CN111108126A - 血清白蛋白结合剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含免疫球蛋白可变结构域的多肽，其以高亲和力与血清白蛋白结合以增加治疗剂和组合物的半衰期，尤其对于包含多特异性免疫球蛋白可变结构域的治疗剂如此。本文中还提供用于产生包含血清白蛋白结合性免疫球蛋白可变结构域的本发明多肽的方法。
Description
技术领域
本发明涉及包含免疫球蛋白可变结构域的多肽，其以高亲和力与血清白蛋白结合以增加治疗剂和组合物的半衰期，尤其对于包含多特异性免疫球蛋白可变结构域的治疗剂。本文中还提供用于产生包含血清白蛋白结合性免疫球蛋白可变结构域的本发明多肽的方法。
背景
正在开发数目日益增长的蛋白质治疗剂，如单克隆抗体、抗体片段和疫苗、激素、生长因子、细胞因子、凝血因子、酶、融合蛋白和其他蛋白质，除了完整抗体和Fc-融合蛋白外，它们当中许多具有低于50kDa的分子质量、由肾过滤和降解作用快速清除，导致血浆半衰期短。为了确保治疗效果，这个缺点要求高且频繁的给药，因而伴随可观的不利副作用，这尤其有损于频繁全身性施用治疗剂(例如，针对糖尿病的胰岛素或患有多发性硬化患者中干扰素药物)的患者。半衰期延长策略的研究日益受到生物技术和制药业注意，原因在于治疗益处以及经济益处明显。
因为通过新生Fc受体(FcRn，Brambell受体)的再循环机制(Chaudhury等人,2003；Roopeni和Akilesh,2007)，一些血浆蛋白如血清白蛋白和IgG分子具有2–4周范围内的异乎寻常的长半衰期(Kontermann,2009)。细胞摄取的白蛋白和IgG在早期内体的酸性环境下按pH-依赖性方式与FcRn结合。这种结合使白蛋白和IgG在溶酶体区室中偏转免遭降解并使其重定向到胞质膜，在那里，它们被释放回血浆，原因在于中性pH。这种机制已经开发用来扩展蛋白质的半衰期，例如，通过融合于白蛋白或IgG的Fc区。血清白蛋白也可以通过有能力与白蛋白非共价相互作用的模块，参与半衰期延长。在这些方案中，白蛋白结合性部分与治疗性蛋白缀合或遗传融合。已经使用广泛类型的不同部分，其包括对白蛋白具有内在亲和力的分子，还包括经生成和选择以显示出白蛋白结合活性的其他分子如肽、抗体片段、备选支架和小化学物。
驼类(camelid)产生缺少轻链的有功能抗体(Hamers-Casterman等人,1993)，其具有单一N端结构域(VHH，也称作
)，在不需要结构域配对的情况下结合抗原。这类VHH带来有意义的治疗可能性，原因在于其尺寸小、稳定性高、易于通过遗传融合修饰和在微生物中生产水平良好。但是，VHH的小尺寸也是一个治疗缺点，因为施用至患者时，它们从循环中快速清除。在另一方面，这也提供了将它们偶联于半衰期延长分子或偶联于特异性药物(例如形成抗体-药物缀合物)或示踪剂的机会。本领域描述了多种偶联方法(例如，尤其适用于单克隆抗体修饰领域)并且这些技术例如着重于分别通过酰化或烷基化，借助伯胺基(赖氨酸残基和N末端)或借助半胱氨酸缀合。
在小鼠和大鼠中，血清白蛋白的天然半衰期是大约1.5-2.5天，并且已经显示不同血清白蛋白结合剂表现出可比性的半衰期，即大约2天。一种对小鼠白蛋白特异的
与两种拮抗性抗EGFR
融合，生成双特异性三价分子，并且将半衰期从1小时增加至44小时，并在动物模型中有效地延迟EGFR-阳性肿瘤生长物(Roovers等人,2007)。然而就临床前研究而言，大鼠的代谢生理学相比小鼠更接近于人类，这使大鼠成为研究药物的药代动力学/药效动力学特征和人体毒理学的更好物种。此外，如与小鼠相比，大鼠的较大尺寸允许复杂的外科操作，并且较大的血液量/CSF和组织允许最佳的实验读出。基因修饰的大鼠模型现在还使得药物疗效和安全性研究成为可能，因而临床前研究中使大鼠比小鼠更有内在转化，以进行相同品系和物种中的安全性研究如功效。如例如Hoefman等人(2015)研究，白蛋白结合物在不同物种如啮齿类、灵长类和人类中的半衰期对功效研究中允许最佳给药和实现所需的暴露量及允许更可靠地预测跨物种暴露量至关重要。因此，显然重要的是，不仅依赖于血清白蛋白结合性蛋白在其治疗目标物种(即人类)中的半衰期，对临床前开发环境下每个目的动物物种中的白蛋白而言也显然重要。将不仅有利的是，找到对人白蛋白有足够高的亲和力的血清白蛋白结合剂或多肽，以扩展治疗性蛋白的半衰期；还将有利的是，鉴定在频繁使用的检验用动物(如啮齿类)中具有最高亲和力或最长半衰期的那些血清白蛋白结合剂，以增加成功率和临床前结果的可转化性。
VHH有利于治疗性靶向，这是因为它们作为单价结构物或作为多价或多特异性结构的尺寸小，及它们通过与靶向血清白蛋白抗原的VHH融合，扩展治疗性蛋白半衰期的可能性。血清白蛋白结合性VHH的另一个实例由Ablynx N.V.(WO 2004/041865和WO2006/122787)提供，其描述了针对血清白蛋白和尤其针对人血清白蛋白的纳米抗体，所述纳米抗体可以连接于其他(治疗性)蛋白质(如一种或多种针对所需靶的其他
)，以增加所述(治疗性)蛋白质在患者中的半衰期。
从而总而言之，血清白蛋白结合性VHH将令人有兴趣增加治疗性蛋白(也可能是VHH，作为血清白蛋白结合性VHH的融合配偶体)的半衰期，不仅在人类中如此，在试验物种中也如此，以允许在非人灵长类中的更大型研究或随访临床研究之前更广泛地采集临床前数据。这种血清白蛋白结合性VHH将允许更可靠和更易开发新治疗剂。并且，由于还显示VHH作为抗体-药物缀合物可用于例如肿瘤靶向中(Fang等人,2016)，故而以下是想要的：鉴定在不妨碍结合功能情况下可以与血清白蛋白缀合的特定VHH并且理想地鉴定所述两个特征的组合以增进新治疗剂的高效研发。最后，针对治疗性用途待开发的VHH还应当就其生物化学特性而言是合适的。
发明概述
本发明涉及产生和表征新的VHH，其结合血清白蛋白并且当突变互补决定区(CDR)之一中存在的糖基化位点时，令人惊讶地保留其血清白蛋白结合亲和力，并且另外展示出极高的大鼠血清白蛋白亲和力。另外，所述新的血清白蛋白结合性VHH具有高的抗体-药物缀合物(ADC)潜力，因为在偶联引入的赖氨酸和缀合物后，尽管在CDR1中产生丝氨酸至赖氨酸突变，保留其血清白蛋白结合亲和力，因此保留体内半衰期延长能力。
本发明的第一方面涉及包含免疫球蛋白可变结构域(IVD)的多肽，其中所述IVD以高亲和力与血清白蛋白结合，如通过Biolayer Interferometry所测定，其中所述IVD包含遵循共同结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的氨基酸序列，并且其中如SA1_S30K VHH(SEQ ID NO:4)或其人源化变体(h1至h4：SEQ ID NOs:8-11；图5)中存在的CDR1区、CDR2区和CDR3区代表3个互补决定区(CDR)。在图1中，显示根据SA1_S30K的CDR区注释。尤其，依据Chothia、AbM、MacCallum或IMTG法确定所述CDR区。在一个实施方案中，特异性的血清白蛋白亲和力针对人血清白蛋白并且备选地针对大鼠、小鼠和食蟹猴血清白蛋白。在一个实施方案中，多肽包含这样的IVD，其中CDR由针对CDR1的SEQ ID NO:1的氨基酸序列；针对CDR2的SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和针对CDR3的SEQ ID NO:3的氨基酸序列限定。
在又一个实施方案中，本发明多肽包含一种IVD，其中CDR如本文所述那样定义，并且其中FR3区由SA1_S30K的FR3区或SA1_S30K的人源化变体的FR3氨基酸序列限定，其中根据所应用的注释限定FR3区(图1)，并且其中该IVD的位置73和74可以是任何氨基酸，其中位置78可以是V或L，其中位置79是H或Y，和/或位置82b是T或S(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，根据AbM的注释限定FR3序列，与SEQ ID NO:18对应，并且其中位置74是S，位置79是Y，和/或位置82b是S。
在另一个实施方案中，包含血清白蛋白结合性IVD的所述多肽涉及包含SA1_S30K(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的IVD或其人源化变体。
另一个实施方案涉及包含本发明所述IVD的多肽，其中FR3氨基酸序列在位置79处是酪氨酸(Y)和/或在位置82b处是丝氨酸(S)(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，多肽包含了包含具有所述FR3氨基酸序列的氨基酸序列的IVD，所述IVD是SA1_S30K(或SEQ ID NO:4)的人源化变体。在一个具体实施方案中，本发明的多肽包含分别如SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17中所述的SA1_S30K的人源化变体h1至h7。更具体地，SA1_S30K可以备选地借助至少一个以下置换来人源化，或所述人源化变体可以进一步包含以下至少一个额外置换：位置1处置换成E或D、位置5处置换成V、位置14处置换成P、位置73处置换成任何氨基酸、位置74处置换成任何氨基酸、位置78处置换成L或位置108处置换成L(根据Kabat编号；还展示于图5中(‘备选性h’))。在一个具体实施方案中，包含所述血清白蛋白结合性IVD的所述多肽是IVD缀合物，其中所述IVD是借助CDR1中存在的、更具体地如SEQ ID NO:1的位置1处所示的赖氨酸残基与所述缀合物偶联。在一个更具体的实施方案中，所述缀合物是药物。
一个实施方案涉及本发明的所述多肽，其用于增加治疗用部分的半衰期。备选的实施方案涉及血清半衰期增加的治疗剂，特征在于所述药剂包含本发明的多肽和治疗用部分，其中如与无本发明多肽情况下的药剂相比，治疗剂的血清半衰期较长。另一个实施方案将本发明的多肽或包含本发明多肽的治疗剂用作药物。
在第二方面，本发明涉及多特异性构建体，其包含了包含所述血清白蛋白结合性免疫球蛋白可变结构域(IVD)的所述多肽和至少一个治疗用部分。另一个实施方案涉及所述的多特异性构建体，其中治疗用部分包含IVD或其片段。在一个更具体的实施方案中，治疗用部分包含免疫球蛋白单一可变结构域或其片段。甚至更具体地，在一个实施方案中，所述多肽经接头或间隔序列与至少一个治疗用部分连接。
本发明的另一个方面提供编码本发明多肽或多特异性构建体的核苷酸序列或核酸。其他实施方案涉及包含本发明多肽、多特异性构建体或核苷酸序列或核酸的宿主细胞。
另外实施方案公开了一种药物组合物，其包含至少一种如本文所述的多肽、多特异性构建体或治疗剂，和任选地至少一种可药用载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的最后方面涉及一种产生血清白蛋白结合性多肽的方法，所述方法包括步骤：i)在合适的表达系统中重组表达所述多肽、所述多特异性构建体或所述核苷酸序列或核酸，和ii)分离或纯化所述表达的血清白蛋白结合性多肽，以获得包含所述白蛋白结合性IVD的所述血清白蛋白结合性多肽。
附图描述
所述附图仅为示意性并且是非限制的。在附图中，出于说明目的，某些要素的尺寸可能夸大并且未按比例绘制。
图1：血清白蛋白结合性SA1_S30K VHH的氨基酸序列和CDR注释。
显示氨基酸的Kabat编号，并且如MacCallum等人,J.Mol.Biol.(1996)262,732–745中所述，基于接触分析和结合位点形貌展示CDR。还展示与备选性CDR注释(AbM、Chothia、Kabat、IMGT)相对应的区域。
图2：显示生物素化的SA1、Alb8和SA1_S30K与人血清白蛋白结合的ELISA。
图3：小鼠中SA1_S30K VHH的药代动力学特征。
小鼠中按照10mg/kg静脉内(iv)或腹膜内(ip)注射时VHH-GFP-SA1_S30K的血浆浓度。
图4：纯化的SA1_S30K人源化VHH变体的SDS-PAGE分析。
5μg加载的Nb的考马斯染色凝胶。从左至右：Thermo Pageruler预染标志物、纯化的SA1_S30K h1、h2、h3、h4 VHH(分别是带附加Hi标签的SEQ ID NO:8、9、10、11)。
图5：SA1_S30K VHH和人源化变体的比对结果。
如图1中注释，以灰色显示CDR区。SA1_S30K的氨基酸序列根据Kabat编号。与SA1_S30K的序列的比对结果中显示人源化变体SA1_S30K_h1至h4(分别与SEQ ID NOs:8-11相对应的h1、h2、h3、和h4)中的氨基酸置换。另外，在作为'备选h'所示的线中显示可能的替代性人源化位置/置换，附带这条线中所展示置换的任何组合，连同上文展示的任何序列(SA1_S30K、h1至h4)，所述任何序列包含SA1_S30K(SEQ ID NO:4)的或SA1_S30K_h1(SEQ ID NO:8)、SA1_S30K_h2(SEQ ID NO:9)、SA1_S30K_h3(SEQ ID NO:10)、SA1_S30K_h4(SEQ ID NO:11)的(又一)人源化变体。
图6：与人参考共有序列比较的人IGHV3种系等位基因的比对。
本文中比较了IGHV3-30、IGHV3-33、IGHV3-NL1、IGHV3-9、IGHV3-25、IGHV3-43和IGHV3-20的等位基因(相对应于本申请中的氨基酸序列SEQ ID NO:19至157)。序列见于IMGT数据库中或免疫球蛋白FactsBook(Lefranc和Lefranc,San Diego,CA,AcademicPress,2001)中。
发明详述
将根据具体实施方案并参考某些附图来描述本发明，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求书来限定。权利要求中的任何附图标记不应被解释为限制范围。当然，应当理解，根据本发明的任何具体实施方案，并无必要可以实现所有方面或优点。因此，例如，本领域技术人员将认识到，本发明可以以实现或优化本文所教导的一个优点或一组优点的方式实施或实现，而不必实现本文所教导或建议的其他方面或优点。
当结合附图阅读下面的详细描述时，可以最好地理解本发明的组织和操作方法以及其特征和优点。参考下文描述的实施方案，本发明的各方面和优点将变得显而易见并得到阐明。在整个说明书中，提到“一个实施方案”或“实施方案”，是指结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性将包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书中各处出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”无需，但可以，均指相同实施方案。类似地，应当理解，在本发明的示例性实施方案的描述中，有时将本发明的多种特征组合在单个实施方案、附图或其描述中，以简化公开并帮助理解多个发明方面中的一个或多个。然而，该公开方法不应解释为反映了这样一种意图，即所要求保护的发明需要比每个权利要求中明确叙述的特征更多的特征。相反，如所附权利要求所反映的，发明方面具有的特征可以少于单个之前公开的实施方案的所有特征。
