ES2536921T3 - Métodos y composiciones para modular la activación por hepsina del activador de plasminógeno de tipo urocinasa - Google Patents

Abstract

Una molécula antagonista que inhibe la activación por hepsina del activador de plasminógeno de tipo prourocinasa (pro-uPA) para su uso en un método para tratar cáncer en un sujeto, en donde la molécula antagonista comprende: (i) un polipéptido que comprende una secuencia del dominio de Kunitz (KD); (ii) al menos una porción del inhibidor-1, -1B o -2 del activador del factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HAI-1, HAI-1B o HAI-2); (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencias con pro-uPA y que puede unirse a hepsina y que carece de un sitio de escisión de hepsina.

Description

E07798837

13-05-2015

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para modular la activación por hepsina del activador de plasminógeno de tipo urocinasa

5 Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica prioridad bajo la Sección 119 del Título 35 del USC a la solicitud provisional de EE.UU. nº 60/805.584, presentada el 22 de junio de 2006.

Campo técnico

La presente invención se refiere generalmente a los campos de la biología molecular y la regulación de factores de crecimiento. Más específicamente, la invención se refiere a moduladores de la activación enzimática del activador de plasminógeno de tipo urocinasa, y usos de dichos moduladores.

15

Antecedentes

La hepsina es una serina proteasa de transmembrana de tipo II (TTSP) expresada sobre la superficie de células epiteliales. La proteína de 417 aminoácidos está compuesta por un dominio citoplásmico del extremo N corto, un dominio transmembrana y un único dominio rico en cisteína de receptor depurador que se compacta estrechamente contra el dominio de proteasa del extremo C (1). La función fisiológica de la hepsina no está clara. A pesar de su expresión en las fases muy tempranas de la embriogénesis (2), los ratones deficientes en hepsina fueron viables y se desarrollaron normalmente (3, 4). Se encontró que la hepsina no era esencial para la regeneración del hígado y para las funciones fisiológicas relacionadas con la coagulación (3, 4). Sin embargo, la hepsina participa en el cáncer 25 de ovario ((5 y el documento WO2001/62271) y de próstata (6-11), en los que varios estudios de expresión génica la han identificado como uno de los genes más altamente inducidos. Se encontró que los niveles de ARN de hepsina eran bajos en próstata normal e hiperplasia benigna, pero fuertemente elevados en carcinoma de próstata, particularmente en estadios avanzados (7-10). La tinción de la proteína hepsina con un anticuerpo anti-hepsina monoclonal mostró que la expresión de la hepsina era la mayor en sitios de metástasis al hueso y en tumores primarios de estadio tardío (12), que está de acuerdo con el hallazgo de que niveles de ARN de hepsina elevados se correlacionaron con mayores grados de Gleason y progresión tumoral (9-10, 13). A diferencia, usando un anticuerpo diferente, Dhanasekaran et al. (6) encontraron la mayor expresión de hepsina en lesiones intra-neoplásicas de próstata anaplásico y menor expresión en carcinoma primario y en lesiones metastásicas. Estos estudios plantearon la cuestión de si la hepsina participaba en el cáncer de próstata. Estudios in vitro no proporcionaron respuestas

35 claras, y dependiendo de las condiciones experimentales usadas, se encontró que la hepsina promovía, inhibía o no afectaba el crecimiento de células tumorales (12, 14, 15).

La evidencia de una función de la hepsina en el cáncer de próstata provino de un estudio reciente por Klezovitch et al. (16) que demostró que en un modelo de ratón de cáncer de próstata no metastatizante, la expresión en exceso de hepsina condujo a la progresión de tumor primario y metástasis. Curiosamente, la expresión en exceso de hepsina se asoció a rotura de la membrana basal (16), indicando hacia la posibilidad de que la actividad de la hepsina estuviera algo asociada a la degradación de componentes de la membrana basal. In vitro, la hepsina pudo convertir el factor de crecimiento latente el pro-factor de crecimiento de hepatocitos (pro-HGF) en su forma bicatenaria activa (HGF), que indujo la señalización del receptor de Met (17, 18, documento WO2006/014928).

45 Debido a que la ruta de HGF/Met participa en el crecimiento tumoral invasivo y la metástasis, es posible que la expresión en exceso de la hepsina active el eje de HGF/Met en cáncer de próstata. También se mostró que la hepsina escindía otros sustratos in vitro, principalmente proteínas relacionadas con la coagulación (17, 19). Sin embargo, no se conoce su función en la tumorigénesis.

En vista de los defectos de la membrana basal que se asociaron a la expresión en exceso de la hepsina en la próstata de ratón, los presentes inventores supusieron que la hepsina podría activar zimógenos de proteasa que están directamente asociados a la degradación de la membrana basal. Se sabía de estudios previos que la hepsina no activa el plasminógeno (18).

55 El perfil de expresión de la hepsina en tejidos con cáncer como se ha descrito anteriormente, acoplado a su posible función en actuar de regulador de factores celulares, cuya desregulación podría subyacer la carcinogénesis, sugiere que la modulación de la interacción de hepsinas con tales factores celulares podría demostrar ser un enfoque terapéutico eficaz. A este respecto, hay una clara necesidad de un entendimiento completo de sustratos fisiológicos para hepsina. La invención cumple esta necesidad y proporciona otros beneficios.

El documento WO 01/57194 desvela un inhibidor de MTSP (tal como, por ejemplo, la serina proteasa de tipo membrana MTSP1) (antagonista) que puede ser un anticuerpo, o un inhibidor de la activación de MTSP, por tanto de interacción entre la MTSP y el sustrato (tal como, por ejemplo, sc-uPA, o pro-tPA). También se desvelan otras MTSP tales como el antígeno prostático específico (PSA); o hepsina; o gen similar a serina proteasa, denominado

65 específico 1 de células epiteliales normales (NES1).

E07798837

13-05-2015

El documento US 2004/009911 se refiere a moléculas escindibles por hepsina que tienen un sitio de escisión de hepsina. El documento US 2004/009911 describe tales moléculas escindibles por hepsina asociadas a un resto inhibidor capaz de la inactivación de hepsina como inhibidores de hepsina, y profármacos con tales moléculas escindibles por hepsina asociados a un resto de modulación de células para la liberación.

5

Divulgación de la invención

En el presente documento se desvela que la hepsina no escinde activador del plasminógeno de tipo pro-tisular (protPA), pero convierte eficazmente pro-uPA en uPA de alto peso molecular por la escisión en el enlace peptídico Lys158-Ile159 (P1 -P1'). El reconocimiento de una Lys como el residuo P1 fue sorprendente, ya que otros estudios mostraron que la hepsina prefiere Arg con respecto a Lys en la posición P1. Aún, el modelado estructural soportó los hallazgos experimentales, que indican que el péptido escindible por pro-uPA se acomodó fácilmente en el sitio activo de hepsina. Además, el uPA generado por hepsina mostró actividad enzimática hacia sustratos sintéticos y macromoleculares pequeños indistinguibles de uPA producido por plasmina. La eficiencia catalítica de la activación

15 de pro-uPA por hepsina (kcat/Km 4,8 x 105 M-1 s-1) fue similar a la de plasmina, que se considera el activador de prouPA más potente, y fue aproximadamente 6 veces superior a la de matriptasa. La conversión de pro-uPA también se demostró con hepsina de longitud completa expresada en la superficie celular. Una línea celular de LnCaP que expresa en exceso hepsina estable convirtió pro-uPA en uPA de alto peso molecular a una tasa de 6,6 ± 1,9 nM uPA h-1, que fue aproximadamente 3 veces superior a la de células LnCaP que expresan menores niveles de hepsina sobre su superficie. Se concluyó que la hepsina puede desempeñar una función en activar pro-uPA para iniciar las rutas proteolíticas mediadas por plasmina en la superficie de separación tumor/estroma, conduciendo a la rotura de la membrana basal y progresión del tumor.

Como se describe en el presente documento, un sustrato fisiológico para la hepsina es el activador de plasminógeno

25 de tipo pro-urocinasa, que es un zimógeno de proteasa que está directamente asociado a la degradación de la membrana basal y otras funciones fisiológicas asociadas a diversos aspectos del desarrollo del cáncer. Se muestra en el presente documento que la hepsina escinde pro-uPA con potente actividad, produciendo uPA activado que presenta actividades enzimáticas normales. La invención proporciona métodos y composiciones basadas al menos en parte en estos hallazgos, que se describen en detalle en el presente documento. La hepsina y su interacción con pro-uPA es una diana única y ventajosa para un mayor ajuste en el diseño de enfoques profilácticos y/o terapéuticos contra afecciones patológicas asociadas a actividad proteolítica anormal o no deseada mediada por hepsina y/o uPA/plasmina. Así, la invención proporciona métodos, composiciones, kits y artículos de fabricación para identificar y para usar sustancias que pueden modular la ruta proteolítica mediada por hepsina y/o uPA/plasmina mediante la modulación de interacciones moleculares que participan en la regulación de la activación de uPA.

35 Por consiguiente, la solicitud proporciona un método de cribado (o identificación) de una sustancia inhibidora candidata (es decir, antagonista) que inhibe la activación por hepsina de pro-uPA, comprendiendo dicho método: (a) poner en contacto una sustancia candidata con una primera muestra que comprende hepsina y un sustrato de prouPA, y (b) comparar la cantidad de activación del sustrato de pro-uPA en la muestra con la cantidad de activación del sustrato de pro-uPA en una muestra de referencia que comprende cantidades similares de hepsina y sustrato de pro-uPA como la primera muestra, pero que no se ha puesto en contacto con dicha sustancia candidata, por lo que una disminución en la cantidad de activación del sustrato de pro-uPA en la primera muestra en comparación con la muestra de referencia indica que la sustancia candidata es capaz de inhibir la activación por hepsina de uPA. En una realización, la hepsina en una muestra está en una cantidad eficaz para activar dicho sustrato de pro-uPA. Un

45 sustrato de pro-uPA adecuado para su uso en estos métodos puede estar en varias formas, mientras que imite la característica del sitio de escisión de hepsina sobre pro-uPA. Ejemplos de sustrato de pro-uPA incluyen, pero no se limitan a, uPA monocatenario de longitud completa que comprende una forma no mutada del enlace peptídico Lys158-Ile159 (P1 -P1'), y cualquier fragmento de uPA que comprenda este enlace peptídico. Tal fragmento puede ser de cualquier longitud, por ejemplo, al menos (aproximadamente) 5, 7, 10, 15, 20, 25 aminoácidos de longitud, o entre (aproximadamente) 4 y 25, 5 y 20, 7 y 15 aminoácidos de longitud. Generalmente y preferentemente, un sustrato de pro-uPA comprende un enlace peptídico Lys158-Ile159 (P1 -P1') que puede escindirse por una hepsina no mutada.

La solicitud proporciona un método de cribado de una sustancia que bloquea la activación de pro-uPA por hepsina, comprendiendo dicho método cribar una sustancia que se une (preferentemente, pero no necesariamente,

55 específicamente) a hepsina o pro-uPA y bloquea la interacción específica (por ejemplo, unión) entre la hepsina y pro-uPA. En la divulgación, la sustancia compite con la hepsina para unirse a uPA. En la divulgación, la sustancia compite con pro-uPA para unirse a hepsina. En la divulgación, la sustancia comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % de similitud de secuencias o identidad con respecto a pro-uPA (por ejemplo, humano), por ejemplo, un fragmento de uPA humano que comprende los residuos de aminoácidos Lys158 ligados peptídicamente a IIe159. En la divulgación en la que la sustancia comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos tal, el fragmento está mutado o carece de al menos una porción de la secuencia de uPA asociada a actividad enzimática, por ejemplo, activación de plasminógeno.

65 Como sería evidente para un experto en la materia, ensayos de cribado de acuerdo con aquellos descritos anteriormente también pueden comprender una primera etapa de cribado de la formación del complejo de hepsina

E07798837

13-05-2015

uPA para obtener un primer conjunto de sustancia moduladora candidata, seguido de una segunda etapa de cribado basada en la capacidad del primer conjunto de sustancia moduladora candidata para modular la activación de prouPA y/o conversión de pro-uPA en una forma que es enzimáticamente activa. Lecturas adecuadas pueden ser cualquiera que fuera evidente para un experto en la materia, basándose en el conocimiento de la formación de

5 complejos de enzima-sustrato y/o actividades biológicas asociadas a la ruta de hepsina/uPA/plasmina. La formación de complejos de enzima-sustrato puede medirse usando, por ejemplo, ensayos bioquímicos rutinarios (por ejemplo, electroforesis en gel, cromatografía, RMN, etc.). Las actividades biológicas de uPA/plasmina incluyen, pero no se limitan a, degradación/rotura de la membrana basal, degradación de la matriz, etc.

La divulgación proporciona antagonistas que rompen la interacción de hepsina/uPA. Por ejemplo, la divulgación proporciona una molécula que inhibe la escisión por hepsina de pro-uPA (por ejemplo, escisión en la posición Lys158-Ile159). La molécula puede ejercer su función inhibidora en cualquier número de formas, que incluyen, pero no se limitan a, unión a cualquier hepsina o pro-uPA de forma que la escisión por hepsina de pro-uPA se inhiba, unión al complejo de hepsina-pro-uPA de forma que la escisión de pro-uPA se inhiba, y/o unión a pro-uPA o hepsina

15 (individualmente o en complejo) de forma que se inhiban los efectos de la escisión de uPA por hepsina (por ejemplo, inhibición de la liberación de uPA posterior a la escisión por hepsina). En la divulgación, una molécula antagonista de la invención inhibe las actividades biológicas asociadas a la activación de pro-uPA.

En un aspecto, un antagonista de la invención se deriva del descubrimiento descrito en el presente documento de que un fragmento de inhibidores del activador del factor de crecimiento de hepatocitos (HAI-1, HAI-1B, HAI-2) es un potente inhibidor de la activación por hepsina de pro-uPA. En la realización, la invención proporciona un antagonista de la activación de pro-uPA por hepsina, comprendiendo dicho antagonista al menos una porción (incluyendo todo) de HAI-1, HAI-1B o HAI-2 humano. La porción comprende una secuencia del dominio de Kunitz (KD) que puede inhibir la activación de pro-uPA por hepsina. Dicha secuencia del dominio de Kunitz es el dominio 1 de Kunitz (KD1) 25 de HAI-1 o HAI-1B. Un antagonista de la divulgación comprende una secuencia de KD1 variante que tiene al menos aproximadamente el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencias con KD1 no mutado de HAI-1 humano, en el que dicha secuencia variante tiene al menos capacidad comparable como KD1 no mutado en inhibir la escisión por hepsina de pro-uPA humano. Un antagonista de la divulgación comprende una secuencia de KD1 de variante que tiene entre aproximadamente el 70 % y el 99 %, aproximadamente el 75 % y el 98 %, aproximadamente el 80 % y el 97 %, el 85 % y el 95 % de identidad de secuencias con KD1 no mutado de HAI-1 humano, en el que dichas secuencias tienen al menos capacidad comparable como KD1 no mutado en inhibir la escisión por hepsina de pro-uPA humano. Dicha secuencia del dominio de Kunitz podría ser uno o ambos de los dominios de Kunitz de HAI-2. En una realización, un antagonista de la divulgación comprende una secuencia del dominio de Kunitz de HAI-2 de variante que tiene al menos aproximadamente el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95

35 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencias con el (los) dominio(s) de Kunitz correspondiente(s) de HAI-2 humano no mutado, en el que dicha secuencia variante tiene al menos capacidad comparable como HAI-2 no mutado en inhibir la escisión por hepsina de pro-uPA humano. En una realización, un antagonista de la divulgación comprende una secuencia del dominio de Kunitz de HAI-2 de variante que tiene entre aproximadamente el 70 % y el 99 %, aproximadamente el 75 % y el 98 %, aproximadamente el 80 % y el 97 %, 85 % y 95 % de identidad de secuencias con el (los) dominio(s) de Kunitz correspondiente(s) de HAI-2 humano no mutado, en el que dichas secuencias tienen al menos capacidad comparable como HAI-2 no mutado en inhibir la escisión por hepsina de prouPA humano.

Un antagonista de la divulgación es o comprende una molécula pequeña, péptido, anticuerpo, fragmento de

45 anticuerpo, aptámero, o una combinación de los mismos. Los antagonistas como se describen en el presente documento pueden obtenerse rutinariamente usando técnicas conocidas en la técnica (incluyendo aquellas descritas en mayor detalle más adelante) basándose en el descubrimiento de la interacción de hepsina y pro-uP como se describe en el presente documento. Por ejemplo, un antagonista de la divulgación compite con la hepsina para unirse a pro-uPA, pero no tiene la capacidad de escindir pro-uPA en el sitio de escisión de hepsina (por ejemplo, en Lys158-Ile159). Un antagonista de la divulgación compite con pro-uPA para unirse a hepsina. El antagonista de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % de similitud de secuencias o identidad con respecto a pro-uPA (por ejemplo, pro-uPA humano) y puede unirse sustancialmente a hepsina, pero carece de un sitio de escisión de hepsina (por ejemplo, enlace peptídico Lys158-Ile159 de pro-uPA). Un antagonista de la divulgación comprende, consiste o consiste esencialmente

55 en un fragmento de pro-uPA que puede unirse a hepsina, en el que dicho fragmento carece de al menos una porción de una secuencia de uPA asociada a actividad enzimática.

Así, la divulgación proporciona un mutante de pro-uPA que puede unirse sustancialmente a hepsina, pero tiene actividad enzimática de uPA reducida en comparación con uPA no mutante, por ejemplo, un antagonista de actividad de uPA o una variante de uPA que presenta una reducción, pero no una ausencia, de actividad enzimática de uPA. Un antagonista de la divulgación es capaz de inhibir la actividad biológica de uPA no mutante (in vitro o in vivo) (tal actividad biológica incluye, pero no se limita a, actividad enzimática con respecto a plasminógeno como sustrato). Un antagonista de la divulgación proporciona actividad enzimática de uPA y/o activación de plasminógeno reducida.

65 Un antagonista de la divulgación se obtiene por un método de cribado o identificación de la invención como se describe en el presente documento.

E07798837

13-05-2015

Una molécula antagonista de la divulgación está asociada a una toxina tal como un agente citotóxico. Estas moléculas pueden formularse o administrarse en combinación con un aditivo/agente potenciador, tal como radiación y/o un agente quimioterapéutico.

5 La divulgación proporciona el uso de un antagonista de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno proliferativo de células, o un trastorno asociado a rotura/degradación de la membrana basal y/o degradación de la matriz. El antagonista puede ser de cualquier forma descrita en el presente documento, que incluye anticuerpo, fragmento de anticuerpo, molécula pequeña (por ejemplo, una molécula orgánica), polipéptido (por ejemplo, un oligopéptido), ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido, tal como un oligonucleótido antisentido o ARN interferente pequeño), un aptámero, o combinación de los mismos.

En un aspecto, la divulgación proporciona el uso de un ácido nucleico de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un

15 trastorno proliferativo de células, o un trastorno asociado a la rotura/degradación de la membrana basal y/o degradación de la matriz.

La divulgación proporciona un método de tratar terapéuticamente un mamífero que tiene un tumor canceroso asociado a activación de pro-uPA, comprendiendo dicho método administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de un antagonista de la invención, tratando así eficazmente dicho mamífero.

En un aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden uno o más antagonistas de la invención y un vehículo. En una realización, el vehículo es farmacéuticamente aceptable.

25 La divulgación proporciona ácidos nucleicos que codifican un antagonista de la invención. En una realización, un ácido nucleico de la invención codifica un antagonista que es o comprende un polipéptido (por ejemplo, un oligopéptido). En una realización, un ácido nucleico de la invención codifica un antagonista que es o comprende un anticuerpo o fragmento del mismo.

Realizaciones de la invención son:

1. Una molécula antagonista que inhibe la activación por hepsina del activador de plasminógeno de tipo prourocinasa (pro-uPA) para su uso en un método para tratar cáncer en un sujeto, en la que la molécula antagonista comprende:

35

(i)

un polipéptido que comprende una secuencia del dominio de Kunitz (KD);

(ii)

al menos una porción del inhibidor-1, -1B, o -2 del activador del factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HAI-1, HAI-1B o HAI-2);

(iii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencias con pro-uPA y que puede unirse a hepsina y que carece de un sitio de escisión de hepsina.

45 2. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la realización 1, en la que la secuencia del dominio de Kunitz (KD) comprende una secuencia del dominio 1 de Kunitz (KD-1).

3.

La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la realización 1, en la que la porción de inhibidor-1, -1B, o -2 del activador del factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HAI-1, HAI-1B o HAI-2) comprende una secuencia del dominio de Kunitz (KD).

4.

La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la realización 3, en la que la secuencia del dominio de Kunitz (KD) es:

55 (i) secuencia del dominio 1 de Kunitz (KD-1) del inhibidor-1, -1B del activador del factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HAI-1, HAI-1B), o variante del mismo; o

(ii) uno o ambos de los dominios de Kunitz del inhibidor-2 del activador del factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HAI-2), o variante del mismo.

5.

La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la realización 1, en la que un sitio de escisión de hepsina es el enlace peptídico Lys158-Ile159 de pro-uPA.

6.

La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la realización 1 o 5, en la

65 que la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencias con pro-uPA y que puede unirse a hepsina y que carece de un sitio de escisión de

E07798837

13-05-2015

hepsina carece de actividad de uPA.

7. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la realización 6, en la que la

molécula es un mutante en el que la cadena b está mutada o carece de al menos una porción de la secuencia de 5 uPA asociada a actividad.

8.

La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según una cualquiera de las realizaciones 1 a 7, en la que la molécula está asociada a una toxina.

9.

La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la realización 8, en la que la toxina es un agente citotóxico.

10.

La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según una cualquiera de las

realizaciones 1 a 9, en la que el método comprende además administrar radiación o un agente quimioterapéutico. 15

11.

La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según una cualquiera de las realizaciones 1 a 10, en la que el cáncer es próstata u ovario.

12.

Una composición que comprende una molécula como se define en una cualquiera de realizaciones 1 a 9 y un vehículo, para su uso en tratamiento como se define en una cualquiera de las realizaciones 1 u 11.

13.

La composición para su uso según la realización 12, en la que el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable.

25 Breve descripción de los dibujos

FIGURA 1. Escisión de pro-uPA por hepsina. (A) Se incubó pro-uPA (1,5 µM) con hepsina 15 nM o plasmina 15 nM o tampón (control) durante 4 min y 60 min a temperatura ambiente. El uPA convertido se analizó por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras (R) y no reductoras (NR) seguido de tinción de proteína. (B) Se incubó protPA (1,5 µM) con hepsina 15 nM o plasmina 15 nM o tampón (control) durante 10 min y 60 min a temperatura ambiente y se analizó por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras (R). Los patrones de peso molecular se muestran como Mr x 103. FIGURA 2. Actividad enzimática de pro-uPA escindido por hepsina. Pro-uPA se convirtió completamente en uPA por hepsina o plasmina y los productos (uPAHepsina y uPAPlasmina) se analizaron para su actividad

35 enzimática. Los controles contuvieron hepsina o plasmina, pero no pro-uPA (control de hepsina y plasmina, respectivamente). (A) Un experimento representativo que muestra escisión del sustrato S2444 de paranitroanilida (pNA) sintético pequeño. Las tasas de formación de pNA se muestran en función de [S2444]. Triángulos, uPAHepsina; cuadrados, uPAPlasmina; triángulos invertidos, control de hepsina; diamantes, control de plasmina; (B) Un experimento representativo que muestra las tasas lineales iniciales de activación por plasminógeno. Símbolos como en (A). FIGURA 3. Cinética de primer orden de la activación de pro-uPA por hepsina y otras serina proteasas similares a tripsina. Se incubó pro-uPA (30 nM) con enzimas (3 nM) y la cantidad de pro-uPA escindido se determinó en diversos momentos de tiempo (véase 'Procedimientos experimentales'). La figura muestra la disminución dependiente del tiempo de [pro-uPA] por hepsina (triángulos), plasmina (cuadrados), matriptasa (círculos) y

45 HGFA (diamantes); promedio de 5 experimentos ± DE. FIGURA 4. Expresión de ARNm de hepsina y proteína por células LnCaP. Las líneas celulares LnCaP-17 y LnCaP-34 que expresan en exceso hepsina se establecieron como se describe en 'Procedimientos experimentales'. (A) Niveles de ARN de hepsina total (=hepsina endógena + transfectada) (gris), hepsina endógena (rayado) y matriptasa (negro) como se ha determinado por RT-PCR en tiempo real. (B) Expresión de la superficie celular de hepsina de longitud completa por células LnCaP. Se detectó hepsina por el anticuerpo monoclonal 3H10 usando FACS. Líneas grises/sin relleno, control de LnCaP-17 (anticuerpo secundario solo); relleno gris, LnCaP-17 + 3H10; líneas negras/sin relleno, control de LnCaP-34 (anticuerpo secundario solo); relleno negro, LnCaP-34 + 3H10. FIGURA 5. Conversión de pro-uPA por células LnCaP. (A) Se dejó que células LnCaP-34 (que expresan en

55 exceso hepsina) procesaran pro-uPA (30 nM) durante 1 h, 3 h y 5 h en presencia o ausencia de inhibidor de KD1. El producto de reacción se analizó por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras (R) y no reductoras (NR) seguido de inmunotransferencia usando un anticuerpo policlonal anti-uPA. Panel izquierdo, células/sin KD1; panel central, células/+KD1; panel derecho, sin células/sin KD1. Se indican la posición del zimógeno, cadena A de uPA y cadena B de uPA (dominio de proteasa). (B) Cinética de la activación de pro-uPA por células LnCaP17 y LnCaP-34. Se incubaron capas de células confluentes con pro-uPA 100 nM a 37 ºC y alícuotas tomadas en diferentes momentos de tiempo. La concentración de uPA formado se determinó en la segunda etapa del ensayo. Triángulos, LnCaP-34; cuadrados, LnCaP-17; triángulos rellenos, LnCaP-34 + KD1 1 µM; cuadrados rellenos, LnCaP-17 + KD1 1 µM. FIGURA 6. Modelo de los residuos P4 -P1 de pro-uPA en el sitio activo de hepsina.

65 FIGURA 7. Una realización de una secuencia de aminoácidos de hepsina humana nativa (SEC ID Nº: 1). FIGURA 8. (A) y (B) Otra realización de una secuencia de aminoácidos de hepsina humana nativa (SEC ID

E07798837

13-05-2015

Nº:2). FIGURA 9. Una realización de una secuencia de aminoácidos del activador del plasminógeno de tipo prourocinasa (pro-uPA) humano nativo. FIGURA 10. Estructura química del inhibidor de molécula pequeña HI-10331.

5

Modos para llevar a cabo la invención

La invención proporciona métodos, composiciones, kits y artículos de fabricación que comprenden moduladores de la ruta de señalización de HGF/c-met, que incluyen métodos de uso de tales moduladores.

Detalles de estos métodos, composiciones, kits y artículos de fabricación se proporcionan en el presente documento.

Técnicas generales

15 La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la experiencia de la materia. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía, tal como “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edición (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney, ed., 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Current Protocols in Molecular Biology” (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, y actualizaciones periódicas); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis et al., ed., 1994); “A Practical Guide to Molecular Cloning” (Perbal Bernard V., 1988); “Phage Display: A Laboratory Manual” (Barbas et al., 2001).

