KR20110117789A - 멜리틴을 함유하는 동맥경화 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동맥경화에 관련된 경화성 인자와 염증성 인자 그리고 혈관부착인자의 발현량을 감소시킬 수 있는 봉독의 유효성분인 멜리틴을 함유한 동맥경화 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 멜리틴을 동맥경화 실험동물 모델에 투여한 결과, 총콜레스테롤과 중성지질은 감소시켰으며 고밀도 콜레스테롤은 유지하거나 오히려 증가시키는 효과가 있으며, 혈액에서 염증 관련 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β 발현량 감소, 대동맥 및 심장에서 섬유화 관련 사이토카인과 혈관부착인자 발현량 감소, 동맥경화에서 일반적으로 나타나는 플라크 침착의 감소, 단백질 수준에서 혈관부착인자인 ICAM과 VCAM, 섬유화 사이토카인인 TGF-β1과 피브로넥틴의 발현량 감소를 가져오는 효과가 있다.

Description

멜리틴을 함유하는 동맥경화 치료용 조성물{Composition for treating atherosclerosis containing melittin}

본 발명은 멜리틴을 함유하는 동맥경화 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 동맥경화에 관련된 경화성 인자와 염증성 인자 그리고 혈관부착인자의 발현량을 감소시킬 수 있는 멜리틴을 유효성분으로 함유한 동맥경화 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

현대인의 다양한 생활환경과 식생활의 변화로 인하여 질병의 형태에 있어서도 많은 변화를 가져왔으며, 특히 순환기계 질환은 미국, 유럽뿐만 아니라 우리나라에서도 주요 사망원인으로 대두되고 있는 실정이다.

우리나라에서도 생활수준의 향상과 식생활의 서구화로 인하여 동맥경화를 수반하는 고혈압, 허혈성 뇌졸중, 비만, 당뇨병 등의 각종 성인병 및 심혈관계 질환이 증가하고 있으며, 그로 인한 사망률 또한 큰 폭으로 증가하는 추세이다.

이러한 동맥경화증을 유발하는 위험인자로는 고지혈, 고혈압, 흡연, 당뇨병, 고뇨산, 비만, 운동부족, 과음 등이 있다. 이 중에서도 고혈압, 흡연, 당뇨병이 우리나라에서 주로 위험인자로 꼽히며, 최근 고지혈증이 주요 위험인자로 부상하고 있다. 이를 수반하여 국내에서 동맥경화증과 그에 따른 심혈관계 질환의 유병률과 사망률이 증가하는 추세임을 고려할 때, 고지혈증의 적절한 예방과 치료를 위한 대책이 절실히 요구된다.

현재 가장 많은 지지를 받고 있는 동맥경화증 발생 이론은 "손상반응설(response-to-injury hypothesis)"이며, 이는 동맥 내피세포의 손상 및 증식, 혈중 단핵구(monocyte)의 혈관벽 내 이동과 대식세포(macrophage)로의 변형, 지질과 죽은 세포조각의 침착, 평활근 세포의 증식 및 섬유화 과정, 혈소판 흡착 및 응집반응으로 인한 혈관수축과 협착을 거쳐 일어나며, 이에 따라 혈관이 비후되어 좁아지고 동맥벽이 경화되는 것으로 설명되고 있다.

불과 20년 전만 하더라도 동맥경화증은 나이가 들면서 자연히 생기는 퇴행성 과정이라고 생각했으나 수십 년에 걸친 역학적인 조사에서 여러 가지 위험인자들이 복합적으로 작용하여 동맥경화 병변을 만들며 많은 종류의 세포들과 이들이 분비하는 각종 성장인자와 사이토카인들이 복잡한 과정으로 병변에 관여하는 것으로 사료되었다.

동맥경화증을 예방하기 위한 여러 가지 민간요법 혹은 식이요법들이 권장되고 있고 특히 생약재나 천연물 혹은 그 추출물을 우리나라를 비롯한 동양권에서 민간적으로 널리 사용되고 있다.

