮＨＳエステルを除去した。残渣を乾燥させ、無水ＤＭＦに再溶解して、２当量のＤＩＥＡの存在下、もう半分のペプチドで処理した。反応は２４時間進行させた。この混合物をＹＭＣ逆相ＨＰＬＣカラムに直接かけ、直線的濃度勾配の水中アセトニトリル（いずれも０．１％ＴＦＡ含有）で溶離して精製した。
２．ヘテロ二量体含有構築物の製造
説明のため、“Ａ”及び“Ｂ”は、本明細書で先に定義の通り、分枝基Ｂ内で既に官能化された単量体ペプチドＡ及びＦ並びにスペーサーＣ及びＥの構築物を意味するものとする。ヘテロ二量体の場合、単量体の一つ（“Ａ”）をグルタル酸のビス−ＮＨＳエステルと反応させ、過剰のビス−ＮＨＳエステルを洗い落とした後（ホモ二量体化合物で記載の通り）、第二の単量体“Ｂ”をＤＩＥＡの存在下で加えた。反応後、混合物を分取ＨＰＬＣで精製した。典型的には、グルタル酸ビスＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（０．０２ｍｍｏｌ、１０当量）のＤＭＦ（０．３ｍＬ）中溶液に、ペプチドＡとＤＩＥＡ（２当量）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）中溶液を加え、混合物を２時間撹拌した。反応の進行はＨＰＬＣ分析と質量分析によってモニタした。反応の完了後、揮発性物質を真空下で除去し、残渣を酢酸エチル（３×１．０ｍＬ）で洗浄して未反応のビス−ＮＨＳエステルを除去した。残渣を乾燥させ、無水ＤＭＦ（０．５ｍＬ）に再溶解して、ペプチド“Ｂ”とＤＩＥＡ（２当量）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）中溶液で２４時間処理した。混合物を水で希釈し（１：１、ｖ／ｖ）、ＹＭＣのＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムに直接かけ、直線的濃度勾配の水中アセトニトリル（いずれも０．１％ＴＦＡ含有）で溶離して精製した。フラクションを分析ＨＰＬＣで分析し、純生成物を含有するフラクションを合わせて凍結乾燥し、必要な二量体を得た。以下の二量体は本方法によって製造された（構造、名称、化合物参照番号）。
二量体Ｄ５の製造の場合、個々のペプチドのカップリング反応後、５０μＬのヒドラジンを反応混合物に加え（リジンＮε−アミノ基を露出するため）、溶液を２分間撹拌した。反応混合物を水（１．０ｍＬ）で希釈し、ｐＨをＴＦＡで２に調整した。次にこれを前述の方法によって精製した。
３．Ｄ２７の合成
スキーム１−化合物２（Ｐ１２−Ｑ）の合成
スキーム２−化合物４（Ｐ６−Ｆ−Ｑ）の合成
ａ．１及び３の合成
単量体の合成は、出発樹脂としてＦｍｏｃ−ＧＧＧＫ（ｉｖＤｄｅ）ＮＨ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂を用い、０．２５ｍｍｏｌ規模で方法５に記載のようにして実施した。ペプチド樹脂は洗浄及び乾燥してから自動又は手動法による切断又は更なる誘導体化を行った。
ｂ．２及び４の合成のための手順
１及び３へのビオチン−ＪＪ、リシル、グリシル及びセリニル（ＧａｌＮＡｃ（Ａｃ）３−α−Ｄ）部分の付加は、方法６及び方法８に記載のような手動ＳＰＰＳによって行った。アミノ酸のカップリングはＤＭＦ中でＨＯＢｔ／ＤＩＣ活性化を用いて実施した（Ｓｅｒ（ＧａｌＮＡｃ（Ａｃ）３−α−Ｄ）以外）。Ｆｍｏｃの除去はＤＭＦ中２０％ピペリジンで実施した。どのカップリングも５〜１６時間の長さであった。各カップリング後、完了はカイザー試験で確認した。Ｓｅｒ（ＧａｌＮＡｃ（Ａｃ）３−α−Ｄの場合、カップリングは、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡをカップリング剤として用いてＤＭＦ中で実施した。カイザー試験で未反応アミノ基が示された場合、カップリングを繰り返した。Ｎ末端Ｆｍｏｃ基の除去及び樹脂からの切断を実施した。粗ペプチドをエーテル中に沈殿させ、エーテルで２回洗浄して真空下で乾燥させた。粗直鎖ペプチドを、該ペプチドをＤＭＳＯ（４０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、溶液のｐＨをＮ−メチルグルカミン水溶液の添加によって８に調整し、空気中室温で４８時間撹拌することによって直接環化した。次にペプチドを方法１に記載のように勾配ＨＰＬＣを用い、Ｗａｔｅｒｓ−ＹＭＣのＣ−１８ ＯＤＳ分取カラム（２５０ｍｍ×内径４．６ｍｍ）を用いて精製した。純生成物含有フラクションを合わせ、凍結乾燥して必要なペプチドを得た。
スキーム３−Ｄ２７（６）の合成
ｃ．手順：Ｄ２７−化合物６の合成
グルタル酸ビス−ＮＨＳエステル（０．１２２ｍｍｏｌ、１０当量、Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．）の無水ＤＭＦ中溶液に、ＤＭＦ中４の溶液（４０ｍｇ、０．０１２２ｍｍｏｌ）を１滴ずつ加えた。ＤＩＥＡを加えて、ペプチドに結合したトリフルオロ酢酸及び反応中に形成されたＮ−ヒドロキシスクシンイミドを中和した。この０．７ｍＬ溶液を４時間撹拌した。反応はＨＰＬＣ及び質量分析によってモニタした。ＤＭＦを真空下で除去した。過剰のジエステルを酢酸エチルの添加によって除去したが、これによってグルタル酸ビス−ＮＨＳエステルを溶解中にペプチド−モノエステル５が沈殿した。混合物を遠心分離し、液体部分をデカントした。これを２回繰り返した。残渣を真空下に１０分間維持した。残渣をＤＭＦに溶解し、２（３７ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（ｐＨ７）中溶液と混合した。それを周囲温度で１６時間撹拌した。揮発性物質を高真空下で除去し、残渣を１ｍＬのヒドラジン／ＭｅＯＨ（１５／８５、ｖ／ｖ）溶液で２．５時間周囲温度で撹拌しながら処理することによって酢酸官能基を除去した。アセトンを加えて過剰のヒドラジンをクエンチングし、揮発性物質を真空下で除去した。得られた残渣をＤＭＳＯに溶解し、上記のように分取ＨＰＬＣで精製して９ｍｇの純物質を得た。
４．Ｄ３２の合成
Ａｃ−ＶＣ＊ＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣ＊ＦＲＹＤＰＧＧＧＫ｛［ＰｎＡＯ６−Ｇｌｕｔ−Ｋ（−Ｇｌｕｔ−ＪＪ−ＮＨ（ＣＨ２）４−（Ｓ）−ＣＨ（Ａｃ−ＡＱＤＷＹＹＤＥＩＬＪＧＲＧＧＲＧＧＲＧＧ−ＮＨ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２］−ＮＨ２｝−ＮＨ２：Ｄ３２の製造
Ａｃ−ＶＣ＊ＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣ＊ＦＲＹＤＰＧＧＧＫ［Ｋ（ＰｎＡＯ６）］-ＮＨ２（３）の製造
Ａｃ−ＶＣ＊ＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣ＊ＦＲＹＤＰＧＧＧＫ［Ｋ（ｉＶＤｄｅ）］-ＮＨ２（１）、新規Ｐ６配列誘導体、４８ｍｇを方法５の手順によって製造した。化合物をＤＭＦ（０．８５ｍＬ）に溶解し、化合物Ｂで処理し、ＤＩＥＡ（７μＬ）を加えて反応混合物の塩基性を維持した。反応の進行はＨＰＬＣ及び質量分析でモニタした。反応完了後（２０時間）、揮発性物質を真空下で除去した。化合物２からなる残渣をＤＭＦ（５μＬ）中１０％ヒドラジンで１０分間処理した。ＨＰＬＣ分析及び質量分析によって反応の完了が示された。次に該混合物をＷａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＸＴｅｒｒａ ＭＳＣ１８分取ＨＰＬＣカラム（５０ｍｍ×内径１９ｍｍ）に直接かけ、直線的濃度勾配の水中アセトニトリル（いずれも０．１％ＴＦＡ含有）で溶離して精製し、１１ｍｇの純化合物３を得た。
化合物３及びＡｃ−ＡＱＤＷＹＹＤＥＩＬ−Ａｄｏａ−ＧＲＧＧＲＧＧＲＧＧＧＫ（Ａｄｏａ−Ａｄｏａ）-ＮＨ２化合物４（新規Ｆ３誘導体）からの二量体Ｄ３２の製造
グルタル酸ジスクシンイミジル（１２ｍｇ）をＤＭＦ（５００μＬ）に溶解し、ＤＩＥＡを加えた（１μＬ）。ＤＭＦ中の化合物３をグルタル酸ジスクシンイミジル／ＤＩＥＡのＤＭＦ溶液に加えた。混合物を２．５時間撹拌した。ＨＰＬＣ及び質量分析で反応の完了が示された。揮発性物質を真空下で除去し、残渣をエーテルで洗浄し（３回）、未反応のビス−ＮＨＳエステルを除去した。残渣を乾燥させ、無水ＤＭＦに再溶解し、２当量のＤＩＥＡの存在下、化合物４、Ａｃ−ＡＱＤＷＹＹＤＥＩＬ−Ａｄｏａ−ＧＲＧＧＲＧＧＲＧＧＧＫ（Ａｄｏａ−Ａｄｏａ）-ＮＨ２（方法５及び方法８によって製造）で処理した。反応を２０時間進行させた。次に混合物をＷａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＭＳＣ１８逆相分取ＨＰＬＣカラム（５０ｍｍ×内径１９ｍｍ）に直接かけ、直線的濃度勾配の水中アセトニトリル（いずれも０．１％ＴＦＡ含有）で溶離して精製し、２ｍｇのＤ３２を得た。
５．Ｄ３３の合成
Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣ＊ＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ［Ａｃ−ＶＣ＊ＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣ＊ＦＲＹＤＰＧＧＧＫ［ＳＧＳ−Ｇｌｕｔ−ＳＧＳ−（Ｓ）−ＮＨ（ＣＨ２）４−ＣＨ（ビオチン−ＪＪ−ＮＨ）−Ｃ（＝Ｏ）］−ＮＨ２］−ＮＨ２：Ｄ３３の合成
Ｄ３３の合成に使用する単量体化合物２及び単量体化合物４の構造
ａ．単量体ペプチド１及び単量体ペプチド３の合成
単量体１及び３の合成は、ＡＢＩ ４３３Ａ 合成機のための方法５の手順を用いて実施した。
ｂ．単量体ペプチド２及び単量体ペプチド４の合成
必要に応じてビオチン−ＪＪ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ及びＳｅｒの１及び３への付加は、方法６、７及び８の手順に従って、適当なＦｍｏｃアミノ酸、ビオチン−ＪＪ及びＦｍｏｃ−Ｊ（Ｊ＝８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸）を用い、ＳＰＰＳによって手動で行った。樹脂からのペプチドの切断と粗ペプチドの処理は、ペプチドの合成のための方法１に記載のように実施した。システイン部分の環化による環状ジスルフィドペプチドの形成は方法９の手順によって実施した。
ペプチドの精製は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０Ａ ＨＰＬＣシステム及びＹＭＣ Ｃ−１８ ＯＤＳ分取ＨＰＬＣカラムを使用し、０．１％ＴＦＡ水溶液中アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）の直線的勾配溶離を用いて実施した。純フラクションを合わせ、凍結乾燥した。
二量体Ｄ３３は、方法１３及び実施例９の表題‘ヘテロ二量体含有構築物の製造’に記載の手順を用い、単量体化合物４を用いて活性化単量体化合物５を現場生成し、それを次に単量体化合物２と反応させることによって製造した。化合物Ｄ３３を、Ｗａｔｅｒｓ−ＹＭＣ Ｃ−１８ ＯＤＳカラムを用いる分取逆相ＨＰＬＣによって精製し、１０ｍｇの二量体Ｄ３３を得た。
６．分析データ
二量体ペプチドＤ１〜５及びＤ８〜３０及び上で同定された３２〜３３、並びに二量体Ｄ２７のペプチド成分のＨＰＬＣ分析データ及び質量分析データを以下の表６に示す。
６．ＨＰＬＣ分析システム
システムＡ：カラム：ＹＭＣ Ｃ−４（４．６×２５０ｍｍ）；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、２５％Ｂ、１０分で直線勾配２５〜６０％Ｂ；流速２．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＢ：カラム：ＹＭＣ Ｃ−４（４．６×２５０ｍｍ）；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、２５％Ｂ、２０分で直線勾配２５〜６０％Ｂ；流速２．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＣ：カラム：ＹＭＣ Ｃ−４（４．６×２５０ｍｍ）；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、３０％Ｂ、１０分で直線勾配３０〜６０％Ｂ；流速２．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＤ：カラム：ＹＭＣ Ｃ−４（４．６×２５０ｍｍ）；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、２０％Ｂ、１０分で直線勾配２０〜６０％Ｂ；流速２．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＥ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、１０％Ｂ、１０分で直線勾配１０〜６０％Ｂ；流速３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＦ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、３０％Ｂ、１０分で直線勾配３０〜７０％Ｂ；流速３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＧ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、３０％Ｂ、１０分で直線勾配３０〜７５％Ｂ；流速３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＨ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、２０％Ｂ、１０分で直線勾配２０〜５２％Ｂ；流速３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＩ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、１０％Ｂ、１０分で直線勾配１０〜６５％Ｂ；流速３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＪ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、２０％Ｂ、１０分で直線勾配２０〜６０％Ｂ；流速３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＫ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、５％Ｂ、１０分で直線勾配５〜６０％Ｂ；流速３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＬ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、５％Ｂ、１０分で直線勾配５〜６５％Ｂ；流速３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＭ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、１５％Ｂ、１０分で直線勾配１５〜５０％Ｂ；流速３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＮ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、１０％Ｂ、１０分で直線勾配２０〜８０％Ｂ；流速３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＯ：カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８、４．６×２５０ｍｍ；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、３０％Ｂ、１０分で直線勾配３０〜６０％Ｂ；流速２．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＰ：カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８、４．６×２５０ｍｍ；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、２０％Ｂ、２０分で直線勾配２０〜８０％Ｂ；流速２．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＱ：カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８、４．６×２５０ｍｍ；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、２０％Ｂ、６分で直線勾配２０〜６０％Ｂ；流速２．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＲ：カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８、４．６×２５０ｍｍ；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、２５％Ｂ、１０分で直線勾配２５〜６０％Ｂ；流速２．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＳ：カラム：ＹＭＣ−Ｃ１８、４．６×１００ｍｍ；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、１０％Ｂ、１０分で直線勾配１０〜６０％Ｂ；流速３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
システムＴ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶離液：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件、１５％Ｂ、８分で直線勾配１５〜５０％Ｂ；流速３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。
実施例１０
ＨＵＶＥＣ及びＫＤＲトランスフェクト細胞上のＫＤＲへの結合に対する１２５Ｉ−ＶＥＧＦとの競合
以下の実験で、ＫＤＲ結合ポリペプチドであるホモ二量体及び本発明のヘテロ二量体が、トランスフェクト２９３Ｈ細胞によって発現されたＫＤＲへの結合を巡って１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦと競合する能力を評価した。
１．プロトコル
本明細書中に記載の標準技術を用いて、２９３Ｈ細胞にＫＤＲ ｃＤＮＡをトランスフェクト又は偽トランスフェクトした。細胞を競合化合物（１０μＭ、０．３μＭ、及び０．０３μＭ）の存在下又は不在下で１２５Ｉ−ＶＥＧＦとインキュベートした。細胞の洗浄後、結合放射能をガンマカウンタで定量した。ＶＥＧＦ結合の阻害率は、式［（Ｙ１−Ｙ２）×１００／Ｙ１］を用いて計算した。式中、Ｙ１はペプチド不在下におけるＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への特異的結合、Ｙ２はペプチド競合物存在下におけるＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への特異的結合である。ＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への特異的結合は、ＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合から偽トランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合を差し引くことによって計算した。