Definiciones

25 El término “hepsina”, como se usa en el presente documento, engloba polipéptidos de secuencia nativa, variantes de polipéptidos y fragmentos de un polipéptido de secuencia nativa y variantes de polipéptidos (que se definen adicionalmente en el presente documento) que es capaz de la escisión de pro-uPA de un modo similar a la hepsina no mutada. El polipéptido de hepsina descrito en el presente documento puede ser aquel que se aísla de varias fuentes, tales como de tipos de tejidos humanos o de otra fuente, o se prepara por métodos recombinantes o sintéticos. Los términos “hepsina”, “polipéptido de hepsina”, “enzima hepsina” y “proteína hepsina” también incluyen variantes de un polipéptido de hepsina como se desvela en el presente documento.

Una “polipéptido de hepsina de secuencia nativa” comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de

35 aminoácidos que el polipéptido de hepsina correspondiente derivado de la naturaleza. En una realización, un polipéptido de hepsina de secuencia nativa comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1 (véase la Figura 7). En una realización, un polipéptido de hepsina de secuencia nativa comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 (véase la Figura 8). Tal polipéptido de hepsina de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede producirse por medios recombinantes o sintéticos. El término “polipéptido de hepsina de secuencia nativa” engloba específicamente formas truncadas o secretadas que se producen naturalmente del polipéptido de hepsina específico (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular), formas variantes que se producen naturalmente (por ejemplo, formas alternativamente cortadas y empalmadas) y variantes alélicas que se producen naturalmente del polipéptido.

45 “Variante del polipéptido de hepsina”, o variaciones de los mismos, significa un polipéptido de hepsina, generalmente un polipéptido de hepsina activo, como se define en el presente documento, que tiene al menos aproximadamente el 80 % de identidad de secuencias de aminoácidos con cualquiera de las secuencias de polipéptidos de hepsina de secuencia nativa que se desvelan en el presente documento. Tales variantes de polipéptidos de hepsina incluyen, por ejemplo, polipéptidos de hepsina en los que uno o más residuos de aminoácidos se añaden, o delecionan, en el extremo N o C de una secuencia de aminoácidos nativa. Generalmente, una variante de polipéptidos de hepsina tendrá al menos aproximadamente el 80 % de identidad de secuencias de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente el 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % de identidad de secuencias de aminoácidos, con una secuencia de polipéptidos de hepsina de secuencia nativa como se ha desvelado en el presente documento. Generalmente, los polipéptidos de

55 variantes de hepsina tienen al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 aminoácidos de longitud, o más. Opcionalmente, los polipéptidos de variantes de hepsina tendrán no más de una sustitución de aminoácidos conservativa en comparación con una secuencia de polipéptidos de hepsina nativa, alternativamente no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácidos conservativas en comparación con la secuencia de polipéptidos de hepsina nativa.

“Porcentaje (%) de identidad de secuencias de aminoácidos” con respecto a una secuencia de péptidos o

65 polipéptidos se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de péptidos o polipéptidos, después de alinear las secuencias e

E07798837

13-05-2015

introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencias, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencias. El alineamiento para los fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos puede lograrse de diversas formas que están dentro de la habilidad en la materia, por ejemplo, usando software informático públicamente disponible tal como el 5 software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Aquellos expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir el alineamiento, que incluyen cualquier algoritmo necesario para lograr el máximo alineamiento con respecto a la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los fines en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencias de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2, como se describe en patente de EE.UU. nº

6.828.146.

El término “vector”, como se usa en el presente documento, pretende referirse a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico con el que se ha unido. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se han ligado segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un

15 vector de fago. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que segmentos de ADN adicionales pueden ligarse en el genoma viral. Ciertos vectores pueden replicarse autónomamente en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y así se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que están operativamente ligados. Tales vectores se denominan en el presente documento “vectores de expresión recombinantes” (o, simplemente, “vectores de expresión”). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están frecuentemente en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, “plásmido” y “vector” pueden usarse indistintamente ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector.

25 “Polinucleótido”, o “ácido nucleico”, como se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse en un polímero por ADN o ARN polimerasa, o por una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación a la estructura del nucleótido puede conferirse antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede interrumpirse por componentes de no nucleótido. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la síntesis, tal como por conjugación con una marca. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, “tapas”, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones

35 de internucleótidos tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellos que contienen restos laterales tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, ply-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa-anoméricos, etc.), además de formas sin modificar del (de los) polinucleótido(s). Además, cualquiera de los grupos hidroxilo generalmente presente en los azúcares puede sustituirse, por ejemplo, con grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse por grupos protectores convencionales o activarse para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o pueden conjugarse con soportes sólidos o semisólidos. Los OH del extremo 5' y 3' pueden

45 fosforilarse o sustituirse con aminas o restos de grupos de remate orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivatizarse a grupos protectores convencionales. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que generalmente son conocidos en la técnica que incluyen, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil-, 2'-fluoro-o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares alfa-anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos tales como metilrribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden sustituirse con grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, realizaciones en las que el fosfato está sustituido con P(O)S (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), (O)NR2 (“amidato”), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 (“formacetal”), en las que cada R o R' es independientemente H o alquilo (1-20 C) sustituido o sin sustituir que opcionalmente contiene un enlace éter (-O-),

55 arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido necesitan ser idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos citados en el presente documento, que incluyen ARN y ADN.

“Oligonucleótido”, como se usa en el presente documento, generalmente se refiere a polinucleótidos generalmente monocatenarios, generalmente sintéticos, que tienen generalmente, pero no necesariamente, menos de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. Los términos “oligonucleótido” y “polinucleótido” no son mutuamente excluyentes. La descripción anterior para polinucleótidos es igualmente y completamente aplicable a oligonucleótidos.

65 El término “activador de plasminógeno de tipo urocinasa” y “uPA”, o “activador de plasminógeno de tipo prourocinasa” y “pro-uPA”, como se usan en el presente documento, se refieren, a menos que se indique

E07798837

13-05-2015

específicamente o contextualmente de otro modo, a cualquier polipéptido de uPA nativo o de variante (tanto si se produce naturalmente como sintético) que es capaz de, o un polipéptido de uPA que puede activarse por hepsina en uPA activado que es capaz de, activar plasminógeno en condiciones que permiten que se produzca tal proceso. El término “uPA no mutante” generalmente se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de

5 una proteína uPA que se produce naturalmente, por ejemplo, como se exponen en la Figura 9 y se enumera en el nº de acceso NM_002658.

Los términos “anticuerpo” e “inmunoglobulina” se usan indistintamente en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (para, por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos),

10 anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos en tanto que presenten la actividad biológica deseada) y también pueden incluir ciertos fragmentos de anticuerpos (como se describe en mayor detalle en el presente documento). Un anticuerpo puede ser quimérico, humano, humanizado y/o madurado por afinidad.

15 “Fragmentos de anticuerpos” comprenden sólo una parte de un anticuerpo intacto, en el que la porción retiene preferentemente al menos una, preferentemente la mayoría o todas, de las funciones normalmente asociadas a esa porción cuando está presente en un anticuerpo intacto. En una realización, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y, por tanto, retiene la capacidad para unirse al antígeno. En otra realización, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, uno que comprende la región Fc, retiene al menos una de las

20 funciones biológicas normalmente asociadas a la región Fc cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como la unión a FcRn, modulación de la semivida del anticuerpo, función de ADCC y unión al complemento. En una realización, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una semivida in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo tal puede comprender sobre el antígeno el brazo de unión ligado a una secuencia de Fc que puede conferir estabilidad in vivo al fragmento.

25 El término “anticuerpo monoclonal”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población comprenden secuencia de aminoácidos esencialmente idéntica, excepto por posibles mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos

30 monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único antígeno. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante sobre el antígeno.

35 Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos “quiméricos” en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntica a u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, además de fragmentos de

40 tales anticuerpos, en tanto que presenten la actividad biológica deseada (patente de EE.UU. nº 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

Formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En general, los anticuerpos humanizados son 45 inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en la que los residuos de una región hipervariable del receptor están sustituidos con residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) de la inmunoglobulina humana son sustituidos con residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se 50 encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el rendimiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en el que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables se corresponden con los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado 55 también comprenderá opcionalmente al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véanse también los siguientes artículos de revisión y referencias citadas en su interior: Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op.

60 Biotech. 5:428-433 (1994).

Un “anticuerpo humano” es uno que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o ha sido producido usando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos como se ha desvelado en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano

65 excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

E07798837

13-05-2015

Un anticuerpo “madurado por afinidad” es uno con una o más alteraciones en una o más CDR del mismo que producen una mejora en la afinidad del anticuerpo por antígeno, en comparación con un anticuerpo parental que no posee aquella(s) alteración (alteraciones). Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno diana. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen

5 mediante procedimientos conocidos en la técnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad por barajado de dominios VH y VL. La mutagénesis al azar de residuos de CDR y/o de regiones estructurales se describe por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

Un anticuerpo “bloqueante” o un anticuerpo “antagonista” es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno con el que se une. Anticuerpos bloqueantes preferidos o anticuerpos antagonistas inhiben sustancialmente

o completamente la actividad biológica del antígeno.

15 Un “anticuerpo agonista”, como se usa en el presente documento, es un anticuerpo que imita al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés.

Un “trastorno” es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con una composición o método de la invención. Éste incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas que incluyen aquellas afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Ejemplos no limitantes de trastornos que van a tratarse en el presente documento incluyen tumores malignos y benignos; no leucemias y tumores malignos linfoides; trastornos neuronales, de la glía, astrocíticos, hipotalámicos y otros glandulares, macrofágicos, epiteliales, del estroma y blastocélicos; y otros trastornos relacionados con la angiogénesis.

25 Los términos “trastorno proliferativo de células” y “trastorno proliferativo” se refieren a trastornos que están asociados a algún grado de proliferación de células anormales. En una realización, el trastorno proliferativo de células es cáncer.

“Tumor”, como se usa en el presente documento, se refiere a todo crecimiento y proliferación celular neoplásico, tanto maligno como benigno, y a todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos. Los términos “cáncer”, “canceroso”, “trastorno proliferativo de células”, “trastorno proliferativo” y “tumor” no son mutuamente excluyentes como se denomina en el presente documento.

Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que normalmente

35 se caracteriza por crecimiento/proliferación celular no regulado y/o invasividad. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma escamoso de pulmón, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio

o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello.

Como se usa en el presente documento, “tratamiento” se refiere a la intervención clínica en un intento por alterar el

45 curso natural del individuo o célula que está tratándose, y puede realizarse tanto para la profilaxis como durante el curso de la patología clínica. Efectos del tratamiento deseables incluyen prevención de la manifestación o reaparición de enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunas realizaciones, las composiciones y/o métodos de la invención se usan para retardar el desarrollo de una enfermedad o trastorno.

Una “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

55 Una “cantidad terapéuticamente eficaz” de una molécula (por ejemplo, antagonista) de la invención puede variar según factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad de la molécula (por ejemplo, antagonista) para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la molécula (por ejemplo, antagonista) es superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, pero no necesariamente, como una dosis profiláctica se usa en sujetos antes de o en un estadio temprano de enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será inferior a la cantidad terapéuticamente eficaz.

65 El término “agente citotóxico”, como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o produce destrucción de células. Está previsto que el término incluya isótopos

E07798837

13-05-2015

radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, metrotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de las mismas tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos y toxinas tales como toxinas de

5 moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, que incluyen fragmentos y/o variantes de los mismos, y los diversos agentes antitumorales o anticancerígenos desvelados más adelante. Otros agentes citotóxicos se describen más adelante. Un agente tumoricida produce la destrucción de células tumorales.

Un “agente quimioterapéutico” es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y la ciclofosfamida CYTOXAN®; alquilsulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); delta-915 tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol; colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; callistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediína (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma 11 y 25 caliqueamicina omega 11 (véase, por ejemplo, Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, que incluye dinemicina A; una esperamicina; además de cromóforo de neocarzinostatina y la cromoproteína relacionada cromóforos antibióticos de enediína), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorubicina, cianomorfolinodoxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, inyección de liposomas de HCl de doxorubicina (DOXIL®) y desoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), una epotilona y 535 fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metrotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenérgicos tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; recuperador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); 45 razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido (“Ara-C”); tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®), formulación de nanopartículas manipuladas con albúmina de paclitaxel (ABRAXANE™) y docetaxel (TAXOTERE®); clorambucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina (VELBAN®); platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatino; leucovorina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; además de combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una

55 abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisolona, y FOLFOX, una abreviatura para una pauta de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina.

En esta definición también se incluyen agentes antihormonales que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento de cáncer, y están frecuentemente en forma de tratamiento sistémico, o del cuerpo completo. Pueden ser las propias hormonas. Ejemplos incluyen antiestrógenos y moduladores de receptores de estrógenos selectivos (SERM) que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo el tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno (EVISTA®), droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (FARESTON®); antiprogesteronas; reguladores por disminución de receptores de estrógenos (ERD); antagonistas de receptores de estrógenos como fulvestrant (FASLODEX®); agentes que 65 funcionan para suprimir o cerrar los ovarios, por ejemplo, agonistas de la hormona liberadora de hormona leutinizante (LHRH) tales como acetato de leuprolida (LUPRON® y ELIGARD®), acetato de goserelina, acetato de

E07798837

13-05-2015

buserelina y tripterelina; otros antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; e inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol (MEGASE®), exemestano (AROMASIN®), formestano, fadrozol, vorozol (RIVISOR®), letrozol (FEMARA®) y anastrozol (ARIMIDEX®). 5 Además, tal definición de agentes quimioterapéuticos incluye bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®) o risedronato (ACTONEL®); además de troxacitabina (un análogo de citosina de nucleósido de 1,3-dioxolano); oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en las rutas de señalización implicadas en la proliferación celular anómala tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); vacunas tales como la vacuna THERATOPE® y vacunas de terapia génica, por ejemplo, la vacuna ALLOVECTIN®, la vacuna LEUVECTIN® y la vacuna VAXID®; inhibidor de la topoisomerasa 1 (LURTOTECAN®); rmRH (por ejemplo, ABARELIX®); ditosilato de lapatinib (un inhibidor de moléculas pequeñas de tirosina cinasa dual ErbB-2 y EGFR también conocido como GW572016); inhibidores de la COX-2 tales como celecoxib (CELEBREX®; 4-(5-(4

15 metilfenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il) bencenosulfonamida; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

Un “agente inhibidor del crecimiento” cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula cuyo crecimiento depende de la activación de uPA tanto in vitro como in vivo. Por tanto, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células dependientes de uPA en la fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un sitio distinto de la fase S), tal como agentes que inducen la detención de G1 y la detención de la fase M. Bloqueantes de la fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxanos e inhibidores de la topoisomerasa II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina,

25 etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que detienen G1 también se extienden a la detención de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Puede encontrarse más información en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Capítulo 1, titulado “Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs” de Murakami et al. (WB Saunders: Filadelfia, 1995), especialmente la pág. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticancerígenos derivados ambos del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblaje de microtúbulos de dímeros de tubulina y estabilizan microtúbulos previniendo la despolimerización, que produce la inhibición de la mitosis en células.

35 “Doxorubicina” es un antibiótico de antraciclina. El nombre químico completo de la doxorubicina es (8S-cis)-10-[(3amino-2,3,6-tridesoxi-α-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-5,12naftacenodiona.

Composiciones y métodos de la invención

A. Anticuerpos

En una realización, la presente invención proporciona anticuerpos antagonistas que pueden encontrar uso en el presente documento como agentes terapéuticos y/o de diagnóstico. Anticuerpos a modo de ejemplo incluyen

45 anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.

1. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales se producen preferentemente en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante (especialmente cuando se usan péptidos sintéticos) con una proteína que es inmunogénica en las especies a inmunizar. Por ejemplo, el antígeno puede conjugarse con hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil-sulfosuccinimida (conjugación por residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (por

55 residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl2, o R1 N=C=NR en la que R y R1 son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados combinando, por ejemplo, 100 µg o 5 µg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después, los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 días después, los animales se sangran y el suero se ensaya para título de anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta la meseta del título. También pueden prepararse conjugados en cultivo celular recombinante como fusiones de proteínas. Por tanto, agentes agregantes tales como

65 alumbre se usan adecuadamente para potenciar la respuesta inmunitaria.

E07798837

13-05-2015

2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o resto no proteináceo mediante métodos de ADN recombinante (patente de 5 EE.UU. nº 4.816.567).

En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado tal como un hámster se inmuniza como se ha descrito anteriormente para provocar que los linfocitos produzcan o puedan producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Después de la inmunización, los linfocitos se aíslan y luego se fusionan con una línea de células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pág. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma así preparadas se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado, medio que

15 contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma sin fusionar parentales (también denominado componente de fusión). Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo selectivo para los hibridomas normalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Células de mieloma de componentes de fusión preferidos son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan producción de alto nivel estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio selectivo que selecciona contra las células parentales sin fusionar. Líneas de células de mieloma preferidas son líneas de mieloma murino tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y

25 MPC-11 disponibles de the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU., y células SP-2 y derivados, por ejemplo, células X63-Ag8-653 disponibles de la Colección americana de cultivos tipo, Manassas, Virginia, EE.UU. Las líneas de células de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pág. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

El medio de cultivo en el que las células de hibridoma están cultivándose se ensaya para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión

35 in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA).

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, por el análisis de Scatchard descrito en Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Una vez se han identificado las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse por procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante métodos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pág. 59-103 (Academic Press, 1986)). Medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores ascíticos en un animal, por ejemplo, por inyección i.p.

45 de las células en ratones.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido ascítico o suero por procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad (por ejemplo, usando proteína A o proteína G-Sepharose) o cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, etc.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención se aísla y se secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que pueden unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las células de

55 hibridoma sirven de fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión que entonces se transfectan en células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otra forma proteína de anticuerpo para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr, Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol, Revs, 130:151-188 (1992).

En otra realización, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554(1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581.597(1991) describen el aislamiento 65 de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo de nM) por barajado de cadenas (Marks

E07798837

13-05-2015

et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), además de infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Por tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridomas de anticuerpos monoclonales tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

5 El ADN que codifica el anticuerpo puede modificarse para producir polipéptidos de anticuerpos quiméricos o de fusión, por ejemplo, sustituyendo las secuencias del dominio constante de la cadena pesada y la cadena ligera humana (CH y CL) por las secuencias murinas homólogas (patente de EE.UU. nº 4.816.567; y Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o fusionando la secuencia codificante de inmunoglobulina con toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido de no inmunoglobulina (polipéptido heterólogo). Las secuencias de polipéptido de no inmunoglobulina pueden sustituirse con los dominios constantes de un anticuerpo; o están sustituidas con los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.

15

3. Anticuerpos humanos y humanizados

Los anticuerpos de la invención pueden comprender adicionalmente anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad,

25 afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural Fv de la inmunoglobulina humana están sustituidos con residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que ni se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o de la región estructural importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos un dominio variable, y normalmente dos, correspondiéndose todas o sustancialmente todas las regiones CDR con las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá óptimamente al menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

35 Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son muy conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él de una fuente que es no humana. Estos residuos no humanos de aminoácidos se denominan frecuentemente en lo sucesivo residuos “importados”, que se toman normalmente de un dominio variable “importado”. La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1968); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1998)] sustituyendo CDR de roedor o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos “humanizados” son anticuerpos quiméricos (patente de EE.UU. nº 4.816.567) en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente

45 de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR están sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que van a usarse en la producción de anticuerpos humanizados puede ser importante para reducir la antigenicidad y respuesta HAMA (anticuerpo antiratón humano) cuando el anticuerpo está previsto para uso terapéutico humano. Según el llamado método “de mejor ajuste”, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba contra la biblioteca completa de secuencias de dominio variable humano conocido. La secuencia del dominio V humana que está más próxima a la del roedor es identificada y la región estructural humana (FR) en su interior es aceptada para el anticuerpo

55 humanizado (Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901 (1997)). Otro método usa una región estructural particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma región estructural puede usarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).

Es adicionalmente importante que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, según un método preferido, anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los

65 modelos tridimensionales de inmunoglobulina están comúnmente disponibles y son familiares para aquellos expertos en la materia. Están disponibles programas informáticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales

E07798837

13-05-2015

tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis de la probable función de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta forma, los residuos de FR pueden seleccionarse y combinarse a partir

5 de las secuencias del receptor y de importación de manera que se logre la característica de anticuerpo deseada, tal como aumento de la afinidad por el (los) antígeno(s) diana. En general, los residuos de la región hipervariable están directamente y principalmente sustancialmente implicados en influir la unión a antígeno.

Se contemplan diversas formas de un anticuerpo humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab, que está opcionalmente conjugado con uno o más agentes citotóxicos con el fin de generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgG1 intacto.

Como una alternativa a la humanización pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible

15 producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que tras la inmunización pueden producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones quiméricos y mutantes en la línea germinal produce la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de la línea germinal en tales ratones mutantes en la línea germinal producirá la producción de anticuerpos humanos tras la exposición a antígeno. Véanse, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993); las patentes de EE.UU. nº 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas de GenPharm); 5.545.807; y el documento WO 97/17852.

25 Alternativamente, la tecnología de expresión en fago (McCafferty et al., Nature 348, 552-553 [1990]) puede usarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro a partir de repertorios de genes del dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes sin inmunizar. Según esta técnica, los genes del dominio V de anticuerpo se clonan en marco en un gen de la proteína de la cubierta tanto principal como minoritario de un bacteriófago filamentoso tal como M13 o fd, y se muestran como fragmentos funcionales de anticuerpos sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenaria del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también producen la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta esas propiedades. Por tanto, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. Las muestras de fago pueden realizarse en varias formas, revisadas en, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Pueden usarse

35 varias fuentes de segmentos de genes de V para la expresión en fago. Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) aislaron una matriz diferente de anticuerpos de anti-oxazolona a partir de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes de V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V de donantes humanos sin inmunizar y los anticuerpos con respecto a una matriz diferente de antígenos (incluyendo autoantígenos) pueden aislarse esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993). Véase, por tanto, las patentes de EE.UU. nº 5.565.332 y 5.573.905.

Como se trata anteriormente, los anticuerpos humanos también pueden generarse por linfocitos B activados in vitro (véanse las patentes de EE.UU. 5.567.610 y 5.229.275).

45

4. Fragmentos de anticuerpos

En ciertas circunstancias hay ventajas de uso de fragmentos de anticuerpos en vez de anticuerpos completos. El tamaño más pequeño de los fragmentos permite la rápida eliminación, y puede conducir al acceso mejorado a tumores sólidos.

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron por digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin 55 embargo, estos fragmentos pueden ahora ser directamente producidos por células huésped recombinantes. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv pueden todos expresarse en y secretarse de E. coli, permitiendo así la fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de bibliotecas de fagos de anticuerpos tratadas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Según otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente de cultivo de células huésped recombinantes. El fragmento Fab y F(ab')2 con elevada semivida in vivo que comprende residuos del epítope de unión al receptor silvestre se describe en la patente de EE.UU. nº 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el médico experto. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv monocatenario (scFv). Véase el documento WO 93/16185; patente de 65 EE.UU. nº 5.571.894; y patente de EE.UU. nº 5.587.458. Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que carecen de regiones constantes; por tanto, pueden ser adecuadas para la unión no específica reducida

E07798837

13-05-2015

durante el uso in vivo. Pueden construirse proteínas de fusión de sFv para dar la fusión de una proteína efectora en tanto el extremo amino como el carboxi de un sFv. Véase Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, arriba. El fragmento de anticuerpo también puede ser un “anticuerpo lineal”, por ejemplo, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.641.870. Tales anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.

5

5. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión por al menos dos epítopes diferentes. Los anticuerpos biespecíficos a modo de ejemplo pueden unirse a dos epítopes diferentes de hepsina, uPA y/o complejo de hepsina:uPA como se describe en el presente documento. Otros de tales anticuerpos pueden combinar un sitio de unión sobre estas entidades con un sitio de unión para otro polipéptido. Alternativamente, un brazo de anticuerpo puede combinarse con un brazo que se une a una molécula desencadenante sobre un leucocito tal como una molécula receptora de linfocitos T (por ejemplo, CD3), o receptores de Fc para IgG (FcγR), tales como FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) y FcγRIII (CD16), de manera que centren y localicen mecanismos de defensa celular

15 para la célula que expresa y/o de unión a hepsina y/o uPA. Los anticuerpos biespecíficos también pueden usarse para localizar agentes citotóxicos para células que expresan y/o se unen a hepsina, uPA y/o complejo de hepsina:uPA. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a polipéptido y un brazo que se une al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-α, alcaloide de la vinca, cadena A de ricina, metrotrexato o hapteno de isótopo radiactivo). Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2).

El documento WO 96/16673 describe un anticuerpo anti-ErbB2/anti-FcγRIII biespecífico y la patente de EE.UU. nº

5.837.234 desvela un anticuerpo anti-ErbB2/anti-FcγRI biespecífico. Un anticuerpo anti-ErbB2/Fcα biespecífico se

muestra en el documento WO98/02463. La patente de EE.UU. nº 5.821.337 enseña un anticuerpo anti-ErbB2/anti25 CD3 biespecífico.

Se conocen en la técnica métodos de producción de anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina en los que las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Milstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Debido al surtido aleatorio de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una posible mezcla de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las que sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se hace normalmente por etapas de cromatografía de afinidad, es bastante embarazosa, y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares se desvelan en el documento WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

35 Según un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios que combinan anticuerpo-antígeno) están fusionados a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. Preferiblemente, la fusión es con un dominio constante de la cadena pesada de Ig que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión a cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se co-transfectan en una célula huésped adecuada. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en realizaciones en las que relaciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos usadas en la construcción proporcionan el

45 rendimiento óptimo del anticuerpo biespecífico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas de polipéptidos en un único vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos en relaciones iguales produzca altos rendimientos o cuando las relaciones no tengan efecto significativo sobre el rendimiento de la combinación de cadenas deseada.

En una realización preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesadacadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado a partir de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de

55 inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación. Esta solución se desvela en el documento WO 94/04690. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Según otro enfoque descrito en la patente de EE.UU. nº 5.731.168, la superficie de separación entre un par de moléculas de anticuerpos puede manipularse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La superficie de separación preferida comprende al menos una parte del dominio CH3. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la superficie de separación de la primera molécula de anticuerpo están sustituidas con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Las “cavidades” de compensación de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) se 65 crean sobre la superficie de separación de la segunda molécula de anticuerpo sustituyendo las cadenas laterales de

E07798837

13-05-2015

aminoácidos grandes por más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero con respecto a otros productos finales no deseados tales como homodímeros.

5 Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o “heteroconjugados”. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para elegir como diana células del sistema inmunitario para células no deseadas (patente de EE.UU. nº 4.676.980) y para el tratamiento de infección por el VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/00373 y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden producirse usando cualquier método de reticulación conveniente. Agentes de reticulación adecuados son muy conocidos en la técnica y se desvelan en la patente de EE.UU. nº 4.676.980, junto con varias técnicas de reticulación.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse usando enlace químico. Brennan et

15 al., Science 229:81 (1985), describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol arsenito de sodio para estabilizar ditioles vecinos y prevenir la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte entonces en el Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro Fab'-TNB derivado para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

El reciente progreso ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que pueden acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992), describen la 25 producción de una molécula de anticuerpo biespecífico completamente humanizado F(ab')2. Cada fragmento Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. Por tanto, el anticuerpo biespecífico formado podía unirse a células que expresan en exceso el receptor ErbB2 y linfocitos T humanos normales, además de desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano. También se han descrito diversas técnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente a partir de cultivo celular recombinante. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se han producido usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):15471553 (1992). Los péptidos de cremalleras de leucina de las proteínas Fos y Jun se ligaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región de bisagra para formar monómeros y entonces se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este

35 método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología de “diacuerpos” descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993), ha proporcionado un mecanismo alternativo para producir fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un VH conectado a un VL por un conector que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento están obligados a aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formándose así dos sitios de unión a antígeno. También se ha notificado otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros Fv (sFv). Véase, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. 45 Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

6. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugado también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos covalentemente unidos. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para elegir como diana células del sistema inmunitario para células no deseadas [patente de EE.UU. nº 4.676.980] y para el tratamiento de infección por el VIH [documentos WO 91/00360, WO 92/00373 y EP 03089]. Se contempla que los anticuerpos puedan prepararse in vitro usando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, que incluyen aquellos que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas

55 pueden construirse usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y 4-mercaptobutirimidato de metilo y los desvelados, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 4.676.980.

