CN105579062A - 组合的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于治疗受试者的癌症的适于同时、单独或顺序施用的组合的药物组合物，所述组合的药物组合物包含：(a)缀合物，所述缀合物包含：(i)包含白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列的多肽，和(ii)包含IL-15Rα的sushi结构域或其衍生物的氨基酸序列的多肽；编码所述缀合物的多核苷酸或包含这种多核苷酸的载体；和(b)拮抗T细胞活化的抑制中牵涉的免疫通路的抗体或其片段，编码所述抗体或其片段的多核苷酸或包含这种多核苷酸的载体。

Description

组合的药物组合物
本国际专利申请要求于2013年8月8日提交的欧洲专利申请EP13003964.7的优先权，该申请以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及新的“组合的药物组合物”，更具体地涉及用于治疗癌症的特异性IL-15超激动剂和拮抗T细胞活化的抑制中牵涉的免疫通路的抗体的组合。
背景技术
适应性免疫响应涉及称为T细胞和B细胞的两种主要淋巴细胞类别的活化、选择和克隆性增殖。当遭遇抗原后，T细胞增殖并分化为抗原特异性效应细胞，而B细胞增殖并分化为抗体分泌细胞。
T细胞的活化是一个多步骤的过程，这一过程需要T细胞和抗原呈递细胞(APC)之间的若干信号传导事件。对于T细胞活化的发生，必须有两种信号传递至静息T细胞。
第一种信号由抗原特异性T细胞受体(TcR)介导，并赋予免疫响应特异性。
第二种共刺激信号调节响应的幅度并通过T细胞上的辅助受体传递。这些受体包括免疫抑制受体(例如CTL-A4、PD-1或抑制性KIR)和共刺激受体(例如CD40、4-1BB、OX-40或糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(TNFR)相关蛋白(GITR))。
根据免疫抑制受体的抑制或共刺激受体的活化，已经开发了多种治疗策略来增强免疫系统的抗肿瘤响应。
事实上还设想了组合的策略。现在，根据所测试的化合物得到的结果具有很大的不确定性。
发明概述
现在，发明人展示了其命名为RLI的特异性化合物和拮抗T细胞活化的抑制中牵涉的免疫通路的抗体的组合，这种组合导致很高比例的肿瘤消退，而这种消退是基于仅采用RLI或免疫抑制受体拮抗剂所获得的肿瘤消退不能想象的。
此外，采用低剂量的组合也获得这一协同作用，在该低剂量的组合中低剂量的RLI与低剂量的抗-PD1组合。惊奇的是，与前述组合相比，这一组合提供了强的、协同的肿瘤生长抑制。
这种强的协同作用能够想到新的疗法。
因此，本发明涉及一种用于治疗受试者的癌症的适于同时、单独或顺序施用的组合的药物组合物，所述组合的药物组合物包含：
1)缀合物，所述缀合物包含：(i)包含白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列的多肽，和(ii)包含IL-15Rα的sushi结构域或其衍生物的氨基酸序列的多肽；编码所述缀合物的多核苷酸或包含这种多核苷酸的载体；和
2)拮抗T细胞活化的抑制中牵涉的免疫通路的抗体或其片段，编码所述抗体或其片段的多核苷酸，或包含这种多核苷酸的载体，
作为用于治疗受试者的癌症的同时、单独或顺序使用的组合制剂。
第二方面，本发明涉及用于治疗癌症的方法，该方法包括向有此需要的受试者同时、单独或顺序地施用治疗有效量的如下物质的步骤：
1)上述缀合物，编码所述缀合物的核酸序列，或包含这种多核苷酸的载体，和
2)拮抗T细胞活化的抑制中牵涉的免疫通路的抗体或其片段，编码所述抗体或其片段的核酸序列，或包含这种多核苷酸的载体。
附图说明
图1示出了用于小鼠癌症模型的BIOXCELL抗-PD1注射实验规程。
图2示出了CT26模型中存在的TIL。
图3示出了小鼠中抗-PD1(RPMI1-14)和RLI的组合疗法。
图4示出了对于抗-PD1/RLI组合治疗的小鼠的存活。
图5示出了用于小鼠癌症模型的注射实验规程。
图6示出了小鼠中抗-PD1(mBAT)和RLI的组合疗法。
发明详述
缀合物
术语“白细胞介素15”为其在本领域的一般含义，是指具有类似于IL-2的结构的细胞因子(GRABSTEIN等,Science,vol.264(5161),p:965-968,1994)。这种细胞因子也被称为IL-15、IL15或MGC9721。这种细胞因子和IL-2共享许多生物活性，且发现它们结合相同的促红细胞生成素受体亚基。因此，IL-15和IL-12可以竞争相同的受体，从而负调节彼此的活性。已经证实，IL-15调节T细胞和自然杀伤细胞的活化和增殖，且证明CD8+记忆细胞的数量由IL-15这种细胞因子和IL-2之间的平衡来控制。如实施例中所公开的，IL-15的活性可以通过测定其对kit225细胞系的增殖诱导来测量(HORI等,Blood,vol.70(4),p:1069-72,1987)。
对于kit225细胞系的增殖诱导，所述IL-15或其衍生物具有人白细胞介素-15的活性的至少10％，优选地至少25％，更优选地至少50％。
所述白细胞介素15为哺乳动物白细胞介素15，优选地为灵长类动物白细胞介素15，更优选地为人白细胞介素15。
本领域技术人员可以简单地识别哺乳动物白细胞介素15。作为实例，可以引用源自野猪(Susscrofa)(登录号：ABF82250)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)(登录号：NP_037261)、小家鼠(Musmusculus)(登录号：NP_032383)、牛(BosTaurus)(登录号：NP_776515)、家兔(Oryctolaguscuniculus)(登录号：NP_001075685)、绵羊(Oviesaries)(登录号：NP_001009734)、家猫(Feliscatus)(登录号：NP_001009207)、食蟹猴(Macacafascicularis)(登录号：BAA19149)、智人(登录号：NP_000576)、恒河猴(MacacaMulatta)(登录号：NP_001038196)、土拨鼠(Caviaporcellus)(登录号：NP_001166300)或绿猴(Chlorocebussabaeus)(登录号：ACI289)的白细胞介素15。
本文所用术语“哺乳动物白细胞介素15”是指共有序列SEQIDNO:1。
本领域技术人员可以简单地识别灵长类动物白细胞介素15。作为实例，可以引用源自野猪(登录号：ABF82250)、家兔(登录号：NP_001075685)、食蟹猴(登录号：BAA19149)、智人(登录号：NP_000576)、恒河猴(登录号：NP_001038196)或绿猴(登录号：ACI289)的白细胞介素15。
本文所用术语“灵长类动物白细胞介素15”是指共有序列SEQIDNO:2。
本领域技术人员可以简单地识别人白细胞介素15，且所述人白细胞介素15是指氨基酸序列SEQIDNO:3。
本文所用术语“白细胞介素15的衍生物”是指与选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少92.5％(即对应于约10个氨基酸置换)、优选地至少96％(即对应于约5个氨基酸置换)、更优选地至少98.5％(即对应于约2个氨基酸置换)或至少99％(即对应于约1个氨基酸置换)同一性百分数的氨基酸序列。本领域技术人员根据其自身的知识及本专利申请的教导可以简单地识别这类衍生物。作为这类衍生物的实例，可以引用国际专利申请PCTWO2009/135031中描述的那些。还应当理解的是天然的氨基酸可以被化学修饰的氨基酸替换。通常，这种化学修饰的氨基酸增加多肽的半衰期。