２．結果
図１４に示されているように、アッセイしたすべてのＫＤＲ結合化合物は、ＫＤＲトランスフェクト細胞への結合を巡って１２５Ｉ−ＶＥＧＦと競合できた。ヘテロ二量体（Ｄ１）は二つのホモ二量体（Ｄ２及びＤ３）よりも明らかに１２５Ｉ−ＶＥＧＦとの競合に最も効果的であり、Ｄ１の優れた結合を裏付けている。
実施例１１
受容体活性化アッセイ
本発明のヘテロ多量体を含むＫＤＲ結合多量体構築物が、ＶＥＧＦの誘導するＫＤＲの活性化（リン酸化）を阻害する能力を以下のアッセイ（上記実施例４も参照）を用いて評価した。
１．プロトコル
ほぼコンフルエント状態のＨＵＶＥＣの皿を血清又は成長因子を欠く基本培地中に一晩置いた。翌日、下記グループ（ｃ）の皿をＫＤＲ結合ペプチドを含む基本培地中で１５分間予備処理し、次いでグループ（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の皿を、
（ａ）添加剤なし（陰性対照）
（ｂ）５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（陽性対照）、又は
（ｃ）５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ＋推定競合／阻害ペプチド
を含有する新鮮基本培地中に置いた。
５分間の処理後、皿から溶解物（ライセート）を調製した。溶解物からの免疫沈降ＫＤＲを、リン酸化については抗ホスホチロシン抗体を用い、総ＫＤＲについては抗ＫＤＲ抗体を用いて（サンプル装填量について対照するため）イムノブロット法により順に分析した。
２．結果
図１５に示されているように、Ｄ１は、ＨＵＶＥＣにおいてＶＥＧＦが誘導するＫＤＲのリン酸化を１０ｎＭで完全に遮断した。１ｎＭで半分以上のリン酸化が化合物によって阻害された。Ｄ１に含有される二つの個々の結合部分それぞれからなるホモ二量体のＤ２及びＤ３は１００ｎＭまでリン酸化に何の影響も及ぼさず、受容体−リガンドの相互作用を遮断するには適当なヘテロ二量体を使用することが利益をもたらしうることを示した。複数の実験で、本アッセイにおけるＤ１のＩＣ５０は０．５〜１ｎＭの間で変動した。無関係の結合配列を含有する異なるヘテロ二量体Ｄ３１（構造は以下に示す）は、高い結合親和性（ＢｉａｃｏｒｅによればＫＤＲに対して１１ｎＭ）にもかかわらず、１００ｎＭでもリン酸化に何の影響も及ぼさず、ＫＤＲへの結合を巡ってＶＥＧＦと競合する多量体を構築する場合ＫＤＲ結合部分の選択が重要であることを示唆している。Ｄ１のＫＤＲに対する親和性はＤ２より１０倍高いが（ＳＰＲ分析による）、活性化アッセイにおけるそのＩＣ５０は少なくとも１００分の１で、一つの結合分子でＫＤＲ上の二つの異なるエピトープを標的とすることは、類似の親和性を有するがＫＤＲ上の単一のエピトープにしか結合しない分子より大きい立体障害を引き起こしうることを示唆している。同様に、Ｄ１内の二つのＫＤＲ結合部分は、受容体活性化アッセイで単量体の遊離ペプチド（Ｐ１２−ＸＢ及びＰ６−Ｄ）として試験した場合、ＩＣ５０がそれぞれ０．１及び１マイクロモルで、アッセイではＤ１のＩＣ５０より１００〜１０００倍高く、単量体ペプチドのフルオレセイン化誘導体のＫＤより１４〜３０倍高かったことも指摘しなければならない。このように、ＶＥＧＦ遮断活性が弱い二つのペプチドを含有する二量体を創製することにより、Ｄ１の結合親和性の増大をはるかに超える非常に強力なＶＥＧＦ遮断活性を有する分子が得られた。
実施例１２
遊走アッセイ
以下の実験で、本発明のヘテロ多量体であるＤ１が、ＶＥＧＦの誘導する培養ＨＵＶＥＣの移動を遮断する能力を評価した。
１．プロトコル
血清飢餓ＨＵＶＥＣをウェルあたり１００，０００細胞、ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ ２４ウェルインサートプレート（＃３５４１４１）の上部チャンバに入れた。ＶＥＧＦを遮断／阻害する可能性のある化合物の存在下又は不在下で、何も含まない又はＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）もしくは血清（５％ＦＢＳ）のような異なる誘因物質を含有する基本培地をウェルの下部チャンバに加えた。２２時間後、インサートプレートの細胞を蛍光染料で後標識（ポストラベル）し、浸潤／移動細胞の蛍光を蛍光プレートリーダーで測定することによって、細胞移動／浸潤の定量化を達成した。ＶＥＧＦ誘導性移動は、基本培地のみをウェルの下部チャンバに入れた場合に発生した移動を差し引くことによって計算した。
２．結果
ＶＥＧＦは本アッセイで内皮細胞の移動に大きな増加を誘導したが、Ｄ１はこれを強力に遮断した。５ｎＭのＤ１で、ＶＥＧＦ刺激による内皮細胞の移動は８４％遮断された（図１６参照）。２５ｎＭのＤ１で、この移動はほぼ完全に遮断された。他の実験で、公知ＫＤＲ阻害薬であるＳＵ−１４９８（（Ｅ）−３−（３，５−ジイソプロピル−４−ヒドロキシフェニル）−２−［（３−フェニル−ｎ−プロピル）アミノカルボニル］アクリロニトリル］をアッセイで試験した。ＳＵ−１４９８は３マイクロモルでＶＥＧＦの誘導する移動をＤ１ほどよく遮断しなかった（３マイクロモルで４７％遮断）。５０ｎＭのＤ７もＶＥＧＦによって刺激された移動を本質的に完全に阻害した。血清は、ＶＥＧＦの代わりに使用した場合、本アッセイにおける非常に強力な誘因物質であったが、その効果はＤ１によって著しく減退されることはなく、Ｄ１がＶＥＧＦによって誘導される内皮細胞の移動を特異的に阻害することが示された。
実施例１３
下記の実験でＴｃ、Ｉｎ、Ｌｕ、及びＩ−標識化合物の製造に用いる方法を説明する。
１． ９９ｍ Ｔｃ−Ｐ１２−Ｐの製造
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（２０ｍｇ）を１ｍＬの１Ｎ ＨＣｌに溶解し、この溶液１０μＬを、１０ｍｇのＣａＮａ２ＤＴＰＡ・２．５Ｈ２Ｏ（Ｆｌｕｋａ）を１ｍＬの水に溶解して調製したＤＴＰＡ溶液１ｍＬに加えた。第一スズＤＴＰＡ溶液のｐＨを１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ６〜８に調整した。５０μＬの１０％ＤＭＦ中５０μｇのＰ１２−Ｐ（Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣ＊ＥＤＤＷＹＹＣ＊ＷＬＦＧＴＧＧＧＫ（ＰｎＡＯ６−ＮＨ−（Ｏ＝）Ｃ（ＣＨ２）３Ｃ（＝Ｏ）−ＪＪ）−ＮＨ２）を、２０μＬの９９ｍＴｃＯ４ −（２．４〜４ｍＣｉ、Ｓｙｎｃｏｒ）、次いで１００μＬの第一スズＳｎ−ＤＴＰＡ溶液と混合した。室温で３０分後、放射化学的純度（ＲＣＰ）は９３％であった。生成物を、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ１６アミドカラム（４×２５０ｍｍ、孔径５μｍ）上、水（Ａ）及びアセトニトリル（Ｂ）中１ｇ／Ｌの酢酸アンモニウムの水性／有機勾配を用い、０．５ｍＬ／分の流速で溶離して精製した。以下の濃度勾配を用いた。３０分で３０．５％Ｂから３５％Ｂへ、１０分で７０％Ｂに上げていく。リテンションタイム２１．１分で溶出された化合物を５００μＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）（１％アスコルビン酸及び０．１％ＨＳＡ含有）中に回収し、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を用いてアセトニトリルを除去した。精製後、化合物のＲＣＰは＞９８％であった。
２． １１１ Ｉｎ−Ｐ１２−ＸＤＴの製造
５０μＬの１０％ＤＭＦ中５０μｇのＰ１２−ＸＤＴ（Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＪＫ（ＪＪ−ＤＯＴＡ）-ＮＨ２）を、１１１ＩｎＣｌ３（５０μＬ、４００μＣｉ、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）及び１００μＬの０．２Ｍ酢酸アンモニウム又はクエン酸緩衝液（ｐＨ５．３）と混合した。８５℃で４５分間加熱後、放射化学的純度（ＲＣＰ）はＨＰＬＣを用いた測定で４４％〜５２．２％の範囲であった。１１１Ｉｎ標識化合物をＶｙｄａｃ Ｃ１８カラム（４．６×２５ｃｍ、孔径５ミクロン）を用い、下記条件下で非標識リガンドから分離した。水性相、１ｇ／Ｌ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．８）；有機相、アセトニトリル。濃度勾配：３０分で２３％有機相から２５％有機相へ、２分で３０％有機相まで上げ、１０分間保持。リテンションタイム２０．８分で溶出された化合物を２００μＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）（１％アスコルビン酸及び０．１％ＨＳＡ含有）中に回収し、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を用いてアセトニトリルを除去した。精製後、化合物のＲＣＰは＞９３％であった。
３． １１１ Ｉｎ−Ｄ４の製造
ヒスチジン緩衝液を、ヒスチジン（Ｓｉｇｍａ）の０．１Ｍ溶液を濃水酸化アンモニウムでｐＨ６．２５に調整することによって調製した。酢酸アンモニウム緩衝液を、酢酸アンモニウム（９９．９９％、Ａｌｄｒｉｃｈ）の０．２Ｍ溶液を濃ＨＣｌ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｕｌｔｒａ Ｐｕｒｅ）を用いてｐＨ５．５に調整することによって調製した。高純度１１１ＩｎＣｌ３（１００μＬ、１．２ｍＣｉ、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）をＤ４（５０％ＤＭＦ２００中２００μｇ、１０％ＤＭＳＯ、２０％アセトニトリル及び２０％水）に加え、次いで３００μＬのヒスチジン緩衝液を加えた。最終ｐＨは５．５であった。反応混合物を８５℃で４５分間インキュベーション後、ＲＣＰは２０％であった。
あるいは、市販のＯｃｔｒｅｏＳｃａｎ（登録商標）キット（１３４μＬ、０．６ｍＣｉ、Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ）で提供される１１１ＩｎＣｌ３を０．２Ｍの酢酸アンモニウム緩衝液１６２μＬ中のＤ４（１３５μｇ）に加えてもよい。最終ｐＨは５．５であった。反応混合物を８５℃で４５分間インキュベーション後、ＲＣＰは２０％であった。
４． １２５ Ｉ− Ｄ５の製造
ジイソプロピルアミンを用いて予めｐＨ８．５〜９．０に調整されているＤＭＦ３０μＬ中のＤ５（２００μｇ）を１ｍＣｉのモノヨウ化１２５Ｉ Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（ＮＥＸ−１２０、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）（蒸発乾固されている）に加えた。バイアルを振盪し、それから氷上で３０分間、時々振盪しながらインキュベートした。この時間後、ＲＣＰは２３％であった。１２５Ｉ− Ｄ５（以下に示す）を、ＨＰＬＣにより流速１ｍＬ／分でＶｙｄａｃ Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、孔径５ミクロン）を用い、下記条件下で精製した。水性相：水中０．１％ＴＦＡ；有機相：アセトニトリル中０．０８５％ＴＦＡ。濃度勾配：３０分で３０％有機相から３６％有機相へ、５分で６０％有機相まで上げ、５分間保持。化合物を２００μＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）（１％アスコルビン酸及び０．１％ＨＳＡ含有）中に回収した。Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を用いてアセトニトリルを除去した。得られた化合物のＲＣＰは９７％であった。
５． １７７ Ｌｕ−Ｄ１１の製造
Ｄ１１（０．０５Ｎ ＮＨ４ＯＨ／１０％ＥｔＯＨ中〜１μｇ／μＬ溶液５μＬ）を、８０μＬの０．２Ｍ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５．６）が入ったガラスインサートマイクロバイアルに加えた。十分な１７７Ｌｕを加えてリガンド：Ｌｕの比が≦２：１（１〜５ｍＣｉ）になるようにした。バイアルを圧着封印して１００℃で１５〜２０分間加熱し、５分間冷却して３μＬのＨ２Ｏ中１％Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏで処理した。全反応混合物をＳｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＲＰ アミドＣ１６カラム（４ｍｍ×２５０ｍｍ×５μｍ）に注入した。以下のＨＰＬＣ条件を使用した。カラム温度＝５０℃、溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ ０．１％ＴＦＡ含有、溶媒Ｂ＝ＡＣＮ ０．０８５％ＴＦＡ含有、勾配ｔ＝０分で０．６／０．２５ｍＬ／分のＡ／Ｂからｔ＝６０分で０．５／０．４ｍＬ／分のＡ／Ｂへ。Ｄ１１のリテンションタイムは〜４０分；１７７Ｌｕ−Ｄ１１ １３３４のそれは〜４２分であった。放射能ピークを０．７ｍｌの０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．３）（０．１％ヒト血清アルブミンフラクションＶ及び１．０％アスコルビン酸含有）中に回収し、混合物をＳａｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃで遠心分離して有機溶媒を除去した。８０％を上回る放射化学的純度が得られた。
６． ９９ｍ Ｔｃ−Ｄ１２の製造
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（２０ｍｇ）を１ｍＬの１Ｎ ＨＣｌに溶解し、この溶液１０μＬを、１０ｍｇのＣａＮａ２ＤＴＰＡ・２．５Ｈ２Ｏ（Ｆｌｕｋａ）を１ｍＬの水に溶解して調製したＤＴＰＡ溶液１ｍＬに加えた。Ｄ１２（１００μＬの５０％ＤＭＦ中１００μｇ）を７５μＬの０．１Ｍ、ｐＨ９のリン酸緩衝液及び６０μＬの９９ｍＴｃＯ４ −（２．４〜４ｍＣｉ、Ｓｙｎｃｏｒ）、次いで１００μＬの第一スズＳｎ−ＤＴＰＡ溶液と混合した。４０℃で１０分後、放射化学的純度（ＲＣＰ）は１６％であった。生成物を、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ１６アミドカラム（４×２５０ｍｍ、孔径５μｍ）上、水中０．１％ＴＦＡ（Ａ）及びアセトニトリル中０．０８５％ＴＦＡ（Ｂ）の水性／有機勾配を用い、０．７ｍＬ／分の流速で溶離して精製した。以下の濃度勾配を用いた。３６分で３０％Ｂから４２％Ｂへ、１０分で７０％Ｂに上げていく。リテンションタイム３７．１分で溶出された化合物を５００μＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）（０．２％ＨＳＡ含有）中に回収し、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を用いてアセトニトリルを除去した。精製後、化合物のＲＣＰは＞９０％であった。
７． ９９ｍ Ｔｃ−Ｄ１４の製造
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（２０ｍｇ）を１ｍＬの１Ｎ ＨＣｌに溶解し、この溶液１０μＬを、１０ｍｇのＣａＮａ２ＤＴＰＡ・２．５Ｈ２Ｏ（Ｆｌｕｋａ）を１ｍＬの水に溶解して調製したＤＴＰＡ溶液１ｍＬに加えた。Ｄ１４（１００μＬの５０％ＤＭＦ中１００μｇ）を５０μＬの９９ｍＴｃＯ４ −（６ｍＣｉ、Ｓｙｎｃｏｒ）及び１２５μＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ９）、次いで１００μＬの第一スズＳｎ−ＤＴＰＡ溶液と混合した。４０℃で１５分後、放射化学的純度（ＲＣＰ）は２１％であった。生成物を、ＶｙｄａｃペプチドＣ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ）上、水中０．１％ＴＦＡ（Ａ）及びアセトニトリル中０．０８５％ＴＦＡ（Ｂ）の水性／有機勾配を用い、１ｍＬ／分の流速で溶離して精製した。以下の濃度勾配を用いた。４０分で３０％Ｂから４５％Ｂへ。リテンションタイム３４．９分で溶出された化合物を５００μＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．３）（０．２％ＨＳＡ含有）中に回収し、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を用いてアセトニトリルを除去した。精製後、化合物のＲＣＰは９２．５％であった。
８． ９９ｍ Ｔｃ−Ｄ３２の製造
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（２０ｍｇ）を１ｍＬの１Ｎ ＨＣｌに溶解し、この溶液１０μＬを、１０ｍｇのＣａＮａ２ＤＴＰＡ・２．５Ｈ２Ｏ（Ｆｌｕｋａ）を１ｍＬの水に溶解して調製したＤＴＰＡ溶液１ｍＬに加えた。Ｄ３２（１００μＬのＤＭＦ中１００μｇ）を１５０μＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）及び５０μＬの９９ｍＴｃＯ４ −（５．２ｍＣｉ、Ｓｙｎｃｏｒ）、次いで１００μＬの第一スズＳｎ−ＤＴＰＡ溶液と混合した。１００℃で１５分後、放射化学的純度（ＲＣＰ）は１３％であった。生成物を、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８ペプチドカラム（４．６×２５０ｍｍ、孔径５μｍ）上、水中０．１％ＴＦＡ（Ａ）及びアセトニトリル中０．０８５％ＴＦＡ（Ｂ）の水性／有機勾配を用い、１ｍＬ／分の流速で溶離して精製した。以下の濃度勾配を用いた。３０分で１０％Ｂから５０％Ｂへ、５０％Ｂを５分間保持、５分で７０％Ｂに戻す。リテンションタイム３３．２分で溶出された化合物を３ｍＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）（０．２％ＨＳＡ含有）中に回収し、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を用いてアセトニトリルを除去した。精製後、化合物のＲＣＰは９２．４％であった。
実施例１４
本発明の１２５Ｉ−標識ヘテロ多量体のＫＤＲトランスフェクト細胞への結合
１２５Ｉ−標識Ｄ５がＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞に結合する能力を試験するため実験を実施した。本実験では、異なる量の１２５Ｉ−標識Ｄ５（１〜４μＣｉ／ｍｌ、１２５Ｉ−Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬で標識、ＨＰＬＣ精製）を偽＆ＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞と、９６ウェルプレート中で室温で１時間インキュベートした。結合は、４０％マウス血清がある場合とない場合で実施し、ＫＤＲトランスフェクト細胞への結合に及ぼす血清効果を評価した。非結合化合物を洗い落とした後、各ウェルの細胞を０．５Ｎ ＮａＯＨで溶解し、溶解物（ライセート）をガンマカウンタで計数した。