在提及单数名词时使用不定冠词或定冠词的地方，例如“一”或“一个”，“该”，除非特别说明，否则包括该名词的复数形式。在本说明书和权利要求书中使用术语“包括”时，其不排除其他元素或步骤。此外，说明书和权利要求书中的术语第一，第二，第三等用于区分相似的元件，而非一定用于描述顺序或时间顺序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施方案能够以不同于本文描述或示出的其他顺序来操作。提供以下术语或定义仅用于帮助理解本发明。除非本文特定限定，否则本文使用的所有术语具有与本发明领域的技术人员所理解的相同的含义。本领域技术人员尤其可以参考Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，第四版，冷泉港出版社，纽约州普莱恩斯维尤(2012年)；和Ausubel等人，《现代分子生物学实验方案》(增刊114)，约翰·威利父子出版社，纽约(2016年)，以了解本领域的定义和术语。本文所提供的定义不应被解释为具有小于本领域普通技术人员所理解的范围。
定义
当涉及诸如量、持续时间之类的可测量值时，本文所用的“约”意在包括距规定值±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，且还更优选±0.1％的变化，只要这样的变化适合于执行所公开的方法。
如本文所用，“核苷酸序列”，“DNA序列”，或“核酸分子”是指,核苷酸(即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的任何长度的聚合形式。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括双链和单链DNA以及RNA。它还可以包括已知类型的修饰，例如甲基化、“帽子”、一个或多个天然存在的核苷酸用类似物的取代。“编码序列”是核苷酸序列，当置于适当调节序列的控制下时，其可以转录成mRNA和/或翻译成多肽。编码序列的边界由5'-末端的翻译起始密码子和3'-末端的翻译终止密码子确定。“编码序列”可以包括但不限于mRNA，cDNA，重组核苷酸序列或基因组DNA，而内含子在某些情况下也可以存在。如此处所用的“基因”包括基因的启动子区以及编码性序列。它既指基因组序列(包含可能的内含子)，又指从剪接的信使衍生的cDNA，其与启动子序列有效连接。
术语“蛋白质”、“多肽”、“肽”可互换地在本文中进一步用来指氨基酸残基(本文中以三字母代码或单字母代码显示，根据标准代码，每个3字母或1字母命名一个氨基酸残基)及其变体和合成性类似物的聚合物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸(如相应天然存在的氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物。这个术语还包含多肽的翻译后修饰，如糖基化、磷酸化和乙酰化。“蛋白质结构域”是蛋白质中迥异的功能单元和/或结构单元。通常，某蛋白质结构域负责特定功能或相互作用，促进蛋白质的总体作用。结构域可以存在在多种生物学背景下，其中相似的结构域可以见于不同功能的蛋白质中。“重组多肽”意指使用重组技术(即，通过表达重组或合成性多核苷酸)产生的多肽。当重组地产生嵌合多肽或其生物学活性部分时，它还优选地基本上不含培养基，即，培养基占所述蛋白质制备物的体积少于约20％、更优选小于约10％并且最优选小于约5％。“分离的”或“纯化的”意指这样的材料，所述材料大体上或基本上不含其天然状态下通常伴随它的组分。例如，如本文所用，“分离的多肽”或“纯化的多肽”指这样的多肽，所述多肽已经从天然存在状态侧接其的分子纯化，例如，包含血清白蛋白结合性IVD蛋白的蛋白质，所述蛋白质已经从生产宿主中存在的与所述已分离蛋白质毗邻的分子中取出。也可以通过氨基酸化学合成法产生或通过重组产生法产生这种分离或纯的蛋白质。
术语“融合蛋白”指通过以下方式产生的蛋白质：将两个或更多个不同(多)肽或蛋白质连接、优选地头-对-尾(即，N末端至C末端或反之亦然)方式连接，产生具有从每种原始蛋白质衍生的功能特性的单一蛋白。如本文所用，术语“融合于”尤其指遗传融合，例如，通过重组DNA技术遗传融合。可以在两种蛋白质之间直接产生融合或可以经接头产生融合。
如本文所用，术语“可检测标记物或标签”指允许检测和/或分离、纯化和/或固定已分离或纯化的本文所述(多)肽的可检测标记物或标签并且意在包括本领域已知用于这些目的的任何标记物/标签。特别优选亲和标签，如壳多糖结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、多(His)(例如，6x His或His6)、链霉亲和素-
链霉亲和素-
和Twin-链霉亲和素-
增溶标签，如硫氧还蛋白(TRX)、多(NANP)和SUMO；色谱标签，如FLAG标签；表位标签，如V5标签、myc标签和HA标签；荧光标记物或标签(即，荧光物质(fluorochrome)/萤光团)，如荧光蛋白(例如，GFP、YFP、RFP等)和荧光染料(例如，FITC、TRITC、香豆素和花青)；发光标记物或标签，如萤光素酶；和(其他)酶标记物(例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、尿素酶或葡萄糖氧化酶)。还包括前述标记物或标签中任意者的组合。分离的(多)肽可以例如融合或缀合于半衰期延长模块，或可以本身作为半衰期延长模块发挥作用。这类模块是本领域技术人员已知的并且例如包括白蛋白、白蛋白结合性结构域、免疫球蛋白Fc区/结构域、免疫球蛋白结合性结构域、FcRn结合基序和聚合物。特别优选的聚合物包括聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、透明质酸、聚唾液酸和PEG-模拟物肽序列。阻止已分离(多)肽聚集的修饰也是技术人员已知的并且例如包括将一个或多个疏水性氨基酸、优选地表面暴露的疏水性氨基酸置换为一个或多个亲水性氨基酸。在一个实施方案中，分离的(多)肽或其免疫原性变体或前述任一者的免疫原性片段包含亲水性氨基酸对多达10、9、8、7、6、5、4、3或2、优选地5、4、3或2个疏水性氨基酸、优选地表面暴露的疏水性氨基酸的置换。优选地，分离的(多)肽的其他特性，例如，其免疫原性，不受这类置换损害。
术语“野生型”指从天然存在来源分离的基因或基因产物。野生型基因是在群体中最频繁观察到并且因此任意指定为该基因的“正常”或“野生型”形式的那种。相反，术语“修饰的”、“突变体”或“变体”指与野生型基因或基因产物相比时，显示序列修饰、翻译后修饰和/或功能特性(即，改变的特征)的基因或基因产物。注意到，可以分离天然存在的突变体；依据以下事实鉴定这些突变体：与野生型基因或基因产物相比时，它们具有改变的特征。
如本文所用的术语“氨基酸同一性”指序列基于氨基酸对氨基酸在比较窗口范围内相同的程度。因此，通过以下方式计算“序列同一性百分数”：在比较窗口范围内比较两个最佳比对的序列；确定其中相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)在两个序列中出现的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数(即，窗口大小)并且将结果乘以100以产生序列同一性百分数。如本文所用，如与亲本蛋白或其片段的氨基酸序列或核苷酸序列相比，“置换”或“突变”因一个或多个氨基酸或核苷酸分别由不同的氨基酸或核苷酸替换所致。可以理解，蛋白质或其片段可以具有基本上不影响蛋白质活性的保守性氨基酸置换。
“结合”意指任何相互作用，无论它是直接或间接的。直接相互作用提示结合配偶体之间的接触。间接相互作用意指任何相互作用，其中借此相互作用配偶体在多于两种化合物的复合体中相互作用。这种相互作用可以借助一个或多个桥接分子而是完全间接的，或是部分间接的，其中在配偶体之间仍存在直接接触，所述直接接触借助一种或多种化合物的附加相互作用稳定化。如本文就抗体所用的术语“特异性结合”意指识别特定抗原，但基本上不识别或不结合样品中其他分子的抗体。例如，与来自一个物种的抗原特异性结合的抗体还可能与来自一个或多个物种的这种抗原结合。但是，这类跨物种反应性本身不改变抗体划分为特异性。在一些情况下，在指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质相互作用时，术语“特异的结合”或“特异性结合”可以用来意指这种相互作用依赖于特定结构(例如，抗原决定簇或表位)在这种化学物质上的存在；例如，抗体识别并且结合于特定的蛋白结构而非总体结合于蛋白质。如果抗体对表位“A”是特异的，则含有表位A的分子(或游离、未标记的A)在含有标记的“A”和这种抗体的反应中的存在将减少与抗体结合的标记A的量。
如本文所用，术语“抗体”指与抗原特异性结合的免疫球蛋白(Ig)分子。抗体可以是来自天然来源或来自重组来源的完整的免疫球蛋白并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体一般是免疫球蛋白分子的四聚体。如本文所用的术语“免疫球蛋白结构域”指抗体链(如例如，常规4链抗体的链或重链抗体的链)的球状区域、或基本上由这种球状区域组成的多肽。免疫球蛋白结构域的特征在于，它们保留抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，所述的免疫球蛋白折叠特征由约七个反平行β-链的按两个β-片层布置的双层夹心组成，所述双层夹心任选地由保守的二硫键稳定。
如本文所用的术语“免疫球蛋白可变结构域”(缩写为“IVD”)意指基本上由四个“框架区”组成的免疫球蛋白结构域，所述框架区在本领域及下文分别称作“框架区1”或“FR1”；称作“框架区2”或“FR2”；称作“框架区3”或“FR3”；及称作“框架区4”或“FR4”；所述框架区由三个“互补决定区”或“CDR”中断，所述互补决定区在本领域和下文分别称作“互补决定区1”或“CDR1”；称作“互补决定区2”或“CDR2”；和称作“互补决定区3”或“CDR3”。因此，免疫球蛋白可变结构域的总体结构或序列可以如下指示：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。正是免疫球蛋白可变结构域(IVD)通过携带抗原结合位点，赋予抗体对抗原的特异性。
术语“免疫球蛋白单一可变结构域”(缩写为“ISVD”)，等同于术语“单一可变结构域”，定义了其中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上并由其形成的分子。这设定免疫球蛋白单一可变结构域区别于其中两个免疫球蛋白结构域、尤其两个可变结构域相互作用以形成抗原结合位点的“常规”免疫球蛋白或其片段。一般，在常规的免疫球蛋白中，重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)相互作用以形成抗原结合位点。在这种情况下，VH和VL的互补决定区(CDR)均将有助于抗原结合位点，即总计6个CDR将涉及抗原结合位点形成。鉴于以上定义，常规4链抗体(如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；本领域已知)或衍生自这类常规4链抗体的Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段(如二硫键连接的Fv或scFv片段)或双体抗体(diabody)(本领域均已知)的抗原结合结构域正常情况下将不视作免疫球蛋白单一可变结构域，因为在这些情况下，与相应的抗原表位结合正常情况下将不借助一个(单一)免疫球蛋白结构域发生，而借助与相应抗原的表位共同结合的一对(缔合的)免疫球蛋白结构域(如轻链可变结构域和重链可变结构域)(即，借助免疫球蛋白结构域的VH-VL对)发生。相反，不与额外的免疫球蛋白可变结构域配对情况下，免疫球蛋白单一可变结构域能够与抗原的表位特异性结合。免疫球蛋白单一可变结构域的结合位点由单一VH/VHH或VL结构域形成。因此，免疫球蛋白单一可变结构域的抗原结合位点由不多于三个CDR形成。从而，单一可变结构域可以是轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)或其合适的片段；或重链可变结构域序列(例如，VH-序列或VHH序列)或其合适的片段；只要它能够形成单一抗原结合单元(即，基本上由单一可变结构域组成的有功能抗原结合单元，从而单一抗原结合结构域不需求与另一个可变结构域相互作用以形成有功能抗原结合单元)。在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白单一可变结构域是重链可变结构域序列(例如，VH-序列)；更具体地，免疫球蛋白单一可变结构域可以是从常规四链抗体衍生的重链可变结构域序列或从重链抗体衍生的重链可变结构域序列。例如，免疫球蛋白单一可变结构域可以是(单一)结构域抗体(或适合用作(单一)结构域抗体的氨基酸序列)、“dAb”或dAb(或适合用作dAb的氨基酸序列)或
(如本文定义，并包括但不限于VHH)；其他单一可变结构域、或其任一者的任何合适片段。特别地，免疫球蛋白单一可变结构域可以是
(如本文定义)或合适的其片段。注：
和
(
和
)是Ablynx N.V.的注册商标。关于
的一般说明，参考以下进一步描述以及本文中援引的现有技术，例如，如WO2008/020079中描述。除非明确地提到，否则本文中根据Kabat命名法描述IVD或ISVD序列的编号。
“VHH结构域”，也称为VHH，VHH域，VHH抗体片段和VHH抗体，最初被描述为“重链抗体”(即，“不含轻链的抗体”；Hamers-Castermanet等人(1993)Nature363：446-448)的抗原结合免疫球蛋白(可变)结构域。选择术语“VHH结构域”以将这些可变结构域与常规4链抗体中存在的重链可变结构域(在本文中称为“VH结构域”)和存在于常规4-链抗体中的轻链可变结构域(在本文中称为“VL结构域”)区分开来。对于VHH和
的进一步描述，参考Muyldermans的综述文章(Reviews in Molecular Biotechnology 74：277-302，2001)以及以下专利申请(这些文献被作为一般背景技术提及)：布鲁塞尔自由大学的WO94/04678，WO95/04079和WO 96/34103；联合利华的WO 94/25591，WO 99/37681，WO 00/40968，WO 00/43507，WO 00/65057，WO 01/40310，WO 01/44301，EP 1134231和WO 02/48193；VlaamsInstituutvoor Biotechnologie(VIB)的WO 97/49805，WO 01/21817，WO 03/035694，WO03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和Ablynx N.V.的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会的WO 01/90190；抗体研究所的WO 03/025020(＝EP 1433793)；以及Ablynx NV的WO 04/041867，WO 04/041862，WO 04/041865，WO 04/041863，WO 04/062551，WO05/044858，WO 06/40153，WO 06/079372，WO 06/122786，WO 06/122787和WO 06/122825；以及Ablynx NV的其他公开的专利申请。如这些参考文献中所述，纳米
