JP7118508B2 - 神経損傷を治療するペプチドベースの方法 - Google Patents

神経損傷を治療するペプチドベースの方法 Download PDF

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Description

関連出願データ
本出願は、ここに参照することによって本願に援用される、２０１６年２月２３日出願の米国仮特許出願第６２／２９８，５８５号の優先権の利益を主張する。
配列表データ
ファイル名「２８４８－２０２＿配列＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」で２０１６年２月２３日作成のサイズ３キロバイトの本明細書に添付される配列表テキストファイルは、その全体が、参照することによって本明細書に取り込まれる。
脳卒中は、重大な経済的負担を伴う世界第２位の死亡原因であり、認知障害の理由から、回復した患者の生活の質が悪い。残念ながら、脳損傷を軽減するため、及び脳卒中患者を治療するために利用可能な薬理学的ツールは、非常に限られている。脳卒中についての最も重要かつ修正不可能なリスク要因のうちの２つは、年齢及び性別であり、脳卒中のリスクは５５歳以降の１０年ごとに倍増し、また、高齢女性の脳卒中率が上昇する晩年に至るまでは、女性よりも男性に大きな影響を及ぼす。この後者の観察結果は、細胞死経路におけるアンドロゲン及びエストロゲンの影響に起因する可能性が高い。しかしながら、ほとんどの神経保護についての研究（前臨床又は臨床）は、メスの動物を使用していないか、あるいは、ヒト臨床における性差の違いを見出すことに注力されていない。よって、新規化合物の治療可能性を決定するために、ヒト患者集団をより正確にモデル化することが重要である。
一過性受容体電位Ｍ２（ＴＲＰＭ２）は、一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルのスーパーファミリーの成員である。これらのチャネルは、６つの膜貫通ドメイン並びに細胞内のアミノ末端及びカルボキシ末端を有すると考えられる。ＴＲＰチャネルは、配列相同性及び特定の構造モチーフに基づいて３つのファミリーに分類される（Harteneckら, 2000, Trends Neurosci., 23:159; Montellら, 2002, Mol. Cell., 9:229）。ＴＲＰＭ２は、創設メンバーであるメラスタチンにちなんで命名されたファミリーＭに属する。ＴＲＰＭチャネルは、キナーゼ活性などの追加的な機能を有する、それらのアミノ末端及びカルボキシ末端における複雑な構造的部分領域によって特徴付けられる（Ryazanov, 2002, FEBS Lett., 514:26）。ＴＲＰＭ２の発現及び機能に関しては、限られた情報が存在する。高レベルの発現が神経系において検出され、例えば骨髄、脾臓、肺及び心臓などの末梢組織では低レベルで検出された（Nagamineら, 1998, Genomics, 54:124; Perraudら, 2001, Nature, 411:595）。ＴＲＰＭ２チャネルは、ＡＤＰリボース（ＡＤＰｒ）によって活性化される非選択的カチオンチャネルである。ＡＤＰｒは、酸化ストレス及び脳虚血に応答してＰＡＲＰ－１によって生成される可能性があり、これは、虚血後の再灌流傷害の設定に特に関連する。クロトリマゾール（ＣＴＺ）又は遺伝子ノックダウンを用いたＴＲＰＭ２イオンチャネルの阻害は、脳卒中後、男性では梗塞のサイズを縮小するが、女性では縮小しない。ＴＲＰＭ２は、男性における脳卒中の治療的介入のための実行可能な標的であるように思われるが、前臨床試験は、特異的阻害剤の欠如によって制限されてきた。
ＴＲＰＭ２イオンチャネルの調節は、ある特定の障害及び疾患の原因及び／又は制御と有意に関連していることが示されていることから、ＴＲＰＭ２イオンチャネルの阻害において安全かつ有効な薬剤を見出すことが必要である。
ＴＲＰＭ２チャネルは、１０年以上にわたり、虚血性ニューロン損傷に関与している（レビューには、Aarts MM, Tymianski M. Trpms and neuronal cell death. Pflugers Arch - Eur J Physiol. 2005; 451:243-249を参照；米国特許出願公開第２０１０／０２９８３９４号、２０１０年１１月２５日も参照されたい）が、それにもかかわらず、この分野は、チャネルに特異的な阻害剤の欠如に悩まされてきた。クロトリマゾール（ＣＴＺ）などの非特異的ＴＲＰＭ２阻害剤は、インビトロにおける皮質及び海馬ニューロンにおける神経細胞死を減少させて、局所及び全脳虚血後のオス動物の傷害を軽減することが示されている。本発明者らは、ＴＲＰＭ２チャネルの新規かつ特異的ペプチド阻害剤を特定した。
ＴＲＰＭ２チャネルの識別特性は、それらが、Ｃ－末端におけるＡＤＰｒ加水分解酵素相同性ドメイン（「ＮＵＤＴ９－Ｈ」と呼ばれる）への結合を介して、ＡＤＰリボース（ＡＤＰｒ）によってゲート制御されることである。ＮＵＤＴ９－Ｈの触媒ドメインは、同じドメイン内の幾つかの離れたアミノ酸と協調してＡＤＰｒ結合ポケットを形成する、Ｎｕｄｉｘドメインである。本発明者らは、ＴＲＰＭ２チャネルの活性化を阻害する戦略としてＡＤＰｒ結合ポケットを標的とした。Ｃ－末端Ｎｕｄｉｘ相同性ドメインを欠くチャネルの発現は、不活性である。したがって、本発明者らは、ＧＳＲＥＰＧＥＭＬＰＲＫＬＫＲＶＬＲＱＥＦＷＶ（配列番号１；「Ｍ２ＮＸ」）を含むペプチドを生成し、細胞透過性ＴＡＴ配列、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２；「ｔａｔ４７－５７」）に融合して、チャネルのＮＵＤＴ９－ＨドメインのＡＤＰｒ結合ポケットとの相互作用を介してＴＲＰＭ２チャネル活性を特異的に阻害する、３４－ｍｅｒ、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＳＲＥＰＧＥＭＬＰＲＫＬＫＲＶＬＲＱＥＦＷＶ（配列番号３；「ｔａｔ－Ｍ２ＮＸ」）を形成した。
重要なことには、本明細書に開示される一次データは、ＴＲＰＭ２チャネルの阻害が、脳卒中、外傷性脳損傷、心停止誘発性の全虚血及び神経変性疾患後の機能回復を改善することを示している。これらの効果は、オスの動物及びメスの動物の両方に、及び、ＴＲＰＭ２阻害が急性又は慢性の時点の間に達成される場合に、観察される。
よって、本開示は、本開示のＴＲＰＭ２阻害性ペプチドを含む医薬組成物を被験体に投与することによる、被験体における、神経障害又は損傷、若しくは神経変性疾患を治療又は予防する方法、あるいは、神経機能の回復を促進する方法を提供する。
本開示はまた、本開示のＴＲＰＭ２阻害性ペプチド、又はそれらの変異体、及び少なくとも１つの追加的な治療剤を含む医薬組成物を被験体に投与することによる、被験体における、神経障害又は損傷、若しくは神経変性疾患を治療又は予防する方法、あるいは、神経機能の回復を促進する方法も提供する。追加的な治療剤は、１つ以上の神経保護、神経修復、又は血栓を防止する又は溶解する薬剤でありうる。
これらの方法では、投与は非経口投与によるものでありうる。これらの方法では、ペプチドは、約０．０５から約２５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与されうる。これらの方法では、被験体はヒトでありうる。被験体は、オス（男性）でありうる。
１つの態様は、神経障害又は損傷、若しくは神経変性疾患の治療又は予防のため、あるいは神経機能の回復を促進するための、本開示のペプチド、若しくはそれらの多量体、誘導体、又は変異体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。これらの組成物は、少なくとも１つの追加的な治療剤を含んでいてもよく、したがって、別の態様は、脳卒中を含む神経障害又は損傷の治療又は予防のための、本開示のペプチド、若しくはそれらの多量体、誘導体、又は変異体、少なくとも１つの追加的な治療剤、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。関連する態様は、脳卒中を含む神経障害又は損傷の治療又は予防のための、本開示のペプチド若しくはそれらの多量体、誘導体、又は変異体の使用である。
本開示の他の態様は、以下の開示に説明されるか、又は以下の開示から明白であり、本開示の範囲内にある。
実施例として与えられるが、本開示を、記載される特定の実施態様に限定することは意図されていない、以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて理解することができる。
図１Ａは、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸが、ＴＲＰＭ２チャネルを通じたＣａ２＋の流入を阻害し、インビボにおける神経保護をもたらすことを、ＦＬＡＧタグ付きヒトＴＲＰＭ２のテトラサイクリン調節されるサイトメガロウイルス駆動性転写を発現するＨＥＫ－２９３細胞における、ベースラインからのパーセンテージ増加として示される、Ｆｌｕｏ－５Ｆ蛍光の平均蛍光変化として示している。試料は、２００μＭのＨ２Ｏ２の存在下、１００μＭのｔａｔ－Ｍ２ＮＸ（三角）又はｔａｔ－ＳＣＲ（丸）で処理された。図１Ｂは、２５、５０、１００μＭのｔａｔ－Ｍ２ＮＸ又は１００μＭのｔａｔ－ＳＣＲで処置されたＨＥＫ－２９３細胞におけるＦｌｕｏ－５Ｆ蛍光のパーセンテージ増加の定量化を示している。 図１Ｃは、ＭＣＡＯの前に６０分間、（Ｃ’）ｔａｔ－ＳＣＲ及び（Ｃ’’）ｔａｔ－Ｍ２ＮＸで処置したオスの脳、及び（Ｃ＊）ｔａｔ－ＳＣＲ及び（Ｃ＊＊）ｔａｔ－Ｍ２ＮＸで処置したメスの脳に由来するＴＴＣ染色を示す写真を提供している。図１Ｄは、ビヒクル、１００μＭのｔａｔ－ＳＣＲ、又は１００μＭのｔａｔ－Ｍ２ＮＸで処置したＷＴオス及びメスマウスにおける梗塞体積のパーセンテージの定量化を示している。 ｔａｔ－Ｍ２ＮＸが、６０分間のｔＭＣＡＯ後のＴＲＰＭ２－／－マウスを保護しないことを示している。ＴＴＣで染色したＷＴ及びＴＲＰＭ２－／－マウスの脳由来の梗塞体積のパーセンテージの定量化。ＴＲＰＭ２－／－オスのマウスを１００μＭのｔａｔ－Ｍ２ＮＸペプチド又はビヒクルで処置した。 図３Ａは、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸが、臨床的に関連する治療濃度域を示すことを、再灌流後３時間、及び再灌流後２４時間の染色したｔａｔ－ＳＣＲ（Ａ’）又はｔａｔ－Ｍ２ＮＸ（Ａ’’）で処置したオスのマウスの代表的なＴＴＣ染色として、示している。図３Ｂは、再灌流後３時間、及び再灌流後９６時間の染色したｔａｔ－ＳＣＲ（Ｂ’）又はｔａｔ－Ｍ２ＮＸ（Ｂ’’）で処置したオスのマウスを示している。 薬物を受けた後２４時間及び９６時間における、ＴＴＣで染色したオス及びメスの脳における梗塞体積のパーセンテージの定量化を示している。オス及びメスマウスは、ビヒクル、クロトリマゾール（ＣＴＺ）、ｔａｔ－ＳＣＲ（２０ｍｇ／ｋｇ）又はｔａｔ－Ｍ２ＮＸ（２０ｍｇ／ｋｇ）で処置された。 