本実験の結果を図１７及び図１８にまとめた。これらの結果から、１２５Ｉ−標識Ｄ５はＫＤＲトランスフェクト細胞に特異的に結合することが可能で、その結合は４０％マウス血清の存在に影響されないことが明らかにわかる。４０％マウス血清の存在下における結合と比べて血清不在の場合にはいくらか多くのＫＤＲトランスフェクト細胞への結合が観察された。しかしながら、アッセイ中血清を除いた場合、１２５Ｉ−Ｄ５の偽トランスフェクト細胞への結合もほぼ同程度増加し、血清不在下での結合の増加は非特異的であることを示している（図１７）。ＫＤＲトランスフェクト細胞への特異的結合（偽トランスフェクト細胞への結合を差し引き後）は、マウス血清がある場合とない場合でほとんど同一のようであった（図１８に示されている通り）。本実験において、加えた総ＣＰＭの１０〜１４％はＫＤＲトランスフェクト細胞に特異的に結合した（データ示さず）。
実施例１５
ペプチドヘテロ二量体（Ｄ６、以下に示す）を、グルタル酸ビスＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを用い、実施例９で前述したようにして製造した。ヘテロ二量体をＢｉａｃｏｒｅを用いてＫＤＲ−Ｆｃへの結合について試験し、親和定数を以下のようにして測定した。
３種類の密度のＫＤＲ−ＦｃをＣＭ５センサーチップのデキストラン表面に標準的アミンカップリング法で架橋した（５０ｍＭ酢酸塩で１：１００又は１：５０に希釈された０．５ｍｇ／ｍＬ溶液、ｐＨ６．０）。フローセル１を活性化し、その後遮断して参照差し引きとしての役割を担わせた。達成された最終固定化レベル：
（１）Ｒｌ Ｆｃ ２ ＫＤＲ−Ｆｃ ＝ １６０７
（２）Ｒｌ Ｆｃ ３ ＫＤＲ−Ｆｃ ＝ ３００１
（３）Ｒｌ Ｆｃ ４ ＫＤＲ−Ｆｃ ＝ ６３１９
実験はＰＢＳ緩衝液（５．５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．６５、０．１５ＭのＮａＣｌ）＋０．００５％Ｐ−２０（ｖ／ｖ））中で実施した。Ｄ６をＰＢＳ中で２５０ｎＭに希釈し、系列希釈を実施して１２５、６２．５、３１．３、１５．６、７．８、及び３．９ｎＭの溶液を調製した。全サンプルとも二重に注入した。結合のためにペプチドを２０μＬ／分で１２．５分間、キンジェクト(kinject)プログラムを用いて注入した。１０分間の解離時間後、５０ｍＭのＮａＯＨ＋１ＭのＮａＣｌを７５μＬ／分で１２秒間急速注入して、あらゆる残存ペプチドをＫＤＲ表面から除去した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．１とＳｉｇｍａＰｌｏｔ６．０で双曲型二重矩形回帰方程式(hyperbolic double rectangular regression eqation)を用いてセンサーグラムを分析した。ヘテロ二量体の定常状態の結合親和性（ＫＤＡＶ）を全３種類のＫＤＲ固定化密度で決定した（表７）。
このデータによれば、固定化密度が高いほどヘテロ二量体はサブナノモルの親和性（〜０．６ｎＭ）でＫＤＲに結合するようである。
このペプチドへテロ二量体のインビボクリアランスを評価するために、標準のプロトコル（Ｐｉｅｒｃｅ）に従ってヨードゲン(iodogen)及びＮａ１２５Ｉを用いて少量の物質をヨウ化した。放射ヨウ化を放射線安全研究室の指定フード内で実施した。ヨードゲン試薬で被覆した１本の管を１ｍＬの２５ｍＭトリス、０．４Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で予め湿らせた。これを廃棄し、同じ緩衝液１００μＬを加えた。Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを用い、１１μＬの１２５Ｉ−ＮａＩを反応管に移した。Ｎａ１２５Ｉ濃度の原推定値１４３．５５５ｍＣｉ／ｍｌに基づくと、１１μＬは約１．５ｍＣｉを含有するはずである。室内にはドーズキャリブレータはなかった。添加後、サンプルを回旋し、ｌｅａｄ ｐｉｇにセットして３０秒ごとに回旋しながら６分間インキュベートした。６分後、全サンプルをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管内のペプチドに移した。サンプルを回旋し、３０秒ごとに回旋しながら８分間インキュベートするようにセットした。８分後、反応をチロシン（１０ｍｇ／ｍＬ、飽和溶液）でクエンチング（反応終結）し、５分間静置した後２μＬを標準用として取り出した。
精製のため、Ｄ−ｓａｌｔポリアクリルアミド１８００の１０ｍＬカラムを使用し、標識ペプチドを標識チロシンから分離した。カラムは最初に１０ｍＬの生理食塩水、次いで２．５％のＨＳＡを含有する２５ｍＭトリス、０．４Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄し、非特異的部位を遮断した。ＨＳＡ緩衝液での洗浄後、カラムを６０ｍＬの２５ｍＭトリス、０．４Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で溶離し、カラムを４℃で一晩保存した。標識サンプルはドーズキャリブレータでの測定によれば１．３５５ｍＣｉ含有していた。標準として取り出した２μＬのサンプルは８．８μＣｉ含有していた。ペプチドサンプルをＤ−ｓａｌｔ１８００カラムにかけ、トリス／ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶離した。流れは、＃１〜１４の各フラクションに対して０．５ｍｌを１回、次いでフラクション２５〜４３に対しては１．０ｍＬを加えることによって制御した。フラクション＃９、１０、及び１１における放射能のピークはペプチドと思われた。２４〜４０における放射能は標識チロシンとみられる。この精製から、フラクション＃９〜１２を一緒にプールしてその後のクリアランス試験に使用した（プール中の１２５Ｉ−Ｄ６の濃度は７．０２３μｇ／ｍＬ；１００μＬ＝０．７０２μｇで８．６μＣｉ）。
合計１５匹のマウスに１００μＬの１２５Ｉ−Ｄ６を注射し、マウス（３匹のセット）を次の時点で犠死させた。すなわち、０、７、１５、３０、９０分。注射した実際の放射能は約６μＣｉであった。注射された６μＣｉからすると、投与された対応ペプチドは動物１匹あたり〜０．５μｇであった。犠死させたら、各動物の血漿サンプル５０μＬ中のカウントを測定した。各時点における３匹の各セットについてカウントを平均し、％注射量／ｍｌ血漿（ＩＤ％／ｍＬ）に変換し、クリアランス速度を評価するためにプロットした（図１９）。次にこのデータを４又は５パラメータ等式のいずれかに当てはめて、この分子の二相性半減期を決定した。４パラメータに当てはめた結果は、Ｔ１／２αが２．５５分及びＴ１／２βが６４．６６分であった。５パラメータに当てはめた結果は、Ｔ１／２αが２．１３分及びＴ１／２βが２３．２６分であった。
血漿サンプルのカウントを取るほかに、より大量の血漿を０、３０、及び９０分の時点で犠死させたマウスから採取した。これらのサンプルを、放射能検出器に接続したＳｕｐｅｒｄｅｘペプチドカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注入し、ペプチドと血清タンパク質の結合を評価した（図２０）。示されているように、標識ペプチドは実際高ＭＷタンパク質と結合している。これはその二相性半減期のクリアランス挙動を説明しうるものである。
ペプチドの抗血管新生阻害薬としての効力を評価するための手助けとして、Ｄ６をＨＵＶＥＣ及びＢｒｄＵ検出を用いる内皮細胞増殖アッセイで試験した。手短に言うと、摘出したばかりのＨＵＶＥＣ（ｐ３〜６の間）を、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋１％抗生物質＋１％ｌ−グルタミン＋０．４％ＢＢＥ（ウシ脳抽出物）中で培養し、ウェルあたり１００μＬ中５０００〜１００００／ウェル、播種した。細胞は使用前に２４時間回復させた。次に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＲＰＭＩ＋０．１％ＢＳＡ＋１％ｌ−グルタミン中の抗ＶＥＧＦ抗体（陽性対照）又はペプチドＡ、Ｂ及びＣ（０．１及び１０ｕｇ／ｍＬ）で４８時間処理した。下記６種類を２つのシリーズで試験した（ｎ＝４）。
シリーズＩ：ＶＥＧＦ含有せず
シリーズII：ＶＥＧＦ含有（３０ｎｇ／ｍＬ）
１．標準培地：ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋１％抗生物質＋１％ｌ−グルタミン＋０．４％ＢＢＥ
２．陰性対照１：ＲＰＭＩ（真の飢餓）
３．陰性対照２：ＲＰＭＩ＋０．１％ＢＳＡ＋１％ｌ−グルタミン
４．陽性対照：抗ＶＥＧＦ１０μｇ／ｍｌ、ＲＰＭＩ＋０．１％ＢＳＡ＋１％ｌ−グルタミン中
５．０．１μｇ／ｍｌＫＤＲペプチド、ＲＰＭＩ＋０．１％ＢＳＡ＋１％ｌ−グルタミン中
６．１０μｇ／ｍｌＫＤＲペプチド、ＲＰＭＩ＋０．１％ＢＳＡ＋１％ｌ−グルタミン中
１．プロトコル
１）各種条件下で細胞を４８時間インキュベートする
２）１０μＬのＢｒｄＵ希釈液（ＥＢＭ中１：１００）を各ウェルに２４時間時点で加える
３）さらに２４時間インキュベートする（合計４８時間）
４）培地を吸引する
５）１００μＬのＦｉｘＤｅｎａｔを各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートする
６）ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を廃棄する
７）１００μＬの抗体溶液（ＰＢＳ１％ＢＳＡ及び抗ＢｒｄＵ ＰＯ）を各ウェルに加える
８）室温で９０分間インキュベートする
９）ＰＢＳ、２００μＬ／ウェルで５分間３回洗浄する
１０）基質溶液（ＴＭＢ）を加え、１０〜３０分間インキュベートする
１１）すべてをフレキシベル(flexibel)プレートに移す
１２）２Ｍ Ｈ２ＳＯ４、２５μＬ／ウェルを加えることによって反応を停止する
１３）反応停止後５分以内に４５０ｎｍにおける吸光度を読む
注：バックグラウンド結合は、対照細胞（完全培地で培養；ＥＢＭ＋ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）を含有する４個のウェルで抗ＢｒｄＵを除くことによって、そしてＢｒｄＵに暴露されていない細胞を完全標識することによって測定した。
図２１（Ａ、Ｄ６；Ｂ、Ｐ１２−Ｇ；Ｃ、ＰＮＣ−１；Ｆ、ＰＮＣ−１）に示されているように、試験した２つのＫＤＲ結合構築物（Ｄ６及びＰ１２−Ｇ（Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣ＊ＥＤＤＷＹＹＣ＊ＷＬＦＧＴ−ＧＧＧＫ−ＮＨ２））のうち、Ｄ６は、抗ＶＥＧＦ抗体（陽性対照）と同様、ＶＥＧＦの存在下、１０μｇ／ｍＬでＨＵＶＥＣの増殖を完全に阻害する。ＰＮＣ−１（Ａｃ−ＡＥＧＴＧＤＬＨＣＹＦＰＷＶＣＳＬＤＰＧＰＥＧＧＧＫ−ＯＨ）（配列番号２９）は陰性対照として使用した。一方、Ｐ１２−Ｇ（ヘテロ二量体を構成するペプチドの一つ）は本アッセイでは試験した最高濃度（１０μｇ／ｍＬ）で増殖を阻害しない。結果として、ヘテロ二量体は明らかに、Ｐ１２−Ｇ単独と比べて、ＶＥＧＦと競合する能力の増強を示した。
実施例１６
ＢＩＡｃｏｒｅ分析−ペプチド二量体Ｄ１及びＤ７のマウスＫＤＲ−Ｆｃ結合
ＢＩＡｃｏｒｅを用いてペプチド二量体Ｄ１（Ｐ１２−ＧとＰ６−Ｄのトランケート形のヘテロ二量体）及びＤ７（Ｐ５−Ｄ及びＰ６−Ｄのヘテロ二量体）のマウスＫＤＲ−Ｆｃに対する結合定数を決定する。
１．手順
３種類の密度の組換えマウスＫＤＲ−ＦｃをＣＭ５センサーチップのデキストラン表面に標準的アミンカップリング法で架橋した（５０ｍＭ酢酸塩で１：１００又は１：４０に希釈された０．５ｍｇ／ｍＬ溶液、ｐＨ６．０）。フローセル１を活性化し、その後遮断して参照差し引きとしての役割を担わせた。達成された最終固定化レベル：
Ｒｌ Ｆｃ ２ ＫＤＲ−Ｆｃ ＝ ２７７０
Ｒｌ Ｆｃ ３ ＫＤＲ−Ｆｃ ＝ ５０８５
Ｒｌ Ｆｃ ４ ＫＤＲ−Ｆｃ ＝ ９２６５
実験はＰＢＳ緩衝液（５．５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．６５、０．１５ＭのＮａＣｌ）＋０．００５％Ｐ−２０（ｖ／ｖ））中で実施した。Ｐ１２−Ｇ（対照として実施）をＰＢＳ中で１２５ｎＭに希釈した。系列希釈を実施して６２．５、３１．３、１５．６、７．８、及び３．９ｎＭの溶液を作製した。Ｄ１及びＤ７をＰＢＳ中で５０ｎＭに希釈し、系列希釈を実施して２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５６、０．７８、及び０．３９ｎＭの溶液を作製した。全サンプルとも二重に注入した。結合のためにペプチドを３０μＬ／分で３分間、キンジェクト(kinject)プログラムを用いて注入した。１０分間の解離時間後、５０ｍＭのＮａＯＨ＋１ＭのＮａＣｌを７５μＬ／分で１２秒間急速注入して、あらゆる残存ペプチドをＫＤＲ−Ｆｃ表面から除去した。
ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．１の同時ｋａ／ｋｄ適合プログラムを用いてセンサーグラムを分析した。結果を表８及び図２２〜２４に示す。両ヘテロ二量体とも、センサーチップ上の受容体密度が半減した場合でもほぼ同じＫＤ２定数を達成したという事実は、受容体間の架橋型結合というよりヘテロ二量体の各受容体への多量体型結合と一致するものである。
実施例１７
インビトロアッセイを通じて結合親和性と生物学的効力との差異を示す
以下の実験で、ヘテロ多量体が、同一標的に対して類似の結合親和性を有する単量体ペプチドよりずっと大きい生物学的効力を示しうることを示した。
１．プロトコル 実験１
実施例６に記載の標準技術によって２９３Ｈ細胞にＫＤＲのｃＤＮＡをトランスフェクト又は偽トランスフェクトした。細胞をＰＧ−１（Ａｃ−ＥＲＶＴＴＣＷＰＧＥＹＧＧＶＥＣＹＳＶＡＹ−ＮＨ２）（配列番号：３０）又はＤ１（３００、３０、３、及び０．３ｎＭ）の存在下又は不在下で１２５Ｉ−ＶＥＧＦとインキュベートした。細胞の洗浄後、結合放射能をガンマカウンタで定量化した。ＶＥＧＦ結合の阻害率は式［（Ｙ１−Ｙ２）×１００／Ｙ１］を用いて計算した。式中、Ｙ１はペプチド不在下におけるＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への特異的結合、Ｙ２はペプチド競合物存在下におけるＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への特異的結合である。ＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への特異的結合は、ＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合から偽トランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合を差し引くことによって計算した。
２．プロトコル 実験２
血清飢餓ＨＵＶＥＣを、ウェルあたり１００，０００細胞、ＢＤフィブロネクチン被覆ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ ２４ウェルインサートプレートの上部チャンバに入れた。濃度を上げていくＰＧ−１又はＤ１の存在下又は不在下で、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有する又は含有しない基本培地をウェルの下部チャンバに加えた。２２時間後、インサートプレートの細胞を蛍光染料で後標識（ポストラベル）し、浸潤／移動細胞の蛍光を蛍光プレートリーダーで測定することによって、細胞移動／浸潤の定量化を達成した。ＶＥＧＦ刺激による移動は、ＶＥＧＦ不在下で測定した基本移動を差し引くことによって導き出した。
３．結果 実験１
図２６に示されているように、ＰＧ−１とＤ１はＫＤＲトランスフェクト細胞への結合を巡って１２５Ｉ−ＶＥＧＦとほぼ等しく良く競合し、それらが同程度の結合親和性並びにＶＥＧＦのＫＤＲへの結合を阻害する同程度の能力を持つことが示された。
４．結果 実験２
ＰＧ−１及びＤ１とも１２５Ｉ−ＶＥＧＦのＫＤＲ発現細胞への結合を同じくらい強力に遮断する（図２６）という事実にも関わらず、ヘテロ二量体のＤ１のほうが、内皮細胞遊走アッセイ（図２７）に示されているように、単量体のＰＧ−１よりもＶＥＧＦの生物学的影響を遮断することにおいて著しく強力であった。６２．５ｎＭまでＰＧ−１はＶＥＧＦ刺激による移動に何の影響も及ぼさなかったが、Ｄ１は５０ｎＭでＶＥＧＦ刺激による移動を完全に遮断した。これらのデータは、ヘテロ多量体の結合は単量体よりも（たとえ単量体が、リガンドのその受容体への結合を阻害する同程度の能力を有していたとしても）、リガンドの生物学的活性をより効果的に遮断できることを示唆している。
実施例１８
本発明のＴｃ標識へテロ二量体のＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合
本実施例ではＴｃ標識Ｄ１０のＫＤＲへの結合能力をＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞を用いて評価した。結果は、Ｔｃ標識Ｄ１０は偽トランスフェクト２９３Ｈ細胞に対してよりもＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞に対して著しく良く結合し、良好な結合は４０％マウス血清の存在下でも維持されたことを示している。さらに、Ｔｃ標識Ｄ１０のアミノ酸配列をスクランブルした誘導体Ｄ１８は、ＫＤＲ発現細胞に対する親和性を持たないことが示され、それらの細胞へのＤ１０結合の特異性が確認された。
１． ９９ｍ Ｔｃ標識ペプチドの合成
ａ． ９９ｍ Ｔｃ−Ｄ１０の製造：
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（２０ｍｇ）を１ｍＬの１Ｎ ＨＣｌに溶解し、この溶液１０μＬを、１０ｍｇのＣａＮａ２ＤＴＰＡ・２．５Ｈ２Ｏ（Ｆｌｕｋａ）を１ｍＬの水に溶解して調製したＤＴＰＡ溶液１ｍＬに加えた。Ｄ１０（１００μＬの５０％ＤＭＦ中１００μｇ）を、７５μＬの０．１Ｍ ｐＨ９のリン酸緩衝液及び５０μＬの９９ｍＴｃＯ４ −（２．４〜５ｍＣｉ、Ｓｙｎｃｏｒ）、次いで１００μＬの第一スズＳｎ−ＤＴＰＡ溶液と混合した。室温で１５分後、放射化学的純度（ＲＣＰ）は７２％であった。生成物を、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ１６アミドカラム（４×２５０ｍｍ、孔径５μｍ）上、水中０．１％ＴＦＡ（Ａ）及びアセトニトリル中０．０８５％ＴＦＡ（Ｂ）の水性／有機勾配を用い、０．７ｍＬ／分の流速で溶離して精製した。以下の濃度勾配を用いた。３６分で３０％Ｂから４２％Ｂへ、１０分で７０％Ｂに上げていく。リテンションタイム３２分で溶出された化合物を５００μＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）（０．２％ＨＳＡ含有）中に回収し、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を用いてアセトニトリルを除去した。精製後、化合物のＲＣＰは＞９０％であった。
ｂ． ９９ｍ Ｔｃ−Ｄ１８の製造：