(特别是VHH序列和部分人源化的
)尤其可以通过在一个或多个框架序列中存在一个或多个“Hallmark残基”来表征。
的进一步描述，包括纳米
的人源化和/或驼源化以及其他修饰、部分或片段、衍生物或“
融合物”、多价构建体(包括接头序列的一些非限制性示例)和用于延长
的半衰期的不同修饰及其制备，可以见于例如在WO08/101985和WO 08/142164中。
“结构域抗体”，也称为“Dabs”、“域抗体”和“dAbs”(术语“域抗体”和“dAbs”由葛兰素史克集团公司使用作为商标)，已经描述在例如EP0368684,Ward等人(Nature 341：544-546，1989)，Holt等(Tends in Biotechnology 21：484-490，2003)和WO 03/002609以及例如WO04/068820，WO 06/030220，WO 06/003388和Domantis Ltd.的其他公开专利申请。结构域抗体基本上对应于非驼类哺乳动物，尤其是人4链抗体的VH或VL结构域。为了以单抗原结合结构域(即，不与VL或VH结构域配对)结合表位，需要对这种抗原结合特性进行特异性选择，例如，通过使用人单VH或VL结构域序列的文库。像VHH一样，结构域抗体具有约13至约16kDa的分子量，并且如果衍生自完整的人序列，则不需要人源化用于例如在人类中的治疗用途。还应注意，单可变结构域可衍生自某些鲨鱼物种(例如，所谓的“IgNAR结构域”，参见例如WO 05/18629)。
免疫球蛋白单一可变结构域如结构域抗体和
(包括VHH结构域和人源化VHH结构域)可以通过在一个或多个CDR的氨基酸序列中引入一个或多个改变，经历亲和力成熟，所述改变导致如与相应的亲本分子相比，所得的免疫球蛋白单一可变结构域对其相应抗原的亲和力改善。可以通过本领域已知的方法，例如，如Marks等人(Biotechnology10:779-783,1992)、Barbas等人(Proc.Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813,1994)、Shier等人(Gene 169:147-155,1995)、Yelton等人(Immunol.155:1994-2004,1995)、Jackson等人(J.Immunol.154:3310-9,1995)、Hawkins等人(J.MoI.Biol.226:889 896,1992)、Johnson和Hawkins(Affinity maturation of antibodies using phage display,OxfordUniversity Press,1996)所描述的方法，制备本发明的亲和力成熟的免疫球蛋白单一可变结构域分子。从免疫球蛋白单一可变结构域如结构域抗体或
开始，设计/选择和/或制备多肽的过程，本文中也称作“格式化”所述免疫球蛋白单一可变结构域；并且使其成为某多肽之部分的免疫球蛋白单一可变结构域称为“被格式化”或“处于所述多肽的格式”。基于本文的公开内容，技术人员将显而易见其中免疫球蛋白单一可变结构域可以格式化的方式的实例和这类格式(例如避免糖基化)的实例。
免疫球蛋白单一可变结构域如结构域抗体和
(包括VHH结构域)可以经受人源化，即增加与最近缘的人类种系序列的序列同一性程度。特别地，人源化免疫球蛋白单一可变结构域，如
(包含VHH结构域)可以是这样的免疫球蛋白单一可变结构域，它们如先前段中总体上所定义那样，但是其中存在至少一个是和/或对应于(如本文进一步限定的)人源化置换的氨基酸残基(和尤其，至少一个框架残基)。可以通过将天然存在的VHH序列的框架区的序列与一个或多个密切相关的人VH序列的相应框架序列比较，确定潜在有用的人源化置换，此后，如此确定的一个或多个潜在有用的人源化置换(或其组合)可以被引入所述VHH序列中(以本身已知的任何方式，如本文进一步描述)并且可以对所得的人源化VHH序列测试对靶的亲和力、稳定性、表达难易度和水平和/或其他所需特性。以这种方式，借助有限程度的试验和误差，可以由技术人员确定其他合适的人源化置换(或合适的其组合)。另外，基于前文所描述，免疫球蛋白单一可变结构域，如
(包含VHH结构域)的(框架区)可以是部分人源化的全人源化的。
如本文所用，“血清白蛋白结合剂”或“血清白蛋白结合性多肽”，是能够与血清白蛋白特异性结合的基于蛋白质的药剂。在多种实施方案中，血清白蛋白结合剂可以与血清白蛋白的全长形式和/或成熟形式和/或同工型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其他天然存在的或合成性类似物、变体或突变体结合。在多种实施方案中，本发明的血清白蛋白结合剂可以与任何形式的血清白蛋白结合，包括单体形式、二聚体形式、三聚体形式、四聚体形式、异二聚形式、多聚体形式和缔合形式。在一个实施方案中，血清白蛋白结合剂与单体形式的血清白蛋白结合。在一个实施方案中，本发明的血清白蛋白结合性多肽包含具有抗原结合位点的免疫球蛋白可变结构域，所述抗原结合位点包含三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。在一个实施方案中，所述抗原结合位点识别血清白蛋白上存在的一个或多个表位。在多种实施方案中，血清白蛋白结合剂包含全长抗体或其片段。在一个实施方案中，血清白蛋白结合剂包含单结构域抗体或免疫球蛋白单一可变结构域(ISVD)。在一个具体实施方案中，血清白蛋白结合剂结合于大鼠的血清白蛋白(Uniprot P02770，SEQ ID NO:14)。在一个具体实施方案中，血清白蛋白结合剂结合于小鼠的血清白蛋白(Uniprot P07724，SEQID NO:13)。在一个具体实施方案中，血清白蛋白结合剂结合于人血清白蛋白(UniprotP02768，SEQ ID NO:12)。
本文中互换使用的术语“受试者”、“个体”或“患者”指其需要治疗或预防的任何受试者，具体地指脊椎动物受试者，并且甚至更具体地指哺乳动物受试者。落于本发明范围内的合适脊椎动物动物包括，但不限于灵长类、禽类、鱼类、爬行类、家畜动物(例如，羊、奶牛、马、驴、猪)、实验室检验用动物(例如，兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、伴侣动物(例如，猫、犬)和圈养野生动物(例如，狐、鹿、澳洲野狗)。但是，应当理解前述的术语不表明存在症状。术语“治疗”以及其各种词性形式可以互换使用并且由治疗性干预定义，所述治疗性干预减慢、干扰、停滞、控制、停止、减少或逆转体征、症状、病症、病状或疾病的进展或严重程度，但不必然地涉及完全消除全部疾病相关的体征、症状、条件或病症。如本文所用，术语“药物”指治疗中即在预防或治疗疾病或病症中所用的物质/组合物。根据本发明，术语“疾病或病症”指任何病理状态、尤其如本文定义的疾病或病症。
发明详述
在第一方面，本发明涉及包含免疫球蛋白可变结构域(IVD)的多肽，其中所述IVD与血清白蛋白特异性结合。所述IVD特别包含以下总体结构F：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在多种实施方案中，本发明的血清白蛋白结合性多肽提供针对人血清白蛋白(Uniprot P02768，SEQ ID NO:12)的全长形式和/或成熟形式和/或异构体和/或剪接变体和/或片段和/或单体形式和/或二聚体形式和/或四聚体形式和/或任何其他天然存在的或合成性类似物、变体、或突变体(包括单体形式和/或二聚体形式和/或四聚体形式)的结合亲和力，并且可以由平衡解离常数(KD)描述。在多种实施方案中，本发明的血清白蛋白结合性多肽提供针对大鼠血清白蛋白(Uniprot P02770，SEQ ID NO:14)的全长形式和/或成熟形式和/或异构体和/或剪接变体和/或片段和/或单体形式和/或二聚体形式和/或四聚体形式和/或任何其他天然存在的或合成性类似物、变体、或突变体(包括单体形式和/或二聚体形式和/或四聚体形式)的结合亲和力，并且可以由平衡解离常数(KD)描述。在多种实施方案中，本发明的血清白蛋白结合性多肽提供针对小鼠血清白蛋白(Uniprot PP07727，SEQID NO:13)的全长形式和/或成熟形式和/或异构体和/或剪接变体和/或片段和/或单体形式和/或二聚体形式和/或四聚体形式和/或任何其他天然存在的或合成性类似物、变体、或突变体(包括单体形式和/或二聚体形式和/或四聚体形式)的结合亲和力，并且可以由平衡解离常数(KD)描述。
SEQ ID NO:12描述了全长人血清白蛋白(Uniprot P02768)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12：人血清白蛋白(Uniprot P02768)
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO:13描述全长小鼠血清白蛋白(Uniprot P07724)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13：小鼠血清白蛋白(Uniprot P07724)
MKWVTFLLLLFVSGSAFSRGVFRREAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRCKDALA
SEQ ID NO:14描述全长大鼠血清白蛋白(Uniprot P02770)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14：大鼠血清白蛋白(Uniprot P02770)
MKWVTFLLLLFISGSAFSRGVFRREAHKSEIAHRFKDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCPYEEHIKLVQEVTDFAKTCVADENAENCDKSIHTLFGDKLCAIPKLRDNYGELADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPPFQRPEAEAMCTSFQENPTSFLGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEKYNEVLTQCCTESDKAACLTPKLDAVKEKALVAAVRQRMKCSSMQRFGERAFKAWAVARMSQRFPNAEFAEITKLATDVTKINKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQACCDKPVLQKSQCLAEIEHDNIPADLPSIAADFVEDKEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEGDPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCELYEKLGEYGFQNAVLVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEAQRLPCVEDYLSAILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHKPKATEDQLKTVMGDFAQFVDKCCKAADKDNCFATEGPNLVARSKEALA
本发明涉及包含血清白蛋白结合性IVD的多肽，所述IVD包含具有3个互补决定区(CDR)的氨基酸序列，所述CDR由SA1_S30K(SEQ ID NO:4)或其人源化变体如h1、h2、h3、h4(SEQ ID NO:8-11)的CDR1、CDR2和CDR3区表征。
SEQ ID NO:4描述全长SA1_S30K VHH的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4：SA1_S30K
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRNIKEYVMGWFRQAPGKEREFVAAISWSAGNIYYADSVKGRFTISRDNAKNTVHLQMNTLRPEDTAVYYCAAGRYSAWYVAAYEYDYWGQGTQVTVSS
在一个实施方案中，所述包含血清白蛋白结合性IVD的多肽对大鼠血清白蛋白具有高亲和力，其中所述亲和力高于基准(Ablynx N.V.的Alb8抗血清白蛋白
参见实施例)至少1000倍，或具有低于前述基准至少1000倍的KD，并且优选地，所述亲和力高于该基准至少5000，或所述KD低于该基准5000倍。
一个具体实施方案提供，所述包含IVD的蛋白质以≤40pM的高亲和力(KD)结合大鼠血清白蛋白。术语“亲和力”指免疫球蛋白(如抗体)与抗原结合的程度，从而使抗原和抗体的平衡偏向存在因它们的结合而形成的复合物。因此，在抗原和抗体按相对均等的浓度合并情况下，高亲和力抗体将结合于可获得的抗原，从而使该平衡偏向高浓度的所得复合物。因而，结合亲和力是IVD和抗原(在这种情况下血清白蛋白)之间结合相互作用的强度，并且一般依据平衡解离常数(KD)测量及报告，所述平衡解离常数用来评价双分子相互作用的强度并对其排序。KD值越小，配体对其靶的结合亲和力越大。可以通过BioLayerInterferometry(BLI)、或通过表面等离子体共振(SPR)、还通过例如ELISA、凝胶移位测定、下拉测定、平衡透析、分析性超速离心和光谱测定测量或确定结合亲和力和解离常数。另一种确定亲和力的方法例如通过等温滴定量热法(ITC)进行，所述方法是一种直接、无标记物测定法，其测量彼此相互作用的任何两个生物分子之间的结合亲和力(例如，Ig/抗原结合作用)，并且可以测量微摩尔和纳摩尔范围内的KD值以及在表征分子间相互作用时重要的结合化学计量和结合热动力学。将ITC描述为相互作用分析的“黄金标准’，因为它能够研究类型广泛的相互作用并得出高度定量的KD值。
另一个实施方案涉及如通过Biolayer interferometry所测定，以≤40pM的亲和力与血清白蛋白、优选地大鼠血清白蛋白结合的免疫球蛋白单一可变结构域(ISVD)。
SEQ ID NO:5描述全长SA1 VHH的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5：SA1
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRNISEYVMGWFRQAPGKEREFVAAISWSAGNIYYADSVKGRFTISRDNAKNTVHLQMNTLRPEDTAVYYCAAGRYSAWYVAAYEYDYWGQGTQVTVSS