本文所用术语两个氨基酸序列之间的“同一性百分数”是指通过将进行比较的两个序列的最佳比对获得的所述两个序列之间相同氨基酸的百分数，这一百分数是纯粹统计学意义的且两个序列之间的差异被随机地分布于氨基酸序列中。本文所用“最佳比对”或“最优比对”是指所确定的同一性百分数(参见下文)最高的比对。两个氨基酸序列之间的序列比较通常是通过比较事先已经根据最佳比对来比对过的序列而实现的；这一比较在片段比较中实现，以便识别和比较局部区域的相似性。除通过手动方式之外，实施比较的最佳序列比对可以通过采用由Smith和Waterman开发的全局同源算法(Ad.App.Math.,vol.2,p:482,1981)、由Neddleman和Wunsch开发的局部同源算法(J.Mol.Biol.,vol.48,p:443,1970)、由Pearson和Lipman开发的相似法(Proc.Natl.Acd.Sci.USA,vol.85,p:2444,1988)、使用这种算法的计算机软件(WisconsinGenetics软件包中的GAP、BESTFIT、BLASTP、BLASTN、FASTA、TFASTA,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WIUSA)、MUSCIE多重比对算法(Edgar,RobertC.,NucleicAcidsResearch,vol.32,p:1792,2004)来实现。为了获得最佳的局部比对，可以优选使用具有BLOSUM62矩阵的BLAST软件。两个氨基酸序列之间的同一性百分数是通过比较最佳比对的两个序列确定的，所述氨基酸序列能够包含相对于参考序列的添加或缺失，以便得到两个序列之间的最佳比对。通过以下方法来计算同一性百分数：确定两个序列中相同位点的数量，用该数量除以比较的位点的总数，然后所得结果乘以100，从而得到两个序列之间的同一性百分数。
优选地，所述白细胞介素15的衍生物是IL-15激动剂或超激动剂。本领域技术人员能够简单地识别IL-15-激动剂或IL-15-超激动剂。作为IL-15-激动剂或IL-15-超激动剂的实例，可以引用国际专利申请WO2005/085282或ZHU等(J.Immunol.,vol.183(6),p:3598-607,2009)中公开的那些。
进一步优选地，所述IL-15激动剂或超激动剂选自包含下述或由下述组成的组：L45D、L45E、S51D、L52D、N72D、N72E、N72A、N72S、N72Y和N72P(参考人IL-15的序列，SEQIDNO:3)。
本文所用术语“IL-15Rα的sushi结构域”具有其在本领域的一般含义，是指起始于IL-15Rα的信号肽之后的第一个半胱氨基酸残基(C1)，并终止于所述信号肽之后的第四个半胱氨基酸残基(C4)的结构域。对应于IL-15Rα的胞外区域的一部分的所述sushi结构域是其结合至IL-15所必需的(WEI等,J.Immunol.,vol.167(1),p:277-282,2001)。
所述IL-15Rα的sushi结构域或其衍生物具有人IL-15Rα的sushi结构域对人白细胞介素-15的结合活性的至少10％，优选至少25％，更优选至少50％。所述结合活性可以通过WEI等公开的方法(上述提及，2001)简单地确定。
所述IL-15Rα的sushi结构域为哺乳动物IL-15Rα的sushi结构域，优选地为灵长类动物IL-15Rα的sushi结构域，更优选地为人IL-15Rα的sushi结构域。
本领域技术人员可简单地识别哺乳动物IL-15Rα的sushi结构域。作为实例，可以引用源自褐家鼠(登录号：XP_002728555)、小家鼠(登录号：EDL08026)、牛(登录号：XP_002692113)、家兔(登录号：XP_002723298)、食蟹猴(登录号：ACI42785)、豚尾猴(Macacanemestrina)(登录号：ACI42783)、智人(登录号：Q13261.1)、恒河猴(MacacaMulatta)(登录号：NP_001166315)、苏门答腊猩猩(Pongoabelii)(登录号：XP_002820541)、白颈白眉猴(Cercocebustorquatus)(登录号：ACI42784)、普通狨(Callithrixjacchus)(登录号：XP_002750073)或豚鼠(Caviaporcellus)(登录号：NP_001166314)的IL-15Rα的sushi结构域。
本文所用术语“哺乳动物IL-15Rα的sushi结构域”是指共有序列SEQIDNO:4。
优选地，包含哺乳动物IL-15Rα的sushi结构域的氨基酸序列的多肽是指共有序列SEQIDNO:5。
本领域技术人员可简单地识别灵长类动物IL-15Rα的sushi结构域。作为实例，可以引用来自家兔、食蟹猴、豚尾猴、智人、恒河猴、苏门答腊猩猩、白颈白眉猴或普通狨的IL-15Rα的sushi结构域。
本文所用术语“灵长类动物IL-15Rα的sushi结构域”指共有序列SEQIDNO:6。
优选地，包含灵长类动物IL-15Rα的sushi结构域的氨基酸序列的多肽是指共有序列SEQIDNO:7。
本领域技术人员可简单地识别人IL-15Rα的sushi结构域，并且所述人IL-15Rα的sushi结构域是指氨基酸序列SEQIDNO:8。
优选地，包含人IL-15Rα的sushi结构域的氨基酸序列的多肽是指SEQIDNO:9。
本文所用术语“IL-15Rα的sushi结构域的衍生物”是指与选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的氨基酸序列具有至少92％(即对应于约5个氨基酸置换)、优选地至少96％(即对应于约2个氨基酸置换)、更优选地至少98％(即对应于约1个氨基酸置换)同一性百分数的氨基酸序列。这类衍生物包含L-15Rα的sushi结构域的四个半胱氨酸残基，且本领域技术人员根据其自身的一般知识及本专利申请的教导可以简单地识别这类衍生物。还应当理解的是天然的氨基酸可以被化学修饰的氨基酸替换。通常，这种化学修饰的氨基酸能够增加多肽的半衰期。
根据优选的实施方案，所述缀合物包含(ii)包含IL-15Rα的sushi和铰链结构域或其衍生物的氨基酸序列的多肽。
所述IL-15Rα铰链结构域定义为开始于sushi结构域后的第一个氨基酸残基并终止于第一个糖基化潜在位点前的最后一个氨基酸残基的氨基酸序列。在人IL-15Rα中，所述绞链区的氨基酸序列由十四个氨基酸组成，所述十四个氨基酸位于该IL-15Rα的sushi结构域之后，位于相对于所述sushi结构域的C末端位置，即所述IL-15Rα绞链区开始于所述(C4)半胱氨酸残基后的第一个氨基酸且终止于第十四个氨基酸(以标准的“从N-末端到C-末端”方向计数)。
所述IL-15Rα的sushi和铰链结构域为哺乳动物IL-15Rα的sushi和铰链结构域，优选地为灵长类动物IL-15Rα的sushi和铰链结构域，更优选地为人IL-15Rα的sushi和铰链结构域。
本领域技术人员可简单地识别哺乳动物IL-15Rα的sushi和铰链结构域的氨基酸序列。本文所用术语“哺乳动物IL-15Rα的sushi和铰链结构域”是指共有序列SEQIDNO:10。
本领域技术人员可简单地识别灵长类动物IL-15Rα的sushi和铰链结构域的氨基酸序列。本文所用术语“灵长类动物IL-15Rα的sushi和铰链结构域”是指共有序列SEQIDNO:11。