7. Anticuerpos multivalentes

Un anticuerpo multivalente puede ser internalizado (y/o catabolizado) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son distintos de los de la clase de IgM) con tres o más sitios de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que pueden ser fácilmente producidos por expresión 65 recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptidos del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión a antígeno. El dominio de dimerización

E07798837

13-05-2015

preferido comprende (o consiste en) una región Fc o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fc y tres o más sitios de unión a antígeno del extremo amino a la región Fc. El anticuerpo multivalente preferido en el presente documento comprende (o consiste en) tres a aproximadamente ocho, pero preferiblemente cuatro, sitios de unión a antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena de 5 polipéptidos (por ejemplo, dos cadenas de polipéptidos), en el que la(s) cadena(s) de polipéptidos comprende(n) dos

o más dominios variables. Por ejemplo, la(s) cadena(s) de polipéptidos puede(n) comprender VD1-(X1)n -VD2-(X2)n -Fc en la que VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena de polipéptidos de una región Fc, X1 y X2 representan un aminoácido o polipéptido y n es 0 o 1. Por ejemplo, la(s) cadena(s) de polipéptidos puede(n) comprender: cadena de VH-CH1-conector flexible-VH-CH1-región Fc; o cadena de VH-CH1-VH-CH1-región Fc. El anticuerpo multivalente en el presente documento comprende preferiblemente adicionalmente al menos dos (por ejemplo, cuatro) polipéptidos del dominio variable de la cadena ligera. El anticuerpo multivalente en el presente documento puede comprender, por ejemplo, de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos del dominio variable de la cadena ligera. Los polipéptidos del dominio variable de la cadena ligera contemplados aquí comprenden un dominio variable de la cadena ligera y, opcionalmente,

15 además comprenden un dominio CL.

8. Ingeniería de la función efectora

Puede desearse modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo, de forma que se potencie la citotoxicidad mediada por célula dependiente de antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede lograrse introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, el (los) residuo(s) de cisteína puede(n) introducirse en la región Fc, permitiendo así la formación del enlace disulfuro entre cadenas en esta región. Por tanto, el anticuerpo homodimérico generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o destrucción 25 de células mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) elevadas. Véase Caron et al., J. Exp Med, 176:1191-1195(1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral potenciada también pueden prepararse usando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo puede manipularse, teniendo regiones Fc duales y así puede tener lisis del complemento y capacidades de ADCC potenciadas. Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Para aumentar la semivida en suero del anticuerpo puede incorporarse un epítope de unión al receptor silvestre en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. 5.739.277. Como se usa en el presente documento, el término “epítope de unión al receptor silvestre” se refiere a un epítope de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de aumentar la

35 semivida en suero in vivo de la molécula de IgG.

9. Inmunoconjugados

La invención también se refiere a inmunoconjugados o conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas) o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).

El uso de conjugados de anticuerpo-fármaco para la administración local de agentes citotóxicos o citostáticos, es

45 decir, fármacos para destruir o inhibir células tumorales en el tratamiento de cáncer (Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; patente de EE.UU. 4.975.278) permite la administración elegida como diana del resto de fármaco a tumores, y la acumulación intracelular en los mismos, en los que la administración sistémica de estos agentes de fármaco sin conjugar puede producir niveles inaceptables de toxicidad para células normales, además de las células tumorales que se busca eliminar (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) “Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review” en Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pág. 475-506). Así se busca la máxima eficacia con la mínima toxicidad. Se ha informado de tanto anticuerpos policlonales como de anticuerpos monoclonales útiles en estas estrategias (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87). Los fármacos usados en estos métodos incluyen daunomicina,

55 doxorubicina, metrotrexato y vindesina (Rowland et al., (1986), arriba). Las toxinas usadas en conjugados de anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como toxina diftérica, toxinas de plantas tales como ricina, toxinas de moléculas pequeñas tales como geldanamicina (Mandler et al. (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623) y caliqueamicina (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Las toxinas pueden efectuar sus efectos citotóxicos y citostáticos por mecanismos que incluyen unión a tubulina, unión a ADN o inhibición de topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con anticuerpos grandes o ligandos de receptores de proteínas.

65 ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) es un conjugado de anticuerpo-radioisótopo compuesto por un anticuerpo monoclonal IgG1 kappa murino dirigido contra el antígeno CD20 encontrado sobre la superficie de

E07798837

13-05-2015

linfocitos B normales y malignos y radioisótopo 111In o 90Y unido por un quelante de conector de tiourea (Wiseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al. (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Aunque ZEVALIN tiene actividad contra linfoma no Hodgkin (LNH) de linfocitos B, la administración produce citopenias graves y prolongadas en la 5 mayoría de los pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto por un anticuerpo huCD33 ligado a caliqueamicina, fue aprobado en 2000 para el tratamiento de leucemia mieloide aguda mediante inyección (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; patentes de EE.UU. nº 4.970.198; 5.079.233; 5.585.089; 5.606.040; 5.693.762; 5.739.116; 5.767.285; 5.773.001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto por el anticuerpo huC242 ligado por el conector de disulfuro SPP al resto de fármacos maitansinoides, DM1, está avanzando a ensayos de fase II para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, tales como colon, pancreático, gástrico y otros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto por el anticuerpo monoclonal anti-antígeno prostático específico de membrana (PSMA) ligado al resto de fármacos maitansinoides, DM1, está en desarrollo para el posible tratamiento de tumores de próstata. Los péptidos de

15 auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de la dolastatina, se conjugaron con anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y en carcinomas) y cAC10 (específicos para CD30 en tumores malignos hematológicos) (Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784) y están en desarrollo terapéutico.

Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados se han descrito anteriormente. Toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena A de la difteria, fragmentos activos de no unión de toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcinas, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, 25 crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Está disponible varios radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re. Se preparan conjugados del anticuerpo y agente citotóxico usando varios agentes de acoplamiento a proteínas bifuncionales tales como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al. (1987) Science, 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminapentaacético (MX-DTPA)

35 marcado con carbono 14 es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. Véase el documento WO94/11026.

Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de moléculas pequeñas, tales como una caliqueamicina, maitansinoides, un tricoteceno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se contemplan en el presente documento.

Maitansina y maitansinoides

En una realización, un anticuerpo (longitud completa o fragmentos) de la invención se conjuga con una o más 45 moléculas de maitansinoide.

Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de tubulina. La maitansina se aisló por primera vez del arbusto del África oriental Maytenus serrata (patente de EE.UU. nº 3.896.111). Posteriormente se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de maitansinol C-3 (patente de EE.UU. nº 4.151.042). El maitansinol sintético y los derivados y análogos del mismo se desvelan, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533.

55 Conjugados de maitansinoide-anticuerpo

En un intento por mejorar su índice terapéutico, la maitansina y los maitansinoides se han conjugado con anticuerpos que se unen específicamente a antígenos de células tumorales. Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides y su uso terapéutico se desvelan, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 5.208.020, 5.416.064 y la patente europea EP 0 425 235 B1. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describieron inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide designado DM1 ligado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra cáncer colorrectal humano. Se encontró que el conjugado era altamente citotóxico hacia células de cáncer de colon cultivadas y mostró actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo. Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) describen inmunoconjugados en los que un maitansinoide se conjugó mediante un 65 conector de disulfuro con el anticuerpo A7 murino que se une a un antígeno en líneas de células de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que se une al oncogén HER-2/neu. La citotoxicidad del

E07798837

13-05-2015

conjugado de TA.1-maitansonoide se probó in vitro en la línea celular de cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antígenos de superficie HER-2 por célula. El conjugado de fármaco alcanzó un grado de citotoxicidad similar al fármaco maitansinoide libre, que podría aumentarse aumentando el número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado de A7-maitansinoide mostró baja citotoxicidad sistémica en

5 ratones.

Conjugados de anticuerpo-maitansinoide (inmunoconjugados)

Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide se preparan ligando químicamente un anticuerpo con una molécula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica de tanto el anticuerpo como la molécula de maitansinoide. Un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo ha mostrado eficacia en potenciar la citotoxicidad de células diana sin afectar negativamente la función o solubilidad del anticuerpo, aunque incluso se esperaría que una molécula de toxina/anticuerpo potenciara la citotoxicidad con respecto al uso de anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son muy conocidos en la técnica y pueden sintetizarse

15 por técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Maitansinoides adecuados se desvelan, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.208.020 y en las otras patentes y publicaciones de no patente citadas anteriormente en el presente documento. Maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tal como diversos ésteres de maitansinol.

Hay muchos grupos de enlace conocidos en la técnica para preparar conjugados de anticuerpo-maitansinoide que incluyen, por ejemplo, los desvelados en la patente de EE.UU. nº 5.208.020 o la patente EP 0 425 235 B1, Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992). Los grupos de enlace incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles de peptidasa o lábiles de esterasa, como se desvela en las patentes anteriormente identificadas, prefiriéndose los grupos disulfuro y tioéter.

25 Los conjugados del anticuerpo y el maitansinoide pueden prepararse usando varios agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(Nmaleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6diisocianato) y compuestos de flúor bis-activo (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) (Carlsson et al., Biochem.

J. 173:723-737 [1978]) y 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro.

35 El conector puede unirse a la molécula de maitansinoide en diversas posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, puede formarse un enlace éster mediante la reacción con un grupo hidroxilo usando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede producirse en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una realización preferida, el enlace se forma en posición la C-3 del maitansinol o un análogo de maitansinol.

Caliqueamicina

45 Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo conjugado con una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de la caliqueamicina puede producir roturas de ADN bicatenario a concentraciones inferiores a picomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de la caliqueamicina véanse las patentes de 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas a American Cyanamid Company). Los análogos estructurales de la caliqueamicina que pueden usarse incluyen, pero no se

11 1

limitan a, γ1, α2, α31, N-acetil-γ11, PSAG y θ1 (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes de EE.UU. anteriormente mencionadas a American Cyanamid). Otro fármaco antitumoral con el que puede conjugarse el anticuerpo es QFA que es un antifolato. Tanto la caliqueamicina como QFA tienen sitios de acción intracelular y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por tanto, la captación celular de estos agentes por la internalización mediada por anticuerpos potencia

55 enormemente sus efectos citotóxicos.

Otros agentes citotóxicos

Otros agentes antitumorales que pueden conjugarse con los anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocida conjuntamente el complejo LL-E33288 descrito en las patentes de EE.UU. 5.053.394, 5.770.710, además de esperamicinas (patente de EE.UU. 5.877.296).

Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena A de la difteria, fragmentos activos de no unión de toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa),

65 cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina,

E07798837

13-05-2015

crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993.

La presente invención contempla adicionalmente un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto 5 con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como una desoxirribonucleasa; DNasa).

Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radiactivo. Están disponibles varios isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Ejemplos incluyen At211 , I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu. Si el conjugado se usa para detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios escintigráficos, por ejemplo, Ttc99m o I123 , o una marca de espín para la obtención de imágenes de resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como obtención de imágenes de resonancia magnética, irm), tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

15 Las radiomarcas u otras marcas pueden incorporarse en el conjugado de formas conocidas. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse por síntesis química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos adecuados que implican, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Marcas tales como Tc99m o I123, Re186, Re188 e In111 pueden unirse por un residuo de cisteína en el péptido. Itrio-90 puede unirse por un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 puede usarse para incorporar yodo

123. “Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy” (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle.

Los conjugados de anticuerpo y agente citotóxico pueden prepararse usando varios agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), 4-(N

25 maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugación de radionucleótido con el anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El conector puede ser un “conector escindible” que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede usarse un conector lábil de ácido, conector sensible a peptidasa, conector fotolábil, conector de dimetilo o conector que

35 contiene disulfuro (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); patente de EE.UU. nº 5.208.020).

Los compuestos de la invención contemplan expresamente, pero no se limitan a, ADC preparado con reactivos de conector cruzado: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4vinilsulfona)benzoato) que están comercialmente disponibles (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A). Véanse las páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.

Preparación de conjugados de anticuerpo-fármaco

45 En los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) de la invención, un anticuerpo (Ab) está conjugado con uno o más restos de fármaco (D), por ejemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 20 restos de fármaco por anticuerpo, mediante un conector (L). El ADC de fórmula I puede prepararse por varias rutas empleando reacciones de química orgánica, condiciones y reactivos conocidos para aquellos expertos en la materia que incluyen: (1) reacción de un grupo nucleófilo de un anticuerpo con un reactivo de conector bivalente para formar Ab-L, mediante un enlace covalente, seguido de reacción con un resto de fármaco D; y (2) reacción de un grupo nucleófilo de un resto de fármaco con un reactivo de conector bivalente, para formar D-L, mediante un enlace covalente, seguido de reacción con el grupo nucleófilo de un anticuerpo.

Ab-(L-D)p I

55 Los grupos nucleófilos en anticuerpos incluyen, pero no se limitan a: (i) grupos amina del extremo N, (ii) grupos amina de la cadena lateral, por ejemplo, lisina, (iii) grupos tiol de la cadena lateral, por ejemplo, cisteína, y (iv) grupos hidroxilo o amino de azúcar en los que el anticuerpo está glucosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleófilos y pueden reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en restos de conector y reactivos de conector que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) aldehídos, cetonas, grupos carboxilo y maleimida. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros entre cadenas reducibles, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para la conjugación con reactivos de conector mediante tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol). Por tanto, cada puente de cisteína formará teóricamente dos

65 nucleófilos de tiol reactivos. Grupos nucleófilos adicionales pueden introducirse en anticuerpos mediante la reacción de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) produciendo la conversión de una amina en un tiol.

E07798837

13-05-2015

Los conjugados de anticuerpo-fármaco de la invención también pueden producirse por modificación del anticuerpo para introducir restos electrófilos que pueden reaccionar con sustituyentes nucleófilos en el reactivo de conector o fármaco. Los azúcares de anticuerpos glucosilados pueden oxidarse, por ejemplo, con reactivos oxidantes de peryodato para formar grupos aldehído o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivos de conector

5 o restos de fármaco. Los grupos de base de Schiff de iminas resultantes pueden formar un enlace estable, o pueden reducirse, por ejemplo, por reactivos de borohidruro para formar enlaces de amina estables. En una realización, la reacción de la porción de hidrato de carbono de un anticuerpo glucosilado con tanto galactosa oxidasa como metaperyodato de sodio puede dar grupos carbonilo (aldehído y cetona) en la proteína que pueden reaccionar con grupos apropiados en el fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques). En otra realización, las proteínas que contienen residuos de serina o treonina del extremo N pueden reaccionar con meta-peryodato de sodio, produciendo la producción de un aldehído en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138146; documento US 5362852). Tal aldehído puede hacerse reaccionar con un resto de fármaco o nucleófilo conector.

15 Asimismo, los grupos nucleófilos en un resto de fármaco incluyen, pero no se limitan a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidracina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidracina y arilhidrazida que pueden reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en restos de conector y reactivos de conector que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) aldehídos, cetonas, grupos carboxilo y maleimida.

Alternativamente, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y agente citotóxico puede prepararse, por ejemplo, por técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado tanto adyacentes entre sí como separadas por una región que codifica un péptido conector que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.

25 En otra realización más, el anticuerpo puede conjugarse con un “receptor” (como estreptavidina) para la utilización en la elección previa como diana de tumores en el que el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la eliminación del conjugado sin unir de la circulación usando un agente de limpieza y luego administración de un “ligando” (por ejemplo, avidina) que está conjugado con un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido).

10. Inmunoliposomas

Los anticuerpos desvelados en el presente documento también pueden formularse como inmunoliposomas. Un

35 “liposoma” es una pequeña vesícula compuesta por diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivo que es útil para la administración de un fármaco a un mamífero. Los componentes del liposoma están comúnmente dispuestos en una formación de bicapa similar a la disposición de lípidos de membranas biológicas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tal como se describen en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); las patentes de EE.UU. nº 4.485.045 y 4.544.545; y el documento WO97/38731 publicado el 23 de octubre de 1997. Los liposomas con tiempo de circulación potenciado se desvelan en la patente de EE.UU. nº 5.013.556.

Pueden generarse liposomas particularmente útiles por el método de evaporación en fase inversa con una composición de lípido que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG

45 PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para dar liposomas con el diámetro deseado. Pueden conjugarse fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención con los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem, 2571286-288 (1982) por una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico está opcionalmente contenido dentro del liposoma. Véase Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989).

B. Oligopéptidos de unión

Los oligopéptidos de unión de la invención son oligopéptidos que se unen, preferentemente específicamente, a hepsina, uPA y/o complejo de hepsina: uPA, como se describe en el presente documento. Los oligopéptidos de 55 unión pueden sintetizarse químicamente usando metodología de síntesis de oligopéptidos conocida o pueden prepararse y purificarse usando tecnología recombinante. Los oligopéptidos de unión tienen normalmente al menos aproximadamente 5 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 aminoácidos de longitud o más, en los que tales oligopéptidos pueden unirse, preferentemente específicamente, a una diana de interés. Los oligopéptidos de unión pueden identificarse sin experimentación adicional usando técnicas muy conocidas. A este respecto se observa que técnicas para cribar bibliotecas de oligopéptido para oligopéptidos que pueden unirse específicamente a una diana son muy conocidas en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes de 65 EE.UU. nº 5.556.762, 5.750.373, 4.708.871, 4.833.092, 5.223.409, 5.403.484, 5.571.689, 5.663.143; publicaciones PCR nº WO 84/03506 y WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et

E07798837

13-05-2015

al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., en Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991)

5 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, y Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668).

A este respecto, la expresión en bacteriófago (fago) es una técnica muy conocida que permite cribar grandes bibliotecas de oligopéptidos para identificar miembro(s) de aquellas bibliotecas que pueden unirse específicamente a una diana. La expresión en fago es una técnica por la que polipéptidos variantes son expresados como proteínas de fusión para la proteína de la envuelta sobre la superficie de partículas de bacteriófago (Scott, J.K. y Smith, G. P. (1990) Science 249: 386). La utilidad de la expresión en fago se basa en el hecho de que grandes bibliotecas de variantes de proteína selectivamente aleatorizadas (o ADNc clonados aleatoriamente) pueden clasificarse rápidamente y eficientemente para aquellas secuencias que se unen a una molécula diana con afinidad alta. La expresión de bibliotecas de péptido (Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378) o proteína

15 (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363) en fago se ha usado para cribar millones de polipéptidos o oligopéptidos para aquellos con propiedades específicas de unión (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). La clasificación de bibliotecas de fagos de mutantes al azar requiere una estrategia para construir y propagar un gran número de variantes, un procedimiento para la purificación por afinidad usando el receptor diana y un medio de evaluación de los resultados de los enriquecimientos de unión. Patentes de EE.UU. nº 5.223.409, 5.403.484, 5.571.689 y 5.663.143.

Aunque la mayoría de los métodos de expresión en fago han usado fago filamentoso, también se conocen sistemas de expresión en fago lambdoide (documentos WO95/34683; U.S. 5.627.024), sistemas de expresión en fago T4

25 (Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)) y sistemas de expresión en fago T7 (Smith y Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); U.S. 5.766.905).

Ahora se han desarrollado muchas otras mejoras y variaciones del concepto básico de la expresión en fago. Estas mejoras potencian la capacidad de sistemas de expresión para cribar bibliotecas de péptido para la unión a moléculas diana seleccionadas y para expresar proteínas funcionales con el potencial de cribar estas proteínas para propiedades deseadas. Se han desarrollado dispositivos de reacción combinatorios para las reacciones de expresión en fago (documento WO 98/14277) y se han usado bibliotecas de expresión en fago para analizar y 35 controlar interacciones bimoleculares (documentos WO 98/20169; WO 98/20159) y propiedades de péptidos helicoidales obligados (documento WO 98/20036). El documento WO 97/35196 describe un método de aislamiento de un ligando de afinidad en el que una biblioteca de expresión en fago se pone en contacto con una solución en la que el ligando se unirá a una molécula diana y una segunda solución en la que el ligando de afinidad no se unirá a la molécula diana, para aislar selectivamente ligandos de unión. El documento WO 97/46251 describe un método de ciclos de selección de una biblioteca de expresión en fago aleatoria con un anticuerpo purificado por afinidad y luego aislamiento del fago de unión, seguido de un proceso de microadsorción usando pocillos de microplaca para aislar fago de unión de alta afinidad. También se ha informado del uso de proteína A de Staphylococcus aureus como marca de afinidad (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187). El documento WO 97/47314 describe el uso de bibliotecas de sustracción de sustrato para distinguir especificidades de enzima usando una biblioteca combinatoria que puede

45 ser una biblioteca de expresión en fago. Un método para seleccionar enzimas adecuadas para su uso en detergentes usando expresión en fago se describe en el documento WO 97/09446. Métodos adicionales de selección de proteínas de unión específica se describen en las patentes de EE.UU. nº 5.498.538, 5.432.018, y el documento WO 98/15833.

Los métodos de generación de bibliotecas de péptidos y el cribado de estas bibliotecas también se desvelan en las patentes de EE.UU. nº 5.723.286, 5.432.018, 5.580.717, 5.427.908, 5.498.530, 5.770.434, 5.734.018, 5.698.426,

5.763.192 y 5.723.323.

C. Moléculas pequeñas de unión

55 Las moléculas pequeñas de unión son preferentemente moléculas orgánicas distintas de oligopéptidos o anticuerpos como se definen en el presente documento que se unen, preferentemente específicamente, a hepsina, uPA y/o complejo de hepsina:uPA como se describe en el presente documento. Las moléculas pequeñas orgánicas de unión pueden identificarse y sintetizarse químicamente usando metodología conocida (véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT nº WO00/00823 y WO00/39585). Las moléculas pequeñas orgánicas de unión tienen normalmente menos de aproximadamente 2000 dalton de tamaño, alternativamente menos de aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 dalton de tamaño, en las que tales moléculas pequeñas orgánicas que pueden unirse, preferentemente específicamente, a una diana como se describe en el presente documento pueden identificarse sin experimentación adicional usando técnicas muy conocidas. A este respecto, se observa que técnicas para cribar

65 bibliotecas de moléculas orgánicas para moléculas que pueden unirse a una diana son muy conocidas en la técnica (véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT nº WO00/00823 y WO00/39585). Las moléculas pequeñas orgánicas

E07798837

13-05-2015

de unión pueden ser, por ejemplo, aldehídos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidracinas N-sustituidas, hidrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres, disulfuros, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonatos, cetales, tiocetales, acetales, tioacetales, haluros de arilo, sulfonatos de arilo, haluros de alquilo, sulfonatos de alquilo, compuestos

5 aromáticos, compuestos heterocíclicos, anilinas, alquenos, alquinos, dioles, aminoalcoholes, oxazolidinas, oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epóxidos, aziridinas, isocianatos, cloruros de sulfonilo, compuestos diazónicos, cloruros de ácido o similares.

D. Cribado de anticuerpos, oligopéptidos de unión y moléculas pequeñas de unión con las propiedades deseadas

Anteriormente se han descrito técnicas para generar anticuerpos, oligopéptidos y moléculas pequeñas de la invención. Pueden seleccionarse adicionalmente anticuerpos, oligopéptidos u otras moléculas pequeñas con ciertas características biológicas, según se desee.

15 Los efectos inhibidores de un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula pequeña de la invención pueden evaluarse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando células que expresan hepsina y/o pro-uPA tanto endógenamente como tras la transfección con el gen(es) respectivo(s). Por ejemplo, líneas celulares tumorales apropiadas y células transfectadas con el polipéptido de hepsina y/o de pro-uPA pueden tratarse con un anticuerpo monoclonal, oligopéptido u otra molécula pequeña de la invención a diversas concentraciones durante algunos días (por ejemplo, 2-7) y analizarse para actividad(es) biológica(s) conocida(s) por estar asociadas a activación de uPA, que incluye las actividades enzimáticas evaluadas según los ejemplos más adelante y aquellos descritos en Andreasen et al., Int. J. Cancer (1997), 72(1):1-22; Dano et al., Tromb. Haemost. (2005), 93(4):676-681; Helenius et al., Cancer Res. (2001), 61(14):5340-5344; Knudsen et al., Adv. Cancer Res. (2004), 91:31067; Shen'g, S., Cancer Metastasis Rev. (2001), 20(3-4):287-296; Van Veldhuizen et al., Am. J. Med. Sci. (1996), 312(1):8-11. El anticuerpo,

25 oligopéptido de unión o molécula pequeña orgánica de unión inhibirá la actividad de una célula tumoral que expresa hepsina y/o uPA in vitro o in vivo aproximadamente el 25-100 % en comparación con la célula tumoral sin tratar, más preferentemente aproximadamente el 30-100 %, e incluso más preferentemente aproximadamente el 50-100 % o el 70-100 %, en una realización, a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,5 a 30 µg/ml. La inhibición de la actividad puede medirse a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,5 a 30 µg/ml o aproximadamente 0,5 nM a 200 nM en cultivo celular, u otro sistema experimental adecuado, en el que la inhibición de la actividad se determina 1-10 días después de la exposición de las células tumorales al anticuerpo. El anticuerpo es inhibidor in vivo si la administración del anticuerpo a aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal produce la reducción en el tamaño del tumor, reducción de la invasividad de células tumorales, etc., en el plazo de aproximadamente 5 días a 3 meses desde la primera administración del anticuerpo, preferentemente

35 en el plazo de aproximadamente 5 a 30 días.

Para cribar anticuerpos, oligopéptidos u otras moléculas pequeñas orgánicas que se unen a un epítope sobre una diana de interés puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Este ensayo puede usarse para determinar si un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula pequeña orgánica de prueba se une al mismo sitio o epítope que un anticuerpo conocido. Alternativamente o adicionalmente, el mapeo de epítopes puede realizarse mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la secuencia de anticuerpos puede mutagenizarse tal como por cribado con alanina para identificar residuos de contacto. El anticuerpo mutante se prueba inicialmente para la unión con anticuerpo policlonal para garantizar el plegamiento apropiado. En un método diferente, los péptidos

45 correspondientes a diferentes regiones de un polipéptido pueden usarse en ensayos de competencia con los anticuerpos de prueba o con un anticuerpo de prueba y un anticuerpo con un epítope caracterizado o conocido.

E. Terapia con profármacos mediada por enzimas dependientes de anticuerpos (ADEPT)

Los anticuerpos de la presente invención también puede usarse en ADEPT conjugando el anticuerpo con una enzima activadora de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de peptidilo, véase el documento WO81/01145) en un fármaco anticanceroso activo. Véase, por ejemplo, el documento WO 88/07370 y la patente de EE.UU. nº 4.975.278.

55 El componente de enzima del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima que pueda actuar sobre un profármaco de tal forma que lo convierta en su forma citotóxica más activa.