ｔａｔ－Ｍ２ＮＸが、老齢期のオスに神経保護をもたらすことを、ｔａｔ－ＳＣＲ（ＳＣＲ）又はｔａｔ－Ｍ２ＮＸ（Ｍ２ＮＸ）のいずれかを受けた１８～２０月齢のオス及びメスのマウスにおける梗塞部のパーセンテージの定量化として、示している。ＹＡ＝若齢成熟期；Ａ＝老齢期。＊ｐ＜０．０５。 図５Ａは、ジヒドロテストステロンではなく、テストステロンが、オスのマウスの加齢に伴って減少することを、２月、４～５月、及び１８月齢のオスのマウスにおける、ＥＬＩＳＡによって測定したテストステロンの血清濃度の定量化として、示している。図５Ｂは、２月、４～５月、及び１８月齢のオスのマウスにおける、ＥＬＩＳＡによって測定したジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の血清濃度の定量化を示している。＊ｐ＜０．０５。 図６Ａ及び６Ｂは、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸの遅延投与後のシナプス可塑性の虚血誘発性機能障害の逆転を実証している。図６Ａは、ＴＢＳに対するオスの応答のダイアリープロットである。矢印は、ＴＢＳのタイミング（４０パルス）を示している。図６Ｂは、オス（青色）及びメス（赤色）におけるベースラインからの変化の定量化を示している。＊シャム対照と比較してＰ＜０．０５。 図７Ａ及び７Ｂは、特にオスのマウスにおける、ＣＡ１神経損傷のｔａｔ－Ｍ２ＮＸ減少及び長期的なシナプス機能の向上を実証している。図７Ａは、ＣＡ／ＣＰＲの３日後の海馬のＣＡ１領域における虚血ニューロンの定量化を示している。＊Ｐ＜０．０５。図７Ｂは、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸが、シナプス可塑性の虚血誘発性機能障害を防ぐことを示している。矢印は、ＴＢＳのタイミング（４０パルス）を示している。 図８Ａ及び８Ｂは、急性の切片におけるＴＲＰＭ２の阻害が、シナプス可塑性の虚血誘発性機能障害を逆転させることを実証している。図８Ａは、ＴＢＳに対するオスの応答のダイアリープロットである。矢印は、ＴＢＳのタイミング（４０パルス）を示している。図８Ｂは、オス（青色）及びメス（赤色）におけるベースラインからの変化の定量化を示している。 図９Ａ及び９Ｂは、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸの遅延投与が、シナプス可塑性の虚血誘発性機能障害を逆転させることを実証している。図９Ａは、ＴＢＳに対するオスの応答のダイアリープロットである。矢印は、ＴＢＳのタイミング（４０パルス）を示している。図９Ｂは、オス（青色）及びメス（赤色）におけるベースラインからの変化の定量化を示している。＊シャム対照と比較してＰ＜０．０５。 図１０Ａ及び１０Ｂは、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸの遅延投与が、虚血誘発性の記憶機能障害を逆転させることを実証している。図１０Ａは、新しい文脈及びフットショックへの曝露の２４時間後、８日目の凍結挙動の定量化を示している。ｔａｔ－ＳＣＲスクランブルペプチドを注入されたＣＡ／ＣＰＲマウスは、凍結挙動の低減を示し、文脈の損なわれた記憶と一致している。対照的に、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸで処置したマウス（７日目）は、凍結挙動が増加していた。図１０Ｂは、ＣＡ／ＣＰＲの３０日後の損なわれた文脈的恐怖条件づけ挙動を示している。 図１１Ａ及び１１Ｂは、外傷性脳損傷後のマウスの運動及び記憶機能におけるｔａｔ－Ｍ２ＮＸによるＴＲＰＭ２チャネル阻害の効果を示している。 図１２Ａ及び１２Ｂは、急性の切片におけるＴＲＰＭ２の阻害がシナプス可塑性の虚血誘発性機能障害を逆転させることを実証している。図１２Ａは、アミロイドβへの曝露に対する応答のダイアリープロットである。図１２Ｂは、ベースラインからのパーセント変化としてのシナプス可塑性の定量化を示している。
前述の通り、本開示は、ＴＲＰＭ２チャネルのリガンド（ＡＤＰリボース）－結合ポケットを破壊し、それによって、活性化を防止する働きをする、ＴＲＰＭ２阻害剤に関する。したがって、本開示は、ＴＲＰＭ２チャネルのＡＤＰｒ結合部分を破壊する小分子を検討する。
一態様において、本開示は、神経保護及び神経修復するペプチド及びペプチド構築物、及びこれらのペプチドの使用、並びに、神経損傷、神経障害、又は神経変性疾患を患う、又は神経損傷を被る危険性のある、又は神経障害又は神経変性疾患を発症している被検体にこのようなペプチドを投与する方法に関する。
定義
本明細書で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。よって、例えば、「細胞（a cell）」についての言及は複数のこのような細胞を含み、「タンパク質（the protein）」についての言及は、１つ以上のタンパク質及び当業者に知られているそれらの等価物等についての言及を含む。本明細書で用いられる技術的及び科学的用語はすべて、他に明確に示されていない限り、この技術が属する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。
用語「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、本明細書では、アミノ酸残基から構築されるポリマーを称するための同義語として用いられる。
「実質的に純粋」とは、本明細書で用いられる場合には（例えば、医薬組成物の文脈において）、ペプチドが、組成物の総含有量の約５０％超（例えば、組成物の総タンパク質）、又は総タンパク質含量の約８０％超を構成することを意味する。例えば、「実質的に純粋」なペプチドとは、組成物全体の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又はそれ以上がペプチドである（例えば、総タンパク質の９５％、９８％、９９％、９９％超）である組成物のことを指す。ペプチドは、組成物中の総タンパク質の約９０％超、約９５％超、９８％超、又は９９％超を構成しうる。幾つかの実施態様では、ペプチドが、生産の間に関連づけられる有機分子を含まない重量で少なくとも６０％又は少なくとも７５％である場合、ペプチドは、実質的に純粋である。幾つかの実施態様では、ペプチドは、重量で、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の純度である。例えば、幾つかの実施態様では、免疫調節ペプチドは、免疫調節ペプチドが、生産の間に関連づけられる有機分子を含まない重量で、少なくとも６０％又は少なくとも７５％である場合に、実質的に純粋であり、幾つかの実施態様では、免疫調節ペプチドは、重量で、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の純度である。
用語「被験体」、「患者」、及び「個人」は、本明細書において区別せずに用いられ、多細胞動物（哺乳類（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ａｙｅｓ等）、鳥類（例えば、ニワトリ）、両生類（例えば、アフリカツメガエル）、爬虫類、及び昆虫（例えば、ショウジョウバエ）を含む）のことを指す。「動物」には、モルモット、ハムスター、フェレット、チンチラ、マウス、及びラットが含まれる。これらの用語には、特にヒトが含まれ、特にオスの哺乳動物、したがって、ヒト男性が含まれる。
本明細書で用いられる用語「神経保護」とは、ニューロンの死、アポトーシス、破壊又は傷害を、評価できる、及び／又は、低減又は阻害する、若しくは低減又は阻害すると期待される、及び／又は、被験体における神経変性を低減又は阻害する、ペプチドの任意の特性を指す。
本明細書で用いられる用語「神経修復」とは、細胞死の変化とは無関係に、脳機能、シナプス機能、ニューロン発火、脳ネットワーク機能を改善しうる、ペプチドの任意の特性を指す。神経修復は、障害時近辺又は慢性の時点で投与されて脳機能における安定した障害を逆転させる薬剤に適用される。
「有効量」とは、所望の治療的または予防的結果を達成するのに必要な投与量及び期間で有効な量のことを指す。ペプチド又は本開示のペプチドを含む医薬組成物の「治療的有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重などの因子、並びに個体に所望の反応を引き出すペプチド又は組成物の能力に応じて変動しうる。治療的有効量はまた、ペプチド又はペプチドを含む組成物の毒性又は有害な影響を治療的に有益な効果が上回るものである。
数値範囲に対する本明細書での言及（例えば、投与量範囲）は、その範囲に包含される各数値（分数及び整数を含む）を明示的に含む。例えば、限定はしないが、０．５ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの範囲についての言及は、その２つの間のすべての整数及び分数を明示的に含む。
本明細書に記載されるように、脳卒中、ＴＢＩ、心停止を含む神経損傷を「患う」と称される個体は、脳卒中を含む神経損傷の１つ以上の症状と診断されている、及び／又は、それら症状を示す。
本明細書で用いられる場合、脳卒中を含む神経損傷の「危険性」があるという用語は、脳卒中を発症しやすい、及び／又は、疾患の１つ以上の症状を発現しやすい被験体（例えば、ヒト）を指す。この素因は、遺伝的であることも、あるいは他の要因に起因することもある。本開示が特定の兆候又は症状に限定されることは意図されていない。よって、本開示が、亜臨床的から本格的まで、脳卒中を含む任意の範囲の神経損傷を経験する被験体を包含することが意図されており、被験体は脳卒中を含む神経損傷に関連する兆し（例えば、兆候及び症状）のうちの少なくとも１つを示す。
本明細書で用いられる場合、用語「治療／処置／処理する（treat, treating）」、又は「治療／処置／処理（treatment）」とは、疾患、障害、及び／又は状態（例えば、神経損傷、神経変性疾患）の１つ以上の症状又は特徴を、部分的に又は完全に緩和する、寛解させる、軽減する、阻害する、予防する、その発症を遅延させる、その重症度を軽減する、及び／又は、その発生率を低減するために用いられる任意の方法のことを指す。治療／処置／処理は、疾患、障害、及び／又は状態の兆候を示していない被験体に投与されてもよい。幾つかの実施態様では、治療／処置／処理は、疾患、障害、及び／又は状態に関連する病理発生リスクを低減させる目的で、疾患、障害、及び／又は状態の初期の兆候のみを示す被験体に投与されてもよい。
用語「含む（comprises, comprising）」は、特許法に帰属する幅広い意味を有し、「含む（includes, including）」などを意味しうる。
本開示は、以下の詳細及び、本開示の非限定的な実施態様を例示することが意図される例示的な実施例を参照することにより、より十分に理解することができる。
ポリペプチド