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（２０ｍｇ）を１ｍＬの１Ｎ ＨＣｌに溶解し、この溶液１０μＬを、１０ｍｇのＣａＮａ２ＤＴＰＡ・２．５Ｈ２Ｏ（Ｆｌｕｋａ）を１ｍＬの水に溶解して調製したＤＴＰＡ溶液１ｍＬに加えた。Ｄ１８（１００μＬの５０％ＤＭＦ中１００μｇ）を、５０μＬの０．１Ｍ ｐＨ９のリン酸緩衝液及び９０μＬの９９ｍＴｃＯ４ −（１４ｍＣｉ、Ｓｙｎｃｏｒ）、次いで１００μＬの第一スズＳｎ−ＤＴＰＡ溶液と混合した。反応を３７℃で２０分間温めた。全反応をＶｙｄａｃ ２１８ＴＰ５４ Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍシリカ）に注入し、水中０．１％ＴＦＡ（Ａ）及びアセトニトリル中０．０８５％ＴＦＡ（Ｂ）の水性／有機勾配を用い、１．５ｍＬ／分の流速で溶離した。以下の濃度勾配を用いた。３０分で３２％から３９％Ｂへ、２分で８０％Ｂに上げていく。遊離リガンドはリテンションタイム１９分で溶出した。２４分に溶出した複合体を５００μＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．３）（０．１％ＨＳＡ及び１％アスコルビン酸含有）中に回収した。アセトニトリルと過剰のＴＦＡをＳｐｅｅｄ Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を４０分間用いて除去した。精製後、化合物のＲＣＰは９３％であった。
２．２９３Ｈ細胞のトランスフェクション
実施例６に記載のプロトコルを用いて２９３Ｈ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションは、黒／透明９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃ ３５４６４０）で実施した。プレートの半分（４８ウェル）の細胞は偽トランスフェクト（ＤＮＡなし）で、プレートのもう半分の細胞にＫＤＲのｃＤＮＡをトランスフェクトした。細胞はトランスフェクション時８０〜９０％のコンフルエント状態であったが、翌日のアッセイ時には完全コンフルエント状態であった。そうでなければアッセイは中止された。
３．０．１％ＨＳＡ入りｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地の調製
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ＃ １１０５８−０２１）から入手し、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）はＳｉｇｍａ（カタログ＃ Ａ−３７８２）から入手した。０．１％ＨＳＡ入りｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地を調製するために、０．１％ ｗ／ｖ ＨＳＡをｏｐｔｉ−ＭＥＭＩに加え、室温で２０分間撹拌し、次いで０．２μＭフィルタを用いてろ過滅菌した。
４．アッセイ用Ｔｃ標識ペプチド希釈液の調製
Ｔｃ標識Ｄ１０及びＤ１８のストック溶液を０．１％ＨＳＡ入りｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ中で希釈し、最終濃度１．２５、２．５、５．０、及び１０μＣｉ／ｍＬの各Ｔｃ標識ヘテロ二量体を得た。第二セットの希釈液も、希釈剤として４０％マウス血清／６０％ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ（０．１％ＨＳＡ入り）の混合物を用いて調製した。
５．Ｔｃ標識ヘテロ二量体の結合を検出するためのアッセイ
細胞はトランスフェクションの２４時間後に使用し、アッセイ用細胞を準備するために細胞を室温の０．１％ＨＳＡ入りｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ １００μＬで１回洗浄した。洗浄後、０．１％ＨＳＡ入りｏｐｔｉ−ＭＥＭＩをプレートから除去し、７０μＬの１．２５、２．５、５．０、及び１０μＣｉ／ｍＬのＴｃ標識Ｄ１０又はＤ１８（２種類の希釈溶液で上記のように調製）と取り替えた。各希釈液を偽及びＫＤＲトランスフェクト細胞の３個の別個のウェルに加えた。室温で１時間インキュベートした後、プレートを１００μＬの冷結合緩衝液（０．１％ＨＳＡ入りｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ）で５回洗浄した。１００μＬの可溶化溶液（０．５Ｎ ＮａＯＨ）を各ウェルに加え、プレートを３７℃で１０分間インキュベートした。各ウェル中の可溶化溶液をピペットで上下して混合し、１．２ｍＬ管に移した。各ウェルを１００μＬの可溶化溶液で１回洗浄し、洗液を対応する１．２ｍＬ管に加えた。次に各１．２ｍＬ管をＬＫＢガンマカウンタでカウントするために１５．７ｍｍ×１００ｃｍの管に移した。
６．Ｔｃ標識ヘテロ二量体のＫＤＲトランスフェクト細胞への結合
Ｔｃ標識Ｄ１０及びＤ１８のＫＤＲに特異的に結合する能力を一過性トランスフェクト２９３Ｈ細胞を用いて示した。図２８Ａに示すように、Ｔｃ標識Ｄ１０は、４０％マウス血清が存在する場合もしない場合も、偽トランスフェクト２９３Ｈ細胞に比べてＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞に著しく良く結合した（血清の存在下では多少の阻害はあったが）。このＴｃ標識ヘテロ二量体のＫＤＲ発現細胞への総特異的結合は、Ｔｃ標識単量体ペプチドで前に観察されたもの（実施例５）よりはるかに大きかった。これに対し、Ｔｃ標識Ｄ１８は偽トランスフェクト２９３Ｈ細胞にもＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞にも親和性を示さず、Ｄ１０結合の特異性が確認された。
実施例１９
Ｌｕ標識へテロ二量体のＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合
本実施例ではＬｕ標識Ｄ１３のＫＤＲへの結合能力をＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞を用いて評価した。結果は、Ｌｕ標識Ｄ１３は偽トランスフェクト２９３Ｈ細胞に対してよりもＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞に対して著しく良く結合し、良好な結合は４０％マウス血清の存在下でも維持されたことを示している。
１． １７７ Ｌｕ標識ペプチドの合成
ａ． １７７ Ｌｕ−Ｄ１３の製造
Ｄ１３（３０６μｇ）を、〜４５０μＬの円錐形インサートを備えた２ｍＬの自動サンプル採取バイアルに加え、０．０１ＮのＮＨ４ＯＨ（５０μＬ）に溶解した。これに安定剤を含有する０．５Ｍの酢酸アンモニウム３００μＬを加えた。６．８μＬ分の０．０５Ｎ ＨＣｌ中１７７ＬｕＣｌ３（３９．３ｍＣｉ）を加え、バイアルを圧着封印し、３７℃で１５分間温め、〜５分間冷却して１０μＬのＨ２Ｏ中１％Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏを加えた。３５０μＬ分の反応混合物をＳｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＲＰ アミドＣ１６カラム（４ｍｍ×２５０ｍｍ×５μｍ）に注入した。以下のＨＰＬＣ条件を使用した。カラム温度＝３７℃、溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ ２ｇ／ＬのＮＨ４ＯＡｃ緩衝液含有、ｐＨ７．０、溶媒Ｂ＝８０％ＡＣＮ／２０％Ｈ２Ｏ、勾配ｔ＝０分で０．５６／０．２４ｍＬ／分のＡ／Ｂからｔ＝３０分で０．４７／０．３３ｍＬ／分のＡ／Ｂへ。Ｄ１３のリテンションタイムは〜２８分；１７７Ｌｕ−Ｄ１３のリテンションタイムは〜２９分であった。放射能ピークを安定剤含有の１ｍＬ緩衝液（最終ｐＨ＝７．６、水酸化ナトリウムで調整）中に回収した。次にそれをＳｐｅｅｄ Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を用いて〜４０分間遠心分離し、ＡＣＮを除去した。単離生成物のＲＣＰは８６％であった。
２．２９３Ｈ細胞のトランスフェクション
実施例６に記載のプロトコルを用いて２９３Ｈ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションは、黒／透明９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ＃ ３５４６４０）で実施した。プレートの半分（４８ウェル）の細胞は偽トランスフェクト（ＤＮＡなし）で、プレートのもう半分の細胞にＫＤＲのｃＤＮＡをトランスフェクトした。細胞はトランスフェクション時８０〜９０％のコンフルエント状態であったが、翌日のアッセイ時には完全コンフルエント状態であった。そうでなければアッセイは中止された。
３．０．１％ＨＳＡ入りｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地の調製
０．１％ＨＳＡ入りｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地を実施例１８のように調製した。
４．アッセイ用Ｌｕ標識ペプチド希釈液の調製
Ｌｕ標識Ｄ１３のストック溶液を０．１％ＨＳＡ入りｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ中で希釈し、最終濃度１．２５、２．５、５．０、及び１０μＣｉ／ｍＬの標識ヘテロ二量体を得た。第二セットの希釈液も、希釈剤として４０％マウス血清／６０％ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ（０．１％ＨＳＡ入り）の混合物を用いて調製した。
５．Ｌｕ標識ヘテロ二量体の結合を検出するためのアッセイ
これは実施例１８に詳述したようにして実施した。ただし、Ｔｃ標識ヘテロ二量体の代わりにＬｕ標識Ｄ１３を用いた。
６．Ｌｕ標識ヘテロ二量体のＫＤＲトランスフェクト細胞への結合
Ｌｕ標識Ｄ１３のＫＤＲに特異的に結合する能力を一過性トランスフェクト２９３Ｈ細胞を用いて示した。図２９に示すように、Ｌｕ標識Ｄ１３は、４０％マウス血清が存在する場合もしない場合も、偽トランスフェクト２９３Ｈ細胞に比べてＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞に著しく良く結合した（血清の存在下では多少の結合阻害はあったが）。
実施例２０
ＫＤＲトランスフェクト細胞におけるインビトロ競合実験
１．実験Ａ
以下の実験でペプチド結合マイクロバブルのＫＤＲ発現細胞への結合の特異性を評価した。
ａ．プロトコル
２９３Ｈ細胞にＫＤＲのｃＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクト細胞をペプチド結合マイクロバブルの懸濁液と、対応する遊離ペプチドの存在下又は不在下（１００μＭ〜３ｎＭ）でインキュベートした。非結合対照ペプチドを競合化合物として用いて競合も実施した。インキュベーション終了時、トランスフェクト細胞をＰＢＳ中で３回すすぎ、顕微鏡検査した。結合バブルの結合(Binding of the conjugated bubbles)を定量化し、標的マイクロバブルによる表面カバー率として表した。
ｂ．結果
ＫＤＲ結合二量体のＤ２３、又は単量体のＰ１２に結合させたマイクロバブルは、対応する遊離のＫＤＲ特異的ペプチドに競り負けたが、対照ペプチドの存在は影響なかった。残存結合の割合を競合物濃度の関数としてプロットして得られた代表的曲線を図３０Ａに示す。
２．実験Ｂ
以下の実験で、マイクロバブルに結合させた単量体及び二量体の結合効率をＫＤＲトランスフェクト細胞アッセイで比較する。
ａ．プロトコル
２９３Ｈ細胞にＫＤＲのｃＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を異なるペプチド（単量体又は二量体）に結合させたマイクロバブルの懸濁液と、濃度を上げていく遊離二量体の存在下又は不在下（１０００、３００、１００、３０、１０、３、１ｎＭ）でインキュベートした。インキュベーション終了時、トランスフェクト細胞をＰＢＳ中で３回すすぎ、顕微鏡検査した。結合バブルの結合を定量し、標的マイクロバブルによる表面カバー率として表した。
ｂ．結果
ＫＤＲ特異的二量体Ｄ２３に結合させたマイクロバブルは、ＫＤＲ特異的単量体Ｐ１３及びＰ１２に結合させたマイクロバブルよりも競合に抵抗性があり、対応する遊離二量体ペプチドによって置換されにくかった。残存結合の割合を競合物濃度の関数としてプロットして得られた例示的曲線を図３０Ｂに示す。
３．実験Ｃ−多重単量体と比較したヘテロ多量体及び二量体のインビトロ結合
以下の実験で、マイクロバブルに結合させた混合単量体、二量体及び単量体の結合効率をＫＤＲトランスフェクト細胞アッセイで比較する。
ａ．プロトコル
マイクロバブルを二量体（Ｄ２３）又は二つの異なるペプチド単量体（Ｐ６、Ｐ１２）のうちの一つのいずれかと結合させた。第四の結合反応は、各単量体を同量ずつ使用し総ペプチド量は同じにして実施した（例えば“混合単量体”）。２９３Ｈ細胞にＫＤＲのｃＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を同数の標的マイクロバブルと、５０％ヒト血清の存在下でインキュベートした。インキュベーション終了時、トランスフェクト細胞をＰＢＳ中で３回すすぎ、顕微鏡検査した。結合バブルの結合を定量し、標的マイクロバブルによる表面カバー率として表した。
ｂ．結果
図３０Ｃに示されているように、Ｐ６と結合させたマイクロバブルは、Ｐ１２又は二量体Ｄ２３と結合させたマイクロバブルと比べて結合不良であった。驚くべきことに、Ｄ２３に結合させたマイクロバブルは、Ｄ２３はＰ１２の半分の量であったにもかかわらず、Ｐ１２に結合させたマイクロバブルと同等に結合した。さらに、“混合単量体”を結合させたマイクロバブルは、これもＰ１２の量の半分であったのに、Ｐ１２又はＤ２３と結合させたマイクロバブルと同様に良く結合した。これらの結果は、ヘテロ多量体の結合能力の増大を示すものである。
実施例２１
腫瘍保持マウスにおけるＬｕ標識へテロ二量体による放射線治療
本実施例で、Ｌｕ標識Ｄ１３の、ヌードマウスに移植されたＰＣ３細胞腫瘍の成長を阻害する能力を示す。
１． １７７ Ｌｕ標識Ｄ１３の合成
１７７Ｌｕ標識Ｄ１３は実施例１９に記載のようにして製造した。
ａ．動物モデル
ＡＴＣＣから入手し、供給業者の推奨に従って成長させたＰＣ３をヌードマウスの肩甲骨間に皮下注射した。腫瘍が１００〜４００ｍｍ３に到達したら、１２匹のマウスに５００マイクロキュリーのＬｕ標識Ｄ１３を静脈内注射し、その成長をさらに１８日間モニタした。マウスは、体重が２０％以上減少するか腫瘍が２０００ｍｍ３を超えたら犠死させた。処置マウスにおける腫瘍成長を、ＰＣ３腫瘍を移植された３７匹の未処置ヌードマウスにおける平均腫瘍成長と比較した。
ｂ．結果
研究した１２匹の処置マウス中６匹において、未処置腫瘍マウスと比べて腫瘍の顕著な又は完全な成長遅延が見られ（図３１）、Ｄ１３は使用した条件下でＰＣ３腫瘍成長の鈍化に有効であることが示された。
実施例２２
ＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体結合剤の結合に関する細胞ベースのアッセイ
本実験で、ＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体結合ペプチドの、ＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体に選択的に結合する能力を示す。
１．試薬調製
本アッセイ用の試薬は別途記載のない限り実施例５に記載のようにして調製した。
２．ペプチド− １２５ Ｉ−ストレプトアビジン複合体溶液の調製
ビオチン化ペプチドＰ３０−ＸＢ、Ｐ３１−ＸＢ、Ｐ３２−ＸＢ及びビオチン化非結合対照ペプチドを用いて５０％ＤＭＳＯ中１．２５μＭのストック溶液を調製した。１２５Ｉ−ストレプトアビジンの３３．３３ｎＭストック溶液はＡｍｅｒｓｈａｍ社から購入した。１３．３３ｎＭのＩ−１２５ストレプトアビジン／１００ｎＭのＶＥＧＦのストック溶液は、８５０ｍｌのＩ−１２５ストレプトアビジンを２２μｌの１０μＭ ＶＥＧＦ及び１２７５μｌのＭ１９９培地と混合することによって調製した。ＶＥＧＦを入れない別のストック溶液も同様に調製した。１３．３３ｎＭのペプチド−１２５Ｉ−ストレプトアビジン複合体溶液±ＶＥＧＦを調製するために、５００μＬの１２５Ｉ−ストレプトアビジン（ＶＥＧＦを含む及び含まない）ストック溶液（最後のステップで調製）を、Ｐ３０−ＸＢ、Ｐ３１−ＸＢ、Ｐ３２−ＸＢ、又は対照ペプチドの１．２５μＭペプチド溶液２４μＬと混合した。混合物を回転器上４℃で６０分間インキュベートし、その後５０μＬのソフトリリースアビジン−セファロース（ｄｄＨ２Ｏ中５０％スラリー）を加えて過剰のペプチドを除去し、さらに３０分間回転器上４℃でインキュベートした。最後に、ソフトリリースアビジン−セファロースを１２，０００ｒｐｍで５分間室温で遠心分離してペレット化し、得られた上清をアッセイに使用した。
３．ペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰのＫＤＲトランスフェクト細胞への結合
このアッセイでは、ＶＥＧＦ存在下又は不在下における対照ペプチド及び試験ペプチド（Ｐ３０−ＸＢ、Ｐ３１−ＸＢ、Ｐ３２−ＸＢ）の１２５Ｉ−ストレプトアビジンとの複合体（前述のように調製）を、ＫＤＲを一過性トランスフェクトされた２９３Ｈ細胞へのそれらの結合能について試験した。Ｐ３０−ＸＢと１２５Ｉ−ストレプトアビジンとの複合体は、ＶＥＧＦの存在下で、偽トランスフェクト細胞に比べてＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞に特異的に結合したが（図３２Ａ）、ＶＥＧＦ不在下ではそうではなかった（図３２Ｂ）。Ｐ３０−ＸＢは、蛍光偏光及びＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）アッセイを用いて試験したペプチドの中で最高のＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体結合剤でもあった。表９、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／３６０，８５１、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／４４０，４４１、並びに同時係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／３８２，０８２、及びＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／６６１，１５６；ＰＣＴ ＵＳ０３／２８７８７；ＰＣＴ ＵＳ０３／０５７３１、２００３年９月１１日出願、発明の名称“ＫＤＲ及びＶＥＧＦ／ＫＤＲ結合ペプチド並びに診断及び治療におけるそれらの使用(KDR and VEGF/KDR Binding Peptides and Their Use in Diagnosis and Therapy)”参照。これらは引用によってそれらの全体を本明細書に援用する。本実施例は、ペプチド（Ｐ３０−ＸＢ）が細胞表面に存在するＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体に特異的に結合できることを示している。従って、該ペプチドは、診断又は治療の目的のために、ＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体をインビトロ及びインビボで標的にするのに使用できそうである。ＫＤＲ／ＶＥＧＦ結合ペプチドは、機能し活性化されたＫＤＲ受容体を検出するだけで、細胞表面に存在するすべてのＫＤＲを検出するわけではないので、腫瘍、転移、糖尿病性網膜症、乾癬、及び関節症における活発な血管新生を検出及び／又は治療するのに有用であろう。さらに、これらのペプチドは、ＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体に結合するその他のペプチドと同様、本発明のヘテロ多量体に都合よく含めることができる。