Enzimas que son útiles en el método de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa útil para convertir no 5-fluorocitosina tóxica en el fármaco anticanceroso, 5-fluorouracilo; proteasas tales como proteasa de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de Daminoácido; enzimas que escinden hidratos de carbono tales como β-galactosidasa y neuraminidasa útiles para 65 convertir profármacos glucosilados en fármacos libres; β-lactamasa útil para convertir fármacos derivatizados con βlactamas en fármacos libres y penicilina amidasas tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa útiles

E07798837

13-05-2015

para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como “abzimas”, pueden usarse para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Los conjugados anticuerpo-abzima pueden

5 prepararse como se describen en el presente documento para administrar la abzima a una población de células tumorales.

Las enzimas de la presente invención pueden unirse covalentemente a los anticuerpos por técnicas muy conocidas en la técnica tales como el uso de los reactivos de reticulación heterobifuncionales anteriormente tratados.

10 Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden al menos la región de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención ligada a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención pueden construirse usando técnicas de ADN recombinante muy conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)).

15 F. Variantes de anticuerpos

Además de los anticuerpos descritos en el presente documento, se contempla que puedan prepararse variantes de anticuerpos. Las variantes de anticuerpos pueden prepararse introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN codificante, y/o mediante síntesis del anticuerpo deseado. Aquellos expertos en la materia apreciarán que los

20 cambios de aminoácidos pueden alterar procesos postraduccionales del anticuerpo tales como cambiar el número o la posición de sitios de glucosilación o alterar las características de anclaje a la membrana.

Las variaciones en los anticuerpos descritas en el presente documento pueden hacerse, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas y pautas para mutaciones conservativas y no conservativas expuestas, por ejemplo, en la 25 patente de EE.UU. nº 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, deleción o inserción de uno o más codones que codifican el anticuerpo que produce un cambio en la secuencia de aminoácidos en comparación con el anticuerpo o polipéptido de secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es mediante sustitución de al menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del anticuerpo. La orientación para determinar qué residuo de aminoácido puede insertarse, sustituirse o delecionarse sin afectar adversamente la 30 actividad deseada puede encontrarse comparando la secuencia del anticuerpo con las de moléculas de proteínas conocidas homólogas y minimizando el número de cambios de secuencias de aminoácidos hechos en regiones de alta homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de sustituir un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares tales como la sustitución de una leucina por una serina, es decir, sustituciones de aminoácidos conservativos. Las inserciones o deleciones puede estar

35 opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse haciendo sistemáticamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y probando las variantes resultantes para la actividad mostrada por la secuencia parental.

En el presente documento se proporcionan fragmentos de anticuerpos y de polipéptidos. Tales fragmentos pueden

40 estar truncados en el extremo N o extremo C, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con un anticuerpo o proteína nativa de longitud completa. Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada del anticuerpo o polipéptido.

Los fragmentos de anticuerpos y de polipéptidos pueden prepararse por distintas técnicas convencionales. Los

45 fragmentos de péptidos deseados pueden sintetizarse químicamente. Una solución alternativa implica generar fragmentos de anticuerpos o polipéptidos por digestión enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con una enzima conocida por escindir proteínas en sitios definidos por residuos de aminoácidos particulares, o digiriendo el ADN con enzimas de restricción adecuadas y aislando el fragmento deseado. Todavía otra técnica adecuada implica aislar y amplificar un fragmento de ADN que codifica un fragmento de anticuerpo o polipéptido deseado por reacción en

50 cadena de la polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de ADN se emplean en los cebadores de 5' y 3' en la PCR. Preferentemente, los fragmentos de anticuerpos y de polipéptidos comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con el anticuerpo o polipéptido nativo desvelado en el presente documento.

55 En realizaciones particulares, sustituciones conservativas de interés se muestran en la siguiente tabla bajo el encabezamiento de Sustituciones preferidas. Si tales sustituciones producen un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen más cambios sustanciales, denominados Sustituciones a modo de ejemplo en esta tabla, o como se describe adicionalmente más adelante en referencia a clases de aminoácidos, y los productos se criban.

Residuo original

Sustitución a modo de ejemplo Sustituciones preferidas

Ala (A)

Val; Leu; Ile Val

Arg (R)

Lys; Gln; Asn Lys

Asn (N)

Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln

Asp (D)

Glu; Asn Glu

E07798837

13-05-2015

Cys (C)

Ser; Ala Ser

Gln (Q)

Asn; Glu Asn

Glu (E)

Asp; Gln Asp

Gly (G)

Ala Ala

His (H)

Asn; Gln; Lys; Arg Arg

Ile (I)

Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu

Leu (L)

Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile

Lys (K)

Arg; Gln; Asn Arg

Met (M)

Leu; Phe; Ile Leu

Phe (F)

Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr

Pro (P)

Ala Ala

Ser (S)

Thr Thr

Thr (T)

Val; Ser Ser

Trp (W)

Tyr; Phe Tyr

Tyr (Y)

Trp; Phe; Thr; Ser Phe

Val (V)

Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu

Las modificaciones sustanciales en la función o identidad inmunológica del anticuerpo o polipéptido se llevan a cabo seleccionando sustituciones que se diferencian significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una hoja o conformación

5 helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) la voluminosidad de la cadena lateral. Los aminoácidos pueden agruparse según similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, en Biochemistry, segunda ed., pág. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):

(1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) 10 (2) polares no cargados: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3)

ácidos: Asp (D), Glu (E)

(4)

básicos: Lys (K), Arg (R), His(H)

Alternativamente, los residuos que se producen naturalmente pueden dividirse en grupos basados en propiedades 15 de las cadenas laterales comunes:

(1)

hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2)

hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu; 20 (4) básicos: His, Lys, Arg;

(5)

residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6)

aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservativas implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Tales

25 residuos sustituidos también pueden introducirse en los sitios de sustitución conservativa o, más preferentemente, en los restantes sitios (no conservados).

Las variaciones pueden hacerse usando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida a sitio), exploración con alanina y mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida a sitio

30 [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], la mutagénesis por casete [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], la mutagénesis con selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas pueden realizarse en el ADN clonado para producir el ADN de la variante de anticuerpo o de polipéptido.

35 El análisis de aminoácidos por barrido también puede emplearse para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos por barrido preferidos están aminoácidos neutros relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es normalmente un aminoácido de barrido preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante [Cunningham y Wells, Science, 244:1081

40 1085 (1989)]. La alanina también se prefiere normalmente porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones enterradas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no proporciona cantidades adecuadas de variante, puede usarse un aminoácido isotérico.

E07798837

13-05-2015

Cualquier residuo de cisteína que no participe en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo o polipéptido también puede ser sustituido, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la reticulación anómala. En cambio, el (los) enlace(s) de cisteína puede(n) añadirse al anticuerpo o polipéptido para mejorar su estabilidad (particularmente si el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un

5 fragmento Fv).

Un tipo particularmente preferido de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para el desarrollo posterior tendrá(n) propiedades biológicas modificadas mejoradas con respecto al anticuerpo parental del que se generan. Una forma conveniente de generar tales variantes de sustitución implica maduración por afinidad usando expresión en fago. Brevemente, varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) se maduran para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Las variantes de anticuerpos así generadas se expresan de un modo monovalente en partículas de fago filamentoso como fusiones con el producto génico III de M13 encapsidado dentro de cada

15 partícula. Entonces, las variantes expresadas en fago se criban para su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se desvela en el presente documento. Con el fin de identificar sitios de la región hipervariable candidatos para la modificación, puede realizarse mutagénesis por barrido de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión a antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el polipéptido de antígeno. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en el presente documento. Una vez se generan tales variantes, el panel de variantes se somete a cribado como se describe en el presente documento y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para el posterior desarrollo.

25 Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante varios métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos que se producen naturalmente) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida a sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis en casete de una versión de variante o de no variante anteriormente preparada del anticuerpo.

G. Modificaciones de anticuerpos y polipéptidos

Las modificaciones covalentes de anticuerpos y polipéptidos están incluidas dentro del alcance de la presente invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos de aminoácidos elegidos como diana

35 de un anticuerpo o polipéptido con un agente derivatizante orgánico que puede reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos del extremo N o C del anticuerpo o polipéptido. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular anticuerpo o polipéptido con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su uso en el método para purificar anticuerpos, y viceversa. Agentes de reticulación comúnmente usados incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de Nhidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, que incluye ésteres de disuccinimidilo tales como propionato de 3,3'-ditiobis(succinimidilo), maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como 3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato de metilo.

Otras modificaciones incluyen desamidación de residuos de glutaminilo y asparaginilo para los residuos de glutamilo

45 y aspartilo correspondientes, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilación de los grupos α-amino de lisina, arginina y cadenas laterales de histidina

[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pág. 79-86 (1983)], acetilación de la amina del extremo N y amidación de cualquier grupo carboxilo del extremo C.

Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo o polipéptido incluida dentro del alcance de la presente invención comprende alterar el patrón de glucosilación nativa del anticuerpo o polipéptido. “Alterar el patrón de glucosilación nativa” está previsto que signifique para los fines en el presente documento delecionar uno o más restos de hidrato de carbono encontrados en el anticuerpo o polipéptido de la secuencia nativa (tanto eliminando el sitio de glucosilación subyacente como delecionando la glucosilación por medios químicos y/o enzimáticos) y/o añadir uno o

55 más sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo o polipéptido de la secuencia nativa. Además, el término incluye cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas nativas, que implica un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos restos de hidrato de carbono presentes.

La glucosilación de anticuerpos y otros polipéptidos está normalmente o ligada a N o ligada a O. Ligado a N se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, están en las secuencias de reconocimiento para unión enzimática del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un posible sitio de glucosilación. La glucosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N

65 acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, los más comunes serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

E07798837

13-05-2015

La adición de sitios de glucosilación al anticuerpo o polipéptido se realiza convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de forma que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas anteriormente descritas (para sitios de glucosilación ligados a N). La alteración también puede hacerse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo o polipéptido original (para sitios de

5 glucosilación ligados a O). La secuencia de aminoácidos del anticuerpo o polipéptido puede alterarse opcionalmente mediante cambios al nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el anticuerpo o polipéptido en bases preseleccionadas de forma que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otro medio de aumentar el número de restos de hidrato de carbono sobre el anticuerpo o polipéptido es por acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. Tales métodos se describen en la materia, por ejemplo, en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pág. 259-306 (1981).

La eliminación de restos de hidrato de carbono presentes sobre el anticuerpo o polipéptido puede llevarse a cabo

15 químicamente o enzimáticamente, o por sustitución mutacional de codones que codifican residuos de aminoácidos que sirven de dianas para la glucosilación. Las técnicas de desglucosilación química se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, por Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y por Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). La escisión enzimática de restos de hidrato de carbono sobre polipéptidos puede lograrse por el uso de varias endo-y exo-glucosidasas como se describe por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente de anticuerpo o polipéptido comprende ligar el anticuerpo o polipéptido a uno de varios polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, en el modo expuesto en las patentes de EE.UU. nº 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337. El

25 anticuerpo o polipéptido también puede atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente), en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Tales técnicas se desvelan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Oslo, A., Ed., (1980).

El anticuerpo o polipéptido de la presente invención también puede modificarse de forma que se formen moléculas quiméricas que comprenden un anticuerpo o polipéptido fusionado con otro polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos.

35 En una realización, una molécula quimérica comprende una fusión del anticuerpo o polipéptido a un polipéptido de marca que proporciona un epítope al que puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-marca. La marca de epítope se sitúa generalmente en el extremo amino o carboxilo del anticuerpo o polipéptido. La presencia de tales formas marcadas con epítope del anticuerpo o polipéptido puede detectarse usando un anticuerpo contra el polipéptido de marca. Por tanto, la provisión de la marca de epítope permite que el anticuerpo o polipéptido se purifique fácilmente por purificación de afinidad usando un anticuerpo anti-marca u otro tipo de matriz de afinidad que se une a la marca de epítope. Diversos polipéptidos de marca y sus anticuerpos respectivos son muy conocidos en la técnica. Ejemplos incluyen marcas de poli-histidina (poli-His) o poli-histidina-glicina (poli-His-Gly); el polipéptido de marca de HA flu y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la marca c-myc y los

45 anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 para la misma [Evan et al., Molecular and Celular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y la marca de glucoproteína D del virus del herpes simple (gD) y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos de marca incluyen el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el péptido del epítope KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; un péptido del epítope de α-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; y la marca del péptido de proteína del gen 10 de T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)].

En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del anticuerpo o polipéptido con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada una “inmunoadhesina”), una fusión tal podría ser la región Fc de una molécula de

55 IgG. Las fusiones de Ig incluyen preferentemente la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana delecionado o inactivado) de un anticuerpo o polipéptido en lugar de al menos un región variable dentro de una molécula de Ig. En una realización particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulinas incluye las regiones bisagra, CH2 y CH3, o bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1. Para la producción de fusiones de inmunoglobulinas véase también la patente de EE.UU. nº 5.428.130 concedida el 27 de junio de 1995.

H. Preparación de anticuerpos y polipéptidos

La descripción más adelante se refiere principalmente a la producción de anticuerpos y polipéptidos cultivando células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico que codifica anticuerpos y 65 polipéptidos. Por supuesto, se contempla que pueden emplearse métodos alternativos, que son muy conocidos en la técnica, para preparar anticuerpos y polipéptidos. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos apropiada, o porciones

E07798837

13-05-2015

de la misma, puede producirse por síntesis directa de péptidos usando técnicas en fase sólida [véanse, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteína in vitro puede realizarse usando técnicas manuales o por automatización. La síntesis automatizada puede llevarse a cabo, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos de

5 Applied Biosystems (Foster City, CA) usando las instrucciones del fabricante. Diversas porciones del anticuerpo o polipéptido pueden sintetizarse químicamente por separado y combinarse usando métodos químicos o enzimáticos para producir el anticuerpo o polipéptido.

1. Aislamiento de ADN que codifica anticuerpo o polipéptido

El ADN que codifica anticuerpo o polipéptido puede obtenerse de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree posee el ARNm del anticuerpo o polipéptido y lo expresa a un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN del anticuerpo o polipéptido humano puede obtenerse convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano. El gen que codifica el anticuerpo o polipéptido también puede obtenerse a partir

15 de una biblioteca genómica o por procedimientos de síntesis conocidos (por ejemplo, síntesis automática de ácidos nucleicos).

Las bibliotecas pueden cribarse con sondas (tales como oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por él. El cribado del ADNc o la biblioteca genómica con la sonda seleccionada puede realizarse usando procedimientos habituales tal como se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica el anticuerpo o polipéptido es usar metodología PCR [Sambrook et al., arriba; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

25 Las técnicas para cribar una biblioteca de ADNc son muy conocidas en la técnica. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben ser de longitud suficiente y suficientemente inequívocas de forma que se minimicen falsos positivos. El oligonucleótido está preferentemente marcado de forma que pueda detectarse tras la hibridación con ADN en la biblioteca que está cribándose. Los métodos de marcado son muy conocidos en la técnica e incluyen el uso de radiomarcas como ATP marcado con 32P, biotinilación o marcado con enzimas. Las condiciones de hibridación, que incluyen rigurosidad moderada y alta rigurosidad, se proporcionan en Sambrook et al., arriba.

Las secuencias identificadas en tales métodos de cribado de bibliotecas pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas tales como GenBank u otras bases de

35 datos de secuencias privadas. La identidad de secuencias (a tanto el nivel de aminoácidos como de nucleótidos) dentro de regiones definidas de la molécula o a través de la secuencia de longitud completa puede determinarse usando métodos conocidos en la técnica y como se describen en el presente documento.

La secuencia que codifica proteínas que tienen ácidos nucleicos puede obtenerse cribando ADNc seleccionado o bibliotecas genómicas usando la secuencia de aminoácidos deducida desvelada en el presente documento por primera vez y, si fuera necesario, usando procedimientos de extensión de cebadores convencionales como se describen en Sambrook et al., arriba, para detectar precursores y productos intermedios de procesamiento de ARNm que pueden no haber sido transcritos de forma inversa en ADNc.

45 2. Selección y transformación de células huésped

Las células huésped se transfectan o transforman con vectores de expresión o de clonación descritos en el presente documento para la producción de anticuerpos o polipéptidos y se cultivan en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medio, temperatura, pH y similares, pueden ser seleccionadas por el experto sin experimentación adicional. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., arriba.

55 Los métodos de transfección de células eucariotas y transformación de células procariotas son conocidos para el experto general, por ejemplo, CaCl2, CaPO4, mediados por liposomas y electroporación. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se realiza usando técnicas habituales apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio, como se describe en Sambrook et al., arriba, o la electroporación se usan generalmente para procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células vegetales como se describe por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y el documento WO 89/05859 publicado el 29 de junio de 1989. Para células de mamífero sin tales paredes celulares puede emplearse el método de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Los aspectos generales de las transfecciones del sistema huésped de células de mamífero se han descrito en la patente de EE.UU. nº 4.399.216. Las transformaciones en levadura se llevan a cabo normalmente según el método

65 de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, también pueden usarse otros métodos para introducir ADN en células tales como por microinyección

E07798837

13-05-2015

15

25

35

45

55

nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para diversas técnicas para transformar células de mamífero véanse Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).

Células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en el presente documento incluyen células procariotas, de levadura o de eucariotas superiores. Procariotas adecuados incluyen, pero no se limitan a, eubacterias tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como

E. coli. Diversas cepas de E. coli están públicamente disponibles tales como la cepa MM294 de E. coli K12 (ATCC 31,446); X1776 de E. coli (ATCC 31.537); cepa W3110 de E. coli (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53.635). Otras células huésped procariotas adecuadas incluyen Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescens y Shigella, además de Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, 41P de B. licheniformis desvelada en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes. La cepa W3110 es un huésped o huésped parental particularmente preferido ya que es una cepa huésped común para fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferentemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para efectuar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas para el huésped, incluyendo ejemplos de tales huéspedes la cepa 1A2 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA; cepa 9E4 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; cepa 27C7 de

E. coli W3110 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kanr; cepa 37D6 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; cepa 40B4 de E. coli W3110, que es la cepa 37D6 con un mutación por deleción degP resistente a no kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante desvelada en la patente de EE.UU. nº

4.946.783

concedida el 7 de agosto de 1990. Alternativamente son adecuados métodos de clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de polimerasa de ácido nucleico.

El anticuerpo de longitud completa, fragmentos de anticuerpos y proteínas de fusión de anticuerpos pueden producirse en bacterias, en particular cuando no se necesitan glucosilación y función efectora de Fc, tal como cuando el anticuerpo terapéutico está conjugado con un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) y el inmunoconjugado muestra por sí mismo eficacia en la destrucción de células tumorales. Los anticuerpos de longitud completa tienen mayor semivida en circulación. La producción en E. coli es más rápida y más rentable. Para la expresión de fragmentos de anticuerpos y polipéptidos en bacterias véanse, por ejemplo, los documentos U.S.

5.648.237

(Carter et al.), U.S. 5.789.199 (Joly et al.) y U.S. 5.840.523 (Simmons et al.) que describen la región de iniciación de la traducción (TIR) y secuencias señal para optimizar la expresión y secreción. Después de la expresión, el anticuerpo se aísla de la pasta de células de E. coli en una fracción soluble y puede purificarse mediante, por ejemplo, una columna de proteína A o G dependiendo del isotipo. La purificación final puede llevarse a cabo similar al proceso para purificar anticuerpo expresado, por ejemplo, en células CHO.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levadura son huéspedes de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican anticuerpos o polipéptidos. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariota inferior comúnmente usado. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; documento EP 139.383 publicado el 2 de mayo de 1985); huéspedes de Kluyveromyces (patente de EE.UU. nº 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968975 (1991)) tales como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickerhamii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (documento EP 402.226); Pichia pastoris (documento EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesei (documento EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis (documento EP 394.538 publicado el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (documento WO 91/00357 publicado el 10 de enero de 1991) y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). Las levaduras metilotróficas son adecuadas en el presente documento e incluyen, pero no se limitan a, levadura capaz de crecer en metanol seleccionada de los géneros que están constituidos por Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Una lista de especies específica que son a modo de ejemplo de esta clase de levaduras puede encontrarse en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).

Células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo o polipéptido glucosilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, además de células vegetales tales como cultivos celulares de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco. Se han identificado numerosas cepas baculovirales y variantes y células huésped de insecto permisivas correspondientes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Varias cepas virales para transfección está públicamente disponible, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm

E07798837

13-05-2015

5 de Bombyx mori NPV, y tales virus pueden usarse como virus en el presente documento según la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Sin embargo, el mayor interés ha sido en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en

5 cultivo (cultivo de tejido) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón de embrión humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de bebés de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células

15 MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o de clonación anteriormente descritos para la producción de anticuerpos o polipéptidos y se cultivan en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

3. Selección y uso de un vector replicable

El anticuerpo o polipéptido que codifica ácidos nucleicos (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) puede insertarse en

25 un vector replicable para clonación (amplificación del ADN) o para expresión. Diversos vectores están públicamente disponibles. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiada puede insertarse en el vector mediante varios procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio(s) de endonucleasas de restricción apropiado(s) usando técnicas conocidas en la técnica. Los componentes de vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligación habituales que son conocidas para el experto.

El polipéptido puede producirse recombinantemente no sólo directamente, sino también como un polipéptido de

35 fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que codifica el anticuerpo o polipéptido que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, 1pp o líderes de enterotoxina II estables al calor. Para la secreción de levaduras, la secuencia señal puede ser, por ejemplo, el líder de la levadura invertasa, líder del factor alfa (incluyendo líderes del factor α de Saccharomyces y Kluyveromyces, este último descrito en la patente de EE.UU. nº 5.010.182), o líder de fosfatasa ácida, el líder de glucoamilasa de C. albicans (documento EP 362.179 publicado el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en el documento WO 90/13646 publicado el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamífero, las secuencias señal de mamíferos pueden usarse para dirigir la secreción de la proteína, tal como

45 secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o relacionadas, además de líderes secretores virales.

Tanto los vectores de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Tales secuencias son muy conocidas para una amplia variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen de plásmidos 2µ es adecuado para levadura, y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero.

Los vectores de expresión y de clonación contendrán normalmente un gen de selección, también llamado un

55 marcador de selección. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de marcadores de selección adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para recibir el ácido nucleico que codifica el anticuerpo o polipéptido tal como DHFR o timidina cinasa. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR natural es la línea celular CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada como se describe por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para uso en levadura es el gen trp1 presente en el plásmido 65 de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que

E07798837

13-05-2015

carece de capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC nº 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].

Los vectores de expresión y de clonación contienen normalmente un promotor operativamente ligado a la secuencia

5 de ácidos nucleicos que codifica el anticuerpo o polipéptido para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos mediante varias posibles células huésped son muy conocidos. Los promotores adecuados para uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas promotores de β-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); documento EP 36.776] y promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Los promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente ligada al ADN que codifica anticuerpo o polipéptido.

Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para

15 3-fosfoglicerato cinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otras enzimas glucolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)] tales como enolasa, gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa.

Otros promotores de levadura que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por condiciones de crecimiento son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas al metabolismo de nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Vectores y promotores adecuados para uso en la expresión de levadura se describen adicionalmente en el documento EP 73.657.

25 La transcripción de anticuerpos o polipéptidos a partir de vectores en células huésped de mamífero está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos a partir de los genomas de virus tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar (documento UK 2.211.504 publicado el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus simio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de choque térmico, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

La transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo o polipéptido por eucariotas superiores puede aumentarse

35 insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, normalmente aproximadamente de 10 a 300 pb, que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Ahora se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, α-fetoproteína, e insulina). Sin embargo, normalmente se usará un potenciador de un virus de células eucariotas. Ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y los potenciadores de adenovirus. El potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia que codifica anticuerpo o polipéptido, pero preferentemente está localizado en un sitio 5' del promotor.

45 Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (células de levadura, de hongo, de insecto, vegetales, animales, humanas o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles a partir de regiones sin traducir en 5' y, ocasionalmente 3', de ADN o ADNc de eucariota o viral. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción sin traducir del ARNm que codifica anticuerpo o polipéptido.

Todavía otros métodos, vectores y células huésped adecuados para la adaptación a la síntesis del anticuerpo o polipéptido en cultivo de células de vertebrados recombinantes se describen en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); documentos EP 117.060; y EP 117.058.

55

4. Cultivo de células huésped

Las células huésped usadas para producir el anticuerpo o polipéptido de la presente invención pueden cultivarse en varios medios. Para cultivar las células huésped son adecuados medios de cultivo comercialmente disponibles tales como F10 de Ham (Sigma), medio esencial mínimo ((MEM), (Sigma)), RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma). Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz.

58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem, 102:255 (1980), patentes de EE.UU. nº 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; documentos WO 90/03430; WO 87/00195; o la patente de EE.UU. Re. 30.985. Cualquiera de estos medios puede complementarse según se necesite con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales

65 como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tal como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el

E07798837

13-05-2015

fármaco GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos normalmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También puede incluirse cualquier otro complemente necesario a concentraciones apropiadas que serían conocidas para aquellos expertos en la materia. Las condiciones de cultivo tales como temperatura, pH y similares son aquellas previamente

5 usadas con la célula huésped seleccionada para expresión, y serán evidentes para el experto general.

5. Detección de la amplificación/expresión de genes

La amplificación y/o expresión de genes puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia por puntos (análisis de ADN) o hibridación in situ usando una sonda apropiadamente marcada basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento. Alternativamente pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos que incluyen dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. A su vez, los anticuerpos

15 pueden estar marcados y el ensayo puede llevarse a cabo cuando el dúplex está unido a una superficie, de manera que tras la formación del dúplex sobre la superficie pueda detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex.

Alternativamente, la expresión de genes puede medirse por métodos inmunológicos tales como tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y ensayo de cultivo celular o fluidos corporales para cuantificar directamente la expresión de producto génico. Anticuerpos útiles para tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de fluidos de muestra pueden ser tanto monoclonales como policlonales, y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido de secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en la secuencia de ADN proporcionada en el presente documento o contra secuencia exógena fusionada a ADN de polipéptido y que codifique un epítope de anticuerpo específico.

25

6. Purificación del anticuerpo y polipéptido

Las formas de anticuerpo y polipéptido pueden recuperarse a partir de medio de cultivo o de lisados de células huésped. Si está unido a membrana puede desprenderse de la membrana usando una solución de detergente adecuado (por ejemplo, Triton-X 100) o mediante escisión enzimática. Las células empleadas en la expresión del anticuerpo y polipéptido pueden romperse por diversos medios físicos o químicos tales como ciclos de congelacióndescongelación, sonicación, rotura mecánica o agentes de lisado de células.

Puede desearse purificar el anticuerpo y polipéptido a partir de proteínas de células recombinantes o polipéptidos.

35 Los siguientes procedimientos son a modo de ejemplo de procedimientos de purificación adecuados: por fraccionamiento sobre una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A-Sepharose para eliminar contaminantes tales como IgG; y columnas quelantes de metales para unir formas marcadas con epítopes del anticuerpo y polipéptido. Pueden emplearse diversos métodos de purificación de proteínas y tales métodos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990) Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982). La(s) etapa(s) de purificación seleccionada(s) dependerá(n), por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado y del anticuerpo o polipéptido particular producido.

45 Si se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o directamente secretarse en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como una primera etapa, el residuo particulado, tanto células huésped como fragmentos lisados, pueden eliminarse, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, se descongela pasta de células en presencia de acetato sódico (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los residuos de células pueden eliminarse por centrifugación. Si el anticuerpo es secretado en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión se concentran primero usando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore

55 Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede incluirse en cualquiera de las anteriores etapas para inhibir la proteólisis y pueden incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes fortuitos.

