KR20190127609A - 멜리틴-기반 세포사멸 유발 펩타이드로 m2 유사 종앙관련 대식세포의 표적화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 멜리틴이 항암제와 결합된, 멜리틴-항암제 결합체에 관한 것으로, 멜리틴 및 항암제를 연결하여, 멜리틴-항암제 결합체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 결합체는 M2형 종양관련 TAM을 타겟팅하는 항암 물질로써, M2형 종양관련 TAM 선택적으로 선별하는 우수한 효과를 나타내므로, 향후 M2형 종양관련 대식세포을 타겟팅 하는 약물 전달 용도로 활용될 수 있을 것이다.

Description

멜리틴-기반 세포사멸 유발 펩타이드로 M2 유사 종앙관련 대식세포의 표적화{Targeting of M2-like tumor-associated macrophages with a melittin-based pro-apoptotic peptide}
본 발명은 멜리틴(melittin)이 항암제와 결합된, 멜리틴-항암제 결합체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 본 발명의 조성물은 M1형 종양관련 대식세포 및 암세포에는 영향을 주지 않고 M2형 종양관련 대식세포만을 억제하는 멜리틴-항암제 결합체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
종양관련 대식세포는 거의 모든 조직에서 발견되는 중요한 선천성 면역세포로써, 골수에서 유래해 혈액에서 순환하며, 혈관외유출을 통해 조직에서 분화된다. 이 종양관련 대식세포의 종양억제 M1 대식세포 또는 종양지지 M2 대식세포의 두 가지 표현형으로 분류된다. M1 대식세포는 항원을 제시하는 강력한 능력을 갖고, 일반적으로 인터페론-γ, 지방당류(LPS), 종양 괴사 인자(TNF)-α에 의하여 활성화 되며, 전염증 작용 및 살균 작용을 한다.
M2 대식세포는 다양한 세포 외 기질성분, 혈관 신생 및 주화성 인자를 방출함으로써 면역억제, 종양형성 및 혈관형성을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로, IL-4와 IL-13에 의해 유도되며, 아르기나세-1, mannose(MMR, CD206), 스캐빈저 수용체(SR-A, CD204)와 같은 M2만의 독특한 마커를 발현함으로써 M1 대식세포와 구별된다.
멜리틴(Melittin)은 꿀벌(Apis mellifera L.)의 봉독의 주요성분이고 26개의 아미노산 잔기를 가진 양친매성 펩타이드이다. 멜리틴은 기공 형성, 융합 및 소포형성과 같은 막-섭동(perturbing) 효과를 갖는다. 멜리틴은 종양 세포에 대한 세포독성 및 세포 성장을 억제하거나 세포 사멸 및 괴사를 유도하는 능력 때문에 종양-보유 쥐 연구에 사용되어 왔다(Cancer Immunol Immunother. 2004; 53:411-421.).
또한 종래 멜리틴을 이용한 기술로는 멜리틴을 함유하는 동맥경화 치료용 조성물(공개번호: 10-2011-0117789), 멜리틴을 포함하는 섬유아세포-유사-활막세포의 활성을 억제하는 조성물(공개번호: 10-2011-0117788) 등이 알려져 있다.
한편, 멜리틴을 이용하여 M2형 대식 세포를 선택적으로 사멸하는 약학적 조성물은 확인되었으나(공개번호: 10-2019-0021765), 이를 결합 파트너로 한 M2 타겟팅 약학 조성물에 관한 기술은 알려진 바가 없다. 이에 본 발명자들은 멜리틴이 항암제와 결합된 결합체를 제조하고, 멜리틴이 종양 마우스 모델에서 M1형 종양관련 대식세포인 CD86+ 종양관련 대식세포 및 암세포에는 영향을 주지 않고 M2형 종양관련 대식세포인 CD206+ 종양관련 대식세포만을 억제하는 것을 확인함으로써 기존 항암제로 인한 부작용이 현저히 감소된 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 멜리틴이 항암제와 결합된, 멜리틴-항암제 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 멜리틴 및 항암제를 연결하여, 멜리틴-항암제 결합체를 제조 하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시양태는, 멜리틴 및 항암제가 결합된, 멜리틴-항암제 결합체를 제공한다.
본 발명의 용어, “멜리틴(Melittin; MEL)”은 봉독의 주요성분을 구성하는 펩타이드이다. 상기 본원에 사용되는 용어 “봉독(bee venom; BV)”은 꿀벌(Apismellifera)의 복부에서 생성되는 산성 및 염기성 분비물의 혼합물로서 무색의 쓴 액체형태를 띠며, 그 주된 성분은 펩타이드인 멜리틴(melittin), 아파민(apamin) 및 비만세포 탈과립화(mast cell degranulating; MCD) 펩타이드 및 효소인 포스포리파아제 A2(phospholipase A2; PLA2) 등이며, 이외 여러 가지 미량의 성분을 포함한다. 따라서 본발명의 멜리틴은 꿀벌(Apis mellifera)의 봉독에서 분리되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, CD206+ M2 대식세포를 타겟으로하는 MEL 펩타이드에 GGGS 링커를 통해 세포자살 펩타이드 dKLA를 결합한 결합체를 M1형 및 M2형 대식세포에 처리하여, 다른 진핵세포에는 영향을 미치지 않고 종양 기질 내의 M2형 대식세포만을 제거하는 것을 확인하였고(도 1 내지 3), MEL 펩타이드에 DM1 항암제를 결합한 결합체 역시 종양 기질 내의 M2형 대식세포만을 제거하는 것을 확인하였으며(도 4), 미토콘드리아 막 교란으로 인한 세포 죽음인 것을 세포 호흡을 측정을 통해 확인하였고(도 5 내지 6), 본 발명의 결합체가 미토콘드리아 내로 삽입이 되었음을 염색을 통해 확인하였다 (도 7). 또한, 실험쥐에 MEL, dKLA, 및 MEL-dKLA를 처리하였을 때, MEL-dKLA 결합체가 종양의 크기 및 무게를 더 감소시켰고 (도 8), 또한 종양결절의 수 및 종양 내 전이를 억제하였으며 (도 9), 상기 결합체가 실험쥐에서 유방암 성장을 억제하고, 폐 및 전신으로의 전이를 억제하는 것을 발광을 통해 확인하였다 (도 10 내지 11). 또한, MEL-항암제 결합체를 처리하였을 때, 암에서 많이 발현된다고 알려진 CD44, M2형 대식세포 마커로 알려진 CCL22, 혈관생성, 전이 및 침투 마커로 알려진 HIF-1α, M2형 대식세포의 마커인 Ym1, 종양 세포의 이동 및 정착에 관여하는 MMP-9의 발현이 낮아지는 것을 확인하였고 (도 12), 염색을 통해, 종양 내 면역세포들의 비율 변화를 측정하여 M2형 TAM만이 감소한 것을 확인하였으며 (도 13), M2형 종양관련 TAM의 선택적 세포죽음이 일어났음을 염색을 통하여 확인하였다(도 14). 또한, MEL 및 MEL-dKLA를 처리한 뒤, 종양 내피 세포를 콘포칼로 촬영하여 내피 세포 내 혈관 밀도가 감소함을 확인하였다 (도 15).
본 발명의 멜리틴은 M2형 대식세포를 표적으로 하는 역할을 하며, 멜리틴에 결합된 항암제를 M2형 대식세포에 전달함으로써 항암활성을 나타낼 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, “항암제”란 암을 치료하기 위한 화학요법에 쓰이는 약제의 총칭으로서, 상기 항암제는 화합물 또는 세포사멸성(pro-apoptotic) 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 용어 “암”이란, 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 종양, 또는 종양을 형성하는 병을 의미한다.
