JP6415827B2 - 紙装置を用いたトランスフェリンファミリータンパク質の検出 - Google Patents
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Description
1. 紙基材;
該紙基材上に形成された疎水性バリアにより規定される、蛍光が生成される感知領域;及び
該感知領域上に固定化された少なくとも1種のランタノイドイオン
を含む、体液中のトランスフェリンファミリータンパク質の定量装置。
2. 前記疎水性バリアにより規定される、サンプリング領域とマイクロ流路とをさらに含み、前記感知領域と前記サンプリング領域が前記マイクロ流路により連結されている、1記載の装置。
3. 前記疎水性バリアは、紫外線硬化疎水性インクのインクジェット印刷により形成される1又は2記載の装置。
4. 前記ランタノイドイオンが、La(III)、Eu(III)、Tb(III)及びYb(III)から成る群より選ばれる少なくとも1種である1〜3のいずれか1項に記載の装置。
5. 前記ランタノイドイオンがTb(III)である4記載の装置。
6. 前記紙基材上に固定化された、少なくとも1種のアルカリ金属炭酸水素塩をさらに含む1〜5のいずれか1項に記載の装置。
7. 前記アルカリ金属炭酸水素塩が、LiHCO3, NaHCO3及びKHCO3から成る群より選ばれる少なくとも1種である6記載の装置。
8. 前記トランスフェリンファミリータンパク質を含む体液試料と,1〜7のいずれか1項に記載の前記装置の前記感知領域とを接触させ;そして,該感知領域中に生成した蛍光信号を測定することを含む、トランスフェリンファミリータンパク質の定量方法。
9. 前記装置が、前記疎水性バリアにより規定される、サンプリング領域とマイクロ流路とをさらに含み、前記感知領域と前記サンプリング領域が前記マイクロ流路により連結されており、前記試料は前記サンプリング領域に適用される、8記載の方法。
10. 前記トランスフェリンファミリータンパク質が、血清トランスフェリン、オボトランスフェリン、ラクトフェリン及びメラノトランスフェリンから成る群より選ばれる8又は9に記載の方法。
11. 前記トランスフェリンファミリータンパク質が、ラクトフェリンである10記載の方法。
12. 前記体液が、全血、血漿、血清、尿、唾液、初乳及び涙液から成る群より選ばれる8〜11のいずれか1項に記載の方法。
13. 6記載の前記装置を用い、前記試料の適用後に前記少なくとも1種のアルカリ金属炭酸水素塩が前記少なくとも1種のランタノイドイオンと接触する8記載の方法。
材料。
塩化テルビウム六水和物(TbCl3・6H2O)およびヒトラクトフェリンはシグマアルドリッチ(セントルイス、ミズーリ州)より購入した。1, 10-デカンジオールジアクリレートは東京化成工業(東京、日本)より購入した。N-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)は同仁化学研究所(熊本、日本)より購入した。水酸化ナトリウムおよびポリビニルアルコールは関東化学(東京、日本)より購入した。ヒトラクトフェリンELISAキットはメルク(サンディエゴ、米国)より購入した。ヒト血清トランスフェリンおよびその他全ての試薬は和光純薬工業(大阪、日本)より購入した。全ての溶液は18 MΩのミリQ水を使い調製した。
蛍光スペクトルは、濃度0から1 mg/mLのラクトフェリンの他、100 μMのTbCl3(認識物質)および2.5 mMのNaHCO3(その他の検査物質)を溶解させたHEPES緩衝液(pH 7.4、50 mM)から測定した。ラクトフェリン―テルビウム錯体の形成を促進する炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)の代わりに、他の炭酸水素塩、例えば炭酸水素カリウム(KHCO3)を使用することもできる。試料溶液は290 nmのキセノンランプにより励起し、蛍光スペクトルは440から720 nmの範囲で観測し、この際、励起光の遮断のために420 nmのロングパスフィルター(シグマ光機、東京、日本)を併用した。励起および発光のスリット幅は4.5 nmで固定し、シグナルは励起光から90°回転した方向より測定した。