La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio de Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A puede usarse para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas γ1, γ2o γ4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Methods 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para γ3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la que está unida el ligando de afinidad es más 65 frecuentemente agarosa, pero están disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten flujos de velocidad más rápida y tiempos de

E07798837

13-05-2015

procesamiento más cortos que los que pueden lograrse con agarosa. Si el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas tales como fraccionamiento sobre una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina SEPHAROSE™, cromatografía sobre una

5 resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que vaya a recuperarse.

Tras cualquier etapa de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los

10 contaminantes pueden someterse a cromatografía de interacción hidrófoba a bajo pH usando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, realizado preferentemente a bajas concentraciones de sales (por ejemplo, sal de aproximadamente 0-0,25 M).

I. Formulaciones farmacéuticas

15 Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos, oligopéptidos de unión, moléculas pequeñas orgánicas o inorgánicas de unión y/o polipéptidos usados según la presente invención se preparan para almacenamiento mezclando el anticuerpo, polipéptido, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales (Remington's

20 Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Oslo, A. Ed. (1980)) en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como acetato, Tris, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol

25 fenólico, butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA;

30 tonificantes tales como trehalosa y cloruro sódico; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; tensioactivo tal como polisorbato; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS® o polietilenglicol (PEG). La formulación puede comprender el anticuerpo a una concentración de entre 5-200 mg/ml, preferentemente entre 10-100 mg/ml.

35 Las formulaciones en el presente documento también pueden contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que está tratándose, preferentemente aquellas con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, además de un anticuerpo, oligopéptido de unión o molécula pequeña orgánica o inorgánica de unión, puede desearse incluir en la formulación un anticuerpo

40 adicional, por ejemplo, un segundo anticuerpo que se une a un epítope diferente sobre el mismo polipéptido; o un anticuerpo para alguna otra diana tal como un factor de crecimiento que afecta el crecimiento del cáncer particular. Alternativamente o adicionalmente, la composición puede comprender adicionalmente un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citocina, agente inhibidor del crecimiento, agente antihormonal y/o cardioprotector. Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el fin previsto.

45 Los principios activos también pueden estar atrapados en una microcápsula preparada, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli-(metacilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en

50 macroemulsiones. Tales técnicas se desvelan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Oslo, A. Ed. (1980).

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo cuyas

55 matrices están en la forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsula. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente de EE.UU. nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de γ-etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT® (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato

60 de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

Las formulaciones que van a usarse para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se realiza fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.

65

E07798837

13-05-2015

J. Tratamiento con anticuerpos, oligopéptidos de unión y moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas de unión

Para determinar la expresión del polipéptido (hepsina y/o uPA) en el cáncer están disponibles diversos ensayos de detección. En una realización, la expresión en exceso del polipéptido puede analizarse por inmunohistoquímica 5 (IHC). Secciones de tejido incorporadas en parafina de una biopsia de tumor pueden someterse al ensayo de IHC y conferirles un criterio de intensidad de tinción del polipéptido del siguiente modo:

Puntuación 0 -no se observa tinción o se observa tinción de membranas en menos del 10 % de las células tumorales. Puntuación 1+ -se detecta una tinción de membranas leve/apenas perceptible en más del 10 % de las células tumorales. Las células sólo están teñidas en parte de su membrana. Puntuación 2+ -se observa una tinción de membranas completa de débil a moderada en más del 10 % de las células tumorales. Puntuación 3+ -se observa una tinción de membranas completa de moderada a fuerte en más del 10 % de las

15 células tumorales.

Aquellos tumores con puntuaciones 0 o 1+ para la expresión de polipéptidos pueden caracterizarse como que no expresan en exceso el polipéptido, mientras que aquellos tumores con puntuaciones 2+ o 3+ pueden caracterizarse como que expresan en exceso el polipéptido.

Alternativamente o adicionalmente pueden llevarse a cabo ensayos de FISH tales como INFORM® (comercializado por Ventana, Arizona) o PATHVISION® (Vysis, Illinois) sobre tejido tumoral incorporado en parafina fijado en formalina para determinar el grado (si lo hay) de expresión en exceso del polipéptido en el tumor.

25 La expresión en exceso o amplificación del polipéptido puede evaluarse usando un ensayo de detección in vivo, por ejemplo, administrando una molécula (tal como un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica) que se une a la molécula que va a detectarse y que está marcada con una marca detectable (por ejemplo, un isótopo radiactivo o una marca fluorescente) y barriendo externamente el paciente para la localización de la marca.

Como se ha descrito anteriormente, los anticuerpos, oligopéptidos y moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas de la invención tienen diversas aplicaciones no terapéuticas. Los anticuerpos, oligopéptidos y moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas de la presente invención pueden ser útiles para estadificar cánceres que expresan polipéptido (por ejemplo, en obtención de imágenes por rayos X). Los anticuerpos, oligopéptidos y moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas también son útiles para la purificación o inmunoprecipitación de polipéptido de células, para la

35 detección y cuantificación de polipéptido in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia Western, para destruir y eliminar células que expresan el polipéptido de una población de células mixtas como una etapa en la purificación de otras células.

Actualmente, dependiendo de la fase del cáncer, el tratamiento del cáncer implica una o una combinación de las siguientes terapias: cirugía para eliminar el tejido canceroso, radioterapia y quimioterapia. La terapia con anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica puede ser especialmente deseable en pacientes ancianos que no toleran bien la toxicidad y los efectos secundarios de la quimioterapia y en enfermedad metastásica en la que la radioterapia tiene utilidad limitada. Los anticuerpos, oligopéptidos y moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas que eligen como diana el tumor de la invención son útiles para aliviar cánceres que expresan el polipéptido tras el 45 diagnóstico inicial de la enfermedad o durante la recaída. Para aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo, oligopéptido

o molécula pequeña orgánica/inorgánica puede usarse solo, o en terapia de combinación con, por ejemplo, hormonas, antiangiógenos o compuestos radiomarcados, o con cirugía, crioterapia y/o radioterapia. El tratamiento con anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica puede administrarse conjuntamente con otras formas de terapia convencional, tanto consecutivamente con, terapia preconvencional como posconvencional. Los fármacos quimioterapéuticos tales como TAXOTERE® (docetaxel), TAXOL® (paclitaxel), estramustina y mitoxantrona se usan en el tratamiento de cáncer, en particular en pacientes con buen riesgo. En el presente método de la invención para tratar o aliviar cáncer, al paciente con cáncer puede administrársele el anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica junto con el tratamiento con uno o más de los agentes quimioterapéuticos precedentes. En particular se contempla la terapia de combinación con paclitaxel y derivados

55 modificados (véase, por ejemplo, el documento EP0600517). El anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica se administrarán con una dosis terapéuticamente eficaz del agente quimioterapéutico. En otra realización, el anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica se administra conjuntamente con quimioterapia para potenciar la actividad y eficacia del agente quimioterapéutico, por ejemplo, paclitaxel. El vademécum (PDR) desvela dosificaciones de estos agentes que se han usado en el tratamiento de diversos cánceres. Las pautas de dosificación y las dosificaciones de estos fármacos quimioterapéuticos anteriormente mencionados que son terapéuticamente eficaces dependerán del cáncer particular que está tratándose, el grado de la enfermedad y otros factores familiares para el médico experto en la materia y pueden determinarse por el médico.

En una realización particular, un conjugado que comprende un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña

65 orgánica/inorgánica conjugado con un agente citotóxico se administra al paciente. Preferentemente, el inmunoconjugado unido a la proteína es internalizado por la célula, produciendo un aumento de la eficacia

E07798837

13-05-2015

terapéutica del inmunoconjugado en la destrucción de la célula cancerosa con la que se une. En una realización preferida, el agente citotóxico elige como diana o interfiere con el ácido nucleico en la célula cancerosa. Ejemplos de tales agentes citotóxicos se describen anteriormente e incluyen maitansinoides, caliqueamicinas, ribonucleasas y ADN endonucleasas.

5 Los anticuerpos, oligopéptidos, moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas o conjugados de toxina de los mismos se administran a un paciente humano según métodos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por las vías intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intrarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o por inhalación. Se prefiere la administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica.

Otras pautas terapéuticas pueden combinarse con la administración del anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica. La administración combinada incluye co-administración, usando formulaciones separadas o una única formulación farmacéutica, y administración consecutiva en cualquier orden, en el que

15 preferentemente hay un periodo de tiempo mientras que ambos (o todos los) agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Preferentemente, tal terapia combinada produce un efecto terapéutico sinérgico.

También puede desearse combinar la administración del anticuerpo o anticuerpos, oligopéptidos o moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas con la administración de un anticuerpo dirigido contra otro antígeno de tumor asociado al cáncer particular.

En otra realización, los métodos de tratamiento terapéutico de la presente invención implican la administración combinada de un anticuerpo (o anticuerpos), oligopéptidos o moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas y uno o

25 más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores del crecimiento, que incluyen la co-administración de mezclas de diferentes agentes quimioterapéuticos. Agentes quimioterapéuticos incluyen antibióticos de fosfato de estramustina, prednimustina, cisplatino, 5-fluorouracilo, melfalan, ciclofosfamida, hidroxiurea e hidroxiureataxanos (tales como paclitaxel y docetaxel) y/o antraciclina. La preparación y los programas de dosificación para tales agentes quimioterapéuticos pueden usarse según instrucciones del fabricante o como se determina empíricamente por el médico experto. La preparación y los programas de dosificación para tal quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).

El anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica puede combinarse con un compuesto antihormonal; por ejemplo, un compuesto antiestrogénico tal como tamoxifeno; una antiprogesterona tal como

35 onapristona (véase el documento EP 616 812); o un antiandrógeno tal como flutamida, en dosificaciones conocidas para tales moléculas. Si el cáncer que va a tratarse es cáncer independiente de andrógenos, el paciente puede haberse sometido previamente a terapia antiandrogénica y, después de que el cáncer se convierta en independiente de andrógenos, el anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica (y opcionalmente otros agentes como se describen en el presente documento) puede administrarse al paciente.

Algunas veces también puede ser beneficioso co-administrar un cardioprotector (para prevenir o reducir la disfunción miocárdica asociada a la terapia) o una o más citocinas al paciente. Además de la pautas terapéuticas anteriores, el paciente puede someterse a extirpación quirúrgica de células cancerosas y/o radioterapia antes, simultáneamente con o después de la terapia con anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica. Dosificaciones

45 adecuadas para cualquiera de los agentes anteriormente co-administrados son aquellas presentemente usadas y pueden reducirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente y anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica.

Para la prevención o el tratamiento de enfermedad, la dosificación y el modo de administración se elegirán por el médico según criterios conocidos. La dosificación apropiada de anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica dependerá del tipo de enfermedad que va a tratarse, como se define anteriormente, la gravedad y evolución de la enfermedad, si el anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica se administra para fines preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica, y la discreción del médico adjunto. El anticuerpo, oligopéptido 55 o molécula pequeña orgánica/inorgánica se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Preferentemente, el anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica se administra por infusión intravenosa o por inyecciones subcutáneas. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal (por ejemplo, aproximadamente 0,1-15 mg/kg/dosis) de anticuerpo puede ser una dosificación candidata inicial para administración al paciente, tanto si es, por ejemplo, por una o más administraciones separadas como si es por infusión continua. Una pauta de dosificación puede comprender administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguida de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. Una dosificación diaria típica podría oscilar de aproximadamente 1 µg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o 65 más, dependiendo de la afección, el tratamiento es sostenido hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. El progreso de esta terapia puede monitorizarse fácilmente mediante métodos y ensayos

E07798837

13-05-2015

convencionales y basándose en criterios conocidos para el médico u otros expertos en la materia.

Aparte de la administración de la proteína de anticuerpo al paciente, la presente solicitud contempla la administración del anticuerpo por terapia génica. Tal administración de ácido nucleico que codifica el anticuerpo está

5 englobada por la expresión “administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo”. Véase, por ejemplo, el documento WO96/07321 publicado el 14 de marzo de 1996 referente al uso de terapia génica para generar anticuerpos intracelulares.

Hay dos enfoques principales para entrar el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las células del paciente; in vivo y ex vivo. Para la administración in vivo, el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, normalmente en el sitio en el que se requiere el anticuerpo. Para el tratamiento ex vivo, las células del paciente se extraen, el ácido nucleico se introduce en estas células aisladas y las células modificadas se administran al paciente tanto directamente como, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que son implantadas en el paciente (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.892.538 y 5.283.187). Hay varias técnicas disponibles

15 para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere a células cultivadas in vitro o in vivo en las células del huésped previsto. Técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión de células, DEAE-dextrano, el método de precipitación con fosfato de calcio, etc. Un vector comúnmente usado para la administración ex vivo del gen es un vector retroviral.

Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (tal como adenovirus, virus del herpes simple I o virus adenoasociados) y sistemas basados en lípidos (lípidos útiles para la transferencia mediada por lípidos del gen son, por ejemplo, DOTMA, DOPE y DC-Chol). Para la revisión de los protocolos de marcado y de terapia génica actualmente conocidos véase Anderson et al., Science

25 256:808-813 (1992). Véase también el documento WO 93/25673 y las referencias citadas en su interior.

Los anticuerpos de la invención pueden estar en las diferentes formas englobadas por la definición de “anticuerpo” en el presente documento. Por tanto, los anticuerpos incluyen anticuerpo de longitud completa o intacto, fragmentos de anticuerpos, anticuerpo de secuencia nativa o variantes de aminoácidos, anticuerpos humanizados, quiméricos o de fusión, inmunoconjugados, y fragmentos funcionales de los mismos. En los anticuerpos de fusión, una secuencia de anticuerpos está fusionada con una secuencia de polipéptidos heteróloga. Los anticuerpos pueden modificarse en la región Fc para proporcionar funciones efectoras deseadas. Como se trata en más detalle en las secciones en el presente documento, con las regiones Fc apropiadas, el anticuerpo desnudo unido sobre la superficie celular puede inducir citotoxicidad, por ejemplo, por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) o por

35 reclutamiento de complemento en citotoxicidad dependiente del complemento, o algún otro mecanismo. Alternativamente, si se desea eliminar o reducir la función efectora, de forma que se minimicen los efectos secundarios o las complicaciones terapéuticas, pueden usarse ciertas otras regiones Fc.

En una realización, el anticuerpo compite por la unión a, o se une sustancialmente a, el mismo epítope que los anticuerpos de la invención. También se contemplan anticuerpos que tienen las características biológicas de los presentes anticuerpos de la invención, que incluyen específicamente la elección de tumor como diana in vivo y cualquier inhibición de la proliferación celular o características citotóxicas.

Los métodos de producción de anticuerpos anteriores se describen en detalle en el presente documento.

45 Los presentes anticuerpos, oligopéptidos y moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas son útiles para tratar un cáncer que expresa hepsina y/o uPA o aliviar uno o más síntomas del cáncer en un mamífero. Los métodos de la invención engloban el uso de antagonistas en el tratamiento y/o alivio de síntomas de tumores metastásicos asociados a estos cánceres. El antagonista del anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica puede unirse a al menos una porción de las células cancerosas que expresan el polipéptido(s) (hepsina y/o uPA) en el mamífero. En una realización, el anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica es eficaz en causar la destrucción o muerte de células tumorales que expresan y/o sensibles a polipéptido o inhibir el crecimiento y/o invasividad de tales células tumorales, in vitro o in vivo, tras la unión al polipéptido. Un anticuerpo tal incluye un anticuerpo desnudo (no conjugado con ningún agente). Los anticuerpos desnudos que tienen propiedades

55 citotóxicas u otras de inhibición pueden emplearse adicionalmente con un agente citotóxico para hacerlos incluso más potentes en la destrucción de células tumorales. Las propiedades citotóxicas pueden conferirse a un anticuerpo, por ejemplo, conjugando el anticuerpo con un agente citotóxico, para formar un inmunoconjugado como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el agente citotóxico o un agente inhibidor del crecimiento es una molécula pequeña. En algunas realizaciones, se usan toxinas tales como caliqueamicina o un maitansinoide y análogos o derivados de los mismos.

La invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica de la invención, y un vehículo. Para los fines para tratar cáncer, las composiciones pueden administrarse al paciente en necesidad de tal tratamiento, en el que la composición puede comprender uno o más 65 anticuerpos presentes como inmunoconjugado o como el anticuerpo desnudo. En otra realización, las composiciones puede comprender estos anticuerpos, oligopéptidos o moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas en

E07798837

13-05-2015

combinación con otros agentes terapéuticos tales como agentes citotóxicos o inhibidores del crecimiento, que incluyen agentes quimioterapéuticos. La invención también proporciona formulaciones que comprenden un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica de la invención, y un vehículo. En una realización, la formulación es una formulación terapéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5 Otro aspecto de la invención es ácidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpos. Están englobados ácidos nucleicos que codifican tanto las cadenas H como L, y especialmente los residuos de la región hipervariable, cadenas que codifican el anticuerpo de la secuencia nativa, además de variantes, modificaciones y versiones humanizadas del anticuerpo.

10 La invención también proporciona métodos útiles para tratar un cáncer o aliviar uno o más síntomas del cáncer en un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica al mamífero. Las composiciones terapéuticas de anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica pueden administrarse a corto plazo (aguda) o crónica, o intermitentemente

15 como sea indicado por el médico. También se proporcionan métodos para inhibir el crecimiento de y destruir una célula que expresa y/o sensible al polipéptido (hepsina y/o uPA).

La invención también proporciona kits y artículos de fabricación que comprenden al menos un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica. Los kits que contienen anticuerpos, oligopéptidos o moléculas 20 pequeñas orgánicas/inorgánicas se usan, por ejemplo, para ensayos de destrucción de células, para inhibir la invasión de células tumorales y para la purificación o inmunoprecipitación del polipéptido de células. Por ejemplo, para el aislamiento y la purificación de un polipéptido, el kit puede contener un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica acoplada a perlas (por ejemplo, perlas de Sepharose). Pueden proporcionarse kits que contienen los anticuerpos, oligopéptidos o moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas para la detección y

25 cuantificación de un polipéptido in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia Western. Tal anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica útil para la detección puede proporcionarse con una marca tal como una marca fluorescente o radiomarca.

K. Artículos de fabricación y kits

30 Otra realización de la invención en el presente documento es un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de un cáncer que expresa polipéptido (hepsina y/o uPA), tal como cáncer de próstata y de ovario. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto sobre o asociado al recipiente. Recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas, etc. Los recipientes pueden formarse a

35 partir de varios materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para tratar la afección por cáncer y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar cáncer. La etiqueta o prospecto

40 comprenderá además instrucciones para administrar la composición de anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica/inorgánica al paciente con cáncer. Adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir adicionalmente otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, que incluyen otros

45 tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

También se proporcionan kits que son útiles para diversos fines, por ejemplo, para ensayos que expresan polipéptidos o de destrucción de células, para la purificación o inmunoprecipitación de un polipéptido de células. Para el aislamiento y la purificación de un polipéptido, el kit puede contener un anticuerpo, oligopéptido o molécula 50 pequeña orgánica/inorgánica acoplado a perlas (por ejemplo, perlas de Sepharose). Pueden proporcionarse kits que contienen los anticuerpos, oligopéptidos o moléculas pequeñas orgánicas/inorgánicas para la detección y cuantificación de un polipéptido in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia Western. Al igual que con el artículo de fabricación, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto sobre o asociado al recipiente. El recipiente contiene una composición que comprende al menos un anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña

55 orgánica/inorgánica de la invención. Pueden incluirse recipientes adicionales que contienen, por ejemplo, diluyentes y tampones, anticuerpos de control. La marca o prospecto puede proporcionar una descripción de la composición, además de instrucciones para el uso in vitro o de detección previsto.

L. Polipéptidos y ácidos nucleicos que codifican polipéptidos – Formas específicas y aplicaciones

60 Las secuencias de nucleótidos (o su complemento) que codifican polipéptidos de la invención tienen diversas aplicaciones en la ciencia de la biología molecular, además de usos para terapia, etc. El ácido nucleico que codifica polipéptido también será útil para la preparación de polipéptidos por las técnicas recombinantes descritas en el presente documento, en las que aquellos polipéptidos pueden usarse, por ejemplo, en la preparación de anticuerpos

65 como se describe en el presente documento.

E07798837

13-05-2015

Un gen de polipéptido de la secuencia nativa de longitud completa, o porciones del mismo, puede usarse como sondas de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar otros ADNc (por ejemplo, aquellos que codifican variantes que se producen naturalmente de un polipéptido o un polipéptido de otras especies) que tienen una identidad de secuencias deseada con una secuencia de polipéptido nativa desvelada en el presente documento. 5 Opcionalmente, la longitud de las sondas será aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases. Las sondas de hibridación pueden derivarse de regiones al menos parcialmente novedosas de la secuencia de nucleótidos nativa de longitud completa en las que aquellas regiones pueden determinarse sin experimentación adicional o a partir de secuencias genómicas que incluyen promotores, elementos potenciadores e intrones del polipéptido de la secuencia nativa. A modo de ejemplo, un método de cribado comprenderá aislar la región codificante del gen de polipéptido usando la secuencia de ADN conocida por sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden marcarse mediante varias marcas, que incluyen radionucleótidos tales como 32P o 35S, o marcas enzimáticas tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda por sistemas de acoplamiento de avidina/biotina. Las sondas marcadas que tienen una secuencia complementaria a la del gen de polipéptido de la presente invención pueden usarse para cribar bibliotecas de ADNc humano, ADN genómico o ARNm para

15 determinar con qué miembros de tales bibliotecas se hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen en más detalle en los ejemplos más adelante. Cualquier secuencia EST desvelada en la presente solicitud puede emplearse similarmente como sondas, usando los métodos desvelados en el presente documento.

Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos incluyen oligonucleótidos antisentido o sentido que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos monocatenaria (tanto ARN como ADN) que puede unirse para elegir como diana una secuencia de ARNm de polipéptido (sentido) o un ADN de polipéptido (antisentido). Los oligonucleótidos antisentido o sentido, según la presente invención, comprenden un fragmento de la región codificante de un ADN que codifica hepsina, pro-uPA o fragmentos de unión como se describen en el presente documento. Un fragmento tal generalmente comprende al menos aproximadamente 14 nucleótidos, 25 preferentemente de aproximadamente 14 a 30 nucleótidos. La capacidad para derivar un oligonucleótido antisentido

o uno sentido, basándose en una secuencia de ADNc que codifica una proteína dada, se describe en, por ejemplo, Stein y Cohen (Cancer Res, 48:2659, 1988) y van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988).

La unión de oligonucleótidos antisentido o sentido a secuencias de ácidos nucleicos diana produce la formación de dúplex que bloquean la transcripción o traducción de la secuencia diana por uno de varios medios, que incluyen degradación potenciada de los dúplex, terminación prematura de la transcripción o traducción, o por otros medios. Tales métodos están englobados por la presente invención. Por tanto, los oligonucleótidos antisentido pueden usarse para bloquear la expresión de una proteína, en los que la proteína puede desempeñar una función en la inducción de cáncer en mamíferos. Los oligonucleótidos antisentido o sentido comprenden además oligonucleótidos

35 que tienen esqueletos de azúcar-fosfodiéster modificados (u otros enlaces con el azúcar, tales como aquellos descritos en el documento WO 91/06629) y en los que tales enlaces con el azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, pueden resistir a la degradación enzimática), pero retienen la especificidad de secuencias para poder unirse a secuencias de nucleótidos diana.

Sitios intragénicos preferidos para la unión antisentido incluyen la región que incorpora la iniciación de la traducción/codón de iniciación (5'-AUG / 5'-ATG) o terminación/codón de terminación (5'-UAA, 5'-UAG y 5-UGA/ 5'-TAA, 5'-TAG y 5'-TGA) del marco de lectura abierto (ORF) del gen. Estas regiones se refieren a una parte del ARNm

o gen que engloban de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección

45 (es decir, 5' o 3') desde una iniciación de la traducción o codón de terminación. Otras regiones preferidas para la unión antisentido incluyen: intrones; exones; unión de intrón-exón; el marco de lectura abierto (ORF) o “región codificante”, que es la región entre el codón de iniciación de la traducción y el codón de terminación antisentido; la tapa de 5' de un ARNm que comprende un residuo de guanosina metilado en N7 unido al residuo más hacia 5' del ARNm por un enlace trifosfato 5'-5' e incluye la propia estructura de tapa 5', además de los 50 primeros nucleótidos adyacentes a la tapa; la región sin traducir de 5' (5'UTR), la porción de un ARNm en la dirección 5' del codón de iniciación de la traducción y que, por tanto, incluye nucleótidos entre el sitio de tapa de 5' y el codón de iniciación de la traducción de un ARNm o nucleótidos correspondientes sobre el gen; y la región sin traducir de 3' (3'UTR), la porción de un ARNm en la dirección 3' del codón de terminación de la traducción y que, por tanto, incluye nucleótidos entre el codón de terminación de la traducción y el extremo 3' de un ARNm o nucleótidos

55 correspondientes sobre el gen.

Ejemplos específicos de compuestos antisentido preferidos útiles para inhibir la expresión de un polipéptido incluyen oligonucleótidos que contienen esqueletos modificados o enlaces internucleosídicos no naturales. Oligonucleótidos que tienen esqueletos modificados incluyen aquellos que retienen un átomo de fósforo en el esqueleto y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en el esqueleto. Para los fines de esta memoria descriptiva, y como algunas veces se menciona en la materia, los oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su esqueleto de internucleósidos también pueden considerarse que son oligonucleósidos. Esqueletos de oligonucleótidos modificados preferidos incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metilo y otros alquilos que incluyen fosfonatos de 3'65 alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos,

E07798837

13-05-2015

tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y borano-fosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos ligados en 2'5' de estos, y aquellos que tiene polaridad invertida en los que uno o más enlaces internucleosídicos es un enlace 3' a 3', 5' a 5' o 2' a 2'. Oligonucleótidos preferidos que tienen polaridad invertida comprenden un único enlace 3' a 3' en el enlace internucleosídico más hacia 3', es decir, un único residuo de nucleósido invertido que puede ser abásico

5 (falta la nucleobase o tiene un grupo hidroxilo en su lugar). También están incluidas diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de enlaces que contienen fósforo incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE.UU. nº: 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.194.599; 5.565.555; 5.527.899; 5.721.218; 5.672.697 y 5.625.050.

Esqueletos de oligonucleótidos modificados preferidos que no incluyen un átomo de fósforo en su interior tienen esqueletos que se forman por enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos de heteroátomos y alquilo o cicloalquilo mixtos, o uno o más enlaces internucleosídicos

15 heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Éstos incluyen aquellos que tiene enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfuro, sulfóxido y sulfona; esqueletos de formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de metilenformacetilo y tioformacetilo; esqueletos de riboacetilo; esqueletos que contienen alqueno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que tienen partes componentes de N, O, S y CH2 mixtos. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de tales oligonucleósidos incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE.UU. nº: 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; 5.792.608; 5.646.269 y 5.677.439.