구체적으로, 상기 암은 폐암 (예, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 악성 중피종), 중피종, 췌장암 (예, 췌관암, 췌장 내분비 종양), 인두암, 후두암, 식도암, 위암 (예, 유두 선암, 점액성 선암, 선편평상피암종), 십이지장암, 소장암, 대장암 (예, 결장암, 직장암, 항문암, 가족성 대장암, 유전성 비용종증 대장암, 소화관 간질 종양), 유방암 (예, 침윤성 유관암, 비침윤성 유관암, 염증성 유방암), 난소암 (예, 상피성 난소암종, 고환외 배세포 종양, 난소성 배세포 종양, 난소 저악성도 종양), 고환 종양, 전립선암 (예, 호르몬-의존성 전립선암, 호르몬-비의존성 전립선암), 간암 (예, 간세포암, 원발성간암, 간외 담관암), 갑상선암 (예, 갑상선 수질암종), 신장암 (예, 신세포암종, 신우와 요관의 이행 상피암종), 자궁암 (예, 자궁경부암, 자궁체암, 자궁 육종), 뇌종양 (예, 수모세포종, 신경교종, 송과체 성세포종양, 모양세포성 성세포종, 미만성 성세포종, 퇴형성성 성세포종, 뇌하수체 선종), 망막모세포종, 피부암 (예, 기저세포암, 악성 흑색종), 육종 (예, 횡문근육종, 평활근육종, 연조직 육종), 악성 골종양, 방광암, 혈액암 (예, 다발성 골수종, 백혈병, 악성 림프종, 호지킨병, 만성 골수 증식 질환),원발 미상 암 등 일 수 있으며, 보다 구체적으로, 폐암, 전이암 또는 유방암일 수 있고, 더욱 구체적으로, 상기 폐암은 루이스 폐암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 독소루비신(Doxorubicin), 메토트렉세이트(Methotrexate), 엔티노스테트(Entinostat), 크라드리빈(Cladribine), 프랄라트렉세이트(Pralatrexate), 로라티닙(Lorlatinib), 메이탄시네 DM1(Maytansine DM1), 메이탄시네 DM3(Maytansine DM3), 메이탄시네 DM4(Maytansine DM4)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, “전세포사멸(pro-apoptotsis)”이란 세포가 능동적으로 생체에너지인 ATP를 적극적으로 소모하면서 죽음에 이르는 과정을 의미하며, 전형적인 세포사멸과정은 세포의 축소, DNA의 규칙적인 절단 그리고 세포막의 단편화에 의하여 진행된다. 비정상적인 세포분열, 방사선, 자외선, 세균 감염 또는 바이러스 감염 등의 원인으로 세포가 정상적인 기능을 유지하지 못하게 될 경우 세포사멸이 유도될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 전세포사멸성 펩타이드는 KLA, 알파-디펜신-1(alpha-defensin-1), BMAP-28, Brevenin-2R, 부포린 IIb(Buforin IIb), 세크로핀 A-마가이닌 2(cecropin A-Magainin 2, CA-MA-2), 세크로핀 A(Cecropin A), 세크로핀 B(Cecropin B), 크리소피신-1(chrysophsin-1), D-K6L9, 고메신(Gomesin), 락토페리신 B(Lactoferricin B), LLL27, LTX-315, 마가이닌 2(Magainin 2), 마가이닌 II-봄패신 결합체(Magainin II-bombesin conjugate, MG2B), 파르닥신(Pardaxin)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, “펩타이드(peptide)”란 아미드 결합(또는 펩타이드 결합)으로 연결된 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다. 본 발명의 목적상, 암세포에 대해 높은 선별력을 지니고, 강력한 항암활성을 나타내는 펩타이드를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 상기 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 펩타이드는 상기 아미노산의 비율이 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 100%로 높은 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 추가의 아미노산 서열도 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 이펙터(effectors), 약물, 프로드럭, 독소, 펩타이드, 전달 분자 등의 커플링 파트너와 연결될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 당 분야에 널리 공지된 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 상세하게는 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 펩타이드 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법, 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로 산을 첨가함으로써 염을 형성할 수 있고, 예를 들어 무기산(예: 염산, 히드로브롬산, 인산, 질산, 황산 등), 유기 카르복실산(예: 아세트산, 트리플루오로아세트산과 같은 할로 아세트산, 프로피온산, 말레산, 숙신산, 말산, 시트르산, 타르타르산, 살리실산), 및 산성 당(글루쿠론산, 갈락투론산, 글루콘산, 아스코르브산), 산성 폴리사카리드(예: 히알우론산, 콘드로이틴 술페이트, 아르기닌산), 콘드로이틴 술페이트와 같은 술폰산 당 에스테르를 포함하는 유기 술폰산(예: 메탄술폰산, p-톨루엔 술폰산) 등을 첨가하여 염을 형성할 수 있다.
본 발명의 용어, “결합체”는 멜리틴 펩타이드와 항암제가 결합된 결합체로써, M2형 종양관련 대식세포를 표적하는 것일 수 있다. 상기 결합체는 약물이 타겟팅하는 M2형 대식세포에 결합하여 대식세포의 미토콘드리아를 손상시킴으로써 종양의 생장과 전이를 억제하고, 주변의 혈관신생을 선택적으로 억제함으로써 암을 억제할 수 있다.
즉, 본 발명의 결합체는 항암제에 비해 항암활성이 향상된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 결합체는 Piscataway, NJ, USA에서 구매한 MEL (서열번호 1; GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ)에 dKLA(서열번호 2; d[KLAKLAKKLAKLAK]) 펩타이드를 GGGGS linker를 통해 연결하는 것일 수 있고, 또는 Doxorubicin, Methotrexate, Entinostat, Cladribine, Pralatrexate 및 Lorlatinib와 같은 항암제를 SPDP 링커를 통해 연결하는 것일 수 있다. 또한, Maytansine DM1, Maytansine DM3 및 Maytansine DM4는 링커 없이 결합하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 결합체는 멜리틴이 화학적 링커를 통하거나 또는 직접 항암제와 연계된 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 용어 “화학적 링커”는 멜리틴 및 항암제 상의 아민기(amine), 카르복시기(carboxyl) 또는 설프히드릴기(sulfhydryl)를 통해 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 화학적 링커는 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), DCC(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide), SATA(succinimidyl acetylthioacetate), 술포-SMCC(sulfosuccinimidyl-4-(NDmaleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), DMA(dimethyl adipimidate·2HCl), DMP(dimethylpimelimidate·2HCl), DMS(dimethyl Suberimidate·2HCl), DTBP(dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate·2HCl), 술포-SIAB(sulfosuccinimidyl (4-iodoacetyl)aminobenzoate), SIAB(succinimidyl (4-iodoacetyl)aminobenzoate), SBAP(succinimidyl 3-(bromoacetamido)propionate), SIA(succinimidyl iodoacetate), SM(PEG)n(succinimidyl-([N-maleimidopropionamido]-#ethyleneglycol ester, 상기 n=2, 4, 6, 8, 12 또는 24), SMCC(succinimidyl-4-(N-Dmaleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), LCSMCC(succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate)), 술포-EMCS(N-εester), EMCS(N-ε술포-GMBS(N-γester), GMBS(N-γ ester), 술포-KMUS(N-κester), 술포-MBS(m-maleimidobenzoyl-Nhydroxysulfosuccinimide ester), MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), 술포-SMPB(sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate), SMPB(succinimidyl 4-(pmaleimidophenyl)butyrate), AMAS(N-α-maleimidoacet-oxysuccinimide ester), BMPS(N-β-maleimidopropyloxysuccinimide ester), SMPH(succinimidyl 6-[(β-maleimidopropionamido)hexanoate]), PEG12-SPDP(2-pyridyldithiol-tetraoxaoctatriacontane-N-hydroxysuccinimide), PEG4-SPDP, 술포-LCSPDP(sulfosuccinimidyl 6-[3'-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate), SPDP(succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), LC-SPDP(succinimidyl 6-[3'-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate), SMPT(4-succinimidyloxycarbonyl-alpha-methyl-alpha(2-pyridyldithio)toluene), DSS(disuccinimidyl suberate), BS(PEG)5(bis(succinimidyl) penta(ethylene glycol)), BS(PEG)9(bis(succinimidyl) nona(ethylene glycol)), BS3(bis[sulfosuccinimidyl] suberate), BSOCOES(bis[2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfone), PDPH(3-(2-pyridyldithio)propionyl hydrazide), DSG(disuccinimidyl glutarate), DSP(dithiobis[succinimidyl propionate]), BM(PEG)n(1,8-bismaleimido-ethyleneglycol, n=2 또는 3), BMB(1,4-bismaleimidobutane), BMDB(1,4-bismaleimidyl-2,3-dihydroxybutane), BMH(bismaleimidohexane), BMOE(bismaleimidoethane), DTME(dithiobismaleimidoethane), TMEA(tris(2-maleimidoethyl)amine), DSS(disuccinimidyl suberate), DST(disuccinimidyl tartarate), DTSSP(3,3'-dithiobis[sulfosuccinimidylpropionate]), EGS(ethylene glycol bis[succinimidylsuccinate]), 술포-EGS(ethylene glycol bis[sulfosuccinimidylsuccinate]) 및 TSAT(tris-succinimidyl aminotriacetate),DFDNB(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene) 및 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, “종양관련 대식세포(TAM, Tumor associated tumor)”는 암의 성장, 전이 등 전반적인 종양 미세환경과 관련하여 중요한 역할을 담당하는 대식세포로써, 종양 주변에 존재하는 종양관련 대식세포는 종양세포의 성장, 전이와 밀접하게 관련이 되어 있다. 종양관련 대식세포는 종양억제 M1 또는 종양지지 M2 대식세포의 두 가지 표현형으로 분류된다. M2형 종양관련 대식세포는 암의 성장을 촉진하는 IL-10, TGFβ 및 CCL18과 같은 사이토카인을 생성하고 표면 수용체를 통해 T 세포, NK 세포의 항종양 활성을 억제하는 기능을 한다. 이러한 종양관련 대식세포는 골수(bone marrow). 난황낭(Yolk sac) 또는 골수외조혈(extramedullary hematopoiesis) 중 특히 바장에서 발생한 단핵구 및 대식세포에서 분화된 것일 수 있으며, 바람작히게는 골수(bone marrow)에서 분리되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 실시양태는, 종양관련 대식세포 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 M2형 종양관련 대식세포의 제거에 의한 암의 생장 및 전이의 예방 또는 치료용 약학적 조성물인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, “종양관련 대식세포”는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, “예방”은 본 발명에 따른 결합체에 의해 종양의 생장 및 전이를 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, “치료”는 상기 결합체에 의해 종양의 생장 및 전이의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 결합체는 인간에 사용하는 것이 바람직하나, 염증 질환 또는 암이 발생되고 본 발명의 펩타이드 투여에 의해 암이 억제 또는 감소될 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 또는 고양이 등의 가축에게도 사용될 수 있다.