봉독은 꿀벌의 독낭에 들어있는 약 40여 가지의 물질로 이루어져 있으며 기원전부터 인체의 질병치료에 이용되어 왔다. 봉독에 관한 연구는 현재 미국, 중국, 러시아, 북유럽 등 여러 국가에서 활발히 이루어지고 있다. 봉독 성분에 따른 작용과 기전, 봉독의 과민성과 독성, 면역요법 및 관절염, 단순포진, 다발성 경화증, 종양 등의 질병 치료 등에 대한 연구가 보고되고 있으나 민간적으로 전해내려 올 뿐 임상적인 연구 및 기초적, 과학적 연구는 많이 않은 편이다.

종래 봉독을 이용한 기술로는 동물치료법으로 생봉독을 이용한 돼지의 관절염 치료법(대한민국 특허출원 제10-1999-0005472호), 생봉독을 이용한 돼지의 유방염 치료법(대한민국 특허출원 제10-1999-0005477호), 생봉독을 이용한 모돈의 무유증 치료법(대한민국 특허출원 제10-1999-0005474호), 생봉독을 이용한 돼지의 설사병 치료법(대한민국 특허출원 제10-1999-0005475호), 생봉독을 이용한 모돈의 ＭＭＡ 증후군의 치료법(대한민국 특허출원 제10-2000-0046411호), 생봉독을 이용한 송아지의 설사병 치료법(대한민국 특허출원 제10-2000-0046412호), 생봉독을 이용한 자궁내막염 유우의 치료법(대한민국 특허출원 제10-2001-0071220호)이 있다.

또한 대한민국 등록특허 제10-0668229호 "핵인자-카파비의 활성 억제제"에 봉독 및 그의 주성분인 멜리틴은 NF-κB의 활성화를 저해하고 DNA 결합능을 조절하는 활성을 가지므로 NF-κB 활성 억제제 또는 NF-κB가 관여하는 DNA의 전사를 조절하는 전사 억제제로 사용될 수 있음이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-0483496호 "봉독 수용성분을 함유하는 소염 및 진통용 조성물"에 봉독을 헥산 추출하여 헥산 가용물을 제거한 후, 이를 다시 에틸 아세테이트로 추출하여 에틸 아세테이트 가용물을 제거한 수용성 분획으로부터 얻어진 분자량 10 KDa 이하의 물질로 구성된 소염, 진통 효과를 갖는 봉독 분획이 개시되어 있다.

또한 대한민국 등록특허 제10-0844886호 "봉독을 유효성분으로 포함하는 백반증 치료용 약제학적 조성물 및 봉독에 의해 유도되는 색소침착의 억제제를 스크리닝하는 방법"에 백반증을 용이하게 치료할 수 있는 백반증 치료용 약제학적 조성물과 봉독에 의해 유도되는 색소침착을 억제하는 물질을 대량/고속(highthroughput) 방식으로 스크리닝 할 수 있는 방법이 개시되어 있다.

하지만 지금까지 동맥경화와 관련된 봉독의 유효성분인 멜리틴의 치료활성에 대한 연구는 행하여진 바 없다.

본 발명자들은 봉독의 효능에 대하여 예의 연구를 거듭한 결과 식이를 통한 동맥경화를 유도한 동물모델을 확립한 후 멜리틴을 투여하여 동맥경화에 관련된 경화성 인자와 염증성 인자 그리고 혈관부착인자에 미치는 영향을 확인함으로써 본 발명에 이르게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 멜리틴을 유효성분으로 함유하는 동맥경화 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적은 고콜레스테롤 함유 사료를 급여하여 동맥경화 유발시킨 실험동물에 멜리틴을 투여한 후, 실험 동물의 혈장을 분리하여 염증성 사이토카인의 발현량을 분석하고, 실험 동물의 혈청을 이용하여 콜레스테롤을 측정하고, 동맥, 심장에서 단백질 분리와 웨스턴 블롯 분석을 실시하고, 조직학적 검사를 통해 멜리틴의 효과를 확인함으로써 달성되었다.

본 발명은 멜리틴을 유효성분으로 함유하는 동맥경화 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, "유효성분"이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 의약품의 효능 및 효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군(약리학적 활성성분 등이 밝혀지지 않은 생약 등을 포함한다)으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.

또한 상기 약제학적 조성물은 멜리틴을 함유하고, 다른 담체(carrier) 또는 부형제를 함유하여 정제, 환, 과립, 액상, 캡슐 등 당업자에게 자명한 형태로 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 멜리틴은 동맥경화 동물 모델에서 총콜레스테롤과 중성지질은 감소시켰으며 고밀도 콜레스테롤은 유지하거나 오히려 증가시켰다.