25 En otros oligonucleótidos antisentido preferidos, tanto el enlace con el azúcar como el internucleosídico, es decir, el esqueleto, de las unidades de nucleótidos se reemplazan por grupos novedosos. Las unidades de base se mantienen para la hibridación con un compuesto diana de ácido nucleico apropiado. Un compuesto oligomérico tal, un mimético de oligonucleótidos que se ha mostrado que tiene excelentes propiedades de hibridación, se denomina un ácido nucleico peptídico (PNA). En compuestos de PNA, el esqueleto de azúcar de un oligonucleótido se reemplaza por un esqueleto que contiene amida, en particular un esqueleto de aminoetilglicina. Las nucleobases son retenidas y se unen directamente o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción de amida del esqueleto. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de compuestos de PNA incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE.UU. nº: 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262. Otra enseñanza de compuestos de

35 PNA puede encontrarse en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.

Oligonucleótidos antisentido preferidos incorporan esqueletos de fosforotioato y/o esqueletos de heteroátomos, y en particular -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-[conocido como esqueleto de metilen(metilimino) o MMI], -CH2-ON(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-y -O-N(CH3)-CH2-CH2-[en el que el esqueleto de fosfodiéster nativo se representa como -O-P-O-CH2-] descritos en la patente de EE.UU. nº 5.489.677 anteriormente citada y los esqueletos de amida de la patente de EE.UU. nº 5.602.240 anteriormente citada. También se prefieren oligonucleótidos antisentido que tienen estructuras de esqueleto de morfolino de la patente de EE.UU. nº 5.034.506 anteriormente citada.

45 Los oligonucleótidos modificados también pueden contener uno o más restos de azúcar sustituidos. Oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-alquilo, S-alquilo, o N-alquilo; O-alquenilo, S-alquenilo o N-alquenilo; O-alquinilo, S-alquinilo o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, en los que el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1 a C10 o alquenilo C2 a C10 y alquinilo sustituido o sin sustituir. Particularmente se prefieren O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2 en las que n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos antisentido preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': alquilo C1 a C10 inferior, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo saliente de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o

55 un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504), es decir, un grupo alcoxialcoxi. Otra modificación preferida incluye 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2'-DMAOE, como se describe en ejemplos en el presente documento más adelante, y 2'dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'O-CH2-O-CH2-N(CH2)2.

Otra modificación preferida incluye ácidos nucleicos bloqueados (LNA) en los que el grupo 2'-hidroxilo está ligado al átomo de carbono de 3' o 4' del anillo de azúcar formando así un resto de azúcar bicíclico. El enlace es 65 preferentemente un grupo metileno (-CH2-)n que une por puentes el átomo de oxígeno de 2' y el átomo de carbono de 4' en el que n es 1 o 2. Los LNA y la preparación de los mismos se describe en los documentos WO 98/39352 y

E07798837

13-05-2015

WO 99/14226.

Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi (2'-O-CH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2-NH2), 2'-alilo (2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-alilo (2'-O-CH2-CH=CH2) y 2'-flúor (2'-F). La modificación en 2' puede ser en la posición arabino

5 (arriba) o la posición ribo (abajo). Una modificación en 2'-arabino preferida es 2'-F. También pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones sobre el oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido del extremo 3' o en oligonucleótidos ligados en 2'-5' y la posición 5' del nucleótido del extremo 5'. Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos del azúcar tales como restos de ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE.UU. nº: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; 5.792.747; y 5.700.920.

Los oligonucleótidos también pueden incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (frecuentemente

15 denominadas en la materia simplemente “base”). Como se usa en el presente documento, nucleobases “sin modificar” o “naturales” incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G) y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-C≡C-CH3 o -CH2-C≡CH) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halógeno, 8amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en 8, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidos en 5, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.

25 Otras nucleobases modificadas incluyen pirimidinas tricíclicas tales como fenoxazina citidina (1H-pirimido[5,4b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2(3H)-ona), abrazaderas de G tales como una fenoxazina citidina sustituida (por ejemplo 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)ona), carbazol citidina (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2ona). Nucleobases modificadas también pueden incluir aquellas en las que la base de purina o pirimidina se reemplaza por otros heterociclos, por ejemplo, 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Otras nucleobases incluyen las desveladas en la patente de EE.UU. nº 3.687.808, las desveladas en The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, y las desveladas por Englisch et al., Angewandte Chemie, edición internacional, 1991, 30, 613. Ciertas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos de la

35 invención. Éstas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en N-2, N-6 y O-6, que incluyen 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha mostrado que las sustituciones de 5metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico 0,6-1,2ºC (Sanghvi et al., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pág. 276-278) y se prefieren sustituciones de bases, incluso más particularmente cuando se combinan con modificaciones de 2'-O-metoxietil-azúcar. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de nucleobases modificadas incluyen, pero no se limitan a: la patente de EE.UU. nº 3.687.808, además de las patentes de EE.UU. nº: 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121. 5.596.091; 5.614.617; 5.645.985; 5.830.653; 5.763.588; 6.005.096; 5.681.941 y 5.750.692.

45 Otra modificación de oligonucleótidos antisentido ligar químicamente al oligonucleótido uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, distribución celular o captación celular del oligonucleótido. Los compuestos de la invención pueden incluir grupos conjugados covalentemente unidos a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Grupos conjugados de la invención incluyen intercaladores, moléculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, poliéteres, grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas de oligómeros, y grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas de oligómeros. Grupos conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, lípidos catiónicos, fosfolípidos, fosfolípidos catiónicos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas, en el contexto de la presente invención, incluyen grupos que mejoran la captación de oligómeros, potencian la resistencia de oligómeros a la degradación y/o fortalecen la hibridación

55 específica de secuencias con ARN. Grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas, en el contexto de la presente invención, incluyen grupos que mejoran la captación, distribución, metabolismo o secreción de oligómeros. Restos de conjugado incluyen, pero no se limitan a, restos de lípidos tales como un resto de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecanodiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3H-fosfonato de trietil-amonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett.,1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res.,

65 1990, 18, 3777-3783), una cadena de poliamina o de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) o ácido adamantanoacético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), un resto

E07798837

13-05-2015

palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264. 229-237), o un resto octadecilamina o hexilaminocarbonil-oxicolesterol. Los oligonucleótidos de la invención también pueden conjugarse con principios activos, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triyodobenzoico, ácido flufenámico, ácido folínico, una benzotiadiazida,

5 clorotiazida, una diazepina, indometicina, un barbitúrico, una cefalosporina, una sulfamida, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico. Conjugados de oligonucleótido-fármaco y su preparación se describen en la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 09/334.130 (presentada el 15 de junio de 1999) y las patentes de Estados Unidos nº: 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717; 5.580.731; 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241; 5.391.723; 5.416.203; 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941.

15 No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado estén uniformemente modificadas y, de hecho, más de una de las modificaciones anteriormente mencionadas puede incorporarse en un único compuesto o incluso en un único nucleósido dentro de un oligonucleótido. La presente invención también incluye compuestos antisentido que son compuestos quiméricos. Los compuestos antisentido “quiméricos” o “quimeras” en el contexto de la presente invención son compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, representando cada una al menos una unidad de monómero, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de oligonucleótido. Estos oligonucleótidos normalmente contienen al menos una región en la que el oligonucleótido se modifica de manera que se confiera al oligonucleótido un aumento de la resistencia a la degradación por nucleasas, aumento de la captación celular y/o aumento de la afinidad de unión para el ácido nucleico diana. Una región adicional del oligonucleótido puede servir de sustrato para enzimas que pueden escindir

25 híbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de un dúplex ARN:ADN. Por tanto, la activación de RNasa H produce la escisión de la ARN diana, potenciándose así enormemente la eficiencia de la inhibición de oligonucleótidos de la expresión génica. Por consiguiente, frecuentemente pueden obtenerse resultados comparables con oligonucleótidos más cortos cuando se usan oligonucleótidos quiméricos en comparación con desoxioligonucleótidos de fosforotioato que se hibridan con la misma región diana. Los compuestos antisentido quiméricos de la invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o miméticos de oligonucleótidos como se ha descrito anteriormente. Oligonucleótidos antisentido quiméricos preferidos incorporan al menos un azúcar modificado en 2' (preferentemente 2'-O-(CH2)2-O-CH3) en el extremo 3' para conferir resistencia a nucleasa y una región con al menos 4 azúcares en 2'-H contiguos para conferir actividad de RNasa H. Tales

35 compuestos también se han denominado en la materia híbridos o gápmeros. Los gápmeros preferidos tienen una región de azúcares modificados en 2' (preferentemente 2'-O-(CH2)2-O-CH3) en el extremo 3' y en el extremo 5' separada por al menos una región que tiene al menos 4 azúcares en 2'-H contiguos y preferentemente incorporan enlaces de esqueleto fosforotioato. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de tales estructuras híbridas incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE.UU. nº 5.013.830; 5.149.797; 5.220.007; 5.256.775; 5.366.878; 5.403.711; 5.491.133; 5.565.350; 5.623.065; 5.652.355; 5.652.356; y 5.700.922,

Los compuestos antisentido usados según la presente invención pueden prepararse convenientemente y rutinariamente por la técnica muy conocida de síntesis en fase sólida. El equipo para tal síntesis es comercializado por varios vendedores que incluyen, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Cualquier otro medio para

45 tales síntesis conocidas puede emplearse adicionalmente o alternativamente. Es muy conocido usar técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como los fosforotioatos y derivados alquilados. Los compuestos de la invención también pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo a otras moléculas, estructuras de molécula o mezclas de compuestos como, por ejemplo, liposomas, moléculas elegidas como diana por el receptor, formulaciones orales, rectales, tópica u otras, para ayudar en la captación, distribución y/o absorción. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de tales formulaciones que ayudan en la captación, distribución y/o absorción incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE.UU. nº 5.108.921; 5.354.844; 5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.158; 5.547.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330; 4.534.899; 5.013.556; 5.108.921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016; 5.417.978; 5.462.854; 5.469.854; 5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5.556.948; 5.580.575; y 5.595.756.

55 Otros ejemplos de oligonucleótidos sentido o antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos que están ligados covalentemente a restos orgánicos tales como aquellos descritos en el documento WO 90/10048, y otros restos que aumentan la afinidad del oligonucleótido por una secuencia de ácidos nucleicos diana, tal como poli-(L-lisina). Todavía más, agentes intercalantes, tales como elipticina, y agentes alquilantes o complejos metálicos pueden unirse a oligonucleótidos sentido o antisentido para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido antisentido o sentido por la secuencia de nucleótidos diana.

Los oligonucleótidos antisentido o sentido pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos diana por cualquier método de transferencia génica que incluye, por ejemplo, transfección de ADN 65 mediada por CaPO4, electroporación, o usando vectores de transferencia génica tales como virus de Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, un oligonucleótido antisentido o sentido se inserta en un vector retroviral adecuado.

E07798837

13-05-2015

Una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos diana se pone en contacto con el vector retroviral recombinante, tanto in vivo como ex vivo. Vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados del retrovirus murino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV), o los vectores de doble copia designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase el documento WO 90/13641).

5 Los oligonucleótidos sentido o antisentido también pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos diana por formación de un conjugado con una molécula de unión a ligando, como se describe en el documento WO 91/04753. Moléculas de unión a ligando adecuadas incluyen, pero no se limitan a, receptores de la superficie celular, factores de crecimiento, otras citocinas, u otros ligandos que se unen a receptores de la superficie celular. Preferentemente, la conjugación de la molécula de unión a ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión a ligando para unirse a su molécula o receptor correspondiente o bloquear la entrada del oligonucleótido sentido u antisentido o su versión conjugada en la célula.

Alternativamente, un oligonucleótido sentido o antisentido puede introducirse en una célula que contiene la

15 secuencia de ácidos nucleicos diana por formación de un complejo de oligonucleótido-lípido, como se describe en el documento WO 90/10448. El complejo de oligonucleótido sentido o antisentido-lípido se disocia preferentemente dentro de la célula por una lipasa endógena.

Las moléculas de ARN o ADN antisentido o sentido tienen generalmente al menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750,

25 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000 nucleótidos de longitud, en las que en este contexto el término “aproximadamente” significa la longitud de secuencia de nucleótidos mencionada más o menos el 10 % de esa longitud mencionada.

Las sondas también pueden emplearse en técnicas de PCR para generar un conjunto de secuencias para la identificación de secuencias codificantes de polipéptido estrechamente relacionadas.

Las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido también pueden usarse para la construcción de sondas de hibridación para mapear el gen que codifica ese polipéptido y para el análisis genético de individuos con trastornos genéticos. Las secuencias de nucleótidos proporcionadas en el presente documento pueden mapearse

35 con un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma usando técnicas conocidas, tales como hibridación in situ, análisis de enlaces contra marcadores cromosómicos conocidos y cribado de hibridación con bibliotecas.

El polipéptido puede usarse en ensayos para identificar las otras proteínas o moléculas que participan en una interacción de unión con el polipéptido. Por tales métodos pueden identificarse los inhibidores de la interacción de unión a receptor/ligando. Las proteínas que participan en tales interacciones de unión también pueden usarse para cribar inhibidores de péptidos o moléculas pequeñas de la interacción de unión. Pueden diseñarse ensayos de cribado para encontrar compuestos cabeza de serie que imitan la actividad biológica de un polipéptido nativo o un receptor para el polipéptido. Tales ensayos de cribado incluirán ensayos aceptados para cribados de alto rendimiento de bibliotecas químicas, que hacen que sean particularmente adecuados para identificar candidatos de

45 fármacos de moléculas pequeñas. Moléculas pequeñas contempladas incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los ensayos pueden realizarse en varios formatos, que incluyen ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están todos bien caracterizados en la materia.

También pueden usarse ácidos nucleicos que codifican un polipéptido o sus formas modificadas para generar tanto animales transgénicos como animales de “genes inactivados” que, a su vez, son útiles en el desarrollo y el cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o rata) es un animal que tiene células que contienen un transgén, transgén que se introdujo en el animal o un antecesor del animal en un estado prenatal, por ejemplo, embrionario. Un transgén es un ADN que está integrado en el genoma de una célula a partir 55 de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una realización, el ADNc que codifica un polipéptido puede usarse para clonar ADN genómico que codifica el polipéptido según técnicas establecidas y las secuencias genómicas usadas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN que codifica el polipéptido. Los métodos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han convertido en convencionales en la materia y se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 4.736.866 y

4.870.009. Normalmente, células particulares serían elegidas como diana para la incorporación del transgén del polipéptido con potenciadores específicos de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica un polipéptido introducido en la línea germinal del animal en una etapa embrionaria pueden usarse para examinar el efecto del aumento de la expresión de ADN que codifica un polipéptido. Tales animales pueden usarse como animales de prueba para reactivos debido a que se cree que confieren protección de, por

65 ejemplo, afecciones patológicas asociadas a su expresión en exceso. Según esta faceta de la invención, un animal se trata con el reactivo y una incidencia reducida de la afección patológica, en comparación con animales sin tratar

E07798837

13-05-2015

que llevan el transgén, indicaría una posible intervención terapéutica para la afección patológica.

Alternativamente, homólogos no humanos de un polipéptido pueden usarse para la construcción de un animal de gen “inactivado” que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica el polipéptido como resultado de recombinación 5 homóloga entre el gen endógeno que codifica el polipéptido y ADN genómico alterado que codifica el polipéptido introducido en un citoblasto embrionario del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica el polipéptido puede usarse para clonar ADN genómico que codifica el polipéptido según técnicas establecidas. Una parte del ADN genómico que codifica el polipéptido puede delecionarse o sustituirse con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador de selección que puede usarse para monitorizar la integración. Normalmente, varios kilobases de ADN flanqueante sin alterar (tanto en los extremos 5' como 3') están incluidos en el vector [véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homólogos]. El vector se introduce en una línea de citoblastos embrionarios (por ejemplo, por electroporación) y se seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha recombinado homólogamente con el ADN endógeno [véase, por ejemplo, Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Entonces, las células seleccionadas se inyectan en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón o rata)

15 para formar quimeras de agregación [véase, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pág. 113-152]. Un embrión quimérico puede luego implantarse en un animal adoptivo hembra pseudoembarazado adecuado y el embrión llevarse a término para crear un animal “de genes inactivados”. La progenie que alberga el ADN homólogamente recombinado en sus células germinales puede identificarse por técnicas convencionales y usarse para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN homólogamente recombinado. Los animales de genes inactivados pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad para defenderse contra ciertas afecciones patológicas y por su desarrollo de afecciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido.

El ácido nucleico que codifica los polipéptidos también puede usarse en terapia génica. En aplicaciones de terapia

25 génica, los genes se introducen en células con el fin de lograr la síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente eficaz, por ejemplo, para la sustitución de un gen defectuoso. “Terapia génica” incluye tanto terapia génica convencional en la que se logra un efecto duradero por un único tratamiento como la administración de agentes terapéuticos génicos, que implica la administración de una sola vez o repetida de un ADN o ARNm terapéuticamente eficaz. Los ARN y ADN antisentido pueden usarse como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. Ya se ha mostrado que los oligonucleótidos antisentido cortos pueden importarse en células cuando actúan de inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares producidas por su captación limitada por la membrana celular (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]). Los oligonucleótidos pueden modificarse para potenciar su captación, por ejemplo, sustituyendo sus grupos fosfodiéster negativamente cargados por grupos sin cargar.

35 Hay varias técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere a células cultivadas in vitro o in vivo en las células del huésped previsto. Técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión de células, DEAE-dextrano, el método de precipitación con fosfato de calcio, etc. Las técnicas de transferencia de genes in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (normalmente retrovirales) y transfección mediada por proteína-liposoma de la envoltura viral (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1993]). En algunas situaciones se desea proveer la fuente de ácido nucleico de un agente que elige como diana las células diana, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de la superficie celular o la célula diana, un ligando para un receptor sobre la célula diana,

45 etc. Si se emplean liposomas pueden usarse proteínas que se unen a una proteína de membrana de la superficie celular asociada a endocitosis para la elección de diana y/o para facilitar la captación, por ejemplo, de proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas tróficas para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que se someten a internalización en el ciclado, proteínas que eligen como diana la localización intracelular y potencian la semivida intracelular. La técnica de endocitosis mediada por receptor se describe, por ejemplo, por Wu et al., J Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Para una revisión del marcado de genes y protocolos de terapia génica véase Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992).

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos o fragmentos de los mismos descritos en el presente documento son útiles para la identificación de cromosomas. A este respecto, existe una necesidad continua

55 de identificar nuevos marcadores de cromosomas, ya que actualmente están disponibles relativamente pocos reactivos de marcado de cromosomas, basados en los datos de secuencias reales. Cada molécula de ácido nucleico de la presente invención puede usarse como marcador de cromosoma.

Los polipéptidos y moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden usarse diagnósticamente para el tipado de tejidos, en el que los polipéptidos pueden expresarse diferencialmente en un tejido con respecto a otro, preferentemente en un tejido enfermo con respecto a un tejido normal del mismo tipo de tejido. Las moléculas de ácidos nucleicos se usarán para generar sondas para PCR, análisis de Northern, análisis de Southern y análisis de Western.

65 La presente invención engloba métodos de cribado de compuestos para identificar aquellos que previenen el efecto del polipéptido (antagonistas). Los ensayos de cribado para candidatos de fármacos antagonistas se diseñan para

E07798837

13-05-2015

identificar compuestos que se unen o se complejan con los polipéptidos codificados por los genes identificados en el presente documento, o de otro modo interfieren con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares que incluyen, por ejemplo, inhibir la expresión del polipéptido de células. Tales ensayos de cribado incluirán ensayos aceptados para cribado de alto rendimiento de bibliotecas químicas, que hacen que sean

5 particularmente adecuados para identificar candidatos de fármacos de moléculas pequeñas.

Los ensayos pueden realizarse en varios formatos, que incluyen ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están todos bien caracterizados en la materia.

Todos los ensayos para antagonistas tienen en común que requieren poner en contacto el candidato a fármaco con un polipéptido o complejo de polipéptido en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que estos componentes interaccionen.

15 En ensayos de unión, la interacción es la unión y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una realización particular, el polipéptido o el candidato a fármaco se inmoviliza sobre una fase sólida, por ejemplo, sobre una placa de microtitulación, por uniones covalentes o no covalentes. La unión no covalente se lleva generalmente a cabo por recubrimiento de la superficie sólida con una solución del polipéptido y secado. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido que va a inmovilizarse puede usarse para anclarlo a una superficie sólida. El ensayo se realiza añadiendo el componente no inmovilizado, que puede marcarse por una marca detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando la reacción está completa, los componentes no reaccionados se eliminan, por ejemplo, lavando y se detectan los complejos anclados sobre la superficie sólida. Cuando el componente no inmovilizado originariamente lleva una marca detectable, la detección de

25 la marca inmovilizada sobre la superficie indica que se ha producido el complejamiento. Cuando el componente originariamente no inmovilizado no lleva una marca, la complejación puede detectarse, por ejemplo, usando un anticuerpo marcado específicamente que se une al complejo inmovilizado.

Si el compuesto candidato interacciona, pero no se une a un polipéptido, su interacción con ese polipéptido puede ensayarse mediante métodos muy conocidos para detectar las interacciones proteína-proteína. Tales ensayos incluyen enfoques tradicionales tales como, por ejemplo, reticulación, co-inmunoprecipitación y co-purificación a través de gradientes o columnas cromatográficas. Además, las interacciones proteína-proteína pueden monitorizarse usando un sistema genético basado en levadura descrito por Fields y colaboradores (Fields y Song, Nature (Londres), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)) como se desvela por 35 Chevray y Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991). Muchos activadores transcripcionales, tales como levadura GAL4, consisten en dos dominios modulares físicamente discretos, actuando uno de dominio de unión a ADN, funcionando el otro de dominio de activación de la transcripción. El sistema de expresión en levadura descrito en las publicaciones anteriores (generalmente denominado el “sistema de dos híbridos”) aprovecha esta propiedad y emplea dos proteínas híbridas, una en la que proteína diana está fusionada con el dominio de unión a ADN de GAL4 y la otra en la que las proteínas activadoras candidatas están fusionadas con el dominio de activación. La expresión de un gen indicador GAL1-lacZ bajo el control de un promotor activado por GAL4 depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 por interacción proteína-proteína. Las colonias que contienen polipéptidos interactuantes se detectan con un sustrato cromogénico para β-galactosidasa. Un kit completo (MATCHMAKER™) para identificar interacciones proteína-proteína entre dos proteínas específicas usando la

45 técnica de dos híbridos está comercialmente disponible de Clontech. Este sistema también puede extenderse para mapear los dominios de proteínas que participan en las interacciones de proteínas específicas, además de para localizar residuos de aminoácidos que son cruciales para estas interacciones.

Compuestos que interfieren con la interacción de un gen que codifica un polipéptido identificado en el presente documento y otros componentes intra-o extracelulares pueden probarse del siguiente modo: normalmente se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto del gen y el componente intra-o extracelular en condiciones y durante un tiempo que permitan la interacción y unión de los dos productos. Para probar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la reacción se ejecuta en ausencia y en presencia del compuesto de prueba. Además, puede añadirse un placebo a una tercera mezcla de reacción, para servir de control positivo. La

55 unión (formación de complejos) entre el compuesto de prueba y el componente intra-o extracelular presente en la mezcla se monitoriza como se ha descrito anteriormente en el presente documento. La formación de un complejo en la(s) reacción (reacciones) de control, pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba, indica que el compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto de prueba y su componente de reacción.

Para ensayar antagonistas, el polipéptido puede añadirse a una célula junto con el compuesto que va a cribarse para una actividad particular y la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de interés en presencia del polipéptido indica que el compuesto es un antagonista para el polipéptido. Alternativamente, los antagonistas pueden detectarse combinando el polipéptido y un posible antagonista con receptores del polipéptido o receptores codificados unidos a la membrana bajo condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. El 65 polipéptido puede marcarse, tal como por radiactividad, de forma que el número de moléculas de polipéptido unidas al receptor puede usarse para determinar la eficacia del posible antagonista. El gen que codifica el receptor puede

E07798837

13-05-2015

identificarse por numerosos métodos conocidos para aquellos expertos en la materia, por ejemplo, inmunopurificación de ligandos y clasificación por FACS. Coligan et al., Current Protocols in lmmun., 1(2): Capítulo 5 (1991). Preferentemente se emplea la clonación de la expresión en la que el ARN poliadenilado se prepara a partir de una célula sensible al polipéptido y una biblioteca de ADNc creada a partir de este ARN se divide en conjuntos y

5 se usa para transfectar células COS u otras células que no son sensibles al polipéptido. Las células transfectadas que se cultivan sobre portaobjetos de vidrio se exponen al polipéptido marcado. El polipéptido puede marcarse mediante varios medios que incluyen yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína cinasa específica para sitio. Tras la fijación e incubación, los portaobjetos se someten a análisis autorradiográfico. Se identifican conjuntos positivos y se preparan subconjuntos y se re-transfectan usando un proceso de subagrupamiento y re-cribado interactivo, dando eventualmente un único clon que codifica el receptor putativo.

Ejemplos más específicos de posibles antagonistas incluyen anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos poli-y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos antiidiotípicos y versiones quiméricas o humanizadas de tales anticuerpos o fragmentos, además de anticuerpos humanos y

15 fragmentos de anticuerpos. Alternativamente, un posible antagonista puede ser una proteína estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del polipéptido que reconoce el receptor, pero que no confiere efecto, inhibiendo así competitivamente la acción del polipéptido.

Otro posible antagonista es una construcción de ARN o ADN antisentido preparada usando tecnología antisentido en la que, por ejemplo, una molécula de ARN o ADN antisentido actúa para bloquear directamente la traducción de ARNm hibridándose con el ARNm elegido como diana y previniendo la traducción de proteínas. Puede usarse tecnología antisentido para controlar la expresión génica mediante la formación de una triple hélice o ADN o ARN antisentido, basándose ambos métodos en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la porción codificante de 5' de la secuencia de polinucleótidos, que codifica los polipéptidos maduros en el presente documento 25 puede usarse para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Un oligonucleótido de ADN se diseña para ser complementario a una región del gen que participa en la transcripción (triple hélice -véanse Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), previniéndose así la transcripción y la producción del polipéptido. El oligonucleótido de ARN antisentido se hibrida con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido (antisentido -Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Los oligonucleótidos descritos anteriormente también pueden administrarse a células de forma que el ARN o ADN antisentido pueda expresarse in vivo para inhibir la producción del polipéptido. Si se usa ADN antisentido, se prefieren los oligodesoxirribonucleótidos derivados del sitio de iniciación de la traducción, por ejemplo, entre aproximadamente las posiciones -10 y +10 de la

35 secuencia de nucleótidos del gen diana.

Los posibles antagonistas incluyen moléculas pequeñas que se unen al sitio activo, el sitio de unión del receptor, o factor de crecimiento u otro sitio de unión relevante del polipéptido, bloqueándose así la actividad biológica normal del polipéptido. Ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, péptidos pequeños o moléculas similares a péptidos, preferentemente péptidos solubles, y compuestos orgánicos o inorgánicos de no peptidilo sintéticos.

Las ribozimas son moléculas de ARN enzimático que pueden catalizar la escisión específica de ARN. Las ribozimas actúan por hibridación específica de la secuencia con el ARN diana complementario, seguido de escisión

45 endonucleolítica. Los sitios de escisión de ribozimas específicos dentro de una posible diana de ARN pueden identificarse por técnicas conocidas. Para más detalles véanse, por ejemplo, Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), y la publicación PCT nº WO 97/33551 (publicada el 18 de septiembre de 1997).

Las moléculas de ácidos nucleicos en la formación de la triple hélice usadas para inhibir la transcripción deberían ser monocatenarias y compuestas por desoxinucleótidos. La composición de bases de estos oligonucleótidos se diseña de forma que se promueva la formación de la triple hélice mediante las reglas de apareamiento de bases de Hoogsteen, que generalmente requieren estiramientos considerables de purinas o pirimidinas en una cadena de un dúplex. Para más detalles véase, por ejemplo, la publicación PCT nº WO 97/33551, arriba.

55 Estas moléculas pequeñas pueden identificarse por uno cualquiera o más de los ensayos de cribado tratados anteriormente en el presente documento y/o por cualquier otra técnica de cribado muy conocida para aquellos expertos en la materia.