与SA1 VHH比较时，SA1_S30K中的一个氨基酸置换增加对大鼠血清白蛋白的亲和力20倍或至少10倍。此外，还揭示SA1_S30K的小鼠血清白蛋白结合作用有高亲和力，KD值≤300pM，如与SA1 VHH相比，该值是至少2倍或至少1.5倍更高的亲和力。与基准VHH(Alb8)相比，小鼠血清白蛋白和大鼠血清白蛋白及食蟹猴血清白蛋白均以高得多的亲和力结合于SA1_S30K，这提供了改进开发和临床前评估的机会。
因而在一个备选实施方案中，包含对大鼠血清白蛋白具有高亲和力的IVD的多肽是这样的多肽，所述多肽对大鼠血清白蛋白的亲和力至少1000倍高于或KD至少1000倍低于基准(Ablynx N.V.的Alb8抗血清白蛋白
)，并且优选地，对大鼠血清白蛋白的亲和力至少5000倍高于基准(Ablynx N.V.的Alb8抗血清白蛋白
)。
令人惊讶地，通过引入仅一个突变，以移除糖基化位点，且该突变位点位于CDR1中位置30处(图1)，就可能保留对人血清白蛋白的亲和力，KD值为约0.9nM(表4)，接近于对SA1和Alb8对照观察到的亲和力，并且另外甚至观察到SA1_S30K突变变体对大鼠血清白蛋白和小鼠血清白蛋白的结合亲和力明显增加。大鼠血清白蛋白和小鼠血清白蛋白在氨基酸序列方面显示约90％同一性的高度同源性，并且人血清白蛋白和大鼠血清白蛋白之间的同源性也相当高，同一性为73％，这使得发现这种增加的大鼠血清白蛋白亲和力确实难以置信。这种令人惊讶的特征具有以下优势：许多在大鼠和小鼠中进行的临床前安全性和疗效研究可以从较长的半衰期中获益，还如见于实施例7，其中小鼠中的PK产生大约30小时的半衰期，其对应于KD值反映的极高亲和力。
在多种实施方案中，该蛋白质包含IVD，其与大鼠血清白蛋白(Uniprot P02770，SEQ ID NO:14)的全长形式和/或成熟形式和/或同工型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其他天然存在的或合成性类似物、变体、或突变体(包含单体形式和/或二聚体形式和/或四聚体形式)结合的亲和力(KD)为至少约1μM、约900nM、约800nM、约700nM、约600nM、约500nM、约400nM、约300nM、约200nM、约100nM、约90nM、约80nM、约70nM、约60nM、约50nM、约40nM、约30nM、约20nM、约10nM、约5nM、约2.5nM、约1nM、约950pM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约450pM、约400pM、约350pM、约300pM、约250pM、约200pM、约150pM、约100pM、约50pM、约30pM、约25pM、约20pM、约15pM、约10pM、约5pM或至少约1pM。
在其他实施方案中，该蛋白质包含一种IVD，其与小鼠血清白蛋白(UniprotP07724，SEQ ID NO:13)的全长形式和/或成熟形式和/或同工型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其他天然存在的或合成性类似物、变体、或突变体(包含单体形式和/或二聚体形式和/或四聚体形式)结合的亲和力(KD)为至少约1μM、约900nM、约800nM、约700nM、约600nM、约500nM、约400nM、约300nM、约200nM、约100nM、约90nM、约80nM、约70nM、约60nM、约50nM、约40nM、约30nM、约20nM、约10nM、约5nM、约2.5nM、约1nM、约950pM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约450pM、约400pM、约350pM、约300pM、约250pM、约200pM、约150pM、约100pM、约50pM、约30pM、约25pM、约20pM、约15pM、约10pM、约5pM或至少约1pM。
另外，在可选实施方案中，该蛋白质包含一种IVD，其与人血清白蛋白(UniprotP02768，SEQ ID NO:12)的全长形式和/或成熟形式和/或同工型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其他天然存在的或合成性类似物、变体、或突变体(包含单体形式和/或二聚体形式和/或四聚体形式)结合的亲和力(KD)为至少约1μM、约900nM、约800nM、约700nM、约600nM、约500nM、约400nM、约300nM、约200nM、约100nM、约90nM、约80nM、约70nM、约60nM、约50nM、约40nM、约30nM、约20nM、约10nM、约5nM、约2.5nM、约1nM、约950pM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约450pM、约400pM、约350pM、约300pM、约250pM、约200pM、约150pM、约100pM、约50pM、约30pM、约25pM、约20pM、约15pM、约10pM、约5pM或至少约1pM。完全出乎意料的是，SA1_S30K变体VHH中所述人血清白蛋白结合亲和力仍然相似，如与SA1相比，所述变体在其CDR1中含有赖氨酸置换(图1)，并且这额外地提供本发明的优点，如下文稍后讨论。
另外，在可选实施方案中，该蛋白质包含一种IVD，其与食蟹猴血清白蛋白(Uniprot A2V924)的全长形式和/或成熟形式和/或同工型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其他天然存在的或合成性类似物、变体、或突变体(包含单体形式和/或二聚体形式和/或四聚体形式)结合的亲和力(KD)为至少约1μM、约900nM、约800nM、约700nM、约600nM、约500nM、约400nM、约300nM、约200nM、约100nM、约90nM、约80nM、约70nM、约60nM、约50nM、约40nM、约30nM、约20nM、约10nM、约5nM、约2.5nM、约1nM、约950pM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约450pM、约400pM、约350pM、约300pM、约250pM、约200pM、约150pM、约100pM、约50pM、约30pM、约25pM、约20pM、约15pM、约10pM、约5pM或至少约1pM。
另外，在可选实施方案中，该蛋白质包含一种IVD，其与兔血清白蛋白(UniprotP49065)的全长形式和/或成熟形式和/或同工型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其他天然存在的或合成性类似物、变体、或突变体(包含单体形式和/或二聚体形式和/或四聚体形式)结合的亲和力(KD)为至少约10μm、约9μM、约8μM、约7μM、约6μM、约5μM、约5μM、约5μM、约5μM、约1μM、约900nM、约800nM、约700nM、约600nM、约500nM、约400nM、约300nM、约200nM、约100nM、约90nM、约80nM、约70nM、约60nM、约50nM、约40nM、约30nM、约20nM、约10nM、约5nM、约2.5nM、约1nM、约950pM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约450pM、约400pM、约350pM、约300pM、约250pM、约200pM、约150pM、约100pM、约50pM、约30pM、约25pM、约20pM、约15pM、约10pM、约5pM或至少约1pM。
另外，在可选实施方案中，该蛋白质包含一种IVD，其与马血清白蛋白(UniprotP35747)的全长形式和/或成熟形式和/或同工型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其他天然存在的或合成性类似物、变体、或突变体(包含单体形式和/或二聚体形式和/或四聚体形式)结合的亲和力(KD)为至少约1μM、约900nM、约800nM、约700nM、约600nM、约500nM、约400nM、约300nM、约200nM、约100nM、约90nM、约80nM、约70nM、约60nM、约50nM、约40nM、约30nM、约20nM、约10nM、约5nM、约2.5nM、约1nM、约950pM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约450pM、约400pM、约350pM、约300pM、约250pM、约200pM、约150pM、约100pM、约50pM、约30pM、约25pM、约20pM、约15pM、约10pM、约5pM或至少约1pM。
另外，在可选实施方案中，该蛋白质包含一种IVD，其与犬血清白蛋白(UniprotP49822)的全长形式和/或成熟形式和/或同工型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其他天然存在的或合成性类似物、变体、或突变体(包含单体形式和/或二聚体形式和/或四聚体形式)结合的亲和力(KD)为至少约1μM、约900nM、约800nM、约700nM、约600nM、约500nM、约400nM、约300nM、约200nM、约100nM、约90nM、约80nM、约70nM、约60nM、约50nM、约40nM、约30nM、约20nM、约10nM、约5nM、约2.5nM、约1nM、约950pM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约450pM、约400pM、约350pM、约300pM、约250pM、约200pM、约150pM、约100pM、约50pM、约30pM、约25pM、约20pM、约15pM、约10pM、约5pM或至少约1pM。
本发明涉及包含血清白蛋白结合性IVD的多肽，所述IVD包含具有3个互补决定区(CDR)的氨基酸序列，所述CDR由SA1_S30K(SEQ ID NO:4)或其人源化变体如h1、h2、h3、h4(SEQ ID NO:8-11)的CDR1、CDR2和CDR3区表征，其中图1中描述了根据SA1S30K或其变体的CDR注释。MacCallum、AbM、Chothi或IMGT注释适用于鉴定CDR区。Kabat不适用于CDR1的定义，因为该注释未包含特定的赖氨酸残基。在一个具体实施方案中，CDR1包含或是SEQ IDNO:1的氨基酸序列，CDR2包含或是SEQ ID NO:2的氨基酸序列；并且CDR3包含或是SEQ IDNO:3的氨基酸序列。根据MacCallum等人(1996)的定义确定所述的较靠后CDR区(还参见图1)。所述CDR，例如，如MacCallum等人中所定义的SEQ ID NO:1、2和3提供的，并且尤其CDR1的贡献，提供针对大鼠血清白蛋白的高亲和力的独有特征。
SEQ ID NO:1描述SA1_S30K的CDR1区的氨基酸序列(其中根据MacCallum等人,1996注释CDR)
SEQ ID NO:1：CDR1 SA1_S30K
KEYVMG
SEQ ID NO:2描述SA1_S30K的CDR2区的氨基酸序列(其中根据MacCallum等人,1996注释CDR)
SEQ ID NO:2：CDR2 SA1_S30K
FVAAISWSAGNIY
SEQ ID NO:3描述SA1_S30K的CDR3区的氨基酸序列(其中根据MacCallum等人,1996注释CDR)
SEQ ID NO:3：CDR3 SA1_S30K
AAGRYSAWYVAAYEYD
对于IVD的氨基酸残基编号，可以应用不同的编号方案。例如，编号可以根据如Riechmann,L.和Muyldermans,S.,231(1-2),J Immunol Methods.1999文章中适用于骆驼科VHH结构域的Kabat编号体系来进行，还参见图1，并且本申请通篇范围使用(除非另外声明)。本领域已知对VH结构域的氨基酸残基编号的替代性方法，所述方法也可以按类似方式适用于VHH结构域。也可以通过使用Kabat编号法，阐释FR序列和CDR序列，不过，本领域的其他方法也适用，如MacCallum等人,J.Mol.Biol.(1996)262,732–745中所述的基于接触分析和结合位点形貌的命名法，其中在本发明的说明书、序列注释和权利要求中后续(图1和SEQID NO:1-3，和SA1_S30K VHH的SEQ ID NO:4)。根据AbM(AbM是如http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html上所述的Oxford Molecular Ltd.的抗体建模包)、Chothia(Chothia和Lesk,1987)、Kabat(Kabat等人,1991)和IMGT(LeFranc,2014)对CDR的注释略不同，并且也在图1中提供供参考。应当指出，如本领域对VH结构域和VHH结构域熟知，每个CDR中的氨基酸残基总数可以变动并且可以不对应于Kabat编号法指示的氨基酸残基总数(即，在实际序列中可以不占据一个或多个根据Kabat编号法的位置，或实际序列可以含有比Kabat编号法所允许数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，根据Kabat的编号法可对应于或可不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。VH结构域和VHH结构域中的氨基酸残基总数通常将在110至120范围内，经常在112和115之间。然而，应指出更小和更长的序列也可以适于本文所述的目的。
在一个实施方案中，本文所述的多肽包含一种血清白蛋白结合性IVD，所述IVD包含如本文所述的所述CDR并且还在其FR3区中包含如根据MacCallum CDR注释的SEQ ID NO:18中所述的氨基酸序列，其对应于SEQ ID NO:4(SA1_S30K)的FR3区氨基酸序列。在另一个实施方案中，本文所述的多肽包含与SEQ ID NO:4的人源化变体对应的FR3区，其中所述FR3区具有这样的氨基酸序列(根据Kabat编号)，其中位置73和74处可以存在任何氨基酸，和/或其中位置78处存在缬氨酸或亮氨酸，和/或其中氨基酸位置79处存在组氨酸或酪氨酸，和/或其中位置82b处存在苏氨酸或丝氨酸。
SEQ ID NO:18描述来自SA1_S30K的FR3(其中根据MacCallum等人,1996注释CDR)的并且与SEQ ID NO:4的残基60-96对应的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18：FR3 SA1_S30K
YADSVKGRFTISRDXXKNTVHLQMNTLRPEDTAVYYC
在一个实施方案中，XX是NA(对于FR3，对应于SA1_S30K)，并且在其他实施方案中，XX是NS(对于FR3，对应于SA1_S30K_h1-7)，并且在其他实施方案中，XX是任何氨基酸(SA1_S30K的进一步人源化变体)。