본 발명의 암의 예방 또는 치료 조성물에서, 상기 조성물을 투여하는 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 해당 부위에 상기 조성물이도달할 수 있는 한, 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 안구, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을들 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 용어 “약학적으로 허용가능한”은 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
보다 구체적으로, 상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나, 당업계에서 암의 예방 또는 치료를 위하여 사용되는 제형이라면, 이에 제한되지 않는다.
상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 구체적인 예로, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 폴리카프로락톤(PCL; polycaprolactone), 폴리락틱액시드(PLA; Poly Lactic Acid), 폴리-L-락틱액시드(PLLA; poly- L -lactic acid), 광물유 등을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또 다른 실시 양태는, 멜리틴 및 항암제를 연결하는 단계를 포함하는, 멜리틴-항암제 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 결합체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 종양관련 대식세포 매개 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또 다른 실시 양태는 멜리틴 및 항암제가 연결된 멜리틴-항암제의 종양관련 대식세포 “매개 질환의 예방 또는 치료 용도”를 제공한다.
본 발명의 MEL-항암제 결합체는 M2형 종양관련 TAM을 타겟팅하는 항암 물질로써, M2형 종양관련 TAM 선택적으로 선별하는 우수한 효과를 나타내므로, MEL과 항암제의 결합 방법은 향후 M2형 종양관련 대식세포을 타겟팅 하는 약물 전달 용도로 활용될 수 있을 것이다.
도 1a는 MTS 측정을 통한 M1에 대한 dKLA, MEL 및 MEL-dKLA의 세포 독성을 나타내는 그래프이다.
도 1b는 MTS 측정을 통한 M2에 대한 dKLA, MEL 및 MEL-dKLA의 세포 독성을 나타내는 그래프이다.
도 1c는 PI 염색을 통해 세포 주기를 측정하여 분석한 그래프이다.
도 2는 M1의 dKLA, MEL 및 MEL-dKLA에 대한 변화를 Annexin VFITC 및 MItoTracker-Red CMXRos으로 염색하여 플로우 사이토메트리를 통해 비교분석한 그래프이다.
도 3은 M2의 dKLA, MEL 및 MEL-dKLA에 대한 변화를 Annexin VFITC 및 MItoTracker-Red CMXRos으로 염색하여 플로우 사이토메트리를 통해 비교분석한 그래프이다.
도 4는 MTS 측정을 통한 M2에 대한 MEL-DM1의 세포 독성을 나타내는 그래프이다.
도 5a는 미토콘드리아 막 교란으로 인한 세포 죽음을 측정하기 위한 세포 내 호흡 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 미토콘드리아 막 교란으로 인한 세포 죽음을 측정하기 위한 세포 내 해당작용 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5c는 미토콘드리아 막 교란으로 인한 세포 죽음을 측정하기 위한 기저 호흡의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5d는 미토콘드리아 막 교란으로 인한 세포 죽음을 측정하기 위한 세포 ATP 생산 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5e는 미토콘드리아 막 교란으로 인한 세포 죽음을 측정하기 위한 세포 내 최대 호흡 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 미토콘드리아 막 교란으로 인한 세포 죽음을 측정하기 위해 XF로 측정한 세포 에너지 표현형의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6b는 미토콘드리아 막 교란으로 인한 세포 죽음을 측정하기 위한 세포 내 산소비율(OCR)의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6c는 미토콘드리아 막 교란으로 인한 세포 죽음을 측정하기 위한 세포 외 산성화률(ECAR)의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7a는 미토콘드리아 내 MEL, dKLA 및 MEL-dKLA의 위치를 나타내는 염색 사진이다.
도 7b는 미토콘드리아 내 MEL, dKLA 및 MEL-dKLA의 상관계수이다.
도 8a는 MEL-dKLA의 항암 효과 비교를 위해 종양의 크기를 비교한 그래프이다.
도 8b는 MEL-dKLA의 항암 효과 비교를 위해 종양의 무게를 비교한 그래프이다.
도 8c는 MEL-dKLA의 항암 효과 비교를 위해 종양의 크기를 비교한 fold change 그래프이다.
도 8d는 MEL-dKLA의 항암 효과 비교를 위해 실험쥐의 무게 변화를 비교한 그래프이다.
도 9a는 MEL-dKLA의 항암 효과 비교를 위해 실험쥐의 폐를 비교한 사진이다.
도 9b는 MEL-dKLA의 암 전이 억제 효과 비교를 위해 실험쥐의 폐를 염색하여 비교한 사진이다.
도 9c는 MEL-dKLA의 항암 효과 비교를 위해 폐의 종양결절 수를 비교한 그래프이다.
도 10a는 MEL-dKLA의 항암 효과를 비교하기 위해 쥐에서 발광인자를 주입을 통해 암의 성장을 비교한 사진이다.
도 10b는 MEL-dKLA의 항암 효과를 비교하기 위해 쥐에서 발광세기를 비교한 그래프이다.
도 10c는 MEL-dKLA의 항암 효과를 비교하기 위해 쥐에서 종양크기를 비교한 그래프이다.
도 10c는 MEL-dKLA의 항암 효과를 비교하기 위해 쥐에서 전체 전이 영역의 발광 세기를 비교한 그래프이다.
도 10c는 MEL-dKLA의 항암 효과를 비교하기 위해 쥐에서 전체 전이 영역의 면적을 비교한 그래프이다.
도 11a는 MEL-dKLA의 암 전이 억제 효과를 비교하기 위해 쥐에서 발광인자를 주입을 통해 암의 전이를 비교한 사진이다.
도 11b는 MEL-dKLA의 암 전이 억제 효과를 비교하기 위해 쥐에서 전체 발광세기를 비교한 사진이다.
도 12a는 MEL-dKLA의 항암 효과를 비교하기 위해 암 발현 마커인 CD44의 발현을 측정하여 비교한 그래프이다.
도 12b는 MEL-dKLA의 항암 효과를 비교하기 위해 M2형 대식세포 마커인 CCL22의 발현을 측정하여 비교한 그래프이다.
도 12c는 MEL-dKLA의 항암 효과를 비교하기 위해 전이 및 침투 마커로 알려진 HIF-α의 발현을 측정하여 비교한 그래프이다.
도 12d는 MEL-dKLA의 항암 효과를 비교하기 위해 대식세포 마커로 알려진 Ym1의 발현을 측정하여 비교한 그래프이다.
도 12e는 MEL-dKLA의 항암 효과를 비교하기 위해 종양 세포의 이동 및 정착에 관여하는 MMP-9의 발현을 측정하여 비교한 그래프이다.
도 13a는 MEL-dKLA에 의한 M2형 종양관련 TAM 세포수의 선택적 감소를 비교하기 위해 M1형 종양관련 대식세포의 종양 기질 내 잠입을 CD45+F4/80+CD86+로 염색하여 나타낸 그래프이다.
도 13b는 MEL-dKLA에 의한 M2형 종양관련 TAM 세포수의 선택적 감소를 비교하기 위해 M2형 종양관련 대식세포의 종양 기질 내 잠입을 CD45+F4/80+CD206+로 염색하여 나타낸 그래프이다.
도 13c는 MEL-dKLA에 의한 M2형 종양관련 TAM 세포수의 선택적 감소를 비교하기 위해 M1형 종양관련 대식세포의 종양 기질 내 잠입한 CD45+F4/80+CD86+를 표로 변환하여 나타낸 그래프이다.