El ácido nucleico que codifica polipéptido aislado puede usarse para producir recombinantemente polipéptido usando técnicas muy conocidas en la técnica y como se describen en el presente documento. A su vez, los polipéptidos producidos pueden emplearse para generar anticuerpos usando técnicas muy conocidas en la técnica y como se describen en el presente documento.

Los anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido identificado en el presente documento, además de otras

65 moléculas identificadas por los ensayos de cribado desvelados anteriormente en el presente documento, pueden administrarse para el tratamiento de diversos trastornos, que incluyen cáncer, en forma de composiciones

E07798837

13-05-2015

farmacéuticas.

Si el polipéptido es intracelular y se usan anticuerpos completos como inhibidores, se prefieren anticuerpos de internalización. Sin embargo, también pueden usarse lipofecciones o liposomas para administrar el anticuerpo, o un

5 fragmento de anticuerpo, a células. Si se usan fragmentos de anticuerpos, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, basándose en la secuencias de la región variable de un anticuerpo, pueden diseñarse moléculas de péptido que retienen la capacidad de unirse a la secuencia de proteína diana. Tales péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse por tecnología de ADN recombinante. Véase, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993).

La formulación en el presente documento también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que está tratándose, preferentemente aquellas con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Alternativamente o además, la composición puede

15 comprender un agente que potencia su función tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citocina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el fin previsto.

Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo para fines ilustrativos, y no pretenden limitar de ningún modo el alcance de la presente invención.

Ejemplos

Reactivos

25 Lys-plasmina y Lys-plasminógeno fueron de Heamatologic Technologies Inc., (Essex Junction, VT). Pro-tPA fue de Biodesign International (Saco, ME), uPA (forma de alto peso molecular) de American Diagnostica (Greenwich, CT), pro-uPA de Cortex Biochem (San Leandro, CA) y PAI-1 de Molecular Innovations (Southfield, MI). Los sustratos cromogénicos S2444, S2765 y S2366 fueron de Diapharma (Westchester, OH). Las células T.in.Pro fueron de Expression System LLC (Woodland, CA). La resina de níquel-ácido nitrilotriacético fue de Qiagen Inc (Chatsworth, CA), Q-Sepharose y benzamidina-Sepharose 4 Fast Flow de GE Healthcare (Piscataway, NJ).

Construcción, expresión y purificación de proteínas recombinantes

35 Se produjo una forma soluble de hepsina que comprende el dominio extracelular entero por uso de un sistema de expresión de baculovirus. Se construyó un ADNc de hepsina marcado con His secretado por fusión del ADNc que codifica la secuencia señal de melitina de abeja melífera (Met1-Tyr20) con el ADNc que codifica el dominio extracelular de hepsina humana (Arg45-Leu417). La construcción de ADNc final se insertó en un vector de expresión de baculovirus bajo el control de un promotor de poliedrina y se expresó en células T.in.Pro. Se purificó la hepsina por cromatografía de afinidad en níquel-ácido nitrilotriacético esencialmente como se ha descrito previamente (18). Se acondicionó medio que contenía hepsina con azida de sodio 1 mM, NaCl 0,3 M e imidazol 15 mM y se ajustó a pH 6,5 usando NaOH. Se añadió resina de níquel-ácido nitrilotriacético previamente cargada a medio (4 ml de resina/1 l de medio). La absorción de lotes se realizó agitando suavemente a 4 ºC durante 2 h. Después de dejar que la resina sedimentara durante 1 h, el sobrenadante se decantó y la resina se cargó en una columna. La columna se

45 lavó con un mínimo de 10 volúmenes de columna de PBS/NaCl 0,3 M a pH 7,4, a continuación seguido de 10 volúmenes de columna de imidazol 25 mM, NaCl 0,3 M, azida de sodio 1 mM a pH 8,0. Las proteínas se eluyeron con imidazol 250 mM, NaCl 0,3 M, azida de sodio 1 mM a pH 8,0. Las fracciones reunidas se purificaron adicionalmente usando tanto cromatografía de intercambio iónico sobre ión de Q-Sepharose FF como cromatografía de afinidad sobre una columna de benzamidina-Sepharose 4 Fast Flow.

El dominio de la proteasa matriptasa se expresó en E. coli y se purificó como se ha descrito previamente (20). Se expresaron recombinantemente HGFA y HAI-2 soluble y se purificaron como se ha descrito previamente (18, 20). La concentración del sitio activo de hepsina, matriptasa y HGFA se determinó usando el potente inhibidor del dominio de Kunitz KD1 derivado de HAI-1B, que se produjo en E. coli como se ha descrito previamente (21). Las

55 concentraciones de sitio activo se usaron para todos los ensayos enzimáticos. Para plasmina, se usó la concentración proporcionada por el proveedor (Haematologic Laboratories, Inc.).

Anticuerpo anti-hepsina monoclonal

Se hiperinmunizaron cinco ratones Balb/c (Charles River Laboratories, MA, EE.UU.) con hepsina soluble recombinante en adyuvante RIBI (Ribi Immunochem Research Inc., MO, EE.UU.). Se fusionaron linfocitos B de ganglios linfáticos de cinco ratones con células de mieloma de ratón (X63.Ag8.653; Colección Americana de Cultivos Tipo, MD, EE.UU.) como se ha descrito previamente (22). Después de 10 -14 días, los sobrenadantes se recogieron y se cribaron para la producción de anticuerpo con un ELISA de unión a hepsina. El clon 3H10 mostró alta inmuno65 unión y especificidad después de la segunda ronda de clonación de célula única por pocillo (Elite 1 Sorter, Beckman Coulter, CA, EE.UU.) y se aumentó de escala para la purificación en INTEGRA CELLine 1000 (Integra Biosciences,

E07798837

13-05-2015

AG, Suiza). El sobrenadante se purificó por cromatografía de afinidad en proteína A, se esterilizó por filtración y se guardó a 4 ºC en PBS. El isotipado con el kit mono-AB-ID SP (Zymed Laboratories, CA, EE.UU.) mostró que 3H10 es una IgG1 κ.

5 Producción de células LnCaP que expresan en exceso hepsina

Se obtuvo la línea celular de carcinoma de próstata humano, LnCaP-FGC (LnCaP), de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (ATCC, Manassas, VA) más 10 % de suero bovino fetal (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Se usó un clon de LnCaP que expresó establemente el gen de luciferasa de luciérnaga (LnCaP-luc) para experimentos de transfección de hepsina. Para establecer la línea celular LnCaP-luc, el gen de luciferasa se subclonó como un fragmento de ADNc EcoRI/XhoI insertado en el vector de expresión pMSCVneo (BD Biosciences-Clontech, Mountain View, CA). Las células LnCaP se transfectaron con la construcción de luciferasa usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células se seleccionaron con 500 µg/ml de geneticina (Invitrogen) y los clones se cribaron para actividad de bioluminiscencia usando el kit Luclite

15 (PerkinElmer, Boston, MA). El clon LnCaP-luc, que produjo la señal de luminiscencia más fuerte, se eligió para experimentos de transfección de hepsina.

Se insertó el ADNc de hepsina de longitud completa en un vector de expresión de mamífero que contenía el gen de resistencia a puromicina para la selección de antibióticos (Genentech, South San Francisco, CA). El clon LnCaP-luc se transfectó con la construcción que codifica hepsina de longitud completa con una marca Flag del extremo C y las células se seleccionaron con 0,5 µg/ml de puromicina (Sigma-Aldrich). Los clones se analizaron por FACS para la expresión superficial de hepsina usando un anticuerpo monoclonal anti-Flag (Sigma-Adrich). Se seleccionaron dos clones, el alto expresor de hepsina LnCaP-34 y el bajo expresor de hepsina LnCaP-17, para experimentos adicionales.

25 Para medir la expresión de hepsina total (= endógena y transfectada) sobre la superficie celular, suspensiones de células LnCaP-34 y LnCaP-17 en PBS/1 % (v/v) de FBS se incubaron con 10 µg/ml de anticuerpo 3H10 o sin anticuerpo (= control) durante 40 min sobre hielo. Las células se lavaron dos veces con PBS antes de la incubación con F(ab')2 de cabra anti-IgG de ratón conjugado con PE (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. PA, EE.UU.) diluido 1:1000 en PBS/1 % de FBS (v/v). Después de 30 min sobre hielo, las células se lavaron con PBS y los sedimentos de células se resuspendieron en 1 % de formalina (Richard Allen Scientific, MI, EE.UU.). Se midió la unión del anticuerpo en un FAGSscan (BD Biosciences, San Jose, CA).

Transcripción inversa-PCR en tiempo real

35 Se aisló ARN total de células LnCaP-17 y LnCaP-34 usando el kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA). El análisis de expresión génica se realizó por PCR con transcriptasa inversa en tiempo real (TaqMan) en un detector de secuencias modelo 7500 (ABI-Perkin Elmer, Foster City, CA). Para medir específicamente la hepsina endógena, los presentes inventores usaron cebadores que reconocían secuencias en 3' UTR del gen de hepsina. Para medir la hepsina total (= hepsina endógena más transfectada), los presentes inventores usaron cebadores que reconocían secuencias en ORF que es común para ambas hepsinas. Las secuencias de cebadores y sondas fueron las siguientes. Hepsina endógena: directo 5'-CCCTCCAGGGTCCTCTCT-3', inverso 5'-AGTCCCAGACAGCAGAACAATA-3', sonda 5'-(FAM) CAGCCCCGAGACCACCCAAC (TAMRA)-3'; hepsina total: directo 5'-GCTGTGTGGCATTGTGAGT-3', inverso 5'-TGAGTCTTTATGGCCTGGAA-3', sonda 5'-(FAM)

45 AAGCCAGGCGTCTACACCAAAGTCAC (TAMRA)-3'; matriptasa: directo 5'-CTTCGGAGCCTCCTCAGT-3', inverso 5'-GTCTCAGACCCGTCTGTTTTC-3', sonda 5'-(FAM) CCTCCGAGCCTGGGCTTCCT (TAMRA)-3'; GAPDH: directo, 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3', inverso 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3', sonda 5'-(FAM) CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC (TAMRA)-3. La transcripción inversa se llevó a cabo a 48 ºC durante 30 min seguido de activación por calor de AmpliTaq Gold a 95 ºC durante 10 min. El ciclo térmico avanzó con 40 ciclos de 95 ºC durante 0,5 min y 60 ºC durante 1 min. Todas las muestras se realizaron por duplicado. Los resultados se cuantificaron usando el método de la curva patrón según las instrucciones del fabricante (ABI-Perkin Elmer). Todos los niveles de expresión génica se normalizaron al gen de mantenimiento GAPDH.

Ensayos enzimáticos con HAI-2 y el inhibidor de molécula pequeña HI-10331

55 Se incubaron el inhibidor de sitio activo reversible HI-10331 (Genentech, Inc.) (que tiene la estructura molecular representada en la Figura 10, y desvelada en la patente de EE.UU. nº 6.472.393) o HAI-2 con hepsina 0,5 nM, matriptasa 0,5 nM y uPA 10 nM durante 30 min en tampón HEPES (HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, 0,01 % de Triton X-100) a temperatura ambiente. Se añadieron los sustratos cromogénicos S2366 (para hepsina), S2765 (para matriptasa) y S2444 (para uPA) a una concentración correspondiente a sus valores de Km respectivos, que se determinaron en experimentos separados. Después de la adición del sustrato, las tasas lineales del aumento en absorbancia a 405 nm se midieron en un lector de microplacas cinético (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

65 Para HI-10331, la concentración de inhibidor que dio el 50 % de inhibición de la actividad enzimática (CI50) se determinó ajustando los datos a una ecuación de cuatro parámetros (Kaleidagraph versión 3.6, Synergy Software,

E07798837

13-05-2015

Reading, PA). Los valores de Ki se calcularon según la relación Ki = CI50/(1 + [S]/Km) (23) usando los valores de CI50 y Km experimentalmente determinados para cada par de enzima-sustrato. Para HAI-2, los valores de Ki aparentes (Ki*) se determinaron ajustando los datos a la ecuación para la inhibición de la fuerte unión (24, 25).

5 Activación de pro-uPA por células LnCaP

Se lavaron células LnCaP-34 y LnCaP-17 confluentes con tampón HBSA-glucosa (HEPES 20 mM a pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, 0,05 mg/ml de BSA, glucosa 5 mM) y se añadieron 0,8 ml de pro-uPA 100 nM en tampón HBSA-glucosa previamente calentado a las capas de células. Se añadieron los inhibidores KD1 o HI-10331 para dar 10 concentraciones finales de 1 µM y 10 µM, respectivamente. Las placas de cultivo se mantuvieron a 37 ºC y se extrajeron muestras de 50 µl en diferentes momentos de tiempo, se complementaron con 0,2 ml de S2444 0,625 M en tampón HEPES y se midió el aumento en absorbancia a 405 nm en un lector de microplacas cinético. Los números de células se determinaron al final de los experimentos. La concentración de uPA formado en cada muestra se calculó a partir de una curva patrón de pro-uPA enzimáticamente convertido y se normalizó a 106 células. 15 Después de restar los niveles del ruido de fondo de uPA formado en ausencia de capa de células, se determinaron las tasas lineales de formación de uPA/106 células. La activación de pro-uPA fue estrictamente dependiente de la presencia de las células, ya que las muestras tomadas en diferentes momentos de tiempo no convirtieron ningún pro-uPA adicional. Por tanto, la actividad enzimática hacia S2444 de las muestras extraídas fue enteramente debida a la actividad de uPA y no a hepsina u otras proteasas liberadas de la superficie celular, ya que la actividad

20 cromogénica de las muestras no se inhibió mediante la adición del inhibidor de hepsina KD1, pero se inhibió completamente por el inhibidor de uPA PAI-1 (datos no mostrados).

Para los experimentos de inmunotransferencia, capas de células LnCaP-34 confluentes se lavaron como antes y se incubaron con pro-uPA 30 nM a 37 ºC. Después de 1 h, 3 h y 5 h se tomaron alícuotas y se añadieron

25 inmediatamente a tampón de muestra SDS. Las proteínas se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron sobre filtros de nitrocelulosa usando el sistema de transferencia Bio-Rad Semi Dry. Se visualizaron pro-uPA y uPA usando un anticuerpo policlonal de conejo anti-uPA (Cell Sciences; Canton, MA) seguido de anticuerpo anti-conejo conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratory; West Grove, PA) y potenciamiento por ECL (GE Healthcare; Piscataway, NJ).

30

Análisis de activación de pro-uPA y pro-tPA por SDS-PAGE

Se incubó pro-uPA a una concentración de 1,5 µM con hepsina 15 nM o plasmina 15 nM en tampón HEPES a temperatura ambiente. Después de 4 min y 60 min se tomaron alícuotas de la mezcla de reacción y se añadieron a

35 6x tampón de muestra SDS. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE usando un gel al 4-20 % de gradiente (Invitrogen; Carlsbad, CA). La proteína se visualizó después de la tinción con SimplyBlue Safe Stain (Invitrogen). Se llevaron a cabo idénticamente experimentos con pro-tPA (1,5 µM), excepto que el tampón usado fue fosfato de sodio 50 mM a pH 7,5, arginina 200 mM, 0,01 % de Tween-20.

40 Determinación de las constantes de velocidad de primer orden

Los valores de Km y kcat para la activación de pro-uPA no pudieron determinarse con exactitud debido a que la solución madre de pro-uPA del proveedor (0,8 mg/ml) no fue suficientemente alta. Por tanto, los presentes inventores eligieron determinar la constante de velocidad de primer orden k como una medida de la eficiencia de 45 conversión de pro-uPA. Se garantizó que la concentración de pro-uPA usada (30 nM) estaba en el intervalo de la cinética de primer orden para las enzimas probadas, es decir, hepsina, plasmina y matriptasa. La tasa de formación de uPA por estas enzimas fue lineal hasta 200 nM de pro-uPA. Se añadió pro-uPA (30 nM) a las enzimas (3 nM) en tampón HEPES para empezar la reacción a temperatura ambiente. En diversos momentos de tiempo se extrajeron alícuotas de 50 µl y se añadieron a 150 µl de HAI-2 667 nM (la concentración final en 250 µl fue 400 nM) en tampón 50 HEPES para detener la escisión de pro-uPA adicional. A la concentración usada, HAI-2 inhibe específicamente plasmina (26), HGFA (27), hepsina y matriptasa, pero no el uPA recientemente generado (Tabla 1). Los resultados de los presentes inventores sobre la inhibición por HAI-2 de plasmina y HGFA (datos no mostrados) estuvieron de acuerdo con los datos publicados (26, 27). Después de la adición de 50 µl de S2444 2,5 mM, se midió el aumento en la absorbancia a 405 nm en un lector de microplacas cinético. La concentración de uPA en cada alícuota se calculó

55 a partir de una curva patrón de pro-uPA enzimáticamente convertido. Los datos se expresaron como la disminución en la concentración de pro-uPA (log [pro-uPA]) en función del tiempo. La constante de velocidad de primer orden k se calculó a partir de la pendiente usando la ecuación

log [S]= -(k/2,3) t + log [S]0

60 en la que [S] es la concentración de pro-uPA y [S]0 es la concentración de pro-uPA inicial. Entonces se calculó la eficiencia catalítica, kcatlKm, usando la concentración de enzima conocida [E] y la relación k = (kcat/Km)[E]. Los valores son el promedio de 5 experimentos ± DE.

65

E07798837

13-05-2015

Cinética enzimática de uPA generado por escisión mediada por hepsina y plasmina de pro-uPA

Se convirtió completamente pro-uPA (30 nM) en uPA por hepsina 3 nM o plasmina durante una reacción de 2 h en tampón HEPES a temperatura ambiente. Los controles fueron hepsina 3 nM o plasmina en tampón HEPES sin pro5 uPA. Las alícuotas de muestra de uPA generadas por hepsina (uPAHepsina), por plasmina (uPAPlasmina) y sus controles respectivos se almacenaron a -20 ºC hasta el análisis posterior.

Para ensayos cromogénicos, muestras descongeladas se diluyeron 5 veces en tampón HEPES que contenía sustrato cromogénico de uPA S2444 (1 nM-1000 nM) y HAI-2 400 nM para inhibir las actividades de hepsina y plasmina. Las tasas iniciales de escisión de S2444 se midieron como el cambio de la absorbancia a 405 nm en un lector de microplacas cinético y se expresaron como µM de para-nitroanilida (pNA)/min usando un curva patrón de pNA. Las tasas de formación de pNA se presentaron en función de la concentración de S2444 y se determinaron Km y Vmáx después del ajuste de los datos a una ecuación de 4 parámetros (Kaleidagraph versión 3.6, Synergy Software).

15 Para los ensayos de activación de plasminógeno se usó un método de salto de dilución. La reacción se inició añadiendo plasminógeno 4 µM a un volumen igual de muestras diluidas 25 veces (UPAHepsina, uPAPlasmina y controles respectivos). Se tomaron alícuotas de las mezclas de reacción en diferentes momentos de tiempo y se diluyeron 51 veces en 0,5 mM del sustrato de plasmina S2366. Entonces, el aumento en la absorbancia a 405 nM se midió en un lector de microplacas cinético. Usando una curva patrón de plasmina se determinó la concentración de plasmina en cada alícuota y se calcularon las tasas iniciales de formación de plasmina.

Resultados

25 La escisión de pro-uPA por hepsina produce uPA enzimáticamente activo

La incubación de pro-uPA con hepsina produjo una escisión dependiente del tiempo de la forma monocatenaria en la forma bicatenaria que consistió en la cadena A de 20 kDa y la cadena B de 30 kDa (dominio de proteasa) (Fig. 1A). Ambas cadenas siguiendo estando unidas por disulfuro, como se muestra por la banda de proteína individual de 55 kDa bajo condiciones no reductoras (Fig. 1A). La secuencia del extremo N de la banda de 20 kDa fue 1SNELHQVPS9 (=cadena A) y la de la banda de 30 kDa fue 159IIGGEFTTIENQ170 (= cadena B), que indica que la hepsina generó la forma de alto peso molecular de uPA procesando pro-uPA en el sitio de escisión consenso Lys158 -Ile159. En concordancia, la escisión de pro-uPA por plasmina generó fragmentos idénticos y con un transcurso de tiempo similar a la hepsina. (Fig. 1A). La incubación prolongada de pro-uPA con hepsina no produjo la forma de bajo

35 peso molecular de 32 kDa de uPA (bajo condiciones no reductoras) (28), ni ningún producto de degradación visible. Pro-tPA, que está estructuralmente relacionado con pro-uPA, solo se escindió por plasmina, pero no por hepsina (Fig. 1B).

Para evaluar la función enzimática de uPA generado por hepsina, pro-uPA se convirtió completamente por hepsina (dando uPAHepsina) o por plasmina (dando uPAPlasmina) y a continuación se analizó en dos sistemas de ensayo, es decir, escisión del sustrato de pNA sintético pequeño S2444 y del sustrato macromolecular plasminógeno. Primero, la velocidad de reacción en función de la concentración de S2444 fue idéntica para uPAHepsina y uPAPlasmina (Fig. 2A). La Km determinada para uPAHepsina y uPAPlasmina fueron 34,1 ± 2,2 µM y 34,6 ± 1,5 µM (n =3; ± DE), respectivamente, y los valores de Vmáx fueron 1,74 ± 0,51 µM de pNA min-1 y 1,70 ± 0,51 µM de pNA min-1 (n =3; ± DE),

45 respectivamente. En segundo lugar, en ensayos de activación de plasminógeno (Fig. 2B), las tasas iniciales de generación de plasmina por uPAHepsina y uPAPlasmina fueron 29,3 ± 5,0 nM de plasmina min-1 y 26,4 ± 4,5 nM de plasmina min-1 (n = 3; ± DE), respectivamente. En ambos sistemas de ensayo, ninguno de los dos controles (=hepsina y plasmina apropiadamente diluidas) tuvo actividad (Fig. 2A, B).

Cinética enzimática de la activación de pro-uPA por hepsina, plasmina y matriptasa

Con el fin de comparar la eficiencia de hepsina para convertir pro-uPA con aquellos otros activadores de pro-uPA conocidos, tales como plasmina y otro miembro de la familia de TTSP, matriptasa (29, 30), los presentes inventores determinaron las constantes de velocidad de primer orden de la activación de pro-uPA. El uso del inhibidor de bi55 Kunitz HAI-2 permitió a los presentes inventores detener la reacción en diferentes momentos de tiempo y medir la generación de uPA dependiente del tiempo, debido a que HAI-2 es un potente inhibidor de plasmina (26), hepsina y matriptasa, pero no de uPA (Tabla I) (26). HGFA (31), que se sabe que solo activa pro-HGF, se usó como control negativo. Los resultados en la Figura 3 muestran la cinética de reacción de primer orden, que indica que la hepsina y la plasmina fueron igualmente de activas en el procesamiento de pro-uPA, mientras que la matriptasa escindió prouPA a una tasa significativamente menor. Durante el experimento, la hepsina y la plasmina convirtieron aproximadamente el 70 % de pro-uPA añadido. La constante de velocidad de primer orden determinada k, además de las eficiencias catalíticas calculadas (kcat/Km), se resumen en la Tabla II que muestra que la hepsina y la plasmina fueron activadores de pro-uPA aproximadamente 6 veces más eficaces en comparación con la matriptasa. La eficiencia catalítica de la plasmina determinada en los experimentos de los presentes inventores estuvo en el mismo 65 intervalo (1,9 -6,2 x 105 M-1 s-1) como se ha determinado por Lijnen et al. (32), Collen et al. (33) y Wolf et al. (34). Es difícil una comparación de la actividad de hepsina con otras enzimas conversoras de pro-uPA que incluyen triptasa

E07798837

13-05-2015

de mastocitos (35), triptasa ε (36), serina proteasa relacionada con linfocitos T (37), calicreína plasmática (38), calicreína-6 glandular de ratón (39), diversas catepsinas (40-42) y factor de crecimiento nervioso-γ (34), ya que no siempre se informaron las constantes cinéticas. En comparación con los casos en los que están disponibles datos sobre eficiencias catalíticas (kcat/Km), tales como triptasa ε (2,4 x 105 M-1 s-1) (36), triptasa de mastocito (2,4 x 103 M-1 s-1) (35), factor de crecimiento nervioso-γ (1,3 x 104 M-1 s-1) (34) y calicreína glandular (3,3 x 103 M-1 s-1) (39), la actividad de hepsina (kcat/Km 4,84 x 105 M-1 s-1) aparece muy alta.

Tabla I. Constantes de equilibrio de disociación para la interacción de HAI-2 y el inhibidor de hepsina de molécula pequeña HI-10331 con serina proteasas

Proteasa HAI-2 HI-10331 Ki * a-(nM) ± DE Ki (nM) ± DE

Hepsina 0,26 ± 0,04 41,6 ± 1,1 Matriptasa 0,85 ± 0,21 >10.000 u-PA >1.000 >10.000

a Ki*, constante de equilibrio de disociación aparente.

Tabla II. Constante cinética de activación de pro-uPA por hepsina, plasmina y matriptasa Enzima k (10-3 min-1) ± DE

kcat/Km(105 M-1 S-1) ± DE

Hepsina 87,1 ± 11,3 4,84 ± 0,63 Plasmina 81,5 ± 14,2 4,53 ± 0,79 Matriptasa 14,2 ± 4,9 0,79 ± 0,27

Activación de pro-uPA por hepsina expresada en la superficie celular

15 Con el fin de estudiar el procesamiento de pro-uPA sobre la superficie celular, los presentes inventores establecieron la línea celular de LnCaP LnCaP-34, que expresó establemente en exceso hepsina de longitud completa. Los niveles totales de ARN de hepsina fueron aproximadamente 9 veces superiores a aquellos de LnCaP-17, que solo expresaron hepsina endógena como se ha determinado por RT-PCR Taqman usando conjuntos específicos de cebador/sonda (Fig. 4A). Ni la expresión de hepsina endógena ni la expresión de matriptasa se cambió en las

20 células LnCaP-34 (Fig. 4A). Además, el anticuerpo anti-hepsina monoclonal 3H10 permitió a los presentes inventores detectar proteína hepsina sobre la superficie de células LnCaP. Este anticuerpo se produjo contra el dominio extracelular de hepsina soluble y reconoció específicamente proteína hepsina sobre células LnCaP, pero no sobre células HPAC, que no expresan ningún ARNm de hepsina detectable (datos no mostrados). Las células LnCaP-34 presentaron mayores niveles de expresión superficial de hepsina en comparación con las células LnCaP

25 17, de acuerdo con los diferentes niveles de ARNm (Fig. 4B). La intensidad media de fluorescencia de las células LnCaP-34 fue 5 veces superior a la de las células LnCaP-17, que indica que LnCaP-34 expresó aproximadamente 5 veces más hepsina sobre la superficie celular.

La actividad de la superficie celular de hepsina se midió incubando células LnCaP-34 con pro-uPA 30 nM durante 1

30 h, 3 h y 5 h a 37 ºC. La inmunotransferencia mostró una conversión dependiente del tiempo de pro-uPA en la forma de peso molecular alto como se indica por la aparición de una banda de 30 kDa (cadena B) y 20 kDa (cadena A) (Fig. 5A). Las dos cadenas estuvieron unidas por disulfuro como se muestra por la presencia de una única banda de 55 kDa bajo condiciones no reductoras, de acuerdo con los experimentos con hepsina soluble (Fig. 1A). La adición del inhibidor del dominio de Kunitz derivado de HAI-1B KD1 (21) inhibió fuertemente la escisión de pro-uPA (Fig.

35 5A).