在另一个实施方案中，所述多肽包含IVD，其包含SEQ ID NO:4或SA1_S30K VHH的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述多肽包含本发明的IVD，其包含SEQ ID NO:4或SA1_S30K的人源化变体的氨基酸序列。为了获得本发明的所述人源化变体，技术人员分析了如SEQ ID NO:7中所述的来自人VH3-23(GenBank：P01764.2)/J5的最接近的人同源物序列，旨在将SA1_S30K的FR区中的氨基酸残基置换成更像人的序列，同时往往不影响典型的‘特征’VHH残基或CDR区。
SEQ ID NO:7描述全长VH3-23/J5人VHH(Uniprot P01764.2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7：VH3-23/J5
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISSNGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGQGTLVTVSS
本申请的实施例8中提供并且在SEQ ID NOs：8-11中描述非限制性实例(图5中作为h1-h4提出)。图5中提供(作为‘备选性h’)并且还在SEQ ID NOs：15-17中进一步提供其他的备选实例。
SEQ ID NO:8描述全长SA1_S30K人源化变体1VHH的氨基酸序列
SEQ ID NO：8：SA1_S30K_human1
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRNIKEYVMGWFRQAPGKEREFVAAISWSAGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTVHLQMNTLRPEDTAVYYCAAGRYSAWYVAAYEYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:9描述全长SA1_S30K人源化变体2VHH的氨基酸序列
SEQ ID NO:9：SA1_S30K_human2
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRNIKEYVMGWFRQAPGKEREFVAAISWSAGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNTLRPEDTAVYYCAAGRYSAWYVAAYEYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:10描述全长SA1_S30K人源化变体3VHH的氨基酸序列
SEQ ID NO:10：SA1_S30K_human3
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRNIKEYVMGWFRQAPGKEREFVAAISWSAGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTVHLQMNSLRPEDTAVYYCAAGRYSAWYVAAYEYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:11描述全长SA1_S30K人源化变体4VHH的氨基酸序列
SEQ ID NO:11：SA1_S30K_human4
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRNIKEYVMGWFRQAPGKEREFVAAISWSAGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAGRYSAWYVAAYEYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:15描述全长SA1_S30K人源化变体5VHH的氨基酸序列
SEQ ID NO:15：SA1_S30K_human 5
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRNIKEYVMGWFRQAPGKEREFVAAISWSAGNIYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNTLRPEDTAVYYCAAGRYSAWYVAAYEYDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:16描述全长SA1_S30K人源化变体6VHH的氨基酸序列
SEQ ID NO:16：SA1_S30K_human6
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRNIKEYVMGWFRQAPGKEREFVAAISWSAGNIYYADSVKGRFTISRDNAKNTVHLQMNSLRPEDTAVYYCAAGRYSAWYVAAYEYDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:17描述全长SA1_S30K人源化变体7VHH的氨基酸序列
SEQ ID NO:17：SA1_S30K_human7
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRNIKEYVMGWFRQAPGKEREFVAAISWSAGNIYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAGRYSAWYVAAYEYDYWGQGTQVTVSS
人源化序列变体应当保留原始VHH的有利特性，其包括抗原结合亲和力和生物化学特性与生物物理特性。当分析人源化变体h1、h2、h3和h4时(参见实施例8-10)，令人惊讶的观察结果涉及解链温度(热稳定性指标)明显增加，这可以毫无疑义地关联于位置79处的氨基酸从H置换成Y和位置82b处的氨基酸从T置换成S。每个置换促成解链温度升高4℃(h2和h3)，并且与SA1_S30K相比，在含有两种置换的h4变体中观察到升高至8℃的协同效应。即使已知VHH中的那些位置分别显示那些氨基酸Y和S，在此仍认定与特定CDR组合时，已经确定血清白蛋白结合性多肽的稳定性改善。因此，一个实施方案涉及其中所述FR3区在位置79处具有Y和/或在位置82b处具有S的多肽。
应当指出，本发明的免疫球蛋白单一可变结构域，尤其
在其最广意义上不限于特定生物来源或特定制备方法。例如，通常可以按以下方式获得本发明的免疫球蛋白单一可变结构域，尤其
(1)分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)使天然存在的VHH结构域“人源化”或表达编码这种人源化VHH结构域的核酸；(4)“突变”天然存在的VHH结构域以减少与预存的抗体结合，或表达编码这种突变的VHH结构域的核酸；(5)“驼化”来自任何动物物种并且尤其来自哺乳动物物种(如来自人类)的天然存在的VH结构域，或通过表达编码这种驼化VH结构域的核酸；(6)“驼化”如本领域所述的“结构域抗体”或“Dab”或表达编码这种驼化VH结构域的核酸；(7)使用制备本身已知的蛋白质、多肽或其他氨基酸序列的合成性或半合成性技术；(8)使用本身已知的核酸合成技术制备编码
的核酸，随后表达如此获得的核酸；和/或(9)前述一者或多者的任何组合。
应当再次指出，本发明的人源化免疫球蛋白单一可变结构域可以按本身已知的任何适合方式(即如上文第(1)点-第(9)点下所示)获得并且因此不严格限于已经使用包含天然存在的VHH结构域作为起始材料的多肽所获得的多肽。
与相应的天然存在的VHH结构域相比，人源化免疫球蛋白单一可变结构域，尤其
可以具有若干优点，如降低的免疫原性。人源化意指经突变，从而在人类患者中施用时，免疫原性微小或不存在。这种人源化通常包括替换天然存在的VHH的序列中的一个或多个氨基酸残基为人VH结构域(如人VH3结构域)中相同位置处存在的氨基酸残基。根据本发明，使单结构域抗体人源化包括步骤：将一个或多个氨基酸用例如人类共有序列中存在的其人类对应物替换，同时多肽不丧失其典型特性，即人源化过程不显著影响所得多肽的抗原结合能力。应当选择如此人源化置换，从而所得的人源化多肽仍保留如本文定义的有利特性。本领域普通技术人员将能够选择这样的人源化置换或合适的人源化置换组合，其优化或实现一方面由人源化置换提供的有利特性和另一方面天然存在的VHH结构域的有利特性之间的所需或适宜平衡。
技术人员已知这类方法。人类共有序列可以用作人源化靶序列，本领域还已知其他手段。一个备选项包括这种方法，其中技术人员比对众多人种系等位基因，如，例如但不限于比对图6中所示的IGHV3等位基因，以使用所述比对结果鉴定靶序列中适于人源化的残基。还可以比对与靶序列最有同源性的人种系等位基因子集作为鉴定合适人源化残基的起点。备选地，分析VHH以鉴定人等位基因中其最接近的同源物(如实施例8中那样)，并且将其用于人源化构建体设计。也可以通过包括单独或组合的特定氨基酸置换的方法，进行适用于骆驼科(Camelidae)VHH的人源化技术。所述置换可以基于从文献已知的内容选择，来自已知的人源化工作，以及与天然VHH序列相比，来自人共有序列，或来自最类似于目的VHH序列的人等位基因。如可以从WO 08/020079的表A-5-A-8中给出的VHH熵和VHH变异性数据见到，框架区中的一些氨基酸残基在人和骆驼科之间相比其他更为保守。通常，尽管本发明以其最广意义不受限于此，但优选地在不太保守的位置做出任何置换、缺失或插入。通常，相比氨基酸缺失或插入，还优选氨基酸置换。例如，人样类别的骆驼科单结构域抗体含有一般在人源或来自其他物种的常规抗体中存在的疏水性FR2残基，但是通过位置103处置换来自双链抗体的VH中存在的保守色氨酸残基的其他置换，补偿这种亲水性损失。从而，属于这两个类别的肽显示与人VH框架区的高度氨基酸序列同源性，并且在不期望不想要的免疫应答源自其中和无进一步人源化负担的情况下，所述肽可能直接施用至人类。实际上，某些骆驼科VHH序列显示与人VH框架区的高度氨基酸序列同源性，并且因此在不期望免疫应答源自其中和无附加人源化负担的情况下，所述VHH可能直接施用至患者。
其他VHH序列实际上需要通常导致下述变体的人源化技术，所述变体具有施用至受试者时与靶蛋白反应的有利条件。应当选择如此人源化置换，从而所得的人源化氨基酸序列和/或VHH仍保留如本文定义的有利VHH特性。基于本文公开内容和任选地在有限程度的实验后，技术人员通常将能够确定并选择合适的人源化置换或合适的人源化置换组合，这可以例如涉及引入有限数目的可能的人源化置换并且确定它们对如此获得的VHH的特性的影响。通常，作为人源化的结果，本发明的氨基酸序列和/或VHH可能变得更“像人”，同时仍保留如本文所述的本发明VHH的有利特性。作为结果，与相应的天然存在的VHH结构域相比，这类人源化氨基酸序列和/或VHH可以具有几个优点，如降低的免疫原性。可以在人源化期间引入合适的突变，尤其置换，以产生与预存抗体的结合作用减少的多肽(参考例如WO2012/175741和WO2015/173325)，例如，在以下位置至少一处引入：11、13、14、15、40、41、42、82、82a，82b，83、84、85、87、88、89、103或108。
本发明的氨基酸序列和/或VHH可以适当地在任何框架残基处人源化，如在一个或多个标志残基(如本文定义)处或在一个或多个其他框架残基(即非标志残基)或其任何适宜组合处人源化。取决于用来表达本发明的氨基酸序列、VHH或多肽的宿主生物，这类缺失和/或置换也可以按如此方式设计，从而移除一个或多个用于翻译后修饰(如一个或多个糖基化位点)的位点，如这将属于本领域技术人员的能力范围内。备选地，可以设计置换或插入，从而引入用于接合官能团(如本文所述)(例如允许位点特异性PEG化)的一个或多个位点。
在一些情况下，置换在位置37、44、45和/或47处具有亲水特征的常见骆驼科标志残基中至少之一(参见WO2008/020079的表A-03)。人源化的另一个实例包括FR1中(如位置1、5、11、14、16和/或28)的残基；在FR3(如位置73、74、75、76、78、79、82b，83、84、93和/或94)中；和FR4中(如位置103、104、108和/或111)的置换(参见WO2008/020079的表A-05-A08；全部编号均根据Kabat进行)。
在一个实施方案中，本文所述多肽包含一种血清白蛋白结合性IVD，其包含SEQ IDNO:4的人源化变体的氨基酸序列。备选地，该IVD包含SEQ ID NO:8-11或SEQ ID NO:15-17的氨基酸序列或其又一人源化变体。用来确定SEQ ID NO:4的人源化变体或SEQ ID NO:8-11和15-17的进一步人源化的人源化方案备选地基于与如图6中所示的人种系等位基因比对的人共有性。不同方法合适导出哪些氨基酸残基适于置换。基于图6中比对结果提供的人序列，以下位置(根据Kabat编号)潜在地进行置换，以使本发明的VHH人源化：在FR1中位置1(E、Q)；位置5(V或L)、位置11(L或V)、位置13(Q、K、R)、位置14(P)、位置16(G、R)和位置29(I，F、V)；在FR2中位置37(F、V、I，A)；在FR3位置中59(Y、G、N、D、E、H)、位置61(D、A、G)、位置62(S、P)、位置73(N、D)；位置74(A、S)、位置77(T、S)、位置83(R、K)、位置84(A、T)、位置87(T、M)、位置89(V、L)；在FR4中位置108(Q、L)。当治疗性应用(治疗剂或多特异性构建体)中，本发明的血清白蛋白结合性IVD置于N末端处之时，N末端应当在位置1处含有D(例如与SEQ IDNO:8、9、10或11相比，E1D突变)。
图5提供SA1_S30K VHH与实施例8-10中还例举的SA1_S30K VHH的众多人源化形式(h1-4；SEQ ID NOs:8-11中描述)或用于SA1_S30K人源化的备选性选项(图5中的备选性h)的比对结果。SA1_S30K和人源化形式之间的主要差异是：位置1：Q至E/D；位置5：Q至V；位置14：A至P；位置73：N至任何氨基酸(X)，或位置74：A至S或任何氨基酸；位置78：V至L；位置79：H至Y；位置82b：T至S；和/或位置108：Q至L。
也处于本发明范围内的是如本文定义的本发明免疫球蛋白可变结构域(IVD)或免疫球蛋白单一可变结构域(ISVD)、尤其VHH或