μPADのマイクロ流体構造のパターンは、インクジェットプリンターと紫外線硬化疎水性インクを用い、我々のグループが以前に報告した方法[20, 21]とほぼ同様に印刷した。円形に切り抜いたA4コピー用紙に円形のNo. 5Cの濾紙を貼り付け、紫外線硬化疎水性インクを充填したEPSONインクジェットプリンターに給紙した。紙の表面には、パワーポイント(マイクロソフト)で描いたマイクロ流体構造のパターンを印刷した。紫外線硬化疎水性インクが紙内部へ必要以上に浸透するのを防ぐため、印刷後に濾紙を10℃の冷却プレートの上に乗せ、紫外線硬化疎水性インクを重合するために紫外線を15分間照射した。紙の裏面には、表面のパターニングされた部分を完全に覆うように紫外線硬化疎水性インクを印刷し、冷却および10分間の紫外線照射を行った。次に、マイクロ流体構造がパターニングされた紙に、ラクトフェリン検出のための物質(認識物質およびその他の検査物質)を印刷した。μPADおよびその作製の模式図を図3に示す。まず、15%(v/v)のエチレングリコールを含む1 mMのTbCl3のHEPES緩衝液(pH 7.4、50 mM)を、感知領域に8回印刷した。続いて、ブロッキング処理のため、μPADsを0.5wt%のポリビニルアルコールのHEPES緩衝液(pH 7.4、50 mM)に5分間浸漬し、37℃にて20分間乾燥させた。最後に、25 mMのNaHCO3のHEPES緩衝液(pH 7.4、50 mM)を、サンプリング領域に12回印刷した。テルビウムおよびNaHCO3の最適な印刷回数は実験的に検討され、上述の回数が最適であると判断した(テルビウムは4-12回、NaHCO3は10-15回の範囲でそれぞれ検討を行った)。
本発明では、試料中ラクトフェリン濃度はラクトフェリン―テルビウム錯体の放つ緑色蛍光を用いて定量した。テルビウムと結合したラクトフェリンは、pHに依存した強度の蛍光(λmax = 548 nm)を放つことが報告されている[22]。一定量のラクトフェリンおよびテルビウムを含む溶液の蛍光発光強度は、pH6から7にかけて鋭い増加を示し、およそpH7.2において最大に達する。したがって、一定のpHにおいてラクトフェリン―テルビウム錯体の発する蛍光発光強度を観測することにより試料中ラクトフェリンを定量することができる。
ヒトラクトフェリン濃度を定量的に調べるために、2.5 μLの試料をサンプリング領域に適用した。この発明全体を通し、検量操作や検出を行う際、紙装置に適用する試料体積およびpHは、それぞれ2.5 μL、pH7.4が最適であった。完全に乾燥させたのち、μPADを暗室内で二つのUVハンドランプ(λex = 254 nm)の間に置き、520 nmのロングパスフィルターを装着したデジタルカメラを用いて、発せられる緑色蛍光を撮影した。フィルターは、紙基材に反射されたUVハンドランプの励起光を遮断するために用いた。撮影された画像は、解像度240 dpiのJPEG形式にて保存し、感知領域における緑色強度の数値(RGB表色系において0-255)を、画像解析ソフトImage J(国立衛生研究所)により定量した。蛍光発光信号を撮影するための実験装置は図4に示した。
ヒト涙液試料は、使い捨てのポリエチレンピペット(アズワン、大阪、日本)を使い当研究室の5人の健常な提供者から採取し、加圧滅菌器で処理したProtein LoBindチューブ(エッペンドルフ)内で4℃にて保存し、3日以内に使用した。開発したμPADsによるラクトフェリン濃度分析のため、希釈されていない涙液をサンプリング領域にマイクロピペットで適用した。比較のため、同一の涙液試料に含まれるラクトフェリン濃度をELISAキットによっても定量した。この際、ヒト涙液試料は使用前に、加圧滅菌器で処理したProtein LoBindチューブ内で、ELISAキット付属のサンプル希釈用緩衝液を使用して105倍に希釈した。これは、ELISAキットの応答濃度領域が5-50 ng/mLであるのに対し、ヒト涙液に含まれるラクトフェリンの平均的な濃度はおよそ2 mg/mLであることに因る。
ヒトトランスフェリン濃度を定量的に調べるために、2.5 μLの試料をサンプリング領域に適用した。完全に乾燥させたのち、μPADを暗室内で二つのUVハンドランプ(λex = 254 nm)の間に置き、520 nmのロングパスフィルターを装着したデジタルカメラを用いて、放たれる緑色蛍光を撮影した。フィルターは、紙基材に反射されたUVハンドランプの励起光を遮断するために用いた。撮影された画像は、解像度240 dpiのJPEG形式にて保存し、感知領域における緑色強度の数値(RGB表色系において0-255)を、画像解析ソフトImage J(国立衛生研究所)により定量した。蛍光発光信号を撮影するための実験装置は図4に示した。