実施例２３
以下の実験で、ヘテロ二量体Ｄ２４及びＤ２６の、ＶＥＧＦが誘導する培養ＨＵＶＥＣの移動を遮断する能力を評価し、Ｄ２６に使用された追加のグリコシル化及び／又は独特なスペーサー構造がその効力を高めることを示した。
１．プロトコル
血清飢餓ＨＵＶＥＣを、ウェルあたり１００，０００細胞、ＢＤフィブロネクチン被覆ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ ２４ウェルインサートプレートの上部チャンバに入れた。Ｄ２４又はＤ２６の存在下又は不在下で、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有する又は含有しない基本培地をウェルの下部チャンバに加えた。２２時間後、インサートプレートの細胞を蛍光染料で後標識（ポストラベル）し、浸潤／移動細胞の蛍光を蛍光プレートリーダーで測定することによって、細胞移動／浸潤の定量化を達成した。ＶＥＧＦ誘導による移動は、基本培地のみをウェルの下部チャンバに加えた場合に発生した移動の量を差し引くことによって各実験条件について算出した。
２．結果
ＶＥＧＦはアッセイで内皮細胞の移動の大幅な増加を誘導したが、これはＤ２４及びＤ２６によって強力に遮断された（図３３）。Ｄ２６はＤ２４より１０倍強力で（ＩＣ５０はそれぞれ０．５ｎＭ及び５ｎＭ）、Ｄ２６のグリコシル化及び／又はその独特のスペーサーの性質が、ＫＤＲに結合しＶＥＧＦの作用を遮断するその能力を増強していることが示された。
実施例２４
以下の実験で、ＴＫ−１（構造は以下に示す）、すなわちペプチドＴＫＰＰＲ（ＫＤＲによって媒介されるＶＥＧＦの作用を増強するＶＥＧＦ受容体であるＮＰ−１に結合する）の多量体構築物の、ＶＥＧＦが誘導する培養ＨＵＶＥＣの移動のＤ６による阻害を増強する能力を評価した。
１．プロトコル
血清飢餓ＨＵＶＥＣを、ウェルあたり１００，０００細胞、ＢＤフィブロネクチン被覆ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ ２４ウェルインサートプレートの上部チャンバに入れた。様々な濃度のＤ６又は様々な濃度のＤ６と一定の１００ｎＭ ＴＫ−１（ＷＯ０１／９１８０５ Ａ２に記載のようにして合成）との組合せの存在下又は不在下で、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有する又は含有しない基本培地をウェルの下部チャンバに加えた。２２時間後、インサートプレートの細胞を蛍光染料で後標識（ポストラベル）し、浸潤／移動細胞の蛍光を蛍光プレートリーダーで測定することによって、細胞移動／浸潤の定量化を達成した。ＶＥＧＦ誘導による移動は、ＶＥＧＦの不在下で観察された移動の量を差し引くことによって各実験条件について算出した。
２．結果
ＶＥＧＦはアッセイで内皮細胞の移動の大幅な増加を誘導した。これはＤ６によって強力に遮断されたが（ＩＣ５０は約１２．５ｎＭ）、１００ｎＭのＴＫ−１単独では遮断されなかった（図３４）。しかしながら、驚くべきことに、ＴＫ−１は、アッセイでＤ６と同時に使用するとＤ６の効力を約１０倍増強することができた（ＩＣ５０は約２．５ｎＭ）。このことは、ＴＫ−１に見られるＴＫＰＰＲ配列（又は類似配列）を含有する化合物は、ＫＤＲへの結合を巡ってＶＥＧＦと競合するＤ６のようなある種の化合物の効力を高めるのに使用できることを示している。さらに、Ｄ６に見られるペプチド配列（又は相似配列）並びにＴＫＰＰＲ配列（又は類似配列）を１回以上反復して含有するヘテロ多量体は、このアッセイでは増強された活性を有するであろう（ＴＫＰＰＲ構築物の製造に関する詳細についてはＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／８７１，９７４参照、引用によって本明細書に援用する）。
実施例２５
ＫＤＲ結合活性を有するＰ１３−ＸＢのフラグメントの同定
以下の実験で、Ｐ１３−ＸＢのフラグメントが顕著なＫＤＲ結合活性を維持できることを示した。
１．プロトコル
実施例６に記載の標準技術を用いて２９３Ｈ細胞にＫＤＲのｃＤＮＡをトランスフェクト又は偽トランスフェクトした。Ｐ１２−ＸＢを含有するストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体を実施例６に記載のように製造した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体の細胞への結合は、複合体濃度５．５ｎＭを用い、０〜２５０ｎＭ又は０〜１０００ｎＭの下記競合ペプチド：Ｐ１３−ＸＢ、Ｆ１、Ｆ２、及びＦ３の存在下で、実施例６のように実施した。各実験条件下での特異的結合を判定した後、各ペプチドのＩＣ５０を決定した（可能な場合）。
２．結果
表９ａに示されているように、ちょうどＡｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒの結合モチーフ（Ｐ１２−ＸＢにも共有されている）と非標的Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ配列（ファージディスプレイデータを基に合成されるほとんどの単量体ペプチドに付加されている）とで構成されているＦ１は、Ｐ１２−ＸＢストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体の結合を遮断できる最小のフラグメントで、ＩＣ５０は１マイクロモル未満であった。驚くべきことに、Ｐ１３−ＸＢから誘導されたより大きいフラグメントのＦ２は、１マイクロモルでは複合体の結合を著しく阻害できなかった。しかしながら、後者のペプチドに可溶化モチーフ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）３を加えてＦ３を作製すると、これは結合を巡って複合体と競合でき（ＩＣ５０ １７５ｎＭ）、Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒモチーフを含有するＰ１３−ＸＢのあるフラグメントはＫＤＲ結合活性を保持していることが確認された。標的結合能を保持しているこれらのフラグメント（又は本明細書中に開示されている結合ポリペプチドのその他のフラグメント）は、完全長ペプチドの代わりに本発明のヘテロ多量体に利用することができる。
実施例２６
単一の標的分子上の二つのエピトープを標的にするヘテロ二量体は、標的分子上の二つのエピトープのうちの一つにしか結合しないホモ二量体より優れた結合をもたらす
以下の実験で、ヘテロ二量体構築物のほうが、ペプチド成長因子又はサイトカインの生物学的作用を遮断する能力においてホモ二量体よりも優れているという更なる証拠を提供する。
１．プロトコル
血清飢餓ＨＵＶＥＣを、ウェルあたり１００，０００細胞、ＢＤフィブロネクチン被覆ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ ２４ウェルインサートプレートの上部チャンバに入れた。濃度を上げていくホモ二量体Ｄ８又はヘテロ二量体Ｄ１７の存在下又は不在下で、何も含有しない又はＶＥＧＦを含有する基本培地をウェルの下部チャンバに加えた。２２時間後、インサートプレートの細胞を蛍光染料で後標識（ポストラベル）し、浸潤／移動細胞の蛍光を蛍光プレートリーダーで測定することによって、細胞移動／浸潤の定量化を達成した。
２．結果
ＶＥＧＦはアッセイで内皮細胞の移動の大幅な増加を誘導した。これはＤ１７によって強力に遮断されたが、Ｄ８では遮断されなかった（図３５）。Ｄ１７はＶＥＧＦが誘導する移動を約２５０ｎＭのＩＣ５０で遮断したが、Ｄ８は８００ｎＭでも移動に顕著な影響を及ぼさなかった。これは、Ｄ８はＰ１３−ＸＢに見られる全標的配列を使用したが、Ｄ１７はＫＤＲに対する親和性の低い（実施例２４に示した通り）Ｐ１３−ＸＢ配列のトランケート形（Ｆ３に見られるような）しか含有していなかったという事実にも関わらず起きたことである。従って、同一標的分子上の二つの別個のエピトープに結合可能なヘテロ二量体は、標的分子へのリガンド結合を遮断することにおいて、同一又はさらにはもっと強力な標的配列を含有するホモ二量体よりも有効であると考えられる。
実施例２７
ジスルフィド結合がアミド結合で置換された環状ペプチドの製造
６及び１３位のＣｙｓ残基が１対のアミノ酸、すなわち一つはカルボキシを持つ側鎖を有するもの（Ｇｌｕ又はＡｓｐ）及びもう一つはアミノを持つ側鎖を有するもの［（Ｌｙｓ又はＤｐｒ（２，３−ジアミノプロパン酸）］で置換されているＰ１２−Ｇ（非標的ＧＧＧＫ配列を有するＰ１２）のジスルフィド結合置換類似体を製造した。Ｐ１２−Ｇ（ジスルフィド結合の形成によって製造）に含まれているのと同じ配列位置を包含する環は、側鎖のアミノと側鎖の酸部分の縮合によって製造され、Ｐ１２−Ｇのジスルフィド結合のように残基６〜１３を架橋したラクタム環が得られた。
１．環状ラクタムペプチド−Ｐ３３−Ｌの代表的合成
２．樹脂結合ペプチド１の合成
１の合成は方法５を用い、０．２５ｍｍｏｌ規模で実施した。ペプチド樹脂１を洗浄し乾燥させて、更なる手動誘導体化に供した。
３．４ Ｐ３３−Ｌの合成
１（２４０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）にＮＭＭ（Ｎ−メチルモルホリン）／ＨＯＡｃ／ＤＭＦ １／２／１０（ｖ／ｖ／ｖ）（６５ｍＬ）を加えた。パラジウムトリス−トリフェニルホスフィン［Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、５５４．４ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ］を加え、遮光して樹脂を２０時間振盪した。樹脂をろ過し、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（０．５ｇ）／ＤＩＥＡ（０．５ｍｌ）／ＤＭＦ（１００ｍＬ）の溶液で洗浄し、最後にＤＭＦ（３×７０ｍＬ）で洗浄した。この処理で、ラクタム形成反応に必要なＧｌｕ６及びＬｙｓ１３のカルボキシ及びアミノ基のみが露出された。２の樹脂上環化はＨＡＴＵ（１１４ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、ＮＭＭ（６６μＬ、０．６ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（１０ｍＬ）を３時間用いて実施した。環化の完了はカイザー試験によってモニタした。ペプチドをペプチド樹脂３から試薬Ｂを４時間用いて切断した。樹脂をろ過し、ろ液を蒸発させてペーストにした。粗ペプチドをエーテル中で沈殿させ、エーテルで２回洗浄した。環状ペプチドを分取逆相直線勾配ＨＰＬＣにより、Ｗａｔｅｒｓ−ＹＭＣ Ｃ−１８カラム（２５０ｍｍ×内径３０ｍｍ）及び溶離液としてＨ２Ｏ中ＣＨ３ＣＮ（どちらも０．１％ＴＦＡ含有）を用いて精製した。生成物含有フラクションの凍結乾燥により８ｍｇの（Ｐ３３−Ｌ）が得られた。Ｐ３４−Ｌ、Ｐ３５−Ｌ、Ｐ３６−Ｌ及びＰ３７−Ｌも同様に製造した。
４．ＫＤＲ結合活性を維持しつつＰ１２−Ｇのジスルフィド架橋の置換
以下の実験で、Ｐ１２−Ｇの化学的に反応性のジスルフィド架橋を置換したラクタムＰ３４−Ｌが顕著なＫＤＲ結合活性を維持していることを示した。
５．プロトコル
実施例６に記載の標準技術を用いて２９３Ｈ細胞にＫＤＲのｃＤＮＡをトランスフェクト又は偽トランスフェクトした。Ｐ１２−ＸＢを含有するストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体を実施例６に記載のように製造した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体の細胞への結合は、複合体濃度５．５ｎＭを用い、０〜２５０ｎＭのＰ１２−Ｇ、又はＰ３４−Ｌの存在下で、実施例６のように実施した。各実験条件下での特異的結合を判定した後、各ペプチドのＩＣ５０を決定した。
６．結果
表１１に示されているように、ジスルフィド架橋のラクタム置換を含有するＰ３４−Ｌは、いくらかの親和性は失われたものの（ＩＣ５０はＰ１２−Ｇの１３ｎＭに対して１０８ｎＭ）、ＫＤＲへの結合を巡ってＰ１２−ＸＢ−ストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体と競合可能であった。これらのラクタムペプチド（又は本明細書中に開示されている結合ポリペプチドの、同様に製造されたラクタム類似体）は、ジスルフィド架橋含有ペプチドの代わりに本発明のヘテロ多量体に利用できる。
実施例２８
ペプチド二量体のｃＭｅｔへの結合の測定
ＢＩＡｃｏｒｅ機器を用い、二量体Ｄ２８が固定化ｃＭｅｔ−Ｆｃに結合する結合定数を決定した。
３種類の密度のｃＭｅｔ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＣＭ５センサーチップのデキストラン表面に標準的アミンカップリング法で架橋した（５０ｍＭ酢酸塩で１：１００、１：５０、又は１：２０に希釈された３μＭ溶液、ｐＨ５．５）。フローセル１を活性化し、その後遮断して参照差し引きとしての役割を担わせた。
達成された最終固定化レベル：
Ｒｌ Ｆｃ ２ ｃＭｅｔ−Ｆｃ ＝ ２５８２
Ｒｌ Ｆｃ ３ ｃＭｅｔ−Ｆｃ ＝ ５０４８
Ｒｌ Ｆｃ ４ ｃＭｅｔ−Ｆｃ ＝ ９７２１
実験はＰＢＳＴ緩衝液（５．５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．６５、０．１５ＭのＮａＣｌ）＋０．０５％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０）中で実施した。ペプチド二量体を脱イオンＨ２Ｏに溶解して１ｍｇ／ｍＬの溶液とした。二量体をＰＢＳ中で５０ｎＭに希釈した。系列希釈を実施して２５、１２．５、６．２５、及び３．１２５ｎＭの溶液を製造した。全サンプルとも二重に注入した。結合のために二量体を３０μＬ／分で３分間、キンジェクト(kinject)プログラムを用いて注入した。１０分間の解離時間後、４ＭのＭｇＣｌ２を５０μＬ／分で２分間２回急速注入してあらゆる残存ペプチドをｃＭｅｔ表面から除去した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．１を用いてセンサーグラムを分析した。
Ｄ２８（Ｐ２６−ＡとＰ２７−Ｘのヘテロ二量体）について、０．７９ｎＭというＫｄ値が得られた。これは、２００３年９月１１日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／４５１，５８８、発明の名称“ＨＧＦ受容体（ｃＭｅｔ）に特異的に結合するペプチド及びその使用(Peptides that specifically bind HGF receptor (cMet) and uses thereof)”（引用によりその全体を本明細書に援用する）の表８に示されているいずれかのヘテロ二量体単独のＫｄ値（配列番号：３６９（８８０ｎＭ）及び配列番号：３７０（２２０ｎＭ）参照）より著しく良好であった。
実施例２９
インビトロにおける細胞増殖アッセイ
微小血管内皮細胞（ＭＶＥＣ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、オレゴン州ポートランド）を用いて、Ｄ６及び関連類似体の、ＶＥＧＦ刺激による増殖を阻害するそれらの能力のインビトロ効果を評価した。ＭＶＥＣ（継代２）を９０％コンフルエントに成長させ、トリプシン処理し、ゼラチン被覆９６ウェル・マイクロタイタープレートに４〜８×１０３細胞／ウェルの密度で播種した。播種１６〜２４時間後に、細胞を、ウシ胎仔血清は欠くが０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する培地で１回洗浄した（２００μＬ／ウェル）。新鮮ＢＳＡ含有培地を各ウェルに加え、細胞をさらに２４時間インキュベートした。この２４時間の飢餓期間後、Ｄ６又は他の試験物質を含有する又は含有しない新鮮ＢＳＡ含有培地を加え、細胞をさらに４８時間３７℃でインキュベートした。培地を除去し、新鮮ＢＳＡ含有培地をＢｒｄＵと共に又はＢｒｄＵなしで加え、細胞をさらに２４時間インキュベートした後、取込みレベルを製造業者（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ カタログ＃ ＱＩＡ５８）の説明のとおりに決定した。結果を図３６に示す。
実施例３０
ＶＥＧＦが亢進した腹膜血管透過性のヘテロ二量体ペプチドによる遮断
本実施例で、ヌードマウスの腹膜に注射されたＶＥＧＦによる血管透過性の亢進を阻害するヘテロ二量体Ｄ２５の能力を示す。
１．プロトコル
雄のｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに２ｍＬのビヒクル（９５％生理食塩水／５％ＤＭＳＯ中１％ウシ血清アルブミン）、ビヒクル＋１．２ｎＭ ＶＥＧＦ１６５、又はビヒクル＋１．２ｎＭ ＶＥＧＦ１６５＋２０μＭ Ｄ２５を腹腔内注射した。直後にエヴァンズブルー染料（生理食塩水中０．５％、４ｍＬ／ｋｇ）を尾静脈に静脈内注射した。６０分後、マウスをＣＯ２窒息によって犠死させ、腹水を取り出した。サンプルを短時間遠心後、５９０ｎｍにおける吸光度をそれぞれについて測定した。
２．結果
図５３に示されているように、ＶＥＧＦを腹腔内注射した液に加えた場合、染料の腹膜内への漏れが著しく増加した。この増加はＶＥＧＦと一緒にＤ２５を含めることによって著しく遮断された。
実施例３１
インビボにおける腫瘍成長の阻害
ＳＷ−４８０ヒト結腸がん細胞に対して抗血管新生活性があると思われる試験化合物（二量体Ｄ６）について、３種類の濃度の効果をインビボ異種移植腫瘍モデルを用いて決定するための方法を提供する条件を記載する。
無胸腺ヌードマウスが同種及び異種細胞の成長のための容認可能な宿主である。ヌードマウスは、生物製剤の製造に使用される細胞株の特徴付けにおける留意事項(Points to Consider in the Characterization of Cell Lines used to Produce Biologicals)（ＦＤＡ １９９３）で要求される。
Ｄ６は、抗血管新生活性を有すると考えられる合成ヘテロ二量体ペプチドである。このペプチドはヒトＶＥＧＦ受容体２（ＫＤＲ）に高い親和性で結合し、ＶＥＧＦの結合と競合する。以下の実験でその抗血管新生活性を確かめる。
１．ＳＷ−４８０ヒトがん細胞
結腸がんＳＷ−４８０細胞（ＡＴＣＣ）を、４ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、５０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン、２５０ｍｇ／ｍＬのファンギゾン及び１０％の加熱不活性化ウシ胎仔血清を補給したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、９５％空気及び５％ＣＯ２下で培養した。