도 13d는 MEL-dKLA에 의한 M2형 종양관련 TAM 세포수의 선택적 감소를 비교하기 위해 M2형 종양관련 대식세포의 종양 기질 내 잠입한 CD45+F4/80+CD206+를 표로 변환하여 나타낸 그래프이다.
도 13e는 MEL-dKLA에 의한 M1/M2 비율 변화를 비교하기 위한 그래프이다.
도 13f는 MEL-dKLA에 의한 CD4 T 세포의 변화를 비교하기 위한 그래프이다.
도 13g는 MEL-dKLA에 의한 CD8 T 세포의 변화를 비교하기 위한 그래프이다.
도 13h는 MEL-dKLA에 의한 조절 T 세포의 변화를 비교하기 위한 그래프이다.
도 13i는 MEL-dKLA에 의한 수지상세포의 변화를 비교하기 위한 그래프이다.
도 14a는 MEL-dKLA에 의한 M2형 종양관련 TAM의 선택적 세포 죽음을 비교하기 위해 M1을 염색하여 나타낸 그래프이다.
도 14b는 MEL-dKLA에 의한 M2형 종양관련 TAM의 선택적 세포 죽음을 비교하기 위해 M2를 염색하여 나타낸 그래프이다.
도 14c는 MEL-dKLA에 의한 M2형 종양관련 TAM의 선택적 세포 죽음을 비교하기 위해 염색된 M1과 M2의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 15a는 MEL 및 MEL-dKLA의 항-혈관생장 효과를 비교하기 위하여 LLC 종양의 내피세포를 면역형광염색한 사진이다.
도 15b는 MEL 및 MEL-dKLA의 항-혈관생장 효과를 비교하기 위하여 구역당 혈관의 밀도를 나타내는 그래프이다.
제조예 1. MEL을 활용한 다양한 항암제 결합
1-1. MEL-dKLA 결합체
MEL의 다양한 항암제 약물과의 결합 용이성을 확인하기 위하여 dKLA의 결합을 실시하였다.
MEL (서열번호 1)과 dKLA (서열번호 2)는 짧은 펩타이드에 해당하므로 펩타이드간 아미드 결합을 통해 연결할 수 있다. 이 때 MEL과 dKLA간의 상호작용 및 폴드를 최소화하기 위해 중간에 4개의 글리신 및 1개의 세린으로 구성된 링커를 배치하여 양단을 구분하였다. KLA는 체내 분해를 최소화 하기 위해 L형이 아닌 D형 이성질체를 사용하였다.
1-2. MEL-DM1 결합체
MEL의 다양한 항암제 약물과의 결합 용이성을 확인하기 위하여 DM1과의 결합을 실시하였다.
보다 구체적으로, 멜리틴은 아미노산 서열의 N 말단에 Maleimide 구조가 합성된 것을 구매하였다. Maleimide는 DM1이 가지고 있는 free-sulfhydryl group (-SH)과 공유결합을 이룰 수 있다. Boric acid Buffer에서 멜리틴과 DM1을 2시간 동안 반응한 후 amicon ultra centrifugal filters (Merk Millipore)를 이용해 PBS로 Buffer exchange 및 결합 되지 않은 멜리틴을 걸러내었다. 멜리틴은 약 3k Da의 분자량을 가지며, DM1이 결합 되면 3.6k Da 이상의 분자량을 가지게 된다. 사용한 필터는 3k Da 이상의 물질을 걸러내는 것으로 DM1이 결합된 멜리틴을 분리하였고, 이는 Q-TOF 질량 분석기로 확인하였다.
실시예 1-1. MEL을 통한 M2형 대식세포로의 세포 자살을 일으키는 펩타이드 dKLA 전달
MEL-dKLA이 M2 대식세포에서 세포 자살을 유도하는지 조사하기 위하여 다양한 용량의 dKLA, MEL 및 MEL-dKLA (0.1-1μM)로 세포의 생존률을 측정하였다.
보다 구체적으로, dKLA(서열번호 2), MEL(서열번호 1), MEL-dKLA(서열번호 3; GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQGGGGS-d[KLAKLAKKLAKLAK]) 펩타이드와 5-carboxyl tetramethylrhodamine (TMR)-conjugated dKLA, MEL 및 MEL-KLA 펩타이드는 GenScript (Piscataway, NJ, USA)에서 구매하였다. TMR은 펩타이드의 N-터미널에 위치한 아미노기와 결합되었으며, 모든 펩타이드는 95% 이상 정제된 펩타이드를 사용하였다. 쥣과 루이스 폐 암종 (Murine Lewis lung carcinoma; LLC) 세포와 쥐의 대식세포 RAW264.7는 10%의 열-비활성화된 소태아혈청(fetal bovine serum (Welgene))과 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 (Invitrogen, CA, USA)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Welgene, Korea)에서 배양하였다. M2형으로 분화된 대식세포(RAW264.7)는 배지에 IL-4와 IL-13을 24시간 동안 처리해주었다. 처리 후에는 세포를 48시간 동안 혈청이 부족한 상태로 배양하였다. M1형 대식세포는 LPS 1ng/mL를 24시간동안 처리하여 분화를 유도하였다.
세포 생존률 테스트는 MTS 어세이를 통해 측정하였다. RAW264.7 대식세포를 M1형 또는 M2형 대식세포로 분화시켰으며, 96웰 플레이트에 3 × 104 cells/well 접종하였다. 다음날, PBS, dKLA, MEL 및 MEL-dKLA를 각각 처리하였다. 24시간 후, 배양액을 교체하고 20μL MTS 반응액(Promega, WI, USA)을 세포에 처리하여, 37℃에서 반응시킨 뒤, 490nm에서 형광을 측정해 세포 생존력을 측정하였다.
그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, dKLA은 진핵세포의 막을 교란시킬 수 없기에 대조군으로 사용하였다. 세포 생존률은 0.6-0.5μM의 MEL-dKLA 및 79-71%의 MEL을 처리하고 24시간 동안 반응시켰을 때 약 55-53% 감소하였다. M2 대식세포에 대한 MEL-dKLA의 반 최고치 억제 농도 (The half-maximal inhibitory; IC50)은 MEL을 단독으로 사용할 때 보다 낮았다(0.85μM MEL-dKLA / 0.6-0.8μM MEL). 그러나 M1 대식세포의 생존률은 0.6-0.8μM의 MEL-dKLA을 처리하였을 때 86-66%, 0.6-0.8μM의 MEL을 처리하였을 때 74%로 나타났다. 따라서 상기 대식세포를 상대로 한 MEL과 MEL-dKLA 두 물질간의 IC50 테스트에서는 유의할 만큼의 차이가 없는 것으로 확인되었다 (도 1a, b).
또한, MEL-dKLA가 종양 세포의 무작위적 죽음을 야기하는지를 조사하기 위하여 in vitro에서 PI 염색을 통해 세포 주기를 조사하였다.
보다 구체적으로, 세포를 70%의 차가운 에탄올로 고정하여 ?20℃에 24시간 보관 후 0.1%의 Triton X-100과 20μg/ml의 RNase가 들어있는 PBS에 propidium idodide(PI)를 50μg/ml농도가 되도록 섞어 세포에 처리하여, 플로우 사이토메트리 방법을 사용하여 측정되었다.
그 결과, 0.1-1μM의 MEL-dKLA은 LLC 종양 세포에서 세포 독성을 나타내지 않았다(도 1c).
실시예 1-2. MEL-dKLA의 미토콘드리아 막 교란을 통한 M2 대식세포의 세포자살
M2 대식세포의 죽음이 MEL-dKLA 처리로 인한 미토콘드리아 막 교란에 의하여 일어난 것인지 확인하기 위해 플로우 사이토메트리를 실시하였다.
보다 구체적으로, Annexin V-fluorecein isothiocyanate(FITC;BD Biosciences, CA, USA) 및 MitoTracker RedBOX(Invitrogen)로 세포를 염색하였다. 세포는 24웰 플레이트에 5 x 105 cells/well 접종하고, 다음날, 0.8μM 펩타이드를 처리하였다. 처리 1, 3 그리고 6시간 후 세포를 혈청이 없는 배양액에서 1시간 동안 250nM MitoTracker와 반응시켰다. 그 뒤, 세포를 수거하여 Annexin V와 다시 반응시켰다. 반응시킨 세포를 BD FACSCalibur로 측정하고, FlowJo software(Treestar, Inc., CA, USA)를 통해 분석하였다. MitoTracker는 막 전하에 따라 원형질막을 통과하여 미토콘드리아 내에 축적될 수 있다. 즉, 살아있는 세포의 미토콘드리아 막에서는 염색을 확인 할 수 있지만, 막 교란에 의해 세포 자살이 이루어지는 세포에서는 염색이 어렵다.