本领域技术人员可简单地识别人IL-15Rα的sushi和铰链结构域的氨基酸序列。本文所用术语“人IL-15Rα的sushi和铰链结构域”是指共有序列SEQIDNO:12。
本文所用术语“IL-15Rα的sushi和铰链结构域的衍生物”是指与选自SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的氨基酸序列具有至少93％(即对应于约5个氨基酸置换)、优选地至少97％(即对应于约2个氨基酸置换)、更优选地至少98％(即对应于约1个氨基酸置换)同一性百分数的氨基酸序列。这类衍生物包含L-15Rα的sushi结构域的四个半胱氨酸残基，且本领域技术人员根据其自身的一般知识及本专利申请的教导可以简单地识别这类衍生物。还应当理解的是天然的氨基酸可以被化学修饰的氨基酸替换。通常，这种化学修饰的氨基酸能够增加多肽的半衰期。
缀合物的多肽i)和多肽ii)都可以是非共价连接的，例如在专利US8,124,084B2中公开的复合物中。可通过提供合适量的多肽i)，提供合适量的多肽ii)，在合适的pH和离子条件下混合这两种多肽足以允许复合物(即缀合物)形成的持续时间，并可选地浓缩或纯化所述复合物，简单地获得所述缀合物或复合物。例如，根据标准方法采用肽合成仪；通过在细胞或细胞提取物中分别表达每种多肽，然后分离和纯化所述多肽，可形成所述复合物(即缀合物)的多肽。可选地，通过在相同细胞或细胞提取物中表达多肽i)和多肽ii)，然后例如采用色谱技术，例如具有针对淋巴因子部分、淋巴因子受体部分或复合物的抗体的亲和色谱，分离和纯化该复合物，可形成本发明的治疗性多肽复合物。
缀合物的多肽i)和多肽ii)还可以是采用双功能蛋白质偶联剂或在融合蛋白中共价连接的。
双功能蛋白质偶联剂是本领域技术人员所熟知的，如使用它们的方法，并且所述双功能蛋白质偶联剂包括例如N-琥珀酰亚胺基(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如盐酸二甲基己二酰亚胺)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酸亚胺)、醛(例如戊二醛)、双-叠氮化合物(例如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(例如双-(对重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
术语“融合蛋白”指通过连接最初编码单独的蛋白质的两个或更多个基因产生的蛋白质。其也被称为嵌合蛋白。这种融合基因的翻译产生具有衍生自每种初始蛋白的功能特性的单一多肽。通过应用于生物学研究或治疗的DNA重组技术人工产生重组融合蛋白。重组融合蛋白是通过融合基因的遗传工程化产生的蛋白质。这通常涉及从编码第一个蛋白质的cDNA序列中移除终止密码子，然后通过连接PCR或重叠延伸PCR在框架中附加第二个蛋白质的cDNA序列。然后，由细胞将该DNA序列表达为单一蛋白质。所述蛋白质可以工程化为包括两种初始蛋白质的全序列或任一个初始蛋白质序列的仅一部分。
在一个优选的实施方案中，所述缀合物为融合蛋白。
白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列可以位于相对于IL-15Rα的sushi结构域或其衍生物的氨基酸序列的C-末端或N-末端位置。优选地，白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列位于相对于IL-15Rα的sushi结构域或其衍生物的氨基酸序列的C-末端位置。
白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列与IL-15Rα的sushi结构域或其衍生物的氨基酸序列可被第一“连接子”氨基酸序列隔开。所述第一“连接子”氨基酸序列可以具有足以确保融合蛋白形成合适的二级和三级结构的长度。
在不显著影响融合蛋白生物活性的情况下，第一连接子氨基酸序列的长度是可以变化的。通常，所述第一连接子氨基酸序列包含至少1个、但是少于30个氨基酸，如2-30个氨基酸的连接子，优选10-30个氨基酸的连接子，更优选15-30个氨基酸的连接子，进一步优选15-25个氨基酸的连接子，最优选18-22个氨基酸的连接子。
优选的连接子氨基酸序列是那些允许所述缀合物采用合适构象的序列(即允许通过IL-15Rβ/γ信号传导通路的合适的信号传导活动的构象)。
最合适的第一连接子氨基酸序列(1)将采用柔性延伸构象，(2)不会显示出发展有序二级结构的倾向，所述有序二级结构可与融合蛋白的功能结构域相互作用，和(3)将具有最小的疏水性或带电特性，所述疏水性或带电特性可促进与功能蛋白结构域的相互作用。
优选地，所述第一连接子氨基酸序列包含选自Gly(G)、Asn(N)、Ser(S)、Thr(T)、Ala(A)、Leu(L)和Gln(Q)的近中性氨基酸，最优选地，所述第一连接子氨基酸序列包含选自Gly(G)、Asn(N)和Ser(S)的近中性氨基酸。
连接子序列的实例描述于美国专利No.5,073,627和No.5,108,910中。
更特别地适用于本发明的示例性柔性连接子包括由SEQIDNO:13(SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ)、SEQIDNO:14(SGGSGGGGSGGGSGGGGSGG)或SEQIDNO:15(SGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ)的序列编码的那些连接子。
进一步优选地，所述缀合物为具有序列SEQIDNO:16或SEQIDNO:17的融合蛋白。
免疫抑制受体拮抗剂抗体
术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其对应于包含通过二硫键互连的两个相同的重(H)链(全长时约50-70kDa)和两个相同的轻(L)链(全长时约25kDa)的四个多肽链的四聚体。轻链分为κ和λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，并将抗体的同种型分别限定为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每个重链由N-末端重链可变区(缩写为HCVR)和重链恒定区组成。对于IgG、IgD和IgA，所述重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)组成；对于IgM和IgE，所述重链恒定区由四个结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)组成。每个轻链由N-末端轻链可变区(缩写为LCVR)和轻链恒定区组成。所述轻链恒定区由一个结构域CL组成。可将所述HCVR和LCVR区进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的高变区，穿插着被称为构架区(FR)的更保守的区域。每个HCVR和LCVR由自氨基末端至羧基末端按如下顺序排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。根据熟知的惯例给每个结构域分配氨基酸。抗体结合特定抗原的功能能力取决于每个轻链/重链对的可变区，且主要由CDR确定。
本文所用术语“抗体”是指单克隆抗体本身。单克隆抗体可以是人抗体、嵌合抗体和/或人源化抗体。
有利地，术语抗体是指IgG，如IgG1、IgG2(IgG2a或IgG2b)、IgG3和IgG4。优选地，术语抗体是指IgG1或IgG2，更优选地指IgG2a。