対数増殖期細胞を収穫し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄してトリプシン又は血清をすべて除去した。細胞をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁させて注射用とした。
無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）をｃＧＭＰ規則に従って調製し、適合性を確認するために細胞培養試験した。ｐＨは７．３〜７．７、浸透圧モル濃度は２７１〜２８７ｍＯｓｍ／ｋｇであった。ＰＢＳは、被験物質を再構成（還元）するのに使用されるビヒクルであり、ビヒクル対照注射用でもあった。
シスプラチン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｉｎｃ．；カリフォルニア州ロサンゼルス）を製造業者の説明書に従って調製した。シスプラチンはＢＬ２ ＢｉｏＣｈｅｍガードフードを用いて無菌調製された。
２．試験系
種／系統：ハツカネズミ、Ｃｒｌ：ＮＵ／ＮＵ−ｎｕＢＲマウス（ヌードマウス）
性別：雌
年齢：処置開始時６〜８週齢
体重範囲：体重要件なし
供給源：動物はマサチューセッツ州ウィルミントンのＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｎｏｔｔｏｂｉｏｔｉｃ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔから入手。
数：計１１５匹の動物を入手し、本試験のために注射。試験には９０匹のマウスを使用。
３．同定法
マウスは耳タグシステムを用いて独自に番号付けされた。さらにケージには最小限グループ番号、動物番号、研究番号及びＩＡＣＵＣプロトコル番号が確認できるケージカードを付けた。
４．無作為化
動物は、マイクロソフト（登録商標）エクセル９７ ＳＲ−１プログラムを用いて無作為に処置群に割り振った。
５．動物の管理
マウスにはガンマ照射した齧歯類用の食餌を自由に与えた。水道水は殺菌し、ボトルとストローによって自由に与えた。
６．動物環境
動物は半剛性アイソレーターにグループごとに収容した。収容したケージは平底であった。各ケージには５〜１０匹の動物とガンマ照射された接触寝床を入れた。各ケージのマウス数はマウスの挙動によって変更された。変更についてはアイソレーターの管理台帳に記録した。収容施設は実験動物の管理と使用に関する指針(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ，ワシントンＤ．Ｃ．，１９９６及び以後の全ての改訂版に示されている勧告に従った。
環境管理は、温度１６〜２６℃（７０±８°Ｆ）、相対湿度３０〜７０を維持するように設定された。１２：１２の明：暗サイクルも維持された。
７．順化
入手した動物は研究室環境に２４時間順化させてから試験を開始した。マウスの疾病の徴候、摂食／摂水異常、又はその他の不調の一般的徴候について観察した。入手時、動物は臨床観察され健康なようであった。
８．実験計画
雌の無胸腺ヌードマウス（Ｃｒｌ：ＮＵ／ＮＵ−ｎｕＢＲ）、６〜８週齢、を本試験に使用した。合計１１５匹のマウスの右側胸部に５´１０６のＳＷ−４８０ヒト結腸がん細胞を皮下注射した。腫瘍が約１５０±７５ｍｇのターゲットウィンドウサイズに到達したら、９０匹の腫瘍マウスを無作為に選んで９つの群の一つに分配した。試験化合物及びビヒクルを腹腔内（ＩＰ）投与し、シスプラチンを静脈内（ＩＶ）投与した。腫瘍の測定は週２回携帯型キャリパーを用いて記録した。毒性及び病的状態の徴候についてマウスを毎日モニタした。試験終了時、二酸化炭素の過剰投与によって動物を安楽死させ、解剖して組織を収集した。
本試験には全部で９つの群を使用した。各群に１０匹の腫瘍マウスが配属された。グループ１及び２はそれぞれ未処置及びビヒクル処置の陰性対照マウスの群であった。グループ３、４、及び５のマウスには、３種類の異なる濃度のＤ６ヘテロ二量体のうちの一つが投与された。グループ６、７、及び８のマウスには、３種類の異なる濃度の異なる抗血管新生ペプチドが投与された。グループ９のマウスには、標準化学療法化合物であるシスプラチンが陽性対照として投与された。
各群の用量レベルを表１２に示す。投与は動物を無作為に群に選別したのと同じ日に開始した（第７試験日）。各用量は無菌技術を用いて用量バイアルから各動物用に取り出し、注射部位はアルコール綿で拭いてから用量を投与した。用量は１．０ｍＬシリンジと２７ゲージｘ１／２”針を用いて各マウスに投与した。
試験化合物処置及びビヒクル処置マウスには１５日間毎日腹腔内（ＩＰ）注射した。シスプラチンは平日１日おきに合計５回の用量を静脈内経路で投与した。
各動物の臨床観察を少なくとも１日１回、毒性、病的状態及び死亡について実施し、記録した。病的状態とは、衰弱、脱水、不活発、猫背の姿勢、ボサボサの毛、呼吸困難及び尿又は糞の着色といった疾病の徴候などであるが、これらに限定されない。
９．腫瘍の測定
プロトコルに従って、腫瘍の測定は、試験期間中、週２回、腫瘍の長さ及び幅を目盛り付きキャリパーで測定することにより行った。測定は最低３〜４日間あけて実施したが、動物を安楽死させて測定を取ったときは例外であった。これにより間隔が３日未満になることもあった。腫瘍の重量は下記式：ｍｇ＝（Ｌ×Ｗ２）／２を用いて計算した。動物は、群あたりの平均腫瘍重量が２回続けて≧１０００ｍｇになったときか、又は腫瘍が潰瘍化したときか、又は動物が餌及び水を求めて移動したり摂取できなくなったときに安楽死させた。
１０．予定外の安楽死及び予期しない死亡
ａ．予定外の安楽死：
試験中、予定外の安楽死を必要とした動物はいなかった。
ｂ．予期しない死亡：
試験中死亡した動物はいなかった。
１１．剖検
ａ．安楽死及び剖検順
グループ１、２、３、４、及び５の全マウス（合計５０匹）は、腫瘍が２回続けて一つの群内で群平均ターゲットサイズ≧１０００ｍｇになったときに剖検に委ねられた。動物は、マサチューセッツ州ウィルミントンのＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＨＭ）に剖検のために提出した。全動物とも第２２試験日に安楽死させた。これは被験物質による全２８日間の処置計画より短かったが、被験物質処置群３〜８の平均腫瘍サイズが≧１０００ｍｇになったためであった。全動物とも二酸化炭素（ＣＯ２）吸入によって人道的に安楽死させた。
１２．組織収集
腫瘍は周辺組織や覆われた皮膚を取り除いて切離された。さらに腎臓も回収した。気付いた腎表面のあらゆる異常を記録した。
各動物について腫瘍及び腎臓の凍結ブロックを作製した。組織（腫瘍、腎臓）の代表的切片を採取した。腎切片には皮質と髄質を含めた。組織切片をラベル付きプラスチック凍結金型の底に置いた。組織をＯＣＴ媒体で包埋した。ブロックをドライアイスで冷やしたイソペンタン中に凍結するまで沈めた。ブロックを品質について簡単に検査し、ドライアイス上で保管した。
ブロックには動物番号と組織に対応する文字コード（Ａ：左腎；Ｂ＝右腎；Ｃ＝腫瘍）のラベルを貼った。各動物ごとのブロックをラベル付きバッグに入れた。
１３．結果
ａ．生存中の測定及び観察：
臨床観察、病的状態及び死亡に関する概要説明
全動物とも試験期間中ずっと健康そうで正常範囲内であった。試験化合物（Ｄ６）は本試験で使用した用量では毒性の何らの徴候も示さなかった。
動物は第２２試験日に安楽死させた。グループ９のマウス以外のマウスはすべて、試験化合物投与完了前に安楽死させた。その理由は、平均腫瘍サイズがグループ１〜８で＞１０００ｍｇとなったためである。シスプラチン処置動物のグループ９を第２２試験日に安楽死させたときの腫瘍重量は９９５ｍｇであった。試験中に死亡した動物はなかった。
１４．腫瘍塊の触診概要
試験期間を通して触診可能な塊が全マウスに検出され、腫瘍は試験期間中次第に成長した。予想通り、未処置及びビヒクル処置の陰性対照マウス（グループ１及び２）の腫瘍が最も速く成長し、第２０試験日以前に平均腫瘍サイズ１０００ｍｇに達した。さらに、シスプラチン処置動物（グループ９）の腫瘍は成長が最も遅く、試験終了時（第２２日）に平均腫瘍サイズ９９５ｍｇに達した。
一般的に、グループ３のマウス以外、試験化合物で処置した動物はすべて緩慢な腫瘍成長を示した。低用量のＤ６（０．０５ｍｇ／ｋｇ）で処置したグループ３の動物は、腫瘍の成長速度がグループ１及び２の未処置及びビヒクル処置動物の腫瘍とほぼ同じであった。高用量のＤ６で処置した動物（グループ４及び５）は腫瘍の成長がそれより遅く、第２１試験日に平均腫瘍サイズ１０００ｍｇに達した。対照グループ１及び２のマウスと比較した場合、試験化合物による処置は約１日の腫瘍成長遅延をもたらした。
１５．結論
この試験のデータは使用モデルの正当性を立証している。なぜならば、陰性対照のグループ１及び２と陽性対照のグループ９の腫瘍マウスが予想通りの応答だったからである。
試験期間を通して触診可能な腫瘍塊が全群で観察された。さらに、全動物とも試験期間中ずっと健康で正常範囲内であった。さらに、試験化合物（Ｄ６）は動物に有害作用を与えていないようであった。従ってこれらのデータから、Ｄ６で処置された動物の腫瘍は成長が遅い（２２日間の試験期間で対照より約１日遅い）ことが示唆されるであろう。また、試験化合物は何ら重大な毒作用を示さなかったので、さらに良好な腫瘍退縮の可能性があるより高濃度の試験化合物も使用できるであろう。
実施例３２
以下の実施例で、本発明のＫＤＲ結合ヘテロ二量体に結合させた超音波造影剤の製造と、ヘテロ二量体結合造影剤がインビトロでＫＤＲ発現細胞、インビボで血管新生組織を検出する能力について記載する。
１．ペプチド結合用の誘導体化マイクロバブルの調製
２００ｍｇのＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）、２７５ｍｇのＤＰＰＧ・Ｎａ（ジステアロイルホスファチジルグリセロールナトリウム塩）及び２５ｍｇのＮ−ＭＰＢ−ＰＥを６０℃で５０ｍｌのヘキサン／イソプロパノール（４２／８）に可溶化した。溶媒を真空下で蒸発させ、次いでＰＥＧ−４０００（３５．０４６ｇ）を該脂質に加え、該混合物を水浴中で１０６．９２ｇのｔ−ブチルアルコールに６０℃で可溶化した。該溶液をバイアルに１．５ｍＬの溶液として充填した。サンプルを−４５℃で急速冷凍し、凍結乾燥させた。ヘッドスペースの空気をＣ４Ｆ１０／空気（５０／５０）の混合物で置換し、蓋をして圧着した。凍結乾燥サンプルをバイアルあたり１０ｍｌの生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で再構成（還元）し、リン脂質安定化マイクロバブルの懸濁液を得た。
２．ペプチド結合
Ｄ２３（Ｐ６とＰ１２由来配列の二量体構築物）を以下の方法に従って上記マイクロバブルの調製物と結合させた。チオアセチル化ペプチド（２００μｇ）を２０μｌのＤＭＳＯに溶解し、次いで１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈した。この溶液を、１８ｍＬのＰＢＳ−ＥＤＴＡ １０ｍＭ、ｐＨ７．５中に分散させたＮ−ＭＰＢ−官能化マイクロバブルに加え、２ｍＬの脱アセチル化溶液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５Ｍのヒドロキシルアミン．ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加えた。ヘッドスペースをＣ４Ｆ１０／空気（５０／５０）で満たし、混合物を室温で２．５時間、穏やかな撹拌下（回転ホイール）、暗所でインキュベートした。結合バブルを遠心分離によって洗浄した。同様に、Ｄ２３を構成する単量体ペプチドを、上記の方法に従って２つの異なるマイクロバブル調製物に別個に結合させた。
３．トランスフェクト細胞でのインビトロアッセイ
本発明のヘテロ多量体構築物に結合させたリン脂質安定化マイクロバブルの、ＫＤＲ発現細胞への結合能力を、ＫＤＲを発現するようにトランスフェクトされた２９３Ｈ細胞を用いて評価した。
４．Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ（登録商標）カバースリップ上での２９３Ｈ細胞のトランスフェクション
実施例６に記載のように２９３Ｈ細胞にＫＤＲのＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を上記のように調製したペプチド結合マクロバブルの懸濁液とインキュベートした。トランスフェクト細胞とのインキュベーションのために、小さなプラスチックキャップを１〜３×１０８個のペプチド結合マイクロバブルを含有する懸濁液で満たし、裏返しにしたＴｈｅｒｍａｎｏｘ（登録商標）カバースリップでキャップをカバーし、トランスフェクト細胞が結合マイクロバブルと接触するように置く。室温で約２０分後、カバースリップをピンセットで取り上げ、ＰＢＳ中で３回すすぎ、顕微鏡検査して結合マイクロバブルの結合を評価する。
５．微小胞による表面カバー率（％）の決定
デジタルカメラＤＣ３００Ｆ（Ｌｅｉｃａ）で画像を取得し、画像化領域で結合マイクロバブルに覆われている表面のパーセントをソフトウェアＱＷｉｎ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ ＡＧ、バーゼル、スイス）を用いて決定した。表１３に、本発明の標的微小胞のＫＤＲトランスフェクト細胞への結合親和性の結果を、同じ標的微小胞の偽トランスフェクト細胞への結合と比較して示す。
Ｐ６由来配列及びＰ１２由来配列を単量体として別個にリン脂質安定化マイクロバブルに結合させた場合、得られた調製物が達成するインビトロにおけるバブルのＫＤＲトランスフェクト細胞への結合は程度が異なる（３．５％＆１６．８％）。これらのペプチド単量体のそれぞれを等量ずつ添加して得られる（総ペプチド量は同じ）リン脂質安定化マイクロバブルの調製物を同じ系で試験すると、１２．９％の結合が達成される。結合は二つの平均より少し多いが、それは標的上の異なる部位に結合する二つの配列で達成されたものなので、標的の一方又はもう一方の部位での競合に対してより抵抗性があるのだろう。しかしながら、二量体のＤ２３の場合、結合は２２．９％に増加する（同じペプチド量で）。この結果は、本発明のヘテロ多量体が結合の増加と競合に対する抵抗性の増大を可能にすることを示している。
６．インビボ動物モデル
血管新生組織の公知モデル（ラットＭａｔＢ IIIモデル）を用いて、本発明のヘテロ多量体に結合させたリン脂質安定化マイクロバブルの、血管新生組織の検出及び画像提供能力を調べた。
７．動物
雌の体重１２０〜１６０ｇのＦｉｓｈｅｒ ３４４ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，フランス）をＭＡＴＢIII腫瘍移植に使用した。雄の体重１００ｇ〜１５０ｇのＯＦＡラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，フランス）をＭａｔｒｉｇｅｌ注射に使用した。
８．麻酔
ラットは、Ｋｅｔａｍｉｎｏｌ（登録商標）／キシラジン（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ ＡＧ／Ｓｉｇｍａ）（５０／１０ｍｇ／ｍｌ）混合物の筋肉内注射（１ｍｌ／ｋｇ）で麻酔してからＭａｔｒｉｇｅｌ又はＭＡＴＢIII細胞の移植を行った。画像化実験のため、動物は同じ混合物に５０％ウレタンの皮下注射（１ｇ／ｋｇ）をプラスして麻酔した。
９．ラットＭａｔＢIII腫瘍モデル
１３７６２ ＭａｔＢ IIIに指定されているラットの乳腺腺がんをＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１６６６）から入手し、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５ａ培地＋１０％ＦＣＳ．１％グルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ＃ １５２９０−０１８）中で成長させた。懸濁液中の細胞を回収し、成長培地中で洗浄、計数、遠心分離し、ＰＢＳ又は成長培地に１×１０７細胞／ｍＬで再懸濁させた。腫瘍誘導のため、０．１ｍＬ中１×１０６細胞を麻酔された雌のＦｉｓｈｅｒ ３４４ラットの乳腺脂肪体に注入した。腫瘍は通常８日以内に直径５〜８ｍｍに成長する。
１０．インビボにおける超音波画像化
腫瘍の画像化をＬ７−４リニアプローブを備えた超音波画像化システムＡＴＬ ＨＤＩ ５０００装置を用いて実施した。低音響出力（ＭＩ＝０．０５）でのＢ−モードパルスインバージョン法を用いて、新血管の内皮上に発現されているＫＤＲ受容体へのペプチド結合マイクロバブルの蓄積を追跡した。対照実験として、非結合マイクロバブル又は非特異的ペプチドに結合させたマイクロバブルを静脈内にボーラス注射した。リニアプローブを移植した腫瘍に沿って皮膚に直接固定し、標的バブルの蓄積を３０分間追跡した。
試験バブル懸濁液の注射前にＳｏｎｏ Ｖｕｅ（登録商標）の潅流を投与した。これにより、血管新生状態の評価が可能となり、Ｓｏｎｏ Ｖｕｅ（登録商標）注射後に得られたビデオ強度は内部標準とみなされる。
ベースラインフレームを記録した後、マイクロバブルの注射の間超音波照射を止めた。注射後様々な時点（１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０分）で超音波照射を再活性化し、１秒の２フレームをビデオテープに記録した。
腫瘍画像化の実験から得られたビデオフレームを、ビデオ・キャプチャとＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ２．０ソフトウェアをそれぞれ用いてキャプチャ及び分析した。腫瘍の全断面積を含む同じ長方形の関心領域（ＡＯＩ）を異なる時点（１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０分）で画像上に選択した。各時点で、ＡＯＩ内部のビデオ画素の合計をＡＯＩベースラインの差し引き後に計算した。結果はＳｏｎｏ Ｖｕｅ（登録商標）（１００％とみなされる）で得られた信号のパーセントとして表す。同様に、腫瘍の外側に位置し、自由に循環する造影剤を表す第二のＡＯＩも分析する。
図５２に、上記のように製造された本発明のヘテロ多量体構築物（Ｄ２３）に結合させたリン脂質安定化マイクロバブルの懸濁液について、注射後３０分までの腫瘍中のバブル造影剤の取込み及びリテンション（保持）を示す。一方、腫瘍部位の外側に位置するＡＯＩでは、同じバブルが一過性（せいぜい１０分間）の視覚化／バブル造影しか示さなかった。
その他の態様
本発明を、好適な態様を参照しながら説明してきたが、当業者であればその本質的特徴を容易に究明し、その精神及び範囲から離れることなく、多様な用途及び条件に適合させるために本発明を様々に変形及び変更することが可能である。当業者は、日常実験程度の実験を用いて本明細書中に記載した本発明の特定の態様の多数の等価物を認識し、又は確認できるであろう。そうした等価物も本発明の範囲に包含される。
本明細書中で言及したすべての出版物及び特許は引用によって本明細書に援用する。