ラクトフェリン濃度に対する蛍光発光強度の依存性
ラクトフェリン―テルビウム錯体の放つ蛍光発光強度のpH依存性は報告されているが[22]、ラクトフェリン濃度に対する依存性はこれまでに検討されていない。したがってまず概念実証のため、濃度0から1 mg/mLのラクトフェリンと2.5 mMのNaHCO3を含む、100 μMのTbCl3溶液の放つ蛍光を調べた。発明全体を通し、試薬をHEPES緩衝液(50 mM)に溶解することでpHを7.4に固定し、ヒト涙液の生理的pHに合わせた。ラクトフェリン―テルビウム錯体の蛍光発光スペクトル(図5)から、強度は試料のラクトフェリン濃度に依存することが明らかになった。図5に示されるテルビウム特有の発光スペクトルは549 nmで極大となるため、観測される蛍光発光は緑色を示す。
紙基材を使用することで、ヒト涙液に含まれるラクトフェリンを定量するための、抗体を必要とせず、安価で、使用が簡便、迅速な検出装置を初めて開発することに成功した。信号を得るまでに数時間におよぶ多くのピペッティングや洗浄、インキュベーションなどの操作を要するELISA法と異なり、μPADsによる分析で必要となる操作はマイクロピペッターによる試料の適用のみである。試料を適用してから、目視でも確認可能な蛍光信号を撮影するまでにかかる時間は15分以内である。簡便な操作手順や低い材料コストから、開発されたμPADsは、知識や技術のない人材でも涙液ラクトフェリンを定量することができる有用な装置として期待される。
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Claims (13)
- 紙基材;
該紙基材上に形成された疎水性バリアにより規定される、蛍光が生成される感知領域;及び
該感知領域上に固定化された少なくとも1種のランタノイドイオン
を含む、体液中のトランスフェリンファミリータンパク質の定量装置。 - 前記疎水性バリアにより規定される、サンプリング領域とマイクロ流路とをさらに含み、前記感知領域と前記サンプリング領域が前記マイクロ流路により連結されている、請求項1記載の装置。
- 前記疎水性バリアは、紫外線硬化疎水性インクのインクジェット印刷により形成される請求項1又は2記載の装置。
- 前記ランタノイドイオンが、La(III)、Eu(III)、Tb(III)及びYb(III)から成る群より選ばれる少なくとも1種である請求項1〜3のいずれか1項に記載の装置。
- 前記ランタノイドイオンがTb(III)である請求項4記載の装置。
- 前記紙基材上に固定化された、少なくとも1種のアルカリ金属炭酸水素塩をさらに含む請求項1〜5のいずれか1項に記載の装置。
- 前記アルカリ金属炭酸水素塩が、LiHCO3、NaHCO3及びKHCO3から成る群より選ばれる少なくとも1種である請求項6記載の装置。
- 前記トランスフェリンファミリータンパク質を含む体液試料と,請求項1〜7のいずれか1項に記載の前記装置の前記感知領域とを接触させ;そして,該感知領域中に生成した蛍光信号を測定することを含む、トランスフェリンファミリータンパク質の定量方法。
- 前記装置が、前記疎水性バリアにより規定される、サンプリング領域とマイクロ流路とをさらに含み、前記感知領域と前記サンプリング領域が前記マイクロ流路により連結されており、前記試料は前記サンプリング領域に適用される、請求項8記載の方法。
- 前記トランスフェリンファミリータンパク質が、血清トランスフェリン、オボトランスフェリン、ラクトフェリン及びメラノトランスフェリンから成る群より選ばれる請求項8又は9に記載の方法。
- 前記トランスフェリンファミリータンパク質が、ラクトフェリンである請求項10記載の方法。
- 前記体液が、全血、血漿、血清、尿、唾液、初乳及び涙液から成る群より選ばれる請求項8〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項6記載の前記装置を用い、前記試料の適用後に前記少なくとも1種のアルカリ金属炭酸水素塩が前記少なくとも1種のランタノイドイオンと接触する請求項8記載の方法。
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