的天然或合成性类似物、突变体、变体、等位基因、部分或片段(本文中统称为“变体”)和尤其SEQ ID NO:4的VHH的变体或SEQID NO:4的人源化VHH变体。因此，根据本发明的一个实施方案，术语“本发明的免疫球蛋白可变结构域”或“本发明的VHH”在其最广意义上还涵盖这类变体。通常，在这类变体中，相比如本文定义的本发明的免疫球蛋白单一可变结构域，可能已经替换、缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基。可以在一个或多个FR'中和/或在一个或多个CDR(SEQ ID NOs:1-3)中和尤其SEQ ID NO:4的免疫球蛋白可变结构域的FR和CDR的变体中产生这类置换、插入或缺失。如本文所用，变体是这样的序列，其中每个或任何框架区和每个或任何互补决定区显示与参考序列中相应区域的至少80％同一性、优选地至少85％同一性、更优选地90％同一性、甚至更优选地95％同一性或仍甚至更优选地99％同一性，如可以通过利用如PILEUP和BLAST的算法按电子方式测量。用于进行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心可公开获得的(http://www/ncbi.nlm.nih.gov/)。应当理解为了确定免疫球蛋白可变结构域的一个或多个序列中CDR的氨基酸序列的氨基酸同一性程度，不考虑形成框架区的氨基酸残基。类似地，为了确定本发明免疫球蛋白单一可变结构域的一个或多个序列中FR’s的氨基酸序列的氨基酸同一性程度，不考虑形成互补性区的氨基酸残基。免疫球蛋白可变结构域的这类变体可能特别有优势，因为它们可能具有改进的效价/亲和力。借助非限制性实例，置换可以例如是保守性置换和/或氨基酸残基可以由天然出现在另一个VHH结构域中相同位置的另一个氨基酸残基替换。因此，本发明的范围内包括这样任一个或多个置换、缺失或插入或其任意组合，其改进本发明免疫球蛋白可变结构域的特性或至少不过于从所需特性或从本发明
的所需特性的平衡或组合减损(即，到这样的程度，从而免疫球蛋白单一可变结构域不再适用于其预期用途)。基于本文公开内容和任选地在有限程度的例行实验后，技术人员通常将能够确定并选择合适的置换、缺失或插入或其合适组合，这可以例如涉及引入有限数目的可能的置换并且确定它们对如此获得的免疫球蛋白可变结构域的特性的影响。
在又一个实施方案中，如本文所述的多肽包含如本文所述的IVD，其中所述是IVD缀合物。如本文所用，术语“缀合于”尤其指导致稳定共价连接的化学和/或酶促缀合。“IVD缀合物”或“ISVD缀合物”在本文中是指包含与特定部分(本文中进一步定义为“缀合的部分”或“缀合物”)偶联(或缀合或连接，这些是本领域的等同术语)的本发明IVD或ISVD的多肽。可以借助IVD或ISVD中存在的特定氨基酸(例如赖氨酸、半胱氨酸)实现偶联以获得IVD缀合物或ISVD缀合物。如本文所用，术语“缀合的部分”或“缀合物”包含具有特定生物学活性或特定功能活性的物质(例如，蛋白质(例如，第二IVD或ISVD)、核苷酸序列、脂质、(其他)糖、肽、药物部分(例如，细胞毒药物，抗体药物-缀合物或有效荷载)示踪剂和检测剂)。例如，如与未缀合的本发明IVD或ISVD多肽相比，包含本发明多肽和缀合部分的IVD或ISVD缀合物具有至少一种附加的功能或特性。例如，包含本发明多肽和作为缀合部分的细胞毒药物的IVD或ISVD缀合物导致以药物细胞毒性作为第二功能的结合性多肽形成(即，附加于IVD或ISVD多肽赋予的抗原结合作用，特定情况下，血清白蛋白结合作用)。在又一个实例中，第二结合性多肽与本发明IVD或ISVD多肽(如治疗用部分)的缀合可以赋予附加的结合特性。在某些实施方案中，在缀合的部分是遗传编码的治疗用或诊断用蛋白质或核苷酸序列时，可以借助本领域熟知的肽合成方法或重组DNA方法合成或表达缀合的部分。在另一个方面，在缀合部分是非遗传编码的肽(例如药物部分)时，缀合的部分可以是人工合成的或纯化自天然来源。
在一个具体实施方案中，缀合涉及CDR1的赖氨酸，或SEQ ID NO:1的第一赖氨酸残基，或备选地，SEQ ID NO:4的位置30处存在的赖氨酸。可以通过本领域所述的任何方法进行缀合，并且一些非限制的说明性实施方案将概述于实施例部分。在某些实施方案中，缀合的部分包含各种治疗剂，这包括抗炎、抗癌、细胞毒、抗感染(例如，抗真菌、抗细菌、抗寄生虫、抗病毒等)和麻醉治疗剂。在具体实施方案中，缀合的部分是能够转化前药的酶，其中所述前药被转化成毒性药物。毒剂(例如，毒素、细胞毒药物、放射性核素)也可以适用于治疗目的并且用于癌疗法中。
在本发明的一个特定实施方案中，所述IVD缀合于药物或有效荷载。作为原理验证，在一个具体的实施方案中，本发明提供与生物素的缀合。对这类生物素化的IVD缀合物分析血清白蛋白结合亲和力，确认所述有效荷载与CDR1区中赖氨酸残基的缀合不影响其结合亲和力。此外，偶联较大的有效荷载(例如，作为标记蛋白的辣根过氧化物酶)将揭示以下的进一步原理验证：SA1_S30K中位置30上的赖氨酸适合作为有效荷载缀合位点，同时保留人类和啮齿类(如大鼠和小鼠)中的血清白蛋白结合或半衰期延长功能。
IVD-缀合物的又一具体实例是抗体-药物缀合物(ADC)。原则上，适于治疗目的的每种药剂均构思于本文中。如所述那样的治疗剂一般是小分子或生物制品，但是治疗剂也可以具有另一起源，这应当是技术人员显而易见的并且本发明不应当限于此。那些ADC药物目前是活跃的研究领域，主要聚焦于肿瘤学治疗剂，还有限程度地聚焦于其他领域如传染性疾病(Bessire等人,2016)，通常由三个主要组分组成：选择性靶向肿瘤细胞表面抗原的抗体(或IVD)、细胞毒有效荷载和连接这两种部分的接头单元，在这种情况下所述接头单元也构成血清白蛋白结合性IVD。与细胞表面抗原结合，ADC通过内吞过程内化，并且随后转运至内体和/或溶酶体。在这些区室中，通过抗体分解代谢或通过蛋白酶剪切接头、pH触发的水解或二硫键还原，释放细胞毒有效荷载部分。对于具有可剪切接头的ADC，剪切触发物通常决定于所用接头的性质。例如，常用的可剪切接头缬氨酸-瓜氨酸氨基甲酸对-氨基苄酯(vc-PABC)是胞内半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶B的底物。可剪切接头ADC一般释放未修饰的有效荷载作为活性部分。然而，不可剪切接头ADC不含有快速化学释放或酶促释放机制，反而依赖于降解抗体以释放活跃种类。这些ADC可以含有很多化学接头中任一者，或根本不含接头，并且一般释放带有接头和一个或多个来自抗体或IVD的氨基酸的细胞毒有效荷载。
在某些实施方案中，IVD-缀合物包含在赖氨酸和缀合物或缀合物部分之间的接头。某些接头比其他接头更有用并且具体接头的用途将取决于应用。通常，本领域已知的多种接头可以用来连接本发明的IVD和缀合部分。如应当显而易见，可剪切和不可剪切接头可以用来实现所需的释放特征。通常，必须独特地调整接头和缀合化学的最佳组合，以关联每个独特方面：IVD、缀合部分和待治疗疾病的概况。关于本文所用的抗体-药物缀合物和接头的综述，例如参见McCombs和Owen(2015)和Lu等人,(2016)以及Pillow(2017)的最新综述，其描述可用于治疗癌症和传染性疾病的缀合物中的新型季铵盐接头。其他合适的间隔序列或接头仍将是技术人员显而易见的，并且通常可以是本领域使用的任何接头或间隔序列。在具体方面，接头或间隔序列适用于意图用于制药的应用中。例如在某些方面，赖氨酸和缀合物之间的接头还可以是合适的氨基酸序列，并且尤其是在1和50个氨基酸残基之间或更具体地1和30个氨基酸残基之间的氨基酸序列。这类氨基酸序列的一些实例包括Gly-Ser(GS)接头。另外，其他合适的接头通常包含有机化合物或聚合物，尤其适合用于制药用途的多肽中的那些。例如，聚(乙二醇)部分已经用来连接抗体结构域，参见例如WO 04/081026。本发明的范围内涵盖以下情况：接头的长度、柔性程度和/或其他特性可能某种程度影响本发明的最终IVD缀合物的特性，包括但不限于对特定靶的亲和力、特异性或亲合力。基于本文公开内容，技术人员将能够确定用于本发明具体IVD中的最佳接头，任选地在有限数目的常规实验后确定。例如，在包含结构单元的针对第一和第二靶的本发明多价或多特异性IVD中，接头的长度和柔性优选地是这样，从而它允许每个结构单元与其同族靶结合。再次，基于本文公开内容，技术人员将能够确定用于本发明具体IVD中的最佳接头，任选地在有限数目的常规实验后确定。最后，本发明的IVD中使用两种或更多种接头时，这些接头可以相同或不同。再次，基于本文公开内容，技术人员将能够确定用于本发明具体多肽中的最佳接头，任选地在有限数目的常规实验后确定。
在又一个实施方案中，本发明提供产生本发明IVD缀合物的方法。通常，这类方法始于将表达载体引入选择的合适细胞中，所述表达载体包含编码本发明IVD的核苷酸序列，随后表达IVD多肽一些时间，纯化IVD多肽并将具体缀合部分与纯化的IVD多肽连接。偶联方法本身通常在体外实施。本领域内存在连接本发明IVD多肽和具体缀合部分的几种可能性。通常而言，存在实施偶联反应的化学缀合策略、酶促缀合策略和化学-酶促联合缀合策略。在一个具体实施方案中，本发明包含IVD-缀合物的多肽用来调节循环半衰期或用来增加IVD稳定性，对于选择性靶向而言，用来调节IVD-缀合物的免疫原性或用于检测目的。在又一个实施方案中，使用本发明的IVD-缀合物作为药物。
实际上，本发明的又一个方面涉及包含血清白蛋白结合性IVD的本发明所述多肽，用来增加治疗用部分的半衰期。
目前，利用白蛋白结合或融合、融合于免疫球蛋白Fc区和PEG化的策略支配了生物治疗剂的半衰期延长(Konterman,2016)。因此，本发明血清白蛋白结合性多肽用于治疗用部分或生物制品的半衰期延长或半衰期增长的用途必定地是所述发明的很有前景应用。实际上，通过将血清白蛋白结合性多肽与所述治疗用部分连接或偶联，提供本发明的治疗用部分，所述的治疗用部分可以基本上是任何类型的分子，并且优选地是蛋白质，或更具体地包含IVD。所述偶联或连接可以借助CDR1中的赖氨酸进行，但也可以借助其他残基(如，本发明IVD或多肽的N末端或C末端)进行。
一个实施方案进一步涉及血清半衰期增加的治疗剂，特征在于所述药剂(其可以是较大的多肽或大分子)包含多肽，所述多肽包含本发明的IVD且另外包含治疗用部分。所述治疗剂的特征在于如与缺少本发明的血清白蛋白结合性多肽的相同治疗剂相比，具有较长的半衰期。
在多种实施方案中，还应用本发明多肽用作药物，所述多肽包含与血清白蛋白结合的本发明IVD或本发明的治疗剂。
在具体实施方案中，除了包含血清白蛋白结合亲和力的IVD之外，所述作为药物的用途将涉及所述多肽内部治疗用部分的存在。在所述实施方案中，本发明备选地提供多特异性构建体。
更具体地，所述多特异性构建体包含具有本发明的血清白蛋白结合性IVD和至少一个治疗用部分的所述多肽。因此，所述多特异性或多价构建体或多肽包含至少一个抗原结合位点，具有对血清白蛋白的亲和力，和至少一个治疗上更有有用的部分，所述部分在某些实施方案中还包含靶向治疗相关的蛋白质的抗原结合位点。在所述治疗用部分包含IVD的实施方案中，本发明包含融合的可变结构域，如多价和/或多特异性构建体。关于含有一个或多个VHH结构域的多价和多特异性多肽及其制备，还参考Conrath等人(2001)以及例如WO 96/34103和WO 99/23221。备选地，实施方案涉及多特异性或多价构建体，其中所述治疗用部分包含IVD或ISVD的片段。最后，多种实施方案涉及本发明的多特异性或多价构建体，其中多肽与至少一个治疗用部分经接头或间隔序列连接。
在本发明的另一个方面，提供编码本发明多肽或本发明多特异性构建体的核苷酸序列或核酸或核酸分子。
备选实施方案涉及包含所述核苷酸序列的载体。如本文所用，术语“载体”包括技术人员已知的任何载体，包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体，如λ噬菌体、病毒载体，如腺病毒载体、AAV载体或杆状病毒载体，或人工染色体载体如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、或P1人工染色体(PAC)。所述载体包括表达载体以及克隆载体。表达载体包含质粒以及病毒载体并且通常含有所需编码性序列和对特定宿主生物(例如，细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)或体外表达系统中表达有效连接的编码性序列必要的适宜DNA序列。一般，“表达载体”包含这样的核苷酸序列，其中可表达启动子或调节性核苷酸序列有效连接于或接合于编码mRNA的核苷酸序列或DNA区域，从而调节性核苷酸序列能够调节所接合的核苷酸序列的转录或表达。一般，载体的调节性核苷酸序列或启动子并未如自然界中所发现那样与接合的核苷酸序列有效连接，因此对与其有效连接的DNA区域的编码性序列为异源。如本文中所用的术语“有效地”(operatively or operably)“连接”指可表达启动子序列和目的DNA区域或基因之间功能性连接，从而启动子序列能够启动目的基因的转录，并且指在目的基因和转录终止序列之间确保充分终止真核细胞中转录的功能性连接。克隆载体通常用来工程化并扩增某些所需的DNA片段并且可以缺少为表达所需DNA片段需要的功能序列。
另一个实施方案涉及宿主细胞或表达宿主，其包含本发明提供的多肽或多特异性构建体或核酸序列或分子。术语“宿主细胞”、“表达宿主”或“宿主”指用来以重组方式表达目的蛋白质或核酸的细胞系统。宿主细胞可以涉及“高等真核细胞”，其指并非单细胞生物源细胞的真核细胞。换句话说，高等真核细胞是来自(或在细胞培养的情况下，衍生自)多细胞真核生物的细胞，如人细胞系或另一个哺乳动物细胞系(例如，CHO细胞系)。一般，高等真核细胞将不是真菌细胞。具体地，该术语通常指哺乳动物细胞、人细胞系和昆虫细胞系。更具体地，该术语指脊椎动物细胞，甚至更具体地指哺乳动物细胞或人细胞。如本文所述的高等真核细胞一般将是细胞培养物(例如，细胞系，如HEK或CHO细胞系)的部分，不过并不总是严格要求这点(例如，在植物细胞的情况下，植物本身可以用来产生重组蛋白)。宿主细胞还涉及如本文所用的“低等真核细胞”，其中意指丝状真菌细胞或酵母细胞。酵母细胞可以来自以下的物种：酵母属(Saccharomyces)(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、汉逊酵母属(Hansenula)(例如，多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))、阿氏酵母属(Arxula)(例如，解腺嘌呤阿氏酵母(Arxula adeninivorans))、耶罗维亚酵母属(Yarrowia)(例如，解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica))、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(例如，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis))或先前命名并且按旧命名作为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)更知名且还进一步用于本文中的法夫驹形氏酵母(Komagataella phaffii)(Kurtzman,2009)。根据具体实施方案，低等真核细胞是毕赤酵母属(Pichia)细胞，并且在一个最具体的实施方案中是巴斯德毕赤酵母细胞。在具体实施方案中，丝状真菌细胞是嗜热毁丝霉(Myceliopthora thermophila)(Dyadic公司也称作C1)、曲霉属(Aspergillus)物种(例如，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus))、镰刀菌属(Fusarium)物种(例如，有毒镰刀菌(Fusarium venenatum))、肉座菌属(Hypocrea)和木霉属(Trichoderma)物种(例如，里氏木霉(Trichoderma reesei))。涉及“原核细胞”的宿主细胞一般指非致病性原核生物，如细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)、乳球菌属(Lactococcus)和芽孢杆菌属(Bacillus)物种。