Las tasas de formación de uPA por hepsina de la superficie celular se cuantificaron con un ensayo enzimático. Para medir la actividad de hepsina de la superficie celular, se añadió pro-uPA a las capas de células y se determinó la formación de uPA dependiente del tiempo. De acuerdo con los diferentes niveles de expresión de hepsina, las tasas

40 de formación de uPA fueron mayores para LnCaP-34 en comparación con LnCaP-17 (Fig. 5B, Tabla III). El inhibidor de KD1 casi inhibió completamente la escisión de pro-uPA por ambas líneas celulares (Fig. 5B, Tabla III). Como KD1 no inhibe uPA (21), no interfirió con la determinación de las concentraciones de uPA en la segunda etapa del ensayo.

45 Además de la hepsina, tanto LnCaP-34 como LnCaP-17 expresan el activador de pro-uPA matriptasa (Fig. 4A), que también puede inhibirse por KD1 (21). Para descubrir si la actividad de matriptasa contribuyó o no a la formación de uPA en este sistema, los presentes inventores usaron el inhibidor de molécula pequeña HI-10331, que inhibió la hepsina más de 200 veces más potentemente que la matriptasa, pero no interfirió con la actividad de uPA (Tabla I). Los presentes inventores encontraron que HI-10331 redujo las tasas de activación de pro-uPA por LnCaP-34 que

50 expresan en exceso hepsina casi al mismo nivel que KD1 (Tabla III), que indica que, en comparación con la hepsina, hubo poca actividad conversora de pro-uPA por matriptasa (<10 %). Por otra parte, sobre células LnCaP-17, que tuvieron una actividad conversora de pro-uPA aproximadamente 3 veces menor, la posible contribución por matriptasa fue más sustancial, ya que la tasa de escisión de pro-uPA permaneció a aproximadamente el 30 % de la tasa de control en presencia de HI-10331 (Tabla III).

55

E07798837

13-05-2015

Tabla III. Activación de pro-uPA por líneas de células LnCaP Clon de LnCaP Tasa de activación de pro-uPA por 106 células (nM de uPA h-1) ± DE

Control

KD1 1 µM HI-10331 10 µM

LnCaP-34

6,6 ± 1,9 0,2 ± 0,1 0,4 (0,4, 0,3)a

LnCaP-17

2,4 ± 0,9 0,2 ± 0,2 0,7 (0,8, 0,6)a

a Se muestran los resultados de dos experimentos separados entre paréntesis.

Discusión

5 La actividad conversora de pro-uPA informada en el presente documento de hepsina proporciona una base molecular para enlazar la expresión en exceso de hepsina con la progresión de cáncer de próstata. La propia hepsina no convierte directamente el plasminógeno en plasmina (18), sino que en su lugar amplifica la generación de plasmina activando pro-uPA. El uPA escinde proteolíticamente el plasminógeno a plasmina, que a su vez degrada los componentes de membranas basales y la matriz extracelular tanto directamente como indirectamente

10 activando metaloproteasas de la matriz latentes (43, 44). La asociación del sistema de activación del plasminógeno con la invasión y diseminación tumoral está muy bien documentada (43, 44). La hepsina también activa la forma latente del factor de crecimiento invasivo HGF (17,18), y tanto HGF como uPA participan en el crecimiento y metástasis de cáncer de próstata (45-48). Además, activando pro-HGF, la hepsina puede regular directamente los niveles locales de su sustrato pro-uPA, ya que se mostró que HGF inducía la transcripción de pro-uPA y síntesis de

15 proteínas (49, 50). Por tanto, la hepsina expresada en la superficie de células tumorales podría ser fundamental en orquestar las rutas invasivas en la superficie de separación tumor/estroma. Un concepto tal está de acuerdo con la progresión del tumor mediada por hepsina y la rotura de la membrana basal asociada en un modelo de ratón de cáncer de próstata (16).

20 La capacidad de la hepsina para activar pro-uPA, además de pro-HGF (17, 18), es parecida a la TTSP matriptasa (20, 29, 30), que al igual que la hepsina se expresa en exceso en cáncer de próstata y de ovario (51-55). Por tanto, la hepsina y la matriptasa pueden estar comprometidas en las funciones de solapamiento que contribuyen a la progresión del tumor. Su elevada expresión en tumores de próstata y de ovario no se iguala por HAI-1 (53-55), un inhibidor de bi-Kunitz que también se expresa sobre epitelio tumoral e inhibe potentemente ambas enzimas in vitro

25 (17, 18, 20, 56). En realidad, se informó que los niveles de expresión de HAI-1 durante la progresión del cáncer de próstata siguieron sin cambiar (54) o sin reducirse (55). En cualquier caso, esto produciría un desequilibrio de enzima:inhibidor que podría favorecer la progresión del tumor. Un ejemplo interesante que ilustra las consecuencias de un sistema de enzima:inhibidor desequilibrado es la expresión en exceso de matriptasa en la epidermis de piel de ratón, en la que normalmente la matriptasa y su inhibidor fisiológico HAI-1 se co-expresan de una manera regulada.

30 La expresión en exceso de matriptasa produjo la formación espontánea de lesiones neoplásicas, que podrían prevenirse completamente por la expresión en exceso simultánea del inhibidor HAI-1 (57). Claramente, hay importantes diferencias funcionales entre la matriptasa y la hepsina. Primera, a diferencia de la matriptasa, la expresión en exceso in vivo de hepsina en próstata de ratón no condujo a neoplasia espontánea (16). En segundo lugar, la matriptasa se expresa más ampliamente en tejidos normales y tumorales e interacciona en funciones

35 fisiológicas, tales como diferenciación de piel epidérmica (58), en la que no participa la hepsina. Sin embargo, la regulación por incremento concertada de ambas proteasas en cáncer de próstata y de ovario, combinada con sus especificidades de sustrato similares, sugiere una cooperación funcional en la progresión de cáncer.

La hepsina escindió específicamente pro-uPA en el enlace peptídico Lys158-Ile159 consenso para producir uPA de

40 alto peso molecular, que fue idéntico al material de uPA de referencia con respecto a la activación de sustrato sintético pequeño y macromolecular. Así, la hepsina convirtió pro-uPA en uPA completamente funcional con respecto a tanto la catálisis como la unión a receptor de uPA, ya que uPA de alto peso molecular contiene el sitio de unión a receptor localizado en EGF del extremo N y dominios Kringle (59). Debido a que los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo con una forma soluble de hepsina, fue importante evaluar si la conversión de pro-uPA se sintetizó

45 por hepsina de longitud completa sobre la superficie celular. Usando la línea celular LnCaP-34 que expresa en exceso hepsina, los presentes inventores fueron capaces de demostrar que, al igual que la hepsina soluble, la hepsina expresada sobre la superficie celular convirtió pro-uPA en uPA de alto peso molecular. De acuerdo con la mayor expresión de la proteína hepsina, la tasa de formación de uPA por células LnCaP-34 (6,6 nM de uPA h-1) fue aproximadamente 3 veces superior a la de células LnCaP-17, que expresan aproximadamente 5 veces menos

50 hepsina sobre la superficie. La matriptasa, que también se expresa por células LnCaP-34, no contribuyó significativamente a la generación de uPA. La menor actividad de matriptasa hacia pro-uPA en el sistema basado en células está muy de acuerdo con la eficiencia catalítica aproximadamente 6 veces menor determinada en ensayos de enzimas purificadas.

-

55 La eficiencia catalítica de hepsina para la conversión de pro-uPA fue sorprendentemente alta (kcat/Km 4,8 x 105 M-1 s 1), siendo similar a plasmina, que se considera el activador de pro-uPA más potente. Esto podría implicar que la hepsina es un activador de pro-uPA alternativo, equivalente a plasmina en lo que respecta a la eficiencia. Así, la hepsina se diferencia de pro-uPA convertasas menos potentes, que solo pueden desencadenar el sistema de plasminógeno/plasmina generando cantidades traza de plasmina para permitir la eficaz activación por

60 retroalimentación de pro-uPA.

E07798837

13-05-2015

Excepto por pro-uPA, todos los sustratos macromoleculares conocidos de hepsina tienen una Arg en la posición P1 (17-19), que está de acuerdo con los resultados de un estudio de cribado de bibliotecas de péptidos que mostró una fuerte preferencia de Arg con respecto a Lys como residuo de P1 (17). Aún, el reconocimiento dual de sustratos macromoleculares con Arg o con Lys en P1 no tiene precedente para las serina proteasas similares a tripsina, como 5 se ejemplifica por plasmina y calicreína plasmática. Podría construirse un modelo molecular de la secuencia de P4-P1 de pro-uPA (Pro-Arg-Phe-Lys) sin mayores dificultades usando la estructura de hepsina publicada con el tetrapéptido Lys-Gln-Leu-Arg-cmk (17), derivado de pro-HGF, en el sitio activo (Fig. 6). El simple ajuste de Pro-Arg-Phe-Lys en esta estructura de hepsina es imperfecto, y estaría de acuerdo con una afinidad reducida en comparación con la secuencia de pro-HGF. Por ejemplo, Lys en la posición P1 no puede hacer el mismo número de interacciones de enlace de H con el subsitio S1 que haría un residuo de Arg, un residuo Phe en la posición P2 requeriría un pequeño desplazamiento en el bucle 90s (Asn254) para hacer hueco para la cadena lateral más voluminosa y la sustitución de Lys en P4 con Pro elimina interacciones débiles con Glu252 y Asn254 (Fig. 6). Sin embargo, las hendiduras de unión a sustrato de las enzimas de la familia de tripsina no son rígidas, y muy probablemente está disponible un ajuste conformacional de baja energía que encajaría mejor la secuencia de pro

15 uPA. De hecho, dada la rápida renovación de pro-uPA por hepsina, debe hacerse una acomodación adecuada.

Tal razonamiento fracasa en explicar por qué otro zimógeno, pro-tPA, es un mal sustrato de hepsina, debido a que la secuencia de pro-tPA P4-P1 es un híbrido de aquellas de pro-HGF y pro-uPA (Tabla IV). En el razonamiento de la gran diferencia en la reactividad entre pro-uPA y pro-tPA como sustratos de hepsina, los presentes inventores llegan a la conclusión de que factores más allá de los residuos P4-P1 son probablemente responsables. Se presentan dos posibilidades. En primer lugar, hay un límite a cómo péptidos muy cortos representan proteínas intactas como sustratos enzimáticos, ya que las interacciones fuera de la hendidura de unión del sustrato formal (exositios) pueden influir en la renovación del sustrato. En segundo lugar, aunque sus efectos son menos pronunciados que los residuos en el lado del extremo N del enlace peptídico escindible, los residuos inmediatamente al extremo C al

25 enlace escindible también pueden influir en el procesamiento de sustrato. Aquí, los presentes inventores encuentran que pro-tPA tiene una Lys en la posición P2', en lugar de la casi siempre Val o Ile, entre otros miembros de la familia de tripsina. La naturaleza específica de las interacciones de sustrato/enzima en las posiciones P1' y P2' están mucho menos bien caracterizadas que en las posiciones P4-P1. Como resultado, es difícil saber si, o exactamente cómo, una Lys en P2' puede afectar las interacciones de sustrato-pro-tPA con hepsina. Sin embargo, es razonable especular que una Lys será malamente tolerada en cualquier parte en la que una Val o Ile tenga interacciones significativas.

Tabla IV. Secuencias del sitio de escisión de uPA, tPA y HGF

P4 P3 P2 P1 P1' P2' P3'

Pro-uPA P RFK I I G Pro-tPA P QFRI K G Pro-HGF K QL RV V N

35 En conclusión, la activación de pro-uPA por hepsina proporciona una base mecanística para explicar el desorden de la membrana basal observado en la próstata de ratón que expresa en exceso la hepsina (16). El reciente hallazgo, aunque se basa en un pequeño número de muestras, de que la proteína hepsina se expresa fuertemente en lesiones metastásicas al hueso y cáncer de próstata primario avanzado (12) puede indicar una función de la hepsina durante las etapas tardías de la enfermedad. Esto estaría de acuerdo con el requisito de factores de motilidad (por ejemplo, HGF) y degradación de la matriz (uPA/plasmina), que podrían estar influidos por la actividad enzimática de la hepsina. El reconocimiento de que la hepsina es un potente activador de pro-uPA y pro-HGF in vitro proporciona una infraestructura conceptual para investigar específicamente estas cuestiones in vivo. El reciente desarrollo de potentes inhibidores de hepsina basados en proteína, tales como anticuerpos monoclonales (12) e inhibidor del dominio de Kunitz derivado de HAI-1 (21), puede ayudar a confirmar la(s) función (funciones) exacta(s) de la hepsina

45 en cáncer.

Notas a pie de página

1TTSP, serina proteasa de transmembrana de tipo II; Kid1, dominio-1 de Kunitz derivado de HAI-1B; pNA, paranitroanilida; uPA, activador de plasminógeno de tipo urocinasa; tPA, activador de plasminógeno de tipo tisular; prouPA, forma de zimógeno de uPA; pro-tPA forma de zimógeno de uPA; HGF, factor de crecimiento de hepatocitos; pro-HGF, forma monocatenaria de HGF; HGFA, activador del factor de crecimiento de hepatocitos; tampón HBSAglucosa (HEPES 20 mM a pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, 0,05 mg/ml de BSA, glucosa 5 mM); tampón HEPES (HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, 0,01 % de Triton X-100).

55

Lista parcial de referencias

1.

Somoza, J. R., Ho, J. D., Luong, C., Ghate, M., Sprengeler, P. A., Mortara, K., Shrader, W. D., Sperandio, D., Chan, H., McGrath, M. E., and Katz, B. A. (2003) Structure 11(9), 1.123-1131

2.

Vu, T. K., Liu, R. W., Haaksma, C. J., Tomasek, J. J., and Howard, E. W. (1997) J Biol Chem 272(50), 3131531320

3.

Yu, I. S., Chen, H. J., Lee, Y. S., Huang, P. H., Lin, S. R., Tsai, T. W., and Lin, S. W. (2000) Thromb Haemost

5

15

25

35

45

55

65

E07798837

13-05-2015

84(5), 865-870

4. Wu, Q., Yu, D., Post, J., Halks-Miller, M., Sadler, J. E., and Morser, J. (1998) J Clin Invest 101(2), 321-326 . Tanimoto, H., Yan, Y., Clarke, J., Korourian, S., Shigemasa, K., Parmley, T. H., Parham, G. P., and O'Brien,

T. J. (1997) Cancer Res 57(14), 2884-2887

6. Dhanasekaran, S. M., Barrette, T. R., Ghosh, D., Shah, R., Varambally, S., Kurachi, K., Pienta, K. J., Rubin,

M. A., and Chinnaiyan, A. M. (2001) Nature 412(6849), 822-826

7.

Luo, J., Duggan, D. J., Chen, Y., Sauvageot, J., Ewing, C. M., Bittner, M. L., Trent, J. M., and Isaacs, W. B. (2001) Cancer Res 61(12), 4683-4688

8.

Magee, J. A., Araki, T., Patil, S., Ehrig, T., True, L., Humphrey, P. A., Catalona, W. J., Watson, M. A., and Milbrandt, J. (2001) Cancer Res 61(15), 5692-5696

9.

Stamey, T. A., Warrington, J. A., Caldwell, M. C., Chen, Z., Fan, Z., Mahadevappa, M., McNeal, J. E., Nolley, R., and Zhang, Z. (2001) J Urol 166(6), 2171-2177

. Stephan, C., Yousef, G. M., Scorilas, A., Jung, K., Jung, M., Kristiansen, G., Hauptmann, S., Kishi, T., Nakamura, T., Loening, S. A., and Diamandis, E. P. (2004) J Urol 171(1), 187-191

11.

Welsh, J. B., Sapinoso, L. M., Su, A. I., Kern, S. G., Wang-Rodriguez, J., Moskaluk, C. A., Frierson, H. F., Jr., and Hampton, G. M. (2001) Cancer Res 61(16), 5974-5978

12.

xuan, J. A., Schneider, D., Toy, P., Lin, R., Newton, A., Zhu, Y., Finster, S., Vogel, D., Mintzer, B., Dinter, H., Light, D., Parry, R., Polokoff, M., Whitlow, M., Wu, Q., and Parry, G. (2006) Cancer Res 66(7), 3611-3619

13.

Chen, Z., Fan, Z., McNeal, J. E., Nolley, R., Caldwell, M. C., Mahadevappa, M., Zhang, Z., Warrington, J. A., and Stamey, T. A. (2003) J Urol 169(4), 1316-1319

14.

Srikantan, V., Valladares, M., Rhim, J. S., Moul, J. W., and Srivastava, S. (2002) Cancer Res 62(23), 68126816

. Torres-Rosado, A., O'Shea, K. S., Tsuji, A., Chou, S. H., and Kurachi, K. (1993) Proc Natl Acad Sci U S A 90(15), 7181-7185

16.

Klezovitch, O., Chevillet, J., Mirosevich, J., Roberts, R. L., Matusik, R. J., and Vasioukhin, V. (2004) Cancer Cell 6(2), 185-195

17.

Herter, S., Piper, D. E., Aaron, W., Gabriele, T., Cutler, G., Cao, P., Bhatt, A. S., Choc, Y., Craik, C. S., Walker, N., Meininger, D., Hoey, T., and Austin, R. J. (2005) Biochem J 390(Pt 1), 125-136

18.

Kirchhofer, D., Peek, M., Lipari, M. T., Billeci, K., Fan, B., and Moran, P. (2005) FEBS Lett 579(9), 19451950

19.

Kazama, Y., Hamamoto, T., Foster, D. C., and Kisiel, W. (1995) J Biol Chem 270(1), 66-72

. Kirchhofer, D., Peek, M., Li, W., Stamos, J., Eigenbrot, C., Kadkhodayan, S., Elliott, J. M., Corpuz, R. T., Lazarus, R. A., and Moran, P. (2003) J Biol Chem 278(38), 36341-36349

21.

Shia, S., Stamos, J., Kirchhofer, D., Fan, B., Wu, J., Corpuz, R. T., Santell, L., Lazarus, R. A., and Eigenbrot, C. (2005) J Mol Biol 346(5), 1335-1349

22.

Hongo, J. A., Mora-Worms, M., Lucas, C., and Fendly, B. M. (1995) Hybridoma 14(3), 253-260

23.

Cheng, Y., and Prusoff, W. H. (1973) Biochem Pharmacol 22(23), 3099-3108

24.

Morrison, J. F. (1969) Biochim Biophys Acta 185(2), 269-286

. Olivero, A. G., Eigenbrot, C., Goldsmith, R., Robarge, K., Artis, D. R., Flygare, J., Rawson, T., Sutherlin, D. P., Kadkhodayan, S., Beresini, M., Elliott, L. O., DeGuzman, G. G., Banner, D. W., Ultsch, M., Marzec, U., Hanson, S. R., Refino, C, Bunting, S., and Kirchhofer, D. (2005) J Biol Chem 280(10), 9160-9169

26.

Delaria, K. A., Muller, D. K., Marlor, C. W., Brown, J. E., Das, R. C., Roczniak, S. O., and Tamburini, P. P. (1997) J Biol Chem 272(18), 12209-12214

27.

Kawaguchi, T., Qin, L., Shimomura, T., Kondo, J., Matsumoto, K., Denda, K., and Kitamura, N. (1997) J Biol Chem 272(44), 27558-27564

28.

Bachmann, F. (1994) Colman, R.W., Hirsh, J, Marder V.J. and Salzman, E.W., Editors (Lippincott Company, Philadelphia), 1592-1622

29.

Lee, S. L., Dickson, R. B., and Lin, C. Y. (2000) J Biol Chem. 275(47), 36720-36725

. Takeuchi, T., Harris, J. L., Huang, W., Yan, K. W., Coughlin, S. R., and Craik, C. S. (2000) J Biol Chem 275(34), 26333-26342

31.

Miyazawa, K., Shimomura, T., Kitamura, A., Kondo, J., Morimoto, Y., and Kitamura, N. (1993) J Biol Chem 268(14), 10024-10028

32.

Lijnen, H. R., Van Hoef, B., and Collen, D. (1987) Eur J Biochem 169(2), 359-364

33.

Collen, D., Zamarron, C., Lijnen, H. R., and Hoylaerts, M. (1986) J Biol Chem 261(3), 1259-1266

34.

Wolf, B. B., Vasudevan, J., Henkin, J., and Gonias, S. L. (1993) J Biol Chem 268(22), 16327-16331 . Stack, M. S., and Johnson, D. A. (1994) J Biol Chem 269(13), 9416-9419

36.

Yasuda, S., Morokawa, N., Wong, G. W., Rossi, A., Madhusudhan, M. S., Sali, A., Askew, Y. S., Adachi, R., Silverman, G. A., Krilis, S. A., and Stevens, R. L. (2005) Blood 105(10), 3893-3901

37.

Brunner, G., Vettel, U., Jobstmann, S., Kramer, M. D., and Schirrmacher, V. (1992) Blood 79(8), 2099-2106

38.

Ichinose, A., Fujikawa, K., and Suyama, T. (1986) J Biol Chem 261(8), 3486-3489

39.

List, K., Jensen, O. N., Bugge, T. H., Lund, L. R., Ploug, M., Dano, K., and Behrendt, N. (2000) Biochemistry 39(3), 508-515

. Goretzki, L., Schmitt, M., Mann, K., Calvete, J., Chucholowski, N., Kramer, M., Gunzler, W. A., Janicke, F., and Graeff, H. (1992) FEBS Lett 297(1-2), 112-118

41. Kobayashi, H., Schmitt, M., Goretzki, L., Chucholowski, N., Calvete, J., Kramer, M., Gunzler, W. A., Janicke, F., and Graeff, H. (1991) J Biol Chem 266(8), 5147-5152

5

10

15

20

25

30

E07798837

13-05-2015

42.

Nauland, U., and Rijken, D. C. (1994) Eur J Biochem 223(2), 497-501

43.

Andreasen, P. A., Kjoller, L., Christensen, L., and Duffy, M. J. (1997) Int J Cancer 72(1), 1-22

44.

Dano, K., Behrendt, N., Hoyer-Hansen, G., Johnsen, M., Lund, L. R., Ploug, M., and Romer, J. (2005) Thromb Haemost 93(4), 676-681

45.

Helenius, M. A., Saramaki, O. R., Linja, M. J., Tammela, T. L., and Visakorpi, T. (2001) Cancer Res 61(14), 5340-5344

46.

Knudsen, B. S., and Edlund, M. (2004) Adv Cancer Res 91, 31-67

47.

Sheng, S. (2001) Cancer Metastasis Rev 20(3-4), 287-296

48.

Van Veldhuizen, P. J., Sadasivan, R., Cherian, R., and Wyatt, A. (1996) Am J Med Sci 312(1), 8-11

49.

Ried, S., Jager, C., Jeffers, M., Vande Woude, G. F., Graeff, H., Schmitt, M., and Lengyel, E. (1999) J Biol Chem 274(23), 16377-16386

50.

Hall, C. L., Tsan, R., Mugnai, G., Mazar, A., Radinsky, R., and Pettaway, C. A. (2004) Prostate 59(2), 167176

51.

Jin, J. S., Hsieh, D. S., Loh, S. H., Chen, A., Yao, C. W., and Yen, C. Y. (2006) Mod Pathod 19(3), 447-452

52.

Johnson, M. D., Oberst, M. D., Lin, C. Y., and Dickson, R. B. (2003) Expert Rev Mol Diagn 3(3), 331-338

53.

Oberst, M. D., Johnson, M. D., Dickson, R. B., Lin, C. Y., Singh, B., Stewart, M., Williams, A., al-Nafussi, A., Smyth, J. F., Gabra, H., and Sellar, G. C. (2002) Clin Cancer Res 8(4), 1101-1107

54.

Riddick, A. C., Shukla, C. J., Pennington, C. J., Bass, R., Nuttall, R. K., Hogan, A., Sethia, K. K., Ellis, V., Collins, A. T., Maitland, N. J., Ball, R. Y., and Edwards, D. R. (2005) Br J Cancer 92(12), 2171-2180

55.

Saleem, M., Adhami, V. M., Zhong, W., Longley, B. J., Lin, C. Y., Dickson, R. B., Reagan-Shaw, S., Jarrard,

D. F., and Mukhtar, H. (2006) Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 15(2), 217-227

56.

Lin, C. Y., Anders, J., Johnson, M., and Dickson, R. B. (1999) J Biol Chem 274(26), 18237-18242

57.

List, K., Szabo, R., Molinolo, A., Sriuranpong, V., Redeye, V., Murdock, T., Burke, B., Nielsen, B. S., Gutkind, J. S., and Bugge, T. H. (2005) Genes Dev 19(16), 1934-1950

58.

List, K., Haudenschild, C. C., Szabo, R., Chen, W., Wahl, S. M., Swaim, W., Engelholm, L. H., Behrendt, N., and Bugge, T. H. (2002) Oncogene 21(23), 3765-3779

59.

Huai, Q., Mazar, A. P., Kuo, A., Parry, G. C., Shaw, D. E., Callahan, J., Li, Y., Yuan, C., Bian, C., Chen, L., Furie, B., Furie, B. C., Cines, D. B., and Huang, M. (2006) Science 311(5761), 656-659

60.

Petersen, L. C., Lund, L. R., Nielsen, L. S., Dano, K., and Skriver, L. (1988) J Biol Chem 263(23), 1118911195

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una molécula antagonista que inhibe la activación por hepsina del activador de plasminógeno de tipo pro

   urocinasa (pro-uPA) para su uso en un método para tratar cáncer en un sujeto, en donde la molécula antagonista 5 comprende:

   (i)

   un polipéptido que comprende una secuencia del dominio de Kunitz (KD);

   (ii)

   al menos una porción del inhibidor-1, -1B o -2 del activador del factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HAI-1, HAI-1B o HAI-2);

   10 (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencias con pro-uPA y que puede unirse a hepsina y que carece de un sitio de escisión de hepsina.
2. 2. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 1, en la que la

   secuencia del dominio de Kunitz (KD) comprende una secuencia del dominio 1 de Kunitz (KD-1). 15
3. 3. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 1, en la que la porción del inhibidor-1, -1B o -2 del activador del factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HAI-1, HAI-1B o HAI-2) comprende una secuencia del dominio de Kunitz (KD).

   20 4. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 3, en la que la secuencia del dominio de Kunitz (KD) es:

   (i) secuencia del dominio 1 de Kunitz (KD-1) del inhibidor-1, -1B del activador del factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HAI-1, HAI-1B), o variante de la misma; o

   25 (ii) uno o ambos de los dominios de Kunitz del inhibidor-2 del activador del factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HAI-2), o variante de los mismos.
4. 5. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 1, en la que un

   sitio de escisión de hepsina es el enlace peptídico Lys158-Ile159 de pro-uPA. 30
5. 6. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según las reivindicaciones 1 o 5, en la que la secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencias con pro-uPA y que puede unirse a hepsina y que carece de un sitio de escisión de hepsina carece de actividad de uPA.

   35
6. 7. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 6, en donde la molécula es un mutante en el que la cadena β está mutada o carece de al menos una porción de secuencia de uPA asociada a actividad.

   40 8. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la molécula está ligada a una toxina.
7. 9. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 8, en la que la

   toxina es un agente citotóxico. 45
8. 10. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el método comprende además administrar radiación o un agente quimioterapéutico.
9. 11. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según una cualquiera de las 50 reivindicaciones 1 a 10, en donde el cáncer es de próstata o de ovario.
10. 12. Una composición que comprende una molécula como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un vehículo, para su uso en tratamiento como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 u 11.

    55 13. La composición para su uso según la reivindicación 12, en la que el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable.

    56