“嵌合抗体”是指由鼠免疫球蛋白的可变区和人免疫球蛋白的恒定区组成的抗体。该改变仅包括用鼠恒定区取代人抗体的恒定区，从而产生对药物用途可具有可接受的足够低的免疫原性的人/鼠嵌合体。已经报道了许多用于产生这种嵌合抗体的方法，从而这些方法构成了本领域技术人员的常识的一部分(参见，例如美国专利No.5,225,539)。
“人源化抗体”是指部分或全部由这样的氨基酸序列组成的抗体：所述氨基酸序列通过改变具有非人互补决定区(CDR)的抗体的序列而衍生自人抗体种系。所述抗体的可变区以及最终的CDR的这种人源化可通过本领域目前熟知的技术进行。作为实例，英国专利申请GB2188638A和美国专利No.5,585,089公开了重组抗体的生产工艺，其中抗体被取代的唯一部分是互补决定区或“CDR”。CDR移植技术已用于产生由鼠CDR和人可变区框架和恒定区组成的抗体(参见，例如RIECHMANN等，Nature，vol.332，p:323-327,1988)。这些抗体保留了对Fc依赖性效应子功能所必需的、但是不太可能引起针对该抗体的免疫响应的人恒定区。作为实例，可变区的框架区被相应的人框架区置换，保持非人CDR基本完整，或甚至用衍生自人基因组的序列替换CDR。在遗传修饰的小鼠中产生完全人抗体，所述小鼠的免疫系统已被改变以对应于人免疫系统。如上述，使用所述抗体的免疫特异性片段，包括代表单链形态的片段，对于用在本发明方法中是足够的。
人源化抗体还指这样的抗体：所述抗体包含人框架、至少一个源自非人抗体的CDR，并且其中存在的任何恒定区与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85或90％、优选至少95％相同。因此，可能除CDR之外，人源化抗体的所有部分都与一个或多个天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。例如，人源化的免疫球蛋白通常不包含嵌合的小鼠可变区/人恒定区抗体。作为实例，可以如下进行人源化免疫球蛋白的设计：当氨基酸属于下述类别时，所采用的人免疫球蛋白(受体免疫球蛋白)的框架氨基酸被源自提供CDR的非人免疫球蛋白(供体免疫球蛋白)的框架氨基酸替换：(a)受体免疫球蛋白的人框架区中的氨基酸对于人免疫球蛋白来说在所述位置是不常见的，而供体免疫球蛋白中的相应氨基酸对于人免疫球蛋白来说在所述位置是常见的；(b)氨基酸的位置紧邻一个CDR；或(c)在三维免疫球蛋白模型中，框架氨基酸的任意侧链原子在CDR氨基酸的任意原子的约5-6埃(中心-至-中心)之内(QUEEN等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.88,p:2869,1991)。当受体免疫球蛋白的人框架区中的氨基酸和供体免疫球蛋白中的相应氨基酸的每个对于人免疫球蛋白来说在该位置不常见时，这种氨基酸被对于人免疫球蛋白来说在该位置典型的氨基酸替换。
本文所用术语“抗体片段”是指能够与其抗体对应物的相同的抗原反应的抗体片段。本领域技术人员可以简单地识别这种片段，其包括，作为实例，本发明包括Fab片段(例如通过木瓜蛋白酶消化)、Fab'片段(例如通过胃蛋白酶消化和部分还原)、F(ab')2片段(例如通过胃蛋白酶消化)、Facb(例如通过纤溶酶消化)、Fd(例如，通过胃蛋白酶消化、部分还原和再聚合)、以及scFv(单链Fv；例如通过分子生物学技术)片段。
采用本领域已知的和/或本文所述的酶裂解、合成或重组技术可以生产这种片段。也可以采用抗体基因以各种截短的形式生产抗体，其中在所述抗体基因中的天然终止位点的上游引入了一个或多个终止密码子。例如，可设计编码F(ab')2重链部分的组合基因以包括编码重链的CH1结构域和/或绞链区的DNA序列。抗体的各个部分可以通过常规技术化学结合在一起，或者可以使用遗传工程化技术制备成连接蛋白。
优选地，所述抗体片段为scFv片段。
术语“拮抗T细胞活化的抑制中牵涉的免疫通路的抗体”是指拮抗免疫抑制受体，如CTL-A4、PD-1或抑制性KIR的抗体，或通过结合免疫抑制受体或其配体、由此通过防止信号下调来促进免疫活化的抗体。作为免疫抑制受体拮抗剂抗体的实例，可以引用对应于CTL-A4、PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L2、抑制性KIR、CD276、VTCN1、BTLA/HVEM、LAG3、HAVCR2和ADORA2A拮抗剂的抗体，优选PD-1/PD-L1抗体。
1987年发现了CTL-A4(细胞毒性淋巴细胞相关抗原，也称为CD152)(BRUNET等,Nature,vol.328,p:267-270,1987)。CTL-A4的主要作用是抑制T细胞活化，这一作用见于患有大量淋巴组织增生的缺乏CTL-A4的小鼠中(CHAMBERS等,Immunity,vol.7,p:8855-8959,1997)。现在，已表明CTL-A4的阻滞能够增强T细胞在体外(WALUNAS等,Immunity,vol.1,p:405-413,1994)和体内(KEARNEY,J.Immunol,vol.155,p:1032-1036,1995)的响应，并且还能增加抗肿瘤免疫(LEACH,Science,vol.271,p:1734-1736,1996)。作为对应于CTL-A4拮抗剂的抗体的实例，可以引用公开在WO01/14424中的易普利单抗(ipilimumab)(也称为MDX-010和10D1，可从MEDAREX获得，且由BRISTOL-MYERSSQUIBB公司以YERVOYTM出售)；公开在WO00/37504中的ticilimumab(也称为11.2.1和CP-675,206)；和公开在国际专利申请WO98/42752、WO01/14424、WO2004/035607和WO2012/120125中的，公开在EP1212422和EP1262193中的，公开在美国专利Nos.US5,811,097、US5,855,887、US5,977,318、US6,051,227、US6,207,156、US6,682,736、US6,984,720、US7,109,003和US7,132,281中的CTL-A4抗体，它们以引用的方式并入本文。
程序性细胞死亡1，也称为PD-1(还称为PDCD1或CD279)，是～55kDI型膜糖蛋白。PD-1是CD28共刺激基因家族的受体，其在天然T、B和NK细胞上适度表达，并通过T/B细胞受体信号传导在淋巴细胞、单核细胞和髓细胞上上调。PD-1具有两个已知的表达谱不同的配体：PD-L1(B7-H1)，其在天然淋巴细胞、在活化的B细胞和T细胞、单核细胞和树突细胞上广泛表达；和PD-L2(B7-DC)，其表达被限制在活化的树突细胞、巨噬细胞和单核细胞及血管内皮细胞上。在一些鼠的同源肿瘤模型中，PD-1或PD-L1的阻滞显著地抑制肿瘤生长或诱导完全消退。因此，PD-1被认为是免疫调节和外周耐受维持中的重要参与物质。作为对应于PD-1/PD-L1/PD-L2拮抗剂的抗体的实例，可以引用公开在WO2006/121168中的纳武单抗(nivolumab)(也称为BMS-936558或MDX1106；抗-PD-1抗体，BRISTOL-MYERSSQUIBB)；公开在WO2009/114335中的Merck3745(也称为MK-3475或SCH-900475，为抗-PD-1抗体)；公开在WO2009/101611中的CT-011(也称为hBAT或hBAT-1，抗-PD-1抗体)；公开在WO2008/156712中的lambrolizumab；公开在WO2010/027423、WO2010/027827、WO2010/027828和WO2010/098788中的AMP514；以及公开在国际专利申请WO2004/056875、WO2006/056875、WO2008/083174、WO2010/029434、WO2010/029435、WO2010/036959、WO2010/089411、WO2011/110604、WO2012/135408和WO2012/145493中的抗体。所述PD-1拮抗剂可对应于抗-PD-L1抗体，如公开在WO2007/005874中的MDX-1105(也称为BMS-936559，抗-PD-Ll抗体)或公开在WO2010/077634中的YW243.55.S70(也称为MPDL3280A或RG7446；抗-PD-Ll抗体)，它们以引用的方式并入本文。
杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)是在免疫系统的重要细胞——天然杀伤(NK)细胞上发现的细胞表面蛋白家族。这些杀伤细胞免疫球蛋白样受体通过与在所有细胞类型上表达的MHCI类分子相互作用来调节天然杀伤细胞的杀伤功能。上述相互作用使它们能够检测在其表面具有特征性低水平的I类MHC的病毒感染细胞或肿瘤细胞。多数KIR为抑制性的，即KIR对MHC的识别抑制其NK细胞的细胞毒性活性。仅有限数量的KIR具有活化细胞的能力。
抑制性KIR具有含有免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)的长细胞质尾，该长细胞质尾通过其MHCI类配体的接合将抑制性信号转导至NK细胞。已知的抑制性KIR包括包含KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2和KIR3DL3的KIR2DL和KIR3DL亚家族的成员。作为对应于抑制性KIR拮抗剂的抗体的实例，可以引用公开在WO2006/003179中的抗体1-7F9，其以引用的方式并入本文。
通过免疫细胞、最近通过肿瘤细胞而已知B7配体家族成员具有强的免疫调节活性，这一家族包括CD276和VTCN1。
CD276(分化抗原簇276)(也称为B7H3、B7-H3、B7RP-2、4Ig-B7-H3)是源自B7配体家族的I型跨膜蛋白，其首次于树突细胞和活化的T细胞中得到鉴定。CD276由一些实体肿瘤表达并认为其参与T细胞介导的免疫响应的调节。更特别地，CD276似乎下调T辅助细胞免疫响应并抑制免疫(SUH等，2003)。作为CD276拮抗剂的实例，可以引用公开在专利申请US2005/0169932和WO2008/116219中的抗体8H9，和其它抗体如公开在WO2011/109400中的MGA271。
VTCN1(含有V-set结构域的T细胞活化抑制剂1)，也称为B7X、B7H4、B7S1、B7-H4，也是B7家族的成员。VTCN1被认为在T细胞响应的抑制性调节中发挥重要作用，并且研究表明这种蛋白的高水平与肿瘤进展有关。作为VTCN1拮抗剂的实例，可以引用公开在WO2009/073533中的抗体。
BTLA(B-和T-淋巴细胞衰减因子)，也称为CD272，其在T细胞活化过程中被诱导并保持在Th1细胞、而非Th2细胞上表达。BTLA通过与肿瘤坏死因子(受体)，成员14(TNFRSF14)，也称为单纯疱疹病毒侵入介质(HVEM)、TR2、ATAR、HVEA、CD270、LIGHTR的相互作用来显示T-细胞抑制作用。TNFRSF14被认为是单纯疱疹病毒(HSV)侵入的细胞介质。已发现该受体的胞质区结合至几种可介导活化免疫响应的信号转导通路的TRAF家族成员。最后，BTLA/HVEM复合物负调节T细胞免疫响应。作为BTLA/HVEM拮抗剂的实例，可引用公开在WO2008/076560、WO2010/106051和WO2011/014438中的抗体。
LAG3(淋巴细胞活化基因3，也称为CD223)属于免疫球蛋白(Ig)超家族，其含有4个胞外Ig样结构域。作为LAG3拮抗剂的实例，可以引用公开在WO2010/019570中的抗体。
HAVCR2(甲型肝炎病毒细胞受体2，也称为Tim-3、KIM-3、TIMD3、Tim-3和TIMD-3)是属于免疫球蛋白超家族的Th-1特异性细胞表面蛋白。HAVCR2调节巨噬细胞的活化并抑制Th-1介导的自体免疫响应和同种免疫响应，从而促进免疫耐受。作为HAVCR2拮抗剂的实例，可以引用公开在WO2013/006490A中的抗体。
ADORA2A(腺苷A2A受体，也称为A2aR、RDC8或ADORA2)属于鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)偶联受体(GPCR)超家族，该家族细分为类和亚型。这种蛋白在许多生物功能(如心脏节律和血液循环、脑和肾血流动、免疫功能、疼痛调节和睡眠)中都发挥重要作用。ADORA2A涉及病理生理状况，如炎性疾病和神经退行性疾病。
所述抗体或其片段与所述缀合物未连接。
核酸和载体
本文所用术语“多核苷酸”是指RNA或DNA，优选DNA。
优选地，这种“多核苷酸”可操作地连接到基因表达序列，所述基因表达序列引导核酸在原核细胞或真核细胞内，优选真核细胞内的表达。“基因表达序列”为任何调控核苷酸序列，例如启动子序列或启动子-增强子组合，基因表达序列促进其可操作地连接的免疫细胞因子核酸的有效转录和翻译。基因表达序列可以例如为哺乳动物启动子或病毒启动子，例如组成型或诱导型启动子。
组成型哺乳动物启动子包括但不限于用于如下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPTR)、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶、β-肌动蛋白启动子、肌肉肌酸激酶启动子、人延伸因子启动子及其它组成型启动子。在真核细胞中组成性起作用的示例性病毒启动子包括，例如源自猴病毒(例如SV40)、乳头状瘤病毒、腺病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、巨细胞病毒(CMV)、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)、乙型肝炎病毒(HBV)、莫洛尼氏白血病病毒的长末端重复序列(LTR)及其它逆转录病毒的启动子，和单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。其它组成型启动子是本领域普通技术人员已知的。
可用作基因表达序列的启动子还包括诱导型启动子。诱导型启动子在诱导剂的存在下表达。例如，在某些金属离子的存在下，启动子中的金属硫基蛋白(metallothione)被诱导，以促进转录和翻译。其它诱导型启动子是本领域普通技术人员已知的。
通常，如需要，基因表达序列应当包括分别参与转录和翻译的启动的5'非转录序列和5'非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。特别地，这样的5'非转录序列包括启动子区，所述启动子区包括用于可操作结合核酸的转录控制的启动子序列。如需要，基因表达序列可选地包括增强子序列或上游激活序列。如本文使用，当编码本发明的免疫细胞因子的核酸序列和基因表达序列共价连接而使得本发明的免疫细胞因子编码序列的表达或转录和/或翻译处于基因表达序列的影响或控制下时，编码本发明的免疫细胞因子的核酸序列和基因表达序列被认为是“可操作地连接的”。