図１は、ＫＤＲ−トランスフェクトされた及びｍｏｃｋ−トランスフェクトされた細胞に対する蛍光ビーズの結合を示す。指示ビオチニル化リガンドを取り付けたノイトラビジン被覆ビーズを、ＫＤＲ発現及び非発現２９３Ｈ細胞への結合に関して試験した。ＫＤＲへの特異的結合が、Ｐ５（親水性スペーサーを有する）とＰ６の両方で検出された。さらなる詳細は、実施例2に記載する。 図２は、実施例３に記載するように、ＫＤＲ−トランスフェクトされた２９３Ｈ細胞に対する１２５Ｉ標識ＶＥＧＦ結合の、２種類の濃度（３０μＭと０．３μＭ）のペプチド［Ｐ６、Ｐ４、Ｐ５−Ｘ−Ｂ及びＰ１２−Ｘ−Ｂ］による阻害率（％）を示す。Ｐ６、Ｐ４及びＰ５−Ｘ−Ｂの結果は、３実験の平均値±ＳＤであるが、Ｐ１２−Ｘ−Ｂの結果は、1実験に基づくものである。 図３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し(resolved)、ブロットし、抗ホスホチロシン（「Ｐｈｏｓｐｈｏ ＫＤＲ」）及び抗ＫＤＲ（「Ｔｏｔａｌ ＫＤＲ」）抗体によって連続的にプローブした、無刺激（−Ｖ）及びＶＥＧＦ刺激（＋Ｖ）ＨＵＶＥＣｓからのＫＤＲ免疫沈降物のイムノブロットを示す。活性化（リン酸化）ＫＤＲは、無刺激（−Ｖ）ＨＵＶＥＣｓでは検出されなかったが、ＶＥＧＦ刺激（＋Ｖ）ＨＵＶＥＣｓからの免疫沈降物中では豊富に存在した。抗ＫＤＲによる該ブロットの再プロービング(reprobing)は、両方の免疫沈降物中に匹敵しうる量のＴｏｔａｌ ＫＤＲが存在することを実証した。この図は、同じプロトコールに従った１２回実験を表す。 図４は、実施例４に記載するような、中和抗ＫＤＲ抗体によるＫＤＲリン酸化（活性化）の阻害を実証するイムノブロットを示す。無刺激（−Ｖ）、ＶＥＧＦ刺激（＋Ｖ）及び同時ＶＥＧＦ／抗ＫＤＲ（１μｇ／ｍｌ）（＋Ｖ＋α−ＫＤＲ）−処理ＨＵＶＥＣｓからの免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、ブロットし、抗ホスホチロシン（「Ｐｈｏｓｐｈｏ ＫＤＲ」）及び抗ＫＤＲ（「Ｔｏｔａｌ ＫＤＲ」）抗体によって連続的にプローブした。実施例４に記載するように、該中和抗体は、ＫＤＲのＶＥＧＦ誘導活性化を部分的にブロックすることができた。 図５は、ＫＤＲ−結合ペプチドによるＫＤＲリン酸化（活性化）の阻害を実証するイムノブロットを示す（反復実験）。無刺激（−Ｖ）、ＶＥＧＦ刺激（＋Ｖ）及びＫＤＲ−結合ペプチド（１０μＭ）（＋Ｖ＋Ｐ１０）−処理ＨＵＶＥＣｓからの免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、ブロットし、抗ホスホチロシン（「Ｐｈｏｓｐｈｏ ＫＤＲ」）及び抗ＫＤＲ（「Ｔｏｔａｌ ＫＤＲ」）抗体によって連続的にプローブした。実施例４に記載するように、ＫＤＲ−結合ペプチドＰ１０は、ＫＤＲのＶＥＧＦ誘導活性化を１０μＭにおいて部分的にブロックすることが明らかに可能であった。 図６は、実施例５に記載するような、ｍｏｃｋ及びＫＤＲ−トランスフェクトされた２９３Ｈ細胞に対するＴｃ標識Ｐ１２−Ｃの結合を示す。 図７は、実施例５に記載するような、ＫＤＲ−トランスフェクトされた２９３Ｈ細胞に対するＴｃ標識Ｐ１２−Ｃの特異的結合を示す。 図８は、実施例６に記載するような、ペプチド／ノイトラビジン(neutravidin)ＨＲＰ複合体の飽和結合を示す。図８Ａは、Ｐ６−ＸＢとＰ５−ＸＢを用いて得た結果を示す。図８Ｂは、Ｐ１２−ＸＢとＰ１３−ＸＢを用いて得た結果を示す。ＫＤ計算値は、１０．００ｎＭ（Ｐ６−ＸＢ）、１４．８７ｎＭ（Ｐ５−ＸＢ）、４．０３ｎＭ（Ｐ１２−ＸＢ）及び１．８１ｎＭ（Ｐ１３−ＸＢ）であった。 図９は、実施例６に記載するような、ＫＤＲ−トランスフェクトされた及びｍｏｃｋ−トランスフェクトされた２９３Ｈ細胞に対するペプチド／ノイトラビジンＨＲＰ複合体（Ｐ１−Ｘ−Ｂ、Ｐ５−Ｘ−Ｂ、Ｐ６−ＸＢ、Ｐ１２−ＸＢ及びＰ１３−ＸＢ）の単一濃度（５．５ｎＭ）における結合を示す。 図１０は、実施例６の実験Ｂに記載するような、ＫＤＲ−トランスフェクトされた及びｍｏｃｋ−トランスフェクトされた２９３Ｈ細胞に対するペプチド／ノイトラビジンＨＲＰ複合体（Ｐ１−ＸＢ、Ｐ１−Ｂ、Ｐ５−ＸＢ、Ｐ５−Ｂ、Ｐ６−ＸＢ及びＰ６−Ｂ）の単一濃度（２．７８ｎＭ）における結合を示す。 図１１は、実施例６の実験Ｃに記載するような、４０％ラット血清を含む又は含まないペプチド／ノイトラビジンＨＲＰ複合体（Ｐ６−ＸＢ、Ｐ５−ＸＢ、Ｐ１２−ＸＢ及びＰ１３−ＸＢ）の特異的結合（ＫＤＲ−トランスフェクトされた細胞に対する結合マイナスｍｏｃｋ−トランスフェクトされた細胞に対する結合）を示す。ペプチド／アビジンＨＲＰ溶液の濃度は、Ｐ６-ＸＢとＰ５−ＸＢに対して６．６６ｎＭ、Ｐ１２−ＸＢに対して３．３３ｎＭ、及びＰ１３−ＸＢに対して２．２２ｎＭであった。 図１２は、４５０ｎｍにおける吸光度としてプロットした、ｍｏｃｋ−及びＫＤＲ−トランスフェクトされた細胞とのペプチド／アビジンＨＲＰの結合を示す。各テトラマー複合体の形成に用いた対照とＫＤＲ-結合ペプチドとの割合は、レジェンドに、試験した各マルチマーに関して示す。 図１３は、４５０ｎｍにおける吸光度としてプロットした、ＫＤＲ−トランスフェクトされた細胞へのＰ５−ＸＢ／アビジン−ＨＲＰ複合体の特異的結合（ｍｏｃｋ−トランスフェクトされた細胞に対するバックグラウンド結合を控除する）を示す。レジェンドに示すように、非複合体化ペプチドの上昇する濃度（Ｘ軸によって示す）を、アッセイに加えた。遊離Ｐ５−ＸＢのみが、ＫＤＲ−トランスフェクトされた細胞へのＰ５−ＸＢ／アビジン複合体の結合を減ずることができた。 図１４は、ＫＤＲ−トランスフェクトされた２９３Ｈ細胞に対する、３種類の異なる濃度（１０μＭ、０．３μＭ及び０．０３μＭ）のペプチド（Ｐ１2−ＸＢ、Ｄ２、Ｄ１、Ｄ３、及びＰ１３−Ｄ）による、１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦ結合の阻害率（％）を示すグラフである。結果は、３通りに行なった１実験から＋／−Ｓ．Ｄ．である。 図１５は、１０ｎＭにおけるＨＵＶＥＣｓ中のＫＤＲのＶＥＧＦ誘導リン酸化を完全にブロックし、１ｎＭにおけるリン酸化の大部分をブロックするＤ１の能力を示すフォトグラフである。ｔｏｔａｌ ＫＤＲ（下部パネル）のブロットの再プロービングは、試験した化合物の効果がサンプル負荷の減少によるものではないことを実証した。Ｄ１に含有される２結合配列から成るホモダイマーは、１００ｎＭまでにおいてリン酸化を妨害しなかった。 図１６は、Ｄ１が、ＶＥＧＦによって誘導される、内皮細胞のマイグレーション／侵入(invasion)を強力にブロックすることを示す。マイグレートした細胞を蛍光染料で染色した後の蛍光測定によって、マイグレートする細胞を数値化した。 図１７は、４０％マウス血清の不存在下及び存在下での、ｍｏｃｋ−及びＫＤＲ−トランスフェクトされた２９３Ｈ細胞への１２５Ｉ−標識Ｄ５の結合を示すグラフである。 図１８は、４０％マウス血清の不存在下及び存在下での、ＫＤＲ−トランスフェクトされた２９３Ｈ細胞への１２５Ｉ−標識Ｄ５の特異的結合（ＫＤＲ−ＭＯＣＫ）を示すグラフである。 図１９は、注入量％／ｍｌ対 時間としての血漿クリアランスのグラフである。 図２０は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘペプチドカラムからの血漿のＳＥ−ＨＰＬＣプロフィルを示す。頂部パネル、サンプル注入；その後、０分、３０分及び９０分に注入する。各パネル内のインサートは、時点、動物数、及びＨＰＬＣ分析のための注入量を示す。 図２１は、ＨＵＶＥＣ増殖アッセイにおけるＫＤＲペプチドの試験結果を示すグラフである。ＡはＤ６を表し；ＢはＰ１２−Ｇを表し；ＣはＰＮＣ−１（ネガティブ対照）を表す；Ｆ、ＰＮＣ-1（ネガティブ対照）。 図２２は、ネズミＫＤＲ−Ｆｃに結合するＤ１（Ｐ６−Ｄ及びＰ１２-Ｇの切頭形(truncated form)のヘテロダイマー）の動的分析(kinetic analysis)を示す。全てのセンソグラムは、二価分析物モデル(bivalent analyte model)に適合する。 図２３は、ネズミＫＤＲ−Ｆｃに結合するＤ７（Ｐ５−Ｄ及びＰ６-Ｄのヘテロダイマー）の動的分析を示す。全てのセンソグラムは、二価分析物モデルに適合する。 図２４は、ネズミＫＤＲ−Ｆｃに結合するフルオレセイン標識Ｐ１２-Ｇの動的分析を示す。全てのセンソグラムは、１：１ Langmuirモデルに適合する。 図２５は、実施例６の実験Ｃに記載するような、４０％ラット血清の存在下及び不存在下での、９９ｍＴｃ標識Ｐ１２Ｃの特異的結合（ＫＤＲ−トランスフェクトされた細胞への結合マイナスｍｏｃｋ−トランスフェクトされた細胞への結合）を示すグラフである。結果は特異的結合したＣＰＭ＋／−ｓ．ｄ．としてプロットする。 図２６は、ＰＧ−１（方形）、Ｄ１（菱形）による、ＫＤＲ−トランスフェクトされた細胞への特異的１２５Ｉ−ＶＥＧＦ結合の阻害％＋／−ｓ．ｄ．を示すグラフである。 図２７は、指示濃度のＰＧ−１（菱形）、Ｄ１（方形）の存在下でのＨＵＶＥＣ細胞の最大ＶＥＧＦ刺激マイグレーション％＋／−ｓ．ｄ．を示すグラフである。 図２８は、実施例１８に記載したような、ＫＤＲ−トランスフェクトされた２９３Ｈ細胞に対するＴｃ−標識Ｄ１０の結合を示す第１グラフと、 実施例１８に記載したような、ＫＤＲ−トランスフェクトされた２９３Ｈ細胞に対するＴｃ−標識Ｄ１８の結合の欠損を示す第２グラフを示す。Ｍｏｃｋ＝ｍｏｃｋ−トランスフェクトされた。Ｔｒａｎｓ＝ＫＤＲ−トランスフェクトされた。ＭＳ＝マウス血清。 図２９は、実施例１９に記載したような、ＫＤＲ−トランスフェクトされた２９３Ｈ細胞に対するＬｕ−標識Ｄ１３の結合を示すグラフである。Ｍｏｃｋ＝ｍｏｃｋ−トランスフェクトされた。Ｔｒａｎｓ＝ＫＤＲ−トランスフェクトされた。ＭＳ＝マウス血清。 図３０Ａは、ＫＤＲ−発現細胞に対するペプチド−コンジュゲートしたミクロバブルの結合の特異性を示すグラフである。 図３０Ｂは、ＫＤＲ−発現細胞上のミクロバブルにコンジュゲートしたモノマー及びダイマーの結合効率を示すグラフである。 図３０Ｃは、ＫＤＲ−発現細胞上のミクロバブルにコンジュゲートした、混合モノマー、ダイマー及びモノマーの結合効率を示すグラフである。 図３１は、ＰＣ３腫瘍を移植されたヌードマウスで行なったＤ１３による放射線療法試験の結果を要約するグラフである。実施例２１に記載するように、非治療マウス組における平均腫瘍成長を表すヘビーダッシュ線を除いて、各プロット線は、治療されたマウスにおける個々の腫瘍の長期間にわたる成長を表す。 図３２は、ｍｏｃｋ−トランスフェクトされた及びＫＤＲ-トランスフェクトされた細胞に対する、対照ペプチド及び試験ペプチド（Ｐ３０−ＸＢ、Ｐ３１−ＸＢ、Ｐ３２−ＸＢ）の１２５Ｉ−ストレプトアビジンとの複合体の総合結合を示すグラフである。Ｐ３０−ＸＢを含有する複合体のみが、特異的結合（ＫＤＲ−ｍｏｃｋ）を示した。 図３３は、そのグリコシル化と修飾されたスペーサーを有するＤ２６(方形)がＶＥＧＦ−刺激マイグレーションを、このような化学的修飾を有さないＤ２４（菱形）よりもさらにより強力にブロックすることが可能であることを示すグラフである。 図３４は、ＴＫ−１が、培養されたＨＵＶＥＣｓによるマイグレーション・アッセイにおいてＶＥＧＦの生物学的効果のブロッキングにおけるＤ６の効力を強化することを示すグラフである。菱形：指示濃度におけるＤ６単独。方形：指示濃度におけるＤ６プラス１００ｎＭ ＴＫ−１（一定）。 図３５は、ホモダイマーＤ８（方形）が、実施例２５で行なわれたようなマイグレーション・アッセイにおいてＶＥＧＦの効果のブロッキングに関して、ヘテロダイマーＤ１７（菱形）よりも低い能力であることを示すグラフである。 図３６は、本明細書の実施例３１に記載するような、Ｄ６に関する細胞増殖データを示すグラフである。 図３７Ａは、（Ａ）Ｃ−末端〜Ｃ−末端連結ダイマー；（Ｂ）Ｎ−末端〜Ｃ−末端連結ダイマー；及び（Ｃ）Ｎ−末端〜Ｎ−末端連結ダイマーの例の説明である。 図３７Ｂは、Ｃ−末端〜Ｃ−末端連結ダイマーの一般的構造の説明である。 図３７Ｃは、Ｎ−末端〜Ｃ−末端連結ダイマーの一般的構造の説明である。 図３７Ｄは、Ｎ−末端〜Ｎ−末端連結ダイマーの一般的構造の説明である。 図３７Ｅは、Ｎ−末端〜Ｎ−末端連結ダイマーの代替え構造の説明である。 図３８Ａは、ペプチド１のための分枝基Ｂの例を説明する。 図３８Ｂは、ペプチド１のための分枝基Ｂの他の例を説明する。 図３９は、本発明の中間体化合物を製造するための合成方法の例を説明する。 図４０は、リンカーＤの製造に用いられる環状ジカルボン酸ＨＯＯＣ−Ｚ−ＣＯＯＨの例を説明する。 図４１は、リンカーＤ化合物の活性アシル化誘導体に用いられる脱離基の例を説明する。 図４２は、二官能性リンカーＤとしての４−メルカプトブタノイル基を用いる反応の例を説明する。 図４３Ａは、ペプチド２のための分枝基Ｂ’の例を説明する。 図４３Ｂは、ペプチド２のための分枝基Ｂ’の他の例を説明する。 図４４は、ペプチド１−分枝基Ｂ−リンカーＤ−脱離基化合物の製造を説明する。 図４５は、ペプチド１−分枝基Ｂ−スペーサー１−リンカーＤ−スペーサー２−分枝基Ｂ’-ペプチド２ダイマーのアセンブリの例を説明する。 図４６は、アミン含有ダイマーとの活性アシル化種の反応による、レポーター−ｓｐ分子の取り付けの例を示す。 図４７は、アミン含有レポーター−ｓｐとの活性アシル化ダイマーの反応によるレポーター−ｓｐ分子−標識ダイマーの製造の例を示す。 図４８は、ペプチド構築体にレポーター−ｓｐ分子を取り付けるための代替え方法を説明する。 図４９は、リンカーＤ機能としてジアミンを用いる活性アシルペプチド分枝基スペーサーからのダイマーペプチドの製造例を示す。 図５０は、ジアミン・リンカーＤとして用いた、式：ＮＨ２−Ｑ−Ｚ−Ｑ’−ＮＨ２で示され、芳香核Ｚを有する環状ジアミンの例を示す。 図５１は、ジアミン・リンカーＤとして用いた、式：ＮＨ２−Ｑ−Ｚ−Ｑ’−ＮＨ２で示され、脂肪族核Ｚを有する環状脂肪族ジアミンの例を示す。 図５２は、ヘテロマルチマー構築体（Ｄ２３）にコンジュゲートしたリン脂質安定化ミクロバブルの懸濁液の注射後３０分間までの腫瘍中のバブル造影剤(bubble contrast)の取り込みと保持を示すグラフである。 図５３は、腹腔内注射されたＶＥＧＦによって誘導された腹膜血管透過性上昇をＤ２５がブロックすることを示す棒グラフである。 図５４Ａは、ＴＮ１１／１ライブラリーから単離されたＫＤＲ−結合ペプチドのリストである。 図５４Ｂは、ＴＮ１１／１ライブラリーから単離されたＫＤＲ−結合ペプチドのリストである。 図５４Ｃは、ＴＮ１１／１ライブラリーから単離されたＫＤＲ−結合ペプチドのリストである。 図５４Ｄは、ＴＮ１１／１ライブラリーから単離されたＫＤＲ−結合ペプチドのリストである。 図５４Ｅは、ＴＮ１１／１ライブラリーから単離されたＫＤＲ−結合ペプチドのリストである。 図５４Ｆは、ＴＮ１１／１ライブラリーから単離されたＫＤＲ−結合ペプチドのリストである。 図５４Ｇは、ＴＮ１１／１ライブラリーから単離されたＫＤＲ−結合ペプチドのリストである。 図５４Ｈは、ＴＮ１１／１ライブラリーから単離されたＫＤＲ−結合ペプチドのリストである。 図５４Ｉは、ＴＮ１１／１ライブラリーから単離されたＫＤＲ−結合ペプチドのリストである。 図５４Ｊは、ＴＮ１１／１ライブラリーから単離されたＫＤＲ−結合ペプチドのリストである。 図５４Ｋは、ＴＮ１１／１ライブラリーから単離されたＫＤＲ−結合ペプチドのリストである。 図５４Ｌは、ＴＮ１１／１ライブラリーから単離されたＫＤＲ−結合ペプチドのリストである。 図５４Ｍは、ＴＮ１１／１ライブラリーから単離されたＫＤＲ−結合ペプチドのリストである。 図５４Ｎは、ＴＮ１１／１ライブラリーから単離されたＫＤＲ−結合ペプチドのリストである。 図５４Ｏは、ＴＮ１１／１ライブラリーから単離されたＫＤＲ−結合ペプチドのリストである。 図５４Ｐは、ＴＮ１１／１ライブラリーから単離されたＫＤＲ−結合ペプチドのリストである。 図５４Ｑは、ＴＮ１１／１ライブラリーから単離されたＫＤＲ−結合ペプチドのリストである。 図５４Ｒは、ＴＮ１１／１ライブラリーから単離されたＫＤＲ−結合ペプチドのリストである。

Claims (79)

  1. 式：
    Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆ
    ［式中、Ａは第１ペプチドであり、Ｂは第１分枝基であり、Ｃは任意の第１スペーサーであり、Ｄは、ジカルボン酸の誘導体を含むリンカーであり、Ｅは、前記第１スペーサーＣと同じものでも、異なるものでもよい、任意の第２スペーサーであり、Ｂ’は、前記第１分枝基Ｂと同じものでも、異なるものでもよい、任意の第２分枝基であり、Ｆは、前記第１ペプチドＡと同じものでも、異なるものでもよい、第２ペプチドである］
    で示される多価化合物の製造方法であって、前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ’又はＦのいずれかを、式：Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆにおける、その各隣接構成要素(単数又は複数）のいずれかに、化合物Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆが形成されるまで、任意の順序で取り付ける工程を含む方法。
  2. Ｄが、グルタル酸ビスＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル又はその誘導体を含む、請求項１記載の方法。
  3. 前記分枝基Ｂ又はＢ’の一方に第１レポーター−ｓｐ基を取り付ける工程を含む、請求項１記載の方法。
  4. 第１レポーター−ｓｐ基が取り付けられなかった、前記分枝基Ｂ又はＢ’の他方に第２レポーター−ｓｐ基を取り付ける工程を含む、請求項３記載の方法。
  5. 前記第１ペプチドＡと前記第２ペプチドＦとが、Ｃ末端からＣ末端に接続される、請求項１記載の方法。
  6. 前記第１ペプチドＡと前記第２ペプチドＦとが、Ｎ末端からＣ末端に接続される、請求項１記載の方法。
  7. 前記第１ペプチドＡと前記第２ペプチドＦとが、Ｃ末端からＮ末端に接続される、請求項１記載の方法。
  8. 前記第１ペプチドＡと前記第２ペプチドＦとが、Ｎ末端からＮ末端に接続される、請求項１記載の方法。
  9. 前記最終生成物Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆが、ヘテロダイマーである、請求項１記載の方法。
  10. 第１ペプチドＡと第２ペプチドＦとが、異なるペプチドである、請求項１記載の方法。
  11. 第１ペプチドＡと第２ペプチドＦとが、異なるターゲッティング・ペプチドである、請求項１記載の方法。
  12. 第１ペプチドＡと第２ペプチドＦとが、同一ターゲットの異なるエピトープを標的とする、請求項１記載の方法。
  13. 第１ペプチドＡと第２ペプチドＦとが、同一受容体の異なるエピトープを標的とする、請求項１記載の方法。
  14. 前記受容体がＫＤＲである、請求項１３記載の方法。
  15. 前記受容体がｃＭＥＴである、請求項１３記載の方法。
  16. 前記第１ペプチドＡ又は前記第２ペプチドＦの少なくとも一方が、下記：
    から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
  17. 前記第１ペプチドＡ及び前記第２ペプチドＦのいずれか一方又は両方がジスルフィド・ペプチドである、請求項１記載の方法。
  18. 前記第１ペプチドＡが、前記第１分枝基Ｂによって供給されるアミノ基によって前記第１スペーサーＣにアミド結合を介して接合する、ジスルフィド結合を含む又は含まない３〜５０（Ｄ又はＬ）−α−アミノ酸を含む、請求項１記載の方法。
  19. 前記第１ペプチドＡ及び前記第２ペプチドＦの一方又は両方が、線状ペプチド、環状ジスルフィド・ペプチド、ジスルフィド結合模倣環状ペプチド、ペプチド模倣体（線状若しくは環状のいずれか）、小分子、環状ラクタム・ペプチド及び環状ペプチド・ラクトンから成る群から選択される、請求項１記載の方法。