그 결과, 도 2 내지 3에서 볼 수 있듯이, M1 대식세포에서는 MEL 및 MEL-dKLA 펩타이드를 1, 3시간 처리하였을 때는 효과도 나타나지 않았고, 6시간 처리하였을 때 MitoTracker 염색이 낮아지고, Annexin V+ 염색이 증가하였지만 유의할 만큼의 변화는 나타나지 않았다 (도 2). 하지만 M2 대식세포에서 MEL-dKLA를 6시간 처리하자 상당수의 세포가 죽는 것을 확인하였다. 반면에, MEL 및 dKLA를 단독으로 사용한 경우에는 유의한 차이를 발견할 수 없었다 (도 3).
실시예 1-3. MEL을 통한 M2형 대식세포로의 세포 자살을 일으키는 항암제 DM1 전달
MEL-DM1이 M2 대식세포에서 세포 자살을 유도하는지 조사하기 위하여 DM1, MEL 및 MEL-DM1을 세포에 처리하여 세포의 생존률을 측정하였다.
MEL-DM1 항암제 결합 방법 및 세포 실험 방법은 상기에서 서술한 바와 같다.
그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, MEL 및 DM1을 각각 처리하였을 때보다, MEL-DM1 결합체를 처리하였을 때 더 높은 M2 선택적 세포 사멸 효과를 확인하여, MEL-항암제 결합체가 더 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 2. MEL-dKLA에 의한 대사 작용 변화 측정
MEL-dKLA가 미토콘드리아의 대사 작용에 미치는 영향을 측정하기 위해 해마 어세이를 실시하였다.
보다 구체적으로, 대사 작용 측정은 XF24 Extracellular Flux analyzer(Agilent, CA, USA)를 통해 측정하였다. M2로 분화된 RAW264.7 세포를 XF-24 플레이트에 (3 x 104 cells/well)에 접종하고, 다음날, 상황 변화로 인한 잠재적 스트레스를 최소화하기 위하여, 각 펩타이드 1μM을 처리하여 5% CO2 조건의 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 잠시 적응을 위한 배양 후에는 4500mg/L D-glucose (w/v), 1mM 피부르산나트륨, 4mM L-글루타민을 첨가한 500μL XF running 배양액(pH 7.4)에 세포를 접종한 뒤, 이산화탄소가 없는 37℃ 환경에서 배양하고, 대사 독소(1μM 올리고마이신, 0.5μM carbonyl cyanide p-trifluoromethoxy-phenylhydrazone [FCCP], 0.5μM rotenone 및 antimycin A [Rot/AA])는 약물 포트에 담지하였다. 그 뒤, 약물을 첨가하여 세포 내 산소 소비률(OCR) 및 세포 외 산성화률(ECAR)을 실시간으로 측정하였다.
또한, OCR은 12회의 지점에서 측정하였다. 3회는 기저 상태, 3회는 올리고마이신 첨가 후 ATP-연결 호흡, 3회는 FCCP 첨가 후 최대 호흡 및 나머지 3회는 Rot/AA 첨가 후 비-미토콘드리아성 호흡을 나타내는 포인트를 측정하여 미토콘드리아의 호흡 능력을 측정하였다. 해당 작용의 비율을 나타내는 ECAR도 같은 포인트에서 측정하였다.
그 결과, 도 5 내지 6에서 볼 수 있듯이, MEL-dKLA 그룹의 기저 호흡 비율은 PBS 그룹과 비교하여 현저히 낮아졌다. 그러나 dKLA 혹은 MEL만 처리한 경우에는 PBS와 비교하여 기저 OCR의 변화가 나타나지 않았다 (도 5a, b). 또한, MEL-dKLA는 현저하게 ATP 생산을 감소시켰다 (도 5a, d). 더욱이, MEL-dKLA 처리를 할 경우 최대 호흡이 현저히 낮아졌다 (도 5a, e). 기저 해당 작용 능력은 유의한 변화를 보이지 않았으며, 올리고마이신을 처리하자 모든 그룹에서 상승하였다 (도 5b). 에너지 표준형에서도 MEL-dKLA가 기저 상태, 스트레스 상태 두 상태 모두에서 호흡 능력을 감소시키는 것을 확인하였다 (도 6a, b). 그러나 기저 ECAR은 MEL-dKLA 처리에 의해 억제되지 않은 반면, MEL-dKLA에 의해 스트레스를 받던 상황의 그룹에서 ECAR은 dKLA 그룹과 비교하여 다소 감소하였다. 하지만 PBS 그룹과 MEL-dKLA 그룹을 비교하여 유의한 차이는 나타나지 않았다 (도 6a, c).
이를 통해, 세포질의 해당 작용에서는 MEL-dKLA의 영향이 미미한 것을 확인하였고, 따라서 미토콘드리아 호흡의 기능 이상은 미토콘드리아를 타겟팅한 MEL-dKLA에 의한 것이라는 것을 알 수 있었다.
실시예 3. MEL-dKLA의 선택적인 미토콘드리아 내 침투력 측정
M2형 대식세포의 미토콘드리아 내 MEL-dKLA의 침투 및 위치를 확인하고자 염색을 통해 형광현미경으로 확인하였다. 또한, 정량 분석을 위해 PASCAL 5 LSM 이미지 측정을 실시하였다.
보다 구체적으로, M2로 분화된 RAW264.7 대식세포를 1μM의 TMR-결합 dKLA, MEL 또는 MEL-dKLA와 함께 2시간 동안 배양하였다. 결합하지 않은 펩타이드는 세척으로 씻어낸 뒤, 세포를 250nM MitoTracker green(Invitrogen)으로 30분간 염색시켰다. 염색 후, 세포는 다시 4μg/mL 4’6-diamidino-2-phenylidole(DAPI; Sigma-Aldrich, MO, USA)를 첨가한 PBS에 10분간 염색시켰다. 염색된 세포는 레이저 스캐닝 콘포컬 현미경(Carl Zeiss, Germany)로 측정하고, 미토콘드리아 내 MEL-dKLA의 위치 확인은 LSM5 이미지 측정기(Carl Zeiss)로 측정하였다.
그 결과, 도 7에서 볼 수 있듯이, 상기 이미지 측정을 통해 미토콘드리아 내에 MEL-dKLA가 상당히 존재하는 것을 확인하였지만, MEL은 확인할 수 없었으며, dKLA는 적은 수가 세포에 결합 한 것을 확인하였다 (도 7a). 또한, 오직 MEL-dKLA만 미토콘드리아와 정적 상관관계(positive correlation)를 보였으며, dKLA 및 MEL는 미토콘드리아와 연관을 보이지 않았다 (도 7b).
이를 통해, MEL-dKLA는 선택적으로 미토콘드리아에 반응하여 침투할 수 있는 것을 확인하였다.
실시예 4-1. MEL-dKLA에 의한 쥐의 폐암 세포 억제 효과 측정
MEL-dKLA와 MEL의 항암 효과를 in vivo로 비교하기 위하여, 폐암 세포를 가진 쥐에 PBS, dKLA, MEL 혹은 MEL-dKLA 펩타이드를 주사한 뒤 종양의 변화를 확인하였다.
보다 구체적으로, C57BL/6 야생형 쥐는 DBL (Korea)에서 구입하였으며, LLC 종양 세포는 매트리겔(Corning, NY, USA)과 섞어 쥐의 오른쪽 옆구리에 주사하였다(5 × 104 cells/mouse). 종양 세포를 주입하고 5일 뒤, 재조합 된 dKLA, MEL 및 MEL-dKLA 펩타이드는 3일간 (175 nmol/kg씩 체중/무게) 복강 내로 총 3회 주사하였다. 모든 종양 조직은 주사 후 12일 뒤에 수거하였다. 상기 동물 실험은 경희대학교 동물관리위원회의 승인을 받았으며 [KHUASP(SE)-17-087], 동물들은 병원균이 없는, 12시간의 빛/어둠 주기 환경에서 물과 음식의 자율 배식으로 관리하였다.
그 결과, 도 8에서 볼 수 있듯이, PBS 및 dKLA를 주사한 쥐에서 꾸준히 쥐의 종양이 자라는 것을 확인하였다. MEL-dKLA 주사는 PBS를 주사한 대조군에 비하여 상당히 종양의 성장을 억제하였다. 또한, dKLA를 주사한 그룹과 비교하였을 때도 종양의 크기와 무게가 상당히 감소한 것을 확인하였다 (도 8a, b). 또한, MEL을 주사한 그룹에서도 상당히 종양의 크기가 감소한 것을 확인하였다. 중요한 것은, MEL-dKLA를 투여한 그룹에서 dKLA 그룹과 비교하여 상당히 종양의 크기와 무게의 감소를 나타내었다(도 8c). 반면, 모든 그룹에서 쥐의 무게는 변하지 않음을 확인하였다(도 8d).