如果5'基因表达序列中启动子的诱导导致了本发明的免疫细胞因子的转录，并且如果两个DNA序列之间的连接的性质不会(1)导致移码突变的引入，(2)干扰启动子区域引导本发明的免疫细胞因子转录的能力或(3)干扰相应的RNA转录产物翻译成蛋白质的能力，则两个DNA序列被认为是可操作地连接的。因此，如果基因表达序列能够影响该核酸序列的转录而使产生的转录产物翻译成期望多肽，则基因表达序列是可操作地连接至编码本发明的免疫细胞因子的核酸序列的。
有利地，所述核酸序列包含内含子，因为前体mRNA分子通常被证实提高重组分子的产品收率。可以提出任何内含子序列，作为实例，可以引用在ZAGO等(Biotechnol.Appl.Biochem.,vol.52(Pt3),p:191-8,2009)和CAMPOS-DA-PAZ等(Mol.Biotechnol.,vol.39(2),p:155-8,2008)中公开的那些。
编码所述缀合物或免疫调节抗体的多核苷酸可以在体内单独递送或与载体组合递送。
最广义地讲，“载体”为能够促进编码本发明的免疫细胞因子的核酸转移到细胞中的任何媒介。优选地，载体将核酸转运到细胞，相对于在不存在载体时导致的降解程度，减少了降解。通常，本发明中有用的载体包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒(phagmid)、附加体、人工染色体、病毒、已经通过插入或引入免疫细胞因子核酸序列操作的源自病毒或细菌源的其它媒介。
质粒载体是优选类型的载体，其在本领域已被广泛描述，并且为本领域技术人员所熟知。参见例如SANBROOK等，“MolecularCloning:ALaboratoryManual”第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989。质粒的非限制性实例包括pBR322、pUC18、pUCl9、pRC/CMV、SV40和pBlueScript，以及本领域普通技术人员熟知的其它质粒。另外，可以使用限制性内切酶和连接反应以移除和加入DNA的特定片段来定制设计质粒。
优选地，所述载体可以包括在细菌和哺乳动物细胞中均有活性的可选标记。
药物组合物和治疗方法
本文所用术语“受试者”指哺乳动物，例如啮齿类动物、猫科动物、犬科动物或灵长类动物，最优选人。
本发明的药物组合物可包括一种或多种药学上可接受的媒介物(carrier)。
表述“药学上可接受的”是指这样的分子实体和组合物：其是生理可耐受的，并且当给药于人时通常不产生过敏反应或类似的不良反应，例如反胃、头晕等。优选地，如本文使用的表述“药学上可接受的”指联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典或其它普遍认可的用于动物、更特别是用于人类的药典中列出的。
术语“媒介物”指与化合物一起给药的溶剂、助剂、赋形剂或溶媒。这样的药物媒介物可以为无菌液体，比如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，比如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。
在本发明的上下文中，本文所用术语“治疗”或“处理”指逆转、减缓、抑制应用该术语的障碍或病症或这样的障碍或病症的一个或多个症状的发展，或预防所述障碍或病症或这样的障碍或病症的一个或多个症状。本文所用表述“治疗癌症”是指癌细胞的生长抑制。优选地，所述治疗还导致肿瘤生长的消退，即，可测量肿瘤的尺寸的减小。最优选地，这种治疗导致肿瘤的完全消退。
表述“治疗有效量”是指足以抑制癌细胞的生长，优选地足以诱导肿瘤生长的消退的量。给药剂量可根据多种参数而改变，特别是根据使用的给药模式、相关病理学或可选地期望的治疗持续时间而改变。自然地，药物组合物的形式、给药途径、剂量和方案自然取决于将被治疗的病症、疾病的严重程度、受试者的年龄、体重和性别等。下文中提供的有效剂量的范围不旨在限制本发明和代表优选的剂量范围。然而，如本领域技术人员理解和可确定的，可为单独的受试者定制优选的剂量，而无需过多实验。
鉴于本发明的组合物的显著功效，本领域技术人员可以计划使用两个单独的化合物的非常少的剂量来治疗受试者。
作为非限制性实例，本发明的免疫抑制受体拮抗剂抗体可以以500μg/kg或更低的剂量，优选地以100μg/kg或更低的剂量，最优选地以50μg/kg或更低的剂量通过注射给药。
优选地，所述免疫抑制受体拮抗剂抗体可以以至少1μg/kg受试者的剂量，优选地至少5μg/kg受试者的剂量，最优选地至少10μg/kg受试者的剂量通过注射给药。
作为非限制性实例，本发明的缀合物可以以60μg/kg或更低的剂量，优选地以10μg/kg或更低的剂量，最优选地以5μg/kg或更低的剂量通过注射给药。
优选地，所述缀合物可以以至少0.5μg/kg受试者的剂量，优选地至少0.7μg/kg受试者的剂量，最优选地0.8μg/kg受试者的剂量通过注射给药。
作为实例，所述给药步骤可对应局部、口服、鼻内、眼内、静脉内、肌内、肿瘤内或皮下给药等。优选地，这些给药步骤对应注射。因此，所述缀合物、免疫调节抗体或其片段、编码这种多肽的多核苷酸或包含这种多核苷酸的载体与溶媒相关，所述溶媒对于旨在被注射的剂型为药学上可接受的。特别地，这些可以是等渗的、无菌的盐水溶液(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠，氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或这些盐的混合物)，或干的、尤其是冷冻干燥的组合物，其根据情形加入无菌水或生理盐水时，允许构成可注射的溶液。合适的药物媒介物描述于E.W.Martin的“Remington'sPharmaceuticalSciences”中。
所述缀合物、免疫调节抗体或其片段、编码这种多肽的多核苷酸或包含这种多核苷酸的载体可以溶解在缓冲液或水中，或者包含在乳液、微乳液、水凝胶(例如基于PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的水凝胶)、微球、纳米球、微粒、纳米粒(例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)微粒(例如，聚乳酸(PLA)；聚(丙交酯-共-乙醇酸)(PLGA)；聚谷氨酸酯微球、纳米球、微粒或纳米颗粒)、脂质体或其它盖仑制剂中。在所有情形中，制剂必须是无菌的和注射可接受程度的流体的。制剂必须在制备和贮存条件下稳定，并且必须防止例如细菌和真菌的微生物的污染作用。
呈游离碱或药理上可接受的盐的活性化合物的溶液可在与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)合适地混合的水中制备。
分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在一般的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
本发明的缀合物、免疫抑制受体拮抗剂抗体或其片段、编码这种多肽的多核苷酸或包含这种多核苷酸的载体可以以中性或盐形式配制到组合物中。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，所述酸加成盐是与例如盐酸或磷酸的无机酸或例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成的。与游离羧基形成的盐也可以来源于无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、或氢氧化铁，以及来源于有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。