本发明的另一个方面涉及一种药物组合物，其包含至少一种蛋白质，所述蛋白质包含具有血清白蛋白结合性特性的本发明IVD，或至少一种本发明治疗剂，或至少一种本发明多特异性构建体，和任选地至少一种可药用载体、稀释剂或赋形剂。
本发明因此包括这样的药物组合物，其包含可药用载体、稀释剂或赋形剂和药用有效量的多肽，所述多肽包括IVD或IVD-缀合物，与血清白蛋白结合，并且任选地还在多特异性构建体中借助CDR1中其赖氨酸与另一个治疗用或诊断用部分缀合或与药物缀合。“载体”或“佐剂”、尤其“可药用载体”或“可药用佐剂”是任何合适的赋形剂、稀释剂、载体和/或佐剂，它们本身不诱导有害于接受组合物的个体产生抗体，也不激发保护作用。“可药用”意指并非在生物上不利或并非另外不利的材料，即，该材料可以随化合物一起施用至个体，不造成任何不利的生物效果或不以有害方式与其中含有该材料的药物组合物的任何其他组分相互作用。可药用载体优选地是这样的载体，其在与活性成分的有效活性相符的浓度，对患者相对无毒和无害，从而可归咎于载体的任何副作用不破坏活性成分的有益作用。优选地，可药用载体或佐剂增强受抗原激发的免疫应答。合适的载体或佐剂一般包括一种或多种纳入以下非排他性清单的化合物：巨大的缓慢代谢的大分子如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性病毒粒子。如本文所用，术语“赋形剂”意在包括可以在药物组合物存在且不是活性成分的全部物质，如盐、粘合剂(例如，乳糖、右旋糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘露糖醇)、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲物质、稳定剂、矫味剂或色素。“稀释剂”、尤其“可药用溶媒”，包括溶媒如水、盐水、生理盐溶液、甘油、乙醇等。辅助物质如润湿或乳化剂、pH缓冲物质、防腐剂，可以纳入这类溶媒。
本发明多肽或缀合物和可药用载体的药用有效量优选地是对正在接受治疗的具体病状产生结果或施加影响的量。通常，“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”意指为实现所需一种或多种结果而需要的量。本领域普通技术人员会认识到，效价和因此“有效量”可通过本发明多肽中存在的其他治疗用部分，对结合血清白蛋白的多肽和/或其他抗原而言变动。本领域技术人员可以轻易地评估抗体的效价。
本发明的多肽和缀合物和可药用载体可以借助本领域熟知的可药用载体，使用任何有效的常规剂量形式(包括速释、缓释和时间释放制剂)施用，并且可以借助任何合适的途径，如本领域普通技术人员公知的那些途径中任一者施用。对于疗法，本发明的药物组合物可以根据标准技术施用至任何患者。施用可以通过任何适宜的模式进行，包括经口、肠胃外、局部、经鼻、经眼、鞘内、脑室内、舌下、直肠、阴道等。其他配制技术如纳米技术和喷雾剂和吸入剂依旧还处于本发明的范围内。剂量和给药频率将取决于年龄、性别和患者状况、其他药物并存施用、禁忌症和临床医务人员考虑的其他参数。本发明的药物组合物可以冻干储存并在使用前于合适的载体中重构。作为冻干或液体剂配制时，需要向本发明的药物组合物加入生理可接受载体、辅料、稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences第22版,编者Allen,Loyd V,Jr.(2012)。载体、赋形剂和稳定剂的剂量和浓度应当对受试者(人类、小鼠和其他哺乳动物)安全，包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂如维生素C、小型多肽、蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如PVP、氨基酸如氨基乙酸盐、谷氨酸盐、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸；单糖、二糖和其他糖如葡萄糖、甘露糖或糊精、螯合剂如EDTA、糖醇如甘露糖醇、山梨醇；反离子如Na+、和/或表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG等。含有本发明药物组合物的制品应当在注射之前灭菌。可以使用无菌过滤膜在冻干和重构之前或之后进行这个程序。药物组合物通常灌装于带无菌入口的容器中，如带软木塞的静脉输液瓶。
本发明的又一个方面涉及一种产生血清白蛋白结合性多肽的方法，所述方法包括步骤
i.在合适的表达系统或宿主细胞中表达本发明的多肽、多特异性构建体或或编码所述多肽或多特异性构建体的核苷酸序列或核酸，并且
ii.纯化或分离所述血清白蛋白结合性多肽。
纯化或分离所述已表达多肽例如意指，而不限于，基于亲和力的纯化，如亲和色谱、亲和纯化、免疫沉淀、蛋白质检测、免疫化学、表面展示，连同其他等，并且全部为本领域熟知。
在另一个实施方案中，本发明提供一种延长治疗剂在受试者中半衰期的方法，所述方法包括施用本发明的药物组合物。
本发明的又一个方面涉及一种包含本发明多肽、多特异性构建体或核酸的试剂盒。该试剂盒可以还包含试剂如缓冲剂、分子标签、载体构建体、参比样品材料以及合适的固相支持物、细胞、核酸等的组合。这种试剂盒可以用于如本文所述的本发明的任何应用。
本发明的范围内还涵盖是包含多肽的固相支持物或树脂，所述多肽包含具有血清白蛋白结合亲和力的本发明IVD。合适的固相支持物的非限制性实例包括珠、柱、片、条或板。更具体地，固相支持物可以呈颗粒状(例如，珠或颗粒，通常用于提取柱中)或处于片形式(例如，膜或滤器、玻璃或塑料片、微量滴定分析平板、浸渍片、毛细管充填装置或其他等)，所述片形式可以是扁平、有褶或中空的纤维或管。给出以下基质作为实例并且它们不是排他性的，这类实例可以包括二氧化硅(多孔无定型氧化硅)，即，Biotage(Dyax Corp.的部门)供应的含有60A不规则二氧化硅(32-63um或35-70um)的FLASH系列管状柱、琼脂糖或聚丙烯酰胺支持物，例如，Amersham Pharmacia Biotech供应的琼脂糖凝胶系列产品或Bio-ad供应的Affi-Gel载体。此外，存在大孔聚合物，如Bio-Rad供应的压力稳性定Affi-Prep支持物。可以利用的其他支持物包括；葡聚糖、胶原蛋白、聚苯乙烯、甲基丙烯酸酯、藻酸钙、可控孔玻璃、铝、钛和多孔陶瓷。备选地，固态表面可以包含部分的质量依赖性传感器，例如，表面等离子体共振检测器。例如在Protein Immobilisation,R.F.Taylor编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,(1991)中讨论其他市售支持物实例。使用本领域已知的技术，固定化可以是非共价的或共价的。
应当理解，虽然已经在本文中对本发明的工程化细胞和方法讨论了具体实施方案、具体布局以及材料和/或分子，但可以对形式和细节做出各种变化或修饰，而不脱离本发明的范围和精神。提供以下实施例以更好显示具体实施方案，并且它们不应当视为限制本申请。本申请仅由权利要求限定。
实施例
实施例1：血清白蛋白结合性VHH SA1的非糖基化变体的产生和解离速率测定。
基于位置28-30处存在NIS糖基化共有序列，人白蛋白结合性VHH SA1(WO2014/037419；本申请SEQ ID NO:5)在位置28处含有推定性N-糖基化位点。显示在巴斯德毕赤酵母中表达SA1时，该位点易于部分糖基化。因此，通过将位置30处的丝氨酸突变成赖氨酸氨基酸，设计了无糖基化共有序列的SA1突变变体SA1_S30K(SEQ ID NO:4)。
这种SA1突变变体SA1_S30K以及基准VHH也结合血清白蛋白(ALB8；来自EP1888641B1的SEQ ID NO:62)，并且将SA1的未突变形式亚克隆入pHEN6c表达载体(Ghahroudi等人,1997)中pelB前导信号序列(用于VHH周质运输)和C末端六组氨酸(His6)标签之间。将该载体电转化入大肠杆菌WK6并接种到LB-琼脂氨苄青霉素平板上。将克隆接种于1mL TB+氨苄青霉素培养基中。5小时后，用1mM IPTG诱导VHH产生。在过夜产生后，将细胞培养物离心并将细胞重悬于TES缓冲液(Tris pH8.0+蔗糖和EDTA)中。在2小时温育后，添加水用于另外4小时温育。通过离心移除细菌，此后将周质提取物(PE)立即冷冻在-80℃。
中性pH缓冲液(PBS)中和低pH缓冲液(75mM乙酸钠，pH 5.5)中按1/4稀释度，分析全部PE的解离速率排序(表1)。使用人血清白蛋白(HSA)包被的Octet AR2G传感器(将HSA按20μg/mL在pH 5.0偶联，如FortebioTechnical Note 26中详述)，在Octet RED96(Fortebio)仪上，通过BioLayer Interometry分析解离速率。
基于两种pH条件时观测的结合水平、两种pH条件时的解离速率和氨基酸的生物物理特性，得出结论：SA1_S30K突变变体适于进一步分析。
表1：如与对照相比，SA1_S30K的解离速率筛选结果
以纳米(nm)为单位的响应、每秒解离速率(kdis)(1/s)、解离速率的误差(kdis误差)和决定系数(Dissoc R2)
实施例2：重组表达和纯化SA1_S30K突变变体VHH时的产率
将SA1_S30K变体于1L TB培养基(3瓶)中表达，并且与SA1未突变的VHH以及Alb8基准比较。在5mL LB+氨苄青霉素中启动每种VHH的小规模过夜培养。这些培养物用来接种3个含330mL TB+氨苄青霉素/葡萄糖的摇瓶。当培养物的OD600达到0.8时，通过添加1mM IPTG(终浓度)诱导培养物。次日，将细胞离心并将沉淀物称重。大部分培养物生长至OD600高于20并且在离心后具有清亮上清液。
通过将沉淀物在12mL TES缓冲液中温育3小时并且随后添加18mL水，对其进行渗透休克。在4℃温育过夜后，通过离心收集PE。随后对沉淀物再次进行渗透休克。当收集全部提取物时，向每份独立PE添加1mL His-选择基质(Sigma-Aldrich)。将混合物在4℃温育1小时，之后空柱中归集。将PE再施加于柱上第二次后，用PBS+20mM咪唑洗涤基质。最后，通过添加PBS+0.5M咪唑并收集1mL级分，洗脱VHH。在nanodrop上在280nm测量这种固定化金属亲和色谱(IMAC)后获得的这些级分以测量收集的VHH的量。汇集含有大量蛋白质的级分并加载于凝胶过滤(GF)柱上。收集并汇集来自VHH单体峰的全部级分。表2中列出最终的VHH产率。
值得注意地，如与原始SA1 VHH相比并且如与基准Alb8相比，SA1_S30K变体显示更高的产率。
表2：如与对照相比，His-选择和大小排阻色谱后SA1_S30K变体的产率。
实施例3：SA1_S30K突变变体VHH的热稳定性。
测定VHH SA1_S30K突变变体的热稳定性，以分析如与SA1相比，纯化的VHH中稳定性是否将受突变影响。在蛋白质浓度0.5mg/mL时测定热稳定性。对于0.5℃期间SyproOrange掺入情况，在Biorad实时PCR仪中监测Sypro橙掺入。使用玻尔兹曼S型拟合，拟合所得值。基于这种拟合，测定每种VHH的解链温度(Tm)(表3)。如与未突变的SA1相比，SA1_S30K显示相似的热稳定性，并且与基准相比，显示热稳定性高得多。
表3：如与对照相比，SA1_S30K变体的Tm。
实施例4：SA1_S30K突变变体VHH对血清白蛋白的亲和力
通过BioLayer Interometry(Octet RED96仪；Fortebio)测定SA1_S30K突变变体以及原始SA1 VHH和基准Alb8对人、食蟹猴、小鼠、大鼠、豚鼠、兔和牛血清白蛋白的亲和力。为此目的，如实施例1中对HSA所述那样，将每个物种的血清白蛋白与AR2G传感器(Fortebio)偶联。
基于初步剖析，从100nM1/2向下连续稀释至1.5nM确定基准VHH Alb8、SA1和SA1_S30K变体的完整动力学概况。但是，归因于对兔白蛋白相互作用的低亲和力，对于这种白蛋白，使用始于1600nM向下至25nM的浓度。表4中呈现每种VHH的所得值。
全部受检VHH对人血清白蛋白的亲和力均可比。牛白蛋白对任意VHH不显示可检出的结合亲和力。
如与基准相比，食蟹猴白蛋白(Uniprot A2V924)、小鼠白蛋白(Uniprot P07724，SEQ ID NO:13)和大鼠白蛋白(Uniprot P02770，SEQ ID NO:14)对SA1 VHH和SA1_S30K VHH的亲和力显著更高。并且令人惊讶地，如与SA1相比，SA1_S30K突变变体对大鼠白蛋白和小鼠白蛋白的亲和力改进。
表4：如与对照相比，SA1_S30K变体血清白蛋白亲和力(以nM计的KD)
NB＝不可检出结合
总之，显示SA1_S30K VHH(即，SEQ ID NO:4中所述的VHH)对大鼠白蛋白的亲和力(KD)是0.02nM或20pM，如与其他VHH相比(如SA1(低20倍)或Alb8(低10,000倍))，这高得多。如与SA1(低2倍)或Alb8(低15倍)相比，SA1_S30K VHH对小鼠血清白蛋白的亲和力(KD)不太明显，但也较高，其为0.29nM或290pM。
实施例5：SA1_S30K突变变体VHH的生物素化
将未突变的对照SA1 VHH和SA1_S30K突变变体VHH按生物素/VHH的5/1摩尔比用生物素标记(来自Thermo-Fisher的"No Weigh"NHS-PEG4-生物素试剂盒)。用ELISA初始评估结合活性并且随后通过BioLayer Interometry(OctetRED96仪；Fortebio)进行亲和力测定。
1)ELISA：简而言之，包被HSA(ON，4℃，5μg/mL、碳酸盐缓冲液)，此后用1％酪蛋白封闭平板(RT，1小时)。随后，温育生物素化VHH的系列(0.5对数)稀释物，起始浓度为3μg/mL(2小时，RT，PBS-0.05％Tween 20–0.1％酪蛋白)。最后，用链霉亲和素-HRP(1小时，RT、PBS-0.05％Tween 20–0.1％酪蛋白)和OPD底物检测生物素化VHH结合。通过添加1M H2SO4终止颜色反应并且在490nm读取OD。使用PBS-0.05％Tween20进行温育之间的洗涤步骤。