또한, 본 발명에 따른 멜리틴은 동맥경화 동물 모델의 혈액에서 염증 관련 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β 발현양이 감소시켰으며, 대동맥에서 섬유화 관련 사이토카인과 혈관부착인자를 조직 및 단백질 수준이 감소시켰으며, 동맥경화에서 일반적으로 나타나는 플라크의 침착을 감소시켰다.

또한, 본 발명에 따른 멜리틴은 단백질 수준에서 혈관부착인자인 ICAM과 VCAM, 섬유화 사이토카인인 TGF-β1과 피브로넥틴의 발현량을 감소시켰으며, 심장에서 섬유화 관련 사이토카인과 혈관부착인자의 발현량을 감소시켰다.

본 발명에 따른 멜리틴을 동맥경화 실험동물 모델에 투여한 결과, 총콜레스테롤과 중성지질은 감소시켰으며 고밀도 콜레스테롤은 유지하거나 오히려 증가시키는 효과가 있으며, 혈액에서 염증 관련 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β 발현양 감소, 대동맥 및 심장에서 섬유화 관련 사이토카인과 혈관부착인자 발현량 감소, 동맥경화에서 일반적으로 나타나는 플라크 침착의 감소, 단백질 수준에서 혈관부착인자인 ICAM과 VCAM, 섬유화 사이토카인인 TGF-β1과 피브로넥틴의 발현량 감소를 가져오는 효과가 있어, 본 발명의 멜리틴은 동맥경화 치료에 있어 매우 효과적이다.

도 1은 동맥경화 동물모델에서 심장과 대동맥을 적출하여 H&E 염색을 통한 멜리틴이 미치는 영향을 나타낸 도면으로서, A는 심장조직, B는 대동맥 조직을 나타낸다.
도 2는 동맥경화 동물모델에서 멜리틴이 콜레스테롤에 미치는 영향을 나타낸 그래프로서, A는 총 콜레스테롤, B는 중성지질, C는 HDL-콜레스테롤을 나타낸다.
도 3은 동맥경화 동물모델에서 멜리틴이 염증관련 사이토카인에 미치는 영향을 나타낸 그래프로서, A는 TNF-α의 생산량, B는 IL-1β의 생산량을 나타낸다.
도 4는 동맥경화 동물모델에서 심장을 적출하여 멜리틴이 혈관부착인자 및 섬유화에 미치는 영향을 나타낸 도면으로서, A는 단백질 수준에서 확인한 것이며, B는 면역조직화학염색법 결과를 나타낸다.
도 5는 동맥경화 동물모델에서 대동맥을 적출하여 멜리틴이 혈관부착인자 및 섬유화에 미치는 영향을 나타낸 도면으로서, A는 단백질 수준에서 확인한 것이며, B는 면역조직화학염색법 결과를 나타낸다.
도 6은 동맥경화 동물모델에서 심장과 대동맥을 적출하여 멜리틴이 대식세포의 발현에 미치는 영향을 면역형광염색법으로 나타낸 도면으로서, A는 심장조직, B는 대동맥조직을 나타낸다.
도 7은 동맥경화 세포모델에서 멜리틴이 염증관련 사이토카인에 미치는 영향을 나타낸 그래프로서, A는 THP-1에서 분화한 대식세포에서의 TNF-α의 생산량, B는 THP-1에서 분화한 대식세포에서의 IL-1β의 생산량, C는 혈관평활근세포에서의 TNF-α의 생산량, D는 혈관평활근세포에서의 IL-1β의 생산량을 나타낸다.

이하 본 발명이 구체적인 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예

본 발명의 실시예에서 실험동물은 10주된 C57BL/6 생쥐(20-25 g)를 ㈜샘타코로부터 구입하여 1주일간의 순화기간을 거친 후 실험에 사용하였다. 동맥경화 실험동물 모델은 LPS(2 mg/kg)로 유도하였으며 3회 복강으로 주사하였다. 또한 동맥경화증을 유발하기 위한 고콜레스테롤 함유 사료로는 정상 식이용 분말 사료에 15% 지방, 1.25% 콜레스테롤과 0.5% 콜린산을 섞은 후 펠렛 형태로 제조하여 12주간 자유 식이하였다.