所述媒介物还可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们合适的混合物及植物油的溶剂或分散介质。所述多肽也可以被修饰，例如被聚乙二醇化，以提高其生物可分布性(biodisponibility)。
例如，通过使用包衣(例如卵磷脂)，在分散体的情况下通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。通过多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，可以实现防止微生物的作用。在许多情况下，优选地包括等渗剂，例如糖或氯化钠。
可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝、明胶、多元醇和增长半衰期的共价和非共价制剂实现。
肽不稳定或降解的原因有许多，包括水解和变性。疏水性相互作用可引起分子集合到一起(即聚集)。可以加入稳定剂从而减少或防止这类问题。
稳定剂包括环糊精及其衍生物(参见美国专利No.5,730,969)。还可加入合适的防腐剂如蔗糖、甘露醇、山梨醇、海藻糖、葡聚糖和甘油以稳定最终制剂。可将选自离子型和非离子型表面活性剂、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-半乳糖醛酸、海藻糖、葡聚糖、羟乙基淀粉、及其混合物的稳定剂添加至所述制剂中。碱金属盐或氯化镁的添加可以稳定肽。所述肽还可通过使其与选自葡聚糖、硫酸软骨素、淀粉、糖原、糊精和海藻酸盐的糖接触而被稳定。其它可添加的糖包括单糖、二糖、糖醇及它们的混合物(例如，葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、木糖醇)。多元醇可稳定肽，且是可与水混溶的或水溶性的。合适的多元醇可以是多羟基醇、单糖和二糖，包括甘露醇、甘油、乙二醇、丙二醇、三甲基二醇、乙烯基吡咯烷酮、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖及它们的聚合物。各种赋形剂也可稳定肽，包括血清白蛋白、氨基酸、肝素、脂肪酸和磷脂、表面活性剂、金属、多元醇、还原剂、金属螯合剂、聚乙烯吡咯烷酮、水解明胶和硫酸铵。
在下文中，参照氨基酸序列、核酸序列和实施例更详细地描述本发明。然而，本发明不旨在受实施例的细节的限制。相反，本发明适于包括在本文实施例中未明确提及的、但本领域技术人员无需过多努力即可发现的细节的任何实施方案。
实施例
1)PD1/PD-L1癌症模型
从BALB/C小鼠的右侧(rightflank)皮下注射CT26肿瘤细胞(2.105/小鼠)。在肿瘤达到20-30mm2的第9天，用250μg/小鼠的仅抗-PD1(BIOXCELL,克隆RPM1-14,#BE0146)或同种型对照(大鼠IgG2a；BIOXCELL,克隆2A3,#BE0089)治疗小鼠。在第9、12和15天注射抗-PD1(α-PD1)或同种型对照(2A3)。自13至37天，用2μg的RLICHO(1004-14p)或PBS的对照组每周两次治疗小鼠。采用卡尺每周测量肿瘤三次，并按照下式计算肿瘤面积：长度×宽度。当肿瘤尺寸达到300mm2或肿瘤溃烂时，将小鼠处死。
实验规程示于图1。自第9天至第15天，患有CT26肿瘤的小鼠接受3次3个剂量(250μg/剂量)的抗-PD1或同种型对照。自第13天至第37天，每周两次注射RLI治疗(2μg/剂量)。
CT26肿瘤模型表达PD-L1(PD1的配体；(DURAISWAMY等，CancerRes.,Jun5,2013))并被高度表达PD1受体的T细胞浸润。图2示出了CT26模型中的肿瘤浸润的CD8+T细胞共表达的PD-1和Tim-3的高频率。将源自患有CT26肿瘤的小鼠的分离的脾和肿瘤染色并用流式细胞术分析。显示了在脾中(左边小图)和肿瘤中(右边小图)的CD3+CD8+T细胞上共表达的Tim-3和PD-1。
图3示出了用抗-PD1(aPD1)或对照(2A3)、RLI或对照(PBS)治疗或根据上述实验规程两者组合(aPD1+RLI)治疗的患有CT26肿瘤的小鼠的肿瘤尺寸演变。(A)：每组的肿瘤生长(n＝5只小鼠/组)，(B)：与A相同，但是源自第二个实验。(C):每组中具有完全肿瘤消退的小鼠的百分数。(D-G):对照治疗组(D)、RLI独立治疗组(F)、aPD1独立治疗组(F)和aPD1+RLI治疗组(F)中每只小鼠的肿瘤生长(实验1和2的汇集，n＝10)。采用双向方差分析(2-wayANOVA)进行统计检验测定。*p<0.05；***p<0,001。
图4示出了抗-PD1/RLI组合治疗增加了小鼠的总存活。A：每一治疗组的总存活(n＝10每组)。
结果显示，与独立组相比，抗-PD1+RLI组合治疗增强了抗-肿瘤效应。特别地，RLI/aPD1治疗增加了具有完全肿瘤消退的小鼠的数量和总存活(图3C和4)。惊奇地，在完全缓解后的第145天，用CT26肿瘤对采用RLI和抗-PD1组合治疗的无肿瘤小鼠再次攻击，小鼠未显示任何肿瘤增长，这表明了保护性抗-肿瘤免疫的持久性(数据未示出)。这些结果在证明了以下情况的另一系列实验中被证实：i)独立组中，当自肿瘤接种后第10天开始治疗，RLI对肿瘤生长无作用；ii)那时，抗-PD1增加了存活但很少引起完全消退(5.9％)。抗-PD1和RLI的组合增加了存活和完全缓解(30,4％)，该种缓解为长效缓解。由于小鼠在完全消退后的145天中仍然为无肿瘤，并且再攻击治愈的小鼠未显示肿瘤恢复，则上述组合诱导了有效的抗肿瘤记忆免疫响应(数据未示出)。
从BALB/C小鼠的右侧皮下注射CT26肿瘤细胞(2.105/小鼠)。第10天，小鼠接受腹腔内(i.p.)注射低剂量抗-PD1(克隆mBAT，12μg/小鼠)或对照、2μgRLICHO(1004-15p)或对照、或两种治疗的组合。一周后(第17天)，小鼠接受第二次注射抗-PD1、RLI或对照。采用卡尺每周测量肿瘤三次，并按照下式计算肿瘤面积：长度×宽度。当肿瘤尺寸达到300mm2或肿瘤溃烂时，将小鼠处死。实验规程示于图5。
图6示出了采用两次腹腔内(i.p.)注射低剂量抗-PD1和RLI的组合治疗的患有CT26肿瘤的小鼠中的CT26肿瘤生长。采用双向方差分析(2-wayANOVA)进行统计检验测定。***p<0,001。
结果表明，低剂量的仅抗-PD1或RLI不能支撑原发性皮下肿瘤生长的抑制。然而，将低剂量的抗-PD1与RLI组合允许肿瘤生长抑制。这一实验证实RLI可以与抗-PD1策略协同作用从而与肿瘤生长斗争，甚至RLI可以与亚适量的抗-PD1治疗协同作用。
最后，这一低剂量的组合似乎导致了显著的产生强肿瘤抑制的协同作用。
2)转移性黑色素瘤
第0天，通过在C57Bl/6小鼠的右侧皮内(i.d.)注射3×104B16F10细胞来植入B16F10肿瘤。通过腹腔内(i.p.)注射用抗-CTLA-4(克隆：UC10-4F10-11100或克隆：9D9)、或用抗-PD-1(克隆RPM1-14，#BE0146)、或用抗-PD-L1mAb(克隆：10F.9G2)或抗-PD-L1mAb(克隆：10F.9G2)与RLICHO(2μg/小鼠)的组合(自第7天至第25天每周两次腹腔内注射2μg的RLICHO)治疗小鼠。每次注射抗-CTLA-4或抗-PD-1或抗-PD-L1抗体的剂量：第3天为200μg和第6天及第9天为100μg。对照组接受相应剂量的抗体同种型。通过物理检查监测随时间推移的肿瘤尺寸和发病率。
3)晚期肺癌