이를 통해, 폐암에서 MEL-dKLA가 다른 펩타이드 및 항암제 단독 처리보다 월등히 종양의 생장과 전이를 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 4-2. MEL-dKLA에 의한 쥐의 유방암 세포 억제 효과 측정
MEL-dKLA와 MEL의 종양 억제 및 암 전이 억제 효과를 측정하기 위하여, 종양을 확인하고, 염색을 통해 폐로의 전이 정도를 확인하였다.
보다 구체적으로, 4T1 유방암 세포(1x105)를 BALB/c 쥐에 주사하고 3일 뒤, 175 nmol/kg의 PBS, dKLA, MEL 및 MEL-dKLA를 3일 간격으로 각각의 그룹에 주사하였다. 전이 정도와 폐 표면의 결절을 조사하기 위하여 암세포 주사 15일 뒤, 쥐를 희생하여 폐의 표면 결절을 확인하였다.
그 결과, 도 9에서 볼 수 있듯이, MEL-dKLA를 처리한 그룹에서는 폐 표면의 결절이 현저히 줄어들었지만, MEL 및 dKLA를 단독으로 처리한 그룹에서는 결절의 감소가 일어나지 않았음을 확인하였다.(도 9a).
또한, 통상의 방법을 통해 H&E 염색을 실시하여, 폐로의 전이 정도를 측정하였다.
보다 구체적으로, H&E 염색은 hematoxylin 용액에 조직을 담가 세포의 핵을 보라색으로 염색한 후 산성 알코올 용액으로 핵을 제외한 나머지 염색을 제거하고 에오신이 첨가된 용액에 조직을 다시 담가 세포질을 분홍색으로 염색하여 세포의 구조를 관찰하였다.
그 결과, 도 9에서 볼 수 있듯이, PBS 및 dKLA를 처리한 그룹에서는 종양 세포가 널리 퍼지며 전이가 일어난 것을 확인하였다. 반면, MEL 및 MEL-dKLA를 처리한 그룹에서는 비교적 적은 전이가 일어난 것을 확인하였다 (도 9b). 그러나 MEL-dKLA는 결절의 수를 현저히 감소시킨 반면, MEL을 단독으로 처리하였을 때는 유의한 결절의 수 감소는 일어나지 않았다 (도 9c).
또한, 형광물질 4T1-루시퍼레이즈(luciferase)를 쥐에 주입하여 MEL-dKLA이 종양 성장과 전이에 미치는 영향을 형광을 통해 확인하였다.
보다 구체적으로, 먼저 유방암 세포를 유방에 동위이식 하였을 때 MEL-dKLA가 종양의 성장 및 전이에 미치는 영향을 확인하기 위하여 4T1-루시퍼레이즈 유방암 세포(1x105)를 면역결핍 쥐인 NOD-SCID 쥐에 주사하였다. 5일 뒤 4번 유선에서 종양 덩어리가 자라기 시작한 시점부터 175 nmol/kg의 PBS, dKLA, MEL 및 MEL-dKLA를 3일에 한번 각각의 그룹에 주사하였다. 종양의 성장을 측정하기 위하여 caliper 기기를 이용하여 3일에 한번 종양의 크기가 측정되었으며 모든 종양 조직은 주사 후 4주 뒤에 수거하였다. 종양 이식 4주째, 종양의 림프절 및 폐로의 전이를 확인하기 위하여 복강투여로 루시퍼레이즈 효소의 기질인 루시페린(D-luciferin)을 40mg/ml의 농도로 희석하여 100μl씩 쥐에 투여하였다. 약 15분간 반응시킨 후 in vivo imaging 기기인 NightOwl(Berthold Technologies)를 사용하여 발광을 측정하고 쥐의 사진과 함께 분석하여 전신 및 폐로의 전이 정도를 분석하였다. 상기 동물 실험은 경희대학교 동물관리위원회의 승인을 받았으며 [KHUASP(SE)-18-133], 동물들은 병원균이 없는, 12시간의 빛/어둠 주기 환경에서 물과 음식의 자율 배식으로 관리하였다.
추가적으로, 종양 세포의 전이성을 확인하기 위하여 꼬리 정맥을 통해 4T1-루시퍼레이즈 유방암 세포(1x105)를 BALB/c 쥐에 주사하였다. 3일 뒤부터 175 nmol/kg의 PBS, dKLA, MEL 및 MEL-dKLA를 3일에 한번 각각의 그룹에 주사하였다. 암세포 주사 15일 뒤, 복강투여로 루시퍼레이즈 효소의 기질인 루시페린(D-luciferin)을 40mg/ml의 농도로 희석하여 100μl씩 쥐에 투여하고 약 15분간 반응시킨 후 NightOwl(Berthold Technologies)를 사용하여 쥐의 사진과 함께 전신 및 폐로의 암세포 정착 및 전이 정도를 분석하였다.
그 결과, 도 10 내지 11에서 볼 수 있듯 PBS를 처리한 그룹에서는 유선에서의 유방암 덩어리가 빠르게 성장함을 확인할 수 있다. MEL-dKLA를 처리한 그룹에서는 유방암 세포의 성장이 효과적으로 감소되었으며 MEL 및 dKLA를 단독 처리한 그룹에서는 유방암 성장 감소 효과가 유의하게 일어나지 않았다 (도 10a 내지 10c). 겨드랑이의 림프절과 폐로의 전이를 확인한 결과에서도 마찬가지로 PBS 그룹에서는 전이가 일어난 면적이 넓고 전이 부위의 발광 수치가 매우 높음을 확인할 수 있다. dKLA나 MEL 그룹에서는 전이 면적상 PBS 그룹과 큰 차이가 없었고 발광 수치는 감소하는 경향을 보였으나 유의성을 나타내지 않았다. MEL-dKLA에서는 전이가 거의 관찰되지 않았으며 전이 면적 및 발광 수치가 유의하게 감소함을 확인하였다(도 10d, e).
또한, 종양 세포의 전이성을 확인하기 위한 실험에서도 마찬가지로 PBS 및 dKLA를 처리한 그룹에서는 암세포의 발광 수치가 전신에서 높게 측정되었으며 MEL을 처리한 경우 PBS또는 dKLA에 비해서는 전이가 감소된 것을 확인하였다. MEL-dKLA 그룹에서는 폐에서의 암세포 발광 수치가 매우 낮게 측정되었으며 전신에서도 MEL에 비해서도 유의하게 낮은 전이성을 보였다 (도 11).
이를 통해, 유방암에서 MEL-dKLA가 다른 펩타이드 및 항암제를 단독으로 처리하였을 때 보다 월등히 종양의 생장과 전이를 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 5. MEL-dKLA의 종양 전이 유전자 발현 정도 측정
MEL-dKLA의 종양 전이 억제 능력을 측정하기 위하여, 세포외기질 리간드와 상호작용하여 전이와 침투를 촉진하며 암에서 많이 발현된다고 알려진 CD44, M2형 대식세포 마커로 알려진 CCL22, 혈관생성, 전이 및 침투 마커로 알려진 HIF-1α, M2형 대식세포의 마커인 Ym1, 종양 세포의 이동 및 정착에 관여하는 MMP-9의 발현을 정량 real-time PCR을 통해 측정하였다.