本開示のペプチドは、チャネルのＮＵＤＴ９－ＨドメインのＡＤＰｒ結合ポケットとの相互作用を介してＴＲＰＭ２チャネル活性を特異的に阻害する、ＴＲＰＭ２チャネルのＣ－末端のＮＵＤＴ９－Ｈ領域のＮｕｄｉｘドメインの断片、又はそれらの変異体を含む。よって、本開示の被験体ペプチドは、ＧＳＲＥＰＧＥＭＬＰＲＫＬＫＲＶＬＲＱＥＦＷＶ（配列番号１）である。本開示のペプチドのいずれかは、好ましくはＮ－末端において、細胞の原形質膜を介した移動を促進する内在化ペプチドに連結されうる。これらのペプチドの例としては、ＨＩＶから誘導されるＴＡＴ（Vivesら, 1997, J. Biol. Chem. 272:16010；Nagaharaら, 1998, Nat. Med. 4:1449）、ショウジョウバエ由来のアンテナペディア（Derossiら, 1994, J. Biol. Chem. 261:10444）、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ２２（Elliot及びD'Hare, 1997, Cell 88:223-233）、抗ＤＮＡ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）２及び３（Avrameasら, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95:5601-5606）、７０ＫＤａ熱ショックタンパク質（ＦFujihara, 1999, EMBO J. 18:411-419）、及びトランスポータン（Poogaら, 1998, FASEB J. 12:67-77）が挙げられる。例えば、ＨＩＶ ＴＡＴ内在化ペプチドＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２）が用いられうる。ＨＩＶ Ｔａｔ内在化ペプチド及びＴＲＰＭ２チャネル活性の活性ペプチド阻害剤を含む本開示の１つの例示的なペプチドは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ－ＧＳＲＥＰＧＥＭＬＰＲＫＬＫＲＶＬＲＱＥＦＷＶ（配列番号３、「Ｔａｔ－Ｍ２ＮＸ」）である。
標準的なＴＡＴ配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２）の変異体も用いられうる。本開示の実施は機構の理解に依存してはいないが、膜を横断する能力及びＴＡＴのＮ型カルシウムチャネルに対する結合の両方が、ペプチドの正に荷電した残基Ｙ、Ｒ及びＫの異常に高い発生によって与えられると考えられる。本開示で使用するための変異体ペプチドでは、細胞内への取り込みを促進する能力は保持すべきであるが、Ｎ型カルシウムチャネルに結合する能力が低減されている。幾つかの適切な内在化ペプチドは、アミノ酸配列ＸＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）を含む、又はそれからなり、ここで、Ｘは、Ｙ以外のアミノ酸である。好ましいＴＡＴ変異体は、Ｎ末端のＹ残基がＦで置換されている。よって、ＦＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号５）を含む又はそれからなるＴＡＴ変異体が用いられうる。ＴＡＴ内在化ペプチドの別の好ましい変異体は、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号６）からなる。ＸＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）に隣接する追加的な残基が（活性ペプチドの他に）存在する場合、該残基は、例えば、典型的には、２つのペプチドドメインを結合するために用いられる種類のＴＡＴタンパク質、スペーサー又はリンカーアミノ酸に由来するこのセグメント、例えば、Ｇｌｙ（Ｓｅｒ）４（配列番号７）、ＴＧＥＫＰ（配列番号８）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号９）、又はＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号１０）（例えば、Tangら (1996), J. Biol. Chem. 271, 15682-15686；Henneckeら (1998), Protein Eng. 11, 405-410を参照）、ＧＳＲＶＱＩＲＣＲＦＲＮＳＴＲ（配列番号１１）（米国特許出願公開第２０１４／０２３５５５３号；２０１４年８月２１日参照）に隣接する中性アミノ酸でありうるか、若しくは、隣接する残基なしに変異体の取り込み量を検出可能に減少させないであろう、かつ、隣接する残基なしに変異体に関連してＮ型カルシウムチャネルの阻害を大幅には増加させない、いずれかの他のアミノ酸でありうる。好ましくは、活性ペプチド以外に、隣接するアミノ酸の数は、ＸＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）の両側において１０残基を超えない。好ましくは、隣接するアミノ酸は存在せず、内在化ペプチドは、そのＣ－末端において本開示の活性ＴＲＰＭ２阻害剤ペプチドに直接連結する。
本明細書に記載のペプチドの「変異体」は、本明細書に開示されるポリペプチドと実質的に同様のポリペプチドであり、かつ、本開示のペプチドのＴＲＰＭ２阻害剤特性又は神経保護活性のうちの少なくとも１つを保持する。変異体は、本明細書に開示されるポリペプチドのＮ末端又はＣ末端における１つ以上のアミノ酸残基の欠損（すなわち、トランケーション）；本明細書に開示されるポリペプチドの１つ以上の内部部位における１つ以上のアミノ酸残基の欠損及び／又は付加；及び／又は、本明細書に開示されるポリペプチドの１つ以上の位置における１つ以上のアミノ酸残基の置換を含みうる。１２アミノ酸残基長又はそれより短いポリペプチドについては、変異体ポリペプチドは、好ましくは、Ｎ－末端において、及び／又は、Ｃ末端において、内部に位置していてもいなくても、３つ又はそれ以下（例えば、２つ、１つ、又はなし）の欠損アミノ酸残基を含む。
したがって、本発明にかかる方法及び組成物は、本明細書に開示されるＴＲＰＭ２阻害性ポリペプチドに対して少なくとも５０％同一であり（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上の配列同一性を有する）、かつ、配列番号３の少なくとも１つの神経保護特性を保持する、神経保護ポリペプチドについても同様に考えられる。通常、本開示の神経保護ペプチドのタンパク質変異体は、本明細書に開示される全長の天然配列のタンパク質配列、又は本明細書に開示される全長タンパク質配列の他の特に定められた断片に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有し、あるいは、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。任意選択的に、変異体ポリペプチドは、天然のタンパク質配列と比較して、１を超えない保存的アミノ酸置換を有し、あるいは、天然のタンパク質配列と比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０を超えない保存的アミノ酸置換を有する。
置換されたアミノ酸残基は、置換されるアミノ酸残基と無関係であってもよく（例えば、疎水性／親水性、サイズ、電荷、極性等に関して無関係）、あるいは、置換されたアミノ酸残基は、類似、保存的、又は高度保存的アミノ酸置換を構成しうる。本明細書で用いられる場合、「類似」、「保存的」、及び「高度保存的」アミノ酸置換は、下記表に示されるように定められる。アミノ酸残基置換が類似、保存的、又は高度保存的であるかどうかの決定は、排他的に、アミノ酸残基の側鎖に基づいており、ペプチド骨格に基づいているのではなく、これは、後述されるペプチド安定性を増加するように改変されうる。
Figure 0007118508000001
被験体ペプチドの文脈における保存的アミノ酸置換は、ペプチドの活性を保存するように選択される。
改変ポリペプチド
本発明にかかる方法及び組成物の文脈では、化学的又は遺伝的手段による、本明細書に記載の神経保護ポリペプチドの改変も企図されている。このような改変の例としては、Ｌ又はＤのエナンチオマー形態で非中性アミノ酸及び／又は中性アミノ酸を有する部分的又は完全な配列のペプチドの構築を含む。例えば、本明細書に開示されるペプチド、及びそれらの変異体は、すべてＤ形態で産生されうる。さらには、ポリペプチドは、アミノ酸の側鎖若しくはＮ－又はＣ－末端に共有的に結合された、糖又は脂肪酸などの炭水化物又は脂質部分を含むように改変されうる。加えて、ポリペプチドは、グリコシル化及び／又はリン酸化によって改変されうる。
加えて、ポリペプチドは、投与時の溶解性及び／又は半減期を高めるために改変されうる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連ポリマーは、血液中のタンパク質治療薬の溶解性及び半減期を高めるために用いられている。したがって、本開示のポリペプチドは、ＰＥＧポリマーなどによって改変されうる。ＰＥＧ又はＰＥＧポリマーとは、ポリ（エチレングリコール）を不可欠な部分として含む残基を意味する。このようなＰＥＧは、本開示のペプチドの治療的活性に必要とされる；分子の化学合成から生じる；若しくは、分子の部分の互いに対する最適な距離のためのスペーサーである、さらなる化学基を含みうる。加えて、このようなＰＥＧは、互いに結合した１つ以上のＰＥＧ側鎖で構成されうる。１より多いＰＥＧ鎖を有するＰＥＧ基は、多アーム型又は分岐型ＰＥＧと呼ばれる。分岐型ＰＥＧは、例えば、グリセロール、ペンタエリトリトール、及びソルビトールを含むさまざまなポリオールにポリエチレンオキシドを付加することによって、調製されうる。例えば、４アームの分岐型ＰＥＧは、ペンタエリトリトール及びエチレンオキシドから調製されうる。分岐型ＰＥＧは、通常、２から８アームを有しており、例えば、米国特許第５，９３２，４６２号に記載されている。とりわけ好ましいのは、リシンの一級アミノ基を介して結合している２つのＰＥＧ側鎖を有するＰＥＧ（ＰＥＧ２）である（Monfardini, C,ら, Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69）。用語「ＰＥＧ」は、任意のポリエチレングリコー分子を包含するように幅広く用いられており、エチレングリコール（ＥＧ）単位の数は、少なくとも４６０、好ましくは４６０から２３００、とりわけ好ましくは４６０から１８４０である（２３０ＥＧ単位とは、約１０ｋＤａの分子量を指す）。ＥＧ単位の上記数値は、本開示のＰＥＧ化ペプチドの溶解度によってのみ制限される。通常、２３００単位を含むＰＥＧより大きいＰＥＧは使用されない。好ましくは、本発明において使用されるＰＥＧは、一方の端部がヒドロキシ又はメトキシで終端（メトキシＰＥＧ、ｍＰＥＧ）し、他方の端部は、エーテル酸素結合を介してリンカー部分に共有結合している。ポリマーは、直鎖状又は分岐状のいずれかである。分岐型ＰＥＧは、例えば、Veronese, F. M.ら, Journal of Bioactive and Compatible Polymers 12 (1997) 196-207に記載されている。本開示のＰＥＧ化ペプチド及び変異体の生成のための適切なプロセス及び好ましい試薬は、米国特許出願公開第２００６／０１５４８６５号に記載されている。例えば、Veronese, F. M., Biomaterials 22 (2001) 405-417に記載される方法に基づく改変などの改変は、そのプロセスが本開示のＰＥＧ化ペプチドを結果的に生じる限り、その手順で行うことができることが理解される。本開示のＰＥＧ化ペプチドの調製に特に好ましいプロセスは、参照することによって本明細書に取り込まれる、米国特許出願公開第２００８／０１１９４０９号に記載されている。