  20. 前記第１分枝基Ｂ及び前記第２分枝基Ｂ’の一方又は両方が、リシン、オルニチン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、又はこれらの誘導体である、請求項１記載の方法。
  21. 前記第１分枝基Ｂが、下記：
    ペプチド１−パート１のための分枝基Ｂの例
    ペプチド１−パート２のための分枝基Ｂの例
    から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
  22. 前記第２分枝基Ｂ’が、下記：
    ペプチド２のＣ−末端分枝基
    ペプチド２のＮ−末端分枝基Ｂ’
    から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
  23. 前記第１スペーサーＣが存在する、請求項１記載の方法。
  24. 前記第１スペーサーＣが１つ以上のアミノ酸を含む、請求項２３記載の方法。
  25. 前記第１スペーサーＣが、下記：
    （ａ）Ｇｌｙ
    （ｂ）Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
    （ｃ）Ｓｅｒ（Ｓ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｓ）
    式中、Ｓ基は、例えば、Ｎ−アセチルガラクトースアミン、Ｄ−（＋）−アロース、Ｄ−（＋）−アルトロース、Ｄ−（＋）−グルコース、Ｄ−（＋）−マンノース、Ｄ−（−）−グロース、Ｄ−（−）−イドース、Ｄ−（＋）−ガラクトース、Ｄ−（−）−タロース、Ｄ−（−）−リボース、Ｄ−（−）−アラビノース、Ｄ−（＋）−キシロース又はＤ−（−）−リキソースから選択されうる糖部分のような親水性官能基を含み、セリン側鎖酸素と該糖との結合はアノマー炭素を介する；
    （ｄ）８−アミノ−３，５−ジオキサオクタン酸
    （ｅ）８−（８−アミノ−３，５−ジオキサオクタノイル)アミノ−３，５−ジオキサオクタン酸若しくは９，１７−ジアミノ−１０−オキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸
    （ｆ）４−アミノ安息香酸
    （ｇ）４−アミノメチル安息香酸
    （ｈ）４’−アミノ−４−ビフェニルカルボン酸
    （ｉ）４’−アミノメチル−４−ビフェニルカルボン酸
    （ｊ）４−メルカプト酪酸
    （ｋ）２−メルカプト酢酸
    （ｌ）システイン
    （ｍ）４−（２−ピリジルジチオ）酪酸
    （ｎ）２−ピリジルジチオ酢酸
    （ｏ）システイン−２−チオピリジルジスルフィド
    （ｐ）２−アミノエチル−２−ピリジルジスルフィド
    の１つ以上を含む、請求項２３記載の方法。
  26. 第１スペーサーＣと第２スペーサーＥの両方が存在する、請求項１記載の方法。
  27. 前記第２スペーサーＥが、下記：
    （ａ）Ｇｌｙ
    （ｂ）Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
    （ｃ）Ｓｅｒ（Ｓ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｓ）
    式中、Ｓ基は、例えば、Ｎ−アセチルガラクトースアミン、Ｄ−（＋）−アロース、Ｄ−（＋）−アルトロース、Ｄ−（＋）−グルコース、Ｄ−（＋）−マンノース、Ｄ−（−）−グロース、Ｄ−（−）−イドース、Ｄ−（＋）−ガラクトース、Ｄ−（−）−タロース、Ｄ−（−）−リボース、Ｄ−（−）−アラビノース、Ｄ−（＋）−キシロース又はＤ−（−）−リキソースから選択されうる糖部分のような親水性官能基を含み、セリン側鎖酸素と該糖との結合はアノマー炭素を介する；
    （ｄ）８−アミノ−３，５−ジオキサオクタン酸
    （ｅ）８−（８−アミノ−３，５−ジオキサオクタノイル)アミノ−３，５−ジオキサオクタン酸若しくは９，１７−ジアミノ−１０−オキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸
    （ｆ）４−アミノ安息香酸
    （ｇ）４−アミノメチル安息香酸
    （ｈ）４’−アミノ−４−ビフェニルカルボン酸
    （ｉ）４’−アミノメチル−４−ビフェニルカルボン酸
    （ｊ）４−メルカプト酪酸
    （ｋ）２−メルカプト酢酸
    （ｌ）システイン
    （ｍ）４−（２−ピリジルジチオ）酪酸
    （ｎ）２−ピリジルジチオ酢酸
    （ｏ）システイン−２−チオピリジルジスルフィド
    （ｐ）２−アミノエチル−２−ピリジルジスルフィド
    の１つ以上を含む、請求項２６記載の方法。
  28. 前記第１レポーター−ｓｐ基がリン脂質又は脂質部分を含む、請求項３記載の方法。
  29. 前記第１レポーター−ｓｐ基又は第２レポーター−ｓｐ基のいずれか又は両方が、リン脂質又は脂質部分を含む、請求項４記載の方法。
  30. 前記第１レポーター−ｓｐ基が、反磁性若しくは常磁性金属キレート、金属キレーター系、放射性金属キレート形成系、放射性同位元素標識分子、染料分子、蛍光性分子、リン光性分子、ＵＶスペクトル吸収分子、近赤外線若しくは遠赤外線吸収可能な分子；又はＸ線、ガンマー線、ベータ粒子、アルファ粒子、超音波、光学若しくは磁気シグナルを吸収若しくは放出する分子若しくは超分子構築体を含む、請求項３記載の方法。
  31. 前記第１レポーター−ｓｐ基又は前記第２レポーター−ｓｐ基のいずれか又は両方が、反磁性若しくは常磁性金属キレート、金属キレーター系、放射性金属キレート形成系、放射性同位元素標識分子、染料分子、蛍光性分子、リン光性分子、ＵＶスペクトル吸収分子、近赤外線若しくは遠赤外線吸収可能な分子；又はＸ線、ガンマー線、ベータ粒子、アルファ粒子、超音波、光学若しくは磁気シグナルを吸収若しくは放出する分子若しくは超分子構築体を含む、請求項４記載の方法。
  32. 前記レポーター−ｓｐ基が、治療剤として作用する可能性を有する、請求項３記載の方法。
  33. 前記第１レポーター−ｓｐ基又は前記第２レポーター−ｓｐ基のいずれか又は両方が、治療剤として作用する可能性を有する、請求項４記載の方法。
  34. 前記レポーター−ｓｐ基が、癌細胞又は正常組織の増殖を選択的に殺す及び／又は阻害するために用いられるトキシンとして作用する可能性を有する、請求項３記載の方法。
  35. 前記第１レポーター−ｓｐ基又は前記第２レポーター−ｓｐ基のいずれか又は両方が、癌細胞又は正常組織の増殖を選択的に殺す及び／又は阻害するために用いられるトキシンとして作用する可能性を有する、請求項４記載の方法。
  36. 第１分枝基Ｂ又は第２分枝基Ｂ’のいずれかに少なくとも第３レポーター−ｓｐ基を取り付ける工程を含む、請求項４記載の方法。
  37. 製造される多価化合物が、下記：
    から成る群から選択される、請求項２記載の方法。
  38. 製造される多価化合物が、下記：
    である、請求項１記載の方法。
  39. 式：
    Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆ
    ［式中、Ａは第１ペプチドであり、Ｂは第１分枝基であり、Ｃは任意の第１スペーサーであり、Ｄは、ジアミン又はその誘導体を含むリンカーであり、Ｅは、前記第１スペーサーＣと同じものでも、異なるものでもよい、任意の第２スペーサーであり、Ｂ’は、前記第１分枝基Ｂと同じものでも、異なるものでもよい、任意の第２分枝基であり、Ｆは、前記第１ペプチドＡと同じものでも、異なるものでもよい、第２ペプチドである］
    で示される多価化合物の製造方法であって、前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ’又はＦのいずれかを、式：Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆにおける、その各隣接構成要素(単数又は複数）のいずれかに、化合物Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆが形成されるまで、任意の順序で取り付ける工程を含む方法。
  40. 前記分枝基Ｂ又はＢ’の一方に第１レポーター−ｓｐ基を取り付ける工程を含む、請求項３９記載の方法。
  41. 第１レポーター−ｓｐ基が取り付けられなかった、前記分枝基Ｂ又はＢ’の他方に第２レポーター−ｓｐ基を取り付ける工程を含む、請求項４０記載の方法。
  42. 前記第１ペプチドＡと前記第２ペプチドＦとが、Ｃ末端からＣ末端に接続される、請求項３９記載の方法。
  43. 前記第１ペプチドＡと前記第２ペプチドＦとが、Ｎ末端からＣ末端に接続される、請求項３９記載の方法。
  44. 前記第１ペプチドＡと前記第２ペプチドＦとが、Ｃ末端からＮ末端に接続される、請求項３９記載の方法。
  45. 前記第１ペプチドＡと前記第２ペプチドＦとが、Ｎ末端からＮ末端に接続される、請求項３８記載の方法。
  46. 前記最終生成物Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｂ’−Ｆが、ヘテロダイマーである、請求項３９記載の方法。
  47. 第１ペプチドＡと第２ペプチドＦとが、異なるペプチドである、請求項３９記載の方法。
  48. 第１ペプチドＡと第２ペプチドＦとが、異なるターゲッティング・ペプチドである、請求項３９記載の方法。
  49. 第１ペプチドＡと第２ペプチドＦとが、同一ターゲットの異なるエピトープを標的とする、請求項３９記載の方法。
  50. 第１ペプチドＡと第２ペプチドＦとが、同一受容体の異なるエピトープを標的とする、請求項３９記載の方法。
  51. 前記受容体がＫＤＲである、請求項５０記載の方法。
  52. 前記受容体がｃＭＥＴである、請求項５０記載の方法。
  53. 前記第１ペプチドＡ又は前記第２ペプチドＦの少なくとも一方が、下記：
    から成る群から選択される、請求項３９記載の方法。
  54. 前記第１ペプチドＡ及び前記第２ペプチドＦの一方又は両方が、ジスルフィド・ペプチドである、請求項３９記載の方法。
  55. 前記第１ペプチドＡが、前記第１分枝基Ｂによって供給されるアミノ基によって前記第１スペーサーＣにアミド結合を介して接合する、ジスルフィド結合を含む又は含まない３〜５０（Ｄ又はＬ）−α−アミノ酸を含む、請求項３９記載の方法。
  56. 前記第１ペプチドＡ及び前記第２ペプチドＦの一方又は両方が、線状ペプチド、環状ジスルフィド・ペプチド、ジスルフィド結合模倣環状ペプチド、ペプチド模倣体（線状若しくは環状のいずれか）、小分子、環状ラクタム・ペプチド及び環状ペプチド・ラクトンから成る群から選択される、請求項３９記載の方法。
  57. 前記第１分枝基Ｂ及び前記第２分枝基Ｂ’の一方又は両方が、リシン、オルニチン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、又はこれらの誘導体である、請求項３９記載の方法。
  58. 前記第１分枝基Ｂが、下記：
    ペプチド１−パート１のための分枝基Ｂの例
    ペプチド１−パート２のための分枝基Ｂの例
    から成る群から選択される、請求項３９記載の方法。
  59. 前記第２分枝基Ｂ’が、下記：
    ペプチド２のＣ−末端分枝基
    ペプチド２のＮ−末端分枝基Ｂ’
    から成る群から選択される、請求項３９記載の方法。
  60. 前記第１スペーサーＣが存在する、請求項３９記載の方法。
  61. 前記第１スペーサーＣが１つ以上のアミノ酸を含む、請求項６０記載の方法。
  62. 前記第１スペーサーＣが、下記：
    （ａ）Ｇｌｙ
    （ｂ）Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
    （ｃ）Ｓｅｒ（Ｓ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｓ）
    式中、Ｓ基は、例えば、Ｎ−アセチルガラクトースアミン、Ｄ−（＋）−アロース、Ｄ−（＋）−アルトロース、Ｄ−（＋）−グルコース、Ｄ−（＋）−マンノース、Ｄ−（−）−グロース、Ｄ−（−）−イドース、Ｄ−（＋）−ガラクトース、Ｄ−（−）−タロース、Ｄ−（−）−リボース、Ｄ−（−）−アラビノース、Ｄ−（＋）−キシロース又はＤ−（−）−リキソースから選択されうる糖部分のような親水性官能基を含み、セリン側鎖酸素と該糖との結合はアノマー炭素を介する；
    （ｄ）８−アミノ−３，５−ジオキサオクタン酸
    （ｅ）８−（８−アミノ−３，５−ジオキサオクタノイル)アミノ−３，５−ジオキサオクタン酸若しくは９，１７−ジアミノ−１０−オキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸
    （ｆ）４−アミノ安息香酸
    （ｇ）４−アミノメチル安息香酸
    （ｈ）４’−アミノ−４−ビフェニルカルボン酸
    （ｉ）４’−アミノメチル−４−ビフェニルカルボン酸
    （ｊ）４−メルカプト酪酸
    （ｋ）２−メルカプト酢酸
    （ｌ）システイン
    （ｍ）４−（２−ピリジルジチオ）酪酸
    （ｎ）２−ピリジルジチオ酢酸
    （ｏ）システイン−２−チオピリジルジスルフィド
    （ｐ）２−アミノエチル−２−ピリジルジスルフィド
    の１つ以上を含む、請求項６０記載の方法。
  63. 第１スペーサーＣと第２スペーサーＥの両方が存在する、請求項３９記載の方法。
  64. 前記第２スペーサーＥが、下記：
    （ａ）Ｇｌｙ
    （ｂ）Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
    （ｃ）Ｓｅｒ（Ｓ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｓ）
    式中、Ｓ基は、例えば、Ｎ−アセチルガラクトースアミン、Ｄ−（＋）−アロース、Ｄ−（＋）−アルトロース、Ｄ−（＋）−グルコース、Ｄ−（＋）−マンノース、Ｄ−（−）−グロース、Ｄ−（−）−イドース、Ｄ−（＋）−ガラクトース、Ｄ−（−）−タロース、Ｄ−（−）−リボース、Ｄ−（−）−アラビノース、Ｄ−（＋）−キシロース又はＤ−（−）−リキソースから選択されうる糖部分のような親水性官能基を含み、セリン側鎖酸素と該糖との結合はアノマー炭素を介する；
    （ｄ）８−アミノ−３，５−ジオキサオクタン酸
    （ｅ）８−（８−アミノ−３，５−ジオキサオクタノイル)アミノ−３，５−ジオキサオクタン酸若しくは９，１７−ジアミノ−１０−オキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸
    （ｆ）４−アミノ安息香酸
    （ｇ）４−アミノメチル安息香酸
    （ｈ）４’−アミノ−４−ビフェニルカルボン酸
    （ｉ）４’−アミノメチル−４−ビフェニルカルボン酸
    （ｊ）４−メルカプト酪酸
    （ｋ）２−メルカプト酢酸
    （ｌ）システイン
    （ｍ）４−（２−ピリジルジチオ）酪酸
    （ｎ）２−ピリジルジチオ酢酸
    （ｏ）システイン−２−チオピリジルジスルフィド
    （ｐ）２−アミノエチル−２−ピリジルジスルフィド
    の１つ以上を含む、請求項６記載の方法。
  65. 前記第１レポーター−ｓｐ基がリン脂質又は脂質部分を含む、請求項４０記載の方法。
  66. 前記第１レポーター−ｓｐ基又は第２レポーター−ｓｐ基のいずれか又は両方が、リン脂質又は脂質部分を含む、請求項４１記載の方法。
  67. 前記第１レポーター−ｓｐ基が、反磁性若しくは磁性金属キレート、金属キレーター系、放射性金属キレート形成系、放射性同位元素標識分子、染料分子、蛍光性分子、リン光性分子、ＵＶスペクトル吸収分子、近赤外線若しくは遠赤外線吸収可能な分子；又はＸ線、ガンマー線、ベータ粒子、アルファ粒子、超音波、光学若しくは磁気シグナルを吸収若しくは放出する分子若しくは超分子構築体を含む、請求項４０記載の方法。
  68. 前記第１レポーター−ｓｐ基又は前記第２レポーター−ｓｐ基のいずれか又は両方が、反磁性若しくは磁性金属キレート、金属キレーター系、放射性金属キレート形成系、放射性同位元素標識分子、染料分子、蛍光性分子、リン光性分子、ＵＶスペクトル吸収分子、近赤外線若しくは遠赤外線吸収可能な分子；又はＸ線、ガンマー線、ベータ粒子、アルファ粒子、超音波、光学若しくは磁気シグナルを吸収若しくは放出する分子若しくは超分子構築体を含む、請求項４１記載の方法。
  69. 前記レポーター−ｓｐ基が、治療剤として作用する可能性を有する、請求項４０記載の方法。
  70. 前記第１レポーター−ｓｐ基又は前記第２レポーター−ｓｐ基のいずれか又は両方が、治療剤として作用する可能性を有する、請求項４１記載の方法。
  71. 前記レポーター−ｓｐ基が、癌細胞又は正常組織の増殖を選択的に殺す及び／又は阻害するために用いられるトキシンとして作用する可能性を有する、請求項４０記載の方法。
  72. 前記第１レポーター−ｓｐ基又は前記第２レポーター−ｓｐ基のいずれか又は両方が、癌細胞又は正常組織の増殖を選択的に殺す及び／又は阻害するために用いられるトキシンとして作用する可能性を有する、請求項４１記載の方法。
  73. 第１分枝基Ｂ又は第２分枝基Ｂ’のいずれかに、少なくとも第３レポーター−ｓｐ基を取り付ける工程を含む、請求項４１記載の方法。
  74. 前記リンカーＤが式：
    で示されるリンカーである、請求項３９記載の方法。
  75. 前記リンカーＤが、式：ＮＨ２−Ｑ−Ｚ−Ｑ’−ＮＨ２、
    ［式中、（１）Ｚは、２つのアミノ基を有する足場である芳香核又は複素環核を表す；及び（２）ＱとＱ’は、
    であり；この場合、ＱとＱ’は、ここに挙げた部分のセットの同じメンバー又は異なるメンバーのいずれでもよい］
    で示される、置換された芳香族又は複素環ジアミンである、請求項３９記載の方法。
  76. Ｚが、下記化合物群：
    のなかから選択される、請求項７５記載の方法。
  77. 前記リンカーＤが、４−アミノメチルベンジルアミン、４−アミノメチル−４’−アミノメチルビフェニル、Ｎ−メチルピロール−２，５−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミド、ピリジン−２，６−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミド、Ｎ−メチルピロール−２，３−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミド、Ｎ−メチルピロール−２，４−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミド、ピリジン−２，３−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミド、ピリジン−３，５−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミド、及びピリジン−３，４−ジカルボン酸ビス−２−アミノエチルアミドから成る群から選択される、請求項３９記載の方法。
  78. 前記リンカーＤが、Ｄ−若しくはＬ−アミノ酸に由来するか、又はリシン、オルニチン若しくは２，３−ジアミノプロピオン酸に由来するＤ−若しくはＬ−アミノ酸に由来する、請求項３９記載の方法。
  79. 製造される多価化合物が、下記：
    である、請求項３９記載の方法。
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