보다 구체적으로, 폐 조직에서 easy-BLUE RNA 추출 키트 (iNtRON Biotechnology, Korea)를 통해 RNA를 추출하고, cyclescript reverse transcriptase (Bioneer, Korea) 메뉴얼을 따라 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성 조건은 95에서 15초, 55에서 10초, 72에서 10초이며, 각 반응은 3번 진행하였다. 그 후, CD44: forward, (서열번호 4; 5‘-TGGATCCGAATTAGC TGGA-3’); (서열번호 5; reverse, 5‘-GCTTTTTCTTCTGCCCACA-3’); CCL22: forward, (서열번호 6; 5‘-TCCCAGGGGAAGGAATAAA-3’); reverse, (서열번호 7; 5‘-GGTTTGGATCAA GCCCTTT-3’); HIF-1α: forward, (서열번호 8; 5‘-TCCCTTTTTCAAGCAGCAG-3’); reverse, (서열번호 9; 5‘-TGCCTTGTATGGGAGCATT-3’); Ym-1: forward, (서열번호 10; 5‘-CATTCAGTCAGTTATCAGATTCC-3’); reverse, (서열번호 11; 5‘-AGTGAGTAGCAGCCTTGG-3’); MMP-9: forward, (서열번호 12; 5‘-TGAATCAGCTGGCTTTTGTG-3’); reverse, (서열번호 13; 5‘-GTGGATAGCTCG GTGGTGTT-3’); 프라이머를 이용하고, the SensiFAST SYBR no-Rox kit (Bioline, Korea)를 통해 정량 real-time PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 12에서 볼 수 있듯이, WT와 비교하여 PBS를 처리한 그룹에서 CD44 발현이 현저히 증가하였으며, MEL-dKLA를 처리한 그룹은 PBS, dKLA, MEL을 처리한 그룹보다 CD44 발현 수준이 눈에 띄게 낮아졌다 (도 12a). CCL22 및 HIF-1α도 WT와 비교하여 PBS를 처리한 그룹에서 발현이 증가하였지만, MEL-dKLA를 처리한 그룹에서는 현저히 낮아짐을 확인하였다. 반면, dKLA 및 MEL을 처리한 그룹에서는 PBS 그룹과 크게 다르지 않음을 확인하였다(도 12b 내지 12c). Ym1의 경우 PBS 그룹에 비해 dKLA 그룹에서는 오히려 크게 증가하는 것을 확인하였으며, MEL 및 MEL-dKLA 처리 그룹에서는 PBS 그룹과 별다른 차이를 보이지 않았다 (도 12d). MMP-9의 발현은 PBS 그룹 및 dKLA 그룹에서 높게 측정되었으며 MEL을 처리한 그룹에서는 PBS 그룹과 비교하였을 때 낮아짐을 확인하였다. 반면, MEL-dKLA를 처리한 그룹에서는 MEL을 처리한 그룹보다 MMP-9의 발현 수준이 더 낮아짐을 확인하였다 (도 12E).
이를 통해, MEL-dKLA이 MEL 및 dKLA를 단독으로 사용할 때 보다 현저한 높은 종양 전사 인자 발현 억제 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 6. 플로우사이토메트리를 통한 CD206+ M2형 종양관련 TAM을 타겟으로 하는 MEL-dKLA 분석
in vivo에서 MEL-dKLA 펩타이드를 M2형 종양관련 TAM를 타겟으로 하는 펩타이드로 사용할 수 있는지 확인하기 위하여, 종양 조직을 배양하고 이들을 염색하고 개별로 분석하여 세포 증가를 확인하였다.
보다 구체적으로, 종양 세포를 얇게 으깨어 DNaseI(1U/mL) 및 Collagenase D(1mg/mL)이 첨가된 DMEM에서 분리하였다. 조직은 37℃에서 1시간 동안 약하게 교반하고, 100-μM 나일론 그물 여과기에서 분리하였다. 적혈구는 Phrmlyse buffer(BE bioscience)에서 용해하였다. 개별의 세포들은 40-μm 나일론 그물 여과기를 통과하여 다음의 항체들로 염색하였다. CD4+ T 세포(CD45+CD4+CD8-), CD8+ T 세포(CD45+CD4-CD8+), Foxp3+ 조절 T 세포(CD4+CD25+Foxp3+), 수지상세포(CD45+CD11b+CD11c+) 및 M1(CD45+F4/80+CD86+) 또는 M2 대식세포(CD45+F4/80+CD206+): 항-CD45-FITC, 항-CD4-phycoerythrin(PE), 항-CD8-allophycocyanin(APC), 항-CD4-FITC, 항-CD25-PE, 항-Foxp3-Alexa Fluor647, 항-CD11b-APC, 항-CD11c-APCcy7, 항-Gr1-PEcy7, 항-CD86-PEcy7 및 항-CD206-APC 항체. Annexin-V는 이전 대식 세포의 세포률을 측정하기 위해 이미 처리하였었다.
그 결과, 도 13에서 볼 수 있듯이, F480+ CD86+ M1형 종양관련 대식세포는 PBS 및 dKLA 투여 그룹과 비교하여, MEL 투여 그룹에서 다소 증가하였지만 dKLA 그룹과 유의한 차이는 확인할 수 없었다. 반면, MEL-dKLA를 투여한 그룹에서는 MEL 그룹과 비교하여 F480+ CD86+ M1형 종양관련 대식세포가 상당히 증가하는 것을 확인하였다 (도 13a, c). PBS 및 dKLA 투여 그룹에서 CD45+ 백혈구 내 M2형 종양관련 F4/80+ CD206+ TAM의 비율은 약 20%였다. MEL 그룹과 MEL-dKLA 그룹에서는 PBS 그룹과 비교하여 M2형 종양관련 TAM 세포가 절반가량 감소하여 약 10%의 비율인 것을 확인하였다 (도 13b, d). 하지만, M1/M2의 비율은 MEL 그룹에 비해 MEL-dKLA 그룹에서 월등히 높은 것을 확인하였다. 비록 M2형 종양관련 TAM은 MEL 및 MEL-dKLA 그룹에서 PBS 및 dKLA 그룹과 비교하여 상당히 낮아졌지만 (도 13e), CD4 T 세포, Foxp3+ Tregs, CD8 T 세포 및 수지상세포와 같은 기타 백혈구들에는 변화가 없어, 이들에게는 영향을 미치지 않은 것으로 확인되었다 (도 13f 내지 13i).
또한, 쥐 내에서 M2형 종양관련 TAM 세포가 선택적으로 사멸되었는지 확인하기 위하여, M1형 종양관련 TAM(F4/80 CD86+) 및 M2형 종양관련 TAM(F4/80 CD206+)을 각각 Annexin-V로 염색하였다.
그 결과, 도 14에서 볼 수 있듯이, CD86+ M1형 종양관련 TAM에서는 Annexin 염색된 세포의 증가가 대조군 PBS 그룹과 비교하여 모든 그룹에서 나타나지 않았다 (도 14a). 또한, MEL 및 MEL-dKLA 그룹에서 M2형 종양관련 TAM의 감소가 일어났지만, 상당한 양의 CD206+ M2형 종양관련 TAM 세포 죽음은 오직 MEL-dKLA 투여 그룹에서만 확인할 수 있었다 (도 14b). MEL-dKLA의 투여로 인한 세포자살 비율은 M1형 종양관련 TAM 보다 M2형 종양관련 TAM에서 월등히 많이 나타났다 (도 14c).
이를 통해, MEL-dKLA는 선택적으로 M2형 종양관련 TAM의 세포 자살을 유도하여, MEL 처리하였을 때보다, M1/M2의 비율이 월등히 증가한 것을 확인하였다.
실시예 7. 종양 내 CD206+ TAM 감소와 항-혈관생장 효과의 관계
CD31(PECAM-1)은 혈관 내피에서 활발히 분비되며, 혈관생장을 미리 알 수 있는 마커로 잘 알려져 있다. 종양의 혈관 생장은, 종양 내 산소가 낮은 지역으로의 산소와 영양분을 공급하기 위한 필수 수단이며, 암의 성장과 전이와도 밀접하다. M2-양극화 대식세포는 혈관 생장 요소의 주요 전구체로, cyclooxygenase-2, matrix metalloproteinase-9 및 VEGF를 포함하며, 대식세포의 밀도도 혈관생장과 관련이 있다. 따라서 종양 내 M2형 종양관련 TAM의 감소가 혈관 생장의 감소를 일으키는지 확인하기 위하여 면역염색을 실시하고 콘포칼을 이용하여 확인하였다.
보다 구체적으로, 조직을 파라포름알데하이드와 함께 24시간동안 건조하였다. 그 후, 회전 박절기(rotary microtome)을 사용하여 4μm 두께로 자르고, tri-sodium citrate buffer와 함께 1분간 가압멸균하여 복원하였다. 복원된 조직 절편은 항-쥐 혈청 내피 세포 접착 물질(PECAM; CD31) 항체(1:200;santa Cruz Biotechnology, CA, USA)와 Alexa-488과 결합한 항-토끼 2차 항체(1:500; Invitrogen)와 함께 배양하여 시각화 하였다. 염색 후 절편은 마운트하여 레이저 스캐닝 콘포컬 현미경(Carl Zeiss)에서 분석하였다. 모든 이미지는 LSM5 PASCAL에서 촬영하고, ImageJ software를 사용하여 형광값을 분석하였다.
그 결과, 도 15에서 볼 수 있듯이, MEL 및 MEL-dKLA 그룹에서 모두 현저한 CD31+ 내피 세포의 감소를 확인하였다 (도 15a, b).
이를 통해, 혈관 생장의 억제는 M2형 종양관련 TAM의 감소와 연관이 있는 것을 확인하였다.