肿瘤细胞系TC-1源自C57Bl/6小鼠的原发性肺上皮细胞，并是人乳头瘤病毒16(HPV-16)E6/E7和c-Ha-Ras共转化的。在C57Bl/6小鼠的背部，向真皮上部中皮下(s.c.)注射105个TC-1肺癌细胞。在肿瘤接种后的第10天启动治疗，此时肿瘤变得清晰可见和可感知，其尺寸≈15-20mm2。在三个单一时间点(第10、14、17天)给予抗-CTLA-4mAb(100μg/小鼠，克隆：UC10-4F10-11100或克隆：9D9)、或抗-PD-1(250μg/小鼠，克隆RPM1-14，#BE0146)、或抗-PD-L1mAb(100μg/小鼠，克隆：10F.9G2)，和在第10、13和18天给予RLI(2μg/小鼠)。每周两次测定的肿瘤生长作为端点(endpoint)，比较单一药剂治疗与每种抗体和RLI的双重组合的治疗。对照组接受相应剂量的抗体同种型。
4)晚期膀胱癌
MB49肿瘤细胞系源自来源于C57BL/6雄性小鼠的膀胱上皮的致癌物诱导的肿瘤。在C57Bl/6小鼠的背部，向真皮上部中皮下(s.c.)注射106个MB49膀胱癌细胞。在肿瘤接种后的第6天启动治疗，此时肿瘤变得清晰可见和可感知，其尺寸≈15mm2。在四个单一时间点(第6、9、12天)给予抗-CTLA-4mAb(100μg/小鼠，克隆：UC10-4F10-11100或克隆：9D9)、或抗-PD-1(100μg/小鼠，克隆RPM1-14，#BE0146)、或抗-PD-L1mAb(100μg/小鼠，克隆：10F.9G2)，和在第7、8、10、11、13、14、16和17天给予RLI(2μg/小鼠)。比较单一药剂治疗与每种抗体和RLI的双重组合的治疗。对照组接受相应剂量的抗体同种型。采用卡尺每周测量肿瘤三次，并按照下式计算肿瘤面积：长度×宽度。当肿瘤尺寸达到300mm2或肿瘤溃烂时，将小鼠处死。
5)乳腺癌
第0天，将5×1044T1乳腺癌细胞接种至BALB/c小鼠的乳腺。在肿瘤接种后的第10天启动治疗，此时肿瘤变得清晰可见和可感知，其尺寸≈15-20mm2。在四个单一时间点(第10、13、16天)给予抗-CTLA-4mAb(100μg/小鼠，克隆：UC10-4F10-11100或克隆：9D9)、或抗-PD-1(250μg/小鼠，克隆RPM1-14，#BE0146)、或抗-PD-L1mAb(200μg/小鼠，克隆：10F.9G2)，和在第10、11、13、14、16、17、19和20天给予RLI(2μg/小鼠)。比较单一药剂治疗与每种抗体和RLI的双重组合的治疗。对照组接受相应剂量的抗体同种型。采用卡尺每周测量肿瘤三次，并按照下式计算肿瘤面积：长度×宽度。第27天时处死小鼠。在双目显微镜下对肺转移结节进行计数。
6)卵巢癌
从小鼠卵巢上皮乳头状浆液性腺癌细胞系预先产生了ID8-VEGF卵巢癌细胞系。在C57Bl/6小鼠的右侧皮下植入5×106ID8肿瘤细胞。在肿瘤接种后的第10天启动治疗，此时肿瘤变得清晰可见和可感知，其尺寸≈15-20mm2。在四个单一时间点(第10、13、16天)给予抗-CTLA-4mAb(100μg/小鼠，克隆：UC10-4F10-11100或克隆：9D9)、或抗-PD-1(250μg/小鼠，克隆RPM1-14，#BE0146)、或抗-PD-L1mAb(200μg/小鼠，克隆：10F.9G2)，和在第10、11、13、14、16、17、19和20天给予RLI(2μg/小鼠)。每周两次测定的肿瘤生长作为端点(endpoint)，比较单一药剂治疗与每种抗体和RLI的双重组合的治疗。对照组接受相应剂量的抗体同种型。采用卡尺每周测量肿瘤三次，并按照下式计算肿瘤面积：长度×宽度。当肿瘤尺寸达到300mm2或肿瘤溃烂时，将小鼠处死。
7)前列腺癌：RM-1
将2×105个RM-1鼠前列腺癌细胞皮下(s.c.)接种至C57BL/6雌性小鼠。在肿瘤接种后的第3天启动治疗，此时肿瘤变得清晰可见和可感知，其尺寸≈15-20mm2。在三个单一时间点(第3、6、9天)给予抗-CTLA-4mAb(100μg/小鼠，克隆：UC10-4F10-11100或克隆：9D9)、或抗-PD-1(250μg/小鼠，克隆RPM1-14，#BE0146)、或抗-PD-L1mAb(200μg/小鼠，克隆：10F.9G2)，和在第6、7、9、10、12、13、15、16、18和19天给予RLI(2μg/小鼠)。每周两次测定的肿瘤生长作为端点(endpoint)，比较单一药剂治疗与每种抗体和RLI的双重组合的治疗。对照组接受相应剂量的抗体同种型。采用卡尺每周测量肿瘤三次，并按照下式计算肿瘤面积：长度×宽度。当肿瘤尺寸达到300mm2或肿瘤溃烂时，将小鼠处死。

Claims (11)

1.一种用于治疗受试者的癌症的适于同时、单独或顺序施用的组合的药物组合物，所述组合的药物组合物包含：
a)缀合物，所述缀合物包含：(i)包含白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列的多肽，和(ii)包含IL-15Rα的sushi结构域或其衍生物的氨基酸序列的多肽；编码所述缀合物的多核苷酸或包含这种多核苷酸的载体；和
b)拮抗T细胞活化的抑制中牵涉的免疫通路的抗体或其片段，编码所述抗体或其片段的多核苷酸，或包含这种多核苷酸的载体。
2.根据权利要求1所述的组合的药物组合物，其中：
a)所述缀合物以60μg/kg或更低的剂量，优选地以10μg/kg或更低的剂量，最优选地以5μg/kg或更低的剂量通过注射给药；和
b)所述拮抗T细胞活化的抑制中牵涉的免疫通路的抗体或其片段以500μg/kg或更低的剂量，优选地以100μg/kg或更低的剂量，最优选地以50μg/kg或更低的剂量通过注射给药。
3.根据权利要求1或2所述的组合的药物组合物，其中所述抗体选自CTL-A4、PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L2、抑制性KIR、CD276、VTCN1、BTLA/HVEM、LAG3、HAVCR2和ADORA2A拮抗剂，优选PD-1/PD-L1拮抗剂。
4.根据权利要求3所述的组合的药物组合物，其中所述抗体选自CTL-A4拮抗剂，优选易普利单抗或ticilimumab。
5.根据权利要求3所述的组合的药物组合物，其中所述抗体选自抑制性KIR拮抗剂，优选1-7F9。
6.根据权利要求3所述的组合的药物组合物，其中所述抗体选自PD-1/PD-L1和PD-1/PD-L2拮抗剂，优选纳武单抗、Merck3745、CT-011、lambrolizumab、AMP514、MDX-1105或YW243.55.S70。
7.根据权利要求3所述的组合的药物组合物，其中所述抗体选自CD276拮抗剂，优选8H9或MGA271。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合的药物组合物，其中
a)所述缀合物的多肽i)和多肽ii)在融合蛋白中共价连接；和
b)所述缀合物与所述抗体或其片段未连接。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合的药物组合物，其中所述白细胞介素15具有氨基酸序列SEQIDNO:1。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合的药物组合物，其中所述IL-15Rα的sushi结构域具有氨基酸序列SEQIDNO:4。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合的药物组合物，其中所述缀合物具有氨基酸序列SEQIDNO:16或SEQIDNO:17。
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