멜리틴은 농촌진흥청의 농업과학기술원에서 공급받아 사용하였으며 실험동물에 멜리틴의 투여 농도는 0.1 mg/kg으로 하여 12주 동안 복강으로 주 2회 투여하였다.

실험군은 동맥경화 실험군(LPS+Fat), 동맥경화 실험군에 멜리틴(0.1 mg/kg)을 투여한 실험군(LPS+Fat+M)과 대조군(normal control, NC)으로 나누어 실험을 수행하였다. 실험 동물은 2주, 4주, 8주와 12주에 희생하여 실험 재료로 사용하였다. 혈액은 심장에서 추출하였고 조직은 대동맥을 적출하여 10% 중성 포르말린 용액으로 고정하였다.

실험의 분석결과는 각각의 군별로 평균과 표준편차(mean ± S.D.)를 사용하여 표기하였으며, 모든 자료는 SPSS 프로그램(Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 처리하였고, 반복측정에 의한 ANOVA 검정을 적용하여 유의도 수준 p < 0.05에서 확인하였다.

실시예 1 : 염증성 사이토카인( TNF -α, IL -1β)의 발현량 확인

실험 동물의 혈장을 분리하여 염증성 사이토카인의 발현량을 ELISA 분석 키트(enzyme-linked immunosorbent assay kit; R&D, Minneapolis, MN)를 이용하여 측정하였다. TNF-α와 IL-1β의 일차항체와 이차항체를 순서대로 반응시키고 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘을 첨가하여 발색시킨 다음 ELISA 리더기로 450nm에서 흡광도를 측정하였으며 TNF-α와 IL-1β의 표준용액을 이용한 기준단위(standard)를 이용하여 시료의 농도를 환산하였다.

실시예 2 : 콜레스테롤의 분석

분리된 실험 동물의 혈청을 이용하여 총-콜레스테롤, 트리글리세라이드, HDL-콜레스테롤을 측정하였다. 콜레스테롤분석 시약은 아산제약의 각각의 kit를 사용하였으며, 표준 기준단위는 각각의 표준용액을 이용하여 작성하였으며 이 그래프를 이용하여 시료의 농도를 환산하였다.

실시예 3 : 단백질 분리와 웨스턴 블롯 분석

동맥, 심장 그리고 간세포는 IPH 용리 완충액(50mM pH 8.0 Tris, 150mM NaCl, 5mM EDTA, 0.5% NP-40, 100mM PMSF, 1mg/mL 류펩틴, 1mg/mL 아프로티닌 및 1M DTT)를 첨가한 후, 4℃에서 30분 동안 반응시키고 12,000rpm에서 10분 동안 원심 분리 후 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질을 브래드포드법(Bradford)법(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)으로 정량하였으며, 정량한 단백질은 SDS-PAGE로 전기영동하고 PVDF 멤브레인(Milipore, USA)에 옮겼다. 멤브레인은 일차 항체 항-TGF-α, 항-α-SMA, 항-피브로넥틴, 항-ICAM-1 그리고 항-VCAM-1과 반응시키고 TBS-T로 15분간 2회 세척 후 멤브레인을 2차 항체로 2시간 반응시켰다. 항체들에 대한 발현 분석은 HRP(horseradish peroxidase-linked) 이차항체에 의해 발현되는 ECL 웨스턴 블롯 분석(enhanced chemiluminescence Western Blot Analysis (Amersham, NJ, USA) 시스템을 이용하였으며 X-ray 필름에 현상한 후 사이언스 랩(Science Lab) 2005 (Fujifilm, Japan)를 이용하여 비교 분석하였다.