종양 기질 내 TAM 농도는 종양의 성장, 전이 및 혈관 생장과 밀접한 연관이 있다. 그러나 단지 대식세포를 줄이는 방법은 효과적인 상기 종양 성장 및 혈관생장과 같은 문제들을 해결할 수 없었다. 본 발명을 통해 향상된 항암 효과는 M1/M2의 높은 비율과 관련이 있는 것으로 사료되었다. 본 발명의 MEL-dKLA는 선택적으로 M2형 종양관련 TAM을 감소시켜 효과적으로 M1/M2의 비율을 향상시키고, 미토콘드리아의 자살을 유도하여, 종양 성장 및 혈관 생장을 억제하였다. 따라서 MEL-dKLA는 효과적으로 M2형 종양관련 TAM을 타겟으로 하는 암 치료제로써 사용 될 수 있을 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Targeting of M2-like tumor-associated macrophages with a melittin-based pro-apoptotic peptide <130> KPA180529-KR-P1 <150> KR 10-2018-0051800 <151> 2018-05-04 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombination peptide <400> 1 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 20 25 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombination peptide <400> 2 Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombination peptide <400> 3 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln Gly Gly Gly Gly Ser Lys 20 25 30 Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys 35 40 45 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombination peptide <400> 4 Thr Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Ala Ala Thr Thr Ala Gly Cys Thr 1 5 10 15 Gly Gly Ala <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombination peptide <400> 5 Gly Cys Thr Thr Thr Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr Gly Cys Cys Cys 1 5 10 15 Ala Cys Ala <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombination peptide <400> 6 Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Gly Gly Ala Ala Gly Gly Ala Ala Thr 1 5 10 15 Ala Ala Ala <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombination peptide <400> 7 Gly Gly Thr Thr Thr Gly Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys 1 5 10 15 Thr Thr Thr <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombination peptide <400> 8 Thr Cys Cys Cys Thr Thr Thr Thr Thr Cys Ala Ala Gly Cys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Ala Gly <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombination peptide <400> 9 Thr Gly Cys Cys Thr Thr Gly Thr Ala Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys 1 5 10 15 Ala Thr Thr <210> 10 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombination peptide <400> 10 Cys Ala Thr Thr Cys Ala Gly Thr Cys Ala Gly Thr Thr Ala Thr Cys 1 5 10 15 Ala Gly Ala Thr Thr Cys Cys 20 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombination peptide <400> 11 Ala Gly Thr Gly Ala Gly Thr Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Thr 1 5 10 15 Gly Gly <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombination peptide <400> 12 Thr Gly Ala Ala Thr Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Cys Thr Thr Thr 1 5 10 15 Thr Gly Thr Gly 20 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombination peptide <400> 13 Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ala Gly Cys Thr Cys Gly Gly Thr Gly Gly 1 5 10 15 Thr Gly Thr Thr 20

Claims (15)

  1. 멜리틴이 항암제와 결합된, 멜리틴-항암제 결합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항암제는 전세포사멸성(pro-apoptotic) 펩타이드인 것인, 멜리틴-항암제 결합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 전세포사멸성 펩타이드는 KLA, 알파-디펜신-1(alpha-defensin-1), BMAP-28, Brevenin-2R, 부포린 IIb(Buforin IIb), 세크로핀 A-마가이닌 2(cecropin A-Magainin 2, CA-MA-2), 세크로핀 A(Cecropin A), 세크로핀 B(Cecropin B), 크리소피신-1(chrysophsin-1), D-K6L9, 고메신(Gomesin), 락토페리신 B(Lactoferricin B), LLL27, LTX-315, 마가이닌 2(Magainin 2), 마가이닌 II-봄패신 결합체(Magainin II-bombesin conjugate, MG2B), 파르닥신(Pardaxin) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 멜리틴-항암제 결합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항암제는 독소루비신(Doxorubicin), 메토트렉세이트(Methotrexate), 엔티노스테트(Entinostat), 크라드리빈(Cladribine), 프랄라트렉세이트(Pralatrexate), 로라티닙(Lorlatinib), 메이탄시네 DM1(Maytansine DM1), 메이탄시네 DM3(Maytansine DM3), 메이탄시네 DM4(Maytansine DM4) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 멜리틴-항암제 결합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 결합체는 M2형 종양관련 대식세포를 표적하는 것인, 멜리틴-항암제 결합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 결합체는 항암제에 비해 항암활성이 향상된 것인, 멜리틴-항암제 결합체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 멜리틴 및 항암제는 화학적 링커를 또는 직접 연계에 의하여 연결된, 멜리틴-항암제 결합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 화학적 링커는 멜리틴 및 항암제 상의 아민기(amine), 카르복시기(carboxyl) 또는 설프히드릴기(sulfhydryl)를 통해 결합하는 것인, 멜리틴-항암제 결합체.
  9. 제7항에 있어서, 상기 화학적 링커는 양 말단에 카르보디이미드기(carbodiimide), N-히드록시숙신이미드 에스테르(N-hydroxysuccinimide ester; NHS ester), 이미도에스테르(imidoester), 펜타플루오로페닐에스테르 (pentafluorophenyl ester), 히드록시메틸포스핀(hydroxymethyl phosphine), 말레이미드(maleimide), 할로아세틸(haloacetyl), 피리딜디설파이드(pyridyldisulfide), 티오술포네이트(thiosulfonate), 비닐술폰 (vinylsulfone) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 작용기를 포함하는 것인, 멜리틴-항암제 결합체.
  10. 제7항에 있어서, 상기 화학적 링커는 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), DCC(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide), SATA(succinimidyl acetylthioacetate), 술포-SMCC(sulfosuccinimidyl-4-(NDmaleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), DMA(dimethyl adipimidate·2HCl), DMP(dimethylpimelimidate·2HCl), DMS(dimethyl Suberimidate·2HCl), DTBP(dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate·2HCl), 술포-SIAB(sulfosuccinimidyl (4-iodoacetyl)aminobenzoate), SIAB(succinimidyl (4-iodoacetyl)aminobenzoate), SBAP(succinimidyl 3-(bromoacetamido)propionate), SIA(succinimidyl iodoacetate), SM(PEG)n(succinimidyl-([N-maleimidopropionamido]-#ethyleneglycol ester, 상기 n=2, 4, 6, 8, 12 또는 24), SMCC(succinimidyl-4-(N-Dmaleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), LCSMCC(succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate)), 술포-EMCS(N-εester), EMCS(N-ε술포-GMBS(N-γester), GMBS(N-γ ester), 술포-KMUS(N-κester), 술포-MBS(m-maleimidobenzoyl-Nhydroxysulfosuccinimide ester), MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), 술포-SMPB(sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate), SMPB(succinimidyl 4-(pmaleimidophenyl)butyrate), AMAS(N-α-maleimidoacet-oxysuccinimide ester), BMPS(N-β-maleimidopropyloxysuccinimide ester), SMPH(succinimidyl 6-[(β-maleimidopropionamido)hexanoate]), PEG12-SPDP(2-pyridyldithiol-tetraoxaoctatriacontane-N-hydroxysuccinimide), PEG4-SPDP, 술포-LCSPDP(sulfosuccinimidyl 6-[3'-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate), SPDP(succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), LC-SPDP(succinimidyl 6-[3'-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate), SMPT(4-succinimidyloxycarbonyl-alpha-methyl-alpha(2-pyridyldithio)toluene), DSS(disuccinimidyl suberate), BS(PEG)5(bis(succinimidyl) penta(ethylene glycol)), BS(PEG)9(bis(succinimidyl) nona(ethylene glycol)), BS3(bis[sulfosuccinimidyl] suberate), BSOCOES(bis[2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfone), PDPH(3-(2-pyridyldithio)propionyl hydrazide), DSG(disuccinimidyl glutarate), DSP(dithiobis[succinimidyl propionate]), BM(PEG)n(1,8-bismaleimido-ethyleneglycol, n=2 또는 3), BMB(1,4-bismaleimidobutane), BMDB(1,4-bismaleimidyl-2,3-dihydroxybutane), BMH(bismaleimidohexane), BMOE(bismaleimidoethane), DTME(dithiobismaleimidoethane), TMEA(tris(2-maleimidoethyl)amine), DSS(disuccinimidyl suberate), DST(disuccinimidyl tartarate), DTSSP(3,3'-dithiobis[sulfosuccinimidylpropionate]), EGS(ethylene glycol bis[succinimidylsuccinate]), 술포-EGS(ethylene glycol bis[sulfosuccinimidylsuccinate]) 및 TSAT(tris-succinimidyl aminotriacetate),DFDNB(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, 멜리틴-항암제 결합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 결합체를 포함하는, 종양관련 대식세포 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 질환은 폐암, 전이암, 유방암인 것인, 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 질환은 루이스 폐암 또는 염증질환 인 것인, 약학적 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 M2형 종양관련 대식세포의 제거에 의한 암의 성장 및 전이의 예방 또는 치료용 약학적 조성물인 것인, 조성물
  15. 멜리틴 및 항암제를 연결하는 단계를 포함하는, 멜리틴-항암제 결합체를 제조하는 방법.
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