追加的に又は代替的に、本開示のペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインに融合されうる。抗体は、２つの機能的に独立した部分、抗原に結合する「Ｆａｂ」として知られる可変ドメイン、及び補体活性化及び貪食細胞による攻撃のようなエフェクター機能に関与している「Ｆｃ」として知られる定常ドメインを含む。Ｆｃは、長い血清半減期を有するのに対し、Ｆａｂは短命である（Caponら, 1989, Nature 337:525-31）。本開示の治療的タンパク質とともに構築される場合には、Ｆｃドメインは、より長い半減期をもたらすことができる、あるいは、Ｆｃ受容体結合として、プロテインＡ結合として、補体固定として、及びおそらくは血液脳関門としてさえも、又は胎盤通過として、このような機能を取り込むことができる。一例では、ヒトＩｇＧヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域は、当技術分野で知られている方法を使用して、本開示のペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端のいずれかにおいて、融合されうる。結果として得られる融合ポリペプチドは、プロテインＡアフィニティーカラムを使用して精製されうる。Ｆｃ領域に融合したペプチド及びタンパク質は、インビボにおいて、融合していない対応物よりも実質的に長い半減期を示すことが判明している。また、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量体化／多量体化を可能にする。Ｆｃ領域は、天然のＦｃ領域であってよく、あるいは、治療上の性質、循環時間、又は凝集の低減など、特定の性質を改善するために変更されてもよい。
ポリペプチドはまた、硫黄、リン、ハロゲン、金属などを含むように改変されてもよい。アミノ酸模倣体をポリペプチドの生成に用いることができ、したがって、本開示のポリペプチドは、分解に対する耐性などの向上した特性を有するアミノ酸模倣体を含みうる。例えば、ポリペプチドは、１つ以上（例えば、すべて）のペプチド単量体を含みうる。
本開示はまた、本明細書に定められ、かつ、本開示の全長の阻害剤ペプチド配列をコードする核酸配列と少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する、本開示の神経保護ペプチド、好ましくはＴＲＰＭ２イオンチャネルの活性阻害剤をコードする核酸分子を提供する。通常、本開示の変異体ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される全長のＴＲＰＭ２阻害剤タンパク質配列をコードする核酸配列と少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の核酸配列同一性を有する。変異体は、天然のヌクレオチド配列を包含しない。
通常、変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約５のヌクレオチド長、あるいは、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、又は１３０のヌクレオチド長であり、この文脈において、用語「約」とは、参照されたヌクレオチド配列の長さにその参照された長さの１０％をプラス又はマイナスすること意味する。本開示の変異体ポリペプチドは、本開示の変異体ポリヌクレオチドによってコードされるものでありうる。
これらのポリヌクレオチドは、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列である、制御配列を含みうる。原核生物に適している制御配列は、例えば、プロモーター、任意選択的にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれたときに、「作動可能に連結」される。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合に、ポリペプチドのＤＮＡに動作可能に連結される；プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合に、コード配列に動作可能に連結される；あるいは、リボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように配置されている場合に、コード配列に動作可能に連結される。一般に、「作動可能に連結」とは、結合しているＤＮＡ配列が連続していることを意味し、分泌リーダーの場合には、連続しており、かつリーディングフェーズにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続している必要はない。結合は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、従来の実施にしたがって用いられる。
本開示はまた、ＴＲＰＭ２イオンチャネルの単離されたペプチド阻害剤を提供する。「単離された」とは、本明細書に開示されるさまざまなペプチドを説明するために用いられる場合には、同定及び分離され、及び／又は、その中性環境の構成成分から回収されたポリペプチドを意味する。その中性環境の汚染成分は、典型的には、ポリペプチドの診断的又は治療的使用に干渉するであろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性の溶質を含みうる。好ましい実施態様では、ポリペプチドは、（１）スピニングカップ配列決定装置を使用して少なくとも１５残基のＮ－末端又は内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度に、あるいは（２）クーマシーブルー又は、好ましくは、銀染色を使用する非還元又は還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均質性を示す程度まで、精製される。タンパク質中性環境の少なくとも１つの構成成分が存在していないであろうことから、単離ポリペプチドは、組換え細胞内にインサイチュのポリペプチドを含む。しかしながら、通常、単離ポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
本開示のペプチドは、「タグポリペプチド」に融合した本開示のＴＲＰＭ２阻害剤ペプチドを含むキメラポリペプチドを指す、「エピトープタグ」ペプチドを含みうる。タグポリペプチドは、それに対する抗体を作ることができるエピトープを提供するのに十分であるが、それが融合する阻害性ポリペプチドの活性と干渉しないように十分に短い残基を有する。タグポリペプチドはまた、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように、かなり唯一的でもある。適切なタグポリペプチドは、概して、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８から５０のアミノ酸残基（好ましくは、約１０から２０のアミノ酸残基）を有する。
本開示のペプチドは、本開示のペプチドが付着又は結合することができる非水性マトリクスである、「固体相」又は「固体支持体」に連結又は関連づけられうる。本明細書に包含される固体相の例としては、部分的に又は全体的に、ガラス（例えば、制御された細孔ガラス）、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンの形態のものが挙げられる。ある特定の実施態様では、文脈に応じて、固体相は、アッセイプレートのウェルを含みうる；他には、それは、精製カラム（例えば、アフィニティクロマトグラフィーカラム）である。この用語はまた、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されるものなど、離散粒子の不連続な固体相も含む。
本明細書の目的で「活性な」又は「活性」とは、ＴＲＰＭ２イオンチャネルを横断するカルシウムイオンの流量を低下させるなど、ＴＲＰＭ２イオンチャネルの活性を阻害するペプチドを指す。本開示はまた、本明細書に開示される天然のＴＲＰＭ２タンパク質の生物学的活性を部分的に又は完全に遮断、阻害、又は中和する任意の分子を含む、ＴＲＰＭ２イオンチャネルの「アンタゴニスト」を提供する。適切なアンタゴニスト分子には、特に、天然のＴＲＰＭ２タンパク質、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、有機小分子等のアンタゴニスト抗体又は抗体断片、断片又はアミノ酸配列変異体が含まれる。ＴＲＰＭ２タンパク質のアンタゴニストを同定する方法は、ＴＲＰＭ２タンパク質をアンタゴニスト分子の候補と接触させること、及び、通常はＴＲＰＭ２イオンチャネルタンパク質に関連する１つ以上の生物学的活性における検出可能な変化を測定することを含みうる。
治療／療法
ある特定の実施態様では、本開示は、治療する（例えば、緩和する、改善する、軽減する、安定化する、その発症を遅延させる、その進行を阻害する、その重症度を軽減する、及び／又はその発生率を低減する）ため、及び／又は、被験体における、脳卒中、脳卒中に関連するＴＢＩ又は心停止又は１つ以上の症状、脳卒中後の脳傷害又は神経障害、脳傷害を予防するための方法及び組成物を提供する。本方法及び組成物はまた、例えば心停止後の全脳虚血などの脳虚血から結果的に生じる神経障害の治療及び／又は予防にも有用でありうる。本方法及び組成物はまた、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の治療に有用である。追加的に、本方法及び組成物はまた、神経損傷の後、若しくは活発な又は所定のリハビリテーションプログラムの間に、例えば患者の回復又はリハビリテーションにおけるシナプス機能及び記憶を改善することによって、これらの神経学的傷害からの患者の回復を支援するのに有用でありうる。実際、データは、本開示の活性ペプチドの遅延投与が、脳卒中、心停止、及びＴＢＩの後のオス及びメスの両方の記憶を改善することを示唆している。
追加的に又は代替的に、本方法及び組成物は、神経変性障害、末梢神経障害、又は神経因性疼痛の治療及び／又は予防に有用であってよく、ここで、神経変性障害は、アルツハイマー病、多発性硬化症、ＨＩＶ関連認知障害、ハンチントン病、パーキンソン病、及び筋萎縮性側索硬化症から選択される。データは、ＴＲＰＭ２チャネルは、酸化的ストレス条件下で活性化され、その結果、損傷及び機能不全に寄与することから、ＴＲＰＭ２チャネルが、神経変性疾患の発症に関与することを示唆している。例えば、パーキンソン病及びアルツハイマー病はいずれも、酸化的ストレスが強く関与している神経変性障害であり、これらの障害の病因におけるＴＲＰＭ２の役割を論理的にする。よって、本開示はまた、パーキンソン病及びアルツハイマー病を含む神経変性障害の治療及び／又は予防に有用な方法及び組成物を提供する。