실시예 4 : 조직학적 검사

조직에서 TGF-β1, α-SMA, 항-ICAM 그리고 항-VCAM의 발현 억제 정도를 살펴보기 위하여 면역조직화학염색을 시행하였다. 면역조직화학염색은 먼저 파라핀으로 포매(包埋)된 신장의 생검조직을 회전형 박절기로 4㎛ 두께로 잘라 부착제가 처리된 슬라이드에 붙이고 탈파라핀화시킨 후 에탄올과 증류수를 사용해서 함수시켰다. 메탄올에 희석한 3% 과산화수소 용액에 30분간 처리하여 내인성 과산화효소에 대한 반응을 차단하고 증류수로 세척하였다. 미리 데워놓은 95℃ 다코 에피토프 복구 용액(Dako Epitope Retrieval Solution; 0.01mol/L 시트르산염 완충액, pH 6.0)에 조직 절편이 충분히 잠기게 넣은 후 10분간 끓여 에피토브 복구 과정을 시행하고 실온에서 식힌 후 PBS로 세척해 주었다. 조직에서 TGF-β1, α-SMA, 항-피브로넥틴, 항-ICAM 그리고 항-VCAM에 대한 1차 항체를 4℃에서 16시간 동안 반응시키고, 비오티닐화 항-마우스 IgG(biotinylated anti-mouse IgG; DAKO, CA, USA)로 37℃에서 15분간 반응시켰다. 스트렙타비딘 퍼옥시다제(streptavidin peroxidase; DAKO, CA, USA)로 37℃에서 15분간 반응시키고, DAB(3,3´-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드)로 발색한 후 헤모톡실린으로 대조 염색을 하여 광학현미경으로 관찰하였다.

실시예 5: 실험 결과

동맥경화 동물 모델의 심장과 대동맥은 H&E 염색으로 조직을 확인해 본 결과 동맥경화 4주에서 12주로 갈수록 동맥경화에서 일반적으로 나타나는 플라크의 침착 및 혈관벽이 두꺼워지고 지방줄무늬가 불규칙적으로 나열되나, 멜리틴을 투여한 실험군은 그 현상이 감소하였음을 확인하였다(도 1 참조).

도 2에 나타낸 바와 같이, 동맥경화 동물 모델에 멜리틴을 투여한 다음 혈청을 분리하여 총콜레스테롤과 중성지질, 고밀도 콜레스테롤을 측정한 결과 총콜레스테롤과 중성지질은 멜리틴을 투여한 실험군에서 감소하였으며 고밀도 콜레스테롤은 유지하거나 오히려 증가시켜 멜리틴의 효과를 확인하였다.

또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 동맥경화 동물 모델에 멜리틴을 투여한 다음 혈청을 분리하여 염증 관련 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β를 ELISA로 측정한 결과 멜리틴을 투여한 실험군에서 4주, 8주와 12주 모두 감소하여 멜리틴의 효과를 확인하였다.

동맥경화 동물 모델에 멜리틴을 투여한 다음 심장을 적출하여 혈관부착인자와 섬유화 관련 사이토카인을 조직 및 단백질 수준에서 확인한 결과 4주, 8주와 12주 모두 감소하여 멜리틴의 효과를 확인하였다.

단백질 수준에서 혈관부착인자인 VCAM-1과 !CAM-1, 섬유화 사이토카인인 피브로넥틴과 TGF-β1의 발현량을 확인해본 결과 멜리틴을 투여한 실험군에서의 발현량이 감소함을 확인하였다(도 4-A 참조). 또한 면역조직화학염색법으로 확인한 결과 단백질 수준에서의 결과와 동일함을 확인하였다(도 4-B 참조).

동맥경화 동물 모델에 멜리틴을 투여한 다음 대동맥을 적출하여 혈관부착인자와 섬유화 관련 사이토카인을 조직 및 단백질 수준에서 확인한 결과 4주, 8주와 12주 모두 감소하여 멜리틴의 효과를 확인하였다.

단백질 수준에서 혈관부착인자인 VCAM-1과 ICAM-1, 섬유화 사이토카인인 피브로넥틴과 TGF-β1의 발현량을 확인해본 결과 멜리틴을 투여한 실험군에서의 발현량이 감소함을 확인하였다(도 5-A 참조). 또한 면역조직화학염색법으로 확인한 결과 단백질 수준에서의 결과와 동일함을 확인하였다(도 5-B 참조).

동맥경화 동물 모델에 멜리틴을 투여한 다음 대동맥을 적출하여 대식세포를 면역형광염색법으로 확인한 결과 모두 감소하여 멜리틴의 효과를 확인하였다(도 6 참조).

동맥경화 세포 모델(THP-1에서 분화한 대식세포와 혈관평활근세포)에 멜리틴을 투여한 다음 배양 상등액을 염증관련 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β를 ELISA로 측정한 결과 멜리틴을 농도별로 투여한 세포 모델에서 감소하여 멜리틴의 효과를 확인하였다(도 7 참조).

Claims (1)

1. 멜리틴을 유효성분으로 하는 동맥경화 치료용 약학 조성물.

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