2)亲和力：如实施例1中所述，将HSA包被在octet AR2G尖头上。基于先前数据，从100nM1/2向下连续稀释至1.5nM，使用SA1 VHH和SA1_S30K VHH。
针对生物素化SA1_S30K VHH变体观测的ELISA信号明显地更高(图2)，这多半与位置30处的附加赖氨酸残基有关。尽管这个赖氨酸是CDR1(SEQ ID NO:1；根据MacCallum等人、Chothia或AbM的CDR定义)的部分，这种生物素化的确并不明显影响生物素化SA1_S30KVHH对HSA的亲和力(表5：KD或kon或koff变化<2倍)。
表5：(生物素化)SA1_S30K和SA1对照对HSA结合的亲和力。
实施例6：SA1_S30K突变变体VHH在马、犬、猫和猪中的交叉反应性。
显示SA1_S30K突变变体VHH和原始SA1 VHH结合对人类和实验室动物模型血清半衰期延长有意义的众多白蛋白。为了查明这些VHH是否用于兽医应用中，这里测试它们对犬血清白蛋白、猫血清白蛋白、马血清白蛋白和猪血清白蛋白的结合。证明牛白蛋白无反应性(参见实施例4)。对于这些实验，参考基准HSA
(ALB8)。
将不同的白蛋白包被在Octet AR2G生物传感器上并用来使用BioLayerInterometry(Octet RED96仪；Fortebio)，测量SA1_S30K、SA1和ALB8结合的动力学结合曲线。
在Octet AR2G尖头上包被白蛋白
将10mg冻干的猫、犬、马或猪血清(HSA)白蛋白(Sigma)重悬于1mL PBS(10μg/μL)中。结合Fortebio Octet Red96仪，将这种重悬物按20μg/mL用于如Fortebio TechnicalNote 26详述的AR2G生物传感器“配体侦察固定条件”方案中。仅测试pH 5.0和pH 4.0条件。通过使HSA包被的尖头接触于PBS中的1000nM SA1 VHH溶液，确定包被质量。总之，对于猫、马和猪，HSA包被在pH 5.0最高效，并且对于马，在pH 4.0最高效。
结合动力学测定
使用上文描述的包被条件，将3列8个AR2G尖头用每种白蛋白包被用于结合研究。将SA1_S30K VHH、SA1 VHH和ALB8 VHH按浓度800、400、200、100、50、25、12.5和0nM稀释于PBS+0.05％Tween20中。这些浓度与白蛋白尖头接触600秒以测量结合情况，并在含有PBS-Tween20的孔中温育900秒以测量解离。
在数据采集后，使用Octet数据分析软件v9.0分析曲线。1:1结合模型适用于各值，产生涉及马和犬血清白蛋白的实验的Kon、Koff和KD参数(表6)。不能观察到任何VHH对猫血清白蛋白和猪血清白蛋白的结合。对两种(马和犬)白蛋白，观察到SA1_S30K VHH和SA1 VHH的KD为约100nM，伴随约1x10-2/s的高解离速率。对于马血清白蛋白，两种VHH均具有约5x104的Kon。对于犬血清白蛋白，该值在1.5x105略高。SA1_S30K VHH和SA1 VHH对马白蛋白和犬白蛋白均具有可比的结合曲线。ALB8基准VHH不与任何测试的白蛋白结合。
结论
基准VHH ALB8不与猫、犬、马或猪血清白蛋白结合，而原始SA1 VHH以及突变变体SA1_S30K显示与马和犬血清白蛋白有交叉反应性。仅可以观察KD为约10-7的低亲和力，这特别归因于约10-2/s的极高解离速率。不过，对马血清白蛋的5x104结合速率和对犬血清白蛋白的105结合速率可以视为良好值。
表6：SA1_S30K VHH、SA1 VHH和ALB8 VHH对猫(Uniprot P49064)、犬(UniprotP49822)、马(Uniprot P35747)和猪(Uniprot P08835)SA的动力学结合常数。
实施例7：SA1_S30K突变变体VHH在小鼠中的药代动力学特征
为了评估SA1_S30K变体VHH延长其他蛋白质的半衰期的能力，生成了融合蛋白。该构建体由结合于GFP(绿色荧光蛋白)的VHH、GS接头和SA1_S30K VHH组成并且进一步称作VHH-GFP-SA1_S30K(SEQ ID NO:6)。在巴斯德毕赤酵母中表达这种蛋白质并在2步骤程序中从发酵培养基纯化。借助阳离子交换(SP Sepharose Fast Flow；GE Healthcare)的捕获步骤后，将蛋白质通过大小排阻色谱(Superdex 75，GE Healthcare)精制到至少95％纯度的完整蛋白质。最后，将蛋白质在PBS中浓缩至5mg/mL并且无菌过滤。通过评估对GPF(KD0.5nM)和人血清白蛋白(KD 5nM)的亲和力，确认融合蛋白的功能。
在2组12只成年雄性小鼠(雄性RjOrl：Swiss CD-1)中进行PK研究。第一组通过静脉内注射接受剂量等同于10mg/kg的VHH-GFP-SA26。第二组通过腹膜内注射接受相同剂量。血液样品在以下时间点取自每个组3只动物：0.083小时(动物1-3)、0.25小时(动物4-6)、1小时(动物7-9)、3小时(动物10-12)、8小时(动物1-3)、24小时(动物3-6)、72小时(动物7-9)和168小时(动物9-12)。K-EDTA血液储存在冰上直至离心(在3000xg，10分钟，4℃)并且最终的血浆样品冷冻于-20℃。在定量每份血浆样品中的VHH-GFP-SA26浓度后(图3)，静脉内注射和腹膜内注射的终末半衰期分别计算为30.3小时和36.2小时。仅假定GFP结合性VHH的半衰期类似于小鼠中0.5-1.5小时的典型VHH半衰期(Hoefman等人,2015；Huang等人,2008)，因为这种VHH不结合小鼠中的任何靶。因此，这些数据证实，SA1_S30K突变变体很强力地延长其他蛋白质的半衰期。
实施例8：SA1_S30K的人源化
为了改善与人VH结构域的同源性，将SA1_S30K变体VHH序列与最接近的人同源物序列人VH3-23(GenBank：P01764.2)/J5(SEQ ID NO:7)比对。大部分VHH序列中共同的典型残基经常保持不变，因为认为这些残基对VHH特性至关重要。但是，将框架区中似乎不太典型的突变在它们的相应位置突变成人氨基酸。作为SEQ ID NO:4的人源化变体的非限制性实施例，对SA1_S30K变体VHH产生四种不同的人源化序列，如由SEQ ID NOs:8-11提供，其包含C末端六组氨酸标签用于纯化(类似于实施例1)。产生全部4种变体并根据用于SA1_S30KVHH的方法纯化(参见实施例1和2)，并且在SDS-PAGE上鉴定为纯单体(图4)。其次，分析它们与人血清白蛋白和动物血清白蛋白结合的亲和力(如实施例4中那样进行)。
在表7中，显示观察到对人或食蟹猴血清白蛋白的亲和力无损失，从而产生4种适于进一步分析的人源化变体。
表7：如与SA1_S30K参考相比，SA1_S30K人源化变体的血清白蛋白亲和力(KD)。
实施例9：人源化SA1_S30K VHH变体的热稳定性。
分析了人源化变体的热稳定性(如实施例3中那样进行)，并且揭示，如与SA1_S30KVHH相比，全部四个人源化变体均展示相等或更高的解链温度(Tm)(表8)。
表8：如与SA1_S30K参考相比，SA1_S30K人源化变体的Tm。
更细致探究时，2个氨基酸置换的贡献显著升高解链温度TM并因此改进人源化变体的热稳定性：观察到SA1_S30K_h2和SA1_S30K_h3的Tm升高4℃，并且如与SA1_S30K VHH相比，甚至观察到SA1_S30K_h4的Tm升高总计8℃。有助于这种热稳定性升高的置换可以从图5得出：位置79处(Kabat编号)的组氨酸(H)置换成酪氨酸(Y)以及位置82b处的苏氨酸(T)置换成丝氨酸(S)对人源化VHH产生协同性稳定效果。这些置换各自促成Tm升高4℃(参见h2和h3)，并且与SA1_S30K VHH相比，h4中两种置换的组合导致8℃升高(表8)。
总之，如与SA1_S30K VHH相比，H79Y和T82bS升高VHH的解链温度4℃，并且组合升高8℃，这显示，至少3种人源化变体(h2、h3和h4)如与非人类序列相比展示出改进的热稳定性。
实施例10：人源化SA1_S30K VHH变体的溶解度
通过以下2种不同方案分析VHH的溶解度：一方面通过添加主要通过排阻体积效应沉淀蛋白质的聚乙二醇(PEG)，测量表观蛋白质溶解度(Toprani等人，JPharmSci,2016)，并且另一方面，借助重复冻融后测量可溶性蛋白含量。
使用商业浓缩装置(Pierce浓缩器，PES，3K，MWCO；5-6mL)浓缩VHH制备物。在Nanodrop装置上在OD280nm分析每个步骤之前和之后的蛋白质浓度。
对于第一测试(PEG沉淀测试)，将VHH样品按4mg/mL与等体积的0、10、20或40％(w/v)PEG10000混合，以实现PEG终浓度0、5、10和20％(w/v)。在温育过夜后，将样品在96孔滤板中(Millipore
HTS GV 0.22μm亲水性
PVDF膜)离心，并且收集滤液供浓度测定(OD280nm)、浊度(OD320nm)和聚集评估(OD500nm、OD600nm)。保留未过滤的样品以评估过滤前浊度。
对于第二冻融测试，使浓度3mg/ml的VHH样品经历5次冷冻(-80℃)和解冻(RT)循环(冷冻：4小时或过夜；解冻1小时)。在第5次循环后，测量96孔过滤板上过滤之前和之后的OD280nm、OD320nm、OD500nm和OD600nm并且与冻融循环时间期间4℃储存的参比样品比较。
表9：PEG温育的VHH样品的OD280nm值(与参比样品比较)
表9表明使用PEG水排阻测试在高达1.5mg/mL终浓度的浓度测试VHH时，就溶解度而言，在各种VHH之间未观察无主要差异。
表10：冻融循环的样品的OD280nm值和OD320nm值(与参比样品比较)
| 样品 | OD280 | OD320 |
| SA1_S30K_h1 | 0.778 | 1.097 |
| SA1_S30K_h2 | 0.759 | 1.065 |
| SA1_S30K_h3 | 0.777 | 1.078 |
| SA1_S30K_h4 | 1.073 | 1.053 |
| SA1_S30K | 0.604 | 1.066 |
表10显示对于冻/融循环，VHH样品之间差异也不明显。
因此，得出结论，全部人源化变体的溶解度至少与SA1_S30K VHH一样高。
参考文献
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Claims (20)
1.一种包含免疫球蛋白可变结构域的多肽(IVD)，其中所述IVD与血清白蛋白结合，并且其中IVD的氨基酸序列包含以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，并且其中3个互补决定区(CDR)选自如SEQ ID NOs:4、8、9、10或11的任意中存在的那些CDR1、CDR2和CDR3区域。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中CDR1包含SEQ ID NO:1，CDR2包含SEQ ID NO:2并且CDR3包含SEQ ID NO:3。
3.根据权利要求1或2述的多肽，其中框架3(FR3)区的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:4的FR3序列或对应于SEQ ID NO:4的人源化变体的FR3序列，其中位置73和74处的氨基酸(根据Kabat编号)是任何氨基酸，位置78处的氨基酸是V或L，位置79处的氨基酸是H或Y，和/或位置82b处的氨基酸是T或S。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含了包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或SEQ ID NO:4的人源化变体的IVD。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中FR3氨基酸(根据Kabat编号)在位置79处是Y和/或在位置82b处是S。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含了包含SEQ ID NO:4的人源化变体的氨基酸序列的IVD。
7.根据权利要求6所述的多肽，其中SEQ ID NO:4的人源化变体是SEQ ID NO:8、9、10、11、15、16或17或其其它人源化变体。
8.根据权利要求所述的多肽7，其中所述其它人源化变体包含在以下位置处置换了至少一个附加氨基酸(根据Kabat编号)的SEQ ID NO:4、8、9、10、11、15、16或17：在位置1处置换成E或D、在位置5处置换成V、在位置14处置换成P、在位置73处置换成任何氨基酸、在位置74处置换成任何氨基酸、在位置78处置换成L或在位置108处置换成L。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的多肽，其中所述多肽是IVD缀合物，其中所述IVD借助CDR1的赖氨酸残基配对。
10.根据权利要求9所述的多肽，其中所述IVD与药物缀合。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的多肽，用于增加治疗用部分的半衰期。
12.血清半衰期增加的治疗剂，特征在于所述药剂包含根据权利要求1-11中任一项所述的多肽和治疗用部分，其中如与无所述多肽的治疗用部分的半衰期相比，治疗剂的半衰期较长。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的多肽或根据权利要求12所述的治疗剂，用作药物。
14.多特异性构建体，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的多肽或和至少一个治疗用部分。
15.根据权利要求14所述的多特异性构建体，其中治疗用部分包含IVD、免疫球蛋白单一可变结构域或其片段。
16.根据权利要求14或15中任一项所述的多特异性构建体，其中多肽经接头或间隔序列与至少一个治疗用部分连接。
17.核苷酸序列或核酸，其编码根据权利要求1至11中任一项所述的多肽或根据权利要求14至16中任一项所述的多特异性构建体。
18.宿主细胞，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的多肽、根据权利要求14至16中任一项所述的多特异性构建体或根据权利要求17所述的核苷酸序列或核酸。
19.药物组合物，包含根据权利要求1至11中任一项所述的至少一种多肽、根据权利要求12所述的治疗剂、根据权利要求14至16中任一项所述的多特异性构建体和任选地至少一种可药用载体、稀释剂或赋形剂。
20.产生血清白蛋白结合性多肽的方法，包括步骤
i.在合适的表达系统中表达根据权利要求1至11中任一项所述的多肽、根据权利要求14至16中任一项所述的多特异性构建体或根据权利要求17所述的核苷酸序列或核酸，以及
ii.纯化所述血清白蛋白结合性多肽。
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