追加的に又は代替的に、本方法及び組成物は、被験体における認知機能の向上に有用でありうる。例えば、本方法及び組成物は、シナプス機能を高めるため、及び／又は記憶を向上させるために被験体に投与されうる。これらの効果は、神経変性障害の進行を低減又は遅延させ、又は神経損傷からの回復を増進しうる。
追加的に又は代替的に、本方法及び組成物は、炎症、虚血、アテローム性動脈硬化症、喘息、自己免疫疾患、糖尿病、関節炎、アレルギー、移植拒絶、感染、糖尿病性神経障害の疼痛、胃痛、帯状疱疹後神経痛、線維筋痛、外科手術、又は慢性背部痛の治療及び／又は予防に有用でありうる。
これらの方法では、被験体はヒトでありうる。被験体はオス又はメスでありうる。特定の実施態様では、被験体はヒト男性でありうる。
これらの治療方法は、本開示のペプチドを含む医薬組成物を被験体に投与することを含む。ある特定の実施態様では、治療方法は、被験体におけるＴＲＰＭ２の活性を阻害する（少なくとも１０％（例えば、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又はそれ以上）ことをさらに含む。
これらの方法は、損傷が被験体に維持された後に、脳卒中を含む神経損傷を有する、又は神経損傷を有する疑いのある被験体への本開示のペプチドの投与を含みうる。ペプチドは、神経損傷が生じた時点から１ヶ月以内に、最初に被験体に投与されうる。好ましくは、ペプチドは、神経損傷が生じた時点から９６時間以内、又は８日間以内に被験体に投与される。さらに好ましくは、ペプチドは、神経損傷が生じた時点から１時間から９６時間以内に最初に投与される。さらに好ましくは、ペプチドは、神経損傷が生じた時点から１分から５時間以内に最初に投与される。
併用療法
追加的に、本開示の神経保護ペプチド（又は、このようなペプチドを含む医薬組成物）が、脳卒中、又は脳卒中後の神経障害の予防及び／又は治療に有効であることが現在知られているか、又は後に見出される、少なくとも１つの他の薬物又は療法と併用して投与されうる、治療方法（及び組成物）が本明細書に開示される。薬物は、アスピリン、クロピドグレル、又は組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）などの抗凝固剤又は血栓溶解薬でありうる。薬物は、リシノプリルなどのＡＣＥ阻害剤、あるいは、ワーファリン、又はヘパリン、又はアピキサバン、又は、アトルバスタチン又はロスバスタチンなどのスタチン、又はイルベサルタン、又はレテプラーゼ、又はアルテプラーゼなどの血液希釈剤でありうる。
企図される療法には、頚動脈内膜切除、又は血管形成術、又はステント留置などの外科手術が含まれる。企図される療法には、脳卒中及び外傷性脳損傷後のリハビリテーション及び回復に特に有効であることが証明されている、身体的又は精神的リハビリテーションプログラムも含まれうる。
本開示の神経保護／神経修復ペプチドは、追加的な薬物及び／又は療法の投与前、同時、又はその後に投与されうる。これらの方法は、治療的処置の有効性を評価するステップを含みうる。このような有効性の評価は、任意の数の評価結果に基づいてもよい。評価される有効性のレベルに応じて、本開示の神経保護ペプチドの投与量は、必要に応じて上下に調整することができる。
よって、「併用」には、本開示のペプチド及び追加的な薬剤又は療法が、同時に投与されなければならないこと又は一緒に送達されるように処方されなければならないことを含意することは意図されていないが、これらの送達方法は、本開示の範囲内にある。さらには、併用して利用される治療用活性薬剤は、単一の組成物と一緒に投与されてもよく、あるいは、異なる組成物で別々に投与されうることが認識されよう。一般に、各薬剤は、ある用量で、及び／又は、その薬剤について決定されたタイムスケジュールで投与される。
概して、各薬剤（この文脈において、「薬剤」のうちの１つは本開示のペプチドである）は、ある用量で、及びその薬剤について決定されたタイムスケジュールで投与される。追加的に、本開示は、バイオアベイラビリティを改善する、代謝を低下又は修正する、排出を抑制する、又は体内分布を修正することができる薬剤と併用した組成物の送達も包含する。
併用レジメンで採用する療法（例えば、治療法又は手法）の特定の組合せは、所望の治療法及び／又は手法の相容性、並びに達成すべき所望の治療効果を考慮に入れる。概して、併用利用される薬剤は、個別に利用されるレベルを超えないレベルで利用されることが期待される。幾つかの実施態様では、併用利用されるレベルは、個別に利用されるよりも低い。
診断
一実施態様では、本発明にかかる治療方法は、追加的に、神経損傷、傷害、又は神経変性疾患を有する被験体を診断すること、若しくは、治療の間に、治療方法の有効性を診断、又は評価、又はモニタリングすることを含む。脳卒中は、病歴及び身体検査、頭部コンピュータトモグラフィー、磁気共鳴画像、コンピュータトモグラフィー用動脈造影及び磁気共鳴用動脈造影、頚動脈超音波、頸動脈血管造影、ＥＫＧ（心電図）、心エコー検査、及び／又は血液検査によって診断されうる。
治療及び投与のための組成物
神経学的傷害、疾患、及び障害を治療し、本開示の認知機能を高めるための組成物は、当技術分野で知られ、かつ、文献に広く記載されている従来の方法のいずれかに従って処方されうる。よって、活性成分（例えば、本開示のペプチド）は、任意選択的に他の活性物質と一緒に、投与に適した、又は投与用に好適に作られうる従来の調剤を生成するために、組成物の特定の用途に適した従来の薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤等のうちの１つ以上とともに取り込まれうる。担体は、用いられる投与量及び濃度で曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤を含みうる。しばしば、生理学的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理学的に許容される担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；例えばマンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；及び／又は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。それらは、意図される投与モード及び治療用途に応じて、液体として、半固体又は固体として、溶液、分散液、懸濁液などとして、処方されうる。幾つかの実施態様では、本発明にかかる組成物は、注入可能な又は不溶解性（infusible）の溶液の形態で調製される。本開示のペプチドは、さまざまなタイプの脂質、リン脂質、及び／又は、哺乳動物への薬物（本開示の阻害性ペプチドなど）の送達に有用な界面活性剤で構成されている小胞である「リポソーム」内に処方されうる。リポソームの構成成分は、生物学的膜の脂質配置と同様に、一般に、二重層形成で配置される。
本開示の組成物は、血清アルブミンなど（例えば、ＨＳＡ、ＢＳＡ等）の担体タンパク質を含みうる。血清アルブミンは、精製又は組換え産生されうる。医薬組成物中の神経保護ポリペプチドを血清アルブミンと混合することによって、神経保護ポリペプチドは、血清アルブミン上に効果的に「負荷」されて、より多量の神経保護ポリペプチドを神経損傷部位に首尾よく送達可能にしうる。
本開示の神経学的傷害、疾患、又は神経変性疾患を治療する方法は、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、動脈内、髄内、髄腔内、皮下（ＳＱ）、脳室内、経皮、皮膚間、皮内、気管内注入、気管支注入、及び／又は吸入；鼻内噴霧、及び／又はエアロゾルとして、及び／又は門脈カテーテルを介して、を含むさまざまな経路のいずれかを介した本開示のペプチドの投与を含みうる。任意の適切な投与部位が用いられうる。例えば、組成物は、局所的に及び作用が必要とされる部位に直接的に投与されてもよく、あるいは、体内の適切な場所への標的化を容易にするもの（entities）に結合されていてもよいし、若しくは、例えば共役するなど、他の方法で関連づけられていてもよい。
これらの組成物では、生理学的に適合する担体、賦形剤、希釈剤、バッファ又は安定剤が用いられうる。適切な担体、賦形剤、希釈剤、バッファ及び安定剤の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、並びにそれらの組合せのうちの１つ以上が挙げられる。幾つかの事例では、例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、又は塩化ナトリウムなどの等張化剤が含まれうる。ある特定の実施態様では、本開示の組成物は、当技術分野でよく知られた手法を用いて被験体に投与した後に、活性成分（本開示のペプチド、又はそれらの変異体及び／又は追加的な薬物）の即時、持続的、又は遅延放出をもたらすように処方されうる。上述のように、ある特定の実施態様では、組成物は、注入に適した形態をしており、適切な担体は、適切な濃度で存在しうるが、例示的な濃度は、１％から２０％、又は５％から１０％である。
治療的組成物は、典型的には、製造及び保管条件下で無菌かつ安定でなければならない。このような無菌性及び安定性を達成するための適切な方法は、当技術分野でよく知られており、説明されている。
医薬組成物は、典型的には、投与の容易さおよび投与量の均一性のために単位投薬形態で処方される。しかしながら、本開示の組成物の毎日の（又は他の）合計使用量は、適切な医学的良識の範囲内で主治医によって判断されることが理解されよう。特定の被験体についての特定の治療上有効な用量レベルは、用いられる組成物の活性；投与後の組成物の半減期；被験体の年齢、体重、全体的な健康、性別、及び食事；ペプチド及び（用いられる場合には）用いられる追加的な治療剤の投与時間、投与経路、及び排出速度；治療の持続期間；使用される特定の化合物と併用して又は同時に使用される薬物；及び、医療分野でよく知られる同様の因子を含めたさまざまな因子に応じて決まる。さらには、有効な用量は、インビトロ及び／又はインビボにおける動物モデルから誘導された用量応答曲線から外挿することができる。
よって、本開示のペプチド及び他の活性成分（含まれる場合）の適切な用量は、患者によって異なり、脳卒中の重症度／ステージにも依存する。幾つかの実施態様では、該投与量は、関連する治療の性質に応じて、治療的有効量又は予防的有効量を構成する。関連する実施態様では、投与量は、神経修復又はリハビリテーションを強化する量を構成する。個体に所望の反応を引き出すペプチドの能力もまた、因子でありうる。例示的な１日用量は、０．１から２５０ｍｇ／ｋｇ、又は０．１から２００又は１００ｍｇ／ｋｇ、又は０．５から１００ｍｇ／ｋｇ、又は１から５０又は１から１０ｍｇ／ｋｇの活性成分である。これは、例えば、皮下、腹腔内、又は静脈内に、単回単位用量として、又は１日に１回より多く投与される複数回の単位用量として、投与されうる。しかしながら、適切な投与量は、患者によって異なりうること、及び、任意の特定の被験体のための特定の投与計画は、患者の個々の必要性にしたがって、時間の経過とともに調整されるべきであることに留意すべきである。例えば、投与量及び投与プロトコルは、例えば、一日おき、週に３回、又は週に２回、又は週１回、又は隔週などを含む、１日１回未満にまで、経過とともに、あるいは、患者がリハビリテーションで進歩するにつれて、調整されうる。よって、本明細書に記載される投与量範囲は、例示的なものとみなされるべきであり、特許請求される組成物又は方法の範囲又は実施を制限することは意図されていない。
神経学的傷害、神経学的疾患、又は神経変性疾患を治療するためのキット
一態様において、本開示はさらに、本開示のペプチド、又はそれらの変異体、若しくはそれらを含む組成物を含む、神経損傷、神経学的疾患、又は神経変性疾患の治療のためのキットも提供する。キットは、使用説明書；他の治療剤（すなわち、併用療法又は脳卒中の救急治療のため）；投与のための組成物を調製するための他の試薬、例えば、希釈剤、デバイス、又は他の物質；薬学的に許容される担体；及び、被験体に投与するためのデバイス、又は他の物質を含むがこれらに限定されない、１つ以上の他の要素を含みうる。使用説明書は、本明細書に記載されるように、例えばヒト被験体における推奨用量及び／又は投与モードを含めた、治療適用のための指示書を含みうる。幾つかの実施態様では、キットは、例えば、治療、診断、又はイメージング方法など、明細書に記載される方法及び用途において使用するためのものであり、あるいは、インビトロでのアッセイ又は方法に使用するためのものである。
幾つかの実施態様では、キットは、神経学的な疾患、障害、又は機能障害を診断するためのものであり、任意選択的に、このような神経学的疾患、障害、又は機能障害の重篤度を診断又は評価するためのキット構成要素の使用説明書を含む。
動物モデル
上記のように、脳卒中を含めた神経損傷を伴う被験体の予後改善の１つの大きなハードルは、治療可能時間域の欠如である。診断時までに、脳卒中の被害者には永久的な神経障害が持続されている可能性があるる。インビトロ及びインビボにおける実験的な成功と臨床試験における失望との間の相違は、脳卒中の周辺の微小環境を再現する際に現行の実験準備の効率の悪さから生じる可能性が高い。
動物の脳卒中モデルは、潜在的治療化合物の前臨床試験にとって重要である。一過性の局所虚血モデルは、脳卒中及び神経保護における創薬のゴールデンスタンダードと考えられている。本開示のＴＲＰＭ２阻害性ペプチドは、一過性の局所虚血モデルにおける再灌流後の損傷を低減する。
よって、本開示の別の態様は、ＴＲＰＭ２チャネルのリガンド（ＡＤＰリボース）－結合ポケットを破壊して、活性化を防止することによって、ＴＲＰＭ２チャネルを特異的に阻害する小分子を特定するためのスクリーニングツールを提供する。このスクリーニングツールは、クローン化されたＴＲＰＭ２チャネルと本開示のＴＲＰＭ２ペプチド阻害剤（ｔａｔＭ２ＮＸなど）との結合を破壊する分子のスクリーニングを含む。
以下の実施例は、説明の目的でのみ提供されており、本開示の範囲を限定することは意図されていない。データはすべて、平均±ＳＥＭとして提示される。各ｎは、インビトロでの実験のための個々の培養物及びインビボでの実験のための個々の動物を表している。実験はすべて、無作為化されかつ盲検的な方法で行われ、独立した研究者が分析及び手術を行った。統計的有意性は、２群についてはスチューデントのｔ検定（対応なし、両側）、及び、２群より多くを用いる研究についてはニューマン－クールズ事後解析を伴う一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して決定された。統計的有意性は、ｐ＜０．０５で確立された。
実施例１： ｔａｔ－Ｍ２ＮＸは、インビトロにおいてヒトＴＲＰＭ２チャネルを阻害する
我々は、ＡＤＰｒ結合ポケットを破壊する模倣ペプチドが、ＴＲＰＭ２チャネルの強力かつ特異的な阻害剤であろうと推論した。我々は、ＨＩＶのＴＡＴ誘導因子、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２）を有する、ＴＲＰＭ２チャネルのＣ－末端のＮＵＤＴ９－Ｈ領域のＮｕｄｉｘドメイン（Ｎｕｄｉｘドメイン＝Ｍ２ＮＸ）に対応するＣ末端、１３８６－ＧＳＲＥＰＧＥＭＬＰＲＫＬＫＲＶＬＲＱＥＦＷＶ－ＯＨ（配列番号１）の一部を融合することによって、ＴＲＰＭ２の細胞透過性ペプチド阻害剤を生成した。我々は、Ｍ２ＮＸペプチドが、ＮＵＤＴ９－Ｈ内の幾つかの残基と相互作用してＡＤＰリボース結合ポケットを破壊する、模倣ペプチドとして作用するであろうと予測した。加えて、スクランブル配列内に同じアミノ酸を含む対照ペプチド（「ｔａｔ－ＳＣＲ」）を生成した。種間で一貫してＴＲＰＭ２チャネルを阻害する配列番号３の配列（「ｔａｔ－Ｍ２ＮＸ」）を有するこのペプチド構築物の能力を決定するため、我々は、テトラサイクリン誘発性のヒトＦＬＡＧタグ付きＴＲＰＭ２チャネル（ｈＴＲＰＭ２）を安定して発現するヒト胚性腎－２９３（ＨＥＫ－２９３）細胞株を使用した。
ＦＬＡＧタグ付きヒトＴＲＰＭ２のテトラサイクリン調節されるサイトメガロウイルス駆動性転写を安定して発現するＨＥＫ－２９３細胞を使用した。ＴＲＰＭ２発現ＨＥＫ－２９３細胞を、５％ＣＯ２インキュベータ内で、３７℃で、１０％ウシ胎児血清、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、及びペニシリン／ストレプトマイシン（１００単位／ｍＬ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地で増殖させた。増殖培地にブラストサイジンＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、５μｇ／ｍＬ）及びゼオシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、０．４ｍｇ／ｍＬ）を補充して安定なＴＲＰＭ２発現を促進した。
ＨＥＫ細胞を、実験の２４時間前にＴＲＰＭ２発現を推進するためにドキシサイクリン（１μｇ／ｍＬ）を含む培地に２５，０００細胞／ウェルでポリ－Ｄ－リシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）でコーティングした９６ウェルプレートに播種した。細胞を、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸ（２５、５０、及び１００μＭ）、ｔａｔ－ＳＣＲ（２５、５０、及び１００μＭ）又はビヒクルを有する５０μＬのドキシサイクリン含有培地で２又は５時間、プレインキュベートした。Ｆｌｕｏ－５Ｆ、ＡＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、１０μＭ）、膜透過性Ｃａ２＋指示薬を、インキュベーションの最後の３０分間に培地に加えた。細胞を２回洗浄し、５０μＬの生理食塩水（１３５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ；ｐＨ ７．４）中に置いた。ベースライン蛍光を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ２）及びＧｅｎ５ソフトウェアを使用して確立し、蛍光（４８５／２０、５２８／２０）を測定した。細胞を、２分間２０秒ごとに励起波長に曝露した後に、Ｈ２Ｏ２（２００μＭの最終濃度）又は生理食塩水（対照）をウェルに適用し、１０分間、２０秒ごとに記録した。
ＴＲＰＭ２チャネル活性を、Ｃａ２＋指示薬Ｆｌｕｏ－５Ｆを使用して測定し、２００μＭのＨ２Ｏ２で処理した後、細胞内Ｃａ２＋の増加として検出される蛍光の変化をモニタリングした。Ｈ２Ｏ２への曝露は、ｈＴＲＰＭ２を発現するＨＥＫ－２９３細胞の蛍光を増加させたのに対し、非誘発性のＨＥＫ－２９３細胞には変化が見られず、インビトロ系におけるチャネルの機能性が示唆された（図１Ａ及びＢ）。ｈＴＲＰＭ２を発現するＨＥＫ－２９３は、１００μＭのｔａｔ－Ｍ２ＮＸとともに２時間のインキュベーションした後にＨ２Ｏ２誘発性のＣａ２＋流入を低減させたのに対し、ｔａｔ－ＳＣＲペプチドでの処理は、ＴＲＰＭ２チャネル活性化によるＨ２Ｏ２誘発性のＣａ２＋流入に効果を有しなかった。さらなる実験は、ｈＴＲＰＭ２を発現するＨＥＫ－２９３細胞における２５、５０、及び１００μＭのｔａｔ－Ｍ２ＮＸへの曝露後のＣａ２＋流入の濃度依存性の減少を明らかにした（図１Ａ及び１Ｂ）。これらのデータは、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸは、ヒトＴＲＰＭ２チャネルを阻害し、虚血後のＴＲＰＭ２チャネルの役割を評価するためのさらなるツールを提供することを実証している。
実施例２： ｔａｔ－Ｍ２ＮＸは、オスの脳の梗塞体積を縮小するが、メスの脳の梗塞体積は縮小しない
本発明者らは、以前に、抗真菌剤クロトリマゾール（ＣＴＺ）を使用して、インビトロにおけるＴＲＰＭ２に関連する神経保護及びインビボにおける梗塞体積の縮小を実証した。脳卒中後の虚血性傷害におけるｔａｔ－Ｍ２ＮＸの効果を調べるため、我々は、ＷＴオス及びメスマウスを６０分間の一過性中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）に供し、全体の半球梗塞体積を解析した。ｔａｔ－Ｍ２ＮＸ又はｔａｔ－ＳＣＲをＭＣＡの閉塞の２０分前に注射し、及び梗塞体積を再灌流後２４時間、解析した。
一過性の局所性脳虚血（６０分間）を、以前に記載された管腔内フィラメント技術通じた可逆的ＭＣＡＯを使用して誘発した（Shimizu T, Macey TA, Quillinan N, Klawitter J, Perraud A-LL, Traystman RJら, Androgen and parp-1 regulation of trpm2 channels after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 2013; 33:1549-1555）。簡潔に言えば、マウスを、フェイスマスクを介して送達されたイソフルランで麻酔した（５％誘導及び１～２％維持）。左鼓膜に隣接して配置されたプローブを用いて頭部の温度をモニタリングし、直腸プローブを用いて体部の温度をモニタリングした。温度を、電気加熱パッド及び加熱灯を用いて、ＭＣＡＯ外科手術全体を通じて３６．５±１．０℃に維持した。レーザードップラープローブ（モデル、Ｍｏｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、英国イングランド、オックスフォード所在）を右頭蓋骨に固定して、皮質灌流をモニタリングし、血管閉塞及び再灌流を確認した。前頸部の中央に皮膚切開を行った。右総頸動脈を６－０のシルク縫合糸を用いて締め付けた後、シリコーンコーティングされた先端を有する６－０ナイロンモノフィラメントを、外頸動脈を介して、レーザードップラー血流計（ＬＤＦ）値がベースラインの２０％未満に低下するまで、右内頚動脈内に挿入した。フィラメントを適所に固定した後、切開部を６－０のシルク縫合糸で閉じた。各マウスを、ケージの下に温水パッドを有する別々のケージに入れた。閉塞期間の終わりに、マウスを再び麻酔するとともに、レーザードップラープローブを右頭蓋骨の同じ部位に再配置し、閉塞フィラメントを再灌流のために引き抜いた。次に、マウスを観察下で回復させた。
対応する再灌流期間の後、マウスを５％イソフルランで麻酔し、頭部切除して脳を回収した。マウスは、クモ膜下出血が観察された場合には、研究から除外した。各大脳を２ｍｍ厚の４つの冠状切片へとスライスした。切片を、３７℃で３０分間、１．２％の塩化２，３，４－トリフェニルテトラゾリウム中に置き、１０％ホルマリン中で２４時間固定した。各冠状スライスを染色し、デジタルカメラを使用して両面を撮影し、梗塞をＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ社、米国メリーランド州ベセスダ所在）で測定し、５つの切片すべてを統合した。浮腫の影響を含めるために、梗塞体積間接的に推定し、反対側の構造のパーセンテージとしてプロットしたが、これは、修正された半球梗塞として提示される。
ｔａｔ－Ｍ２ＮＸ又はｔａｔ－ＳＣＲペプチドを生理食塩水（５ｍｇ／ｍＬ）に溶解させ、指示されたタイミングで後眼窩に注射した（２０ｍｇ／ｋｇ）。簡潔に言えば、動物を導入麻酔ボックス内で３分間、４％イソフルランで麻酔し、頭を右に向けて左側臥位に置いた。インスリン注射器（ＢＤ Ｕｌｔｒａ－ｆｉｎｅ Ｎｅｅｄｌｅ １２．７ｍｍ×３０Ｇ）を、球後空間（retro-bulbar space）内に４５°の角度で挿入した。針の先端を後眼窩洞に侵入するように導入し、溶液を注入した。注入後、目を傷つけるのを防ぐために、ベベルを外向きに保って、針を慎重に取り除いた。
ＭＣＡ閉塞は、ドップラー血流で測定してオスとメスのマウスで同様であり、血圧などの生理学的変数にはｔａｔ－Ｍ２ＮＸの効果はなかった。ｔａｔ－Ｍ２ＮＸで処理したオスは、それぞれ、ｔａｔ－ＳＣＲと比較してより小さい梗塞体積を示した（２９．２±４．６％［ｎ＝８］対４３．４±３．２％［ｎ＝８；ｐ＜０．０１］）（図１Ｄ）。対照的に、ｔ ｔａｔ－ＳＣＲ（４６．６±２．１％［ｎ＝７］）又はｔａｔ－Ｍ２ＮＸ（４５．１±２．１％［ｎ＝７］、図１Ｄ）に曝露されたメスマウスにおける脳卒中後の梗塞のサイズには差異はなかった。Ｔｏｇｅｔｈｅｒ、これらのデータは、ともに、ＣＴＺを使用して前述したように、インビボにおいてＴＲＰＭ２チャネル活性を阻害する、及びオス特有の神経保護を生成する、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸの能力を実証している。
実施例３： ｔａｔ－Ｍ２ＮＸは、ＴＲＰＭ２ノックアウトと比較してさらなる保護を提供しない
ＴＲＰＭ２チャネルについてのｔａｔ－Ｍ２ＮＸの特異性をさらに特徴付けるために、我々は、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸの神経保護効果を、ＴＲＰＭ２ノックアウトマウス（ＴＲＰＭ２－／－）のものと比較した。オスＴＲＰＭ２－／－では、ＷＴオスマウスと比較して、梗塞体積を低減させた（それぞれ２７．３±５．１％（ｎ＝８）対４６．１±６．０％（ｎ＝７；ｐ＜０．０５））（図２）。ＷＴとＴＲＰＭ２－／－のメス間には、梗塞体積の差異は観察されなかった（３５．０±４．６％［ｎ＝９］対４４．２±３．２％［ｎ＝６］、図２）。ｔａｔ－Ｍ２ＮＸの投与は、オスＴＲＰＭ２－／－における梗塞体積をさらには低減せず、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸによるＴＲＰＭ２チャネルに対する特異性のさらなる証拠を提供した。
実施例４： ｔａｔ－Ｍ２ＮＸは、翻訳関連治療濃度域を実証している
脳卒中の臨床試験は、さまざまな理由で失敗してきたが、その多くは、関連治療濃度域に起因して失敗している。虚血性脳卒中後の薬理的介入のためのケアの基準は、依然として、症状発現から３～４．５時間以内に組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）を与えている。したがって、我々は、ＷＴのオスマウスにおける再灌流の３時間後（虚血発症の４時間後）に投与されるｔａｔ－Ｍ２ＮＸが、神経保護を提供できるか否かについて試験した。ｔａｔ－Ｍ２ＮＸ又はｔａｔ－ＳＣＲを、再灌流の３時間後に静脈内投与し、注入後２４時間又は９６時間のいずれかにおいて脳を回収し、梗塞のサイズの程度を解析した。ｔａｔ－Ｍ２ＮＸは、脳卒中後２４時間及び９６時間における梗塞体積を、ｔａｔ－ＳＣＲと比較して、顕著に低減させた（図３Ｃ、２４時間：ｔａｔ－ＳＣＲ４６．５±７．３％（ｎ＝６）対ｔａｔ－Ｍ２ＮＸ２８．３±１３．５％（ｎ＝７、ｐ＜０．０５）；９６時間：ｔａｔ－ＳＣＲ４１．４±８．０％（ｎ＝８）対ｔａｔ－Ｍ２ＮＸ２３．８±１２．５％（ｎ＝８、ｐ＜０．０５））。対照的に、ＭＣＡＯの３時間後の非選択的ＴＲＰＭ２阻害剤クロトリマゾール（ＣＴＺ）の投与では、梗塞体積における効果は有しなかった（図３Ｃ、ビヒクル４７．０±９．９％対ＣＴＺ４６．８±７．４％）。これらのデータは、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸは、神経保護のみならず、ＣＴＺよりも幅広い治療濃度域も有し、ｔＰＡの臨床的介入と同様であることを示している。
実施例５： ｔａｔ－Ｍ２ＮＸは、老齢期のオスマウスに神経保護を提供する
脳卒中の発生率は、すべての種族間及び男女両性において、年齢とともに増加する。したがって、我々は、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸが老齢期マウスに保護をもたらすか否かについて試験した。１８～２０月齢のオス及びメスマウスを、６０分間のＭＣＡＯに供し、再灌流の３０分後にｔａｔ－Ｍ２ＮＸ又はｔａｔ－ＳＣＲを投与した。梗塞体積を２４時間後に解析した。若齢成熟期のデータと一致して、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸを与えられた老齢期のオスマウスは、ｔａｔ－ＳＣＲを与えられた老齢期のオスと比較して、より小さい梗塞体積を有していた（それぞれ、２７．０±０．７％［ｎ＝６］対３４．６±１．７％［ｎ＝６］（図４）；ｐ＜０．０１）。興味深いことに、対照の老齢期オスマウス（ｔａｔ－ＳＣＲ処理）は、以前の報告と一致して、若齢成熟（ＹＡ）マウスと比較してより小さい梗塞部を有していた（ＲＥＦＳ：ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ）（それぞれ、２７．０±０．７％［ｎ＝６］対５２．１±２．７％［ｎ＝６］、（図４））。対照的に、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸは、ｔａｔ－ＳＣＲと比較して、老齢期のメスには神経保護をもたらさなかった（４０．２±４．０％［ｎ＝６］対４１．５±４．５％［ｎ＝６］、図４）。これらのデータはともに、ＴＲＰＭ２チャネルが、老齢期のオスにおける脳卒中後の急性虚血性細胞死に寄与しているが、メスでは寄与しないことを示唆している。
実施例６： ｔａｔ－Ｍ２ＮＸは、ＴＲＰＭ２チャネルを遮断し、オスにおける梗塞体積を低減するが、メスでは低減しない
我々の研究は、より老齢の動物における継続的な有効性を実証するために、老齢期の動物を使用した。前臨床試験における老齢期の動物の研究が必要とされているが、年齢と治療との相互作用について報告している研究は、比較的少数である。この問題は、高齢でのアンドロゲンレベルの変化及びアンドロゲン関連経路によるＴＲＰＭ２チャネルの活性化を考慮すると、特に関係がある。去勢によって保護が除かれ、ＤＨＴの補充（replacement）がＣＴＺの投与後に観察される保護を助けることから、これまでに、オスにおけるＴＲＰＭ２阻害後の保護には、アンドロゲンの存在が必要であることが実証されている。我々は、老齢期のオスマウスにおける低いアンドロゲンがｔａｔ－Ｍ２ＮＸの神経保護の消失を生じるであろうと推測した。したがって、我々は、マウスの生存期間にわたるテストステロン及び高効能のジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の血清レベルを評価した。
オスのナイーブマウスのコホートをＡｖｅｒｔｉｎの過剰摂取（腹腔内）によって殺処理し、ヘパリン化シリンジを用いて心臓の右心室から血液サンプルを採取した。血液サンプルを４℃で１０分間、３３００ｇで遠心分離して、ホルモン検出のために血清を得た。血清は、使用するまで、－８０℃で保管した。テストステロン（Ｃａｌｂｉｏｔｅｃｈ社、米国カリフォルニア州スプリングバレー所在）及びジヒドロテストステロン（ＤＨＴ、米国テキサス州所在のＡｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）についての酵素結合免疫測定法を、製造業者のプロトコルに従って実施した。
テストステロンレベルは、若齢成熟期と比較して高齢マウスで減少した（図５Ａ）が、しかしながら、高効能のジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）では、年齢間での変化はなく（図５Ｂ）、ＤＨＴレベルが依然として、老齢期のオスマウスのＴＲＰＭ２チャネルに関与する（engage）のに十分に高く維持されることが示唆される。本明細書に提示されるデータはともに、ＴＲＰＭ２チャネルを遮断し、オスの梗塞体積を低減するが、メスでは低減しない、新規ペプチドを使用する重要な前臨床試験を表している。
実施例７： ＴＲＰＭ２阻害は、心停止誘発性の神経損傷を軽減する
３４－ｍｅｒである本開示のＴＲＰＭ２阻害剤：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＳＲＥＰＧＥＭＬＰＲＫＬＫＲＶＬＲＱＥＦＷＶ（配列番号３；「ｔａｔ－Ｍ２ＮＸ」）を、オス及びメスマウスにおける心停止／心肺蘇生法（ＣＡ／ＣＰＲ）誘発性の神経損傷を低減する能力について試験した。保護効力を決定するため、我々は、オス及びメスマウスにおいて、８分間の心停止からの蘇生後３０分に、静脈内（ｉｖ）注射によって、２０ｍｇ／ｋｇのスクランブル対照（ｔａｔ－ＳＣＲ）又は２０ｍｇ／ｋｇのｔａｔ－Ｍ２ＮＸのいずれかを投与した。蘇生の３日後にヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用する虚血性ＣＡ１ニューロンの定量化は、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸの静脈内注射が、オスのマウスにおける虚血性傷害に対する強力な保護を提供する（傷害を、ｔａｔ－ＳＣＲ処置したオスにおける４４．９±７．５％（ｎ＝１２）から２０．０±５．１％（ｎ＝１２、Ｐ＜０．０５）へと低減）が、メスの傷害には影響を与えないことを示した（図６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ）。加えて、先に実験的脳卒中で報告したように、我々は、オスＷＴ対照と比較してＴＲＰＭ２のＫＯオスマウスにおいてＣＡ１神経損傷を大幅に低減したが、メスのＴＲＰＭ２のＫＯ及びＷＴマウスにおけるＣＡ１傷害には差がなかったことを観察した。低用量のｔａｔ－Ｍ２ＮＸを使用して生成されたデータは、１ｍｇ／ｋｇの低用量でのオスのマウスにおけるＭＣＡＯ後の神経保護を実証した。
ＣＡ／ＣＰＲによって誘発された虚血によって、海馬シナプス可塑性が少なくとも３０日間、損なわれるという報告に続いて、我々はまた、ＮＭＤＡ受容体機能（又はシナプス前放出、興奮性）に変化がないことも観察しており、他の信号伝達経路がＬＴＰ機能障害に関与している。したがって、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸの急性投与が、オスの動物に持続的な機能的利益を提供するか否かの決定を開始するため、我々は、ＣＡ１ニューロンの細胞外場記録を行い、ｔａｔ－ＳＣＲ及びｔａｔ－Ｍ２ＮＸで処置したマウスにおけるＣＡ／ＣＰＲ後のシナプス可塑性を測定した。ＣＡ１場の興奮性シナプス後電位（ｆＥＰＳＰｓ）に対するシャッファー側枝（ＣＡ３軸索）を記録した。シャム対照の切片では、２０分間の安定なベースラインの後、簡単な生理学的θバースト刺激（simulation）（ＴＢＳ：１０Ｈｚで４０パルス）は、ｆＥＰＳＰの傾斜を１６１±９．２％へと増加させ（ｎ＝６、ベースラインと比較してＰ＜０．０５）、これは、６０分間の記録全体にわたって持続され、したがってＬＴＰと呼ばれる（図７Ａ－黒のトレース）。対照的に、対照ペプチド（ｔａｔ－ＳＣＲ）で処置した虚血後マウスに由来する脳切片から得られた記録は、細胞が同一のＴＢＳ刺激に曝露されたときに、ＬＴＰのほぼ完全な喪失を示した（７日目：１０５．０±８．６％（ｎ＝８）；３０日目：１０９．２±１４．２％（ｎ＝７；図２）、シャム対照と比較して、いずれもＰ＜０．０５）。重要なことには、電気生理学的実験は、シナプス前放出（ＰＰＲ）におけるＣＡ／ＣＰＲの最小効果、ＡＭＰＡ／ＮＭＤＡ比、又は全体的な興奮性（Ｉ／Ｏ）１０を実証している。ＣＡ／ＣＰＲの７日又は３０日後かつｔａｔ－Ｍ２ＮＸで処理した（ＣＡの３０分後）マウスから採取した海馬の切片からの記録は、ＴＢＳ後のＬＴＰが、シャム対照と区別できなかったことを示した（７日目：１８８．１±２２．０％（ｎ＝５）；３０日目：１８４．０±１３．８％（ｎ＝５；図８Ａ及び８Ｂ）、いずれもシャム対照と比較して有意ではなく、各群のベースラインからＰ＜０．０５であった）。これらの実験は、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸの虚血後投与が、シナプス機能の持続的な保護を提供し、認知転帰を改善することを実証している。
実施例８： 虚血後のＴＲＰＭ２チャネルの持続的活性化の阻害は、記憶機能及びシナプス可塑性を改善する
ＴＲＰＭ２チャネルがシナプス可塑性における虚血誘発性機能障害に関与するかどうかを評価するため、我々は、虚血性脳損傷を被ってから数日後に得られた脳切片におけるＴＲＰＭ２チャネルを阻害した。上記のデータと一致して、ＣＡ／ＣＰＲ後、７日間にわたりマウスの脳切片において得られた記録は、細胞が、シャム対照マウスにおいて強力なＬＴＰを刺激する同じＴＢＳ刺激に曝露されたときに、ＬＴＰのほぼ完全な喪失を示した（図９Ａ及び９Ｂ）。意外なことに、１時間のＴＲＰＭ２チャネル阻害剤クロトリマゾール（ＣＴＺ；２０μＭ）の浴適用は、ＣＡ／ＣＰＲ誘発性のＬＴＰの喪失を逆転させ、１４９．８±２６％に回復した（ｎ＝３；同じ日に同じ動物から記録された対の（paired）７日目のＣＡ／ＣＰＲの切片と比較して、Ｐ＜０．０５）。さらには、我々は、ＣＴＺが、同等に効果的にメスのＣＡ／ＣＰＲを誘発性のＬＴＰの喪失を救済し、１５０．１±１７％へと回復したという非常に驚くべき観察をした（ｎ＝２；図８Ｂ）。虚血後の切片を、１μＭのｔａｔ－Ｍ２ＮＸ中で２時間、インキュベートし、シナプス可塑性を測定した。図８Ａ（赤のトレース）は、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸの曝露後の障害の逆転を実証している（ｎ＝３）。この挑発的なデータは、２つの大きな意味合いを有している：１）ＣＡ／ＣＰＲが、オス及びメスの両方において海馬ＣＡ１ニューロンのＴＲＰＭ２チャネルの持続的活性化を生じ、かつ、２）脳虚血後の回復の亜急性期から慢性期の間の海馬のＴＲＰＭ２チャネル活性は、シナプス可塑性を阻害する。
損なわれたシナプス可塑性における持続的なＴＲＰＭ２チャネル活性の役割を確認するため、我々は、インビボにおける海馬機能を救済するｔａｔ－Ｍ２ＮＸの遅延投与の能力を評価するために追加的な実験を行った。マウスを、８分間の心停止及びＣＰＲに供し、蘇生の６日後にｔａｔ－Ｍ２ＮＸ（２０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。ｔａｔ－Ｍ２ＮＸの投与の２４時間後（ＣＡ／ＣＰＲ後７日目）、急性海馬の切片を得て、場記録を行い、シナプス可塑性（ＬＴＰ）を評価した。図９Ａ及び９Ｂは、インビボにおけるｔａｔ－Ｍ２ＮＸの遅延投与が海馬ＬＴＰにおけるＣＡ／ＣＰＲ誘発性の機能障害を逆転させ、１７１±１１％へと回復させるという我々のエキサイティングな発見を説明している（ｎ＝６、ペプチドで処理した４匹のマウスからの記録；７日目のＣＡ／ＣＰＲの切片と比較してＰ＜０．０５）。図９Ｂはさらに、インビボにおける遅延ｔａｔ－Ｍ２ＮＸ処理が、オス及びメスマウスにおけるシナプス可塑性を救済し、メスのＬＴＰを１７０±１６％まで回復させる（ｎ＝３）ことを確認することによって、この観察を拡張したことも実証している。インビボにおけるＬＴＰのＣＡ／ＣＰＲ誘発性の機能障害を逆転させるｔａｔ－Ｍ２ＮＸの能力は、これが、遅延された時点での機能回復を改善するための実行可能な手法であることを示している。図９Ａ（赤いトレース）及び９Ｂは、メスＴＲＰＭ２－／－マウスは、ＷＴメスマウスと同程度の障害を示すことから、神経損傷とは独立して、損なわれたＬＴＰにおけるＴＲＰＭ２の役割と一致して、ＣＡ／ＣＰＲによってメスＴＲＰＭ２－／－マウスにおけるＬＴＰが損なわれないことを示している。
重要なことには、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸの遅延投与は、虚血後マウスの記憶機能を改善する。我々は、十分に確立された海馬記憶課題、文脈的恐怖条件付け（ＣＦＣ）を利用した。簡潔に、マウスを新しい環境に曝露し、その環境に馴化した後、軽度のフットショックを与え（１ｍＡ）、次に、それらのホームケージに戻した。フットショックの２４時間後、マウスをＣＦＣ環境に戻し、１０分の試験の間に凍結挙動を解析する。環境の記憶は、シャムマウスに見られるように、凍結挙動を呼び起こす（図１０Ａ）。対照的に、ＣＡ／ＣＰＲは、凍結挙動に顕著な低下を生じ（図１０Ａ）、記憶の喪失が示唆される。重要なことには、海馬依存性記憶の損失は、ＣＡ／ＣＰＲの７日後（図１０Ａ）及び３０日後（図１０Ｂ）のいずれにおいても観察される。予備実験は、上述の我々のシナプス可塑性実験と一致して（図９Ａ及び９Ｂ）、ｔａｔ－Ｍ２ＮＸの遅延投与（７日目）が、記憶機能を改善する（図１０Ａ）ことを示唆している。
実施例９： ＴＲＰＭ２の阻害は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）後の神経機能を増進する
中等度／重度の外傷性脳損傷のマウスモデルを使用した。制御性皮質衝撃（ＣＣＩ）モデルを使用し、このモデルにＴＢＩを投与した直後に、我々のｔａｔ－Ｍ２ＮＸ ＴＲＰＭ２阻害剤を注射した。運動機能及び記憶機能の解析を、ＴＢＩからの回復後７日間、行った。運動機能は、肢の使用及び対側肢の使用の減少を測定するシリンダー試験を使用して解析し（この事例では、Ｒ皮質損傷のため、左足を使用）、運動障害が示唆される。記憶機能試験は、上述の文脈的恐怖条件付け（ＣＦＣ）課題である。図１１Ａは、ＴＢＩ後にＴＲＰＭ２阻害剤（記憶の事例ではＴＲＰＭ２ ＫＯマウスも）で処置したマウスにおける、運動機能の改善を示しており、図１１Ｂは、記憶機能の改善を示している。さらには、図９に実証されるように、ＴＲＰＭ２阻害は、ＴＢＩ誘発性のＬＴＰ障害を逆転させる。
実施例１０： ＴＲＰＭ２チャネルの阻害はシナプス可塑性におけるβ－アミロイド誘発性の低下を防止する
ＴＲＰＭ２チャネルがシナプス可塑性におけるアミロイド誘発性の機能障害に関与するか否かを評価するため、我々は、アミロイドβに曝露された脳切片におけるＴＲＰＭ２チャネルを阻害した。β－アミロイド及び本開示のＴＲＰＭ２ペプチド阻害剤（ｔａｔＭ２ＮＸ）の存在下又は不存在下におけるマウスの脳切片で得られた記録（図１２Ａ）は、ＴＲＰＭ２チャネル阻害が、シナプス可塑性においてβ－アミロイド誘発性の低下から保護したことを示しており（図１２Ｂ）、これは、本開示のペプチドが、アルツハイマー病の進行の治療又は遅延に有用であることを示している。
本開示は、本開示の個々の態様の単一の例示として意図されている本明細書に記載の特定の実施態様によって範囲を限定されるべきではなく、機能的に同等の方法及び構成要素は、本開示の範囲内にある。実際、本明細書に示されかつ記載されたものに加えて、本開示のさまざまな修正が、前述の説明及び添付の図面から当業者に明白になるであろう。このような修正は、特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図されている。

Claims (9)

  1. ＴＲＰＭ２タンパク質イオンチャネルの活性を阻害するための組成物であって、ＴＲＰＭ２タンパク質のＡＤＰ－リボース結合部位を破壊する薬剤、を含み、
    前記薬剤は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、組成物。
  2. 前記薬剤が、ＡＤＰ－リボースのＴＲＰＭ２タンパク質に対する結合を低減又は予防する、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記薬剤が、ＴＲＰＭ２チャネルのカルボキシ末端に結合する、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記薬剤が、ＴＲＰＭ２タンパク質チャネルを通るカルシウムイオンの流量を低減する、請求項２に記載の組成物。
  5. 神経損傷又は神経障害を治療又は予防するための医薬であって、ＴＲＰＭ２タンパク質イオンチャネルを通るカルシウムイオンの流量を阻害する薬剤を含み、
    前記薬剤は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、医薬。
  6. 前記薬剤が、ＴＲＰＭ２タンパク質のＡＤＰ－リボース結合部位を破壊する、請求項５に記載の医薬。
  7. 前記薬剤が、ＡＤＰ－リボースのＴＲＰＭ２タンパク質に対する結合を低減又は予防する、請求項６に記載の医薬。
  8. 前記薬剤が、ＴＲＰＭ２チャネルのカルボキシ末端に結合する、請求項６に記載の医薬。
  9. ＴＲＰＭ２タンパク質イオンチャネルの活性を阻害するためのインビトロ方法であって、ＴＲＰＭ２タンパク質のＡＤＰ－リボース結合部位を破壊すること、を含み、
    前記破壊が、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを含む薬剤と接触させることを含む、方法。
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